Luana Lôbo Queiroz
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1 Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso PERFIL DE SENSIBILIDADE DAS CEPAS ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE CARCAÇAS DE FRANGOS CONGELADOS COMERCIALIZADOS NO DISTRITO FEDERAL Autor(a): Luana Lôbo Queiroz Orientador(a): MSc. Juliana Camargos Oliveira Peres Brasília 2014 1 LUANA LÔBO QUEIROZ PERFIL DE SENSIBILIDADE DAS CEPAS ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE CARCAÇAS DE FRANGOS CONGELADOS COMERCIALIZADOS NO DISTRITO FEDERAL Monografia apresentada ao curso de graduação em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina. Orientadora: MSc. Oliveira Peres Brasília 2014 Juliana Camargos Monografia de autoria de Luana Lôbo Queiroz, intitulada “Perfil de sensibilidade das cepas Escherichia coli isoladas de carcaças de frangos congelados comercializados no Distrito Federal”, apresentado como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 07 de novembro de 2014, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada: ____________________________________________________ Prof. MSc. Juliana Camargos Oliveira Peres Orientadora Curso de Biomedicina – UCB _____________________________________________________ Prof. MSc. Lídia Maria Pinto de Lima Curso de Biomedicina – UCB Brasília 2014 AGRADECIMENTOS Aos meus pais e irmã, que mesmo distantes, seguiram sempre com muito amor, dando apoio e força para que eu continuasse a caminhada. À minhas tias, que me proporcionaram a chance de trilhar o caminho escolhido por mim, pela parceria e constante estímulo ao estudo. Aos meus queridos amigos baianos, pelo carinho, confiança, pelas palavras de incentivo, mesmo estando em outro Estado. Aos amigos de Brasília também. Agradeço aos amigos do Laboratório de Microbiologia e Higiene dos Alimentos da Universidade Católica de Brasília, pela dedicação, companheirismo, e que foram de extrema importância para a realização do trabalho. À minha orientadora, por participar deste trabalho, sempre me orientando com atenção e dedicação, e proporcionando meios para a realização da pesquisa. Aos colegas de curso, por poder compartilhar momentos únicos, sempre acumulando conhecimentos e experiências. Além disso, agradeço também a todas as pessoas que contribuíram de alguma forma para que este trabalho se realizasse. RESUMO QUEIROZ, Luana Lôbo. Perfil de sensibilidade das cepas Escherichia coli isoladas de carcaças de frangos congelados comercializados no Distrito Federal. 2014. 34f. Monografia (Biomedicina) – Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2014. Entre as bactérias gram negativas, anaeróbias facultativas que compõem a família Enterobacteriaceae está a Escherichia coli. A infecção por E.coli (colibacilose) representa um sério problema na avicultura. É responsável por grande parte das perdas nos criadouros, gerando assim, perdas econômicas significativas. Na produção de frangos de corte, é constante o uso de antimicrobianos para prevenir ou tratar as lesões causadas pela E.coli, visando à diminuição da mortalidade relacionada com a colibacilose. O uso irracional dos agentes antimicrobianos através de doses com concentrações subterapêuticas, tempo prolongado e de forma inadequada, faz com que haja uma pressão na seleção de genes de resistência antimicrobiana, contribuindo assim com o aparecimento de bactérias multirresistentes. As amostras utilizadas neste trabalho foram obtidas a partir das análises de controle de qualidade prestadas a indústrias do Distrito Federal pelo Laboratório de Microbiologia e Higiene dos Alimentos da Universidade Católica de Brasília. Inicialmente foi realizada a etapa de isolamento e identificação das bactérias, utilizando meios de crescimento para enriquecimento e meios seletivos, além de provas bioquímicas. Em seguida procedeu-se a realização dos antibiogramas pelo método de disco difusão testando os seguintes antibióticos: gentamicina, cefotaxima, imipenem, cefalexina, cefoxitina, meropenem, sulfazotrim, ciprofloxacina, amoxicilina/ac. clavulânico. Após incubação as cepas foram classificadas como resistentes, intermediárias ou sensíveis aos antibióticos testados. Do total analisado (40), 92,5% (37) foram sensíveis a Amoxicilina/Ac. Clavulânico, Meropenem, Cefoxitina e Imipenem, 82,5% (33) foram sensíveis a gentamicina e ciprofloxacina, 75% (30) a sulfazotrim, 70% (28) a cefotaxima, e 67,5% (27) a cefalexina. Em relação à resistência, 25% (10) foram resistentes a cefalexina, 17,5% (7) a sulfazotrim, 15% (6) a cefotaxima, 10% (4) a ciprofloxacina, e 10% (4) a gentamicina. O trabalho desenvolvido demonstrou que bactérias resistentes estão sendo veiculadas a consumidores do DF por meio de frangos congelados, e que essa resistência pode estar ligada a falhas no sistema de produção das aves. Além disso, foi verificado que a resistência apresentada pelas cepas testadas está relacionada a antibióticos de uso clínico, fato que implica uma preocupação maior a cerca das opções terapêuticas ao tratar infecções geradas por bactérias desse tipo na população. Palavras-chave: Escherichia coli. Avicultura. Antibióticos. Resistência ABSTRACT QUEIROZ, Luana Lôbo. Perfil de sensibilidade das cepas Escherichia coli isoladas de carcaças de frangos congelados comercializados no Distrito Federal. 2014. 34f. Monografia (Biomedicina) – Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2014. Escherichia coli is among the gram negative, facultative anaerobes that comprise the Enterobacteriaceae family. Infection with E. coli (colibacillosis) represents a serious problem in poultry. It is responsible for much of the loss in breeding, thus generating significant economic losses. In the production of broiler chickens, the constant use of antibiotics to prevent or treat injuries caused by E.coli is aiming to reduce mortality associated with colibacillosis. The prolonged, inappropriate and irrational use of antimicrobial agents through doses with a subtherapeutic concentrations means that there is a pressure on the selection of antimicrobial resistance genes, thus contributing to the emergence of multi-resistant bacteria. The samples used in this work were obtained from the analyzes of quality control provided to the Federal District industries by the Laboratory of Microbiology and Food Hygiene, Catholic University of Brasilia. Initially, the step of isolation and identification of bacteria was performed using growth media for enrichment and selective media and biochemical tests. Then proceeded then realization of antibiograms by disc diffusion method of testing the following antibiotics: gentamicin, cefotaxime, imipenem, cephalexin, cefoxitin , meropenem, sulphazotrin, ciprofloxacin, amoxicillin/Ac . clavulanic. After incubation, the strains were classified as resistant, intermediate or sensitive to antibiotics tested. A total of 92.5 % (37) were susceptible to amoxicillin/Ac. Clavulanic, meropenem, cefoxitin and imipenem, 82.5 % (33) were sensitive to gentamicin and ciprofloxacin , 75 % (30) to sulphazotrin , 70 % (28) to cefotaxime , and 67.5 % (27) cephalexin. Regarding the strength, 25% (10) were resistant to cephalexin, 17.5% (7) sulphazotrin 15% (6) cefotaxime , 10 % (4) ciprofloxacin and 10% (4) gentamicin. The work demonstrated that resistant bacteria are being conveyed to consumers through DF frozen chickens, and that this resistance may be linked to failures in the poultry production system. Furthermore, it was found that the resistance presented by the tested strains is related to the clinical use of antibiotics, a fact that implies a greater concern about therapeutic options to treat infections produced by bacteria of this type in the population. Keywords: Escherichia coli . Poultry . Antibiotics. Resistance. LISTA DE SIGLAS AMC Amoxicilina/Ácido clavulânico ANVISA Agência nacional de vigilância sanitária APCs Antibióticos promotores de crescimento APEC E. coli patogênica aviária CFAs Fatores antigênicos de colonização fimbrial CIP Ciprofloxacina CN Cefalexina CTX Cefotaxima DAEC E.coli difusamente aderentes DF Distrito Federal E.C. E. coli EaggEC E. coli enteroagregativas EHEC E. coli êntero-hemorrágicas EIEC E. coli enteroinvasivas EMB Ágar Eosina Azul de Metileno EPEC E. coli enteropatogênicas ESBL Betalactamase de espectro estendido ETEC E. coli enterotoxigênicas FOX Cefoxitina GM Gentamicina GT Grupo de trabalho HBDF Hospital de base do Distrito Federal HC Colite hemorrágica HUS Síndrome hemolítica urêmica IPM Imipenem IRAS Infecção relacionada com assistência à saúde ITU Infecção do trato urinário KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase LB Caldo lactose MAPA Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento MEM Meropenem NA Ágar nutriente SIM Ágar Sulfeto Indol Motilidade SUT Sulfazotrim TSB Caldo tripticase de soja TSI Ágar tríplice açúcar ferro SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 9 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................. 10 2.1 CEPAS DE E.COLI PATOGÊNICAS ..................................................... 10 2.2 INFECÇÃO POR E.COLI (COLIBACILOSE) EM AVES ........................ 11 2.3 USO DE ANTIBIÓTICOS NA AVICULTURA ......................................... 12 2.3.1 Promotores de crescimento ............................................................ 13 2.3.2 Substncias permitidas e proibidas pela legislação ....................... 14 2.4 ANTIBIÓTICOS NO USO CLÍNICO E MECANISMOS DE RESISTÊNCIA....................................................................................... 15 2.4.1 Mecanismos de resistência ............................................................. 16 3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................... 19 3.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS ............................................................. 19 3.2 IDENTIFICAÇÃO ................................................................................... 19 3.3 REALIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA ..................................................... 20 3.3.1 Padronização do inóculo ................................................................. 20 3.3.2 Plaqueamento e teste....................................................................... 20 3.3.3 Interpretação ..................................................................................... 21 4. RESULTADOS ...................................................................................... 22 5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO .............................................................. 26 9 1. INTRODUÇÃO Em meio a uma infinidade de bactérias presentes em nosso ambiente encontramos a família Enterobacteriaceae, formada por bactérias gram negativas, anaeróbias facultativas e oxidase negativas, com forma de bastonetes retos e não esporogênicas. O número de gêneros e espécies da família vem aumentando ao longo dos anos, enquanto em 1974 eram 12 gêneros e 36 espécies, em 2005 esse número subiu para 44 gêneros e 176 espécies. Nesta família estão diversos gêneros de grande importância em alimentos: Escherichia, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Pantoea, Pectobacterium, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia (SILVA et al., 2007). A Escherichia coli, um dos membros da família Enterobacteriaceae, apresenta vários sorotipos determinados pelos antígenos somáticos (O), flagelares (H) e capsulares (K), pertence à microbiota entérica de mamíferos e aves, e está relacionada à grande porcentagem dos casos de infecções do trato urinário (ITU) em humanos e infecções hospitalares (CARDOSO et al., 2002; KORB et al., 2013). A E.coli foi isolada e estudada pela primeira vez por Theodor Escherich em 1885. Ao tentar isolar o agente causador da cólera, Escherich conseguiu isolar o microrganismo, que inicialmente foi chamado de Bacterium coli commune em razão de estar presente nas diarreias de todos os pacientes examinados (ESCHERICH, T. 1885 apud JAY, J.M. 2005). A infecção por E.coli (colibacilose) representa um sério problema na avicultura. É responsável por grande parte das perdas nos criadouros, gerando assim, perdas econômicas significativas. Na produção de frangos de corte, é constante o uso de antimicrobianos para prevenir ou tratar as lesões causadas pela E.coli, visando a diminuição da mortalidade relacionada com a colibacilose (CARDOSO et al., 2002). Desse modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de sensibilidade das bactérias E. coli isoladas a partir comercializados no Distrito Federal. de carcaças de frangos congelados 10 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 CEPAS DE E.COLI PATOGÊNICAS Com base nas manifestações clínicas, nos fatores de virulência, e nos grupos sorológicos, as cepas de E.coli patogênicas são separadas em cinco grupos: E. coli enteroagregativas (EaggEC), E. coli êntero-hemorrágicas (EHEC), E. coli enteroinvasivas (EIEC), E. coli enteropatogênicas (EPEC), E. coli enterotoxigênicas (ETEC). Alguns autores citam ainda o grupo das E.coli difusamente aderentes (DAEC) e denominam as amostras isoladas de colibacilose aviária como E. coli patogênica aviária (APEC), um grupo responsável por doença respiratória e sistêmica em aves (MANTILLA et al., 2012; SANTOS et al., 2009 ; SAVIOLLI, 2010). E. coli enteroagregativas exibem a capacidade de um tipo específico de aderência a células, algumas linhagens produzem uma enterotoxina termoestável. A característica clinica que difere este tipo de linhagem consiste em uma diarreia persistente com duração de mais de 14 dias, principalmente em crianças (JAY, 2005). As linhagens de E. coli êntero-hemorrágicas afetam somente o intestino grosso e produzem grandes quantidades de toxinas similares à toxina Shiga (Stx1 e Stx2). A Síndrome hemolítica urêmica (HUS), caracterizada por anemia hemolítica, trombocitopenia e falha renal aguda, é causada por linhagens de E.coli produtoras dessas toxinas. Além da HUS, os indivíduos afetados podem desenvolver também a colite hemorrágica (HC), caracterizada pela evacuação de fezes vermelhas sanguinolentas, demonstrando o envolvimento do agente etiológico no cólon. Dentro deste grupo o principal sorotipo é o O157:H7, que é transmitido ao homem principalmente por meio do consumo de alimentos contaminados, como produtos de carne moída crua ou mal passada e leite cru, ou ainda por contaminação fecal de água e outros alimentos, bem como a contaminação cruzada na preparação dos alimentos. Entre os alimentos relacionados a surtos de E.coli O157:H7 estão hambúrgueres mal cozidos, salame curado seco, cidra de maçã não pasteurizada, iogurte e queijo fabricado com leite cru (JAY, 2005; SAVIOLLI, 2010; WHO, 2011). Um surto de contaminação alimentar por E.coli aconteceu em 2011 na Europa. Além das mortes ocorridas houve também um grande impacto econômico 11 devido à suspensão da importação de alguns alimentos. O caso de maior repercussão foi o bloqueio por parte da Alemanha aos pepinos provenientes da Espanha, ficando provado posteriormente, que os vegetais espanhóis não eram os causadores do surto. Acreditava-se que o surto havia sido causado pela E.coli O157:H7, porém existem indícios de que tenha sido causado por uma nova cepa de E.coli mais resistente que a bactéria comum, a E.coli O104:H4 (COSTA E SÁ, 2013). As E.coli enteroinvasivas geralmente não produzem enterotoxinas, a infecção se dá através da penetração em células epiteliais do cólon, seguida de multiplicação e propagação nas células adjacentes de forma parecida com a das Shigella (JAY, 2005). As E.coli enteropatogênicas, assim como as EIEC, geralmente não produzem enterotoxinas, mas ainda assim podem causar diarreia, principalmente em crianças com menos de 1 ano de idade. Caracteriza-se por alterações morfológicas nas células do epitélio intestinal que ocasionam a perda de microvilosidades dos enterócitos e consequentemente processos diarreicos (JAY, 2005; SAVIOLLI, 2010). Através de fatores antigênicos de colonização fimbrial (CFAs) as linhagens de E.coli enterotoxigênicas se ligam e colonizam o intestino delgado, causando diarreia tanto em crianças como em adultos. Existem quatro tipos de CFA (I,II, III e IV), são codificados por plasmídeo e ao serem ligados produzem uma ou duas enterotoxinas: ST (termoestável) e LT(termossensível). As ETEC estão entre as principais causas de diarreia do viajante (JAY, 2005). 2.2 INFECÇÃO POR E.COLI (COLIBACILOSE) EM AVES A colibacilose consiste em um grupo de doenças causadas por E.coli, onde a bactéria pode atuar como agente primário ou secundário, gerando diferentes formas de apresentação como aerossaculite, coligranuloma, artrite e sinovite, onfalite, salpingite, e septicemia. A forma mais frequente de colibacilose é a onfalite, a infecção do saco da gema do ovo, apresentando como sinais clínicos fraqueza, diarreia, abdômen distendido e mortalidade inicial elevada. (SANTOS et al., 1997) No estudo feito por Minharro et al. (2001), constatou-se o envolvimento da E.coli como microrganismo mais frequente entre as bactérias pesquisadas nas 12 lesões de sacos aéreos de frangos abatidos no estado de Goiás, sendo isolada em 80,64% das amostras estudadas em infecções simples ou mistas. Em 2012, Silva e colaboradores realizaram um estudo com amostras de fígados de frangos provenientes de dois matadouros avícolas do Recôncavo baiano sob fiscalização da Agência de Defesa Agropecuária da Bahia e obtiveram como resultado o isolamento da bactéria E.coli em 45,5% dos fígados coletados, sendo que parte desses foi considerada com aspecto macroscópico inalterado, ou seja, a inspeção visual dos fígados no matadouro avícola apenas, não é suficiente para descartar a contaminação das carcaças por E.coli. A contaminação de aves por E.coli pode se dar por meio do contato com o besouro cascudinho (Alphitobius diaperinus), presente no ambiente de confinamento dos criadouros. O cascudinho pode manter patógenos viáveis na sua superfície externa ou no trato digestivo, em sua forma larval ou adulta. Em estudo feito por Segabinazi et al. (2005) foram isoladas das superfícies externa e interna desse inseto, 14 espécies de 10 gêneros de bactérias da família Enterobacteriaceae, sendo a E.coli a enterobactéria mais isolada (36,96% das amostras positivas), seguida da Klebsiella pneumoniae e do Proteus mirabilis. 2.3 USO DE ANTIBIÓTICOS NA AVICULTURA Dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) revelam o Brasil como terceiro produtor mundial e líder em exportação, levando a carne nacional a 142 países. Além do frango, outras aves como peru e avestruz também tem se destacado nos últimos anos. Apesar de estar presente em todo o país, a carne de frango tem destaque na região sul onde estão os principais fornecedores, e vem crescendo na região centro-oeste, por ser grande produtora de grãos (BRASIL, 2013a). Com o passar do tempo, as técnicas para criação de aves foram se aprimorando. Atualmente os criadouros lançam mão de substâncias que atuam de forma a contribuir com o desenvolvimento da ave para fins comerciais. Essas substâncias denominadas aditivos alimentares, estão divididas em 3 grupos funcionais: digestivos, equilibradores da flora do trato digestório e melhoradores de 13 desempenho. Os antibióticos estão entre os melhoradores de desempenho, propiciando benefícios na produtividade dos animais. (RAMOS, 2009) O conceito de aditivos para produtos destinados à alimentação animal inclui substância, produto formulado, ou microrganismo adicionado aos produtos de forma intencional, independente de valor nutritivo, que não seja normalmente utilizada como ingrediente, que proporcione melhorias nas características dos produtos destinados à alimentação animal, no desempenho dos animais saudáveis atendendo às necessidades nutricionais ou possua efeito anticoccidiano (BRASIL, 2004c). Segundo o MAPA, antibióticos são substâncias químicas produzidas ou derivadas de microrganismos, que geram inibição do crescimento de microrganismos patológicos. Os antibióticos comercializados no mundo são utilizados tanto para uso terapêutico e profilático em humanos como também em animais, além do uso como promotores de crescimento em criadouros. A utilização desses fármacos deve seguir normas e leis para que sejam eficazes e não contribuam com o aparecimento de bactérias multirresistentes. O uso irracional dos agentes antimicrobianos por meio de doses com concentrações subterapêuticas, tempo prolongado e de forma inadequada, faz com que haja uma pressão na seleção de genes de resistência antimicrobiana (ZANATTA et al., 2004; BRASIL, 2009). 2.3.1 Promotores de crescimento Na década de 1940 os antibióticos já eram indicados para tratamento de doenças nos homens e em seguida nos animais. Em 1951, a partir do sucesso evidenciado na alimentação dos animais contendo antibióticos em baixas dosagens, o Food and Drug Administration (FDA) aprovou o uso desses agentes na alimentação animal sem prescrição veterinária (GONZALES et al, 2012). Os efeitos dos promotores de crescimento são decorrentes da ação dos antibióticos no trato digestório sobre a microbiota intestinal diminuindo a competição por nutrientes, reduzindo a produção de metabólitos que deprimem o crescimento dos animais, e promovendo também a redução no tamanho e peso do trato digestório. Os APCs (antibióticos promotores de crescimento) são utilizados visando ganho econômico através de objetivos como: obtenção de maior produtividade e 14 maior crescimento, diminuição da mortalidade, melhoramento da saúde e resistência a doenças, e aumento na eficiência da utilização da dieta (GONZALES et al, 2012). Apesar dos benefícios existe uma preocupação crescente em relação à possível pressão seletiva exercida sobre as bactérias existentes e o desenvolvimento de resistência. Busca-se agora, alternativas ao uso de antibióticos como promotores de crescimento. Dentre elas estão os probióticos, microrganismos desejáveis que habitam o tubo digestivo, favorecidos por outros fatores associados, causando a diminuição da proliferação dos patógenos, e proporcionando assim uma situação de equilíbrio, e os prebióticos que são agentes favorecedores da instalação dos probióticos (FLEMMING, 2005). 2.3.2 Substâncias permitidas e proibidas pela legislação Em 2006, o MAPA constituiu um grupo de trabalho (GT) formado por técnicos da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), do MAPA e de universidades brasileiras, para avaliar os princípios ativos de algumas substâncias antes utilizadas em criadouros. A partir das análises, optaram pela proibição de algumas dessas na alimentação animal, e liberação de outras que não possuíam evidências cientificas sugestivas à proibição (ALLIX, 2010). No Brasil, estão registrados no MAPA como aditivos melhoradores de desempenho e anticoccidianos para uso em produtos destinados à alimentação animal, as seguintes substâncias: Avilamicina, Bacitracina metileno disalicilato, Bacitracina de zinco, Colistina, Clorexidina, Enramicina, Flavomicina, Halquinol, Lasalocida, Lincomicina, Tilosina, Virginiamicina, Clopidol+Metilbenzoquato, Maduramicina+Nicarbazina, Monensina, Ractopamina, Zilpaterol, Diclazuril, Narasina, Amprólio, Salinomicina, Tiamulina, Amprólio+etopabato, Maduramicina amônio, Narasina+Nicarbazina, Nicarbazina, Robenidina, Salinomicina, Semduramicina+Nicarbazina (BRASIL, 2013a). Ainda de acordo com o MAPA, as substâncias proibidas na alimentação animal com a finalidade de aditivo e a legislação correspondente são: Avoparcina (Of. Circ. DFPA nº 047/1998), Arsenicais e antimoniais (Portaria nº 31, 29/01/2002), Cloranfenicol e nitrofuranos (IN nº 09, 27/06/2003), Hormônios como aditivos alimentares em aves (IN nº 17, 18/06/2004), Olaquindox (IN nº 11, 24/11/2004), 15 Carbadox (IN nº 35, 14/11/2005), Violeta Genciana (IN nº 34, 13/09/2007), Anfenicóis, tetraciclinas, beta lactâmicos (benzilpenicilâmicos e cefalosporinas), quinolonas e sulfonamidas sistêmicas (IN nº 26, 9/07/2009, revoga Portaria 193/1998), Anabolizantes hormonais para bovinos (IN nº 55, 01/12/2011, revoga IN nº 10/2001), Espiramicina e eritromicina (IN nº 14, 17/05/2012) (BRASIL, 2013b). 2.4 ANTIBIÓTICOS NO USO CLÍNICO E MECANISMOS DE RESISTÊNCIA O principal fator na escolha de um agente terapêutico, visando tratar infecções bacterianas, consiste na determinação da sensibilidade aos antibióticos e quimioterápicos. O antibiograma fornece informações sobre esses agentes em relação ao microrganismo causador da patologia, porém, seu resultado deve estar associado a informações a cerca da farmacocinética e farmacodinâmica da droga testada para que assim seja escolhida a melhor forma de tratamento. (MOURA et al., 2008) Em estudo descritivo sobre o uso de antimicrobianos em hospitais brasileiros entre 1999 a 2009, verificou-se que os grupos de antimicrobianos mais prescritos foram as cefalosporinas e as penicilinas. Os aminoglicosídeos e os macrolídeos, também apresentaram certa frequência de utilização, ainda que não sejam os grupos mais usados (FRANÇA, 2012). No estudo realizado em 2011, Korb et al. analisaram 2.931 culturas de urina, obtendo 265 positivas, e dentre elas, 240 foram positivas para E.coli e 150 apresentaram resistência para algum antimicrobiano. Os resultados demonstram que a resistência em infecções urinárias tem a E.coli como principal agente etiológico (KORB, 2013). A resistência a antimicrobianos é um fato preocupante tendo em vista que humanos, animais e meio ambiente estão sempre em contato, e dessa forma disseminam a partir da fonte contaminante mais cepas resistentes. Com o passar do tempo, o leque de alternativas para tratar infecções vai se estreitando, o número de antibióticos que não são mais eficazes aumenta e restam poucas opções de fármacos que podem ser utilizados para tratamento. Desse modo, a utilização dos antimicrobianos em criadouros deve acontecer de forma controlada, obedecendo às normas impostas pelos órgãos responsáveis pela vigilância, para que dessa forma, 16 se possa evitar a indução de multirresistência nas bactérias presentes e a propagação das mesmas para os consumidores por meio das aves consumidas. Segundo Auto e colaboradores (2008), a resistência se dá quando uma bactéria não é inibida por certa concentração de antibiótico, in vitro, correspondente à que estaria disponível no sangue do paciente durante o tratamento. Surge como consequência de mutações cromossomais ou através da aquisição de elementos genéticos extracromossomais, portando os genes de resistência (CABRERA et al, 2007). A transferência desses elementos se dá através dos mecanismos de: Transformação, onde uma bactéria doadora ao se desintegrar libera o material que será incorporado ao cromossomo de outra bactéria (receptora); Transdução, transferência de material genético entre bactérias através de bacteriófagos; Conjugação, processo no qual a bactéria doadora transfere para a receptora parte do seu plasmídeo contendo o gene de resistência; ou Transposição, onde os transposons transitam entre plasmídeo, destes para o cromossomo e vice-versa, podendo ainda penetrar em bacteriófagos (AUTO et al, 2008). Os microrganismos tem sido capazes de desenvolver meios de escape. Como por exemplo, o Staphylococcus aureus, que em 1946 apresentava a maioria de suas cepas sensíveis à penicilina, e atualmente quase todas as cepas hospitalares são resistentes a benzilpenicilina, algumas a meticilina, gentamicina, ou a ambas, e só podem ser tratadas com vancomicina (CABRERA et al, 2007). 2.4.1 Mecanismos de resistência Os mecanismos de resistência desenvolvidos por bactérias gram negativas podem ser divididos em quatro grupos: modificação enzimática do antibiótico, bombas de expulsão, alterações na permeabilidade da membrana externa (porinas), e alterações no sítio de ação. A modificação enzimática do antibiótico se dá através da expressão de enzimas capazes de mudar a estrutura do agente, fazendo com que ele perca sua funcionalidade. A produção de betalactamases é o mecanismo mais prevalente entre as bactérias gram negativas (TAFUR et al, 2008). As betalactamases atuam rompendo o anel betalactâmico presente na estrutura dos antibióticos betalactâmicos, responsável em grande parte por sua ação antimicrobiana. Os genes responsáveis por codificar estas enzimas podem ser 17 encontrados em cromossomos bacterianos ou em plasmídeos, permitindo facilmente a transferência entre diferentes bactérias, e dessa forma dificultando o controle das infecções (TAFUR et al, 2008). As betalactamases de espectro estendido (ESBL) tem sido observadas em várias espécies de bactérias gram negativas, sendo que a E.coli e a Klebsiella spp. estão frenquentemente envolvidos nesses casos. Essas enzimas são capazes de hidrolisar cefalosporinas de terceira e quarta gerações e aztreonam, e são inativadas pelos inibidores de betalactamases como o sulbactam, tazobactam e o ácido clavulânico. O surgimento e a disseminação de ESBL entre os membros da família Enterobacteriaceae tem sido descritas como ponto de urgência clínica em razão da grande incidência de isolados em infecções relacionadas com a assistência à saúde (IRAS). Mais de 430 ESBL já foram caracterizadas, havendo descrição de muitas delas no Brasil (TAFUR et al, 2008; SILVA, K. et al, 2012). As carbapenemases consistem em enzimas que hidrolisam os carbapenêmicos, podendo estar codificadas no cromossomo bacteriano ou em elementos genéticos móveis. Embora tenham sido consideradas inicialmente como raras, tem gerado preocupação recentemente entre os profissionais de saúde e pesquisa pela dificuldade no tratamento e evolução clínica dos pacientes, já que a resistência aos carbapenêmicos implica resistência a outros betalactâmicos (TAFUR et al, 2008). Além das betalactamases existem outras enzimas também envolvidas na aquisição de resistência, como as metilases, acetil-transferases, nucleotidiltransferases e fosfotransferases, que inativam principalmente os aminoglicosídeos. (TAFUR et al, 2008). Os principais mecanismos de resistência a antibióticos observados em E.coli estão relacionados à betalactâmicos, quinolonas, tetraciclinas, cloranfenicol, e trimetoprim-sulfametoxazol (MOSQUITO et al, 2011). Em oposição à resistência adquirida, a resistência intrínseca existe como uma característica comum a todos ou quase todos os isolados de espécie bacteriana. O conhecimento a cerca da resistência natural bacteriana é de grande importância já que a característica impede a utilização de um agente específico para tratamento da infecção. Os membros da família Enterobacteriaceae apresentam naturalmente resistência a penicilina G, glicopeptideos, ácido fusídico, macrolídeos, clindamicina, 18 linezolida, estreptogramineas, mupirocina. (LECLERCQ et al., 2011; LIVERMORE et al., 2001) 19 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS Foram obtidas 40 amostras a partir das análises de controle de qualidade prestadas a indústrias do Distrito Federal pelo Laboratório de Microbiologia e Higiene dos Alimentos da Universidade Católica de Brasília. A partir de 225ml de água peptonada contendo 25g de frango incubada a 37°C por 24 horas, foi retirada uma alíquota de 100µL, colocada em 1,9mL de caldo Tripticase de soja (TSB) com glicerol a 20% e armazenada sob congelamento a 20°C para posterior isolamento de E.coli e análise do perfil de sensibilidade (SILVA et al., 2007). 3.2 IDENTIFICAÇÃO As amostras em TSB com glicerol foram descongeladas em temperatura ambiente e 50µL de cada foram inoculados em caldo Lactose (LB) para enriquecimento a 37°C por 24 horas. Em seguida as amostras foram inoculadas em caldo Escherichia coli (caldo E.C.) e incubadas a 45°C por 24 horas, as que apresentaram crescimento/turvação e produção de gás foram inoculadas por esgotamento em Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB) e incubadas a 37°C por 48 horas (SILVA et al., 2007). Após a incubação, as colônias características isoladas no EMB foram inoculadas em Ágar nutriente (NA) em tubos com bisel e incubadas a 37°C por 24 horas. Uma colônia por placa, cada amostra foi feita em duplicata. A partir do NA foi dado prosseguimento com a identificação pelas provas bioquímicas: Teste de crescimento em Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI), Ágar Sulfeto Indol Motilidade (SIM), Teste de Citrato (Citrato Simmons), Teste Urease, Teste de Voges-Proskauer e Teste de Lisina descarboxilase, e em seguida, a inoculação em novo TSB glicerol somente das amostras confirmadas como E.coli para armazenamento sob congelamento a -20°C. 20 3.3 REALIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA 3.3.1 Padronização do inóculo As amostras armazenadas foram descongeladas em temperatura ambiente, 100µL de cada foram inoculados em caldo LB e incubado em estufa a 37°C por 24 horas. Após a incubação, a turbidez do inóculo foi ajustada com meio de cultura, de modo que alcance a turbidez comparável à solução padrão de Mc Farland a 0,5. O inóculo deve apresentar absorbância entre 0,08 a 0,10 em um comprimento de onda de 625 nm (NCCLS, 2003). 3.3.2 Plaqueamento e teste Depois do ajuste do inóculo, foi feito o plaqueamento em Agar Mueller Hinton utilizando swabs estéreis, e posteriormente foram colocados os discos de antibióticos. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Foram testados os antibióticos: gentamicina (GM), cefotaxima (CTX), imipenem (IPM), cefalexina (CN), cefoxitina (FOX), meropenem (MEM), sulfazotrim (SUT), ciprofloxacina (CIP), amoxicilina/ac. clavulânico (AMC). A seleção dos antibióticos que foram testados tem o objetivo de unir substâncias que são proibidas para uso animal em criadouros (cefoxitina, meropenem, cefalexina, cefotaxima, ciprofloxacina, imipenem, sulfazotrim) (BRASIL, 2013b) e alguns representantes de três das classes de antibióticos mais frequentemente prescritos em hospitais brasileiros no período de 1999 a 2009 (cefoxitina, cefalexina, gentamicina, cefotaxima, amoxicilina/ácido clavulânico) (FRANÇA, 2012). A cepa usada para controle foi a E.coli ATCC 25922 conforme recomendação pelo NCCLS (NCCLS, 2003). 21 3.3.3 Interpretação Após a incubação a 37° por 24 horas seguiu-se a medição dos halos de inibição com régua milimetrada, e interpretação dos microrganismos como resistentes, intermediários ou sensíveis, de acordo com a classificação do NCCLS (NCCLS, 2003). 22 4. RESULTADOS Foram testados 9 antibióticos em um total de 40 amostras analisadas. Dessas, 92,5% (37) foram sensíveis a Amoxicilina/Ac. Clavulânico, Meropenem, Cefoxitina e Imipenem (Tabela 1). Tabela 1 - Perfil de sensibilidade das cepas Escherichia coli analisadas Amostras 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Antibióticos testados GM CTX IPM CN FOX MEM SUT CIP S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R R S R S S R S S S S S S S S S S S S R S S R S S S S S S S S S S S S S S S S S S I S R S S R S S R S R S S R R S S S S S S S S S S S S S S S S S I S R S S S S S I S R S S S S S S S S S S S S R R S R S S R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R R S R S S R R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R R S R S S S S S S S S S S S S S R S R S S S R AMC S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S Continua em... 23 Continuação de Tabela 1 - Perfil de sensibilidade das cepas Escherichia coli analisadas Nota: S - Sensível; I - Intermediário; R - Resistente; GM - Gentamicina 10µg (S: ≥15, I: 13-14, R: ≤12); CTX - Cefotaxima 30µg (S: ≥23, I: 15-22, R: ≤14); IPM - Imipenem 10µg (S: ≥16, I: 14-15, R: ≤13); CN – Cefalexina 30µg (S: ≥18, I: 15-17, R: ≤14); FOX – Cefoxitina 30µg (S: ≥18, I: 15-17, R: ≤15); MEM - Meropenem 10µg (S: ≥16, I: 14-15, R: ≤13); SUT - Sulfazotrim 23,7/1,25µg (S: ≥16, I: 11-15, R: ≤10); CIP - Ciprofloxacina 5µg (S: ≥21, I: 16-20, R: ≤15) ; AMC - Amoxacilina/Ácido Clavulânico 20/10µg (S: ≥18, I: 1417, R: ≤13);Classificação usando como base o 15º Suplemento Informativo (CLSI)/NCCLS e bula Cefalexina (Eurofarma Laboratórios Ltda). Dentre as 40 amostras, 25% (10) foram resistentes a cefalexina, 17,5% (7) a sulfazotrim, 15% (6) a cefotaxima, 10% (4) a ciprofloxacina, e 10% (4) a gentamicina (Tabelas 1 e 2). Apenas 3 amostras (7,5%) se encaixaram na categoria de interpretação intermediária, somente ao antibiótico cefotaxima (Tabelas 1 e 2). Do total, 82,5% (33) foram sensíveis a gentamicina e ciprofloxacina, 75% (30) a sulfazotrim, 70% (28) a cefotaxima, e 67,5% (27) a cefalexina (Tabela 1). As amostras 1, 9 e 22 representam 7,5% do total, apresentaram crescimento discreto de colônias dentro do halo de inibição de alguns antibióticos e por isso estão excluídas da tabela 1, usada para classificação. Nas amostras 1 e 22 houve crescimento nos halos da cefalexina e cefotaxima, e na amostra 9 nos halos de cefotaxima, gentamicina, sufazotrim, cefoxitina. Segundo o NCCLS, em caso de crescimento discreto em halos evidentes, o antibiograma deverá ser refeito usando uma cultura ou subcultura pura de uma única colônia, isolada a partir da placa de cultura primária. Caso pequenas colônias continuem a crescer no halo, deve-se medir o halo de inibição livre de colônias (NCCLS, 2003). No estudo feito, procederam-se as análises somente até a etapa de realização do antibiograma, devido à falta de tempo hábil para nova etapa de isolamento, identificação, e novo antibiograma. Tratando-se de halos de inibição por sulfazotrim, seguiu-se a orientação do NCCLS de não considerar qualquer crescimento discreto e medir a margem mais visível ao testar trimetoprim e sulfonamidas. 24 Tabela 2 – Quantidade de amostras classificadas de acordo com o perfil de sensibilidade Antibióticos Gentamicina 10µg Cefotaxima 30µg Imipenem 10µg Cefalexina 30 µg Cefoxitina 30 µg Meropenem 10µg Sulfazotrim 23,7/1,25µg Ciprofloxacina 5µg Amoxicilina/Ac. Clavulânico 20/10µg Resistente 4 6 0 10 0 0 7 4 0 Amostras (nº) Intermediário 0 3 0 0 0 0 0 0 0 Sensível 33 28 37 27 37 37 30 33 37 Gráfico 1 – Perfil de sensibilidade para antibióticos presentes entre as substâncias proibidas na alimentação animal com a finalidade de aditivo 40 Quantidade de amostras 35 30 25 Resistente 20 Intermediário 15 Sensível 10 5 0 CTX IPM CN FOX MEM SUT CIP Antibióticos Dos 11 antibióticos testados 7 estão entre as substancias proibidas pela legislação para alimentação animal com a finalidade de aditivo, estes estão representados no gráfico 1. As cepas testadas apresentaram resistência a 4 deles (cefotaxima, cefalexina, sulfazotrim e ciprofloxacina) (Gráfico 1). 25 Gráfico 2 – Perfil de sensibilidade para antimicrobianos contidos entre as classes mais prescritas em hospitais brasileiros no período de 1999 a 2009 40 Quantidade de amostras 35 30 25 Resistente 20 Intermediário 15 Sensível 10 5 0 GM CTX CN FOX AMC Antibióticos Para os antibióticos gentamicina, cefotaxima, cefalexina, cefoxitina e amoxicilina/ac. clavulânico, que estão entre as classes mais prescritas em hospitais brasileiros, foi observada a resistência a três deles: gentamicina, cefotaxima e cefalexina. Sendo que entre as amostras testadas, 3 tiveram um padrão intermediário de resistência à cefotaxima, e todas foram sensíveis a cefoxitina e amoxicilina/ac. clavulânico (Gráfico 2). 26 5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO Os dados das tabelas 1 e 2 demonstram resistência bacteriana a cinco dos nove antibióticos testados, a cefalexina, sulfazotrim, cefotaxima, ciprofloxacina, gentamicina, sendo o nível mais alto relacionado a cefalexina. Os dados indicam que cepas de E.coli apresentando resistência a antibióticos estão sendo veiculadas aos consumidores por meio de frangos congelados. A presença dessas bactérias pode se dar por falhas nas boas práticas de fabricação, acarretando em contaminação das aves por contato direto com o ambiente, equipamentos ou a partir do próprio profissional da indústria no momento da manipulação das aves. As bactérias podem ainda existirem como parte da microbiota dos frangos abatidos, tendo desenvolvido mecanismos de resistência a partir da pressão exercida pelo uso dos antibióticos nos criadouros. Fato preocupante, tendo em vista a possibilidade de que esses microrganismos cheguem enfim à mesa do consumidor. Segundo Jay (2005), doenças de origem alimentar causadas por E.coli podem ocorrer caso não sejam tomadas as precauções devidas na manipulação do alimento, como o cozimento inadequado, o armazenamento entre 4,4ºC e 60ºC por mais de 3 a 4 horas, além da contaminação de vegetais que serão consumidos crus. Foi observada resistência aos representantes das cefalosporinas de 1ª e 3ª geração (betalactâmicos): cefalexina e cefotaxima, e dos aminoglicosídeos: gentamicina, classes essas que estão entre as mais prescritas em hospitais brasileiros no período de 1999 a 2009. As cefalosporinas de primeira geração, como a cefalexina são indicadas para tratamento de infecções mais comumente em pele, partes moles, faringite estreptocócica, e também no tratamento de ITUs não complicadas, além de profilaxia para cirurgias. Enquanto o uso das cefalosporinas de terceira geração pode estar relacionado ao tratamento de variados tipos de infecções por bacilos gram-negativos suscetíveis adquiridos em ambiente hospitalar, como pneumonias, ITUs complicadas, e infecções de feridas cirúrgicas. A cefotaxima pode ser utilizada para tratar meningites por bacilos gram-negativos incluindo a E.coli e outras bactérias (ANVISA, 2007). As indicações de uso para aminoglicosídeos tem se tornado mais criteriosas devido ao advento de antibióticos de amplo espectro com menor potencial de 27 toxicidade. A gentamicina, integrante dessa classe, tem amplo espectro de ação, agindo sobre gram negativos, positivos e micobacterias, indicada principalmente contra enterobacterias e P.aeruginosa (SBP, 2014). Estudos utilizando E.coli mostram a resistência a betalactâmicos, quinolonas, tetraciclinas, cloranfenicol, e trimetoprim-sulfametoxazol, como principais mecanismos desenvolvidos por essas bactérias. A resistência aos betalactâmicos se dá por meio das betalactamases, enzimas que hidrolisam a ligação amida do núcleo betalactâmico, inativando o antibiótico. Em relação às quinolonas a resistência pode acontecer a partir de mutações pontuais que geram a alteração de aminoácidos na enzima alvo do antibiótico, por sistemas de expulsão, ou presença de genes plasmídicos de resistência antibiótica. Contra as tetraciclinas existem bombas de efluxo específicas para este tipo de antibiótico. A resistência ao cloranfenicol é gerada por inativação enzimática por acetilação, ou por exportadores específicos de cloranfenicol. Em relação ao trimetoprim-sulfametoxazol, existem genes que codificam formas mutantes da enzima alvo (MOSQUITO et al, 2011). Os mecanismos de modificação enzimática do antibiótico, bombas de expulsão, e alterações no sítio de ação, modos através dos quais bactérias gram negativas escapam do tratamento com antibióticos, são expressos a partir de genes contidos em cromossomos bacterianos ou encontrados em plasmídeos. A presença desses genes em plasmídeos torna possível sua disseminação para outras populações de bactérias, como por exemplo, as que estão presentes no trato intestinal dos humanos (TAFUR et al, 2008). Levando em consideração o fato de que as bactérias isoladas em carcaças de frango chegam também aos consumidores, infere-se que genes de resistência estão sendo transmitidos e podem estar envolvidos no desenvolvimento de resistência em microrganismos presentes no consumidor. Caso haja uma infecção por este tipo de bactéria, os antibióticos citados, já não serão eficazes ao tratamento. Segundo pesquisa feita na Farmácia hospitalar do Hospital de Base do Distrito Federal (HBDF), os antibióticos mais utilizados no serviço hospitalar são: Meropenem, Imipenem, Vancomicina, Cefepime, Cefazolina e Ciprofloxacina. Seguidos por Ampicilina/Sulbactam, Piperaciclina/Tazobactam, Levofloxacina, Ceftazidima, Polimixina B. Nas bactérias isoladas das amostras de frango usadas para este trabalho, não foi encontrada resistência a meropenem e imipenem. 28 Segundo Livermore et al (2001), Enterobacteriaceae resistentes a essas drogas seriam incomuns, necessitando de confirmação em laboratório de referência. Com o passar dos anos essa situação foi se modificando, e atualmente bactérias resistentes às drogas em questão estão se tornando cada vez mais comuns. A produção de KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) por enterobactérias confere resistência aos antimicrobianos carbapenêmicos, além de inativar penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos (DIENSTMANN et al, 2010). A ciprofloxacina está entre as drogas mais usadas no HBDF e foi observada resistência a ela por parte de algumas bactérias estudadas. Segundo Roriz-Filho et al (2010), a ciprofloxacina está entre as opções terapêuticas para Infecção do trato urinário alta (pielonefrite) e ITU de origem hospitalar. A profilaxia de ITU com antibióticos é indicada principalmente para mulheres com ITU recorrente. Os antibióticos mais usados para esse fim são a nitrofurantoína, sulfametoxazoltrimetoprim e as quinolonas como ácido nalidíxico ou ácido pipemídico (HEILBERG et al, 2003). As análises realizadas neste trabalho mostraram um percentual de resistência a sulfametoxazol-trimetoprim (sulfazotrim) de 17,5%, concordando com a tendência linear de aumento da resistência desenvolvida por E.coli a trimetoprim e trimetoprim/sulfametoxazol (GUPTA et al, 1999). O presente trabalho permitiu observar o perfil de sensibilidade apresentado pelas cepas de E.coli testadas, demonstrando que bactérias resistentes podem estar sendo veiculadas a consumidores do Distrito Federal por meio de frangos congelados, e que essa resistência pode estar ligada a falhas no sistema de produção das aves, visto que quatro dos antibióticos associados à resistência (sulfazotrim, ciprofloxacina, cefalexina e cefotaxima) estão entre as substâncias proibidas na alimentação animal com a finalidade de aditivo. Além disso, foi verificado que a resistência apresentada pelas cepas testadas está relacionada a antibióticos de uso clínico, fato que implica uma preocupação maior a cerca das opções terapêuticas ao tratar infecções geradas por bactérias desse tipo na população do Distrito Federal. 29 REFERENCIAS ANVISA. Antimicrobianos – Bases teóricas e uso clínico. Principais grupos disponíveis para uso clínico: B-Lactâmicos – Cefalosporinas de primeira geração. 2007. 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