Medida da Cinética Enzimática - (LTC) de NUTES

Aula 3 – Parte 2
Medida da Cinética Enzimática
Durante a AP1 vocês foram apresentados a algumas formas alternativas para o
estudo da cinética enzimática, mas também viram como este tema é estudado em
um laboratório através de um método colorimétrico, realizado com uma técnica
espectroscópica. É por meio desta técnica (espectroscopia de UV-Visível) que
daremos início a esta aula.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
A cinética enzimática estuda a velocidade
das reações catalisadas por enzimas. O
estudo do comportamento cinético de uma
enzima nos permite compreender as
particularidades
de
seu
mecanismo
catalítico, a sua função no metabolismo,
como ocorre o controle de sua atividade na
célula e como esta pode ter sua atividade
inibida ou potencializada por outras
moléculas.
Um dos conceitos mais importantes que
vocês precisam saber no estudo da cinética
enzimática é o de velocidade de reação.
Para isso, nesta aula está descrito o
procedimento realizado durante a AP1 onde
medimos a velocidade de uma reação para
que iniciem as discussões sobre o assunto.
Neste estudo utilizamos a Tripsina que é
uma serino-protease, pois ela apresenta um
resíduo de serina no seu sítio ativo que é
responsável pela catálise. Ela somente pode
catalisar a hidrólise de ligações peptídicas
de substratos onde as cadeias laterais dos
resíduos de aminoácidos sejam carregadas
positivamente sendo, assim, extremamente
específica.
Esse experimento foi realizado em um
espectrofotômetro, um equipamento que
permite medir a absorbância (Abs) de uma
amostra.
ESPECTROFOTOMETRIA NO UVVISÍVEL
Espectrofotometria é um método analítico
baseado em medidas de absorção de
radiação
eletromagnética
nas
faixas
correspondentes à luz visível, de 380 a 700
nm1, e à luz ultra-violeta, de 200 a 380 nm.
Ou seja, podemos dizer que a espectroscopia
estuda a interação entre a matéria e a
radiação eletromagnética.
As serino proteases também hidrolisam
ligações do tipo éster ou amida e existem
vários substratos sintéticos disponíveis no
mercado para o estudo dessas enzimas.
Absorbância (ou absorvância) é uma
propriedade que determinados
compostos, apresentam, ou seja, a de
absorver radiação em um determinado
comprimento de onda.
Neste caso, utilizamos como substrato o NBenzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BApNA),
pois quando este é hidrolisado (Figura 1), é
formado como produto a p-nitroanilina, que
é amarela em pH 8. A reação de hidrólise do
BapNA está esquematizada a seguir:
1
nm = nanômetro (1 nm = 10-9 m)
Cada composto absorve uma determinada
quantidade de luz em um comprimento de
onda.
O espectrofotômetro2 emite um feixe de luz
em determinado comprimento de onda, que
é direcionado à cubeta que contém a
amostra, como mostra o esquema a seguir:
Foto: http://www.globescientific.com/analyzerconsumables-cuvettes-c-21_583.html
Dessa forma, são determinados os valores de
absorbância (Abs). A parcela de luz emitida
que não for absorvida é chamada de
transmitância.
A medida da Abs de uma amostra obedece
lei de Lambert-Beer, a qual relaciona
quantidade de luz absorvida com
concentração de amostra de acordo com
equação 1:
Abs = ε .b.C
à
a
a
a
Coeficiente de extinção molar é o valor de
absorbância de uma amostra se sua
concentração fosse 1 Molar.
(eq. 1)
onde ε é coeficiente de extinção molar, b é
o caminho ótico e C é a concentração molar
da amostra. Entendeu? Não? Então, vamos
lá...
Vamos começar pelo caminho ótico, que
corresponde à largura da cubeta usada para
a medida de Abs. O mais comum é usarmos
uma cubeta com 1 cm de caminho ótico,
como vocês viram na AP1. Isso quer dizer
que a luz percorre a amostra atravessando
uma solução que está contida num espaço
de 1 cm. Existem cubetas com caminhos
óticos maiores ou menores mas o suporte de
cubetas do espectrofotômetro precisa ser
adaptado para as mesmas.
2
Procure entender porque isso é importante:
por exemplo, temos uma amostra na qual a
Abs é 0,2 se esta for colocada em uma
cubeta de 1 cm. Se a mesma amostra for
colocada em uma cubeta de 3 cm de
caminho ótico, a Abs será 0,6 (ou seja,
teremos 3 x mais amostra para absorver a
luz que atravessa a cubeta); ao contrário se
a cubeta for menor, o valor de Abs será
menor.
Vejam o Material Complementar onde um vídeo é
apresentado com a descrição de um
espectrofotômetro.
O que é isso?
No caso da anilina, o
1
.cm-1 em 410 nm.
ε é igual a 8.800 M-
Vamos traduzir... uma amostra de anilina 1 M
teria uma absorbância 8.800 em um caminho
ótico de 1 cm.
Como nos espectrofotômetros conseguimos
uma leitura de Abs até 1, devemos usar
amostras muito diluídas.
Quando o espectrofotômetro opera no modo
de obtenção de espectro, na verdade, está
medindo a Abs de uma amostra em vários
comprimentos de onda
Resultados
Segundo Luiz F. C. de Oliveira, Um
espectro é uma espécie de impressão
digital de um composto químico, uma
vez que cada composto difere de outro
em função da composição química, ou
seja, de diferentes átomos que o
formam, e também da geometria
molecular. Dessa forma, a análise do
espectro permite dizer qual é a
molécula em questão!
Leia mais sobre Espectroscopia
Molecular no artigo do Luiz F.C. de
Oliveira publicado na Química Nova na
Escola ANO que está nos Objetos de
Aprendizagem como Material
Complementar.
A amostra utilizada continha:
....... mM de Tris HCl, pH 8;
....... mM de BApNA;
....... uM de Tripsina.
E agora, vamos calcular as concentrações
finais de cada componente do meio de
reação e preencher os espaços acima?
Dica: Para calcular a concentração de cada
componente lembre-se que o volume final é
aquele obtido após a adição da enzima.
Veja na figura a seguir o resultado desta
cinética observado no espectrofotômetro:
Quando o espectrofotômetro opera no modo
cinético, a Abs é medida em função do
tempo de reação, ou seja, a quantidade de
luz absorvida por um composto em
determinado comprimento de onda.
De acordo com a equação 1, a Abs é
diretamente proporcional à concentração da
amostra.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Podemos salvar os dados obtidos para criar
um novo gráfico a fim de calcular a
velocidade de reação, como mostrado
abaixo:
0.16
1. Prepare uma solução de BApNA em
tampão Tris HCl pH 8, contendo:
0.14
0.12
2. Agite bem a cubeta, certifique-se que as
faces por onde será feita a leitura estão bem
limpas e leve-a ao espectrofotômetro para
zerar o aparelho (veja o vídeo sugerido!).
3. Retire a cubeta do espectrofotômetro,
adicione 8 µL de tripsina (100 µM), agite
bem e leve ao aparelho, iniciando
imediatamente a leitura da absorbância em
função do tempo.
Atenção: O comprimento de onda utilizado
para a leitura das amostras foi de 410 nm,
na faixa do visível.
0.10
Abs
80 µL de Tris HCl 0,5 M, pH 8;
7 µL de BapNA 10 mM;
705 µL de água Tipo I.
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0
20
40
60
80
100
Tempo (s)
Este gráfico foi gerado com dados obtidos com a
amostra descrita neste protocolo. A linha vermelha foi
obtida pela regressão linear dos dados de acordo com
uma equação de reta do tipo y = A + Bx.
É proibida a reprodução de parte ou do todo desta
publicação sem a permissão formal de seus autores.
Laboratório de Biocalorimetria
Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ
Apoio: FAPERJ