VIRULÊNCIA E SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE

CENTRO UNIVERSITÁRIO DO MARANHÃO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
ALÍCIA VALÉRIA DOS SANTOS ZARANZA DE CARVALHO
VIRULÊNCIA E SUSCEPTIBILIDADE
ANTIMICROBIANA DE AMOSTRAS DE
Pseudomonas aeruginosa ISOLADAS EM
HOSPITAIS DE SÃO LUÍS - MA
São Luís
2011
ALÍCIA VALÉRIA DOS SANTOS ZARANZA DE CARVALHO
VIRULÊNCIA E SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE AMOSTRAS DE
Pseudomonas aeruginosa ISOLADAS EM HOSPITAIS DE SÃO LUÍS - MA
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Parasitária.
Orientador: Profa. Dra. Patrícia de Maria Silva
Figueiredo
Coorientador: Prof. Dr. Valério Monteiro Neto.
São Luís
2011
Carvalho, Alícia Valéria dos Santos Zaranza de
Virulência e susceptibilidade antimicrobiana de amostras de Pseudomonas aeruginosa
isoladas em hospitais de São Luís - MA/Alícia Valéria dos Santos Zaranza de Carvalho – São Luís,
2011.
102 f.
Orientador: Profa. Dra. Patrícia de Maria Silva Figueiredo
Coorientador: Prof. Dr. Valério Monteiro Neto
Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) – Centro Universitário do Maranhão,
UNICEUMA, Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, 2011.
1. Pseudomonas aeruginosa 2. Fatores de virulência 3. Susceptibilidade antimicrobiana 4. Infecção
Hospitalar. I. Título.
CDU: 616.98:378.37(812.1)
1.1.1.1.1.1.1
CDU 616.24 – 002.5
ALÍCIA VALÉRIA DOS SANTOS ZARANZA DE CARVALHO
VIRULÊNCIA E SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE AMOSTRAS DE
Pseudomonas aeruginosa ISOLADAS EM HOSPITAIS DE SÃO LUÍS - MA
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em
Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia
/
/
, considerou a
candidata:
(
) APROVADO
(
) REPROVADO
1) Examinador _____________________________________
2) Examinador ______________________________________
3) Examinador ______________________________________
4) Presidente (Orientador)_____________________________
Aos meus pais, Araildes e Antônio
Ao meu marido, Cézar Zaranza
À minha avó, Ozita (in memoriam)
À minha irmã, Anneliza.
AGRADECIMENTOS
A Deus, minha força e meu refúgio.
Aos meus pais, pelo amor e carinho.
Ao meu marido, pela paciência e amor inabalável.
À minha irmã e Igor, pelo companheirismo.
À minha orientadora, Profa. Dra. Patrícia de Maria Silva Figueiredo, pela oportunidade e
confiança.
Ao prof. Dr. Valério Monteiro Neto, pela atenção cedida.
À Profa. Dra. Cristina de Andrade Monteiro, por sua colaboração na biologia molecular.
Ao Prof. Ms. Thiago Feitosa Ferro, pela presteza na análise estatística dos resultados.
Ao Hospital Dutra, em especial aos colegas da Microbiologia; à Dra. Ana Luiza e todo o
pessoal da direção do laboratório pelo grande apoio.
A Coordenação e aos colegas do CTA-Lira pela compreensão nos momentos de ausência.
Às minhas amigas do mestrado Roxana, Ione, Francyelle, Adriana e Márcia Boor, pela força
nas horas difíceis e pela ajuda mútua.
A Patrícia Valéria, por sua grande contribuição e dedicação na conclusão deste trabalho.
A Rosália, pela ajuda no isolamento das amostras.
A todos do Laboratório de Pesquisa do UNICEUMA, em especial, Monique, Jéssica e Diogo
pela grande colaboração na realização dos testes.
À Dra. Sirlei Garcia Marques, pelos conselhos e pela amizade.
Ao Centro Universitário do Maranhão, em especial, ao Mestrado em Biologia Parasitária e à
Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão
– FAPEMA.
“A Felicidade mantêm você doce, dores mantêm
você humano, quedas te mantêm humilde, provações
te mantêm forte, mas somente Deus te mantêm
prosseguindo.”
Autor desconhecido
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Distribuição de 100 amostras clínicas de P. aeruginosa por sítio anatômico
40
Figura 2 - Setores hospitalares onde foram isoladas cepas de P. aeruginosa no
42
período de março a julho de 2010
Figura 3 - Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das 100 cepas de P.
aeruginosa isoladas de pacientes atendidos em hospitais de São Luís-MA
(AMI=amicacina,
AZT=aztreonam,
CEP=cefepime,
CAZ=ceftazidima, 43
GEN=gentamicina, IMP=imipenem, LEV=levofloxacinaa, MER= meropenem,
PPZ=piperacilina/tazobactam, POLB=polimixina B)
Figura 4 - Frequência de isolados de P. aeruginosa resistentes aos antimicrobianos
(AMI=amicacina,
AZT=aztreonam,
CEP=cefepime,
CAZ=ceftazidima,
GEN=gentamicina, IMP=imipenem, LEV=levofloxacinaa, MER= meropenem, 44
PPZ=piperacilina/tazobactam, POLB=polimixina B)
Figura 5 - Detecção dos genes blaCTX, blaTEM e blaSHV em cepas multirresistentes de
P. aeruginosa por PCR multiplex. (Visualização em gel de agarose a 2,5 %:
M=ladder de 50pb; 1= ATCC 35218; 2=Pa02; 3=Pa13; 4=Pa14; 5=Pa06; 6=Pa10; 46
7=Pa89; 8=Pa29; 9=Pa33; 10=Pa34; 11=Pa50; 12=Pa83; 13=Pa86; 14=Pa87;
15=Pa58)
Figura 6 - Avaliação da hidrofobicidade de P. aeruginosa em concentrações
47
crescentes de sulfato de amônio
Figura 7 – Frequência dos isolados clínicos de P. aeruginosa produtores e não
49
produtores de biofilme pelo método de Cristal Violeta por indução in vitro
Figura 8 - Produção de cápsula em Ágar Vermelho Congo por cepas de P.
aeruginosa. Colônias pretas indicam resultado positivo e colônias vermelhas 52
resultado negativo
Figura 9 - Formação de biofilme por P. aeruginosa em placas de microtitulação de
poliestireno pelo método do Cristal Violeta (leitura da absorbância em 52
espectrofotômetro)
Figura 10 - Porcentagem das cepas de P. aeruginosa produtoras de exoenzimas
53
Figura 11 - Produção das exoenzimas por cepas de P. aeruginosa. A) halos de
degradação da protease em ágar skim milk 2%; B) gelatinase positiva através da
liquefação da solução de gelatina a 12%; C) halos de degradação da elastase em ágar 55
elastina a 1%
Figura 12 - Atividade hemolítica de isolados de Pseudomonas aeruginosa por tipo de
sangue (A) e em presença de quelantes e cloreto de cálcio (B). * Os isolados
apresentaram menor atividade hemolítica no sangue de cavalo (p < 0,01, Fr = 58
17,700). #Os meios com os quelantes e Cloreto de Cálcio apresentaram inibição na
sua atividade hemolítica (p> 0,05, Fr= 139,122)
Figura 13 - Halos de β-hemólise produzidos por isolados clínicos de P. aeruginosa
59
em ágar sangue de carneiro a 5%
Figura 14 - Produção de hemólise no sobrenadante de cultura de P. aeruginosa pelo
59
método da microplaca (ausência de botão: teste positivo)
Figura 15 - Microscopia óptica da adesão em células HEp-2 de cepas de P.
aeruginosa (1000X). A – Células HEp-2 sem adesão bacteriana (controle); B - Cepa
Pa31 com adesão de padrão agregativo; C - Cepa Pa87 com adesão sem padrão 65
definido
Figura 16 - Detecção dos genes aprA, algD, lasA, lasB, toxA, plcH e plcN por PCR
multiplex. Visualização em gel de agarose a 2,5 %. Canaletas M = marcador de peso
molecular (ladder de 100 pb); 1=cepa n˚ 11; 2=cepa n˚ 34; 3=cepa n˚ 39; 4=cepa n˚ 68
36; 5=cepa n˚ 45; 6=cepa n˚ 50; 7=cepa n˚ 106
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Fatores de virulência de P. aeruginosa e atividade biológica produzida no
20
hospedeiro
Tabela 2 - Classificação das betalactamases segundo Ambler e Bush
27
Tabela 3 - Sequência de oligonucleotídeos usados na detecção dos genes de
35
virulência
Tabela 4 - Primers usados na amplificação por PCR multiplex
36
Tabela 5 - Correlação entre produção de biofilme (microplaca) e hidrofobicidade
50
entre os isolados de Pseudomonas aeruginosa
Tabela 6 - Correlação entre a presença de fímbrias e cápsula e produção de biofilme
51
por cepas de P. aeruginosa
Tabela 7 - Correlação entre as exoenzimas produzidas por isolados clínicos de P.
54
aeruginosa e os Setores do Hospital, Sítios de Infecção e Instituição Hospitalar
Tabela 8 - Fatores de virulência de isolados de Pseudomonas aeruginosa segundo o
61
sítio de infecção
Tabela 9 - Propriedades de virulência de isolados de Pseudomonas aeruginosa
62
segundo a instituição hospitalar
LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC - American Type Culture Collection
ATV - Associação Tripsina-Versene
AVC - Ágar Vermelho Congo
BHI - Brain Heart Infusion
CaCl2 - Cloreto de Cálcio
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
EDDA - Ácido hidroxifenil-acético
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
ESBL - Betalactamases de Espectro Ampliado
HEp-2 – Células de carcinoma epidermoide de laringe
LPS - Lipopolissacarídeo
MEM - Meio mínimo essencial
MβLS - Metalo-β-lactamases
PBS - Phosphate Buffered Saline
PCR – Polimerase Chain Reaction (Reação em cadeia de polimerase)
rpm – rotações por minuto
SFB - Soro fetal bovino
SENTRY - Antimicrobial Surveillance Program
SPA - Serviço de Pronto Atendimento
SST3 - Sistema de Secreção Tipo III
UTI - Unidades de Tratamento Intensivo
vol - volume
RESUMO
Pseudomonas aeruginosa é um bacilo Gram-negativo não fermentador e um agente
oportunista frequentemente envolvido em infecções hospitalares e em situações de resistência
a drogas. As habilidades de invasão, colonização e de destruição tecidual apresentadas por
este patógeno devem-se aos seus múltiplos fatores de virulência. As infecções nosocomiais
causadas por P. aeruginosa são de difícil tratamento devido a sua virulência e resistência a
vários antimicrobianos. O objetivo deste trabalho foi detectar os possíveis fatores de
virulência e analisar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de diversas amostras
clínicas de P. aeruginosa, provenientes de hospitais de São Luís-MA. Foram estudados 100
isolados de P. aeruginosa obtidos de diferentes amostras clínicas hospitalares. Das 100
amostras examinadas, 52% apresentaram produção de cápsula em AVC, 86% produção de
biofilme em diferentes níveis e apenas 19% das amostras produziram fímbria manosesensível. Não houve correlação entre as fímbrias estudadas e o grau de produção de biofilme
(p=0,3). Em relação aos ensaios enzimáticos, 53%, 82%, 52%, 82% e 56% das amostras se
mostraram positivas para lipase, protease, gelatinase, fosfolipase e elastase, respectivamente.
Na detecção dos genes de virulência que codificam a produção das enzimas protease alcalina
(aprA), elastase A (lasA), elastase B (lasB), fosfolipase C hemolítica (plcH), fosfolipase C não
hemolítica (plcN), exotoxina A (toxA) e do gene algD pela técnica de PCR, verificamos que
os isolados clínicos de P. aeruginosa expressaram em maior frequência os genes aprA (64%),
lasA (51%), algD (39%) e plcH (21%). Em relação à atividade hemolítica, os isolados
apresentaram menor atividade no sangue de cavalo; nos meios acrescidos de quelantes e íon
cloreto de cálcio houve inibição de sua atividade hemolítica. Quando se comparou a hemólise
em meio líquido e sólido, verificou-se que houve melhor atividade hemolítica em meio sólido
(p<0,01, Z=7,01). Foram analisadas 34 amostras multirresistentes de P. aeruginosa para os
testes de detecção dos genes de ESBL por PCR, onde 17 (50%) das amostras foram positivas
para o gene blaTEM; e para os testes de adesão e citotoxicidade em células HEp-2, onde 9
(26,5%) amostras apresentaram adesão de padrão agregativo, 1 (2,9%) adesão de padrão
localizado e 7 amostras (20,6%) adesão sem padrão definido; e, 18 amostras (52,9%)
apresentaram efeitos citotóxicos. De acordo com os resultados, a expressão da maioria dos
fatores de virulência foi observada em percentagens variadas em todas as cepas dos materiais
clínicos analisados. Comparando os isolados entre os hospitais de origem não houve diferença
entre eles quanto a expressão dos fatores de virulência (p>0,05). Quando se comparou as
amostras multirresistentes com as sensíveis, observou-se que não há diferença quanto às
propriedades de virulência. Portanto, de acordo com os resultados encontrados, foi constatado
que a virulência dos isolados de P. aeruginosa independe da resistência apresentada aos
antibióticos e que os fatores de virulência pesquisados são importantes em todos os materiais
clínicos analisados sugerindo que a patogênese das infecções por P. aeruginosa é
multifatorial.
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa; fatores
multirresistência.
de virulência;
antimicrobianos;
ABSTRACT
Pseudomonas aeruginosa is a non-fermenting Gram-negative bacillus and a great opportunist
frequently involved in nosocomial infections and in situations of drug resistance. The skill of
invasion, colonization and tissue destruction that this pathogen shows are due to its multiple
virulence factors. Nosocomial infections caused by P. aeruginosa are difficult to treat because
of their virulence and resistance to several antimicrobials. The objective of this study was to
detect possible virulence factors and analyze the profile of susceptibility to antimicrobials of
several clinical samples of P. aeruginosa from hospitals in São Luís-MA. We have studied
100 isolates of P. aeruginosa from different hospital clinical samples. From the 100 examined
samples, 52% showed capsule production in CRA, 86% biofilm production in different levels
and only 19% of samples produced mannose-sensitive fimbriae. There was no correlation
between the studied fimbriae and the biofilm production level (p=0,3). In the enzymatic
assays, 53%, 82%, 52%, 82% and 56% of the samples were positive for lipase, protease,
gelatinase, phospholipase and elastase, respectively. In detection of the virulence genes that
encode production of the enzymes alkaline protease (aprA), elastase A (lasA), elastase B
(lasB), hemolytic phospholipase C (plcH), non-hemolytic phospholipase C (plcN), exotoxin A
(toxA) and the gene algD by PCR, we observed that the clinical isolates of P. aeruginosa
expressed in a higher frequency the genes aprA (64%), lasA (51%), algD (39%) and plcH
(21%). In relation to the hemolytic activity, the isolates showed lower activity in horse blood;
in the media with chelate and calcium chloride ion there was inhibition in the hemolytic
activity. Comparing hemolysis in liquid and solid media, we observed better hemolytic
activity in solid medium (p<0.01, Z=7.01). We analyzed 34 multiresistant samples of P.
aeruginosa in test to detect ESBL genes by PCR, where 17 (50%) samples were positive for
gene blaTEM; and in tests of adhesion and cytotoxicity in HEp-2 cells, where 9 (26.5%)
samples showed aggregative pattern adhesion, 1 (2.9%) local pattern adhesion and 7 samples
(20.6%) adhesion without a well defined pattern; also 18 samples (52.9%) showed cytotoxic
effects. According to the results, the expression of most virulence factors was observed in
different percentages in all strains from the clinical material analyzed. Comparing the isolates
among the hospitals of origin there was no difference among them related to the expression of
virulence factors (p>0.05). Comparing multiresistant to sensitive samples, we observed that
there is no difference related to the virulence properties. Therefore, according to the results
found, it has been established that the virulence of P. aeruginosa isolates does not depend on
the resistance to antibiotics and that the virulence factors studied are important in all clinical
materials analyzed, suggesting the pathogenesis of infections caused by P. aeruginosa is
multifactorial.
Key words: Pseudomonas aeruginosa; virulence factors; antimicrobials; multiresistance.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................
2.1 Bacilos Gram-negativos não fermentadores.......................................................
2.2 Caracterização de Pseudomonas aeruginosa......................................................
2.3 Patogenia.............................................................................................................
2.4 Epidemiologia.....................................................................................................
2.5 Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa.............................................
2.6 Resistência a antimicrobianos.............................................................................
3 OBJETIVOS..............................................................................................................
3.1 Geral....................................................................................................................
3.2 Específicos..........................................................................................................
4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................
4.1 Isolados bacterianos............................................................................................
4.2 Identificação das cepas de P. aeruginosa...........................................................
4.3 Susceptibilidade antimicrobiana.........................................................................
4.4 Detecção da atividade lipolítica..........................................................................
4.5 Detecção da atividade hemolítica.......................................................................
4.5.1 Pesquisa de hemolisina em meio sólido......................................................
4.5.2 Atividade hemolítica no sobrenadante de cultura (teste em microplaca)...
4.5.3 Influência da presença de íons e quelantes na atividade hemolítica...........
4.6 Detecção da atividade proteolítica......................................................................
4.7 Detecção da produção fenotípica da fosfolipase.................................................
4.8 Detecção da produção de gelatinase...................................................................
4.9 Detecção da produção de elastase.......................................................................
4.10 Produção de biofilme.......................................................................................
4.10.1 Avaliação da produção de cápsula............................................................
4.10.2 Indução de biofilme in vitro......................................................................
4.11 Identificação de fímbrias manose-sensível......................................................
4.12 Determinação da hidrofobicidade celular.........................................................
4.13 Detecção dos genes de virulência por PCR......................................................
4.14 Detecção dos genes de Betalactamase por PCR...............................................
4.14.1 Extração do DNA bacteriano....................................................................
4.14.2 Detecção de genes blaTEM, blaCTX-M e blaSHV por PCR multiplex........
4.15 Detecção de citotoxina......................................................................................
4.15.1 Preparo das culturas celulares...................................................................
4.15.2 Preparo das amostras bacterianas..............................................................
4.15.3 Teste de Citotoxicidade.............................................................................
4.16 Pesquisa de Aderência Bacteriana em Células HEp-2......................................
4.16.1 Cultivo e preparo das monocamadas celulares.........................................
4.16.2 Realização do teste de adesão...................................................................
4.17 Análise estatística..............................................................................................
4.18 Aspectos Éticos da Pesquisa.............................................................................
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................
14
16
16
16
17
21
21
23
29
29
29
30
30
30
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31
31
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33
33
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36
36
36
37
37
37
37
38
38
38
38
39
40
5.1 Análise epidemiológica......................................................................................
5.2 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos...................................................
5.3 Detecção genotípica da produção de ESBLs......................................................
5.4 Avaliação da hidrofobicidade bacteriana............................................................
5.5 Identificação dos isolados produtores de fímbrias..............................................
5.6 Formação de biofilme por cepas de P. aeruginosa............................................
5.7 Produção de exoenzimas por P. aeruginosa.......................................................
5.8 Detecção de hemolisina.....................................................................................
5.9 Propriedades de virulência quanto ao sítio de infecção e instituição hospitalar.
5.10 Citotoxicidade e adesão em células HEp-2.....................................................
5.11Perfil genotípico dos fatores de virulência em isolados clínicos de P.
aeruginosa.................................................................................................................
6 CONCLUSÃO...........................................................................................................
REFERÊNCIAS............................................................................................................
ANEXO A – LISTA DE MEIOS DE CULTURA E REAGENTES............................
ANEXO B – ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA DO CENTRO UNIVERSITÁRIO
DO MARANHÃO – UNICEUMA...............................................................................
ANEXO C – APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO XXVIII CONGRESSO DA
SOCIEDADE LATINOAMERICANA DE PATOLOGIA E CONGRESSO
BRASILEIRO DE PATOLOGIA.................................................................................
ANEXO D – APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO 26º CONGRESSO
BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA.......................................................................
ANEXO E – SUBMISSÃO DE TRABALHO PARA A REVISTA DE
PATOLOGIA TROPICAL...........................................................................................
ANEXO F – PROTOCOLO DE SUBMISSÃO DE ARTIGO À REVISTA
ARCHIVES OF MICROBIOLOGY............................................................................
ANEXO G – ARTIGO SUBMETIDO CONFORME AS NORMAS DA REVISTA
ARCHIVES OF MICROBIOLOGY..........................................................................
40
42
45
47
48
48
53
56
60
63
66
69
71
81
85
87
88
89
90
91
14
1
INTRODUÇÃO
Pseudomonas aeruginosa é o micro-organismo mais frequentemente envolvido em
infecções hospitalares e pode ser considerado oportunista, uma vez que causa doença em
indivíduos imunocomprometidos (MURRAY et al., 2000). Portadores assintomáticos, assim
como, pacientes com comprometimento imunológico, acompanhado de procedimentos
invasivos, queimaduras e feridas operatórias tornam-se porta de entrada para esta espécie
(OLIVEIRA et al., 1998; FERNANDES, 2001).
Este patógeno tem sido associado a uma ampla variedade de infecções como
bacteremias, infecções do trato urinário e respiratório e infecções de ouvidos e oculares,
resultando muitas vezes em septicemia fatal. As infecções do trato urinário estão relacionadas
ao uso de cateteres contaminados tanto pela flora do paciente como por micro-organismos
presentes nas mãos dos profissionais de saúde, entre outras fontes (SILVA, 1999; FOXMAN,
2002).
P. aeruginosa produz uma série de fatores de virulência considerados como
responsáveis pelo aumento da colonização e infecção dos tecidos do hospedeiro (KONEMAN
et al., 2006). Entre os fatores de virulência caracterizados como adesinas, têm-se os flagelos,
as fímbrias e o alginato; e entre os fatores que facilitam o rompimento da integridade epitelial
e podem degradar ou inativar importantes componentes do sistema imune podem ser citadas
as elastases, protease alcalina, fosfolipase C, entre outros (KIPNIS; SAWA; WIENERKRONISH, 2006). Os vários determinantes de virulência extracelular desta bactéria
contribuem para a citotoxicidade, necrose, invasão e disseminação (LYCZAK; CANNON;
PIER, 2000).
A maioria das cepas também produz um ou mais pigmentos, sendo o mais comum a
piocianina, que retarda o crescimento de outras bactérias, facilitando sua colonização
(TORTORA; FUNKE; CASE, 2002).
Normalmente, os carbapenêmicos são os antibióticos mais eficazes no tratamento de
infecções ocasionadas por bactérias Gram-negativas. No entanto, geralmente são empregadas
como drogas de reserva nas infecções por cepas resistentes a outros agentes beta-lactâmicos,
por isso recomenda-se restringir o uso de carbapenêmicos (SANTOS-FILHO et al., 2002).
Devidos às mutações e seleções naturais relacionadas ao uso excessivo de antibióticos,
algumas cepas de P. aeruginosa tornaram-se capazes de produzir potentes betalactamases,
15
enzimas que destroem antibióticos, incluindo os carbapenêmicos. Logo, este micro-organismo
apresenta resistência intrínseca a vários antibióticos, o que representa um grande risco para os
pacientes hospitalizados e um grande desafio para a terapêutica (SANTOS-FILHO et al.,
2002; ROSSI; ANDREAZZI, 2005).
P. aeruginosa é um micro-organismo de grande potencial patogênico e ao longo dos
anos vem se destacando entre os agentes infecciosos mais frequentemente isolados em
ambientes hospitalares. Apesar de todos os avanços médicos dos últimos anos e da alta
tecnologia no suporte de doentes críticos, as infecções nosocomiais por este patógeno
continuam associadas a elevados índices de morbimortalidade. Portanto, faz-se necessário um
estudo que vise pesquisar os possíveis fatores de virulência e analisar o perfil de
susceptibilidade aos antimicrobianos de P. aeruginosa isoladas de amostras clínicas
hospitalares, os quais possam ser importantes na elucidação de seu mecanismo de
patogenicidade e na administração de uma terapia antimicrobiana apropriada buscando a
redução no índice de mortalidade por este patógeno.
16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Bacilos Gram-negativos não fermentadores
Os bacilos Gram-negativos classificados como não fermentadores são microorganismos aeróbios, não esporulados, que se caracterizam pelo fato de serem incapazes de
utilizar carboidratos como fonte de energia através da fermentação, degradando-os pela via
oxidativa (MURRAY et al., 2003).
Os principais gêneros de bacilos Gram-negativos não fermentadores foram classificados
em cinco famílias: Pseudomonadaceae, Alcaligenaceae, Flavobacteriaceae, Methyloccaceae,
Rhyzobiaceae. A família Pseudomonadaceae inclui o gênero Pseudomonas e outros gêneros
estreitamente relacionados (KONEMAN et al., 2006).
O gênero Pseudomonas, por sua vez, é constituído por dez espécies isoladas a partir de
espécimes clínicos e do ambiente, sendo P. aeruginosa a espécie mais frequentemente
isolada. Os membros deste gênero apresentam ampla distribuição ambiental que se deve ao
fato desses micro-organismos possuírem pequena exigência nutricional e muitos fatores de
virulência que os tornam mais resistentes às condições ambientais e, também, à ação dos
antimicrobianos mais comumente utilizados (MURRAY et al., 2003; KONEMAN et al.,
2006).
2.2 Caracterização de Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa aeróbica, não fermentadora, que se
apresenta sob a forma de bacilos isolados ou aos pares, movidos por flagelos polares. Tem
tamanho de 0,5 a 0,8 por 1,5 a 3,0 μm e é de natureza ubiquitária comumente habitando o
solo, água, vegetais, animais e os mais variados ambientes hospitalares (TRABULSI;
LINCOPAN, 2008). Apresenta necessidade nutricional mínima, tolera uma ampla variedade
de temperaturas (4ºC a 42ºC), é oxidase positiva, cresce em uma grande variedade de meios
de cultura produzindo colônias grandes e irregulares que são identificadas presuntivamente
pela produção de pigmento azul-esverdeado hidrossolúvel, piocianina e pioverdina, e pelo
odor característico de frutas. Baseado em algumas características bioquímicas, P. aeruginosa
pode ser presuntivamente identificada por métodos manuais e automatizados (MURRAY et
al., 2003; KONEMAM et al., 2006).
17
P. aeruginosa possui genoma com cerca de 6,3 milhões de pares de bases e uma grande
proporção de genes regulatórios, os quais permitem a essa bactéria sobreviver em diversos
ambientes, inclusive crescer em meio com mínimos nutrientes. Conferem ainda resistência
intrínseca a drogas, por alterações de permeabilidade da membrana, efluxo ativo de
antibióticos, secreção de proteínas com função de fator de virulência, como toxinas, lipases e
proteases, sistemas quimiossensores e de quimiotaxia, e secreção de enzimas, como βlactamases (STOVER et al., 2000).
2.3 Patogenia
P. aeruginosa é caracterizada como um agente oportunista. Sua patogênese está
intimamente relacionada à condição do hospedeiro. Normalmente, alguma quebra de barreira
cutâneo-mucosa, como presença de cateter, tubo endotraqueal, queimaduras ou diminuição da
imunidade do hospedeiro, estão presentes nas infecções por este patógeno (ZAVASCKI,
2003).
A patogênese do ponto de vista microbiológico está associada à capacidade invasiva e
toxigênica dessa bactéria. Basicamente, o processo infeccioso da P. aeruginosa pode ser
dividido em três fases: 1) adesão e colonização; 2) invasão local; e 3) disseminação e doença
sistêmica. Nenhuma das fases se desenvolve sem que a anterior tenha ocorrido, embora o
processo possa se limitar a qualquer uma delas e cada uma dessas etapas é mediada por
determinantes de virulência bacterianos específicos (TODAR, 2004).
No processo de adesão e colonização, as fímbrias ou pili que possuem moléculas
ligantes (lectinas ligadoras de maltose e lectinas ligadoras de galactose) promovem a
aderência do micro-organismo a receptores de glicosídeos GM-1 presentes na superfície das
células do hospedeiro (principalmente células cutâneo-mucosas) (KIPNIS; SAWA; WIENERKRONISH, 2006). A fímbria tipo IV é composta por milhares de subunidades proteicas de
15kDa e é considerada a principal adesina de P. aeruginosa, responsável pela aderência
inicial tanto em material abiótico como na superfície de células epiteliais. Essa aderência é
mediada pela região C-terminal da subunidade estrutural da fímbria (GIRARDELLO, 2007).
O alginato, um exopolissacarídeo mucoide produzido por algumas cepas de P.
aeruginosa, também está relacionado à adesão dessas bactérias a membranas mucosas,
sobretudo em pacientes com fibrose cística. Além de funcionar como uma adesina, o
18
exopolissacarídeo também protege essas cepas da atividade mucociliar, da fagocitase e da
atividade do complemento, bem como diminui a ação dos antimicrobianos por dificultar sua
penetração na bactéria e também apresenta um importante papel na formação da arquitetura
de biofilmes por esta bactéria (ZAVASCKI, 2003; TODAR, 2004).
Biofilme é uma comunidade de micro-organismos sésseis caracterizada por células que
se aderem a um substrato biótico ou abiótico e uma às outras, embebidas em uma matriz ou
polímero extracelular, e constitui um modo de proteção dos micro-organismos permitindo sua
sobrevida em ambientes hostis. Além disso, está envolvido em diversos tipos de infecções
crônicas (DONLAN; CESTERTON, 2002). Bactérias sésseis são fisiologicamente distintas
das planctônicas da mesma espécie, tendo como característica marcante a capacidade de
serem mais resistentes aos antibióticos, pois a maioria dos antimicrobianos não consegue
penetrar na matriz extracelular do biofilme (HENTZER et al., 2001).
O mecanismo responsável pela resistência do biofilme aos antimicrobianos ainda não
está bem esclarecido. Entre as possíveis causas tem-se que dentro do biofilme pode haver: 1)
limitação na difusão do antimicrobiano; 2) as bactérias que compõem o biofilme produzem
enzimas que degradam as drogas; e 3) a justaposição das células no biofilme facilita a
transferência de genes de resistência de uma bactéria para outra por meio de plasmídeos
(GIRARDELLO, 2007).
A formação de biofilme representa um grande problema para pacientes hospitalizados,
pois, permite a colonização de cateteres e de outros dispositivos médicos e protege a bactéria
da ação dos antibióticos e do sistema imunológico do hospedeiro, o que dificulta muito o
tratamento de infecções (SOARES, 2005).
A capacidade de P. aeruginosa invadir os tecidos depende da produção de enzimas
extracelulares e toxinas. Dentre os fatores de virulência extracelulares que facilitam o
rompimento da integridade epitelial e interferem com o sistema imunológico do hospedeiro,
são citados como mais importantes as elastases, protease alcalina, fosfolipase C e hemolisinas
(JAFFAR-BANDJEE et al., 1995). A elastase parece ser a principal enzima envolvida no
processo patogênico, pois diminui a atividade mucociliar, provoca dano ao epitélio
respiratório, hemorragia intra-alveolar, degradação da laminina e elastina dos pequenos vasos,
quebra do colágeno e imunoglobulinas IgG, IgA e de fatores do complemento. A elastase
combinada com outra enzima, a protease alcalina, possui ação proteolítica sobre o interferongama e o fator de necrose tumoral alfa (KIPNIS; SAWA; WIENER-KRONISH, 2006).
19
Além disso, P. aeruginosa produz citotoxinas capazes de ocasionar danos teciduais
pulmonares, diminuição da atividade de polimorfonucleares e ativação de fatores
inflamatórios. Duas hemolisinas, fosfolipase C (hemolisina termolábil) e ramnolipídeo
(hemolisina termoestável) agem sinergicamente na degradação de lipídeos e lectina e esses
fatores contribuem para a invasão tecidual por meio de efeitos citotóxicos. A fosfolipase C
caracteriza-se por sua ação citotóxica direta, aumento da síntese de ácido aracdônico e sua
capacidade de degradação da fosfatidilcolina, um componente do surfactante pulmonar,
ocasionando microatelectasias nos alvéolos pulmonares. O ramnolipídeo diminui a atividade
mucociliar do trato respiratório (ZAVASCKI, 2003; KIPNIS; SAWA; WIENER-KRONISH,
2006).
A virulência desse micro-organismo envolve também inúmeros exoprodutos, entre os
quais se destacam os pigmentos piocianina e pioverdina e a exotoxina A. A piocianina é um
pigmento azul que possui atividade bactericida contra ampla variedade de outras bactérias,
induz apoptose em neutrófilos, diminui a concentração de glutationa reduzida (poderoso
antioxidante) e aumenta a expressão de IL-8 e da molécula de adesão intercelular (ICAM-1),
apresentando toxicidade às células de mamíferos em concentrações micromolares (ALLEN et
al., 2005).
O ferro é um elemento essencial para a maioria das bactérias e para adquiri-lo do
ambiente elas precisam de sideróforos, que são moléculas circulantes. A pioverdina é o
principal sideróforo secretado por P. aeruginosa e regula a produção dos determinantes de
virulência, exotoxina A, endoprotease e sua própria secreção, o que lhe confere um
importante papel na patogênse bacteriana. Em hospedeiros humanos e animais, o pigmento
fluorescente pioverdina compete pelo ferro ligados às proteínas transferrina e lactoferrina dos
fluidos extracelulares e à ferritina e hemoglobina internalizadas em células (LAMONT et al.,
2002).
A exotoxina A é uma proteína termolábil que tem o mesmo mecanismo de ação da
toxina da difteria, pois catalisa a ADP-ribosilação e inativação do fator de elongação 2 (EF-2)
de células eucarióticas resultando na inibição da síntese de proteínas na célula afetada e
levando à morte celular. É conhecida como o componente mais tóxico produzido por P.
aeruginosa, sendo encontrada em aproximadamente 90% dos isolados clínicos (TODAR,
2004).
20
São conhecidas quatro toxinas secretadas por P. aeruginosa diretamente no citosol da
célula hospedeira pelo Sistema de Secreção Tipo III (SST3): exotoxinas S, Y, T e U. A
exotoxina S é a de maior importância na patogênese das infecções e sua função patogênica é
atribuída principalmente à atividade da ADP-ribosiltransferase, que gera uma ruptura na
organização normal do citoesqueleto celular (KIPNIS; SAWA; WIENER-KRONISH, 2006).
A exotoxina S é comumente produzida por cepas de P. aeruginosa advindas de tecidos
queimados e de bacteremias (TODAR, 2004).
Para a disseminação sistêmica da doença, acredita-se que contribuam os mesmos fatores
que determinam a invasividade da bactéria, além da camada lipopolissacarídea (LPS). O
lipopolissacarídeo da parece celular bacteriana é responsável pelas propriedades endotóxicas
do micro-organismo e a causa da síndrome séptica: febre, choque, oligúria, leucopenia ou
leucocitose, coagulação intravascular disseminada e anomalias metabólicas (FERREIRA,
2005). Os fatores de virulência de P. aeruginosa e atividade biológica produzida no
hospedeiro encontram-se resumidas na Tabela 1.
Tabela 1 - Fatores de virulência de P. aeruginosa e atividade biológica produzida no hospedeiro.
Fator de virulência
Atividade Biológica
Alginato
Aderência à superfície epitelial pulmonar e formação de biofilmes.
Fímbrias
Aderência.
Neuraminidase
Facilita a aderência.
LPS
Síndrome séptica.
Exotoxina A
Destrói tecido, inibe síntese proteica, interrompe atividade celular e
atividade dos macrófagos.
Enterotoxina
Produz diarreia.
Exoenzima S
Inibe a síntese proteica.
Fosfolipase C
Destrói a membrana citoplasmática. Destrói o surfactante pulmonar.
Inativa opsoninas.
Elastase
Degrada imunoglobulinas e componentes do complemento.
Leucocidina
Inibe função dos neutrófilos e linfócitos.
Piocianinas
Impede crescimento de outras bactérias e elimina atividade ciliar
respiratória.
Fonte: Koneman et al., 2008.
21
2.4 Epidemiologia
P. aeruginosa é uma bactéria cosmopolita em sua distribuição, isolada do solo, da água,
de plantas, de animais e de humanos. A umidade é um fator crítico para a manutenção de
reservatórios deste micro-organismo em ambiente hospitalar, sendo isolado de equipamentos
respiratórios, soluções de limpeza, medicamentos, desinfetantes, sabões, pias e alimentos
(TODAR, 2004).
P. aeruginosa está algumas vezes presente como parte da microbiota normal de
humanos. A prevalência de colonização em pessoas saudáveis é relativamente baixa. As taxas
de colonização de sítios específicos são as seguintes: pele, 0 a 2%; mucosa nasal, 0 a 3,3%;
orofaringe, 0 a 6,6%; e intestino, 2,6 a 24%. Pacientes hospitalizados têm maior taxa de
colonização destes sítios, que aumenta com o tempo de permanência no hospital e com o uso
de antimicrobianos. São mais propensos à colonização a pele de pacientes com queimaduras
severas, o trato respiratório inferior de pacientes em ventilação mecânica, o trato
gastrointestinal de pacientes em quimioterapia e qualquer sítio em pacientes tratados com
antimicrobianos. Portanto, estima-se que mais de 50% dos pacientes hospitalizados podem
estar colonizados por esse patógeno (ZAVASCKI, 2003).
Pacientes internados, principalmente em Unidades de Tratamento Intensivo (UTI), são
colonizados devido à frequente exposição a instrumentos e aparelhos auxiliares, mãos dos
profissionais de saúde e uso de antimicrobianos de amplo espectro. Nas últimas quatro
décadas, P. aeruginosa foi responsável por 10% de todos os casos de infecções nosocomiais
relatados. Dados do programa SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program) mostraram
que no Brasil este foi o patógeno mais frequente em isolados de pneumonia hospitalar, o
segundo em infecções do trato urinário e infecções de ferida cirúrgica e o sétimo patógeno
mais frequente em infecções da corrente sanguínea nos hospitais avaliados pelo programa
(PIRES, 2009). Em um estudo do programa MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test
Information Collection), onde foram investigadas infecções causadas por bactérias Gramnegativas em vinte hospitais brasileiros, concluiu-se que P. aeruginosa foi a espécie
prevalente com 30,3%.
2.5 Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa
22
As infecções hospitalares e comunitárias têm como agentes etiológicos vários microorganismos, sendo de grande relevância as causadas por bactérias. Algumas destas
representam maior risco para o paciente devido ao perfil de sensibilidade reduzido aos
antimicrobianos, como observados em bacilos Gram-negativos não fermentadores. Neste
grupo, P. aeruginosa é a bactéria amplamente isolada nos hospitais em todo o mundo
(MARRA et al., 2006).
Geralmente o processo infeccioso se inicia após quebra de barreira anatômica, como
utilização de procedimentos invasivos. P. aeruginosa tem recebido atenção pela frequência
com que está relacionado a doenças em pacientes com comprometimento imunológico,
acompanhado de procedimentos invasivos, queimaduras e feridas operatórias, que se tornam
porta de entrada para esta espécie (MATA, 2007).
De fato, esta espécie tem sido associada a uma ampla variedade de infecções como
bacteremias, infecções do trato urinário, infecções tegumentares e ósseas, infecções
respiratórias agudas em pacientes submetidos à ventilação mecânica, infecções respiratórias
crônicas em pacientes com fibrose cística, infecções de ouvidos e oculares, resultando, muitas
vezes em septicemia fatal (KIPNIS; SAWA; WIENER-KRONISH, 2006). As infecções no
trato urinário estão relacionadas ao uso de cateteres, que são colonizados tanto pela flora do
paciente como por micro-organismos presentes nas mãos dos indivíduos da equipe de saúde,
entre outras fontes (FOXMAN, 2002).
P. aeruginosa pode causar abscessos cerebrais e meningite, pois o micro-organismo
invade o sistema nervoso central através de uma estrutura contígua, como o ouvido interno ou
seios paranasais, ou é inoculado diretamente por meio de traumatismo craniano, cirurgias ou
procedimentos invasivos de diagnóstico (TODAR, 2004).
As infecções adquiridas na comunidade, como as foliculites, oftalmites e otites externas,
tendem a ser localizadas e associadas ao contato com água contaminada (KISKA; GILLIAN,
2003).
A importância clínica deste patógeno tem se elevado significativamente em razão da
gravidade das infecções, das altas taxas de morbimortalidade em pacientes hospitalizados e de
contínuos fracassos terapêuticos (TORRES et al., 2006), consequência direta da ampla
expressão de fatores de virulência, assim como da resistência intrínseca e adquirida a diversos
agentes antimicrobianos (TRABULSI; LINCOPAN, 2008).
23
P. aeruginosa tem se mantido inalterada na sua posição entre um dos principais
patógenos causadores de infecção em UTI, onde é exercida uma grande pressão seletiva de
agentes antimicrobianos promovendo o aparecimento de cepas resistentes e multirresistentes
(TORRES et al., 2006). Infecções causadas por cepas multirresistentes são de difícil controle,
ocasionando maior tempo de internação hospitalar e alto custo com exames e medicamentos
(MARTINS, 2002).
2.6 Resistência a antimicrobianos
A resistência bacteriana aos antimicrobianos pode ser resultado de mecanismos
intrínsecos ou adquiridos. A resistência intrínseca é uma característica natural de
determinados grupos de bactérias, sendo espécies ou gênero-específica. Provém de herança
genética do micro-organismo, sendo transmitida verticalmente às células filhas. A resistência
adquirida ocorre quando as bactérias naturalmente sensíveis tornam-se resistentes, devido à
aquisição de genes de resistência decorrente da transferência de material genético ou de
mutações em genes cromossomais (POLLOTO, 2010).
Devido às mutações e seleções naturais relacionadas ao uso excessivo de antibióticos,
nos últimos anos tem sido observado um importante aumento nas taxas de resistência aos
antimicrobianos em isolados clínicos de P. aeruginosa (MATA; ABEGG, 2007; SLAMA,
2008).
A baixa permeabilidade da membrana externa a determinadas drogas, a produção de
betalactamases cromossômicas tipo AmpC e a presença constitutiva de bombas de efluxo são
mecanismos intrínsecos de resistência responsáveis pela resistência natural desta espécie às
penicilinas de espectro restrito, cefalosporinas de primeira e segunda geração, trimetoprim e
sulfonamidas. As opções terapêuticas são as penicilinas ticarcilina e piperalicina, as
cefalosporinas de amplo espectro (ceftazidima e cefepime), aztreonam, carbapenêmicos,
aminoglicosídeos e fluoroquinolonas (SPIEGEL, 2005).
Alguns dos mecanismos de resistência adquiridos são a produção de betalactamases de
diferentes classes moleculares, produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos,
alteração do alvo das fluoroquinolonas, a perda de porinas devido à mutação e a
hiperexpressão de bombas de efluxo (LIVERMORE, 2002). Cepas panresistentes combinam
diversos destes mecanismos e são resistentes praticamente a todos os antimicrobianos
24
comercialmente disponíveis, exceto a colistina e a polimixina B, este último, um agente
antimicrobiano altamente tóxico (ZAVASCKI et al., 2007).
Juntamente com outros bacilos Gram-negativos, P. aeruginosa tem apresentado
aumento no perfil de resistência às cefalosporinas de espectro ampliado de uso hospitalar,
ocasionando uso de antimicrobianos beta-lactâmicos de maior potência, como os carbapenens.
Os carbapenens, por possuírem amplo espectro de atividade e serem estáveis à maioria das
betalactamases, são uma classe de uso reservado para tratar infecções severas causadas por
micro-organismos conhecidamente resistentes às penicilinas e cefalosporinas de última
geração e são uma importante opção terapêutica para as infecções graves causadas por cepas
de P. aeruginosa multirresistentes. (PICOLI, 2008; KATTAN et al., 2008)
São utilizados o imipenem e o meropenem, pois o ertapenem, apesar de seu amplo
espectro de ação apresenta atividade limitada sobre este patógeno. Entretanto, cepas de P.
aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos têm sido isoladas frequentemente e esta resistência
é causada pelos seguintes mecanismos: hiperexpressão de sistemas de efluxo, alteração da
permeabilidade da membrana à droga, mediada pela perda ou diminuição da expressão de
porinas, alteração das proteínas ligadoras de penicilinas e produção de enzimas inativadoras
(LIVERMORE, 2001). A perda de uma porina específica, a OprD, devido a mutação no gene
OprD, que condifica porinas com reduzida afinidade pelo imipenem é considerada uma
importante causa de resistência de P. aeruginosa a esta droga e a resistência ao meropenem é
relatada como consequência da hiperexpressão do sistema efluxo MexAB-OprM
(RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ; LAURENT; NORDMANN, 2009).
A produção de carbapenemases, enzimas que inativam os carbapenêmicos, é um
mecanismo de resistência emergente que vem sendo apontado como causa da redução da
utilidade clínica do imipenem e meropenem no tratamento das infecções por P. aeruginosa
(LIVERMORE, 2002).
As betalactamases são enzimas capazes de hidrolisar os antibióticos beta-lactâmicos
através da hidroxilação irreversível da ligação amida do anel beta-lactâmico, gerando
compostos sem atividade antimicrobiana (BUSH, 2001).
Em 1989 foi proposta uma classificação, por Bush, cujo agrupamento inclui enzimas
betalactamases de todos os grupos bacterianos e que correlaciona substratos e propriedades de
inibição, integrando características funcionais e moleculares. Devido ao aparecimento
crescente de betalactamases e de sua diversidade, em 1995, o esquema de classificação
25
desenvolvido por Bush sofreu modificações propostas por Bush, Jacoby e Medeiros, a qual
deu origem a subgrupos, por exemplo, os subgrupos com o prefixo 2b, 2be, 2f, etc., para
melhor caracterizar as diferentes enzimas. Ambler propôs um outro tipo de classificação
molecular, na qual a sequência genética define quatro classes designadas como A, B, C, e D.
As enzimas da classe A, C e D são serinas betalactamases e atuam sobre o antibiótico
rompendo o anel beta-lactâmico por um mecanismo de hidrólise com consequente inativação
da droga; as enzimas da classe B utilizam íons zinco para romper o anel beta-lactâmico e
inativar o antibiótico. Atualmente, utiliza-se a combinação das características estruturais e
funcionais das betalactamases: a classificação molecular de Ambler e a classificação
funcional de Bush-Jacoby-Medeiros (ROSSI; ANDREAZZI, 2005).
As metalo-β-lactamases (MβLS), classificadas no grupo 3 de Bush e B de Ambler, são
enzimas que apresentam um largo espectro de atividade, são codificadas por genes
plasmidiais e ocorrem em espécies particulares de bactérias (JACOBY; MUNHOZ-PRICE,
2005). Elas necessitam de cátions divalentes (Zn++) como co-fatores enzimáticos, ou seja, a
droga interage com o íon zinco no sítio ativo da enzima, sendo inibidas pela ação de agente
quelante e por componentes derivados de tióis, como o ácido tiolático ou ácido 2mercaptopropiônico (2-MPA) (HEMALATHA; UMA, VIJAYLAKSHMI, 2005; MENDES
et al., 2006).
As MβLS, como todas as betalactamases, podem ser divididas em enzimas
cromossomo-mediadas e naquelas codificadas por genes transferíveis. Muitas dessas enzimas
vêm sendo descobertas e elas parecem se espalhar rapidamente devido ao seu potencial de
transferência inter e intra-espécies (JACOBY; MUNHOZ-PRICE, 2005). Essas enzimas
constituem o grupo de carbapenemases de maior importância clínica por apresentarem
atividade hidrolítica não somente sobre os carbapenêmicos, mas também sobre penicilinas,
cefalosporinas, cefamicinas e oxacefamicinas e não serem inibidas pelo ácido clavulânico ou
tazobactam (MENDES et al., 2006).
Atualmente são conhecidas seis subclasses de MβLS adquiridas: imipenemase (IMP),
descoberta no Japão; Verona imipenemase (VIM), descoberta na Itália em 1997, em uma
amostra clínica de P. aeruginosa; São Paulo metalo-beta-lactamase (SPM-1), isolada em 1997
de amostra clínica de P. aeruginosa no Hospital São Paulo da Universidade Federal de São
Paulo; German imipenemase (GIM-1), descoberta na Alemanha; Seoul imipenemase (SIM-1),
detectada em sete amostras clínicas de A. baumannii provenientes da Coreia, entre 2003 e
2004; e, Australian imipenemase (AIM), descoberta em uma amostra de P. aeruginosa isolada
26
em 2007 na Austrália. No entanto, as variantes de metalo-enzimas dos tipos IMP, VIM, SPM1 e GIM-1 são as mais relevantes clinicamente (WALSH et al., 2005). Os tipos de MβLS
detectados no Brasil são SPM, IMP e VIM (FIGUEIREDO et al., 2009).
Nos testes de disco difusão, utilizados para avaliar a susceptibilidade aos
antimicrobianos, geralmente as amostras produtoras de MβLS são resistentes à ceftazidima,
enquanto a susceptibilidade aos carbapenêmicos pode ser variada (FIGUEIREDO et al.,
2009).
Considerando a capacidade das MβLS em degradar todas as classes de beta-lactâmicos
e que está distante de se implantar uma terapêutica inibidora, a disseminação desta enzima
poderá se converter em catástrofe clínica (JACOBY; MUNHOZ-PRICE, 2005).
As Betalactamases de Espectro Ampliado (ESBL) são enzimas mediadas por genes
plasmidiais, não induzíveis, capazes de hidrolisar a cadeia oximino-beta-lactâmica presente na
estrutura química da droga. Isso faz com que seu espectro de ação se estenda aos betalactâmicos como, penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e quarta gerações
e monobactâmicos (aztreonam). Mas não conferem resistência às cefamicinas (cefoxitina e
cefotetan) e carbapenêmicos (imipenem e meropenem), sendo inibidas pelos inibidores das
betalactamases, como ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (ROSSI; ANDREAZZI,
2005).
Estas enzimas pertencem ao grupo 2be e 2d de Bush-Jacoby-Medeiros e ao grupo A de
Ambler, com exceção das ESBL tipo OXA que pertencem a classe D de Ambler e ao grupo
2be e 2d de Bush-Jacoby-Medeiros (PATERSON; BONOMO, 2005).
A existência de P. aeruginosa produtora de ESBL representa um grande desafio na
prática clínica, pois os testes disponíveis para detectar a produção de ESBL no laboratório
clínico não apresentam boa acurácia quando aplicados a este patógeno. Dessa forma, é
provável que sua prevalência nos hospitais seja subestimada (PICÃO; GALES, 2007).
Em 1993, PER-1 foi a primeira ESBL da classe A de Ambler a ser caracterizada em
uma amostra de P. aeruginosa, proveniente da Turquia. As enzimas do tipo TEM e SHV são
bastante comuns em enterobactérias e foram identificadas em isolados de P. aeruginosa entre
1996 e 2002 na França e na Tailândia. Em 1999, foi observado que 93% das amostras deste
micro-organismo resistente à ceftazidima isoladas em um hospital Tailandês produziram uma
nova ESBL denominada VEB-1. O primeiro relato de produção de ESBL por este patógeno
no Brasil data de junho de 2002, onde a amostra clínica produtora de GES-1 foi isolada de
27
uma paciente submetida à histerectomia por uma neoplasia de endométrio e desenvolveu
infecção do sítio cirúrgico, no Hospital São Paulo da Universidade Federal de São Paulo.
Portanto, em P. aeruginosa já foram descritas as ESBL tipo SHV, TEM, PER, VEB, BEL,
GES e CTX-M (PICÃO; GALES, 2005). As classificações das betalactamases encontram-se
descritas na Tabela 2.
Tabela 2 - Classificação das betalactamases segundo Ambler e Bush.
Substrato
Inibição por
clavulanato
Enzimas representantes
C
Cefalosporinas
Não
AmpC de GN, MIR
2ª
A
Penicilinas
Sim
Penicilinases de GP
2b
A
Penicilinas
Sim
TEM-1, TEM-2, SHV
2be
A
Sim
TEM-3 a TEM-26, SHV-2a SHV-6,
Grupo
Classe
1
Cefalosporinas
Penicilinas
Penicilinas
K. oxytoca K1
2br
A
Penicilinas
Sim/Não
TEM-30 a TEM-36, TRC-1
2c
A
Penicilinas
Sim
PSE-1, PSE-3, PSE-4
Sim/Não
OXA-1, OXA-11, PSE-2
Sim
Cefalosporinases induzíveis
Carbernicilina
2d
D
Penicilinas
Cloxacilina
2e
A
Cefalosporinas
de P. vulgaris
2f
A
Penicilinas
Sim
Cefalosporinas
NMC-A de Enterobacter cloacae,
Sme-1 de Serratia marcescens
Carbapenêmicos
3
4
B
Maioria dos betalactâmicos, inclusive
carbapenêmicos
Indeterminada Penicilinas
Não
L1 de Stenotrophomonas
maltophilla, CcrA de Bacteroides
fragilis, MBL
Não
Penicilinases de B. cepacia
GP: Gram-positivos; GN: Gram-negativos. Fonte: Rossi; Andreazzi, 2005.
As principais drogas consideradas antipseudomonas são: penicilinas com inibidor de
betalactamase (piperacilina combinado a tazobactam), cefalosporinas de terceira, quarta e
quinta geração (ceftazidima, cefepime e ceftobiprole), carbapenêmicos (imipenem e
meropenem), aztreonam, fluorquinolonas (ciprofloxacina e levofloxacina), aminoglicosídeos
(gentamicina e amicacina) e peptídeos catiônicos como polimixina B e colistina. No entanto, a
prevalência de isolados de P. aeruginosa resistentes a três ou mais destes antibióticos tem
aumentado consideravelmente nos últimos anos (SILVA et al., 2010).
28
A ceftazidima, o imipenem e o meropenem são os antibióticos mais utilizados para o
tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa. Embora o imipenem seja um dos agentes
antimicrobianos mais prescritos no tratamento dessas infecções, essa decisão tem sido cada
vez mais complicada pela crescente resistência exibida, além do que não é rara a resistência
conjunta aos demais antimicrobianos citados. Entretanto, a resistência deste patógeno ao
imipenem tem sido frequentemente reportada na última década no mundo e no Brasil. Esta
bactéria apresenta taxas de resistência aos carbapenêmicos bastante elevadas (ZAVASCKI,
2003; CACCI, 2007), nestas situações a polimixina B tem sido a única opção terapêutica,
embora alguns estudos já tenham mostrado a existência de cepas de P. aeruginosa com
sensibilidade reduzida a este agente (FALAGAS; KASIAKOU, 2005; LANDMAN et al.,
2005).
Atualmente, a atividade antimicrobiana da combinação de diferentes antibióticos é
estudada in vitro e in vivo, com intuito de propiciar nova alternativa terapêutica para infecções
causadas por micro-organismos multirresistentes (MITSUGUI et al., 2008).
29
3
OBJETIVOS
3.1 Geral
Detectar os possíveis fatores de virulência e analisar o perfil de susceptibilidade aos
antimicrobianos de diversas amostras clínicas de Pseudomonas aeruginosa provenientes de
hospitais de São Luís-MA, os quais possam ser importantes na elucidação do seu mecanismo
de patogenicidade.
3.2 Específicos
Identificar as unidades de internação e espécimes clínicos mais acometidos pelas
amostras em estudo;
Conhecer o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos;
Detectar a presença das ESBL nas cepas multirresistentes por PCR;
Detectar fenotipicamente a produção de lipase, protease, elastase, fosfolipase, gelatinase
e hemolisina nas amostras de P. aeruginosa;
Avaliar o tipo de fímbrias e a produção de biofilme;
Verificar a atividade citotóxica e a capacidade de adesão das amostras multirresistentes
de P. aeruginosa em células HEp-2;
Detectar a presença de genes que codificam a produção das enzimas protease alcalina,
elastase A, elastase B, fosfolipase C hemolítica, fosfolipase C não hemolítica, exotoxina
A e a presença dos genes algD;
Analisar a frequência de expressão dos diversos fatores de virulência pesquisados entre
as cepas multirresistentes.
30
4
MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Isolados bacterianos
Foram isoladas 100 cepas de Pseudomonas aeruginosa obtidas de diferentes amostras
clínicas no período de março a julho de 2010. Os isolados foram provenientes de cinco
hospitais (4 públicos e 1 particular) de São Luís do Maranhão, denominados de HospA,
HospB, HospD, HospE (hospitais públicos) e HospC (hospital particular).
4.2 Identificação das cepas de P. aeruginosa
Todas as cepas foram identificadas pelo método automatizado Vitek 2 (bioMérieux)®
em um laboratório de microbiologia local, e posteriormente estocadas em Ágar BHI acrescido
de glicerol (20%) a -20ºC para conservação e manutenção da viabilidade das mesmas. No
laboratório de Microbiologia do Centro Universitário do Maranhão (UniCEUMA) foi
realizado o reisolamento das amostras em placas de Ágar MacConkey e Ágar Sangue de
Carneiro (5%) pela técnica de semeadura em superfície para certificação da pureza das
amostras e posterior utilização na realização dos testes (KONEMAN et al. 2001). Os meios de
cultura e reagentes empregados na metodologia encontra-se no ANEXO A.
4.3 Susceptibilidade antimicrobiana
Os testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram realizados conforme o método
de disco-difusão em ágar Müeller-Hinton (Kirby-Bauer). Os resultados foram reportados
como sensível, intermediário ou resistente conforme recomendações do Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI, 2010), responsável por estabelecer os critérios e
padronização dos pontos de corte para os diferentes antibióticos. Foram testadas as seguintes
drogas (OXOID): amicacina (30 μg), aztreonam (30 μg), cefepime (30 μg), ceftazidima (30
μg), ciprofloxacina (5 μg), gentamicina (10 μg), imipenem (10 μg), levofloxacina (5 μg),
meropenem (10 μg), piperacilina/tazobactam (100 μg/10 μg) e polimixina B (300 U). Foram
definidas como cepas multirresistentes aquelas que apresentaram resistência a três ou mais
classes de antibióticos. Para o controle de qualidade empregou-se a cepa P. aeruginosa ATCC
27853 (Rockville, Md).
31
4.4 Detecção da atividade lipolítica
Para a detecção da atividade lipolítica foi utilizado o método descrito por Edberg, Gallo
e Kontnick (1996) modificado. As amostras de P. aeruginosa previamente cultivadas em ágar
nutriente a 37oC por 24 horas, foram semeadas por picada em ágar BHI suplementado com
1% de tween-80. As culturas foram incubadas à temperatura ambiente e avaliadas diariamente
por 3 dias. A presença de um halo ao redor do local da inoculação, após 2 a 3 dias, foi
considerado como teste positivo.
4.5 Detecção da atividade hemolítica
4.5.1 Pesquisa de hemolisina em meio sólido
Para a realização do ensaio de hemolisina utilizou-se ágar Müeller-Hinton contendo 5%
de sangue desfibrinado de carneiro, cavalo e humano. Para a detecção da formação de halos
de hemólise, as cepas de P. aeruginosa, previamente semeadas em BHI a 37oC por 24 horas,
foram inoculadas em pontos equidistantes nas placas de Petri, e incubadas a 37oC por 24
horas (BEUTIN et al., 1988). A atividade hemolítica foi verificada pela formação de halos ao
redor das colônias pela ação da enzima hemolítica.
4.5.2 Atividade hemolítica no sobrenadante de cultura (teste em microplaca)
Para a realização desse teste foi utilizado o método descrito por Bhakdi e TranumJensen (1986), com algumas modificações. As amostras de P. aeruginosa foram semeadas em
BHI e incubadas a 37oC por 18 horas em estufa bacteriológica. Após a incubação as amostras
foram centrifugadas (3600 rpm/15min) para obtenção dos sobrenadantes. Alíquotas de 500 μL
dos sobrenadantes foram diluídas na razão 2 com PBS (pH 7,2). Uma alíquota de 500 μL de
suspensão a 1% de hemácia de carneiro, previamente lavada três vezes com PBS (pH 7,2), foi
adicionada a cada tubo contendo os sobrenadantes e incubadas em banho maria a 37oC por 1
hora. Após esse tempo, uma alíquota de 200 μL foi retirada e adicionada a cada orifício da
microplaca de 96 poços e a atividade hemolítica foi determinada visualmente após 60 minutos
de incubação a 37oC. Foi utilizado como controle positivo de lise a suspensão de hemácias
com água destilada e como controle negativo de lise a suspensão de hemácias com PBS.
32
4.5.3 Influência da presença de íons e quelantes na atividade hemolítica
Este experimento foi realizado segundo a metodologia descrita por Beutin et al. (1988)
com algumas modificações. A atividade da hemolisina foi testada em ágar Müeller-Hinton
com 5% de sangue de carneiro, ao qual foi acrescentado separadamente os quelantes EDTA
(10 mM) e EDDA (12,5 μg/mL) e o íon CaCl2 (10 mM). A atividade hemolítica foi verificada
pela formação de halo ao redor das colônias, após semeadura por picada das amostras e
incubação a 37oC por 24 horas.
4.6 Detecção da atividade proteolítica
Para caracterizar fenotipicamente a produção da protease, empregou-se o método
descrito por Jagger, Bahner e Warren (1983). Inicialmente as amostras de P. aeruginosa
foram inoculadas em BHI e após incubação a 37oC por 24 horas, foram semeadas por picada
nas placas de Petri contendo ágar Müeller-Hinton e skim Milk (2%). A observação de halos
claros em torno dos pontos inoculados indica atividade proteolítica.
4.7 Detecção da produção fenotípica da fosfolipase
A realização do teste seguiu as recomendações descritas por Hobermann e Hardat
(1972), com algumas modificações. As cepas, inicialmente semeadas em BHI a 37oC durante
24 horas, foram inoculadas em placas com ágar Müeller-Hinton enriquecido com egg yolk
10% (vol/vol). O aparecimento de um precipitado branco ao redor ou abaixo do local do
inóculo é indicativo de produção de fosfolipase.
4.8 Detecção da produção de gelatinase
Inicialmente, as cepas foram inoculadas em BHI e após a incubação a 37oC durante 24
horas, o pré-inóculo foi inoculado em tubos (semeados em profundidade) contendo 5 mL de
uma solução de gelatina a 12%, preparada em tampão fosfato pH 7,4. Após incubação a 37oC
por 24 horas, a atividade proteolítica é observada quando ocorre liquefação da gelatina
(WILSON, 1930).
33
4.9 Detecção da produção de elastase
A produção da elastase foi realizada segundo o protocolo de Morihara (1964), com
modificações. Inicialmente, as cepas de P. aeruginosa foram semeadas em BHI, incubadas a
37oC durante 24 horas e posteriormente foram inoculadas pontualmente em placas de Petri
com o meio de cultura contendo 1% de elastina e 2% de ágar bacteriológico, diluídos em
tampão Tris-HCl (hidroximetil) aminometano 0,03M pH 8,0 e incubadas por 48 horas a 37oC
e por mais 5 dias em temperatura ambiente. A atividade de elastase foi determinada pela
observação de zonas claras ao redor do local de inoculação, em decorrência da ação da
enzima.
4. 10 Produção de biofilme
4.10.1 Avaliação da produção de cápsula
A avaliação da capacidade de P. aeruginosa em produzir cápsula foi realizada pelo
método de semeadura em Ágar Vermelho Congo, descrito por Freeman, Falkiner e Keane
(1989), com pequenas modificações. O AVC foi preparado conforme ANEXO A. Colônias de
P. aeruginosa obtidas pelo crescimento prévio overnight em BHI foram semeadas por
esgotamento no meio AVC e incubadas a 37°C por 24 horas. Os resultados foram avaliados
de acordo com a coloração apresentada pelas colônias. As amostras foram consideradas
produtoras de cápsula quando apresentaram coloração preta e as não produtoras de cápsula
quando apresentaram coloração vermelha.
4.10.2 Indução de biofilme in vitro
A formação de biofilme por P. aeruginosa também foi avaliada em placas de
microtitulação de poliestireno pelo método de Cristal Violeta descrito por Stepanovic et al.
(2007), com algumas modificações. Primeiramente, as amostras foram inoculadas em caldo
BHI e incubadas a 37°C por 24 horas. Em seguida, uma porção do caldo de cultivo foi diluída
(1:40) em meio BHI estéril. Os poços das placas de microtitulação foram preenchidos
sequencialmente com alíquotas de 200 μL de cada amostra em triplicata. No controle
negativo, transferiram-se somente 200 μL de caldo BHI em triplicata. Após preenchidas, as
placas foram incubadas a 37°C por 24 horas em estufa microbiológica. Posteriormente foram
lavadas três vezes com PBS (pH 7,4) e deixadas secar à temperatura ambiente. Depois foi
34
adicionado o Cristal violeta (200 μL/cavidade) e as placas foram incubadas por 15 minutos à
temperatura ambiente. Em seguida cada cavidade foi lavada com água destilada estéril por
três vezes e deixadas secar a temperatura ambiente.
A avaliação de formação de biofilme foi realizada através da leitura da absorbância de
cada poço utilizando-se o espectrofotômetro (BIO-RAD Laboratories PR 2100), em
comprimento de onda de 490 nm.
Baseando-se nas densidades ópticas dos isolados (DOi) e tomando-se por base a
densidade óptica do controle negativo (DOc), os isolados foram classificados nas seguintes
categorias:
- Não produtor: DOi < Doc
- Produtor fraco: DOc < DOi
(2x Doc)
- Produtor moderado: (2x DOc) < DOi
(4x DOc)
- Produtor forte: (4x DOc < DOi)
4.11 Identificação de fímbrias manose-sensível
As amostras foram previamente semeadas em BHI e incubadas a 37°C por 24 horas,
para posteriormente serem centrifugadas três vezes (3600 rpm por 15 minutos) sempre
descartando o sobrenadante e colocando PBS (pH 7,4). O sangue de carneiro foi lavado três
vezes com PBS (pH 7,4), para o preparo de uma solução de hemácias a 1% em PBS com e
sem a adição de manose (5,4g de manose/1000 mL). Cerca de 100 μL dos isolados foram
misturados, em lâminas de vidro, com 100 μL da solução de hemácias com e sem manose. As
amostras que produziram hemaglutinação somente na ausência de manose foram consideradas
manose sensíveis (CLEGG; OLD, 1979).
4.12 Determinação da hidrofobicidade celular
Após crescimento em ágar BHI por 18 horas a 37°C, as culturas foram suspensas com
concentrações crescentes de sulfato de amônio de 0,5 M, 1,0 M, 1,5 M, 2,0 M, 2,5M e 3,0 M.
A formação de grumos em até dois minutos após a suspensão indica resultado positivo
(SCHMIDT et al., 1998).
35
4.13 Detecção dos genes de virulência por PCR
A detecção dos genes de virulência que codificam protease alcalina (aprA), elastase
A (lasA), elastase B (lasB), fosfolipase C hemolítica (plcH), fosfolipase C não hemolítica
(plcN), exotoxina A (toxA) e alginato (algD) foi realizada por PCR multiplex, conforme
descrito por Lanotte et al. (2004), com modificações. As sequências dos primers utilizados
estão descritos na Tabela 3 e os primers foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA). A
extração de DNA total foi obtida pela fervura das células bacterianas por 8 minutos. As
reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 25 μL, contendo 2 μL da
lise bacteriana, 2,5 nM de dNTP, 20 pmol de cada primer, 2 mM MgCl2 e 1,0 U de Taq DNA
polymerase em tampão de reação 10x (Flexi Buffer). O DNA foi amplificado no
termociclador Mycicler (BioRad) usando o seguinte protocolo: 94°C por 3 min, 30 ciclos a
94°C por 30s, 55°C por 1 min, 72°C por 1 min e 30s e 72°C por 5 min. Os produtos da PCR
foram detectados após eletroforese em gel de agarose a 2,5% a 80 V por 55 min, sendo
posteriormente corado com brometo de etídio na concentração de 20 μg/100 mL de água e
visualizado em luz ultravioleta com auxílio do transluminador.
Tabela 3 - Sequência de oligonucleotídeos usados na detecção dos genes de virulência.
Genes
Sequências de oligonucleotídeos (5'-3')
aprA
F GTCCTATACCGTCGACCAGGC
Tamanho da
amplificação (bp)
Referência
928
(LOMHOLT et al., 2001)
514
(LOMHOLT et al., 2001)
300
(LANOTTE et al., 2004)
307
(LANOTTE et al., 2004)
466
(LANOTTE et al., 2004)
352
(LANOTTE et al., 2004)
1340
(LANOTTE et al., 2004)
R GTCGCTACCCGAGCCGCCGAT
lasA
F CGCCATCCAACCTGATGCAAT
R AGGCCGGGGTTGTACAACGGA
lasB
F GGAATGAACGAAGCGTTCTC
R GGTCCAGTAGTAGCGGTTGG
plcH
F GAAGCCATGGGCTACTTCAA
R AGAGTGACGAGGAGCGGTAG
plcN
F GTTATCGCAACCAGCCCTAC
R AGGTCGAACACCTGGAACAC
toxA
F GGTAACCACGTCAGCCACAT
R TGATGTCCAGGTCATGCTTC
algD
F ATGCGAATCAGCATCTTTGGT
R CTACCAGCAGATGCCCTCGGC
Legenda: F, forward; R, reverse (FONTE: PRADO, 2009)
36
4.14 Detecção dos genes de Betalactamase por PCR
4.14.1 Extração do DNA bacteriano
Para a extração do DNA, foi suspensa uma colônia por isolados em 1 mL de água
destilada estéril. Posteriormente, as cepas foram fervidas durante 8 minutos em banho-maria
e, em seguida, o DNA dos isolados foi mantido à temperatura de -20°C (AGERSBORG;
DAHL; MARTINEZ, 1997).
4.14.2 Detecção de genes blaTEM, blaCTX-M e blaSHV por PCR multiplex
Os primers utilizados no estudo estão listadas na Tabela 4. Os primers foram adquiridos
da Invitrogen (Carlsbad, CA) e todas as reações foram realizadas com 2,5 μL de DNA de cada
micro-organismo, 0,8 μL de primers específicos (1 μM), 0,25 μL Taq DNA polimerase (5
u/μL), 5 μL do tampão Green Go Taq Flexi Buffer (5x), 2 μL MgCl2 (2mM), 0,25 μL dNTPs
(20 mM) e 12,2 μL de água miliQ em um volume total de 25 μL. As condições para
amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial a 95°C por 15 minutos, 30 ciclos de
desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 60°C por 30 segundos, extensão a 72°C
por 2 minutos, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 minutos. As amplificações foram
realizadas no termociclador Mycicler (BioRad) e o produto amplificado de cada reação foi
separado em gel de agarose a 2,5% durante o período de 1 hora (60/80 volts), sendo
posteriormente corado com brometo de etídio na concentração de 20 μg/100 mL de água e
visualizado em luz ultravioleta com auxílio do transluminador (MONSTEIN et al., 2007).
Tabela 4 - Primers usados na amplificação por PCR multiplex.
Nome do
primer
Sequência (direção 5'- 3')
Gene
alvo
Tamanho
do
fragmento (pb)
TEM-164. SE
TEM-165. AS
TGCCCGCATACACTATTCTCAGAATGA
bla
TEM
445
CTX-M-U1
CTX-M-U2
ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC
bla
CTX-M 593
bla
SHV
ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT
TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG
bla-SHV. SE
ATGCGTTATATTCGCCTGTG
bla-SHV. AS
TGCTTTGTTATTCGGGCCAA
Fonte: Monstein et al., 2007.
747
37
4.15 Detecção de citotoxina
4.15.1 Preparo das culturas celulares
Foram utilizadas as células HEp-2 (carcinoma epidermoide de laringe) as quais foram
descongeladas rapidamente em banho-maria a 37°C e transferidas para uma garrafa de cultura
de células contendo meio MEM (meio mínimo essencial de Eagle modificado/ Cultilab),
suplementando com 10% de soro fetal bovino (SFB/ Cultilab) e 1% de solução de antibióticos
contendo penicilina (1000 U/mL; Sigma) e estreptomicina (250 μg/mL; Sigma). Os frascos de
cultura foram incubados em atmosfera de 5% de CO2 a 37°C por 48 horas, até a formação do
tapete celular. Depois o meio foi descartado, sendo adicionado à cultura celular uma solução
de ATV (Associação Tripsina-Versene/Cultilab) para o deslocamento do tapete. As células
foram ressuspendidas no meio MEM, acrescido de 10% de SFB e 1% de antibióticos, para um
número estimado de 2,5 x células/mL. A suspensão de células será distribuída em microplacas
de 96 cavidades (COSTAR), em um volume de 100 μL por cavidade. As placas foram
incubadas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por 24 horas.
4.15.2 Preparo das amostras bacterianas
As amostras de P. aeruginosa foram cultivadas em 3 mL de BHI a 37°C por 18h com
agitação a 150 rpm. Após esse período, as amostras de cada cultura foram centrifugadas (3600
rpm/10min) e seu sobrenadante coletado. O sobrenadante obtido foi centrifugado por mais
três vezes e filtrado, para total retirada das bactérias e mantido a -20°C até o momento dos
ensaios biológicos.
4.15.3 Teste de Citotoxicidade
As placas de cultura de linhagem de célula HEp-2, preparadas como descrito no item
4.15.1, foram utilizadas para detecção de citotoxinas existentes nos sobrenadantes de cultura
das amostras de Pseudomonas aeruginosa (item 4.15.2).
Alíquotas de 100 μL dos sobrenadantes foram utilizadas em duplicata, em diluições
seriadas na razão dois. As placas foram incubadas em estufa a 37°C em atmosfera de 5% de
CO2 e a leitura dos resultados foi feita em 18h, 24h e 72h após incubação. Foi utilizado como
controle positivo a solução de fenol a 2% com PBS (KONOWALCHUK; SPEIRS;
STAVRIC, 1977).
38
4.16 Pesquisa de Aderência Bacteriana em Células HEp-2
4.16.1 Cultivo e preparo das monocamadas celulares
As células HEp-2 foram descongelados em banho-maria a 37°C e transferidas para uma
garrafa de cultura de células contendo meio MEM, suplementando com 10% de soro fetal
bovino e 1% de solução de antibióticos contendo penicilina (1000 U/mL; Sigma) e
estreptomicina (250 μL/ mL; Sigma). Os frascos de cultura foram incubados em atmosfera de
5% de CO2 a 37°C por 48 horas, até a formação do tapete celular. Após esse período, o meio
foi descartado, sendo adicionado à cultura celular uma solução de ATV para o deslocamento
do tapete. As células foram ressuspensas no meio MEM, acrescido de 10% de soro fetal
bovino e 1% de antibióticos, para um número estimado de 2,5 x células/mL. A suspensão de
células foi distribuída em microplacas de 24 cavidades, contendo lamínulas, em volumes de 1
mL por cavidade. As placas foram incubadas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por 48h ou
até que a monocamada atingisse a semi-confluência.
4.16.2 Realização do teste de adesão
Um inóculo de 40 μL das amostras de Pseudomonas aeruginosa cultivadas em BHI por
18h a 37°C em agitação de 150 rpm foram adicionadas em placas de 24 orifícios, contendo
monocamadas celulares semi-confluentes de células HEp-2 contidas em MEM acrescido de
SFB a 2% na ausência ou presença de D-manose a 2%. Após 2h de incubação a 37°C em
atmosfera de 5% de CO2 (período de infecção), as placas foram lavadas com PBS e
adicionado ao meio 1 mL de MEM acrescido de SFB com e sem manose. Após 2h (período
de multiplicação), cada uma das placas foi lavada com PBS e as células foram fixadas com
metanol por um período mínimo de 10 minutos. As preparações foram coradas com MayGrunwald/Giemsa e analisadas quanto ao padrão de aderência em microscópio óptico NIKON
(SCALETSKY; SILVA; TRABULSI, 1984).
4.17 Análise estatística
Os procedimentos estatísticos compreenderam o emprego do coeficiente de
contingência C, da regressão logística múltipla e dos testes de Friedman, Qui-quadrado e
Kruskal-Wallis para a análise dos dados. Em todos os testes o nível de significância aplicado
foi de 5%. No processamento eletrônico dos dados foi utilizado o Programa BioEstat 5.0.
39
4.18 Aspectos Éticos da Pesquisa
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do UNICEUMA, segundo
emissão do parecer 303/2010 (ANEXO B), seguindo rigorosamente as normas da Resolução
CNS 196/96.
40
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise epidemiológica
As cepas de P. aeruginosa incluídas neste estudo foram isoladas de amostras clínicas
obtidas de diferentes sítios anatômicos (Figura 1). Secreção traqueal foi a amostra clínica
mais frequente, correspondendo a 25% do total. A urina correspondeu a 19% das amostras,
seguida da ponta de cateter com 12%, secreções diversas com 11%, ferida com 8%, sangue
com 7% e outros materiais clínicos (aspirado faríngeo, escara, escarro, lavado brônquico,
líquido pleural, líquido ascítico, líquor, placa de cavidade oral e swab nasal) com 18% do total
das amostras clínicas.
18%
Secreção traqueal
25%
Urina
7%
Ponta de cateter
8%
19%
11%
12%
Secreções diversas
Ferida
Sangue
Outros
Figura 1 - Distribuição de 100 amostras clínicas de P. aeruginosa por sítio anatômico.
Estudos relatam que a alta frequência de isolamento de P. aeruginosa a partir de
amostras do trato respiratório está associada à ventilação mecânica, geralmente causando
pneumonias (MENEZES et al., 2004). Um trabalho realizado por Lucchetti et al. (2005),
mostrou que esta bactéria foi o principal agente isolado de infecções do trato urinário e
segundo dados epidemiológico, 35-45% de todas as infecções hospitalares adquiridas são
urinárias, sendo que 80% estão relacionadas ao uso de cateter.
Estudos realizados no Brasil e em outros países da América Latina mostram a alta
frequência de isolamento desta bactéria a partir de amostras do trato respiratório e urina
41
(SANTOS-FILHO et al., 2002; PIRES et al., 2009; POLLOTO, 2010), corroborando com os
resultados do nosso trabalho. P. aeruginosa foi relatada como causa mais frequente de
pneumonias em pacientes hospitalizados e o terceiro patógeno mais isolado de infecções
urinárias em estudos realizados no País. Foi realizado um estudo nos Estados Unidos, no
período de 1986 a 2003, onde foram analisados isolados bacterianos adquiridos em UTI’s e
verificou-se que P. aeruginosa foi o segundo patógeno mais isolado de pneumonias
hospitalares, a terceira causa mais comum de infecções urinárias, o quarto patógeno mais
comum em infecções de sítio cirúrgico e o sexto mais isolado da corrente sanguínea
(GAYNES; EDWARDS, 2005; POLLOTO, 2010).
Quanto à procedência das cepas de P. aeruginosa, observamos que a UTI foi o setor
onde houve maior isolamento deste micro-organismo, correspondendo a 43%, seguido da
clínica médica com 31% dos isolados (Figura 2). Resultados semelhantes foram encontrados
por Menezes et al. (2004) ao estudarem o percentual de infecção e resistência de bacilos
Gram-negativos não fermentadores em um Hospital do Ceará, onde o setor com maior índice
de amostras positivas para P. aeruginosa foi a UTI.
Pode-se dizer que, este elevado índice de isolamento desta bactéria em UTI deve-se ao
fato de P. aeruginosa ser um patógeno oportunista causador de bacteremias em pacientes
imunocomprometidos, vítimas de queimaduras, portadores de infecções urinárias associadas
ao uso de cateteres e de pneumonias hospitalares associadas com a ventilação mecânica,
especialmente em unidades de terapia intensiva (TORRES et al., 2006; MENEZES et al.,
2007; FIGUEIREDO et al., 2009).
42
Figura 2 - Setores hospitalares onde foram isoladas cepas de P. aeruginosa no período de março a julho de
2010.
5.2 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos
P. aeruginosa apresenta resistência inata a várias classes de drogas, além de uma
notável habilidade em adquirir resistência a quase todos os antimicrobianos de importância
clínica, seja através de mutações ou pela aquisição de genes de outras espécies
(LIVERMORE, 2002). O monitoramento da susceptibilidade aos antimicrobianos entre
amostras hospitalares de P. aeruginosa é uma ferramenta de extrema importância, auxiliando
na escolha de esquemas adequados para tratamento de infecções por esse agente (MARRA et
al., 2006).
Entre as amostras de P. aeruginosa analisadas neste estudo, as taxas de sensibilidade
mais elevadas foram detectadas frente à amicacina (75%), piperacilina-tazobactam (69%),
fluoroquinolonas (68%), gentamicina (64%) e meropenem (62%), o que os torna boas
escolhas para o tratamento de infecções por este micro-organismo, nos hospitais avaliados
(Figura 3). Figueiredo et al. (2009), em estudo realizado no Hospital Estadual Azevedo Lima
de Niterói-RJ encontraram taxas de sensibilidade mais elevadas para amicacina (73,1%),
piperacilina- tazobactam (72%), meropenem (72,3%) e imipenem (67,4%), já em estudo
realizado nos Estados Unidos, as taxas de sensibilidade para esses antimicrobianos foram
mais elevadas, variando de 80% a 90% (KARLOWSKY; DRAGHI; JONES, 2003).
43
Em concordância com os dados da literatura, a polimixina B foi o único antimicrobiano
capaz de inibir o crescimento de todas as cepas estudadas, com uma taxa de sensibilidade de
100%, conforme Figura 3. (ZAVASCKI et al., 2007; FIGUEIREDO et al., 2009; POLLOTO,
2010).
As cepas estudadas também apresentaram taxas de resistência elevadas em relação ao
aztreonam (48%), ceftazidima (42%) e cefepime (41%), dados apresentados na Figura 4. Em
trabalho realizado por Santos-Filho et al. (2002), gentamicina, cefpiroma e aztreonam foram
os antimicrobianos para os quais as amostras bacterianas se mostraram mais resistentes, sendo
sensíveis a colistina e ceftazidima. Já no trabalho realizado por Marques et al. (2007), em
relação as cefalosporinas, ceftazidima e cefepime, a sensibilidade foi de 50,7% e 36%,
respectivamente, mostrando um perfil de resistência diferente do observado no nosso trabalho.
Perfil de Susceptibilidade ao Antimicrobianos
120
SENSÍVEL
Percentual de Amostras
100
80
INTERMEDIÁRIO
75
68
58
60
57
62
57
48
43
42
41
40
69
68
64
40
33
32
100
RESISTENTE
32
38
31
24
20
12
1
1
1
CEP
CAZ
3
0
AMI
AZT
CIP
GEN
IMP
LEV
MER
PPZ
POLB
Antimicrobianos
Figura 3 - Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das 100 cepas de P. aeruginosa isoladas de pacientes
atendidos em hospitais de São Luís-MA (AMI=amicacina, AZT=aztreonam, CEP=cefepime, CAZ=ceftazidima,
GEN=gentamicina, IMP=imipenem, LEV=levofloxacina, MER= meropenem, PPZ=piperacilina/tazobactam,
POLB=polimixina B).
Da mesma forma como foi observado em nossos resultados, Polloto (2010), no seu
estudo, também encontrou taxas de resistência elevadas em relação à ceftazidima (78,3%) e
cefepime (98,3%). O uso abusivo de cefalosporinas de terceira e quarta geração,
especialmente ceftazidima, parece ser a principal causa desse mecanismo de resistência
44
(BLATT, 2000). Já a resistência ao aztreonam, que foi observada no nosso trabalho, pode ser
atribuída a uma superexpressão do sistema efluxo MexA-MexB-OprM, que também contribui
para a expulsão de cefalosporinas e inibidores de betalactamases (SOARES, 2005).
Em relação aos carbapenêmicos, as amostras foram mais resistentes ao imipenem (43%)
do que ao meropenem (38%) (Figura 4). Variações nas taxas de resistência entre esses
antibióticos já foram descritas anteriormente. Rodríguez-Martínez, Laurent, Nordmann (2009)
observaram maiores taxas de resistência ao imipenem quando comparadas ao meropenem,
corroborando com nossos resultados. Já Silva e colaboradores (2007), em um estudo no
Brasil, descreveram maior resistência ao meropenem. Esta diferença de susceptibilidade entre
os carbapenêmicos explica-se pela ocorrência simultânea ou em diversas combinações de
vários mecanismos de resistência como perda da proteína de membrana externa OprD, que
causa resistência ao imipenem e não ao meropenem; superexpressão dos sistemas de efluxo;
e, produção de carbapenemases (BONOMO; SZABO, 2006; RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ;
LAURENT; NORDMANN, 2009).
Porcentagem de Resistência
60
48
50
Perfil de Resistência
41
43
42
38
40
32
30
33
32
31
24
20
10
0
0
AMI
AZT
CEP
CAZ
CIP GEN IMP
Antimicrobianos
LEV
MER
PPZ
POLB
Figura 4 - Frequência de isolados de P. aeruginosa resistentes aos antimicrobianos (AMI=amicacina,
AZT=aztreonam, CEP=cefepime, CAZ=ceftazidima, GEN=gentamicina, IMP=imipenem, LEV=levofloxacinaa,
MER= meropenem, PPZ=piperacilina/tazobactam, POLB=polimixina B).
Nossos resultados mostraram que 34% (34/100) das cepas estudadas apresentaram um
perfil de multirresistência. Destas, 50% (17/34) foram sensíveis somente à polimixina B. P.
aeruginosa multirresistentes têm sido relatadas com grande frequência na Europa, América do
45
Norte e América Latina, sendo que cepas isoladas na América Latina, inclusive no Brasil,
possuem as maiores taxas de resistência aos antimicrobianos, o que representa importante
impacto tanto sobre a morbidade e mortalidade como nos custos de tratamento dos pacientes
internos em ambiente hospitalar. É importante, portanto, que esses micro-organismos
portadores de resistência sejam bem caracterizados e identificados para auxiliar os clínicos em
suas opções terapêuticas (CACCI, 2007). Nestas situações, as polimixinas têm sido a única
opção terapêutica em muitos casos de infecções hospitalares graves por este patógeno
(MITSUGUI et al., 2008; POLLOTO, 2010).
Uma característica marcante das infecções por P. aeruginosa adquiridas em UTI é a
multirresistência. Neste trabalho, 53% (18/34) das cepas multirresistentes analisadas foram
provenientes da UTI. Segundo Ferreira (2005), os percentuais de resistência são mais
elevados nas amostras isoladas nestas Unidades de Tratamento refletindo maior intensidade
de uso de antimicrobianos neste ambiente e, possivelmente, transmissão de cepas
multirresistentes entre os pacientes.
5.3 Detecção genotípica da produção de ESBLs
A dificuldade na detecção de ESBL é maior em cepas de P. aeruginosa, possivelmente
devido à maior impermeabilidade da sua membrana externa quando comparado à família
Enterobacteriaceae, assim como a resistência a antimicrobianos mediada por sistemas de
efluxo e presença de betalactamases cromossomais do tipo AmpC que inativam as
cefalosporinas de amplo espectro e não são inibidas pelos inibidores de betalactamase. As
enzimas AmpC podem mascarar a presença de ESBL, logo, a detecção de ESBL em amostras
de P. aeruginosa é um grande desafio para o laboratório clínico, pois o teste fenotípico
utilizado para sua detecção não apresenta sensibilidade e especificidade satisfatória quando
aplicado à P. aeruginosa. Dessa forma, é provável que sua prevalência nos hospitais seja
subestimada (PICÃO; GALES, 2007; SILVA, 2009).
Embora saibamos que é utópico por um fim à resistência bacteriana, seu controle entre
as amostras hospitalares é indispensável à qualidade da assistência à saúde e o controle da
resistência, depende diretamente da detecção de mecanismos de resistência, como a ESBL e
do uso racional dos antimicrobianos (PICÃO; GALES, 2007). No presente estudo,
propusemos empregar métodos moleculares para a detecção de ESBLs em amostras
46
multirresistentes de P. aeruginosa, tentando contornar a dificuldade da detecção fenotípica
nos laboratórios clínicos.
Neste estudo, do total de 34 isolados multirresistentes submetidos à técnica de PCR
multiplex para a detecção de ESBL, 17 (50%) amostras foram positivas para o gene TEM
(FIGURA 5). Não foi observada a expressão dos genes SHV e CTX-M. Nossos resultados
corroboram com estudos realizados na França, onde quatro variantes do tipo TEM (TEM-4,
TEM-21, TEM-24 e TEM-42) foram descritas em P. aeruginosa neste país (MUGNIER et al.,
1996; MARCHANDIAN et al., 2000). Já no trabalho realizado por Silva (2009), onde ele
pesquisou a prevalência de ESBL em isolados clínicos de P. aeruginosa multirresistentes em
hospitais de São Paulo, entre os seis genes de ESBL pesquisados (blaCTX-M, blaOXA, blaTEM,
bla
SHV,
bla
GES e
bla
PER), foram identificados apenas dois genes em todas as amostras
estudadas: os genes blaCTX-M e blaOXA, discordando, assim, dos nossos resultados.
Desta forma, o conhecimento da ocorrência de ESBL entre amostras de P. aeruginosa é
fundamental para que o clínico possa instituir a terapia antimicrobiana adequada, já que a
utilização de cefalosporinas de amplo espectro e monobactans no tratamento das infecções
causadas por amostras produtoras de ESBL pode resultar em falência terapêutica
(BRADFORD, 2001).
Figura 5 - Detecção dos genes blaCTX, blaTEM e blaSHV em cepas multirresistentes de P. aeruginosa por PCR
multiplex. (Visualização em gel de agarose a 2,5 %: M=ladder de 50pb; 1= ATCC 35218; 2=Pa02; 3=Pa13;
4=Pa14; 5=Pa06; 6=Pa10; 7=Pa89; 8=Pa29; 9=Pa33; 10=Pa34; 11=Pa50; 12=Pa83; 13=Pa86; 14=Pa87;
15=Pa58).
47
5.4 Avaliação da hidrofobicidade bacteriana
Para avaliação da hidrofobicidade bacteriana foi realizado o teste de agregação em
concentrações crescentes de sulfato de amônio. Os resultados mostraram que P. aeruginosa
formou grumos em concentração igual ou superior a 2,5M entre a maioria dos isolados
analisados, sugerindo que estas cepas têm uma tendência hidrofóbica elevada (FIGURA 6).
Hidrofobicidade
60
50
53
50
%
40
32
30
20
13
12
7
10
0
3M
2,5 M
2,0 M
1,5 M
1,0 M
0,5 M
Concentrações de Sulfato de Amônio
Figura 6 - Avaliação da hidrofobicidade de P. aeruginosa em concentrações crescentes de sulfato de amônio.
Estudos têm demonstrado que a hidrofobicidade da superfície celular bacteriana é um
dos fatores mais importantes que regem o mecanismo de adesão bacteriana a superfícies
inanimadas e biológicas (CAPELLO; GUGLIELMINO, 2006). Portanto, quanto mais
hidrofóbico for o micro-organismo, maior será sua capacidade em formar biofilmes, pois, as
propriedades físico-químicas da superfície podem exercer uma forte influência sobre a adesão
dos micro-organismos, os quais aderem mais facilmente às superfícies hidrofóbicas (plásticas)
do que às hidrofílicas (vidro ou metais). Estudos mostram que a adesão microbiana se torna
melhor com o aumento da hidrofobicidade, tanto da superfície celular como do substrato de
adesão (RODRIGUES et al., 2009).
De acordo com outro trabalho, na fase exponencial de crescimento, as bactérias tendem
a se tornar mais hidrofóbicas e formar grumos, aderindo umas às outras ou a superfícies
presentes no meio de cultura (LOCATELLI et al., 2004).
48
Os resultados achados no nosso trabalho são condizentes com a literatura ao corroborar
a hipótese de que a hidrofobicidade celular é importante na adesão, ou seja, a adesão
microbiana torna-se melhor com o aumento da hidrofobicidade. Portanto, P. aeruginosa por
apresentar uma elevada hidrofobicidade, apresenta uma maior tendência para formar biofilme
(FLACH; KARNOPP; CORÇÃO, 2005).
5.5 Identificação dos isolados produtores de fímbrias
A interação física entre o patógeno e o hospedeiro é essencial para a patogênese de
praticamente todas as doenças bacterianas. As fímbrias mediam a ligação entre o patógeno e a
superfície das células do hospedeiro dando início à colonização e formação de um filme de
microcolônias que sofrerão maturação, constituindo o biofilme (GIRARDELLO, 2007).
No nosso trabalho buscamos identificar as fímbrias nos isolados de P. aeruginosa pela
sua habilidade de aglutinar eritrócitos. Observamos que em 19% das cepas analisadas houve
aglutinação na ausência de manose e essas fímbrias foram denominadas manose-sensível. Nas
demais cepas as fímbrias foram consideradas manose-resistente, pois houve aglutinação dos
eritrócitos mesmo na presença de manose.
As fímbrias estão presentes na maioria das bactérias Gram-negativas permitindo a
adesão às células e a outras superfícies. As infecções por P. aeruginosa envolvem diferentes
órgãos e tecidos sendo a maioria das infecções invasivas e toxigênicas, compostas por três
estágios distintos: adesão bacteriana e colonização, invasão local e doença sistêmica cada um
mediado por determinantes de virulência bacterianos específicos (TODAR, 2004).
A adesão às células do hospedeiro é crítica para o estabelecimento da infecção e pelo
menos quatro componentes estruturais da superfície de P. aeruginosa facilitam a adesão,
dentre eles as fímbrias (KIPNIS; SAWA; WIENER-KRONISH, 2006).
5.6 Formação de biofilme por cepas de P. aeruginosa
Existem vários fatores relacionados à formação de biofilmes e os principais são:
características físico-químicas do material sobre o qual estão aderidos e expressão de fatores
de virulência pelos micro-organismos, como produção de cápsula exopolimérica e síntese de
adesinas fimbriais e não fimbriais (FLACH; KARNOPP; CORÇÃO, 2005).
49
A formação de biofilme por P. aeruginosa é um fator de virulência de grande
importância que necessita de diversos estudos para melhor entender seu funcionamento. A
avaliação da capacidade de P. aeruginosa em produzir cápsula como teste presuntivo para a
formação de biofilme foi testada neste trabalho pelo método do Ágar Vermelho Congo,
através do qual foi observado que 52% das amostras analisadas foram produtoras de cápsula
(Figura 8). Já a formação de biofilme por este micro-organismo foi avaliada em placas de
microtitulação de poliestireno pelo método do Cristal Violeta, onde 14% dos isolados não
foram produtores de biofilme; 26% apresentaram-se como produtores fracos; 41% como
produtores moderados e 19% como produtores fortes, como se observa nas Figuras 7 e 9.
Girardello (2007), ao estudar a formação de biofilme em microplacas de poliestireno por
amostras de P. aeruginosa isoladas de pacientes com infecção urinária, obteve resultados
semelhantes aos da nossa pesquisa: 9% foram não produtoras, 33% produtoras fracas, 28%
produtoras moderadas e 30% fortes produtoras de biofilme.
Figura 7 - Frequência dos isolados clínicos de P. aeruginosa produtores e não produtores de biofilme pelo
método de Cristal Violeta por indução in vitro.
Essa grande capacidade de P. aeruginosa em formar biofilme representa um grande
problema para pacientes hospitalizados, pois permite a colonização de cateteres (vasculares,
peritoneais, urinários), tubos nasogástricos, tubos endotraqueais, dispositivos ortopédicos,
dentre outros, podendo desencadear infecções crônicas. Além disso, protege a bactéria do
50
sistema imune do hospedeiro e da ação dos antibióticos tornando-as, portanto, mais resistentes
às drogas (SOARES, 2005).
Na última década, os biofilmes microbianos foram intensamente estudados, uma vez
que há um grande interesse científico do conhecimento de como as bactérias formam e vivem
em comunidades multicelulares (DONLAN; CESTERTON, 2002). Muito ainda tem para se
pesquisar sobre a formação e manutenção do biofilme, buscando encontrar maneiras de
controlar sua formação ou mecanismos efetivos para sua remoção, evitando assim, a infecção
crônica e bacteremias (GIRARDELLO, 2007).
Nesta pesquisa verificamos que houve correlação entre hidrofobicidade e produção de
biofilme por P. aeruginosa (p=0,02) conforme mostra tabela 5. Dados semelhantes foram
observados no trabalho realizado por Rodrigues et al. (2009).
Tabela 5 - Correlação entre produção de biofilme (microplaca) e hidrofobicidade entre os isolados de
Pseudomonas aeruginosa.
Biofilme N=100 (%)
Não produtora
Fraco
Moderado
Forte
0,35
Hidrofobicidade
até 1,5M de Sulfato de Amônio
acima de 1,5 de Sulfato de
Amônio
Coeficiente de
Contingência C
7(7%)
2 (2%)
3 (3%)
6 (6%)
5 (5%)
15 (15%)
25 (25%)
9 (9%)
Valor
de p
0,02
Nossos resultados também mostraram a grande capacidade de P. aeruginosa na
formação de biofilme e na produção de cápsula, e um dos fatores relativos ao microorganismo que pode influir na formação de biofilme é a presença de cápsula, como foi
constatado recentemente por Jain e Agarwal (2009). Em um trabalho realizado no Rio Grande
do Sul, também foi possível estabelecer relação entre a produção de cápsula e formação de
biofilme (FREITAS et al., 2010).
Já em nosso trabalho, foi possível observar que não houve associação entre presença de
fímbrias e/ou cápsula com a produção ou grau de biofilme (Tabela 6), sugerindo que deve
haver a presença de outros tipos de fímbrias ou adesinas não fimbriais, já que 63% dos
isolados de P. aeruginosa que apresentaram biofilme forte e 46% dos moderados não
apresentaram nenhuma das fímbrias pesquisadas (dados não demonstrados). Portanto, além da
cápsula e das fímbrias manose-sensível e manose-resistente, outros componentes desta
bactéria também podem facilitar a adesão e posterior formação de biofilme, como a fímbria
tipo IV, flagelo, alginato e o LPS, que é outro fator de virulência desta bactéria responsável
51
pelo choque tóxico e que também pode agir como adesina não fimbrial (GIRARDELLO,
2007).
Tabela 6 - Correlação entre a presença de fímbrias e cápsula e produção de biofilme por cepas de P.
aeruginosa.
Presença de
Fímbrias e
Cápsula
NP
(n=14)
Fraco
(n=26)
Biofilme
Moderado
(n=41)
Forte
(n=19)
Coeficiente de
Contingência C
X²
Valor de p
0,32
12,5
0,4
FMR
4
11
17
6
FMS
1
3
5
1
Cápsula + FMR
7
8
16
12
Cápsula + FMS
2
4
2
0
NP: não produtor; FMR: fímbria manose-resistente; FMS: fímbria manose-sensível.
52
Figura 8 - Produção de cápsula em Ágar Vermelho Congo por cepas de P. aeruginosa.
Colônias pretas indicam resultado positivo e colônias vermelhas resultado negativo.
Figura 9 - Formação de biofilme por P. aeruginosa em placas de microtitulação de
poliestireno pelo método do Cristal Violeta (leitura da absorbância em espectrofotômetro).
53
5.7 Produção de exoenzimas por P. aeruginosa
A infecção por P. aeruginosa é um processo multifatorial que envolve fatores
bacterianos e do hospedeiro. A interação entre esses fatores contribui para o largo espectro de
doenças causadas por este micro-organismo, que é considerado a espécie mais virulenta
dentre os bacilos Gram-negativos não fermentadores. Isso se deve à grande variedade de
fatores de virulência celular e extracelular e entre os fatores extracelulares mais importantes
estão as exoenzimas (HOLLANDA, 2001).
P. aeruginosa elabora um grande número de exoenzimas as quais são determinantes nas
infecções causadas por este micro-organismo. Em nossos estudos observa-se que dentre as
100 cepas analisadas, 53% foram positivas para a produção de lipase, 82% foram produtoras
de protease e fosfolipase, 56% foram produtoras de elastase e 52% delas apresentaram a
característica de liquefazer a gelatina, como pode ser observado nas Figuras 10 e 11. Portanto,
esses isolados foram mais propensos a produzirem protease e fosfolipase do que as outras
enzimas (p<0,01; Q=39,39). Esses resultados já eram esperados, já que a capacidade para
degradar proteínas é fundamental na fase de colonização e adaptação do micro-organismo no
hospedeiro.
Porcentagem
Ensaios Enzimáticos
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
82%
82%
53%
Lipase
52%
Protease
Fosfolipase
Gelatinase
56%
Elastase
EXOENZIMAS
Figura 10 - Porcentagem das cepas de P. aeruginosa produtoras de exoenzimas.
54
Os resultados apresentados nesse trabalho se assemelham aos relatados por Prado
(2009), onde a expressão dessas enzimas foi detectada em altas porcentagens, com exceção da
elastase em que o percentual foi abaixo de 50%, já nos nossos estudos foi de 56%.
Essas exoenzimas contribuem para a destruição tissular e disseminação de P.
aeruginosa e também interfere com a resposta imune do hospedeiro sendo capazes de
melhorar a virulência bacteriana envolvida na destruição de macromoléculas protetoras do
hospedeiro, tais como muco, lipoproteínas de membrana e imunoglobulinas (EDBERG;
GALLO; KONTNICK, 1996; KVITKO, 2010).
Neste trabalho, não encontramos associação entre a produção de exoenzimas (lipase,
protease, fosfolipase, gelatinase e elastase) e os setores hospitalares, sítios de infecção e os
hospitais de onde foram provenientes as amostras de P. aeruginosa (Tabelas 7).
Tabela 7 - Correlação entre as exoenzimas produzidas por isolados clínicos de P. aeruginosa e os Setores do
Hospital, Sítios de Infecção e Instituição Hospitalar.
Setores do Hospital n (%)
Atividade
Enzimática Outros (n=9) UTI (n=43) Pediatria (n=8) Clínica Cirúrgica (n=35)
KruskalWallis
Valor de p
Lipase
7 (77,7%)
24 (55,8%)
3 (37,5%)
17 (48,5%)
2,39
0,66
Protease
5 (55,5%)
35 (81,3%)
6 (75%)
31 (88,5%)
1,54
0,81
Fosfolipase
7 (77,7%)
34 (79%)
7 (87,5%)
30 (85,7%)
1,43
0,83
Gelatinase
2 (22,2%)
23 (53,4%)
4 (50%)
21 (60%)
5,59
0,23
Elastase
5 (55,5%)
23 (53,4%)
4 (50%)
22 (62,8%)
0,75
0,94
Atividade
Enzimática
Outros
(n=28)
Sítios de Infecção n (%)
Ponta de cateter
Sangue
Urina
(12)
(7)
(19)
Sistema
respiratório (34)
Kruskal- Valor
Wallis
de p
Lipase
13 (46,4%)
5 (41,6%)
5 (71,4%) 10 (52,6%)
20 (58,8%)
2,19
0,7
Protease
24 (85,7%)
10 (83,3%)
6 (85,7%) 14 (73,6%)
27 (79,4%)
1,34
0,85
Fosfolipase
24 (85,7%)
10 (83,3%)
7 (100%)
17 (89,4%)
24 (70,5%)
5,47
0,24
Gelatinase
17 (60,7%)
7 (58,3%)
2 (28,5%) 10 (52,6%)
18 (52,9%)
2,07
0,72
Elastase
18 (64,2%)
7 (58,3%)
4 (57,1%) 12 (63,1%)
15 (44,1%)
2,89
0,58
Atividade
Enzimática
HospE
(n=7)
Instituição Hospitalar n (%)
HospB
HospA
HospD
(n=21)
(n=47)
(n=14)
HospC
(n=11)
KruskalWallis
Valor
de p
Lipase
3 (42,8%)
8 (38,0%)
25 (53,1%)
9 (64,2%)
8 (72,2%)
3,99
0,4
Protease
5 (71,4%)
16 (76,0%)
40 (85,1%)
12 (85,7%)
8 (72,2%)
1,89
0,75
Fosfolipase
6 (85,7%)
18 (85,7%)
38 (80,8%)
11 (78,5%)
9 (81,8%)
0,4
0,98
Gelatinase
6 (85,7%)
9 (42,8%)
23 (48,9%)
10 (71,4%)
5 (45,4%)
3,52
0,47
Elastase
5 (71,4%)
13 (61,9%)
27 (57,4%)
5 (35,7%)
5 (45,4%)
0,92
0,92
55
A
B
C
Figura 11 - Produção das exoenzimas por cepas de P. aeruginosa. A) halos de degradação da protease
em ágar skim milk 2%; B) gelatinase positiva através da liquefação da solução de gelatina a 12%; C)
halos de degradação da elastase em ágar elastina a 1%..
56
5.8 Detecção de hemolisina
Hemolisinas produzidas por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas representam um
grupo de toxinas bacterianas que, diferentemente de muitas outras toxinas, não são
internalizadas pelas células atuando como agentes ativos de membranas levando à lise e morte
celular, além de sua característica principal de lisar eritrócitos (ROWE; WELK, 1994).
Quanto à detecção da atividade hemolítica em meio sólido, nos resultados encontrados
em nosso estudo (Figura 12A), podemos observar que houve hemólise em todos os tipos de
sangue analisados. No entanto, os isolados de P. aeruginosa apresentaram menor atividade
hemolítica no sangue de cavalo (p<0,01; Fr=17,700), sugerindo que as hemolisinas podem
variar quanto a sua ação em diferentes eritrócitos.
Quanto ao tipo de hemólise, a presença do halo começou a ser evidenciado após 24
horas de incubação. Observou-se que cerca de 80% das cepas analisadas nesse trabalho
apresentaram halos de hemólise total em ágar sangue de carneiro (Figura 13) e nos demais
tipos de sangue o halo de hemólise foi parcial, sugerindo a presença de diferentes receptores
em diferentes eritrócitos.
A síntese de hemolisinas pode ser dependente de uma série de fatores presentes no meio
de cultura. Em presença de quelantes, a atividade hemolítica em algumas bactérias pode
aumentar ou diminuir. O cálcio foi descrito como sendo essencial para ativação de αhemolisina, para sua estabilidade e para a ligação da toxina às membranas dos eritrócitos
(BARATEIA et al., 2001).
A Figura 12B mostra a influência de agentes quelantes e do cloreto de cálcio na
expressão de hemolisinas e observamos que em presença do EDDA, EDTA e CaCl2 houve
inibição da atividade hemolítica quando testada nas hemácias de carneiro (p>0,05;
Fr=139,122). Para as outras hemácias este teste não foi realizado.
Apenas 37% (37/100) das cepas de P. aeruginosa examinadas apresentaram resultado
positivo para o teste de atividade hemolítica no sobrenadante (Figura 14). Quando se
comparou a hemólise em meio sólido e em meio líquido, notou-se que os isolados de P.
aeruginosa apresentaram melhor atividade hemolítica em meio sólido, ou seja, das 100
amostras analisadas, 61 apresentaram hemólise apenas no meio sólido e 37 no meio sólido e
líquido, sugerindo que a hemolisina pode ser parte constituinte da célula bacteriana e precisa
do contato com os eritrócitos para se expressar (p<0,001; Z=7,01).
57
Analisando as diferentes fontes de isolamento das amostras, não houve correlação
quanto à origem dos isolados e a presença da atividade hemolítica.
A hemolisina pode contribuir no processo da doença por ser citotóxica às células do
tecido, afetando os mecanismos de defesa do hospedeiro, permitindo assim a sobrevivência do
micro-organismo; e, pela lise do eritrócito, mecanismo através do qual o patógeno irá obter
ferro para permanecer vivo e talvez continuar a síntese da hemolisina. A produção de
hemolisina aparece como importante determinante de virulência entre as cepas de P.
aeruginosa, nas quais propicia o aumento da capacidade para provocar lesão e colonização do
tecido pulmonar (HOLLANDA, 2001).
58
Nº de isolados com atividade hemolítica
A
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Tipo A
Carneiro
Cavalo*
Tipo B
Tipo O
Humano
Tipo sanguíneo
Nº de isolados com atividade hemolítica
B
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Carneiro#
Carneiro+EDDA
Carneiro+EDTA Carneiro+Cloreto
de cálcio
Figura 12 - Atividade hemolítica de isolados de Pseudomonas aeruginosa por tipo de sangue (A) e em
presença de quelantes e cloreto de cálcio (B) * Os isolados apresentaram menor atividade hemolítica no
sangue de cavalo (p<0,01, Fr=17,700). # Os meios com os quelantes e Cloreto de Cálcio apresentaram
inibição na sua atividade hemolítica (p>0,05, Fr=139,122).
59
Figura 13 – Halos de hemólise total produzidos por isolados clínicos
de P. aeruginosa em ágar sangue de carneiro a 5%.
Figura 14 - Produção de hemólise no sobrenadante de culturas de P. aeruginosa
pelo método da microplaca (ausência de botão: teste positivo).
60
5.9 Propriedades de virulência quanto ao sítio de infecção e instituição hospitalar
Quando se comparou os isolados de P. aeruginosa quanto ao sítio de infecção e
instituição hospitalar, verificou-se que não há diferença entre eles na atividade hemolítica,
atividade enzimática, presença de fímbrias e produção de biofilme (p>0,05).
As infecções no trato urinário por P. aeruginosa estão relacionadas ao uso de cateteres
contaminados, que são colonizados tanto pela flora do paciente como pelas mãos
contaminadas dos profissionais da saúde, entre outras fontes (FOXMAN, 2002).
No nosso trabalho, em relação às cepas multirresistentes, foi observado que a maioria
delas (11/34) foi proveniente de pacientes com infecção do trato urinário (p=0,003) (Tabela
8), sugerindo, portanto, que essa bactéria continua sendo uma importante causa de infecções
urinárias hospitalares, principalmente em pacientes cateterizados e essa associação cateterbacteriúria está diretamente relacionada ao tempo de duração do uso do implante que não
pode exceder trinta dias (MATA; ABEGG, 2007). Em estudo realizado por Santos-Filho et al.
(2002), a maior parte dos isolados multirresistentes de P. aeruginosa também teve origem no
trato urinário.
Estudos mostram que em nosso país a incidência de infecções hospitalares é maior nos
Hospitais de Ensino do que nos demais Hospitais da Comunidade. Internações hospitalares
mais longas e interação mais efetiva dos pacientes com vários profissionais da área da saúde,
além de estudantes e membros da equipe, contribuem para esse aumento (BOLICK et al.,
2000). Em nossos resultados encontramos que 64% (7/11) das cepas multirresistentes isoladas
do trato urinário foram provenientes do Hospital A, que se trata de um Hospital Público de
Ensino (Tabela 9).
Quando se comparou os hospitais A, B e C em relação às cepas multirresistentes
(Tabela 9), verificou-se que há mais cepas multirresistentes nos hospitais C (p=0,005) e A
(p=0,01) do que no hospital B, dados estes que podem ser explicados pelo fato de o hospital B
ser um hospital infantil e maternidade, sugerindo que nos hospitais pediátricos deve haver um
controle de infecção hospitalar rigoroso incluindo a racionalização na utilização de
antimicrobianos e de procedimentos invasivos.
Quando se comparou as cepas multirresistentes com os outros isolados, verificou-se que
não há diferença entre esses dois grupos quanto às propriedades de virulência, nem quanto ao
setor hospitalar (dados não demonstrados).
61
Tabela 8 - Fatores de virulência de isolados de Pseudomonas aeruginosa segundo o sítio de infecção.
Propriedades de
virulência
Sítio de infecção
Ponta de
cateter
N=12 (%)
Sangue
N=7
(%)
Secreção
Traqueal
N =25 (%)
Trato
Urinário
N = 19 (%)
Ferida
N=8
(%)
Outros
N = 29
(%)
Biofilme (microplaca)
Fraco
2
1
5
8
2
8
Moderado
8
3
8
9
2
10
Forte
Biofilme (Vermelho
Congo)
1
3
6
1
2
7
5
5
15
8
6
12
Fímbrias
Fímbria manose-sensível
4
1
2
2
1
9
Atividade Hemolítica
Carneiro
12
7
21
16
8
26
Cavalo
6
6
17
11
4
13
Sangue Humano Tipo A
8
5
21
16
5
25
Sangue Humano Tipo B
8
5
20
16
4
27
Sangue Humano Tipo O
8
6
21
15
4
27
Sobrenadante
7
2
7
5
3
13
Atividade Enzimática
Lipase
6
5
14
9
3
15
Protease
10
6
19
14
6
26
Fosfolipase
10
7
19
16
8
24
Gelatinase
6
2
15
10
5
15
Elastase
7
4
15
12
3
10
1
1
7
11*
4
10
*Há mais cepas multirresistentes em pacientes com infecção do trato urinário do que pacientes com infecção por
procedimento com ponta de cateter - X2=8,63, p= 0,003, OR 15,12, IC 1,61 a 142,16. Destas 11 cepas
multirresistentes em infecção urinária 7 (64%) eram provenientes do Hosp A.
Isolados Multirresistentes
62
Tabela 9 - Propriedades de virulência de isolados de Pseudomonas aeruginosa segundo a instituição hospitalar.
Instituição Hospitalar
Propriedades de virulência
Biofilme (Microplaca)
Fraco
Moderado
Forte
Biofilme (Vermelho Congo)
Fímbrias
Fímbria manose-sensível
Atividade Hemolítica
Carneiro
Cavalo
Sangue Humano tipo A
Sangue Humano Tipo B
Sangue Humano Tipo O
Sobrenadante
Atividade enzimática
Lipase
Protease
Fosfolipase
Gelatinase
Elastase
Isolados Multirresistentes
Hosp B
N=21(%)
Hosp E
N=7(%)
Hosp C
N=11(%)
Hosp A
N=47(%)
Hosp D
N= 14(%)
3
11
6
14
2
5
0
2
2
4
0
4
15
16
12
24
4
5
1
8
4
2
2
8
3
18
15
17
18
18
8
7
4
6
6
5
3
10
6
4
7
9
5
42
25
39
37
37
17
13
5
11
12
12
4
8
16
18
9
13
2*
3
5
6
5
5
3
8
8
9
5
5
6
25
40
38
24
27
18
9
12
11
10
5
5
Hosp B X Hosp C - há mais cepas multirresistentes nos pacientes internado no Hospital C do que no Hospital
B, p=0,005, OR 11,4, IC 1,74 a 74,6, X 7,62
Hosp B X Hosp A - há mais cepas multirresistentes no Hospital A do que no Hospital B, p=0,01, OR 5,89, IC
1,23 a 28,38 X 6,62
63
5.10 Citotoxicidade e adesão em células HEp-2
Uma série de componentes de superfície e extracelulares sintetizados por P. aeruginosa
contribuem para sua virulência, mas a capacidade de aderir a superfícies inanimadas e
biológicas é uma etapa importante na patogenia das infecções por este micro-organismo
(CAPELLO; GUGLIELMINO, 2006).
Para este teste foram analisadas as 34 cepas multirresistentes de P. aeruginosa isoladas
de pacientes hospitalizados. No teste de citotoxicidade em células HEp-2, 18 amostras
apresentaram efeito citotóxico e foram observadas alterações morfológicas como
arredondamento das células, deslocamento do tapete celular e vacuolização das membranas
celulares. Essa capacidade citotóxica é justificada pelo fato de P. aeruginosa produzir toxinas
hemolíticas que agem ativamente sobre as membranas celulares, causando distúrbios na sua
estrutura e função, manifestados sob a forma de lise e consequentemente morte celular (Di
MARTINO, 2002). Esse fato foi confirmado nesse estudo, pois as 18 amostras que
apresentaram efeito citotóxico também produziram hemolisina, o que é importante na
patogênese desta bactéria.
O primeiro passo para a colonização é a adesão aos tecidos do hospedeiro. No estudo da
capacidade de aderência, os isolados de P. aeruginosa mostraram adesão às células HEp-2 e a
lamínulas. Das amostras analisadas, 26,5% (9/34) apresentaram padrão de adesão agregativo,
2,9% (1/34) padrão localizado e 20,6% (7/34) adesão sem padrão definido (Figura 15).
A adesão em células HEp-2 sugere que P. aeruginosa reconhece receptores nas células
epiteliais e, portanto, pode aderir a outros tipos de células epiteliais, o que foi confirmado por
Di Martino et al. (2002) ao demonstrar a adesão de P. aeruginosa no pneumócito (linhagem
A549), onde se observou os padrões de adesão difuso, localizado e agregativo, sugerindo que
a presença desta bactéria nas células do trato respiratório contribui na patogênese pulmonar
deste micro-organismo, especialmente em pacientes com fibrose cística, nos quais causa uma
infecção pulmonar crônica (Di MARTINO, 2002).
Os isolados bacterianos avaliados quanto ao padrão de adesão, foram obtidos de
infecções hospitalares, 32,3% de infecção urinária e 20,6% da secreção traqueal, e na maioria
dos casos, os pacientes estavam em uso de dispositivos médicos, pois 53% deles se
encontravam na UTI. Desses isolados, 41% (14/34) aderiram mais ao plástico (lamínulas) do
que às células HEp-2, confirmando o que a literatura diz sobre a capacidade desta bactéria em
aderir a superfícies inertes como cateteres, sondas, equipamentos respiratórios, implantes e
64
outros dispositivos médicos, o que representa um importante passo na colonização de
pacientes imunocomprometidos ou em uso desses dispositivos (GARCIA et al., 2002).
Rajan et al. (2000) demonstraram que apenas P. aeruginosa virulentas são capazes de
expressar tanto adesinas como citotoxinas capazes de induzir apoptose em células epiteliais
respiratórias.
65
A
B
C
Figura 15 - Microscopia óptica da adesão em células HEp-2 de cepas de P. aeruginosa (1000X). A – Células
HEp-2 não infectadas (controle); B - Cepa Pa31 com adesão de padrão agregativo; C - Cepa Pa87 com adesão
sem padrão definido.
66
5.11 Perfil genotípico dos fatores de virulência em isolados clínicos de P. aeruginosa
Ao analisarmos os fatores de virulência por PCR, verificamos que os isolados clínicos
de P. aeruginosa apresentaram todos os genes pesquisados neste trabalho (Figura 16), sendo
que, foi detectado em maior porcentagem os genes aprA (64%), lasA (51%), algD (39%) e
plcH (21%). Esses resultados se assemelham aos encontrados por Lanotte et al. (2004) e
Prado (2009), os quais em seus estudos também verificaram altas porcentagens desses genes
de virulência.
Em relação aos genes aprA e lasA, esses resultados já eram esperados uma vez que a
grande maioria dos isolados clínicos e de ambientes de P. aeruginosa são proteolíticos e
elastolíticos e essas duas enzimas contribuem para a destruição tissular e disseminação deste
micro-organismo, além de interferir com a resposta imune do hospedeiro (TODAR, 2004).
As infecções crônicas por Pseudomonas são caracterizadas pela formação de anticorpos
para lasA e lasB, enzimas que degradam a elastina, com deposição de complexos imunes nos
tecidos infectados (KVITKO, 2010).
O cluster gênico algACD é responsável pela síntese do alginato, um dos componentes
da superfície de P. aeruginosa que facilita a adesão. A expressão de algD, que codifica a
enzima GDP manose-desidrogenase, é frequentemente utilizada como indicador da expressão
dos demais genes responsáveis pela biossíntese do alginato, que é o composto primário da
matriz de polímeros orgânicos, matriz essa que envolve o biofilme em P. aeruginosa e é
considerada por alguns autores responsável pela resistência a antimicrobianos, observada em
biofilme, promovendo assim a infecção crônica (TRAUTNER; DAUROICHE, 2004;
CLUTTERBUCK et al., 2007).
No nosso trabalho, em 39% dos isolados foi detectado o gene algD. Já em outro estudo,
das 202 cepas analisadas, 91,1% apresentaram esse gene (MITOV; STRATEVA;
MARKOVA, 2010). Apesar de o alginato ser um exopolissacarídeo mucoide que forma uma
cápsula proeminente na superfície bacteriana favorecendo a adesão e posterior formação de
biofilme, a análise estatística dos dados não mostrou correlação entre a formação de biofilme
e a detecção do gene algD (p=0,13;
2
=2,19), sugerindo que outros genes que regulam a
síntese do alginato (algC, algR, algP, algB, algU) possam estar presentes.
P. aeruginosa secreta duas fosfolipases C, uma hemolítica e outra não hemolítica.
Nossos resultados mostraram que 21% das amostras analisadas apresentaram o gene plcH
(fosfolipase C hemolítica) e apenas 11% apresentaram o gene plcN (fosfolipase C não
67
hemolítica). Dos isolados clínicos que apresentaram o gene plcH, 38% (8/21) foram
provenientes do trato respiratório de pacientes hospitalizados, sugerindo que a fosfolipase C
hemolítica (hemolisina termo-lábil) atua como determinante de virulência na patogênese da
infecção pulmonar inativando o surfactante pulmonar que pode ser responsável pelas
atelectasias associadas às infecções pulmonares crônicas e agudas por P. aeruginosa
(KIPNIS; SAWA; WIENER-KRONISH, 2006).
A virulência deste micro-organismo envolve inúmeros exoprodutos, entre os quais se
destaca a exotoxina A. No entanto, apenas 6% das cepas de P. aeruginosa analisadas na nossa
pesquisa apresentaram o gene toxA. Destes isolados, 50% (3/6) foram provenientes do trato
respiratório, 33,3% (2/6) do trato urinário e apenas 16,7% (1/6) do swab de secreção. Sharma
et al. (2004) em seus estudos, sugeriram que a exotoxina A secretada por P. aeruginosa é um
importante fator de virulência durante infecções pulmonares, septicemia e infecções de córnea
e que a contribuição deste fator de virulência em infecções pulmonares agudas e crônicas tem
sido bastante estudada. No entanto, não existe qualquer informação sobre a contribuição da
exotoxina A em infecções do trato urinário causadas por este patógeno.
Ao analisarmos estatisticamente a produção fenotípica de protease e a detecção do gene
aprA (protease alcalina), observamos que não houve correlação, pois, das 82 amostras
positivas no teste fenotípico, em 68% (56/82) não foi detectado esse gene (p=0,09;
2
=2,72),
sugerindo que P. aeruginosa pode produzir também outras enzimas proteolíticas, tais como as
proteases neutras, elastase e gelatinase.
Nas amostras que apresentaram hemólise em meio líquido não foi detectado o gene
plcH (p=0,008;
2
=20,69) que codifica a fosfolipase C hemolítica, sugerindo que esse micro-
organismo produza outros tipos de hemolisinas. Segundo Delden e Iglewski (1998),
fosfolipase C hemolítica e rhamnolipídeo são duas hemolisinas produzidas por P. aeruginosa
que poderiam atuar de maneira sinérgica para degradar lipídeos e lecitinas, e ambos podem
contribuir para a invasão dos tecidos devido os seus efeitos citotóxicos.
Em relação à elastase, nossos resultados mostraram que das 56 amostras positivas para
o teste fenotípico, 60,7% apresentaram o gene lasA e das 44 amostras de P. aeruginosa que
foram negativas, em 61,4% não foi detectado o mesmo gene, dados estes que foram
estatisticamente significantes (p=0,02;
2
=7,08).
68
Figura 16 - Detecção dos genes aprA, algD, lasA, lasB, toxA, plcH e plcN por PCR multiplex. Visualização em
gel de agarose a 2,5 %. Canaletas M = marcador de peso molecular (ladder de 100 pb); 1=cepa n° 11; 2=cepa n˚
34; 3=cepa n˚ 39; 4=cepa n˚ 36; 5=cepa n˚ 45; 6=cepa n˚ 50; 7=cepa n˚ 106.
69
6
CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho chegam-se as seguintes conclusões:
A maioria das cepas de P. aeruginosa analisadas foi isolada da secreção traqueal
(25%) e da urina (19%). Quanto a procedência, 43% dos isolados foram
provenientes da UTI seguido da Clínica Médica com 31%;
Quanto ao perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos as amostras foram mais
sensíveis frente à amicacina, piperacilina-tazobactam, fluoroquinolonas,
gentamicina e meropenem e altas taxas de resistência em relação aztreonam,
ceftazidima e cefepima;
Cerca de 34% (34/100) das amostras de P. aeruginosa examinadas foram
multirresistentes e destas, 50% (17/34) foram consideradas panresistentes, pois
só apresentaram sensibilidade à polimixina B;
Nossos estudos mostraram que, das cepas multirresistentes submetidas à PCR
para detecção de ESBL, 50% (17/34) foram positivas para o gene TEM;
Quanto à formação de biofilme, 52% das amostras foram produtoras de cápsula
(Vermelho Congo) e 14%, 26%, 41% e 19% das cepas foram não produtoras,
produtoras fracas, moderadas e fortes, respectivamente, pelo método em
microplaca;
Quanto à avaliação da hidrofobicidade bacteriana, P. aeruginosa foi considerada
com hidrofobicidade elevada e houve correlação entre hidrofobicidade e
produção de biofilme;
Na pesquisa de fímbrias, 19% das cepas apresentaram fímbria manose-sensível;
Não houve associação entre presença de fímbrias e/ou cápsula com a produção
ou grau de biofilme;
Protease e fosfolipase, dentre as exoenzimas, foram aquelas que apresentaram
uma maior frequência, representada por 82% de positividade contra os
percentuais de 56%, 53% e 52% encontrados para elastase, lipase e gelatinase,
respectivamente;
Não houve correlação entre a produção das diferentes exoenzimas estudadas e os
setores hospitalares, sítios de infecção e as instituições hospitalares;
Na detecção de hemolisina em meio sólido, as amostras de P. aeruginosa
apresentaram menor atividade hemolítica no sangue de cavalo e 80% das cepas
70
apresentaram hemólise total em sangue de carneiro. Na presença de EDDA,
EDTA e CaCl2 houve uma inibição da expressão de hemolisina testada em
hemácias de carneiro;
Apenas 37% (37/100) dos isolados mostraram atividade hemolítica no
sobrenadante, portanto, ao comparar hemólise em meio líquido e sólido,
verificou-se que o micro-organismo apresentou melhor atividade hemolítica em
meio sólido;
Não houve correlação entre os vários fatores de virulência detectados neste
estudo e o sítio de infecção e instituição hospitalar;
Em relação às cepas multirresistentes, a maioria delas (11/34) foram
provenientes de infecção do trato urinário devido o uso de cateter e 64% (7/11)
destas cepas foram isoladas de pacientes internados no Hospital A, que se trata
de um Hospital Público de ensino;
O Hospital B, por se tratar de um hospital pediátrico, foi o que apresentou o
menor número de cepas multirresistentes;
Quando se comparou as cepas multirresistentes com os outros isolados, não foi
observada diferença entre eles quanto aos fatores de virulência e o setor
hospitalar;
Das 34 cepas multirresistentes de P. aeruginosa submetidas ao teste de
citotoxicidade e adesão em células HEp-2, 18 amostras apresentaram efeitos
citotóxicos, 9 apresentaram padrão de adesão agregativo, 1 padrão localizado e 7
amostras apresentaram adesão sem padrão definido;
Nos isolados clínicos de P. aeruginosa foi detectado em maior porcentagem os
genes aprA (64%), lasA (51%), algD (39%) e plcH (21%);
Não houve correlação entre a formação de biofilme e a detecção do gene algD;
Houve correlação significativa entre a produção fenotípica de elastase e a
detecção do gene lasA nas amostras analisadas;
Torna-se cada vez mais relevante a busca por estratégias alternativas de
tratamentos das infecções por P. aeruginosa, por isso o interesse crescente no
estudo dos fatores de virulência buscando a elucidação dos mecanismos de
adaptação e de patogenicidade deste micro-organismo, além da interpretação
criteriosa do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, que é fundamental
para auxiliar o clínico na indicação de um tratamento adequado e eficaz.
71
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Sul, Porto Alegre, 2003.
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treatment of multidrug-resistant pathogens: a critical review. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, v. 60, n. 6, p. 1206-1215, 2007.
80
ANEXOS
81
ANEXO A – LISTA DE MEIOS DE CULTURA E REAGENTES
BHI líquido
O meio foi preparado segundo as especificações do fabricante (Difco), distribuído em tubos
com volume de 2 mL cada e autoclavado a 121ºC por 15 minutos. O meio foi utilizado para o
crescimento das amostras.
Ágar BHI
O meio foi preparado segundo as especificações do fabricante (Difco) e autoclavado a 121ºC
por 15 minutos. O meio foi distribuído assepticamente em placas de Petri estéreis e utilizado
para o crescimento das amostras.
Ágar sangue
O meio Müeller-Hinton foi preparado segundo as especificações do fabricante (Difco) e
autoclavado a 121ºC por 15 minutos, após seu resfriamento foi adicionado 5% de sangue
desfibrinado e, em seguida, distribuído assepticamente em placas de Petri estéreis. Foram
feitas placas de ágar com sangue de carneiro, cavalo e humano A, B e O para os testes de
hemólise.
Ágar Müeller-Hinton
O meio foi preparado segundo as especificações do fabricante (Difco) e autoclavado a 121ºC
por 15 minutos. O meio foi distribuído assepticamente em placas de Petri estéreis.
Skim Milk (2%)
O meio foi preparado segundo as especificações do fabricante (HIMEDIA) e autoclavado a
121ºC por 5 minutos. Posteriormente foi acrescentado ao Ágar Müeller-Hinton e distribuído
assepticamente em placas de Petri estéreis.
Egg Yolk (10%)
O meio foi preparado segundo as especificações do fabricante (Laborclin). Posteriormente foi
acrescentado ao Ágar Müeller-Hinton e distribuído assepticamente em placas de Petri estéreis.
82
Solução de Gelatina (12%)
Foi preparada uma solução de gelatina (DIFCO) a 12% em PBS (pH 7,4), distribuído em
tubos com volume de 2 mL cada e autoclavado a 121ºC por 15 minutos.
Ágar bacteriológico
O meio foi preparado segundo as especificações do fabricante (HIMEDIA) e autoclavado a
121ºC por 15 minutos. Posteriormente o meio foi distribuído assepticamente em placas de
Petri estéreis e utilizado para o crescimento das amostras.
Ágar Elastina (1%)
Foi preparada uma solução contento 1% de elastina (INLAB) e 2% de ágar bacteriológico
(HIMEDIA) diluídas em tampão Tris-HCl (hidroximetil) aminometano 0,03M (pH8,0).
Posteriormente foi autoclavado a 121ºC por 15 minutos e distribuído assepticamente em
placas de Petri estéreis.
Ágar Nutriente
O meio foi preparado segundo as especificações do fabricante (HIMEDIA) e autoclavado a
121ºC por 15 minutos. O meio foi distribuído assepticamente em placas de Petri estéreis.
Ágar MacConkey
O meio foi preparado segundo as instruções do fabricante (HIMEDIA) e esterilizado em
autoclave a 121ºC por 15 minutos e posteriormente distribuído assepticamente em placas de
Petri estéreis. O meio foi utilizado para verificação da pureza das amostras de P. aeruginosa.
83
Vermelho Congo
Caldo de BHI
Sacarose
Ágar base
Vermelho Congo
Completar o volume para 1000 mL
Esterilizar por autoclavação por 121ºC por 15 minutos.
37 g
50 g
15 g
0,8 g
Gel de Agarose 2,5%
Agarose
TBE 5x
Água destilada
2,5 g
10 mL
90 mL
PBS 10 X
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
Água destilada
Completar o volume para 1000 ml
Estocar em geladeira.
80,0 g
2,0 g
14,4 g
2,4 g
800 mL
PBS 1 X
PBS 10x
Água destilada
Completar o volume para 1000 ml
Ajustar o pH 7,4
Esterelizar por autoclavação por 121ºC por 15 minutos.
100 mL
800 mL
TBE 10 X
Tris base (Trizma)
Ácido bórico
EDTA
Completar para 1000 ml de H2O milli-Q
Filtrar em nitrocelulose
108 g
55 g
7,44 g
TBE 0,5 X
TBE 10x
Completar o volume para 1000 ml.
25 mL
84
Cristal Violeta
Solução A
Cristal violeta (90-95% de pureza)
Etanol 95%
Filtrar em papel de filtro.
2g
20 mL
Solução B
Oxalato de amônio
Água destilada
0,2 g
80 mL
Misturar as soluções colocando-se a solução B sobre a A.
Deixar em repouso por 24 horas, filtrando em seguida, Estocar
em frasco âmbar.
Solução Tris-HCl 1 M pH 8,0
Tris-base
Água destilada (q.s.p)
121 g
1000 mL
Solução Tris-HCl 0,03 M pH 8,0
Solução Tris-HCl 1 M
Água destilada
15 mL
485 mL
Corante Azul de Bromofenol
Bromofenol
Xilene cyanol
Sacarose
Água destilada (q.s.p)
0,25 g
0,25g
40 g
100 mL
Brometo de Etídio
Brometo de Etídio
Água destilada
1g
100 mL
Homogeneizar em agitador magnético até completa dissolução e
transferir a solução para um frasco opaco e estocar em
temperatura ambiente.
85
ANEXO B (frente) – ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA DO CENTRO UNIVERSITÁRIO
DO MARANHÃO - UNICEUMA
86
ANEXO B (verso) – ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA DO CENTRO UNIVERSITÁRIO
DO MARANHÃO - UNICEUMA
87
ANEXO C – APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO XXVIII CONGRESSO DA
SOCIEDADE LATINOAMERICANA DE PATOLOGIA E CONGRESSO BRASILEIRO
DE PATOLOGIA
88
ANEXO D – APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO 26º CONGRESSO BRASILEIRO
DE MICROBIOLOGIA
89
ANEXO E – SUBMISSÃO DE TRABALHO PARA A REVISTA DE PATOLOGIA
TROPICAL
90
ANEXO F – PROTOCOLO DE SUBMISSÃO DE ARTIGO À REVISTA ARCHIVES OF
MICROBIOLOGY
91
ANEXO G – ARTIGO SUBMETIDO CONFORME AS NORMAS DA REVISTA
ARCHIVES OF MICROBIOLOGY
ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY, BIOFILM PRODUCTION AND ADHESION TO HEp-2
CELLS OF Pseudomonas aeruginosa STRAINS ISOLATED FROM CLINICAL SAMPLES
Alicia Valéria Zaranza*;
Francyelle Costa Morais;
Monique Santos do Carmo;
Adriana de Mendonça Marques;
Cristina Andrade-Monteiro;
Thiago Feitosa Ferro;
Valério Monteiro-Neto;
Patrícia de Maria Silva Figueiredo
Núcleo de Pesquisa em Doenças Endêmicas e Parasitárias, Centro Universitário do Maranhão – UniCEUMA,
Rua Josué Montello, n. 01, Renascença II, São Luís – Ma, Cep: 65075-120.
* Corresponding author: e-mail: [email protected]; Fone: (98) 8122-8767; (98) 3226-2954.
ABSTRACT
A hundred Pseudomonas aeruginosa strains from several clinical specimens from five hospitals in São Luís-MA
were evaluated for biofilm production, prevalence of the gene algD, adhesion to HEp-2 cells and antimicrobial
susceptibility. The most affected clinical specimens and hospital sectors were also evaluated. Most isolates were
obtained from the tracheal aspirate (21.0%) and the most affected hospital sector was the ICU (43.0%). The
antibiotics with the highest sensitivity rate were amikacin, piperacillin/tazobactam, fluoroquinolones, gentamicin
and meropenem and the ones with the highest resistance rate were aztreonam, ceftazidime and cefepime. All
samples were sensitive to polymyxin B. In relation to the expression of the gene for ESBL, 50.0% (17/34) of the
multiresistant strains showed the enzyme TEM. Most strains showed high hydrophobicity and 96% of the
isolates produced biofilm on a polystyrene microplate, 52% were capsule producers, 19% showed mannosesensitive fimbriae and 39% expressed the gene algD. We observed adhesion to HEp-2 cells and to the coverslip.
These factors may be reported in the pathogenesis of this bacterium, what represents a potential risk for
colonization of medical devices which favor the establishment of chronic nosocomial infections.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa, antimicrobial, biofilm, adhesion.
INTRODUCTION
Pseudomonas aeruginosa is a glucose non-fermenting Gram-negative bacillus, which is widely
distributed in nature and in hospital environment, since it has minimum nutritional necessities, being able to
survive in several surfaces and in humid places. This bacterium rarely causes severe infections in healthy
individuals, nevertheless, it represents a great threat for hospitalized patients (Karlowski et al. 2003). It is an
opportunist bacterium, invasive and toxigenic that, over the last few years, has reached an important position
among the nosocomial pathogens for causing pneumonia related to mechanical ventilation, bacteremia,
endocarditis, meningitis, urinary infections associated to catheters and skin infections, especially in critical ICU
patients and in those who are immunocompromised (Navon-Venezia et al. 2005).
Nosocomial infections caused by P. aeruginosa are related to high morbimortality rates and among the
risk factors for colonization or invasive infection by this pathogen, we can include the prolonged use of
antimicrobials, previous hospitalization, severe base disease, operation and immunosuppression (Picoli, 2008).
This bacterium shows instrinsec resistance to several antibiotics, combined with the ability of getting new
resistance information during treatments, through mutations in porins (decrease in OprD), super expression of
efflux pumps (MexAB-OprM) and/or production of hydrolytic enzymes that degrades antimicrobials, such as
betalactamase and metallo-β-lactamases (Hemaltha et al. 2005; Zavascki et al. 2006).
The carbapenems have been considered the drugs of choice in the treatment of severe nosocomial
infections caused by Gram-negative bacteria. However, the isolation of bacteria is already common in Brazilian
hospitals, especially P. aeruginosa, resistant to these antibiotics and in these cases polymyxin is the only
therapeutic option (Mitsugui et al. 2008).
92
The pathogenesis of the infections caused by P. aeruginosa is multifactorial and involves several
virulence factors (Sharma et al. 2004). Among the factors characterized as adhesins, there are flagella, fimbriae
and alginate. The fimbriae or pili promote the adherence of the bacterium to receptors on the surface of the host
cell, and the type IV fimbria, especially the adhesin of this bacterium, is responsible for the initial adhesion both
in abiotic material and in the surface of epithelial cells, and the flagella, primarily responsible for the motility,
may act also as adhesins to the epithelial cells (Kipnis et al. 2006).
The alginate, a mucoid exopolysaccharide produced by some strains of P. aeruginosa, in addition to
functioning as an adhesin, it also protects the strains from the mucociliary activity, phagocytosis, complement
system activity, reduces the antimicrobial action, making its penetration in the bacterium difficult, and it is also
associated to biofilm production (Zavascki 2003).
Biofilm is a community of bacteria adhered to a biotic and/or abiotic surface, promoting survival
advantages for micro-organisms, as resistance to antimicrobials, protection against antiseptics, disinfectants,
bacteriophages, host’s immune system, among other (Klausen et al. 2006; Clutterbuck et al. 2007).
The objectives of this study were: to identify the inpatient units and the clinical specimens most affected
by P. aeruginosa; to analyze the profile of susceptibility to antimicrobials and the expression of extendedspectrum betalactamase in multiresistant strains by PCR; to evaluate the type of fimbriae, the hydrophobicity and
the biofilm production; examine the prevalence of the gene encoding the alginate and check the adhesion
capacity of the multiresistant samples in HEp-2 cells.
MATERIAL AND METHOD
Bacterial Strains
We evaluated 100 strains of P. aeruginosa isolated from several clinical specimens of inpatients from one
private and four public hospitals in São Luís–MA, from March to July, 2010. The distribution of samples per
hospital was: HospA (47.0%), HospB (21.0%), HospC (11.0%), HospD (8.0%) e HospE (13.0%). All strains
were identified through the automated method Vitek 2 (bioMérieux) in a local microbiology laboratory. In the
tests, the strains P. aeruginosa ATCC 27853 and E. coli ATCC 25922 were used as positive and negative
control, respectively.
Antimicrobial susceptibility
This test was conducted through the disk diffusion antibiotic sensitivity testing (Kirby and Bauer), with
the following antimicrobials (OXOID): amikacin, gentamicin, cefepime, ceftazidime, ciprofloxacin,
levofloxacin, aztreonam, imipenem, meropenem, piperacillin/tazobactam and polymyxin B. The reading of the
zones of inhibition for each antibiotic followed the criteria established by the Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI 2010) and the results were reported as susceptible, intermediate or resistant. We considered as
multiresistant those strains that showed resistance to three of more classes of antibacterials.
Amplification of β-lactamase genes by PCR
The detection of the genes blaTEM, blaCTX-M and blaSHV, which encodes the β-lactamase (ESBL)
enzymes, was carried out by multiplex PCR, according to what is described by Monstein et al. (2007). The
primers used are described in Table 1. The total DNA extraction was carried out by boiling the bacterial cells for
10 minutes. The amplification reactions were performed with 2.5µL of DNA from each strain, 0.8µL of specific
primers (1µM), 0.25µL Taq DNA polymerase (5u/µL), 5µL of the buffer solution Green Go Taq Flexi Buffer
(5x), 2µL MgCl2 (2mM), 0.25µL dNTPs (20mM) and 12.2µL of milli-Q water in a final volume of 25µL. DNA
was amplified in the thermocycler Mycicler (BioRad), using the following protocol: 95°C for 15min., 30 cycles
at 94°C for 30s., 60°C for 30s., 72°C for 2min and 72°C for 10 min. The PCR products were detected after
electrophoresis in agarose gel 2.5% at 60/80v for 55min., then stained with ethidium bromide (20µg/100mL of
water) and viewed under ultraviolet light with the aid of a transilluminator.
Table 1 Primers used in amplification by multiplex PCR for ESBL detection.
Evaluation of capsule production
This test was performed by the method of inoculation in Congo Red Agar (CRA), described by Freeman
et al. (1989), with minor modifications. The CRA was prepared from 37g.L-1 of BHI, 50g.L-1 saccharose (Difco),
15g.L-1 agar base (Difco) and 0.8g.L-1 Congo Red (Difco). After overnight growth, the strains were inoculated
onto CRA and incubated at 37°C/24hours. The black bacterial colonies were considered as capsule producers
and the red ones were non-producers.
93
Biofilm induction in vitro
This test was performed in microtiter plates of polystyrene by the Crystal Violet method, described by
Stepanovic et al. (2007). After inoculation in BHI and incubation at 37°C/24hours, the samples were diluted
(1:40) in sterile BHI and then, 200µL of each sample in triplicate were added to the wells of the polystyrene
plate, with only 200µL of BHI in triplicate as negative control and the plates were incubated at 37°C/24hours.
They were subsequently washed (3x) with PBS (pH 7.4), left to dry at room temperature, added crystal violet
(200µL/well) and incubated for 15 minutes at room temperature. Then, each well was washed with sterile
distilled water (3x) and left to dry at room temperature. Biofilm formation was evaluated by the reading of the
absorbance of each well using a spectrophotometer (BIO-RAD Laboratories PR 2100), at a wavelength of
490nm. Based on the optical density of the samples (ODi) and on the average of optical density of the negative
control (ODc), the samples were classified as strong (4xODc < ODi), moderate (2xODc < ODi ≤ 4xODc), weak
(ODc < ODi ≤ 2xODc) or non-producer of biofilm (ODi < ODc).
Fimbriae identification
The samples were inoculated in BHI, incubated at 37°C/24h and centrifuged three times
(360rpm/15min.), highlighting the supernatant and adding PBS (pH 7.4). The sheep blood was washed three
times with PBS (pH7.4) to prepare a solution of erythrocytes 1% in PBS with and without mannose addition
(5.4g of mannose/1000mL). On glass slides, 100µL of the isolates were mixed with 100µL of the erythrocytes
solution with and without mannose. The samples that suffered hemagglutination only in the absence of mannose
were considered mannose-sensitive and the one that suffered hemagglutination in presence and absence of
mannose, mannose-resistant (Clegg and Old 1979).
Evaluation of bacterial hydrophobicity
After growth in agar BHI for 18 hours at 37°C, the cultures were suspended in increasing concentrations
of ammonium sulfate (0.5M, 1M, 1.5M, 2M, 2.5M and 3M). The formation of clumps within two minutes after
suspension indicated positive result (Schmidt et al. 1998).
Search for the gene algD by PCR
The PCR technique was performed with the oligonucleotides (F-ATGCGA ATCAGCATCTTTGGT and
R-CTACCAGCAGATGCCCTCGGC) specific for the gene algD, that encodes GDP mannose 6-dehydrogenase
(alginate), amplifying a fragment of 1310 pairs of nitrogenous bases. The total DNA extraction was obtained by
boiling the bacterial cells for 10 min. The amplification reactions were performed in a final volume of 25µL,
containing 2µL of bacterial DNA, 2.5nM of dNTP, 20pmol of the primer, 2mM Mgcl 2 and 1.0U of Taq DNA
polymerase in reaction buffer 1x (Flexi Buffer). DNA was amplified in the thermocycler Mycicler (BioRad)
using the following protocol: 94°C for 3min., 30 cycles at 94°C for 30s.,55°C for 1min., 72°C for 1min. and 30s.
and 72°C for 5 min. The PCR products were detected after electrophoresis in agarose gel 2.5% at 80v for
55min., then stained with ethidium bromide (20µg/100mL of water) and viewed under ultraviolet light with the
aid of a transilluminator (Lanotte et al. 2004).
Test of adhesion to HEp-2 cells
Only multiresistant strains were tested. An inoculum with 40µL of each of these strains cultivated in BHI
was added to plates of 24 wells, containing cellular half-confluent monolayer of HEp-2 cells in MEM medium
with SFB 2% in absence or presence of D-mannose 2%. After 2h of incubation at 37°C in atmosphere of 5% of
CO2 (period of infection), the plats were washed with PBS and we added to the medium 1mL of MEM plus SFB
with and without mannose. After 2h (multiplication period), the plates were washed with PBS and the cells were
fixed with methanol for at least 10 minutes. Afterwards, they were stained with May-Grunwald/Giemsa and
analyzed according to the adherence pattern on the optical microscope NIKON (Scaletsky et al. 1984).
Statistical analysis
We used the Contingency Coefficient C and the Chi-squared distribution. Values of p<0.05 were
considered significant. In data electronic processing, we used the program BioEstat 5.0.
RESULTS
The highest percentages of P. aeruginosa isolates were in the tracheal secretion, with 25 samples (25.0%)
and in urine, with 19 (19.0%). The places with highest incidence of this bacterium were ICU, with 43 samples
(43.0%), followed by the internal medicine ward, with 31 (31.0%) (Table 2).
Table 2 Distribution of P. aeruginosa samples according to clinical specimens and hospital sectors
94
The strains showed most sensitivity to amikacin (75.0%), piperacillin/tazobactam (69.0%),
fluoroquinolones (68.0%), gentamicin (64.0%) and meropenem (62.0%). The antibiotics with the highest
resistance rates were aztreonam (48.0%), imipenem (43.0%), ceftazidime (42.0%), cefepime (41.0%) and
meropenem (38.0%). All the isolates were susceptible to polymyxin B.
From all the isolates, 34.0% (34/100) showed a multiresistance profile. From these, 50.0% (17/34) were
sensitive only to polymyxin B. Our results also showed that 53.0% (18/34) of the multiresistant strains were
from the ICU. These strains were also submitted to the multiplex PCR technique for detecting ESBL S, and
50.0% (17/34) of the samples expressed the gene TEM, there was no expression of the genes SHV and CTX-M.
In the evaluation of bacterial hydrophobicity, 50.0-53.0% of the isolates had clumps formation in
ammonium sulfate concentrations equal or above 2.5M. In the identification of the isolates which produced
fimbriae, 19.0% were producers of fimbriae mannose-sensitive, and in the others, the fimbriae were considered
mannose-resistant.
The evaluation of the capability of P. aeruginosa in producing capsule as a presumptive test for biofilm
production by the method CRA, showed that 52.0% of the analyzed samples were capsule producers. In relation
to biofilm formation on polystyrene microplates, from the 86 (86.0%) strains that adhered to polystyrene, 19
(22.1%) were strongly adhered, 41 (47.7%) were moderate and 26 (30.2%) were weakly adhered.
From the 100 strains of P. aeruginosa tested, 39% showed presence of the gene algD which participates
in the synthesis of alginate, the main component of the matrix produced by bacteria associated to biofilm. It was
possible to observe a fragment of approximately 1310pb by electrophoresis in agarose gel.
About the capacity of adhesion of multiresistant strains to HEp-2 cells, 26.5% (9/34) showed an
aggregative adhesion pattern, 2.9% (1/34) local pattern and 20.6% (7/34) adhesion without a well defined pattern
(Fig. 1), and 41% (14/34) of the samples adhered more to plastic (coverslips) than to cells.
Fig. 1 Optical microscopy of adhesion on HEp-2 cells of P. aeruginosa strains (1000X). A - HEp-2
cells alone; B - Strain Pa31 with aggregative adhesion pattern; C - Strain Pa87 without a well defined
adhesion pattern
DISCUSSION
The infections caused by P. aeruginosa are associated to significant morbimortality rates, due to this
pathogen capability of adapting to the environmental conditions, developing resistance to antibiotics and
producing a variety of virulence factors (Mitov et al. 2010).
In this study, most samples were isolated from tracheal secretion and urine of inpatients and the ICU was
the hospital sector with the highest isolation of this bacterium. Studies report that the high frequency of isolation
of this pathogen from respiratory tract samples is related to mechanical ventilation, usually causing pneumonia
(Menezes et al. 2004). A study by Lucchetti et al. (2005) showed that P. aeruginosa was the main isolated agent
causing infections in the urinary tract, and according to epidemiologic data, 35.0% to 45.0% of all acquired
nosocomial infections are urinary and 80.0% are related to catheter use. Similar results were found by Torres et
al. (2006), who found the highest percentual of Pseudomonas spp isolates in the tracheal tract, followed by urine,
and the place with the highest incidence was the ICU.
The high incidence of this bacterium in the ICU is probably due to the fact that P. aeruginosa is an
opportunist pathogen that causes bacteremia in immunocompromised patients, burn victims, patients with
urinary infections related to catheters use and nosocomial pneumonia, related to mechanical ventilation,
especially in this unit (Menezes et al. 2006; Torres et al. 2006; Figueiredo et al. 2009)
Monitoring the susceptibility of P. aeruginosa hospital samples to antimicrobials is a helpful tool for
choosing the right scheme to treat infections caused by this agent (Marra et al. 2006). The analyzed strains
showed high sensitivity rates to amikacin, piperacillin/tazobactam, fluoroquinolones, gentamicin and
meropenem, what makes them good choices for treating infections by this pathogen. Figueiredo et al. (2009)
found high sensitivity for amikacin, piperacillin/tazobactam, meropenem and imipenem.
In agreement to literature data, all strains were susceptible to polymyxin B. Nevertheless, it is indicated
for specific situations, due to its toxicity. There are reports about P. aeruginosa strains with reduced sensitivity
to this drug (Figueiredo et al. 2009; Zavascki et al. 2007).
The isolates showed high resistance to aztreonam, ceftazidime and cefepime, however, in the study by
Santos-Filho et al. (2002), gentamicin, cefpirome and aztreonam were the most resistant. The abusive use of 3rd
and 4th generation cephalosporins, especially ceftazidime (3rd generation), seems to be the main cause of this
resistance. Resistance to aztreonam may be due to a superexpression of the MexA-MexB-OprM efflux pump,
which also contributes to the expulsion of cephalosporin and betalactamase inhibitors (Blatt 2000).
In relation to carbapenems, the samples were more resistant to imipenem than to meropenem. Variations
in the resistance rates between these antibiotics have been previously described. Rodríguez-Martínez et al.
(2009) observed higher resistance rates to imipenem when compared to meropenem, corroborating our results.
Silva et al. (2007), in a study in Brazil, described higher resistance to meropenem. This susceptibility difference
95
among carbapenems is explained by several resistance mechanisms, such as loss of proteins of external
membrane OprD, that causes resistance to imipenem and not to meropenem; superexpression of efflux systems;
and carbapenemase production (Bonomo and Szabo 2006; Rodríguez-Martínez et al. 2009).
Our results also showed that 34.0% of the strains had a multiresistance profile, where 50.0% were
susceptible only to polymyxin B. The emergence of P. aeruginosa multiresistant to drugs has been reported as an
increasing problem in hospitals worldwide (Galles et al. 2001; Bratu et al. 2005).
A remarkable feature in infections by P. aeruginosa acquired in the ICU is multiresistance, what has been
confirmed in this study, in which 53% of the multiresistant strains were from the ICU, suggesting that it might be
indiscriminate use of antimicrobials in the treatment of nosocomial infections.
Currently, the combination of different antibiotics is studied in vitro and in vivo, with the intention of
providing new therapeutic alternatives for infections caused by multiresistant bacteria (Mitsugui et al. 2008).
The difficulty in detecting ESBLs is higher in P. aeruginosa strains, possibly due to the higher
impermeability of the external membrane when compared to the family Enterobacteriaceae and also to the
presence of the enzymes AmpC that may disguise the presence of ESBLs. Therefore, detecting these enzymes in
P. aeruginosa strains is a great challenge for the clinical laboratory, since the phenotypic test of disk
approximation does not have satisfactory sensitivity and specificity when used for this pathogen. Thus, it is
probable that its prevalence in hospitals is underestimated (Picão and Gales 2007).
The dissemination of the genes for these enzymes may play an important role in antimicrobial resistance
and the presence of P. aeruginosa producing ESBL can limit the antibiotics choice for treating severe infections
by this pathogen. That is why it is important to use molecular methods to detect ESBLs in multiresistant samples
of P. aeruginosa (Wedhagen et al. 2003).
In this study, 50.0% (17/34) of the multiresistant strains have expressed the enzyme TEM, what
corroborates studies performed in France, where four variants of TEM (TEM-4, TEM-21, TEM-24 and TEM-42)
were described in P. aeruginosa (Wedhagen et al. 2003).
Thus, knowing about the occurrence of ESBLs in P. aeruginosa samples is essential so that the internist
can choose an appropriate antimicrobial therapy, since the use of broad-spectrum cephalosporin and
monobactams in the treatment of infections caused by ESBL-producers may result in therapeutical failure
(Bradford 2001).
Bacterial adhesion may be divided into primary and secondary stages. The primary is reversible and
determined by physico-chemical variables, as hydrophobic interactions, that determine adhesion between the two
surfaces, the bacterial cell and the surface of interest. In secondary adhesion, a molecular mediation happens
between specific adhesins and the surface and the micro-organism consolidates the adhesion through producing
an exopolysaccharide complex and/or connecting specific receptors in the fimbriae to the material surface. In the
end of this stage, adhesion is irreversible (Vesterlund et al. 2005; Rodrigues et al. 2009). Therefore, adhesion
depends basically on factors that involve features from the micro-organism, the surface and environmental
conditions.
In our study, most strains of P. aeruginosa showed clumps formation in concentrations of 2.5M and 3M
of ammonium sulfate, that is, our isolates had high hydrophobicity. Studies show that the higher the
hydrophobicity, the better the microbial adhesion, both in cell surface and in adhesion substrate (Rodrigues et al.
2009). Thus, this data suggests that P. aeruginosa has a strong adhesion capacity and, consequently, a higher
tendency to biofilm formation, since it has high hydrophobicity (p=0.02; C=0.35).
Fimbriae are structural components of the surface of P. aeruginosa and also ease adhesion (Kipnis et al.
2006). These structures mediate the connection between the pathogen and the surfaces of the host’s cells, starting
colonization and formation of a film of microcolonies which will mature, forming biofilm, critical for the
infection establishment (Trautner and Darouiche 2004). In this study, we identified mannose-sensitive and
mannose-resistant fimbriae.
There are several factors related to biofilm formation, the main are: physico-chemical features of the
material on which it is adhered and expression of virulence factors by the micro-organisms, as exopolymeric
capsule production and fimbrial and non-fimbrial adhesins synthesis (Flach et al. 2005).
One of the factors related to the micro-organism that may influence the biofilm formation is the presence
of capsule, as recently found by Jain and Agarwal (2009) and corroborated by this study.
Adhesion is the first step for biofilm formation. In this model, the assays performed with the crystal violet
method provided information about the adhesion of the micro-organism tested to an abiotic surface, as P.
aeruginosa produced biofilm on a microtiter polystyrene plate. Therefore, this strong capacity of adhering to
non-biological material showed by P. aeruginosa isolates, represents a great problem in the treatment of patients
that need a catheter or other medical device in which this micro-organism can produce biofilm, leading to
chronic infections. In addition to his, biofilm protects the bacterium from the host’s immune system and
antibiotics action, being more resistant to drugs because, according to Trautner and Dauroiche (2004), the
juxtaposition of cells in the biofilm eases the transfer of resistance genes from one bacterium to another through
plasmids.
96
In our study, there was no association between the presence of fimbriae and/or capsule with the
production or degree of biofilm (p=0.4; 2=12.5), suggesting that other kinds of fimbriae or adhesins may be
present, since 63% of P. aeruginosa isolates that were strong biofilm producers and 46% of the moderate
producers did not show any of the studied fimbriae (non-demonstrated data). In addition, not all the isolates that
were biofilm-producers produced capsule, suggesting that, besides the capsule and fimbriae investigated here,
other components of this bacterium can also ease adhesion and biofilm formation with type IV fimbria,
flagellum, alginate and LPS (Trautner and Darouiche 2004).
The genetic cluster algACD is responsible for the synthesis of alginate, which is a component of the
surface of P. aeruginosa that eases adhesion. The expression of algD, that encodes the enzyme GDP mannose
dehydrogenase, is frequently used as an indicator of the expression of the other genes responsible for
biosynthesis of alginate, which is a primary compound of the organic polymer matrix, that involves biofilm in P.
aeruginosa and is considered by some authors as responsible for the antimicrobial resistance, observed in
biofilm (Trautner and Darouiche 2004; Clutterbuck et al. 2007).
In our study, 39.0% of the isolates expressed the gene algD. In another study, from 202 strains analyzed,
91.1% expressed this gene (Mitov et al 2010). Despite alginate is a mucoid exopolysaccharide that forms a
prominent capsule in the bacterial surface, favoring adhesion and later biofilm formation, the statistical analysis
of data did not show correlation between biofilm formation and the expression of gene algD (p=0,13; ²=2,19),
suggesting that other genes governing alginate synthesis (algC, algR, algP, algB, algU) may be present.
Studying the adherence capacity, 34 multiresistant strains of P. aeruginosa were analyzed and they
showed adhesion to HEp-2 cells and glass slides. Three adhesion patterns were observed: aggregative, local and
without a well defined pattern.
Adhesion to HEp-2 cells suggests that P. aeruginosa recognizes receptors in epithelial cells and therefore
can adhere to other epithelial cells, what has been confirmed by Di Martino et al. (2002) when demonstrating the
adhesion of this bacterium to pneumocytes (lineage A549), where they observed diffuse, local and aggregative
patterns, suggesting that the presence of this bacterium in the respiratory tract cells contributes for the pulmonary
pathogenesis of this micro-organism, especially in patients carrying cystic fibrosis, in whom it causes a chronic
pulmonary infection.
The strains analyzed in the adhesion test were from nosocomial infections and in most cases, patients
were using medical devices, once 53.0% of them were in the ICU. Adhesion to plastic (coverslips) of 41.0%
(14/34) of the samples analyzed in this study confirms the literature about the capacity of this bacterium in
adhering to inert surfaces as catheters, tubes, respiratory equipments, implants and other medical devices, what
represents an important step in colonization of patients who are immunocompromised or using these devices
[13].
Data found in this study suggest that antimicrobial susceptibility profiles should be monitored, supporting
the therapeutics and avoiding treatment failures. They also indicate the great capacity of P. aeruginosa being
hydrophobic and forming biofilm on abiotic surface, what may induce colonization of medical devices, with risk
to the hospitalized patient. Besides, samples adhered to HEp-2 cells, and these characteristics confirm that P.
aeruginosa is one of the most important nosocomial pathogens, therefore there is interest on elucidating the
adaptation and pathogenicity mechanisms of this micro-organism.
AKNOWLEDGMENTS
We thank Centro Universitário do Maranhão (UNICEUMA), especially the Master Program on Parasite Biology
and Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA),
for financial aid (ATB – 04138/10; Edital FAPEMA n° 026/2010 Bancada; APP – Universal-00442/11).
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99
Table 1 - Primers used in amplification by multiplex PCR for ESBL detection.
Primer name
Sequence (direction 5'- 3')
Target
gene
Fragment
(bp)
TEM-164. SE
TEM-165. AS
TGCCCGCATACACTATTCTCAGAATGA
bla
TEM
445
CTX-M-U1
CTX-M-U2
ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC
bla
CTX-M 593
bla
SHV
ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT
TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG
bla-SHV. SE
ATGCGTTATATTCGCCTGTG
bla-SHV. AS
TGCTTTGTTATTCGGGCCAA
Source: Monstein et al., 2007.
747
Table 2 – Distribution of P. aeruginosa samples according to clinical
specimens and hospital sectors.
Clinical Specimens
n
%
Tracheal secretion
Urine
Catheter tip
Diverse secretions
Wound
Blood
Other*
25
19
12
11
8
7
18
25.0%
19.0%
12.0%
11.0%
8.0%
7.0%
18.0%
Hospital Sector
n
%
43.0 %
ICU
43
31.0 %
Internal Medicine Ward
31
8.0 %
Pediatric Ward
8
Orthopedic Ward
6
6.0%
4.0%
Surgical Ward
4
8.0%
Other**
8
Diverse secretions: purulent sec., ear sec., biliary sec., drain sec.,
oropharynx sec., tendon sec., abdominal sec and peritoneal sec.
*Other: liquor, bronchial washing, pleural fluid, sputum, ascitic fluid,
oral cavity plate, nasal swab, blood. **Other: kidney transplant,
nephrology ward, orthopedic ward, urgency and oncology. n =
number of isolates
size
100
A
B
Figure 1 – Optical microscopy of adhesion on HEp-2
cells of P. aeruginosa strains (1000X). A - HEp-2 cells
alone; B - Strain Pa31 with aggregative adhesion
pattern; C - Strain Pa87 without a well defined adhesion
pattern.
C