universidade federal do rio grande do norte centro de

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Joelma Dantas Monteiro
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DOS VÍRUS DENGUE E ZIKA NO ESTADO DO
RIO GRANDE DO NORTE, NO PERÍODO DE JUNHO DE 2014 A MAIO DE 2015.
Natal
2016.
JOELMA DANTAS MONTEIRO
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DOS VÍRUS DENGUE E ZIKA NO ESTADO DO
RIO GRANDE DO NORTE, NO PERÍODO DE JUNHO DE 2014 A MAIO DE 2015.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Biologia
Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo
Natal
2016.
JOELMA DANTAS MONTEIRO
Epidemiologia Molecular dos vírus Dengue e Zika no Estado do Rio Grande do
Norte, no período de junho de 2014 a maio de 2015.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Biologia
Parasitária.
Área de concentração: Microbiologia
Aprovada em: 26/01/2016.
Examinadores
Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo (Presidente) – Universidade Federal do Rio
Rio Grande do Norte
Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes (1º Examinador) – Universidade Federal do Rio
Grande do Norte
Prof. Dr. Thales Allyrio Araújo de Medeiros Fernandes (2º Examinador) Universidade do Estado do Rio Grande do Norte
Dedico este trabalho a Deus e a toda a
minha família, meus alicerces diários.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, autor e princípio de tudo. Pai que me concedeu o dom da vida e
me propicia inúmeras bênçãos diariamente. Creio que nos momentos mais difíceis,
Ele me carregou em seus braços e me forneceu forças para continuar lutando;
Aos meus pais, Maria das Dores e José Monteiro, meus maiores exemplos de vida,
pessoas espetaculares que trazem consigo os adjetivos de humildade, carinho,
dedicação, paciência, esperança, fé e muito amor no coração. Muito obrigada por
tudo o que sou e tenho. Amo muito vocês!
Aos meus irmãos Joel e Josemar pelos conselhos e discussões que serviram muito
para meu engrandecimento pessoal. Amo-vos;
À minha sobrinha Maria Clara, sapequinha que tanto amo e que me faz aprender
todos os dias a ter um coração semelhante ao de criança;
Ao meu namorado Flaviano que me incentivou bastante para continuar lutando pelos
meus objetivos, além de ter tido uma enorme paciência para ouvir minhas
reclamações e aguentar meus aborrecimentos;
A todos os colegas do Laboratório de Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC)
pelos momentos de descontração, ensinamentos e desabafos;
À Gilca e todos os funcionários do Laboratório Central Dr. Almino Fernandes
(LACEN/RN) que há anos contribuem para que muitas pesquisas no LADIC possam
ser realizadas;
Agradeço imensamente ao professor Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo pela
paciência e orientação oferecida desde a graduação. Muito obrigada pela
generosidade nos seus ensinamentos que sem dúvida, serviram significativamente
para o meu engrandecimento pessoal e profissional;
Agradeço à Joana Valverde pela ajuda nas análises estatísticas;
À Kátia Rejane da Silva pela significativa ajuda e paciência na normalização desse
trabalho;
Aos professores Dr. José Veríssimo Fernandes e Dr. Daniel Carlos Ferreira Lanza
pela participação na banca de qualificação;
Agradeço também ao professor Dr. Thales Allyrio Araújo de Medeiros Fernandes e
mais uma vez ao Dr. José Veríssimo Fernandes por ter aceitado fazer parte da
banca de defesa. Tenho um grande respeito e admiração por todos e sei que a
experiência de cada um de vocês, contribuiu significativamente para enriquecer este
trabalho;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à
Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte (FAPERN) pelo
apoio financeiro.
―Não fique ansioso com aquilo que você
ainda não tem. Tudo tem o seu tempo.
Jogue as sementes no chão... Cuide e um
dia elas irão germinar...‖.
Padre Fábio de Melo
RESUMO
Os agentes etiológicos da dengue e da febre zika são vírus de RNA de fita simples,
com polaridade positiva, pertencentes à família Flaviviridae, gênero Flavivirus e são
transmitidos ao homem através da picada de vetores artrópodes hematófagos do
gênero Aedes. O Estado do Rio Grande do Norte (RN) convive com casos da
dengue há mais de duas décadas. Em relação à febre zika, até os primeiros dias do
mês de maio de 2015, o Ministério da Saúde não havia confirmado nenhum caso da
doença no Brasil, tampouco no RN, embora já houvesse suspeita clínica da infecção
causada por esse vírus. Esse trabalho objetivou analisar o perfil epidemiológico dos
vírus Dengue e Zika no Estado do RN, no período compreendido de junho de 2014 a
maio de 2015. Um total de 334 amostras de sangue provenientes de pacientes
foram estudadas para os vírus Dengue (DENV) através da técnica de RT-PCR, onde
8,08% foram positivas e 348 amostras foram analisadas para detecção do vírus Zika
(ZIKV) por meio da qRT-PCR, nas quais 20,98% foram positivas. Foi constatada a
cocirculação dos sorotipos DENV-1, DENV-2 e DENV-4 no RN no período do
estudo, com predominância do DENV-4, detectado em 66,67% (18/27) dos casos
positivos. Os municípios de Natal, Jandaíra e Ouro Branco tiveram maior número de
casos confirmados para os DENV, com 22,22% (6/27), 18,52% (5/27) e 11,11%
(3/27), respectivamente. No que se refere ao ZIKV, as cidades que apresentaram
maior número de casos confirmados foram: Natal, Parnamirim, Guamaré e Nova
Cruz Parnamirim, com 30,14% (22/73), 19,18% (14/73), 13,70% (10/73) e 9,59%
(7/73) respectivamente. O primeiro município a ter um caso confirmado de DENV no
período estudado foi Jandaíra. Caiçara do Rio do Vento foi o primeiro a apresentar
um caso de ZIKV, seguido de Galinhos. Junho foi o mês mais representativo em
número de casos confirmados de DENV com 44,44% (12/27), enquanto março foi o
mês com maior número de casos confirmados de ZIKV com 23,29% (17/73). O
gênero masculino e o feminino apresentaram praticamente a mesma proporção de
casos detectados para os DENV, com 51,85% (14/27) e 48,15% (13/27),
respectivamente, enquanto o ZIKV acometeu um maior número de mulheres,
representando 57,53% (42/73) dos casos. As faixas etárias mais acometidas pelos
DENV foi a de 11-20 e 51-60 anos, com 18,52% (5/27) cada uma. Com relação ao
ZIKV, a idade de 0-10 anos foi a mais incidente com 19,18% (14/73) dos casos
confirmados, seguidas das idades de 31-40 e 41-50 anos, onde cada uma destas
representou 16,44% (12/73). A análise comparativa da carga viral entre os 5 dias da
febre zika realizada por qRT-PCR mostrou uma carga viral maior no 3° dia de
doença. Uma vez comprovada a cocirculação desses dois flavivírus no RN, torna-se
necessário conhecer a prevalência e a dinâmica de circulação de cada um deles na
população local, no intuito de estabelecer medidas de controle, visando prevenir
futuros surtos e epidemias no Estado. Este trabalho representa o estudo mais
abrangente sobre o vírus Zika no Estado do RN.
Palavras-chave: Dengue. Zika. Epidemiologia. Rio Grande do Norte.
ABSTRACT
The etiological agents of dengue fever and zika are single-stranded RNA viruses with
positive polarity belonging to the Flaviviridae family, genus flavivirus and is
transmitted to humans through the bite of blood-sucking arthropod vectors of the
genus Aedes. The state of Rio Grande do Norte (RN) lives with dengue cases for
over two decades. Regarding the zika fever, until the first day of May 2015, the
Ministry of Health had not confirmed any cases of the disease in Brazil, either in RN,
although already had clinical suspicion of infection caused by this virus. This study
aimed to analyze the epidemiological profile of Dengue and Zika virus in the state of
Rio Grande do Norte, in the period June 2014 to May 2015. A total of 334 blood
samples from patients were analyzed for dengue virus (DENV) by RT-PCR technique
where 8.08% were positive and 348 samples which were analyzed to detection Zika
vírus (ZIKV) by means of qRT-PCR, of which 20.98% were positive. It was found the
movement of DENV serotypes-1, DENV-2 and DENV-4 in infants in the study period,
with a predominance of this, detected in 66.67% (18/27) of positive cases. The
municipalities of Natal, Jandaíra and Ouro Branco had a higher number of confirmed
cases to the DENV, with 22.22% (6/27), 18.52% (5/27) and 11.11% (3/27),
respectively. With regard to the ZIKV, the cities with highest numbers of confirmed
cases were Natal, Parnamirim, Guamaré e Nova Cruz with 30.14% (22/73), 19.18%
(14/73), 13.70% (10/73) and 9, 59% (7/73) respectively. The first town to have a
confirmed case of DENV during the study period was Jandaíra. Caiçara of Rio of
Vento was the first to present a case ZIKV, followed by Galinhos. June was the most
representative month in the number of confirmed cases of DENV with 44.44%
(12/27), while March was the month with the highest number of confirmed cases of
ZIKV with 23.29% (17/73). The male and females have about the same proportion of
detected cases for DENV, with 51.85% (14/27) and 48.15% (13/27) respectively,
while the ZIKV occurred in a larger number of women, representing 57.53% (42/73)
of cases. The age groups most affected by dengue were 11-20 and 51-60 years,
each with 18.52% (5/27) each one. Regarding the ZIKV, the age of 0-10 years was
the most frequent with 19.18% (14/73) of the confirmed cases, followed by ages 3140 and 41-50 years, where each of these represented 16 44% (12/73). The
comparative analysis of the viral load between 5 days of fever zika performed by
qRT-PCR showed a viral load higher on the 3rd day of the disease. Once proven the
presence of these two flavivirus in RN, it is necessary to know the prevalence and
circulation dynamics of each of the local population in order to establish control
measures aimed at avoiding future outbreaks and epidemics in the state. This study
represents the largest study on the virus Zika in the state of RN.
Keywords: Dengue. Zika. Epidemiology. Rio Grande do Norte.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática do genoma dos flavivírus ............................ 24
Figura 2 - Replicação dos flavivírus .......................................................................... 26
Figura 3 - Ciclo de transmissão dos flavivírus ........................................................... 28
Figura 4 - Classificação da dengue em níveis de gravidade sugerida pela
Organização Mundial de Saúde ................................................................................ 34
Figura 5 - Países ou áreas de risco para os DENV ................................................... 41
Figura 6 – Distribuição geográfica do ZIKV ............................................................... 46
Figura 7 – Localização do Estado do Rio Grande do Norte ..................................... 57
Figura 8 – Mesorregiões e microrregiões do Estado do Rio Grande do Norte .......... 57
Figura 9 – Curva de amplificação do primeiro teste realizado para identificação
e detecção dos ZIKV através da técnica de qRT-PCR ........................................ 65
Figura 10 – Curva de amplificação do segundo teste para detecção dos ZIKV
através da técnica de qRT-PCR ............................................................................ 66
Figura 11 – Curva de amplificação do terceiro teste para detecção dos ZIKV
através da técnica de qRT-PCR ............................................................................ 68
Figura 12 – Amplificação que não ocorreu no quarto teste para detecção dos ZIKV,
devido redução na concentração do TaqMan FAST Vírus 1- Step Master Mix
(Applied Byossistems) para 1,25x ............................................................................ 68
Figura 13 – Padronização do protocolo implantado (quinto teste) para detecção
dos ZIKV através da técnica de qRT-PCR ............................................................ 70
Figura 14 – Sorotipos do vírus Dengue detectados por mês, no período de junho de
2014 a maio de 2015 ................................................................................................. 71
Figura 15 – Eletroforese horizontal em gel de agarose a 1%. Visualização dos
produtos amplificados pela transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela
polimerase (RT-PCR) para tipagem dos DENV segundo o protocolo descrito por
Lanciotti et al., 1992. Poço 1: Marcador de Peso Molecular de 100 pares de bases
(Promega); Poço 2: Controle negativo; Poço 3: Amostra positiva para DENV-1; Poço
4: Amostra positiva para DENV-2; Poço 5: Amostra positiva para DENV-3; Poço 6:
Amostra positiva para DENV-4.................................................................................. 72
Figura 16 – Vírus Zika detectados por mês, no período de junho de 2014 a maio de
2015. ......................................................................................................................... 73
Figura 17 – Perfil de amplificação do ZIKV demonstrado através da técnica de
transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo real
(qRT-PCR). ............................................................................................................... 73
Figura 18 – Mapa do Estado do Rio Grande do Norte demonstrando os municípios
incidentes pelos DENV no período de junho de 2014 a maio de 2015. .................... 74
Figura 19 – Mapa do Estado do Rio Grande do Norte demonstrando os municípios
incidentes pelo ZIKV no período de junho de 2014 a maio de 2015. ........................ 76
Figura 20 – Mapas do Estado do Rio Grande do Norte, mostrando a evolução dos
DENV e ZIKV durante o período de junho de 2014 a maio de 2015.
A: Junho-Agosto/14; B: Junho-Novembro/14; C: Junho/14 a Fevereiro/15; D:
Junho/14 a Maio/15 .................................................................................................. 79
Figura 21 – Linha do tempo mostrando os municípios incidentes pelo ZIKV durante o
período de junho de 2014 a maio de 2015 ............................................................... 80
Figura 22 – Distribuição mensal dos casos positivos e estudados para os DENV no
período de junho de 2014 a maio de 2015 ............................................................... 82
Figura 23 – Distribuição mensal dos casos positivos e estudados para ZIKV no
período de junho de 2014 a maio de 2015 ............................................................... 83
Figura 24 – Casos confirmados de DENV por gênero, no período de junho de 2014 a
maio de 2015 ............................................................................................................ 84
Figura 25 – Casos confirmados de ZIKV por gênero, no período de junho de 2014 a
maio de 2015 ............................................................................................................ 85
Figura 26 – Casos positivos para os DENV no período de junho de 2014 a maio de
2015, conforme a faixa etária ................................................................................... 85
Figura 27 – Casos positivos para ZIKV no período de junho de 2014 a maio de 2015,
conforme a faixa etária .............................................................................................. 86
Figura 28 – Média dos valores de Ct indicando a carga viral por dia de doença,
obtido de casos confirmados de ZIKV nesse estudo................................................. 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Sequência de oligonucleotídeos que foram utilizados para tipagem dos
vírus da dengue por meio de transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela
polimerase (RT-PCR) ................................................................................................ 59
Tabela 2 - Reagentes utilizados para detectar os sorotipos do vírus da dengue por
meio de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia pela polimerase (RTPCR) ........................................................................................................................ 60
Tabela 3 - Sequência da sonda e dos primers iniciadores utilizados na transcrição
reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR)
para
detecção
do
vírus
Zika
(Y
=
T
ou
C,
R
=
A
ou
G)
....................................................................................................................................62
Tabela 4 - Reagentes utilizados para detecção do vírus Zika por meio de transcrição
reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR)...62
Tabela 5 - Reagentes utilizados no primeiro teste para detectar o ZIKV por meio da
transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo real
(qRT-PCR) ................................................................................................................ 65
Tabela 6 - Reagentes utilizados para detectar o ZIKV por meio de transcrição
reversa seguida pela reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR)
com a concentração padrão implantada no LADIC .................................................. 67
Tabela 7 - Detecção e porcentagem dos casos positivos pelos DENV e dos casos
positivos para ZIKV .................................................................................................. 71
Tabela 8 - Municípios incidentes pelos DENV, número de casos confirmados,
sorotipos circulantes e porcentagem de casos positivos no período de junho de 2014
a maio de 2015 ......................................................................................................... 75
Tabela 9 - Municípios incidentes pelos ZIKV, número de casos confirmados, além da
porcentagem de casos positivos no período de junho de 2014 a maio de 2015 ...... 77
Tabela 10 - Distribuição mensal dos casos confirmados, estudados e sorotipos de
DENV circulantes no Rio Grande do Norte, durante o período de junho de 2014 a
maio de 2015............................................................................................................. 81
Tabela 11 - Distribuição mensal dos casos confirmados e estudados de ZIKV no Rio
Grande do Norte, durante o período de junho de 2014 a maio de 2015 ................... 83
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAS: Ácido acetilsalicílico
C: Proteína estrutural do capsídeo viral
cDNA: ―Complementary DNA‖, DNA complementar
Ct: ―Cycle threshold‖; Ciclo threshold
d.C: Depois de Cristo
DC: Dengue clássica
DENV: Vírus Dengue
DENV-1: Sorotipo 1 dos Vírus Dengue
DENV-2: Sorotipo 2 dos Vírus Dengue
DENV-3: Sorotipo 3 dos Vírus Dengue
DENV-4: Sorotipo 4 dos Vírus Dengue
DNA: Ácido desoxirribonucleico
ECDC: ―European Centre for Disease Prevention and Control‖, Centro Europeu de
Prevenção e Controle de Doenças
FA: Febre Amarela
FHD: Febre hemorrágica da dengue
FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz
Hab/km²: Habitante por kilômetro quadrado
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IgG: Imunoglobulina G
IgM: Imunoglobulina M
kDa: Kilodálton
LACEN: Laboratório Central Doutor Almino Fernandes
LADIC: Laboratório de Doenças Infecciosas e do Câncer
μL: microlitro
μM: Micrômetro
M: Proteína estrutural da membrana
MAC-ELISA: ―IgM Antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay‖, Ensaio
imunoenzimático de captura de anticorpo IgM
MG: Minas Gerais
mL: mililitro
mm³: milímetro cúbico
nM: Nanomolar
OMS: Organização Mundial de Saúde
PCR: ―Polymerase Chain Reaction‖, Reação em Cadeia pela Polimerase
pH: Potencial de hidrogênio
PrM: Proteína estrutural de pré-membrana
qRT-PCR: ―quantitative Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction‖,
Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase quantitativo
RNA: Ácido ribonucleico
RN: Rio Grande do Norte
RT-PCR: ―Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction‖, Transcrição reversa
seguida da reação em cadeia pela polimerase
SCD: Síndrome de choque da dengue
U/μL: Unidade por microlitro
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
UTR: ―Untranslated region‖, Região não traduzida
V: Voltagem
ZIKV: Vírus Zika
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19
1.1 Breve histórico sobre a Dengue ..................................................................... 20
1.2 Breve histórico sobre a Febre Zika ................................................................. 22
1.3 Os agentes etiológicos da Dengue e da Febre Zika ....................................... 23
1.4 Vetores .............................................................................................................. 27
1.4.1 Aedes aegypti................................................................................................... 28
1.4.2 Aedes albopictus .............................................................................................. 30
1.5 Doença .............................................................................................................. 31
1.5.1 Doença causada pelos DENV .......................................................................... 31
1.5.2 Doença causada pelo ZIKV .............................................................................. 34
1.6 Diagnóstico ....................................................................................................... 38
1.6.1 Diagnóstico laboratorial dengue ...................................................................... 38
1.6.2 Diagnóstico laboratorial zika ............................................................................ 39
1.7 Aspectos epidemiológicos - Dengue .............................................................. 40
1.7.1 Dengue no mundo ........................................................................................... 40
1.7.2 Dengue nas Américas ..................................................................................... 42
1.7.3 Dengue no Brasil ............................................................................................. 42
1.7.4 Dengue no Rio Grande do Norte ..................................................................... 44
1.8 Aspectos epidemiológicos – Febre Zika ......................................................... 45
1.8.1 Febre Zika no mundo ...................................................................................... 45
1.8.2 Febre Zika nas Américas ................................................................................. 46
1.8.3 Febre Zika no Brasil ........................................................................................ 47
1.8.4 Febre Zika no Rio Grande do Norte ................................................................ 49
1.9 Controle e vacina ............................................................................................. 50
1.9.1 Da Febre Dengue ........................................................................................... 50
1.9.2 Da Febre Zika ................................................................................................. 51
2 JUSTIFICATIVA..................................................................................................... 53
3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 55
3.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 55
3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 55
4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 56
4.1 Tipo de estudo ................................................................................................... 56
4.2 Local de estudo ................................................................................................. 56
4.3 Amostras clínicas da população e fonte de dados do estudo ....................... 58
4.4 Extração do RNA viral ...................................................................................... 58
4.5 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RTPCR) para detecção e tipagem dos DENV ............................................................ 59
4.6 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em
tempo real (qRT-PCR) para detecção dos ZIKV .................................................... 61
4.7 Análise de dados .............................................................................................. 63
4.8 Considerações éticas ....................................................................................... 63
5 RESULTADOS ...................................................................................................... 64
5.1 Implantação e aplicação da técnica de transcrição reversa seguida da
reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) para detecção do
ZIKV ......................................................................................................................... 64
5.2 Monitoramento viral .......................................................................................... 70
5.2.1 Pesquisa dos sorotipos dos vírus Dengue e identificação da circulação do vírus
Zika no Estado do Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014 a maio de
2015 .......................................................................................................................... 70
5.3 Análise espaço temporal e perfil epidemiológico dos DENV e ZIKV ............ 74
5.3.1 Municípios incidentes pelos DENV no Rio Grande do Norte, no período de
junho de 2014 a maio de 2015 .................................................................................. 74
5.3.2 Municípios incidentes por ZIKV no Rio Grande do Norte, no período de junho
de 2014 a maio de 2015 ........................................................................................... 76
5.3.3 Análise da distribuição espacial e evolução dos DENV e ZIKV no Rio Grande
do Norte, no período de junho de 2014 a maio de 2015 ........................................... 77
5.3.4 Análise temporal dos DENV no Rio Grande do Norte, no período de junho de
2014 a maio de 2015 ................................................................................................ 80
5.3.5 Análise temporal dos casos de ZIKV no Rio Grande do Norte, no período de
junho de 2014 a maio de 2015 ................................................................................. 82
5.3.6 Investigação dos DENV no Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014
a maio de 2015, de acordo com o gênero ................................................................ 84
5.3.7 Investigação do ZIKV no Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014 a
maio de 2015, de acordo com o gênero ................................................................... 84
5.3.8 Investigação dos DENV no Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014
a maio de 2015, de acordo com a faixa etária........................................................... 85
5.3.9 Investigação do ZIKV no Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014 a
maio de 2015, de acordo com a faixa etária.............................................................. 86
5.3.10 Carga viral dos casos confirmados de ZIKV por dia de doença ..................... 86
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 88
7 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 94
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 96
19
1
INTRODUÇÃO
Os arbovírus são um grupo de vírus mantidos na natureza principalmente
através de ciclos que envolvem vetores artrópodes hematófagos e hospedeiros
vertebrados suscetíveis (BATISTA, 2011; FAUCI e MORENS, 2016; FIGUEIREDO,
2007). Esses vírus também são um relevante problema de saúde pública em várias
partes do mundo (TEIXEIRA et al., 2009), causando impacto tanto econômico,
quanto social na população (SANTOS e SILVA, 2015; YUILL, 1986). Estima-se que
haja mais de 545 espécies de arbovírus, dentre as quais, mais de 150 deles estão
relacionados com doenças em seres humanos, onde a maioria é zoonótica (LOPES,
NOZAWA e LINHARES, 2014). Taxonomicamente, os arbovírus são divididos em
diversas famílias, porém, as mais representativas para a saúde pública por causar
infecções em humanos e em animais, são: Togaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae,
Rhabdoviridae e Flaviviridae (BOLLING et al., 2014; LOPES, NOZAWA e
LINHARES, 2014; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1985).
A família Flaviviridae é composta pelos gêneros: Flavivírus, Hepacivírus e
Pestivírus, porém, o mais representativo é o primeiro por contemplar mais de 70
vírus, nos quais cerca de 40 deles são reconhecidamente causadores de patologias
humanas (ASSENBERG et al., 2009). Além disso, o gênero Flavivírus é o único
dessa família cujos vírus são transmitidos por artrópodes e por esse motivo, são
classificados como arbovírus (PAUVOLID-CORRÊA e VARELLA, 2008). Os
flavivírus apresentam uma distribuição cosmopolita. A evolução, o padrão de
dispersão e as características epidemiológicas desses vírus são determinados por
uma combinação de fatores impostos pelo vetor artrópode e pelo hospedeiro
vertebrado (MEDEIROS, 2009). Os vírus do gênero Flavivírus podem causar
encefalites, quadros hemorrágicos, doenças hepáticas e febris severas nos animais
vertebrados, incluindo o homem, sendo responsável por elevadas taxas de
morbidade e mortalidade em seres humanos (MARTINS, 2012; MONATH e HEINZ,
1996).
Alguns vírus pertencentes à família Flaviviridae possuem grande importância
médica, tais como o vírus da Febre Amarela, vírus Ilhéus, vírus Rocio, vírus da
Encefalite de São Luís, vírus do Nilo Ocidental, vírus da Encefalite Japonesa, vírus
20
Dengue e vírus Zika (CASSEB et al, 2013; GATHERER e KOHL, 2015). Neste
trabalho, abordamos sobre o perfil epidemiológico de dois arbovírus circulantes no
Estado do Rio Grande do Norte: vírus Dengue (DENV) e vírus Zika (ZIKV).
1.1
Breve histórico sobre a Dengue
Os primeiros relatos de sintomas compatíveis com a dengue vêm de uma
enciclopédia chinesa que teve sua primeira publicação datada de 265 a 450 d.C.,
mas a referência formal ocorreu nas Dinastias Tang, 610 d.C, e Sung do Norte, 992
d.C (GUBLER, 1998). Inicialmente, a doença ficou conhecida pelos chineses como
―água envenenada‖, pois estes relacionavam insetos voadores à água (SILVA NETO
et al., 2013).
Na região das Índias Francesas Ocidentais no ano de 1635, foram descritos
surtos de uma doença febril aguda. No Panamá, em 1699, ocorreu situação similar
(GUBLER, 1998). Uma doença com as mesmas características também foi descrita
nos anos de 1779 e 1780 em três continentes: Asiático, atingindo a Batávia
(Indonésia), Africano, ocorrido no Cairo (Egito) e Americano, na Filadélfia (Estados
Unidos da América) (GONÇALVES, 2010). Nesse período, alguns termos foram
utilizados para caracterizar a doença e o mais conhecido deles foi ―febre quebra
ossos‖ (VASCONCELOS, 1999). Porém, não há consenso quanto ao fato das
descrições apresentadas terem sido causadas por dengue ou chikungunya (BURKE
e MONATH, 2001).
Dengue é um homônimo espanhol para o Swahili, língua de algumas regiões
da costa leste africana, na qual a expressão ―Kidengapepo‖ significa pancada ou
golpe causada por maus espíritos e provoca um súbito tremor de câimbra
(HALSTEAD, 1980; REZENDE, 1997). O termo dengue só foi introduzido na
literatura médica entre os anos de 1827 e 1828 durante uma epidemia ocorrida no
Caribe, onde as principais características clínicas observadas foram exantema e
artralgia (FARIA, 2010). Em Cuba, houve uma epidemia no ano de 1828 na qual a
doença foi chamada de ―dunga‖, depois mudou para ―dengue‖, por cujo nome é
21
conhecido até hoje para identificar síndromes febris epidêmicas (GUBLER, 1997).
No Brasil, faz-se referência à dengue desde o ano de 1846, período em que a
doença adquiriu importância epidemiológica (BRAGA e VALLE, 2007).
No ano de 1906, Bancroft sugeriu que o vírus causador da doença era
transmitido por um vetor e que esse provavelmente seria o Aedes aegypti,
anteriormente denominado Stegomyia fasciata (BANCROFT, 1907). No ano
seguinte, Ashburn e Craig demonstraram a natureza viral do agente etiológico
(ASHBURN e CRAIG, 1907) e apenas em 1918, na Austrália, foi comprovada a
transmissão do vírus pelo mosquito Aedes aegypti após realização de um teste
sobre a capacidade de transmissão do vírus Dengue (CLELAND e BRADLEY,
1919).
O vírus da dengue só foi isolado em 1943 por Kimura e Hotta, onde a cepa foi
denominada de Mochizuk (KIMURA e HOTTA, 1944). No ano de 1944, Sabin e
Schelinger isolaram cepas virais no Havaí e no mesmo ano, também foram
identificadas cepas em Nova Guiné e, logo descobriram que apesar de possuir
características antigênicas diferentes, os isolados pertenciam ao mesmo vírus,
sendo então considerados sorotipos. (SABIN e SCHELINGER, 1945). As primeiras
cepas foram denominadas respectivamente de sorotipos 1 e 2. Em 1956, no curso
da epidemia de dengue ocorrida nas Filipinas, foram isolados os sorotipos 3 e 4. A
partir de então, o complexo dengue passou a ser formado por quatro sorotipos do
vírus (BARRETO e TEIXEIRA, 2008).
Possivelmente os DENV se originaram na Ásia, uma vez que os quatro
sorotipos foram encontrados em ciclos de transmissão silvestre, nas florestas
asiáticas (RUDNICK, 1986), envolvendo primatas não humanos. Posteriormente,
esses mesmos vírus foram introduzidos para aldeias, iniciando assim o ciclo urbano
da doença (MARCONDES e TAUIL, 2011).
A introdução dos vírus da dengue em aldeias pode ter ocorrido por humanos
ou macacos, porém, a propagação viral ocorreu através dos mosquitos
peridomésticos Aedes aegypti, de origem africana e Aedes albopictus, de origem
asiática. Das aldeias os DENV e ambos os vetores mencionados foram
transportados para cidades portuárias por meio de embarcações (GUBLER, 2004).
22
1.2
Breve histórico sobre a Febre Zika
O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus que leva o nome de uma floresta,
denominada Zika, localizada próximo de Kampala e Entebbe na Uganda, onde foi
encontrado pela primeira vez (FAYE et al., 2014; IOOS et al., 2014). Esse vírus foi
originalmente isolado em 20 de abril de 1947 a partir do soro de uma fêmea de
macaco Rhesus febril, utilizada como sentinela para detecção da febre amarela
silvestre nessa floresta (HADDOW et al., 2012; VASCONCELOS, 2015). No ano
seguinte, o ZIKV foi novamente isolado, desta vez, a partir de uma amostra de
Aedes africanus proveniente do mesmo local (DICK, KITCHEN e HADDOW, 1952) e
em 1952, o vírus foi isolado pela primeira vez a partir de amostras de soro humano
provenientes do Leste da África. Porém, apenas no ano de 1964 é que foi relatado o
primeiro caso de infecção pelo ZIKV em humano, com descrição clinica detalhada,
realizada por um médico entomologista que se infectou com o vírus durante um
trabalho de campo realizado na Uganda e descreveu sua própria infecção (DIALLO
et al., 2014). Inicialmente, esse pesquisador sentiu uma leve dor de cabeça e no dia
seguinte, apresentou uma erupção cutânea maculopapular que se iniciou pelo rosto,
pescoço, tronco, braços, propagando-se para as palmas das mãos e plantas dos
pés, desenvolvendo febre e mal-estar. No outro dia, a febre havia desaparecido e a
erupção estava sumindo. No terceiro dia da infecção, o médico entomologista ainda
apresentava erupção, mas esta desapareceu dois dias depois (HAYES, 2009).
Apesar desta descrição da doença, até o ano de 2007 esse vírus permaneceu
relativamente desconhecido (FAYE et al., 2013; IOOS et.al, 2014; MACNAMARA,
1954; SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2015).
Atualmente, existem três linhagens de ZIKV conhecidas e descritas: duas de
origem africana e uma asiática (PINTO JUNIOR et al, 2015), porém, ainda há muito
que se compreender a respeito desse vírus (SVS, 2015).
23
1.3 Os Agentes etiológicos da Dengue e da Febre Zika
Quanto aos vírus da dengue, estes contêm quatro sorotipos distintos e
estreitamente relacionados: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 (GUBLER e
CLARCK, 1995; WEAVER e VASILAKIS, 2009), exibindo 65% de homologia em seu
genoma (BURKE e MONATH, 2001). Os DENV são esféricos, possuem envelope
lipídico, bem como um capsídeo de simetria icosaédrica, formando uma partícula
que mede entre 40-50 nm de diâmetro (LUPI, CARNEIRO e COELHO, 2007).
No que se refere ao vírus da febre zika, há apenas um sorotipo desse vírus
descrito até o momento, com ciclo natural de transmissão tanto silvestre quanto
urbana (FAYE et al., 2014).
Os vírus DENV e ZIKV são transmitidos ao ser humano pela picada das
fêmeas do mosquito Aedes infectadas (GUBLER, 2002b; IOOS et al., 2014). O
principal vetor é o Aedes aegypti (FAUCI e MORENS, 2016), artrópode hematófago
bem adaptado às condições de vida humana, embora haja outras espécies, como é
o caso do Aedes albopictus, que também pode transmitir os vírus após ingerir o
sangue de um indivíduo infectado (GUBLER, 2002a; GUZMAN e ISTÚRIZ, 2010;
MUSSO et al., 2014b).
Como todos os flavivírus, os DENV e ZIKV possuem genoma composto por
uma fita simples de RNA, polaridade positiva, contendo cerca de 11.000
nucleotídeos e uma única fase aberta de leitura, flanqueada pelas regiões 5’ e 3’ não
traduzidas (UTR’s), codificando uma única poliproteína (CHAMBERS et al, 1990;
FAYE et al., 2013; SOLOMON e MALLEWA, 2001) que posteriormente é clivada em
proteínas estruturais denominadas de capsídeo (C), pré-membrana (prM) e envelope
(E) e não-estruturais conhecidas respectivamente como NS1, NS2A, NS2B, NS3,
NS4A, NS4B e NS5 (BARONTI et al., 2014; ROTHMAN, 2004) (Figura 1). A 5’ UTR
é relativamente curta (com cerca de 100 nucleotídeos), tem a estrutura de uma
tampa na extremidade 5’, possui um cap terminal e é uma região muito conservada,
enquanto a 3’UTR é mais longa (cerca de 450 nucleotídeos), desprovida de cauda
poli A, além de conter estruturas conservadas (ALVAREZ et al., 2005).
24
Figura 1 - Representação esquemática do genoma dos flavivírus.
Fonte: (Modificado de SAMPATH e PADMANABHAN, 2009).
A proteína C compõe o capsídeo viral, é homodimérica com peso aproximado
de 12 kilodaltons (kDa), no qual cada monômero possui quatro alfahélices (CHANG
et al., 2001). Essa proteína tem uma carga elevada, sendo essencial para assegurar
a montagem dos vírions pelo empacotamento do RNA genômico (MA et al., 2004).
A proteína M está associada à membrana (BASTOS, 2004) e na sua forma
imatura é chamada de prM, onde após passar por processamento por clivagem
durante a maturação das partículas virais dentro da via secretora, se torna M, um
pequeno fragmento proteolítico (8kDa) da proteína precursora prM (de 21kDa)
(RODENHUIS-ZYBERT, WILSCHUT e SMIT, 2010).
A glicoproteína E do envelope é uma estrutura em forma de espícula que se
projeta para fora do envelope viral, sendo a maior dentre as proteínas estruturais do
vírus, possuindo cerca de 57 kDa. É dimérica e é a principal proteína estrutural,
responsável pela indução de anticorpos neutralizantes, e pela adsorção das
partículas virais aos receptores nas células do hospedeiro (LUPI, CARNEIRO e
COELHO, 2007). Além disso, ela promove a fusão entre o envelope viral e a
membrana do endossomo, vesícula que se forma durante o processo de entrada do
vírus na célula, possuindo atividade hemaglutinante (BRICKS, 2004). Cada
monômero dessa glicoproteína é composto de três domínios: I, que forma uma
estrutura barril beta; II, responsável por se projetar na superfície do vírus e III, que
mantém uma conformação semelhante à imunoglobulina, envolvendo-se na
25
interação com receptores celulares que contribuem para entrada do vírion na célula
hospedeira (LINDENBACH, THIEL e RICE, 2007; MODIS et al, 2004).
Em se tratando das proteínas não estruturais, a NS1 é dimérica, N-glicosilada,
com 46 kilodaltons de peso molecular existente nas formas intra e extracelulares
(JACOBS et al., 2000). Essa proteína é altamente conservada e parece ser
essencial para a atividade infecciosa dos vírus (YOUNG et al., 2000). A proteína
NS2A possui 22 kilodaltons, é hidrofóbica e possui envolvimento na coordenação da
mudança entre o empacotamento e a replicação do RNA (KHROMYKH et al., 2001).
A NS2B tem peso de 14 kilodaltons e ao se associar com a membrana forma um
complexo estável com a NS3, atuando como cofator na atividade proteolítica de
clivagem das proteínas não estruturais (FALGOUT et al., 1991). Já a proteína NS3
possui 70 kilodaltons e diversas funções, como por exemplo, atividade nucleotídeo
trifosfatase, RNA helicase e age no processamento de replicação de RNA (LI et al.,
1999). Tanto a proteína NS4A (16 kilodaltons) como a NS4B (24 kilodaltons) são
hidrofóbicas e estão envolvidas no processo de replicação viral e na inibição da
sinalização de interferon (LINDENBACH, THIEL e RICE, 2007). Por fim, a proteína
NS5 é a maior proteína viral, sendo altamente conservada, multifuncional, com
atividade de metiltransferase e atividade de RNA polimerase dependente, possui
103 kilodaltons (FAYE et al., 2014; LINDENBACH, THIEL e RICE, 2007) e é uma
enzima chave para o processo de replicação viral (BALEOTTI, MORELI e
FIGUEIREDO, 2003).
É importante ressaltar que as células mononucleares fagocitárias são os
principais alvos para replicação dos vírus em indivíduos infectados (BUCKLEY e
GOULD, 1988; JESSIE et al, 2004; RODENHUIS-ZYBERT, WILSCHUT e SMIT,
2010).
Esses flavivírus se ligam a receptores presentes na superfície das células do
hospedeiro e em seguida, penetram por endocitose mediada por clatrinas (ARAÚJO
e SCHATZMAYR, 2015). Em seguida ocorre a fusão entre o envelope viral e a
membrana do endossoma com dependência da variação de pH. Em meio ácido,
ocorrem mudanças conformacionais na glicoproteína E, expondo os peptídios
promotores dessa fusão, causando a liberação de nucleocapsídeos virais no
citoplasma da célula hospedeira (CHU e NG, 2004). Posteriormente, ocorre a quebra
26
do capsídeo e inicia-se tradução do RNA mensageiro viral em uma poliproteina que
vai dar origem às proteínas não estruturais e estruturais do vírus. Em seguida ocorre
a transcrição do RNA genômico do vírus, dando origem a uma fita de RNA com
polaridade negativa que vai servir de molde para a replicação do genoma viral, o
qual é transcrito em um único RNA mensageiro, seguido do processo de tradução e
replicação (LINDENBACH e RICE, 2001).
O processo de replicação se dá no lúmen do retículo endoplasmático, onde
capsídeos são montados e os vírions imaturos são formados por brotamento da
membrana da organela na qual estão inseridas as proteínas E e prM de onde o vírus
retira o seu envelope. (HILDE et al., 2007). Posteriormente os vírions são maturados
durante o transporte através das vesículas do complexo de Golgi, onde a proteína E
recebe a glicolisação e a prM é clivada por uma furina, tornando-se M. Por fim, as
partículas virais maduras são liberadas da célula por exocitose (LEYSSEN, CLERCQ
e NEYTS, 2000; STADLER et al., 1997) (Figura 2).
Figura 2 - Replicação dos flavivírus.
Fonte: (Modificado de RODENHUIS-ZYBERT; WILSCHUT e SMIT, 2010).
27
1.4
Vetores
Existem dois importantes mosquitos transmissores da dengue, denominados
Aedes aegypti e o Aedes albopictus (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2011). O
primeiro vetor está distribuído por todas as regiões tropicais e subtropicais do mundo
(COSTA et al, 2005) e o segundo encontra-se estabelecido em muitas partes da
Europa, especialmente nos países mediterrânicos e nas Américas (ABRANTES e
SILVEIRA, 2009).
Quanto ao vírus da febre zika, os vetores transmissores são também os
mosquitos do gênero Aedes, especialmente o Aedes aegypti e o Aedes albopictus
que também tem sido relatado na propagação do ZIKV (IOOS et al., 2014; MUSSO,
NILLES e CAO-LOURMEAU, 2014a), levantando desse modo, a possibilidade de
uma nova ameaça emergente para a saúde humana (GRARD et al., 2014).
Os DENV e ZIKV circulam em florestas infectando os mosquitos do gênero
Aedes e primatas não humanos (HADDOW et al., 2012; MARCONDES e TAUIL,
2011). De modo ocasional, mosquitos peridomésticos podem se alimentar do
sangue de animais selvagens, fazendo o elo entre humanos no ambiente próximo a
suas habitações, contribuindo para a transmissão peri e urbana (FREIRE, 2014)
(Figura 3).
28
Figura 3 – Ciclo de transmissão dos flavivírus.
Fonte: (Adaptado de WEAVER e VASILAKIS, 2009).
1.4.1
Aedes aegypti
O Aedes aegypti, é o principal vetor transmissor da dengue no Brasil e no
mundo (BRAGA e VALLE, 2007; BRICKS, 2004; LUPI, CARNEIRO e COELHO,
2007), tendo sido apontado também como o principal transmissor urbano da febre
zika na África e Ásia (IOOS, et al., 2014). É originário da África subsaariana, onde se
domesticou e se adaptou ao ambiente urbano, tornando-se antropofílico em virtude
da sua estreita relação com o homem (BARRETO e TEIXEIRA, 2008).
Esse vetor chegou às Américas e Ásia transportado por navios e foi
introduzido no Brasil no período colonial, adaptando-se com facilidade nas áreas
tropicais e subtropicais (CONSOLI e LOURENÇO-de-OLIVEIRA, 1994). Em 1955, foi
considerada uma espécie erradicada do Brasil, porém, no final dos anos 60 sua
29
reintrodução no país foi facilitada pelas fronteiras entre os estados da Região Norte
e países como a Venezuela e as Guianas, onde a erradicação do vetor não havia
ocorrido (MARTINS et al., 2010).
A primeira transmissão do vírus Zika por mosquitos do gênero Aedes foi
demonstrada em laboratório no ano de 1956, posteriormente, casos isolados foram
relatados na África e Ásia (NHAN, CAO-LORMEAU e MUSSO, 2014).
De coloração preta e branca, o Aedes apresenta hábitos alimentares diurnos e
pode ser encontrado em áreas domiciliares (onde é mais comum) e peridomiciliares
(GUEDES, 2012; TAUIL, 2001).
A fêmea do Aedes aegypti faz seu repasto sanguíneo ao amanhecer e no final
da tarde (CONSOLI e LOURENÇO-de-OLIVEIRA, 1994; GUBLER, 1998), ou seja,
essa espécie costuma se alimentar mais de uma vez entre duas oviposições
sucessivas, especialmente quando perturbada antes de ter feito a completa
ingurgitação, aumentando a possibilidade de transmissão viral (BARATA et al.,
2001).
A maior preferência do Aedes aegypti é por sangue humano e por esse
motivo, quando o homem está infectado, ao picá-lo, o mosquito adquire o vírus
(TAUIL, 2001). Os vírus se replicam no intestino do vetor artrópode, e se
disseminam para as glândulas salivares e ovários onde podem ser encontrados em
grandes quantidades (LUPI, CARNEIRO e COELHO, 2007). Após um período de
incubação extrínseca que dura de nove a doze dias, o vetor passa a transmitir o
vírus durante todo o seu tempo de vida (MULLER, 2011).
Para depositar seus ovos e formar seus criadouros, o Aedes aegypti se abriga
em locais sombreados e utiliza recipientes que acumulam água de chuvas,
comumente encontrados nos lixos das cidades (CÂMARA et al, 2007). Objetos
utilizados pelo homem em seu domicílio, tais como: pneus, latas, vidros, pratos
vasos, caixas d’água, tonéis, latões, cisternas, também contribuem para proliferação
do vetor (CONSOLI e LOURENÇO-de-OLIVEIRA, 1994).
30
1.4.2
Aedes albopictus
Outro mosquito que tem mostrado potencialidade de transmissão dos vírus
Dengue e Zika é o Aedes albopictus (IOOS et al., 2014; MUSSO et al., 2014b;
ROTH et al., 2012; TAPPE et al., 2014). Oriundo das selvas asiáticas se espalhou
pelo mundo desde a década de 1970 e atualmente pode ser encontrado também
nas Américas, Europa, Oriente Médio, Ilhas do Pacífico, Austrália e África
(MONCAYO et al., 2004; WONG et al., 2013). Considerado vetor secundário da
dengue, (BARRETO e TEIXEIRA, 2008) o Aedes albopictus também é susceptível
aos ZIKV apresentando alto poder de difusão e taxas de transmissibilidade já
observadas (WONG et al., 2013).
Diferentemente do Aedes aegypti, o Aedes albopictus está mais associado à
transmissão viral na área rural ou semiurbana, sendo portanto, menos antropofílico e
mais zoofílico, preferindo ocos de árvores para depositar seus ovos (BRAGA e
VALLE, 2007).
Nos últimos anos, em consequência do intenso comércio intercontinental de
pneus, por intermédio dos transportes marítimos, o Aedes albopictus, descrito
originalmente na Índia (CONSOLI e LOURENÇO-de-OLIVEIRA, 1994), se
disseminou para as Américas, sendo identificado inicialmente no ano de 1985 nos
Estados Unidos (IBÁÑEZ-BERNAL et al., 1997).
No Brasil, o Aedes albopictus foi detectado em 1986, e já está presente em
mais de mil municípios (BARRETO e TEIXEIRA, 2008), mas ainda não foi
incriminado em surtos ou epidemias, apesar de que sob condições experimentais,
esse vetor já demonstrou competência à infecção e a transmissão de outros vinte e
dois arbovírus (MARTINS et al., 2010).
Atualmente, sua competência vetorial vem sendo objeto de investigação, já
que seus hábitos podem estabelecer um elo entre o ciclo dos vírus da dengue e zika
nos primatas não humanos e no homem (IBÁÑEZ-BERNAL et al.,1997;
METSELAAR et al., 1980; TAPPE et al., 2014)
31
Quanto à biologia dos vetores Aedes aegypti e Aedes albopictus, os mosquitos
machos são fitófagos e permanecem próximos aos criadouros, onde ocorrem os
acasalamentos e as fêmeas realizam hematofagia em período diurno (CONSOLI e
LOURENÇO-de-OLIVEIRA, 1994), tendo a capacidade de fazer múltiplas ingestões
de sangue durante um único ciclo gonadotrófico, o que amplia a possibilidade de
infectar-se e de transmitir o vírus (TEIXEIRA, BARRETO e GUERRA, 1999).
A partir do século XIX o combate ao vetor no Brasil foi institucionalizado de
forma sistematizada, quando diversas epidemias de febre amarela urbana ocorriam
no país, levando milhares de pessoas à morte (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).
No final da década de 90 e início do século XXI, uma nova relação entre
humanos e os DENV foi iniciado, após esses sorotipos terem sido globalmente
distribuídos. Essa relação foi facilitada pela convergência gradual de diversos
fatores, tais como a expansão das populações, o aumento da densidade vetorial por
programas de controle insustentáveis, o aumento das viagens comerciais, a
elevação dos índices pluviométricos (WEAVER e VASILAKIS, 2009), além da
inadequada infraestrutura básica urbana (habitação deficiente, reservatórios de água
inadequados, limpeza de lixo insuficiente, etc.), decorrente sobretudo, da migração
rural-urbana nas últimas décadas, bem como da ausência de políticas públicas e a
inexistência de vacinas disponíveis comercialmente, dificultando o controle vetorial
(ALVAREZ et al., 2005; MACIEL, SIQUEIRA JUNIOR e MARTELLI, 2008; MONATH,
2007).
1.5
1.5.1
Doença
Doença causada pelos DENV
A dengue é uma doença com um amplo espectro clínico-patológico que afeta
lactentes, crianças jovens e adultos e na sua forma clássica, se assemelha a gripe
(ARAÚJO et al., 2012). A forma branda é uma das manifestações mais comuns, uma
32
vez que grande parte dos indivíduos infectados pelos DENV apresenta apenas
sintomas leves (MONCAYO et al., 2004). Por esse motivo, os portadores da forma
branda geralmente não costumam procurar o serviço de saúde, consequentemente,
seus casos não são notificados (VASCONCELOS et al., 1998). Quando os pacientes
procuram atendimento, a identificação da doença é feita através de testes
sorológicos feitos em laboratórios para detecção de anticorpos das classes IgM ou
IgG (LUPI, CARNEIRO e COELHO, 2007).
No ano de 2014, o Ministério da Saúde, seguindo recomendação da
Organização Mundial de Saúde, estabeleceu uma nova classificação clínica da
dengue, que consta das seguintes categorias: (1) Dengue sem sinais de alarme, (2)
Dengue com sinais de alarme (3) Dengue grave (Figura 4), sendo que a forma grave
se divide em dois tipos: Febre Hemorrágica da Dengue (FHD) e Síndrome do
Choque da Dengue (SCD) (BRASIL, 2014; WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2009).
A dengue sem sinais de alarme, corresponde a forma anteriormente referida
como dengue clássica que se caracteriza como doença febril inespecífica (atingindo
39-40ºC) com duração de 2 a 7 dias, depois de um período de incubação de 4 a 10
dias após a picada do mosquito infectado (WORLD H HEALTH ORGANIZATION,
2009). A febre é acompanhada geralmente de mal-estar, cefaleia, dor retro orbitária,
mialgia, artralgia e é de tão grande intensidade que recebeu o léxico de ―febre
quebra ossos‖ mas esse quadro melhora logo após o período febril (BRICKS, 2004;
MONCAYO et al., 2004).
A dengue com sinais de alarme ocorre quando há uma piora após o período
febril, com manifestação dos sinais de alarme tais como: dor abdominal intensa e
contínua, vômitos persistentes, hipotenção, redução da diurese, hepatomegalia
dolorosa, sangramento de mucosas, desorientação, aumento de hematócrito e
queda acentuada de plaquetas (BRASIL, 2014). Segundo a Organização Mundial de
Saúde (2009), os sinais de alarme de gravidade da doença ocorrem de 3 a 7 dias
depois dos primeiros sintomas, em conjunto com uma diminuição na temperatura
(abaixo de 38ºC). As próximas 24-48 horas após a fase crítica podem ser letais e por
esse motivo, é necessário cuidado médico adequado para evitar complicações e
risco de morte. (SOUZA et al., 2008; VERDEAL et al., 2011).
33
A forma grave da dengue se divide em: Febre Hemorrágica da Dengue (FHD)
e Síndrome do Choque da Dengue (SCD). A primeira apresenta os mesmos
sintomas da forma clássica, mas depois do terceiro dia, quando a febre já começa a
ceder, aparecem sinais de hemorragia, como sangramento nasal, gengival, vaginal,
ou da pele, em virtude do rompimento de capilares, resultando em petéquias e
hematomas e púrpura trombocitopênica (BRASIL, 2014). O risco de manifestação da
forma hemorrágica é maior quando a prova do laço é positiva. A FHD caracteriza-se
por: febre intensa de 40-41ºC, trombocitopenia (contagem de plaquetas menor ou
igual a 90.000 / mm 3), manifestações hemorrágicas, permeabilidade capilar
excessiva (CARDOSO et al., 2011; HALSTEAD, 1988; VERDEAL et al., 2011),
Na SCD, além dos sintomas observados na dengue clássica, há
extravasamento de plasma com intensa perda de líquido para os tecidos e
cavidades, causando hemoconcentração e coagulação intravascular, insuficiência
circulatória, resultando em choque hipovolêmico, levando muitas vezes à morte
(BRASIL, 2014; MONCAYO et al., 2004). Nas formas graves da doença, também
podem ocorrer manifestações neurológicas como: irritabilidade, psicose, demência,
amnésia delírio, sonolência, além de sintomas, cardiorrespiratórios, insuficiência
hepática, hemorragia digestiva e derrame pleural. Essas diversificações de sintomas
dificultam a precisão no diagnóstico, resultando muitas vezes no tratamento
inadequado por confundirem-se com muitas outras doenças exantemáticas (COSTA,
2009). Por esse motivo, é preciso haver um monitoramento dos sinais de alerta para
o reconhecimento da fase crítica, bem como para identificar uma possível evolução
da doença (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
A infecção por um dos sorotipos da dengue confere imunidade protetora
específica para o sorotipo causador da doença, mas não para os demais sorotipos,
embora haja uma reação cruzada que além de não oferecer proteção, aumenta o
risco da forma grave, ou seja, as pessoas que vivem em áreas endêmicas podem ter
durante suas vidas até quatro vezes a doença (GUBLER, 1998; MACIEL, SIQUEIRA
JUNIOR e MARTELLI, 2008).
34
Figura 4 - Classificação da dengue em níveis de gravidade sugerida pela Organização Mundial de
Saúde.
Fonte: (Modificado de WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
Mesmo diante dos elevados índices de morbidade provocados pelos DENV,
não existe nenhum tratamento específico para dengue clássica. Recomenda-se
repouso e ingestão abundante de líquido. O tratamento é referente aos sintomas.
Portanto, para dores e febre, devem-se utilizar analgésicos e antitérmicos e evitar a
ingestão de medicamentos compostos por ácido acetil salicílico (AAS), pois eles tem
ação anticoagulante (LENZI e COURA, 2004).
1.5.2
Doença causada pelo ZIKV
O ZIKV passa aproximadamente dez dias em incubação extrínseca no
mosquito, enquanto no homem, esse período de incubação varia de 3-6 dias e
pouco tempo depois, surgem os sintomas da infecção (KUTSUNA et al., 2014). A
infecção pelo ZIKV tem curta duração sendo, portanto, autolimitada, mas o tempo da
viremia causada pela febre zika ainda precisa ser melhor esclarecido (LANCIOTTI et
al., 2008).
35
De acordo com a Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde,
estima-se que apenas 18% das infecções humanas resultam em manifestações
clínicas (SVS, 2015). A infecção causada pelo ZIKV é frequentemente assintomática
em cerca de 80% dos casos (BOGOCH et al., 2016). Quando sintomática, a doença
possui uma ampla variedade de aspectos clínicos. Os sintomas podem incluir:
artralgia, febre baixa ou ausência de febre, cefaleia, dor retro orbital, hiperemia
conjuntival, erupções maculopapulares geralmente na cabeça e tronco que se
espalha para os membros, prurido, vertigem, mialgia, distúrbio digestivo (IOOS et al.,
2014), além de fadiga (HADDOW et al., 2012), bem como dor de garganta, tosse e
vômito (TAPPE et al., 2014). Também foi relatado comprometimento do sistema
nervoso central (VASCONCELOS, 2015), porém, os sintomas mais comuns da febre
zika são: febre, cefaleia, mal-estar, exantema maculopapular pruriginoso, fadiga ou
mialgia, artralgia (FAUCI e MORENS, 2016; KUTSUNA et al., 2014), dor lombar
discreta menos intensa que a causada pela febre chikungunya, acometendo mãos,
joelhos e tornozelos (PINTO-JUNIOR et al., 2015).
Os sinais e sintomas da febre causada pelo ZIKV apresentam mais exantema,
hiperemia conjuntival e menor alteração nos leucócitos e trombócitos, se comparado
com outras doenças exantemáticas, como exemplo, a dengue e chikungunya (SVS,
2015), porém, em decorrência das semelhanças quanto à sintomatologia com outras
arboviroses, o diagnóstico da doença pode ser dificultado (GRARD et al., 2014;
MUSSO, CAO-LORMEAU e GUBLER, 2015a).
Apesar de existirem relatos de transmissão ocupacional, perinatal, sexual,
vertical e por transfusão sanguínea, considera-se para fins de ações de prevenção e
controle da doença causada pelo ZIKV, que o principal modo de transmissão seja
vetorial (BESNARD et al., 2014; HAYES, 2009; MUSSO et al., 2014b; MUSSO et al.,
2015b).
A taxa de hospitalizações de pessoas com febre zika é baixa, por esse motivo,
o espectro clínico da doença ainda permanece incerto (KWONG, DRUCE e LEDER,
2013). Contudo, as autoridades de saúde devem estar cientes da importância
epidemiológica
desse
vírus
emergente,
pois,
apesar
das formas
clínicas
apresentadas pela doença serem comuns a outros vírus, o risco de surgimento de
complicações neurológicas na população infectada com o vírus Zika já foi relatado
36
no Japão, Noruega, Itália, Polinésia Francesa (MALLET, VIAL e MUSSO, 2015) e
em Nova Caledônia já foram relatados dois casos de coinfecção por DENV e
ZIKV(DUPONT-ROUZEYROL et al., 2015). No Brasil, quadros graves associados ao
ZIKV também têm sido descritos, incluindo comprometimento do sistema nervoso,
tais como: síndrome de Guillain-Barré, mielite transversa, meningite e microcefalia
(VASCONCELOS, 2015).
A microcefalia é uma má formação congênita na qual o cérebro não se
desenvolve adequadamente, ou seja, os bebês ficam com perímetro encefálico
menor que o normal, que habitualmente é superior a 33 centímetros (BRASIL,
2015b). Um relatório preliminar brasileiro indicou que anormalidades fetais
detectadas por ultrassonografia estavam presentes em 29% das mulheres com
infecção pelo vírus Zika durante o período gestacional e o primeiro trimestre de
gravidez é o de maior risco de o bebê nascer com microcefalia (PETERSEN et al.,
2016).
O defeito congênito causador dessa má formação pode ser decorrente de uma
série de fatores de diferentes origens além dos vírus, como as substâncias químicas,
agentes biológicos como bactérias e radiação (BRASIL, 2015b). Em outubro de
2015, no nordeste do Brasil houve um significativo aumento no número de bebês
nascidos com microcefalia (EUROPEAN CENTRE FOR DISEASE PREVENTION
AND CONTROL, 2016). Logo em seguida, outros estados do Nordeste, tais como o
Rio Grande do Norte e a Paraíba, também começaram a perceber um aumento da
incidência dos casos dessa doença, além dos registros de abortos e natimortos
(OLIVEIRA e VASCONCELOS, 2016) e a partir de investigações clínicas e
epidemiológicas, foi levantada a hipótese de que a microcefalia estava associada à
infecção causada pelo ZIKV, baseando-se nos seguintes fatores: quantidade de
casos ocorridos em pouco tempo provenientes de diversos estados, demonstrando
altas taxas de ataque e rápida dispersão (fenômeno associado com doenças
transmitidas por artrópodes). Além disso, a maioria das mães tiveram sintomas
compatíveis com a febre zika no primeiro trimestre de gravidez, período em que o
surto de ZIKV ocorreu e que não havia correlação com histórico de doença genética
na família ou exames com padrão de outros processos infecciosos conhecidos
(OLIVEIRA e VASCONCELOS, 2016). Diante desse cenário, a principal suspeita
recaiu sobre o vírus Zika, uma vez que os vírus Dengue não estão associados à má
37
formações e o ZIKV tem maior neurotropismo que os outros arbovírus (BRITO,
2015). Posteriormente, o Instituto Evandro Chagas isolou o ZIKV do cérebro de um
recém-nascido proveniente do Ceará que evoluiu a óbito após o nascimento e, ao
ser feita a detecção desse vírus no líquor, cérebro e fragmentos de coração, pulmão,
fígado, baço e rim (BRASIL, 2015e). Esses resultados foram reforçados com a
detecção de anticorpos IgM para ZIKV no líquor de doze crianças que nasceram
com microcefalia. Além disso, o vírus Zika foi identificado no líquido amniótico de
duas gestantes da Paraíba com histórico de doença exantemática e em fetos com
microcefalia detectados na ultrassografia fetal (OLIVEIRA e VASCONCELOS, 2016).
Tudo isso mostra o quanto é necessário continuar realizando mais pesquisas
voltadas para esses flavivírus e por esse motivo, recomenda-se que em casos
suspeitos das doenças por eles causadas, seja freito além do diagnóstico clínico,
testes laboratoriais para confirmação dos vírus circulantes (DUPONT-ROUZEYROL
et al., 2015).
Apesar do crescente número de casos da febre zika, não existe nenhum
tratamento específico para a doença. Recomenda-se repouso e ingestão de
bastante líquido (SVS, 2015) e mulheres grávidas devem ter maior precaução para
evitar a picada do vetor, devido a confirmação da relação do ZIKV e a microcefalia
(FAUCI e MORENS, 2016). Em casos sintomáticos, é aconselhável o uso de
paracetamol ou dipirona para controle febril e manejo da dor (SVS, 2015), porém, a
utilização destes medicamentos deve ser criteriosa para evitar a indução de efeitos
adversos, como por exemplo, alergias (PINTO-JUNIOR et al., 2015). Não deve ser
utilizado o ácido acetilsalicílico e outros anti-inflamatórios em função do risco
aumentado de complicações hemorrágicas (SVS, 2015).
38
1.6
1.6.1
Diagnóstico
Diagnóstico laboratorial Dengue
Diante do atual cenário da dengue, o diagnóstico correto da doença é uma
ferramenta fundamental para a compreensão de surtos e epidemias. Os métodos de
diagnóstico laboratoriais mais utilizados envolvem: o isolamento viral realizado
através do cultivo em células do mosquito Aedes albopictus clone C6/36, como
método mais utilizado (GUZMÁN e KOURÍ, 2004), detecção do ácido nucléico viral
através da transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RTPCR), transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo
real (qRT-PCR), técnicas sorológicas para pesquisa de anticorpos específicos e
detecção de antígenos virais, como é o caso do teste de detecção do antígeno NS1
ARAÚJO, 2006; LIMA et al, 2011).
A fim de fornecer informações oportunas para o cuidado do paciente, é
necessário que o diagnóstico da infecção seja feito nos primeiros dias de início dos
sintomas, no intuito de determinar o tipo viral, favorecendo os estudos de vigilância
para execução de medidas de controle da doença (ALCON et al., 2002).
O diagnóstico sorológico é provável quando o paciente apresenta os sintomas
da doença e tem IgM positivo (GUBLER, 1998). O MAC-ELISA tornou-se o teste
sorológico mais utilizado no diagnóstico da dengue nos últimos anos e sua grande
vantagem é que ele exige apenas uma mostra de soro para detecção de anticorpos
(DIAS et al., 2010). Além disso, é um teste simples, rápido, requer um equipamento
não muito sofisticado e possibilita a detecção de IgM antidengue através de ensaio
imunoenzimático (GUZMÁN e KOURÍ, 2004). A IgM é identificável na fase aguda da
dengue (após o quinto dia) enquanto a IgG também utilizada nas pesquisas
sorológicas, aparece um pouco mais tarde em casos de infecções primárias,
podendo ser detectável por vários anos. Nas infecções secundárias da dengue, a
IgG já é encontrada na fase aguda da doença (SILVA, 2008).
39
A detecção do genoma viral através da transcrição reversa seguida da reação
em cadeia pela polimerase (RT-PCR) é outra forma de diagnóstico, gerando um
resultado rápido, além de ser uma técnica sensível, capaz de detectar e identificar
todos os quatro sorotipos simultaneamente por meio da amplificação um segmento
do genoma viral (LANCIOTTI et al, 1992; MIAGOSTOVICH et al., 1997). Há também
a transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo real
(qRT-PCR), caracterizada por apresentar uma maior precisão, especificidade,
sensibilidade e rapidez nos resultados, sendo bastante utilizada para quantificação
viral (ARAÚJO et al., 2009).
Outro método de diagnóstico que está sendo bastante difundido é o teste que
visa a detecção da proteína não estrutural NS1, pesquisada como antígeno viral de
produção precoce, sendo considerado um teste rápido e que permite fazer o
diagnóstico antes da detecção de IgM. O antígeno NS1 pode ser detectado no soro
do paciente a partir do início dos primeiros sintomas da doença causada pelos
DENV, por meio do ensaio imunoenzimático (ELISA) (ALCON et al., 2002). Esse
teste propicia o diagnóstico da dengue tanto primária, quanto secundária e os kits
contendo anticorpos anti-NS1 encontram-se disponíveis comercialmente (LIMA et
al., 2011).
1.6.2
Diagnóstico laboratorial Zika
Os testes laboratoriais utilizados para identificação da infecção por ZIKV
englobam o isolamento viral, considerado como ―padrão ouro‖ em pesquisas virais,
no entanto, ele possui a desvantagem de apresentar baixa viremia (IOOS et al.,
2014) e requer mais de 10 dias para realização do diagnóstico (FAYE et al., 2013).
Assim, a detecção do RNA viral em amostras de soro, urina e saliva na fase aguda
da doença, utilizando a técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia
pela polimerase (RT-PCR) descrita por Lanciotti et al. (2008), é um método mais
sensível e mais rápido que o isolamento viral (BALM et al., 2012; GOURINAT et al.,
2015; MALLET, VIAL e MUSSO, 2015; MUSSO et al., 2015d). Contudo, a
transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo real
40
(qRT-PCR) é o método mais indicado para o diagnóstico do ZIKV por ser mais
sensível, rápido, específico, além de fazer a quantificação do material genético viral
(IOOS et al., 2014). Outras formas de diagnóstico envolvem os testes sorológicos,
tais como: ELISA para detecção de anticorpos específicos IgM ou IgG contra o vírus
Zika (HAYES, 2009) ou a imunofluorescência, ambos são bastante utilizados fora do
Brasil, porém, esses métodos apresentam uma limitação que é a possibilidade de
haver reação cruzada com outros flavivírus, resultado em resultados falso-positivos
(IOOS et al., 2014). No Brasil, o diagnóstico laboratorial para confirmação do vírus
Zika ocorre através da transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela
polimerase (RT-PCR) convencional ou em tempo real (qRT-PCR). Atualmente o
laboratório o Instituto Evandro Chagas, bem como o Instituto Oswaldo Cruz, vem
desenvolvendo ensaios sorológicos para detecção de anticorpos específicos para o
ZIKV (SVS, 2015). Isso se faz necessário, uma vez que muitos casos da doença têm
sido identificados em outros estados do país sem condições de realização da RTPCR, pois o equipamento utilizado para realização desta técnica, não é amplamente
disponibilizado pelo Sistema Único de Saúde. Por este motivo, é importante o
desenvolvimento de testes sorológicos, uma vez que o diagnóstico do ZIKV não
pode ser baseado apenas em aspectos clínicos e epidemiológicos (CAMPOS,
BANDEIRA e SARDI, 2015).
1.7
1.7.1
Aspectos epidemiológicos - Dengue
Dengue no mundo
A dengue é considerada a doença de maior transmissão vetorial com elevado
crescimento mundial (MACIEL, SIQUEIRA JUNIOR e MARTELLI, 2008). Estima-se
que aproximadamente 2,5 bilhões de pessoas correm o risco de contrair a doença
em todo o mundo (BRICKS, 2004; LIMA et al., 2011; MONCAYO et al., 2004;
WEAVER e VASILAKIS, 2009) e atualmente ela é vista como uma doença
endêmica, presente em mais de 100 países nas Américas, África, Sudeste da Ásia,
41
Leste do Mediterrâneo e no Oeste do Pacífico (Figura 5)(LUPI, CARNEIRO e
COELHO, 2007). A cada ano, estima-se em nível de escala global que infecções
pelo vírus da dengue sejam responsáveis por mais de 100 milhões de casos da
dengue clássica e mais de 500 mil casos de dengue hemorrágica (MONATH, 1994;
OLIVEIRA et al., 2011), provocando 22.000 mortes, principalmente em crianças
(GUBLER, 2002a; LIMA et al, 2011). Apesar disto, a real prevalência da doença não
é bem conhecida, uma vez que a notificação em países menos desenvolvidos ainda
é considerada insatisfatória (HALSTEAD, 2006).
Figura 5 – Países ou áreas de risco para os DENV.
Fonte: (Adaptado de MURRAY; QUAM e WILDER-SMITH, 2013).
A primeira pandemia global de dengue possivelmente teve início nas regiões
da Ásia e do Pacífico, onde a primeira epidemia foi relatada em 1779-1780. As
mudanças ecológicas e a intensificação dos transportes marítimos ocorridas desde
então, possivelmente favoreceram a expansão geográfica do vetor, bem como a
quantidade de mosquitos Aedes no mundo (FARES et al., 2015).
42
1.7.2
Dengue nas Américas
Em 1953-1954, foi relatada a primeira epidemia de Febre Hemorrágica da
Dengue (FHD) e esta ocorreu em Manila nas Filipinas, posteriormente a doença
atingiu Bankok na Tailândia em 1958, chegando à Cingapura e Vietnã na década de
60 (GUBLER, 2002b). Nesta mesma década, apenas quatro países relataram casos
de infecção pelos DENV (BARRETO e TEIXEIRA, 2008). Apesar disto, nas décadas
de 1950-1970, as epidemias de dengue foram raras em decorrência dos programas
de erradicação do vetor Aedes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001). Porém, a partir do
momento em que não houve continuidade destes trabalhos, constantes epidemias
ressurgiram (GUZMAN e ISTÚRIZ, 2010) e isto foi demonstrado na década de 1980,
quando vinte e cinco países do continente americano relataram a circulação dos
DENV, pois até 1979 o maior número de países atingidos pela doença eram nove
(BARRETO e TEIXEIRA, 2008).
Atualmente, a infecção pelo vírus Dengue está presente desde os Estados
Unidos da América até o Uruguai, com exceção apenas do Canadá e do Chile, por
razões climáticas e de altitude (BARBOSA et al., 2012).
1.7.3
Dengue no Brasil
No Brasil, há referências de ocorrência da dengue desde o ano de 1916 em
São Paulo e depois na década de 1920, no Rio de Janeiro (CLARO, TOMASSINI e
ROSA, 2004). Neste mesmo estado, relata-se que no ano de 1846 ocorreu uma
epidemia de dengue no país (FIGUEIREDO, 2000). Em 1958, o Brasil foi
considerado livre do Aedes aegypti. Houve relatos da presença do vetor no ano de
1967 nas cidades de São Luís e Belém, mas o vetor foi logo eliminado. Também é
descrito que a reinfestação do Aedes aegypti no país ocorreu no ano de 1976, com
foco em Salvador (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001) e no ano seguinte, a
reinfestação atingiu o Rio de Janeiro e a cidade de Santos em São Paulo (REBÊLO
43
et al., 1999). Contudo, nenhuma dessas informações apresentou diagnóstico
laboratorial que pudesse comprovar tais relatos. A primeira documentação clínica e
laboratorial referente à reintrodução da doença no Brasil ocorreu em 1982, quando
houve uma epidemia na cidade de Boa Vista (Roraima) causada pelos sorotipos da
dengue (DENV 1 e 4) com cerca de onze mil pessoas infectadas (COSTA e
FAÇANHA, 2011; OSANAI et al., 1983). Posteriormente, a circulação de três dos
quatro sorotipos existentes foi detectada pela primeira vez no estado do Rio de
Janeiro, sendo eles: DENV-1, surgido no ano de 1986 e isolado em Nova Iguaçu
(BARRETO e TEIXEIRA, 2008; NOGUEIRA et al., 1988), DENV-2, detectado em
1990 (NOGUEIRA et al., 1990) e DENV-3 surgido no ano 2000 (NOGUEIRA et al.,
2001; PIRES NETO et al., 2005). Apesar desta informação, a introdução do sorotipo
3 foi confirmada apenas em janeiro de 2001, através de um isolamento viral feito
com uma amostra biológica coletada de um indivíduo que havia adoecido em
dezembro do ano anterior (NOGUEIRA et al., 2005). O fato da cidade do Rio de
Janeiro estar próxima dos grandes centros urbanos e possuir um intenso fluxo de
pessoas, o controle do Aedes foi dificultado, contribuindo para a dispersão da
doença, alcançando posteriormente outros estados brasileiros (MACIEL, SIQUEIRA
JUNIOR e MARTELLI, 2008).
O DENV-4 ressurgiu no país em 2010 nos municípios de Boa Vista e Cantá no
Estado de Roraima, espalhando-se posteriormente para diversas regiões do país
(SOUZA et al., 2011).
Atualmente, a dengue está presente nas 27 unidades da Federação, com mais
de três milhões de casos notificados entre os anos de 1998 e 2007. Isso representa
78% de todos os casos nas Américas e 61% de todos os casos referidos pela
Organização Mundial da Saúde, fazendo do Brasil um dos países com maiores taxas
de incidência da doença (BARBOSA et al., 2012).
44
1.7.4
Dengue no Rio Grande do Norte
Durante mais de vinte anos a dengue tem sido um problema de saúde pública
no Estado do Rio Grande do Norte (RN). Além disto, o Estado é considerado o
segundo lugar no Nordeste em termos de registros de casos da doença, uma vez
que o primeiro é o Ceará (NASCIMENTO, PETTA e FARIAS, 2009).
As primeiras notificações de dengue no Rio Grande do Norte ocorreram no
ano de 1994, no município de Assu (CUNHA et al., 1999). Em 1996, vários
municípios do RN registraram a ocorrência de casos da doença. Os anos de 2001 e
2008 foram marcados por dois picos epidêmicos de dengue no Estado: inicialmente,
com a cocirculação dos DENV-1 e DENV-2 até 2002 e em seguida, com o
aparecimento do DENV-3 (BARBOSA et al., 2012). No ano de 2010, detectou-se a
cocirculação dos sorotipos DENV-1, DENV-2 e DENV-3 no Estado. Em 2011 ocorreu
a cocirculação dos DENV-1, DENV-2 e a introdução do DENV-4 e em 2012, apenas
este sorotipo foi detectado no Rio Grande do Norte (BRANCO et al., 2015). Nos
anos de 2013 e 2014 através de um estudo feito sobre a epidemiologia e
caracterização molecular dos vírus da dengue no RN, constatou-se a cocirculação
dos DENV-1, DENV-2 e DENV-4 durante os dois anos de estudo (SOUSA, 2015).
Esses estudos demonstraram que epidemias frequentes da doença vêm
ocorrendo, com anos epidêmicos e surtos de grande proporção, provocando
sobrecarga na demanda da rede pública de saúde (BARBOSA et al., 2012).
Atualmente, 95 municípios do RN apresentam alta incidência da dengue,
requerendo bastante atenção por parte dos profissionais da saúde (GOVERNO DO
ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE, 2015a).
45
1.8
1.8.1
Aspectos epidemiológicos – Febre Zika
Febre Zika no mundo
A partir de 1952, evidências de infecção humana foram relatadas em vários
países africanos, tais como: Uganda, Tanzânia, Egito, República Centro Africana,
Serra Leoa e Gabão, além de haver relatos também em partes da Ásia: Índia,
Malásia, Filipinas, Tailândia, Vietnã, Indonésia, Camboja, Malásia Oriental
(SECRETARIA DE ESTADO DE SAÚDE DE MINAS GERAIS, 2015; PETERSEN et
al., 2016). Países asiáticos como: Índia, Malásia, Filipinas, Tailândia, Vietnã e
Indonésia também tiveram casos evidenciados da febre zika (BRASIL, 2016b), mas
até o ano 2000, apenas alguns casos de zika haviam sido relatados (DIALLO et al.,
2014). Em 2007, ocorreu o primeiro surto epidêmico de ZIKV em Yap Island
(Micronésia), que gerou 108 casos de infecção (DUFFY et al., 2009; FAYE et al.,
2011; IOOS et al., 2014) e esta foi a primeira transmissão documentada da doença
fora da área endêmica África e Ásia (HAYES, 2009; HONG e KIM, 2014). Desde
então, a febre zika é considerada emergente em outros países (IOOS et al., 2014).
Em 2011 a doença surgiu no Senegal (DIALLO et al., 2014) e em 2013 ela
atingiu Nova Caledônia e as Ilhas Cook localizadas na Oceania, causando
epidemias (MUSSO, NILLES e CAO-LORMEAU, 2014a). Neste mesmo ano, um
caso importado da Indonésia para Austrália e outro da Tailândia para o Canadá
foram diagnosticados em viajantes, além de ter ocorrido um surto na Polinésia
Francesa com mais de 361 casos confirmados (TAPPE et al., 2014). Em janeiro de
2014, foram relatados os primeiros casos autóctones da febre zika em Nova
Caledônia (IOOS et al., 2014).
Os ZIKV já foram descritos em mosquitos, primatas e seres humanos nos
continentes da: África, Ásia e Oceania (IOOS et al., 2014) e em 2015, casos
autóctones desse vírus também foram identificados nas Américas (ECDC, 2015a;
PINTO JUNIOR et al., 2015; FAUCI e MORENS, 2016; HAMEL et al., 2016) (Figura
6).
46
Figura 6 – Distribuição geográfica do ZIKV.
Fonte: (HAMEL et al., 2016).
Há registro de circulação esporádica do ZIKV na África (Nigéria, Tanzânia,
Egito, África Central, Serra Leoa, Gabão, Senegal, Costa do Marfim, Camarões,
Etiópia, Quénia, Somália e Burkina Faso), na Ásia (Malásia, Índia, Paquistão,
Filipinas, Tailândia, Vietnã, Camboja, Índia, Indonésia) e Oceania (Micronésia,
Polinésia Francesa, Nova Caledônia/França e Ilhas Cook). Casos importados de
ZIKV também foram descritos na Alemanha, Itália, Japão, Estados Unidos e Ilha de
Páscoa (BRASIL, 2016b).
1.8.2
Febre Zika nas Américas
Em 2013, após ter viajado para a Polinésia Francesa, um americano
apresentou alguns sintomas de doença causada por arbovírus e após testes
47
sorológicos, foi diagnosticado que ele havia sido infectado pelo ZIKV (SUMMERS,
ACOSTA e ACOSTA, 2015).
Após epidemia na Polinésia Francesa, o surto de zika disseminou-se para
ilhas do Pacífico, dentre elas, a Ilha de Páscoa no Chile onde foi identificado no ano
de 2014, o primeiro caso de febre zika registrado na América do Sul (GOVERNO DO
ESTADO DE SÃO PAULO, 2015). Suspeita-se que a introdução desse vírus ocorreu
entre os participantes que vieram de vários lugares (dentre esses, pessoas da
Polinésia Francesa) para uma festival anual na Ilha de Páscoa (MUSSO, 2015c).
Após essa introdução, novos casos foram identificados na região (SVS, 2015).
Em maio de 2015 ocorreu a confirmação de casos autóctones transmitidos
pelo ZIKV no Brasil e em outubro do mesmo ano, a Colômbia também registrou a
primeira transmissão autóctone do vírus Zika (PETERSEN et al., 2016). Nos Estados
Unidos, Haiti, El Salvador, Honduras e Guatemala também foram relatados casos de
transmissão do ZIKV (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION,
2016).
1.8.3
Febre Zika no Brasil
No mês de Junho do ano de 2014, ocorreu no Brasil a competição da Copa do
Mundo de Futebol e, embora nenhum país do Pacífico tivesse participado desse
campeonato, propõe-se que o ZIKV possivelmente foi introduzido no Brasil durante
esse evento, sendo considerada a principal hipótese para introdução desse vírus no
país (SVS, 2015; VASCONCELOS, 2015). Em agosto do mesmo ano também houve
no Brasil, precisamente no Rio de Janeiro, um campeonato mundial de canoagem,
no qual representantes de quatro países do Pacífico (onde o vírus Zika já era
circulante) estavam competindo em diversas categorias. Em decorrência dessa
segunda competição mundial, presumia-se que o ZIKV poderia ter sido introduzido
no Brasil durante esse evento. Esta foi portanto, a segunda hipótese cogitada para
introdução do ZIKV no país (MUSSO, 2015c).
48
Em Fevereiro de 2015, sete meses após, o Ministério da Saúde passou a
investigar casos da síndrome exantemática indeterminada (SVS, 2015), afetando
seis diferentes estados da região Nordeste do país: Maranhão, Pernambuco,
Sergipe, Paraíba, Rio Grande do Norte e Bahia (ECDC, 2015a). No mês de março,
foi relatado um surto de uma doença possivelmente causada por ZIKV em Camaçari
na Bahia e no dia 26 do mesmo mês, obtiveram o soro de 24 pacientes que
receberam diagnóstico presuntivo de uma doença viral aguda. Foram feitos testes
sorológicos para detecção dos vírus DENV e, posteriormente, as amostras de soro
foram encaminhadas para a Universidade da Bahia para serem submetidas às
técnicas moleculares, no intuito de detectar cinco vírus: Dengue, Chikungunya,
Mayaro, West Nile e Zika (CAMPOS, BANDEIRA e SARDI, 2015).
No dia 15 de maio de 2015, o Ministério da Saúde confirmou a circulação dos
primeiros casos de ZIKV no Brasil após identificação desse vírus em 16 amostras de
soro provenientes dos estados da Bahia e do Rio Grande do Norte. Esse
acontecimento deixou a população brasileira em estado de alerta (BRASIL, 2015a).
No dia 20 de maio, foi confirmado pelo Instituto Adolf Lutz, um caso de infecção de
um paciente que recebeu uma transfusão sanguínea de um doador em período de
incubação, em Sumaré, São Paulo (ECDC, 2015a; VASCONCELOS, 2015). Depois
da confirmação de ZIKV na Bahia, no Rio Grande do Norte e em São Paulo, o
mesmo vírus foi confirmado por métodos moleculares circulando em: Alagoas,
Maranhão, Pará, Rio de Janeiro (VASCONCELOS, 2015), Roraima, Pernambuco,
Ceará, Paraíba, Paraná, Piauí (BRASIL, 2015c), Amazonas, Rondônia, Tocantins,
Mato Grosso e Espírito Santo (ECDC, 2015b), além de Goiás, Minas Gerais, Distrito
Federal e Mato Grosso do Sul (BRASIL, 2016a).
Quanto à microcefalia, desde o momento em que as investigações foram
iniciadas, dia 22 de outubro do ano de 2015 até o dia 23 de janeiro de 2016 – 830
municípios de 24 unidades da federação foram registrados com suspeita da doença.
A região Nordeste concentra 86% dos casos notificados, sendo que Pernambuco
continua com o maior número de casos que permanecem em investigação (1.125),
seguido dos estados da Paraíba (497), Bahia (471), Ceará (218), Sergipe (172),
Alagoas (158), Rio Grande do Norte (133), Rio de Janeiro (122) e Maranhão (119),
49
porém, entre o total de casos suspeitos, 6 tiveram confirmação dessa má formação
com o ZIKV (BRASIL, 2016a).
1.8.4
Febre Zika no Rio Grande do Norte
O Rio Grande do Norte foi um dos primeiros estados da federação a registrar a
ocorrência de casos de uma doença exantemática, com sintomas semelhantes aos
da dengue na sua forma leve se diferenciando no entanto desta, por cursar com
febre baixa com no máximo dois dias de duração, mas principalmente, por não
apresentar a plaquetopenia característica da dengue, mesmo em sua forma mais
leve (VASCONCELOS, 2015). Apesar de alguns pacientes apresentarem teste de
IgM positivo para dengue, os médicos especialistas contestavam esse resultado,
argumentando
que
a
clínica
não
era compatível com
a febre dengue.
Posteriormente, o número de casos da doença exantemática cresceu rapidamente
na cidade de Natal, causando uma grande procura pelos serviços de saúde da
cidade, o que despertou atenção de todas as autoridades de saúde do estado que
se mobilizaram na tentativa de esclarecer a etiologia daquela epidemia em curso.
Inicialmente suspeitou-se de infecção pelo vírus Chikungunya, uma vez que, casos
da doença causada por esse agente etiológico haviam sido relatados no município
de Feira de Santana na Bahia. Contudo, todas as tentativas de detecção do vírus
Chikungunya no sangue desses pacientes, realizadas tanto ao nível local, quanto no
Instituto Evandro Chagas no Pará, falharam em detectar a presença desse vírus por
qRT-PCR. Cerca de um mês depois, foi detectada pela técnica de qRT-PCR, uma
sequência específica do vírus Zika nas amostras provenientes dos estados onde
estava ocorrendo o surto epidêmico da doença exantemática, até então de causa
desconhecida (FONTOURA, 2015).
Entre as 16 amostras positivas para o ZIKV, oito eram provenientes do Estado
do RN (GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO, 2015). A confirmação dos casos
foi feito pelo Instituto Evandro Chagas (ECDC, 2015a) através da amplificação do
material genético e posterior sequenciamento do genoma viral (FONTOURA, 2015).
Até o dia 26 de maio do mesmo ano, um total de 18 casos positivos para o ZIKV
50
foram confirmados, sendo dezesseis provenientes do município de Natal e dois do
município de São Gonçalo do Amarante (GOVERNO DO ESTADO DO RIO
GRANDE DO NORTE, 2015b).
Quanto à microcefalia, somente no Rio Grande do Norte, até o mês de janeiro
de 2016, foram registrados 188 casos suspeitos da doença. Entre as notificações, 3
foram na fase intrauterina, 181 nascidos vivos, 2 nascimortos e 2 abortos. Durante
esse período ocorreram 16 óbitos e entre as notificações, 61 casos foram
confirmados (GOVERNO DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE, 2016).
1.9
1.9.1
Controle e vacina
Da Febre Dengue
As medidas de controle da dengue estão concentradas, principalmente no
combate ao vetor (TAUIL, 2002). Também não existem antivirais específicos para
tratamento da doença. Assim, prevenir e controlar a dengue torna-se algo cada vez
mais problemático, uma vez que os vetores vivem em contato íntimo com os
hospedeiros humanos (GUBLER, 2011). Por isso, é fundamental o esclarecimento
da sociedade para que ela atue junto aos órgãos públicos na prevenção dos
mosquitos, já que o principal local onde o vetor da dengue se reproduz é no
ambiente domiciliar (DIAS et al., 2010).
Diversos esforços têm sido feitos no que se refere ao desenvolvimento de
vacinas eficazes para controle da doença (MONATH, 1994). Há mais de 50 anos as
pesquisas em busca de imunizantes contra a dengue foram iniciadas. No momento
em que reconheceram os casos graves da doença e desde a década de 70, são
patrocinados diversos estudos para obtenção dessas vacinas (BRICKS, 2004).
Uma vacina considerada boa para prevenção da dengue deve ser: eficaz para
pelo menos três dos quatro sorotipos (porém, o melhor é uma vacina tetravalente),
51
ser segura, de baixo custo e que induza proteção por pelo menos dez anos
(GUBLER, 2011). O progresso com as vacinas tem sido promissor e encontra-se em
fase de testes clínicos, as vacinas de vírus atenuado, quiméricas, vacinas de vírus
inativados e as que utilizam subunidades de DNA (GUBLER, 2011; HERNÁNDEZÁVILA e SANTOS-PRECIADO, 2016).
A vacina que se encontra em fase mais avançada é denominada
Denguevaxia® e pertence à empresa Sanofi Pasteur, desenvolvida inicialmente pela
empresa de biotecnologia Acambis (SILVA, 2012). Trata-se de uma vacina
quimérica tetravalente (CYD-TDV), na qual os genes da prM e do E de cada sorotipo
dos DENV são inseridos no envelope do vírus vacinal da febre amarela (FA)17D, em
substituição aos mesmos genes do vírus da febre amarela (FLIPSE e SMIT, 2015).
Os resultados obtidos através dessa vacina na fase 2b em crianças na Tailândia
revelaram que apesar de induzir altos níveis de anticorpos neutralizantes contra os 4
sorotipos da dengue, não houve proteção contra o DENV-2 (SABCHAREON et al.,
2012) e por esse motivo, a eficácia alcançada por essa vacina ficou em 56,5%
(GALLER; BONALDO e ALVES, 2015).
Já na América Latina, essa vacina foi
testada em crianças de cinco países, dentre eles, o Brasil, que apresentou eficácia
em 60,8% para os quatro sorotipos, conferindo maior proteção contra o sorotipo
DENV-4 e menor contra o DENV-2 (VILLAR et al., 2015). O registro dessa vacina foi
aprovada no país pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária, requerendo ainda a
definição do valor de cada dose pela Câmara de Regulação do Mercado de
Medicamentos para posterior comercialização (BRASIL, 2015d).
Espera-se que dentro de mais alguns anos, outras vacinas estejam
disponíveis,
suplementando
a
quimérica.
No
Brasil
existem
dois
centros
desenvolvendo a vacina contra a dengue: o Instituto Butantan em São Paulo e a
FIOCRUZ Biomanguinhos no Rio de Janeiro (SILVA, 2012).
1.9.2 Da Febre Zika
A redução da densidade vetorial e a prevenção contra picada de mosquitos do
gênero Aedes são formas de prevenir a febre zika (RODRÍGUEZ-MORALES, 2015).
52
Em nível coletivo, é importante prevenir a doença removendo possíveis focos larvais
do vetor. Já a proteção individual ocorre através da limpeza do ambiente domiciliar
para evitar possíveis focos do Aedes, além do uso de repelentes, mosquiteiros e
roupas de proteção contra picada do mosquito que também são fundamentais
(NHAN, CAO-LORMEAU e MUSSO, 2014). É importante ressaltar a necessidade de
melhorar o controle vetorial nos municípios infestados com Aedes aegypti, já que
olhando apenas para o Brasil, essa espécie está associada à transmissão da febre
dengue, chikungunya e zika, ocasionando um enorme desafio para a vigilância
epidemiológica em reconhecer precocemente as novas áreas com transmissão
vetorial, no intuito de minimizar o impacto dessas doenças na população
(VASCONCELOS, 2015).
No que se refere à vacinação, até o momento não há vacina disponível
comercialmente para imunização contra o ZIKV, nem mesmo drogas antivirais para
combater a doença e por esse motivo, não existem medidas de controle específicas
para o homem (SVS, 2015).
53
2
JUSTIFICATIVA
Desde o surgimento da dengue no Estado, fato ocorrido no ano de 1994, o Rio
Grande do Norte sofre sucessivas epidemias da doença (BARBOSA et al., 2012) e,
mesmo assim, o perfil epidemiológico dos DENV ainda é pouco conhecido, uma vez
que os estudos ainda são reduzidos, frente à proporção de casos existentes no
Estado. Os estudos desenvolvidos por Cunha et al. (1999), Barbosa et al. (2012),
Branco et al. (2015) e o estudo realizado por Sousa (2015) são as poucas
referências encontradas sobre a dengue no Rio Grande do Norte. Aliado a essa
carência de publicações científicas, os dados contidos nos boletins epidemiológicos
provenientes da Secretaria de Saúde Pública e do Ministério da Saúde apresentam
informações limitadas. Além disto, casos de subnotificações da doença também
ocorrem, principalmente quando há circulação de mais de um arbovírus, pois eles
causam características clínicas similares nos pacientes, requerendo maior empenho
dos profissionais de saúde para realizarem o diagnóstico diferencial das doenças
(FAYE et al., 2013). Consequentemente, todos esses fatores geram dificuldades na
obtenção de análises precisas sobre a situação da dengue no RN.
Apesar dos DENV circularem no Estado há mais de duas décadas, as
pesquisas utilizando técnicas moleculares para detecção desse vírus tiveram início
apenas no ano de 2009, através da realização do isolamento viral feito pelo
Laboratório Central Doutor Almino Fernandes, para diagnóstico da febre dengue.
Porém, a implantação desta técnica só foi firmada em 2010 e no mesmo ano, o
Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer da UFRN
consolidou a técnica de RT-PCR para fins de pesquisa dessa doença.
No que concerne à febre zika, até os primeiros dias do mês de maio de 2015,
o Ministério da Saúde não havia confirmado nenhum caso desta doença no Brasil,
tampouco no Rio Grande do Norte, embora já houvesse suspeita clínica da infecção
(BRASIL, 2015a). Para detecção e confirmação dos casos suspeitos de ZIKV, o
Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer padronizou a
técnica qRT-PCR e, apesar de poucos meses de sua implantação, já foram
analisadas 348 amostras com suspeitas da infecção causada por esse vírus. Quanto
54
à febre dengue, essa doença continua necessitando de monitoramento para evitar
futuras epidemias no Estado do Rio Grande do Norte. Por esses motivos, é
fundamentalmente importante compreender os aspectos epidemiológicos da febre
dengue e da febre zika para nortear ações de controle específicas (GOVERNO DO
ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE, 2015b).
Neste trabalho, analisou-se o perfil epidemiológico dos vírus Dengue e Zika no
Estado do Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014 a maio de 2015,
através da aplicação de métodos moleculares, para detecção e identificação dos
vírus, visando contribuir para a vigilância desses vírus no RN através do
fornecimento de dados às Secretarias de Saúde, visando fornecer suporte às ações
de combate aos vetores do gênero Aedes.
Este trabalho é de grande relevância, pois, além de ser o estudo mais
abrangente sobre o ZIKV no Estado do Rio Grande do Norte, também é um dos
estudos pioneiros referentes a esse vírus no Brasil.
55
3
3.1
OBJETIVOS
Objetivo Geral:

3.2
Analisar o perfil epidemiológico dos vírus Dengue e Zika no Estado do
Rio Grande do Norte, no período compreendido de junho de 2014 a
maio de 2015.
Objetivos Específicos:

Implantar e padronizar a técnica de diagnóstico para detecção do vírus
Zika no Laboratório de Doenças Infecciosas e do Câncer;

Pesquisar a circulação dos sorotipos dos vírus Dengue e do vírus Zika
no Estado do Rio Grande do Norte no período de junho de 2014 a maio
de 2015;

Analisar a distribuição e a evolução espacial dos vírus Dengue e Zika
no Estado durante o período de estudo;

Analisar a distribuição temporal desses vírus no Estado durante o
período de estudo;

Investigar os grupos (gênero e faixa etária) mais acometidos pelos
vírus Dengue e Zika desde junho de 2014 até o mês de maio de 2015;

Estimar a carga viral apresentada pelos pacientes com diagnóstico
confirmados de infecção pelo vírus Zika para cada dia de doença.
56
4
4.1
MATERIAL E MÉTODOS
Tipo de estudo
Trata-se de um estudo misto, retrospectivo, prospectivo, epidemiológico
observacional transversal, predominantemente descritivo, de dados primários.
4.2
Local de estudo
Esse estudo foi realizado no Rio Grande do Norte (RN), situado na região
Nordeste do Brasil, limitando-se a Oeste com o Estado do Ceará, ao Sul com o
Estado da Paraíba e a Leste e Norte com o Oceano Atlântico (Figura 7). Atualmente,
o RN possui um número de habitantes estimado em 3. 442.775, em uma área de
52.811,126 km², apresentando densidade demográfica de 59,99 (hab/km²)
(INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2015). O RN está
dividido em 167 municípios, sendo composto por 19 microrregiões, agrupadas em 4
mesorregiões separadas conforme os aspectos físicos e humanos (Figura 8). A
capital do Estado é a cidade do Natal que compõe a região metropolitana
juntamente com outros 11 municípios. São eles: Ceará-Mirim, Extremoz, Ielmo
Marinho, Macaíba, Maxaranguape, Monte Alegre, Nísia Floresta, Parnamirim, São
Gonçalo do Amarante, São José de Mipibu e por fim, Vera Cruz (RIO GRANDE DO
NORTE, 2015; OJIMA, MONTEIRO e NASCIMENTO, 2015).
57
Figura 7 - Localização do Estado do Rio Grande do Norte.
Fonte: (Adaptado de BRANCO, 2014).
Figura 8 - Mesorregiões e microrregiões do Estado do Rio Grande do Norte.
Fonte: (NASCIMENTO; PETTA e FARIAS, 2009).
58
4.3
Amostras clínicas da população e fonte de dados do estudo
Nesse estudo, foram analisadas amostras de sangue ou soro provenientes de
pacientes atendidos em diferentes Centros de Saúde e Hospitais da Rede Pública
do RN com suspeita de dengue e/ou febre zika. Amostras de sangue ou de soro
foram obtidas de pacientes residentes em diversos municípios do RN e
encaminhadas ao Laboratório Central Doutor Almino Fernandes (LACEN/RN).
Posteriormente, uma alíquota dessas amostras foi encaminhada ao Laboratório de
Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC/UFRN) com a ficha de notificação
compulsória de cada paciente (contendo a identificação dos pacientes e algumas
informações, tais como: data da coleta do espécime biológico, data de início dos
sintomas, idade e procedência). Ao chegar no LADIC, as alíquotas foram
acondicionadas em freezer
-70Cº até serem processadas pelas
técnicas
moleculares, conforme descrito a seguir.
4.4
Extração do RNA viral
As amostras de sangue ou soro advindas dos pacientes foram processadas
para extração de RNA, utilizando o kit QIAmp Viral Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia,
EUA), seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, que consiste basicamente
nos seguintes procedimentos: incubação de 140 μL de cada amostra com tampão de
lise AVL durante dez minutos, posteriormente, as amostras foram misturadas com
etanol absoluto e aplicadas em colunas com membrana de sílica, contidas no kit. Em
seguida, os espécimes biológicos foram centrifugados, lavados com os tampões
AW1 e AW2. Finalmente, foram adicionados 60 μL do tampão AVE para eluição do
RNA presente na coluna e o RNA viral extraído foi armazenado no freezer -70Cº até
o momento de utilização.
59
4.5 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RTPCR) para detecção e tipagem dos DENV
Após extração do RNA, foi realizada a técnica de transcrição reversa seguida
da reação em cadeia da polimerase descrita por Lanciotti et al. (1992) para
amplificação do material genético através da obtenção do DNA complementar de
cada amostra. Essa técnica consiste em duas etapas: a primeira denominada RTPCR e a segunda, semi-nested PCR, tendo como finalidade gerar produtos de
amplificação (amplicons) ao final de cada procedimento, para detecção e
identificação dos quatro sorotipos do vírus da dengue.
Na primeira etapa foram utilizados 0,75 L dos iniciadores consensuais (D1 e
D2) a 10 M para os quatro sorotipos do vírus Dengue complementares as
sequências dos genes que codificam as proteínas C e prM. Na segunda etapa,
foram utilizados 0,75L de iniciadores específicos (TS1, TS2, TS3 e TS4) a 10M
para os DENV-1 a 4, respectivamente (Tabela 1).
Tabela 1 - Sequência de oligonucleotídeos que foram utilizados para tipagem dos vírus da dengue
por meio de transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR).
Tipo de
oligonucleotídeo
iniciador
(sentido)
D1 ( + )
D2 ( - )
TS1 ( - )
TS2 ( - )
TS3 ( - )
TS4 ( - )
Sentido da sequência (5’ –
3’)
Posição no
genoma
Tamanho do
amplicon (pares de
bases)
TCA ATA TGC TGA AAC
GCG CAG AAA CCG
TTG CAC CAA CAG TCA
ATG TCT TCA GGT TC
CGT CTC AGT GAT CCG
GGG G
CGC CAG AAG GGC CAT
GAA CAG
TAA CAT CATCATCAT GAC
ACA GAG C
CTC TGT TGT CTT AAA
CAA GAG A
134 – 161
511
616 – 644
511
568 – 586
482 (D1 e TS1)
232 – 252
119 (D1 e TS2)
400 – 421
290 (D1 e TS3)
506 – 527
392 (D1 e TS4)
Fonte: (LANCIOTTI et al., 1992).
Os seguintes reagentes também foram utilizados na composição da mistura,
sendo eles: água livre de nucleases (IDT, Iowa, USA), onde na primeira etapa
60
utilizou-se um volume de 8L e na segunda foi utilizado 6,25L; PCR Master Mix 2x
(Promega, Madison, USA) tendo 12,5L adicionados em cada etapa e 0,5 L da
enzima AMV-RT 5U/µL (Promega, Madison, USA), usado apenas na etapa primeira
etapa.
Na primeira etapa da reação, foi realizado o seguinte procedimento em cada
amostra: Após preparação dos 20 L da mistura da RT-PCR (Tabela 2), foram
adicionados 5,0 L do RNA previamente extraído, estocadas as misturas em
microtubo tipo eppendorfde 0,3 mL. Em seguida, os microtubos foram
imediatamente colocados no bloco aquecido do termociclador Mastercycler
gradient. No primeiro momento das termociclagens, a transcrição reversa ocorreu a
uma temperatura de 45ºC, durante 45 minutos, em seguida, as amostras foram
submetidas a 30 ciclos subsequentes de desnaturação a 94ºC por 35 segundos,
depois ocorreu o anelamento a 56ºC durante 1 minuto, extensão a 72ºC durante dois
minutos e ao final, aconteceu mais uma extensão durante 10 minutos a 72ºC.
Na segunda etapa, semi-nested PCR, 2,5 L do produto da primeira etapa de
cada amostra foi diluído em 247,5L de água livre de nucleases. Em novos
microtubos tipo eppendorfde 0,3 mL, foram adicionados 2,5 L provenientes da
diluição em 22,5L da mistura preparada para essa segunda etapa (Tabela 2). Logo
em seguida, as amostras foram colocadas no bloco aquecido do termociclador e
submetidas a 20 ciclos de desnaturação por 35 segundos a 94ºC, em seguida,
anelamento por 1 minuto a 56ºC, extensão por 2 minutos a 72ºC, finalizando com a
extensão por 10 minutos a 72ºC.
Tabela 2 - Reagentes utilizados para detectar os sorotipos do vírus da dengue por meio de
transcrição reversa seguida pela reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR).
Reagentes
Água livre de nucleases
Primer iniciador D1 (10 µM)
Primer iniciador D2 (10 µM)
Primers iniciadores (TS1 a
TS4)
5 U/µl enzima AMV-RT
PCR Master Mix 2x
Mistura para RT-PCR
(utilizada em uma reação)
8 µL
0,75 µL
0,75µL
_
0,5µL
12,5 µL
Fonte: (Adaptado de LANCIOTTI et al., 1992).
Mistura para SemiNested (utilizada em
uma reação)
6,25 µL
0,75 µL
_
0,75µL
_
12,5 µL
61
Posteriormente, foi realizada a eletroforese em cuba horizontal a 100V durante
60 minutos, para visualização e análise dos produtos amplificados. Para esse
procedimento, foi utilizado 5 L do produto amplificado na segunda etapa da PCR,
adicionado a 2,5L de Blue/Orange Loading Dye, 6x (Promega, Madison, USA)
acrescido de 2,5L do GelRed™0,1% (Biotium). Essa mistura foi aplicada em gel de
agarose a 1% (BioAmerica, Inc., Miami,USA) contendo Tris-Ácido Bórico-EDTA 0,5X
(Promega, Madison, USA) e por fim, o gel foi visualizado em luz ultravioleta.
4.6
Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em
tempo real (qRT-PCR) para detecção dos ZIKV
A técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela
polimerase em tempo real (qRT-PCR) descrita por Faye et al. (2013), foi utilizada
para pesquisa do vírus Zika. Além de ser rápida, sensível e específica, essa técnica
é considerada de grande importância para detecção do vírus Zika, principalmente
em regiões onde outros arbovírus cocirculam.
A qRT-PCR consiste na amplificação e quantificação do RNA viral em tempo
real por meio de um corante de fluorescência que se liga especificamente ao RNA
de cadeia simples, capaz de detectar a luz oriunda do processo de amplificação.
Para que isto seja realizado é necessário que haja uma sonda Zika_qRT_P (Applied
Byossistems™ ) marcada com corante fluorescente específico, um primer iniciador
inverso à sequência genômica estudada Zika_qRT_R e um direto Zika_qRT_F
(Invitrogen) (Tabela 3).
62
Tabela 3 - Sequência da sonda e dos primers iniciadores utilizados na transcrição reversa seguida da
reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) para detecção do vírus Zika (Y = T ou
C, R = A ou G).
oligonucleotídeo
iniciador
(sentido)
Sonda
Zika_qRT_P
Primer
Zika_qRT_F
Primer
Zika_qRT_R
Sentido da sequência (5’ – 3’)
Posição no
genoma
FAM-CTYAGACCAGCTGAAR-MGB
9304–9320
AAR TAC ACA TAC CAR AAC AAA
GTG GT
TCC RCT CCC YCT YTG GTC TTG
9271–9297
9352-9373
Fonte: (FAYE et al., 2013).
Além dos reagentes mencionados acima, também foram utilizados na
composição da mistura: água livre de nucleases (IDT, Iowa, USA) e o TaqMan
FAST Vírus 1- Step Master Mix (Applied Byossistems™ ) (Tabela 4). Nesta etapa
foram feitos os seguintes procedimentos em cada amostra: após preparação dos 5
L da mistura da RT-PCR foram adicionados 5,0 L do RNA previamente extraído
em cada poço da placa de 96 poços. O equipamento ABI Prism 7500 Fast foi
utilizado para a realização dos experimentos de qRT-PCR.
Tabela 4 - Reagentes utilizados para detecção do vírus Zika por meio de transcrição reversa seguida
da reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR).
Reagentes
TaqMan FAST Vírus 1- Step Master Mix (2x)
Mistura para qRT-PCR
(utilizada em uma reação)
2,5 µL
Primer Zika_qRT_F (200nM)
0,2 µL
Primer Zika_qRT_R (200 nM)
0,2 µL
Sonda Zika_qRT_P (125 nM)
0,2 µL
Água livre de nucleases
1,9 µL
Fonte: (Adaptado de FAYE et al., 2013).
63
4.7
Análise de dados
Foi utilizado o programa Microsoft Office Excel 2010 para análise das fichas
de notificação dos pacientes, enviadas pelo LACEN/RN e construção dos gráficos.
Para elaboração das tabelas foi utilizado o Microsoft Office Word  2010. A
construção dos gráficos de gênero e as análises estatísticas da carga viral por dia da
doença causada pelo vírus Zika foram realizadas através do software Graphpad
Prism (GraphPad Software, La Jolla, Ca. EUA) versão 6. Na comparação entre as
amostras foram utilizados teste t para variáveis que apresentaram distribuição
normal, ou Mann Whitney, para variáveis que não apresentaram distribuição normal.
4.8
Considerações éticas
Para a realização deste estudo, este projeto foi previamente submetido à
apreciação e aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte - CAAE: 51057015.5.0000.5537.
64
5
RESULTADOS
5.1 Implantação e aplicação da técnica de transcrição reversa seguida da
reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) para detecção do
ZIKV.
Foram analisadas 348 amostras de sangue ou soro coletadas durante o
período de junho de 2014 a maio de 2015, para a detecção do ZIKV utilizando-se a
técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em
tempo real, conforme descrito por Faye et al. (2013). Esta técnica foi padronizada a
partir de cepas provenientes de diversas regiões africanas e, tanto os primers
quanto a sonda utilizada, foram desenhados a partir da região não estrutural 5
(NS5), que é a mais conservada entre os flavivírus (FAYE et al., 2013).
Inicialmente, devido não haver um protocolo estabelecido para identificação do
vírus Zika no LADIC, foi necessário realizar a implantação da técnica de qRT-PCR
em tempo real para a detecção molecular desse vírus. Primeiro, foram utilizadas 24
amostras obtidas de pacientes com suspeita de infecção pelo ZIKV, provenientes do
Rio Grande do Norte. No primeiro teste, foram utilizados 0,4 L dos primers
iniciadores Zika_qRT_F e Zika_qRT_R a 400 nM por reação e, em seguida,
adicionamos 0,4 L da sonda Zika_qRT_P Applied Byossistems™ a 250 nM. Além
desses reagentes, também foram utilizados na composição da mistura: água livre
de nucleases (IDT, Iowa, USA), onde utilizou-se 1,3L, o TaqMan FAST Vírus 1Step Master Mix 2x (Applied Byossistems) a uma concentração de 2x, onde foi
adicionado 2,5 L na etapa da reação, em cada poço. Foram feitos os seguintes
procedimentos em 24 poços da placa de qRT-PCR: após preparação dos 5 L da
mistura da RT-PCR em um tubo tipo eppendorf  de 0,8 mL (Tabela 5), foi adicionado
em cada poço, 5 L do RNA previamente extraído, em seguida, a placa foi colocada
no equipamento 7500 FAST e submetida a 40 ciclos de desnaturação por 3
segundos a 95ºC, seguido de 40 ciclos na etapa de anelamento por 30 segundos a
60ºC, finalizando com a extensão por 1 minuto a 60ºC. O tempo estimado das
termociclagens foi de 85 minutos. Este foi o primeiro teste, onde obtivemos a
seguinte curva de amplificação (Figura 9).
65
Tabela 5 - Reagentes utilizados no primeiro teste para detectar o ZIKV por meio de transcrição
reversa seguida pela reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) .
Reagentes
Fast vírus 1- step mix (2x)
Mistura para qRT-PCR
(utilizada em uma reação)
2,5 µL
Primer Zika_qRT_F (400 nM)
0,4 µL
Primer Zika_qRT_R (400 nM)
0,4 µL
Sonda Zika_qRT_P (250 nM)
0,4 µL
Água livre de nucleases
1,3 µL
Fonte: (Adaptado de FAYE et al., 2013).
Figura 9 - Curva de amplificação do primeiro teste realizado para identificação e detecção
dos ZIKV através da técnica de qRT-PCR.
Fonte: (LABORATÓRIO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E DO CÂNCER).
No segundo teste, utilizamos 28 amostras, sendo 24 do primeiro teste e
4 que ainda não haviam sido testadas para detecção de ZIKV. Preparamos 5
L da mistura da qRT-PCR e adicionamos 5 L do RNA previamente extraído em
cada poço da placa de qRT-PCR e, como não tínhamos amostras negativas para
66
servir de controle, utilizamos em três poços da placa, 5 L de água livre de
nucleases que serviram como nossos controles negativos. Em seguida, colocamos a
placa no termociclador 7500 FAST, alteramos o tempo de termociclagem da
etapa de desnaturação e anelamento, onde a desnaturação ocorreu em 40
ciclos por 15 segundos a 95ºC e o anelamento aconteceu por 60 segundos a
60ºC. A extensão final permaneceu a 1 minuto por 60ºC, porém, a reação foi
concluída em 75 minutos, ou seja, 10 minutos a menos que no primeiro teste.
Com essas mudanças nos padrões de termociclagem, obtivemos essa curva
de amplificação (Figura 10).
Figura 10 - Curva de amplificação do segundo teste para detecção dos ZIKV através da
técnica de qRT-PCR.
Fonte: (LABORATÓRIO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E DO CÂNCER).
No terceiro teste, voltamos a utilizar 24 amostras, das quais 8 foram
testadas no primeiro experimento e as outras 16, utilizadas no segundo teste .
Acrescentamos 5 L de água livre de nucleases em quatro poços da placa
para servir como controles negativos. Além disso, na preparação da mistura,
mudamos a concentração e o volume dos primers e da sonda, onde utilizamos
em cada poço 0,2 L dos primers Zika_qRT_F e Zika_qRT_R (Invitrogen) a 200nM,
67
em
seguida, utilizamos também 0,2
L
da
sonda Zika_qRT_P
(Applied
™
Byossistems ), porém, a concentração desta foi de 125 nM. Para preparação
da mistura, em cada poço da placa de qRT-PCR permanecemos utilizando o
TaqMan FAST Vírus 1- Step Master Mix (Applied Byossistems) a uma concentração
de 2x. Em consequência da redução do volume dos primers e da sonda,
aumentamos o volume de água livre de nucleases que ficou com 1,9 L
(Tabela 6). Após preparação da mistura, acrescentamos 5 L do RNA viral e por
fim, levamos a placa de qRT-PCR ao termociclador 7500 FAST. O tempo estimado
das termociclagens com estas mudanças voltou a ser de 85 minutos e verificamos
que entre as 24 amostras, 10 amplificaram para ZIKV (Figura 11). Após esse teste,
fizemos uma quarta pesquisa reduzindo apenas o volume do TaqMan FAST Vírus 1Step Master Mix (Applied Byossistems) que era de 2,5 µL, à metade. Desse modo,
aplicamos em cada poço, 1,25 µL deste reagente, mas não obtivemos êxito, pois a
amplificação não ocorreu (Figura 12).
Tabela 6 - Reagentes utilizados para detectar o ZIKV por meio de transcrição reversa seguida pela
reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) com a concentração padrão implantada
no LADIC.
Reagentes
Mistura para qRT-PCR
(concentração utilizada)
(volume utilizado em uma
reação)
TaqMan FAST Vírus 1- Step
2,5 µL
Master Mix (2x)
Primer Zika_qRT_F (200 nM)
0,2 µL
Primer Zika_qRT_R (200 nM)
0,2 µL
Sonda Zika_qRT_P (125 nM)
0,2 µL
Água livre de nucleases
1,9 µL
Fonte: (Adaptado de FAYE et al., 2013).
68
Figura 11 - Curva de amplificação do terceiro teste para detecção dos ZIKV através da técnica
de qRT-PCR.
Fonte: (LABORATÓRIO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E DO CÂNCER).
Figura 12 - Amplificação que não ocorreu no quarto teste para detecção dos ZIKV, devido redução.
Fonte: (LABORATÓRIO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E DO CÂNCER).
69
Posteriormente, fizemos um quinto teste utilizando os mesmos parâmetros de
termociclagem e as mesmas concentrações de primers e sonda do terceiro teste. O
que diferenciou este teste do terceiro foi o fato de termos utilizado um número maior
de amostras, uma vez que, no terceiro teste foram aplicadas 24 amostras e no
quinto, 90. Além disso, utilizamos 6 controles, sendo 4 negativos (dois contendo
água livre de nucleases e os outros dois controles negativos foram provenientes de
amostras que não haviam amplificado para ZIKV no terceiro teste) e 2 positivos (de
duas amostras que amplificaram para o vírus Zika). Em seguida, colocamos a placa
de 96 poços no bloco aquecido do termociclador 7500 FAST e após 85 minutos,
obtivemos uma nova curva de amplificação (Figura 13).
A partir dos resultados obtidos nesse quinto experimento, padronizamos
a técnica de qRT-PCR para detecção dos ZIKV e passamos a utilizá-la nos
experimentos seguintes. Também passamos a fazer uma triagem das amostras que
deveriam ser submetidas a essa técnica, procurando averiguar com cautela a ficha
de notificação dos pacientes para desenvolvermos as pesquisas com as demais
amostras que se encontravam no nosso banco de amostras e que haviam sido
submetidas à extração do RNA viral.
Resumidamente, a qRT-PCR ocorreu em diversos padrões de termociclagens
e concentrações de reagentes até conseguirmos chegar à padronização da técnica
no Laboratório de Doenças Infecciosas e do Câncer.
70
Figura 13 – Padronização do protocolo implantado (quinto teste) para detecção dos ZIKV
através da técnica de qRT-PCR.
Fonte: (LABORATÓRIO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E DO CÂNCER).
5.2
5.2.1
Monitoramento viral
Pesquisa dos sorotipos dos vírus Dengue e identificação da circulação do
vírus Zika no Estado do Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014 a maio
de 2015.
No período compreendido entre junho de 2014 a maio de 2015 foram
analisadas um total de 334 amostras provenientes de pacientes com suspeita de
infecção pelos DENV, das quais 27 foram positivas, representando uma prevalência
de 8,08% (27/334). Além disso, 348 amostras foram analisadas para detecção do
ZIKV, nas quais 73 foram positivas, demonstrando ocorrência da infecção em
20,98% (73/348) dos casos estudados (Tabela 7).
71
Tabela 7 - Detecção e porcentagem dos casos positivos pelos DENV e dos casos positivos para
ZIKV.
DENV (RT-PCR)
27/334
8,08%
ZIKV (qRT-PCR)
73/348
20,98%
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
Foi constatada no período de estudo, a cocirculação de três dos quatro
sorotipos dos vírus Dengue. Foram eles: DENV-1, DENV-2 e DENV-4, onde o
DENV-4 foi o sorotipo predominante, representando 66,67% (18/27) dos casos
positivos. O DENV-1 foi o segundo mais prevalente sorotipo com 18,52% (5/27) de
positividade, enquanto o DENV-2 foi confirmado em 14,81% (4/27) dos casos
confirmados para os sorotipos da dengue (Figura 14).
Figura 14 – Sorotipos do vírus Dengue detectados por mês, no período de junho de 2014 a maio de
Número de casos
2015.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
DENV-1
DENV-2
DENV-4
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
Na figura 15 é mostrado o perfil de bandas obtido a partir da amplificação de
cada um dos quatros sorotipos do vírus dengue existentes, pela técnica da transcrição
72
reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR), utilizando o
protocolo proposto por Lanciotti et al., (1992), para a tipagem desse vírus.
Figura 15 - Eletroforese horizontal em gel de agarose a 1%. Visualização dos produtos amplificados
pela transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) para tipagem dos
DENV segundo o protocolo descrito por Lanciotti et al., (1992). Poço 1: Marcador de Peso Molecular
de 100 pares de bases (Promega); Poço 2: Controle negativo; Poço 3: Amostra positiva para DENV1; Poço 4: Amostra positiva para DENV-2; Poço 5: Amostra positiva para DENV-3; Poço 6: Amostra
positiva para DENV-4.
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
Assim como os DENV, o ZIKV também foi representativo durante o período de
estudo (Figura 16).
73
Figura 16 – Vírus Zika detectados por mês, no período de junho de 2014 a maio de 2015.
18
16
Nº de casos
14
12
10
8
6
Positivos
4
2
0
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
O padrão de amplificação obtido por meio da técnica de transcrição reversa
seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR),
demonstrou a circulação do vírus Zika no Estado do Rio Grande do Norte, conforme
demonstrado (Figura 17).
Figura 17 - Perfil de amplificação do ZIKV demonstrado através da técnica de transcrição
reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR).
Fonte: (LABORATÓRIO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E DO CÂNCER).
74
5.3
5.3.1
Análise espaço temporal e perfil epidemiológico dos DENV e ZIKV.
Municípios incidentes pelos DENV no Rio Grande do Norte, no período de
junho de 2014 a maio de 2015.
A distribuição dos casos positivos para os DENV, bem como os sorotipos virais
identificados nos municípios do Rio Grande do Norte foi realizada a partir da análise
das fichas de notificação dos pacientes. No período de junho de 2014 a maio de
2015, verificou-se a circulação dos sorotipos DENV-1, DENV-2 e DENV-4 em 13
municípios. Todas as quatro mesorregiões do Estado apresentaram casos positivos
para os DENV, durante o período de estudo. (Figura 18).
Figura 18 – Mapa do Estado do Rio Grande do Norte demonstrando os municípios afetados pelos
DENV no período de junho de 2014 a maio de 2015.
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
75
O maior número de casos com diagnóstico confirmado de dengue ocorreu nos
municípios de, Natal, Jandaíra e Ouro Branco, representando respectivamente,
22,22% (6/27), 18,52% (5/27) e 11,11% (3/27) do total de casos positivos.
A cocirculação de mais de um sorotipo dos vírus Dengue ocorreu nos
municípios de Jandaíra, Natal e Parnamirim. No primeiro, foram detectados os
sorotipos DENV-2 e DENV-4, enquanto que no segundo e terceiro, foi confirmada a
cocirculaçãos dos sorotipos DENV-1 e DENV-4 (Tabela 8).
Tabela 8 - Municípios incidentes pelos DENV, número de casos confirmados, sorotipos circulantes e
porcentagem de casos positivos no período de junho de 2014 a maio de 2015.
Municípios
Nº de casos
confirmados
Sorotipos
Porcentagem (%)
Natal
6
22,22%
Jandaíra
5
Ouro Branco
Guamaré
Jardim de
Piranhas
Parnamirim
3
2
2
2DENV-1
4DENV-4
4 DENV-4
1 DENV-2
DENV-4
DENV-2
DENV-4
Brejinho
Caiçara do Rio do
Vento
Canguaretama
Jardim do Seridó
João Câmara
Mossoró
São Pedro
Total
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
2
18,52%
11,11%
7,onte41%
7,41%
7,41%
1
1
1DENV-1
1 DENV-4
DENV-1
DENV-4
1
1
1
DENV-4
DENV-4
DENV-4
3,70%
3,70%
3,70%
1
1
27
DENV-1
DENV-2
5 DENV-1
4 DENV-2
18 DENV-4
3,70%
3,70%
100%
3,70%
3,70%
76
5.3.2
Municípios incidentes por ZIKV no Rio Grande do Norte, no período de junho
de 2014 a maio de 2015.
A distribuição dos casos positivos para o vírus Zika, também foi realizada a
partir da análise das fichas de notificação dos pacientes. No período desse estudo,
ocorreram casos de infecção pelo ZIKV em 16 municípios. Houve 2 casos em que o
município de procedência da amostra não foi informado na ficha de notificação.
Diferentemente dos DENV, apenas três das quatro mesorregiões do Estado
apresentaram casos positivos para o vírus Zika durante o período de estudo. Não
houve casos detectados da doença na mesorregião do Oeste Potiguar (Figura 19).
Figura 19 - Mapa do Estado do Rio Grande do Norte demonstrando os municípios incidentes pelo
ZIKV no período de junho de 2014 a maio de 2015.
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
O maior número de casos positivos para o ZIKV ocorreu nos municípios de
Natal, Parnamirim, Guamaré e Nova Cruz, com porcentagens respectivamente de:
30,14% (22/73), 19,18% (14/73), 13,70% (10/73), 9,59% (7/73) (Tabela 9).
77
Tabela 9 - Municípios incidentes pelos ZIKV, número de casos confirmados, além da porcentagem de
casos positivos no período de junho de 2014 a maio de 2015.
Municípios
Nº de casos
confirmados
Porcentagem(%)
Natal
Parnamirim
Guamaré
Nova Cruz
Jandaíra
Caiçara do Rio do
Vento
Ceará-Mirim
Galinhos
Passa e Fica
Acari
Extremoz
Macaíba
Parelhas
São Gonçalo do
Amarante
São Paulo do
Potengi
São Pedro
Não informado
Total
22
14
10
7
3
2
30,14%
19,18%
13,70%
9,59%
4,10%
2
2
2
1
1
1
1
1
2,74%
2,74%
2,74%
2,74%
1,37%
1,37%
1,37%
1,37%
1,37%
1
1
2
73
1,37%
1,37%
2,74%
100%
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
5.3.3 Análise da distribuição espacial e evolução dos DENV e ZIKV no Rio Grande
do Norte, no período de junho de 2014 a maio de 2015.
Durante esse estudo, verificou-se de acordo com a ficha de notificação dos
pacientes, que no período de Junho a Agosto de 2014, o primeiro município a ter um
caso confirmado de DENV foi Jandaíra, no mês de junho. Caiçara do Rio do Vento
foi a primeira cidade a apresentar um caso confirmado de ZIKV ocorrido no mês de
julho, seguido da cidade de Galinhos. Esse dado contradiz a hipótese da introdução
78
do vírus Zika no Brasil, por ocasião do Campeonato Mundial de Canoagem, uma vez
que esse evento se deu em agosto de 2014, portanto, depois da ocorrência do
primeiro caso de infecção por esse vírus no Rio Grande do Norte.
Na primeira quinzena do mês de julho de 2014, dias antes da confirmação do
primeiro caso de infecção pelo ZIKV no Estado, houve um caso de DENV-4 em
Caiçara do Rio do Vento. Durante o primeiro trimestre desse estudo, houve a
cocirculação dos DENV-1 e DENV-4 em Natal. Já no período de Junho a Novembro
do mesmo ano (que correspondeu ao primeiro semestre desse estudo), ocorreu a
cocirculação do DENV-2 em Guamaré e Jandaíra. Ambos os casos foram
confirmados no mês de novembro de 2014. Nesse mesmo mês, confirmou-se a
circulação do vírus Zika no município de Guamaré. Ainda nesse período, casos de
DENV-2, 4 e ZIKV foram detectados no município de Jandaíra. Nos meses
compreendidos de Junho de 2014 a Fevereiro de 2015, ou seja, durante os nove
meses desse estudo, os DENV-1 e DENV-4 cocircularam em Parnamirim. Nos
municípios de Guamaré e São Pedro houve a cocirculação dos DENV-2 e ZIKV. Em
Jandaíra não ocorreu a circulação do DENV-1 e em Galinhos, Macaíba, Passa e
Fica e Acari, o ZIKV foi o único vírus circulante. Durante todo o período desse
estudo, foram diagnosticados casos de infecção por DENV e/ou ZIKV em 23
municípios do Estado (Figura 20).
No que concerne apenas ao ZIKV, os meses de junho a agosto de 2014,
Caiçara do Rio do Vento e Galinhos foram os únicos municípios afetados por esse
vírus. No período de setembro a novembro de 2014, os municípios de Jandaíra e
Guamaré registram a ocorrência do ZIKV em pacientes. De dezembro de 2014 a
fevereiro de 2015, as cidades de Acari, Guamaré, Jandaíra, Macaíba, Natal, Passa e
Fica e São Pedro foram incidentes. No período de março a maio de 2015,
identificou-se a circulação do vírus Zika em Extremoz, Galinhos, Natal, Nova Cruz,
Parelhas, Parnamirim, São Gonçalo do Amarante e São Paulo do Potengi. Por fim,
houve meses - não informados na ficha de notificação dos pacientes - em que esse
vírus circulou. Foram eles: Ciaçara do Rio do Vento, Ceará-Mirim, Natal e Passa e
Fica (Figura 21).
79
Figura 20 – Mapas do Estado do Rio Grande do Norte, mostrando a evolução dos DENV e ZIKV durante o período de junho de 2014 a maio de 2015.
A: Junho-Agosto/14; B: Junho-Novembro/14; C: Junho/14 a Fevereiro/15; D: Junho/14 a Maio/15.
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
80
Figura 21 – Linha do tempo mostrando os municípios incidentes pelo ZIKV durante o período de
junho de 2014 a maio de 2015.
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
5.3.4 Análise temporal dos DENV no Rio Grande do Norte, no período de junho de
2014 a maio de 2015.
A análise temporal dos casos positivos para os DENV no período desse
estudo demonstrou que os meses de Junho e Novembro de 2014, bem como o mês
81
de Janeiro de 2015 foram os que apresentam maior número de casos positivos,
onde o mês de Junho foi o mais representativo com 44,44% (12/27). Além disso,
houve casos em que a data de início dos sintomas e/ou data de coleta do sangue ou
soro do paciente não foram informados na ficha de notificação (Tabela 10 e Figura
22).
Tabela 10 - Distribuição mensal dos casos confirmados, estudados e sorotipos de DENV circulantes
no Rio Grande do Norte, durante o período de junho de 2014 a maio de 2015.
Mês
Casos
confirmados
12
Casos estudados
Sorotipos
24
Julho
Agosto
Setembro
Outubro
Novembro
Dezembro
Janeiro
2
2
0
1
3
0
3
16
4
9
9
29
24
26
Fevereiro
Março
Abril
Maio
Não informado
Total
0
2
1
0
1
27
16
56
47
26
48
334
9 DENV- 4
3 DENV- 1
2 DENV- 4
2 DENV- 4
1 DENV- 1
3 DENV- 2
1 DENV- 1
1 DENV- 2
1 DENV- 4
2 DENV- 4
1 DENV- 4
1 DENV- 4
5 DENV- 1
4 DENV- 2
18 DENV- 4
Junho
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
82
Figura 22 – Distribuição mensal dos casos positivos e estudados para os DENV no período de junho
de 2014 a maio de 2015.
60
Nº de casos
50
40
30
20
Positivos
Estudados
10
0
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
5.3.5 Análise temporal dos casos de ZIKV no Rio Grande do Norte, no período de
junho de 2014 a maio de 2015.
No que se refere aos casos de infecção pelo ZIKV, a análise temporal
demonstrou que durante o período de estudo, os meses de Março e Maio de 2015
foram os que apresentaram maior número de casos positivos, sendo o mês de
Março o mais representativo com 23,29% (17/73) de incidência. Assim como os
casos incidentes pelos DENV, houve situações em que o mês de início dos sintomas
e/ou data de coleta do espécime biológico do paciente com suspeita de ZIKV não foi
preenchido na ficha de notificação (Tabela 11 e Figura 23).
83
Tabela 11 - Distribuição mensal dos casos confirmados e estudados de ZIKV no Rio Grande do
Norte, durante o período de junho de 2014 a maio de 2015.
Mês
Junho
Julho
Agosto
Setembro
Outubro
Novembro
Dezembro
Janeiro
Fevereiro
Março
Abril
Maio
Não informado
Total
Casos
confirmados
2
5
5
5
7
17
6
15
11
73
Casos estudados
12
14
2
9
5
16
9
22
17
64
64
69
45
348
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
Figura 23 – Distribuição mensal dos casos positivos e estudados para ZIKV no período de junho de
2014 a maio de 2015.
80
70
Nº de casos
60
50
40
30
Positivos
20
Estudados
10
0
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
84
5.3.6
Investigação dos DENV no Rio Grande do Norte, no período de junho de
2014 a maio de 2015, de acordo com o gênero.
Durante o período de estudo e com base nas fichas de notificação dos
pacientes, foi verificado que os dois gêneros foram afetados pelos DENV, tendo
praticamente a mesma proporção de incidência, onde o sexo masculino representou
51,85% (14/27) dos casos positivos e o feminino 48,15% (13/27) (Figura 24).
Figura 24 – Casos confirmados de DENV por gênero, no período de junho de 2014 a maio de 2015.
Nº de casos
15
Positivos
10
5
o
in
Fe
m
in
M
as
c
ul
in
o
0
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
5.3.7 Investigação do ZIKV no Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014
a maio de 2015, de acordo com o gênero.
Durante esse estudo e de acordo com a ficha de notificação dos pacientes,
constatou-se que a maioria dos casos diagnosticados na infecção pelo de ZIKV foi
em indivíduos do sexo feminino, com 57,53% (42/73) dos casos positivos (Figura
25).
85
Figura 25 - Casos confirmados de ZIKV por gênero, no período de junho de 2014 a maio de 2015.
50
Positivos
Nº de casos
40
30
20
10
o
Fe
m
in
in
M
as
c
ul
in
o
0
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
5.3.8 Investigação dos DENV no Rio Grande do Norte, no período de junho de
2014 a maio de 2015, de acordo com a faixa etária.
Nesse estudo, constatou-se com base na análise das fichas de notificação dos
pacientes, que as faixas etárias mais acometidas pelos DENV foram a de 11-20
anos e a de 51-60, cada uma com 18,52% (5/27) (Figura 26).
Figura 26 – Casos positivos para os DENV no período de junho de 2014 a maio de 2015, conforme a
faixa etária.
6
Nº de casos
5
4
3
2
1
0
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
Positivos
86
5.3.9 Investigação do ZIKV no Rio Grande do Norte, no período de junho de 2014
a maio de 2015, de acordo com a faixa etária.
No período de junho de 2014 a maio de 2015, verificou-se que a faixa etária
mais acometida pelo ZIKV foi a de 0-10 anos, representando 19,18% (14/73) dos
casos confirmados, seguidas das faixas etárias de 31-40 e 41-50 anos, onde cada
uma destas representou 16,44%(12/73) de positividade (Figura 27).
Nº de casos
Figura 27 – Casos positivos para ZIKV no período de junho de 2014 a maio de 2015, conforme a faixa
etária.
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Positivos
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA).
5.3.10
Carga viral dos casos confirmados de ZIKV por dia de doença.
Com base nos resultados da qRT-PCR, analisamos a curva virêmica do ZIKV
para verificarmos em qual dia (entre os 5 primeiros dias da febre zika incidente nos
pacientes) ocorreria o maior pico da doença. Para isso, foi feita a comparação a
média dos valores de Ct (Cycle threshold) que indica a carga viral e constatou-se
nesse estudo uma maior carga viral no 3° dia de doença, entretanto, a diferença das
87
médias de Ct entre os diferentes dias de doença não foi significativa. A média de
valor de Ct e desvio padrão foi de 36,59 (± 1,655) para o 1° dia de doença, 33,78 (±
3,394) para o 2° dia, 31,22 (± 7,394) para o 3° dia e 32,30 (± 8,083) para o 4° dia. A
média do valor de Ct e o desvio padrão do 5° dia de doença não foi calculado, pois
apenas uma amostra foi obtida nesse dia (Figura 28). O valor de Ct é inversamente
proporcional a carga viral, ou seja, quanto menor o valor de Cycle threshold, maior é
a carga viral.
Figura 28 - Média dos valores de Ct indicando a carga viral por dia de doença, obtido de casos
confirmados de ZIKV nesse estudo.
INDETECTÁVEL
Cycle threshold
qRT-PCR Zika Virus
35
30
25
20
15
10
5
0
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
Dia 5
Fonte: (LABORATÓRIO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E DO CÂNCER).
88
6
DISCUSSÃO
A implementação e posterior padronização da técnica de qRT-PCR para
detecção do ZIKV pelo Laboratório de Doenças Infecciosas e do Câncer que é um
laboratório de virologia voltado para o âmbito da pesquisa na UFRN, foi
fundamentalmente importante para o Estado pois, desde fevereiro de 2015
comentava-se sobre uma síndrome exantemática ocorrida no Nordeste no qual
possivelmente muitas autoridades de saúde ainda não conhecia o agente etiológico
causador dessa doença e fez-se necessário a identifica-lo com o intuito de alertar
os profissionais de saúde do RN, visando a prevenção de futuras epidemias. Para
isso, fizemos cinco procedimentos-teste até estabelecermos a técnica de qRT-PCR
em nosso laboratório e podermos processar as 348 amostras incluídas no nosso
estudo, seguindo o protocolo descrito por FAYE et al. (2013).
No que concerne à pesquisa dos sorotipos dos DENV e identificação da
circulação do ZIKV, verificamos que durante o período de junho de 2014 a maio de
2015, 8,08% das amostras de sangue foram confirmadas para os DENV e 20,98%
para ZIKV. O número de casos positivos para os vírus Dengue pela técnica de RTPCR foi menor que o encontrado por Branco (2014) no período de 2010-2012, e por
Sousa (2015) no período de 2013-2014 no RN e isso possivelmente é devido tanto
ao esgotamento da população suscetível aos DENV, quanto a interferência viral (não
ocorrência do processamento do RNA mensageiro, impedindo a replicação viral na
célula hospedeira). A análise dos casos suspeito de infecção pelo vírus Zika foi
realizada no nosso estudo pela técnica qRT-PCR. Em comparação com a RT-PCR,
a qRT-PCR é mais sensível, mais rápida, possui maior especificidade, é de fácil
padronização, apresenta menor risco de resultados falsos positivos e permite fazer
análises quantitativas do material genético viral (FAYE et al., 2013; GUEDES, 2012),
enquanto a primeira técnica faz análises apenas qualitativas, determinando se há
presença ou ausência de vírus (BONA; TWERDOCHLIB e NAVARRO-SILVA, 2011).
Três dos quatro sorotipos da dengue circularam no RN durante o período
desse estudo. Foram eles: DENV-1, DENV-2 e DENV-4, com predominância do
último. Resultado semelhante ao encontrado por Branco (2014) e Sousa (2015), mas
diferente do relatado por Cunha et al. (1999) que detectara a circulação dos
89
sorotipos 1 e 2, e por Barbosa et al. (2012). Quanto ao DENV-3, o último ano em
que este sorotipo circulou no Estado foi em 2010, no município de Parnamirim
(BRANCO, 2014) e continua ausente, de acordo com o presente estudo. Isso indica
que os indivíduos nascidos após 2010, são todos susceptíveis a esse sorotipo.
Como os demais sorotipos continuam circulando na população, essa constatação
torna-se preocupante, pois indivíduos infectados com um sorotipo adquirem
imunidade duradoura específica para o tipo viral infectante, mas não para os outros
três tipos (MACIEL, SIQUEIRA JUNIOR e MARTELLI, 2008). Por esse motivo, é
necessário que as autoridades de saúde continuem realizando vigilâncias
epidemiológicas, uma vez que infecções sequenciais por mais de um sorotipo de
dengue podem contribuir para a ocorrência das formas hemorrágicas da doença
(HALSTEAD, 2006).
O sorotipo de maior prevalência foi o DENV-4, encontrado em 66,67% dos
casos confirmados. Possivelmente esse sorotipo foi introduzido no Estado em maio
de 2011 durante a festa de Santa Rita de Cássia, padroeira do município de Santa
Cruz que é um evento religioso que recebe devotos de várias regiões do Brasil,
inclusive, de outros países. Desde o período de detecção do DENV-4 no RN, o
Estado permanece com um número maior de casos da doença, causados por esse
sorotipo. Cordeiro (2008) explica que a alternância dos sorotipos virais se deve
basicamente ao esgotamento ou a diminuição dos indivíduos susceptíveis a pelo
menos um dos sorotipos circulantes.
Quanto aos municípios incidentes pelos DENV e ZIKV, durante esse estudo foi
possível verificar a circulação do DENV nas quatro mesorregiões do Estado. Esse
resultado confirma o que foi constatado por Branco (2014) e Sousa (2015). Os
municípios de Jandaíra, Natal e Ouro Branco merecem destaque por terem sido os
mais afetados. Além disto, os dois primeiros municípios e Parnamirim apresentaram
a cocirculação de mais de um sorotipo do vírus. A maior incidência de DENV em
Natal, capital do Estado do RN e em Parnamirim que faz parte da região
metropolitana, possivelmente é decorrente da elevada urbanização e densidade
demográfica. O maior número de registro de casos, também pode ser devido a uma
maior procura da população desses dois municípios aos serviços de saúde. Teixeira
et al. (2009) explicam que no ano de 1997 as taxas de incidência dos DENV
90
começaram a se elevar em cidades pequenas, principalmente nas que estão
situadas no interior do Norte, Nordeste e Centro-Oeste, que correspondem aos
trechos territoriais das unidades climáticas mais favoráveis para a proliferação
do mosquito e desde 2007, essa tendência se tornou ainda mais clara quando cerca
de 40% dos casos de incidentes pelos DENV no Brasil vieram de municípios com
menos de cem mil habitantes, como é o caso dos municípios de Jandaíra que possui
6.801 habitantes (IBGE, 2014a) e Ouro Branco com 4.699 habitantes (IBGE, 2014b).
Com relação ao ZIKV, este foi detectado em três das quatro mesorregiões do RN, e
possivelmente não foi detectado na mesorregião Oeste Potiguar devido às
subnotificações que infelizmente existem no sistema de saúde.
Devido aos eventos internacionais ocorridos no Brasil em 2014, inclusive no
RN com a Copa do Mundo de Futebol, houve um aumento do fluxo de pessoas,
condição que favorece a dispersão de agentes causadores de doenças. Assim, é
possível que esse evento tenha sido responsável pela introdução do vírus no país
deixando as autoridades de saúde em constante atenção (SVS, 2015). Além disso,
Natal e Parnamirim (que foram dois dos municípios a apresentar o maior número de
casos de ZIKV) recebem um intenso número de turistas anualmente e esse fluxo de
pessoas favorece a importação de novos vírus (BRICKS, 2004). Os municípios de
Guamaré e Nova Cruz também apresentaram significativa positividade para o vírus
Zika. Barcellos e Lowe, (2014) informaram que ondas de difusão viral decorrem de
áreas metropolitanas para cidades de médio e pequeno porte, gerando surtos nas
regiões de influência.
Na análise da distribuição espacial e evolução dos vírus DENV e ZIKV,
verificamos que no período de Junho a Agosto de 2014, o primeiro município a ter
um caso confirmado de DENV foi Jandaíra, enquanto Caiçara do Rio do Vento foi o
primeiro a apresentar um caso confirmado de vírus Zika no mês de julho e em
seguida, foi a cidade de Galinhos, demonstrando que o ZIKV não foi introduzido no
Brasil durante o Campeonato de Canoagem ocorrido no Rio de Janeiro e por esse
motivo, a hipótese de que o ZIKV chegou ao RN durante a Copa do Mundo de
Futebol é a mais provável. Esses dados tornam-se preocupantes, uma vez que a
introdução de um novo tipo viral em uma região pode gerar grandes epidemias e
casos mais graves da doença (BARBOSA et al., 2012).
91
Na análise temporal dos DENV e ZIKV, analisamos que o mês de Junho foi o
que apresentou maior número de casos confirmados de dengue com 44,44%.
Quanto ao ZIKV, o mês de Março foi o de maior incidência, com 23,29% de
positividade. Em um estudo epidemiológico realizado por Monteiro et al. (2009) na
cidade de Teresina, capital do Piauí durante o período de 2002 a 2006 foi também
observado que o maior número de casos positivos para os DENV coincidia com o
período chuvoso (que corresponde ao primeiro semestre do ano), fato também
comprovado por Viana e Ignotti (2013), em um estudo de revisão sistemática
relacionando a dengue a variações meteorológicas no Brasil. A mesma explicação
pode servir para o ZIKV, pois ambos os vírus são transmitidos pelos mesmos
vetores e o período em que ocorrem os maiores índices pluviométricos, é
considerado o mais favorável para reprodução do mosquito Aedes.
Quanto à investigação dos DENV e ZIKV no RN conforme o sexo, observou-se
nesse estudo que ambos os gêneros foram afetados pelos DENV, tendo
praticamente a mesma proporção de casos positivos, corroborando com o estudo
feito em São Luís do Maranhão por Gonçalves Neto e Rebêlo (2004), onde se
verificou que houve transmissão similar
dos vírus entre os sexos. Em estudo
epidemiológico realizado em Manaus, Castro (2004) encontrou diferença nas taxas
de incidência da infecção pelo vírus da dengue em relação ao gênero, mas admite
que ambos os gêneros estão igualmente expostos ao vírus. No que concerne ao
vírus Zika, constatou-se que a maioria dos casos diagnosticados foi do gênero
feminino, com 57,53%. Esse resultado corrobora com o trabalho desenvolvido na
Bahia por Campos, Bandeira e Sardi (2015), onde a maioria dos pacientes positivos
para ZIKV foi também do sexo feminino. Esse dado aumenta ainda mais a
preocupação com esse vírus, uma vez que existe uma forte evidência de sua
transmissão vertical, associada a casos de microcefalia no recém-nascido. O registro
de um maior número de casos de infecção por esse vírus em mulheres se deve
possivelmente, a maior notificação, uma vez que as mulheres procuram mais o
serviço de saúde. Também pode ser devido ao fato de que elas passam mais tempo
no ambiente peri e intradomiciliar, expondo-se com mais frequência ao vetor urbano
(CUNHA e BOHLAND, 2012).
92
No que se refere as faixas etárias mais acometidas pelos DENV e ZIKV
durante esse estudo, verificamos que as idades mais incidentes pelos DENV foram a
de 11-20 anos e a de 51-60, cada uma com 18,52%, diferentemente do resultado
encontrado por Monteiro et al. (2009), onde eles mostraram que a faixa etária mais
acometida por esses vírus foi a de pacientes com idades de 15-49 anos. Gonçalves
Neto e Rebêlo (2004) fizeram um estudo em São Luís no Maranhão e verificaram
que o número de casos incidentes pelos DENV, predominou nas idades acima de 15
anos, informando que o maior número de casos nas faixas etárias mais elevadas é
um padrão observado em áreas de risco em potencial para transmissão do vetor e o
Estado do Rio Grande do Norte está enquadrado nesse padrão por ter registros de
episódios epidêmicos e não epidêmicos de dengue (BARBOSA et al., 2012). A faixa
etária mais acometida pelo ZIKV foi a de 0-10 anos, representando 19,18% dos
casos confirmados, seguidas das faixas etárias de 31-40 e 41-50 anos, onde cada
uma destas representou 16,44% de positividade. Campos, Bandeira e Sardi (2015),
também utilizaram amostras de sangue/soro nas pesquisas desenvolvidas na
Universidade Federal da Bahia e eles verificaram que a média de idade das pessoas
afetadas por esse vírus era de 28 anos. Devido o ZIKV ser um vírus emergente e
não ter havido histórico anterior ao ano de 2014 no Brasil, tampouco no Rio Grande
do Norte, a população está totalmente susceptível à doença, por isso espera-se que
a infecção atinja igualmente todas as faixas etárias.
O futuro do ZIKV ainda é imprevisível, mas a difusão mundial dos DENV
associado às tendências ligadas a urbanização e globalização, sugerem que o vírus
Zika tenha um longo potencial de transmissibilidade pela frente (MUSSO, CAOLORMEAU e GUBLER, 2015a).
Por fim, a utilização da qRT-PCR nesse estudo permitiu a comparação da
quantificação da carga viral entre os cinco primeiros dias da febre zika (fase aguda
da doença), no intuito de analisarmos em quais destes dias, ocorreu viremia e
identificamos através de análise estatística, que o 3° dia apresentou maior pico
virêmico. Vaughn et al. (2000), fizeram um estudo semelhante na Tailândia com os
DENV e eles verificaram que a gravidade da doença relacionava-se aos altos títulos
de viremia. Em estudo realizado por Nunes (2012) no Rio de Janeiro envolvendo os
DENV, demonstrou que as maiores cargas virais foram observadas no 1º e 4º dia da
93
doença, porém, a diferença não foi estatisticamente significativa quando comparado
a outros dias da infecção.
O nosso estudo é de alta relevância, por ser o primeiro no Brasil e no RN a
investigar a carga viral do ZIKV por dia de doença.
94
7
CONCLUSÕES
1. Das 334 amostras estudadas com suspeita de dengue, 8,08% se apresentaram
positivas para a detecção do vírus. Do total de 348 amostras que foram analisadas
para ZIKV, 20,98% foram positivas, representando a suscetibilidade da população a
este vírus;
2. Constatou-se a cocirculação dos sorotipos 1, 2 e 4 do vírus da dengue, durante o
período estudado com predominância do DENV4, que representou 66,67% dos
casos positivos;
3. Os municípios de Natal, Jandaíra, e Ouro Branco foram os que apresentaram
maior números de casos confirmados da infecção pelos DENV. Quanto ao vírus
Zika, os municípios mais incidentes foram: Natal, Parnamirim, Guamaré e Nova
Cruz;
4. A análise da distribuição espacial dos DENV e ZIKV revelou que o primeiro
município com caso confirmado do vírus Dengue no período estudado, foi Jandaíra,
enquanto que Caiçara do Rio do Vento foi o primeiro a apresentar um caso
confirmado de infecção pelo vírus Zika;
5. Junho foi o mês que apresentou maior número de casos confirmados pelos DENV
com 44,44% dos casos diagnosticados, enquanto Março foi o que apresentou maior
positividade para o ZIKV, com 23,29%, pois o primeiro semestre do ano é também o
de maior nível de chuvas no RN ;
6. Os gêneros masculino e feminino foram igualmente afetados pelos DENV, com
51,85% e 48,15%, respectivamente, dos casos confirmados. Com relação ao ZIKV,
constatou-se que o gênero feminino foi mais afetado, com 57,53% dos casos
diagnosticados;
95
7. As faixas etárias mais acometidas pelos DENV foram a de 11-20 anos e a de 5160, cada uma com 18,52%, enquanto para o ZIKV, a faixa etária de 0-10 anos teve
maior representatividade com 19,18%, seguido das idades de 31-40 e 41-50 anos,
onde cada uma representou 16,44% de positividade;
8. Constatou-se uma carga viral maior no 3° dia da doença causada pelo vírus Zika,
o que significa que esse foi o maior pico de viremia atingido durante os cinco dias da
febre zika analisados nesse estudo.
96
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