Diagnóstico Laboratorial
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Diagnóstico Laboratorial das Arboviroses Dengue, Chikungunya, Zika e Febre Amarela Lívia Caricio Martins, PhD Pesquisadora em Saúde Pública Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas/IEC/SVS/MS SAARB 1954 ------------------------------ 2016 Arbovirus (Arthropod+borne+virus) DENV, YFV, OROV, MAYV, CHIKV, WNV, ROCV, SLEV, ZIKV, etc... Raiva Hantavírus* Arenavirus* Filovirus (Ebolavirus) - Laboratório de Referência Nacional - Centro Colaborador da OPAS Robovirus* (Rodent+borne+virus) Arbovírus e síndromes nas Américas Família Vírus Togaviridae Chikungunya Mayaro Mucambo Sindbis Infecção inaparente Doença febril Flaviridae Dengue 1, 2, 3 e 4 Febre Amarela Zika Nilo Ocidental Encefalite Japonesa Rocio Saint Louis Banzi Febre exantemática Apeu, Caraparu Nepuyo Oropouche Alenquer, Candiru Febre do Vale Rift Febre hemorragica da Crimeia Febre hemorrágica Reoviridae Changuinola Kemerovo Encefalite/Síndromes Neurológicas Rhabdoviridae VSV Chandipura Bunyaviridae 1) QUAL O PAPEL DO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL? 2) EM PERÍODOS EPIDÊMICOS É POSSÍVEL O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA TODOS OS CASOS SUSPEITOS? DIAGNÓSTICO INVESTIGAÇÃO CIENTÍFICA Organização - Macrorregional Instituto Evandro Chagas - IEC/PA/LRN LACEN-PE Instituto Aggeu Magalhães - FIOCRUZ-PE LACEN-DF Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ-RJ Instituto Adolfo Lutz – IAL-SP LACEN-PR Instituto Carlos Chagas - FIOCRUZ-PR CICLO URBANO – DENV, ZIKV AND CHIKV Ciclos Enzoóticos da Febre Amarela Amostras Biológicas: Sangue, soro e fragmento de vísceras Detecção NS1 Resposta Imune para Dengue Isolamento viral Detecção RNA Viremia D.O. IgM - primária IgM - secundária IgG - secundária D.O. IgG - Infecção primária Início dos sintomas (dias) RESPOSTA IMUNE PARA ZIKA - VIROLÓGICO: Genoma, antígeno e isolamento viral - SOROLÓGICO: anticorpos IgM, IgG Isolamento viral Urina Fonte: Adaptado de Sullivan Nicolaides Pathology (2014). Resposta Imune para Chikungunya Períodos da doença FASES DA FEBRE AMARELA 1a. Fase 3a. Fase Viremia – (pico 2o. ou 3o. dia) Febre, calafrios Cefaléia, mialgia Dor lombar Hepatomegalia Dor abdominal Surgem os anticorpos Desaparece a viremia Volta a febre, Icterícia se instala, Insuficiência renal aguda, Manifestações hemorrágicas, Coma, choque, óbito 2a. Fase Infecção 3 a 4 dias Remissão 48 horas Intoxicação 7 a 10 dias Tempo de duração da doença – 15 a 20 dias PATOGENESE DA INFECÇÃO PELO CHIKUNGUNYA Cagliot C et al NEWMICROBIOLOGICA 36, 211-227, 2013 Patogênese da Febre Amarela Fígado Dia 2-4 Dia 1-2 Dia 0 Hepatócitos CélulasKupffer Dia 4-5 Dia2-3 Coração Viremia Hepatócitos Célulasdendríticas Baço Rim Dia 9-11 Coração Dia 5-7 Dano microvascular Hepatócitos Hipotensão Hemorrágica Apoptose focal Hipotensão Falência renal Hepatócitos Apoptóticos Liberação viral Dia 8-10 CD4+ CTL Dia 9-11 Necrose Tubular Hepatócitos Apoptóticos Icterícia Hematemese Necrose Mediozonal Choque, anoxia, acidose metabólica MORTE Fonte: Adaptado de Monath, 2001 MÉTODOS LABORATORIAIS INESPECÍFICOS - Hemograma (Plaquetopenia, hematócrito, leucopenia) - Dosagem sérica de AST/TGO e ALT/TGP - Dosagem sérica de bilirrubinas direta/indireta - Dosagem de ureia e creatinina - Dosagem sérica de lactato desidrogenase e outros marcadores de atividade inflamatória (proteína C reativa, ferritina) - Dosagem albumina sérica -Velocidade de Hemossedimentação (VHS) - Fatores de Coagulação Oliveira Melo, A. S., Malinger, G., Ximenes, R., Szejnfeld, P. O., Alves Sampaio, S. and Bispo de Filippis, A. M Duas mulheres grávidas (PB) diagnosticadas com microcefalia fetal tendo relatado sintomas relacionados com a infecção pelo vírus Zika. Embora ambos os pacientes tiveram resultados de sangue negativos para o vírus Zika, a amniocentese e a subsequente RT-PCR em tempo real (FIOCRUZ/RJ) foi positivo para ZIKV. A análise do sequenciamento identificou o genótipo asiático. Ultrasound Obstet Gynecol 2016; 47: 6–7 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DENGUE SÍNDROME SÍNDROME SÍNDROME FEBRIL EXANTEMÁTICA HEMORRÁGICA DOENÇA DE CHAGAS SARAMPO MENINGOCOCCEMIA MALÁRIA FEBRE CHIKUNGUNYA SEPTICEMIA HEPATITE VIRAL ESCARLATINA PTI LEPTOSPIROSE EXANTEMA SÚBITO FEBRE AMARELA MENINGITE RUBÉOLA MALÁRIA GRAVE ENTEROVIROSES LEPTOSPIROSE ZIKA Diagnóstico Laboratorial Específico – Isolamento Viral e/ou detecção do genoma: RT-PCR, RT-PCR em Tempo Real, Cultura de células; – Imuno-histoquímica: Detecção do antígenos virais ou complexo vírus-IgM em amostra de tecidos formalizados. – Histopatológico: Análise de órgãos pós-morte (tecido formalizado) – Sorológico: MAC-ELISA: anticorpos IgM a partir do 6° dia de doença; repetido após 14 dias, se a primeira amostra for negativa. ELISA IgG/Inibição da hemaglutinação: determinação de infecção passada, resposta secundária e inquéritos epidemiológicos INTERFERENCIAS Diversos fatores podem interferir no resultado final do diagnóstico AMOSTRAS BIOLÓGICAS – Soro; – LCR; – Sangue; – Vísceras; – Urina – Saliva Instruções para armazenamento e encaminhamento de amostras para Diagnóstico Laboratorial Tipo de diagnóstico Tipo de material Urina RT-qPCR Sangue/soro Sorologia Sangue/soro Utilizar tubo frasco estéril, resistente à temperatura com tampa de rosca e anel de vedação. Rotular o tubo com o nome do paciente, data da coleta e tipo de amostra. Conservar em freezer a -20ºC ou - 70ºC (preferencialmente) até o envio ao laboratório. Vísceras Acondicionamento e transporte Acondicionar em caixa de transporte de amostra biológica (categoria B UN/3373) com gelo seco. Acondicionar em caixa de Utilizar tubo frasco estéril, com tampa de rosca e anel de transporte de amostra vedação. Rotular o tubo com o nome do paciente, data da coleta biológica e tipo de amostra. (categoria B UN/3373) com gelo seco ou Conservar em freezer a -20ºC. com gelo reciclável (gelox). Utilizar tubo plástico estéril sem NENHUM tipo de conservante (seco), resistente à temperatura ultra baixa com tampa de rosca e boa vedação. Colocar o fragmento de cada víscera em tubos separados. Rotular os tubos com o nome do paciente, data de coleta e tipo de víscera. RT-qPCR Histopatológico e Imuno-histoquímica Armazenamento e conservação Conservar em freezer a -20 ou -70ºC (preferencialmente) até o envio para o laboratório. Utilizar frasco estéril, com tampa de rosca, contendo formalina tamponada a 10%. Rotular com o nome do paciente, data da coleta e tipo de amostra. Conservar em temperatura ambiente. Acondicionar em caixa de transporte de amostra biológica (categoria B UN/3373) com gelo seco. Acondicionar em caixa de transporte de amostra biológica (categoria B UN/3373) SEM GELO. Temperatura, Resultado Positivo do Vírus e IgM Antidengue, por Dia de Febre 300 39.5 80 38.5 38.0 37.5 37.0 225 60 150 40 75 20 0 -4 -3 -2 -1 Temperatura Máx. Média 0 1 Dia de Febre Vírus 2 3 4 IgM do Dengue 5 6 0 IgM do Dengue (unidades de EIA) 39.0 % Positivo do Virus Temperatura (graus Celsius) 100 Adaptado da Figura 1 em Vaughn e outros., J Infect Dis, 1997; 176:322-30. Diagnóstico a partir de amostras de vetores Isolamento Viral Recuperação de agentes virais a partir de fluidos orgânicos; Pode ser realizado em cultura de células e camundongos recém-nascidos. Cultura de células Camundongos recém-nascidos Culturas de Células C6/36 VÍRUS VERO RECEPTOR CELULAR CÉLULA Susceptibilidade celular -Dengue; -Febre Amarela; -Febre Amarela; - CHIK, Mayaro; -CHIK, Mayaro; -Oropouche; - Zika - Zika -Vetores-dengue -Vetores- outros arbovírus ISOLAMENTO VIRAL - Cultura de Células IDENTIFICAÇÃO VIRAL 1 0 - Cultura Celular (NB3) 50 μm μ m 50 μm - Camundongo recém-nascido (NBA3) Acervo de 210 FAI- arbovírus e outros vírus de vertebrados - IF - FC - IH - SN - Pirosequenciamento ISOLAMENTO VIRAL DIFICULDADE PARA ISOLAMENTO DO VZIK Vírus viáveis - Viremia curta (3 dias) - Termolabilidade (50%) - Temperatura – fator crítico - 13 cepas do ZIKV 10 sangue 1 soro 2 vísceras - óbito Diagnóstico Laboratorial Específico ISOLAMENTO VIRAL ECP em VERO – ZIKV (100x) ECP em C6/36 – ZIKV (100x) IFI positiva em C6/36 – ZIKV (100x) Fonte: Eliana Silva – SAARB/IEC/SVS DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL RT-qPCR RT-PCR PCR em Tempo Real X PCR convencional PCR convencional PCR em Tempo Real Padronização Difícil Fácil Sensibilidade/Especificidade Baixa Alta Resolução Baixa (gel) Alta (lazer) Quantificação Limitada (padrão de peso molecular) Precisa (qPCR quantitativo) Discriminação dos amplicons Por tamanho Fluoróforo distintos (FAN, VIC, TED ...) Automação Não automatizado Automatizado Resultados Qualitativos Qualitativo /Quantitativo Contaminação laboratorial Alta Baixa (sistema fechado) Tempo de execução 3 – 6 horas 1 – 2 horas Aparelho Termociclador Real Time Custo do Teste Moderado Elevado (sondas) Laboratórios capacitados na técnica de RT-qPCR DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL – RT-qPCR - Extração do RNA viral - Triagem: VZIK ENV – mais sensível - Confirmação: VZIK NS5 Target: Env Target: NS5 Genoma e Alvos Gênicos do RT-PCR e RT-qPCR Genoma RNA (polaridade positiva, ~ 11 kb) 5`- -3` NS1 NS2 NS3 NS4 NS5 C prM E 70-100 nt Estrutural NS2a NS2b 300-600 nt NS4a NS4b Não estrutural Envelope viral com proteinas M e E RT-qPCR – VFA selvagem e Vacinal RT-PCR – Diferenciação da cepa vacinal e selvagem Nucleocapsideo - composto de RNA viral e proteina C Variações da 3`RNC LSH E lsh4 PK3 B e2 PK1 G3 G2 G1 b4 e3 West African lsh3 A D b3 b2 b1 e1 lsh2 lsh1 PK2 F3 F2 LSH E F1 C PK3 lsh4 B e2 PK1 G3 G2 G1 D e3 17D vaccine A b4 b3 lsh3 b2 b1 e1 lsh1 PK2 F3 F2 F1 lsh2 [Proutski, 1997] C LSH E lsh4 PK3 B e2 PK1 G3 G2 G1 East African b4 e3 lsh3 A D b3 b2 b1 e1 lsh2 lsh1 PK2 F3 F2 F1 C LSH E lsh4 PK3 B e2 PK1 G3 G2 G1 South American b4 e3 lsh3 A D b3 b1 e1 b2 lsh1 lsh2 PK2 F3 F2 F1 C 34 Dados genéticos Não temos apenas um amontoado de dados Análise metagenômica Análise genômica Filogenia-DENV Genotype • Em relação ao Vírus Dengue (sorotipo 4) – Identificação de co-circulação de genótipo Asiático – Diferentes portas de entrada no Brasil – Complexo padrão de dispersão Source: Nunes et al. 2012, EID accepted 2012 Fonte: IEC/SVS/MS - Histopatológico: Analisar as alterações características na infecção viral - Virológico: detecção de antígeno viral (IHQ) Legenda Tecido hepático: seta indicando áreas com antígenos específicos. Fase sólida (lâmina) Antígeno Anticorpo Conjugado (peroxidase) Substrato Antígenos detectados A B C D E F Figura 01 – Aspectos histopatológicos e imunohistoquímica para febre amarela. (A) Lesão médio-zonal característica. (B) Corpúsculos de Councilman (apoptose) no ácino hepático. (C) Área de necrose lítica de hepatócitos ( ) e esteatose microgoticular ( ) (D) Espaço-porta com moderado infiltrado desproporcional ao grau de comprometimento acinar e constituído predominantemente por mononucleares. (E) Trama de reticulina preservada mostrando ausência da formação de septos e manutenção da arquitetura tecidual do fígado. (F) Imunohistoquímica para febre amarela mostrando área positiva no espaço-porta. Óbito paciente adulto – encefalite viral a d b c e Immunohistochemistry of Case 1. A, B and C Areas expressing ZIKV antigens in the brain, especially in the neuronal bodies with (arrows) and without (arrow heads) nucleus and proximal dendrites. D - ZIKV antigens observed in pulmonary alveoli (elipses). 2E - ZIKV antigens observed in myocardial tissue (rectangles). Dados submetidos a publicação Fonte: Marialva Araújo - SAAP IMUNOHISTOQUÍMICA Óbito paciente adulto f g h i (continued): Immunohistochemistry of Case 1. F and G - ZIKV antigens observed in hepatocytes (rectangle). H and I - ZIKV antigens in epithelia of renal tubules (circles). Dados submetidos a publicação Fonte: Marialva Araújo - SAAP DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO Reação cruzada entre Flavivirus circulantes Fonte: biomedicinabrasil.com/2013 Flavivirus x Brasil Bussuquara virus (BSQV) Cacipacoré virus (CPCV) Dengue virus (VDENV) • VDEN-1 • VDEN-2 • VDEN-3 • VDEN-4 Yellow fever virus (YFV) Rocio virus (ROCV) Iguape virus (IGUV) Ilhéus virus (ILHV) Naranjal virus (NJLV) West Nile virus (WNV) Zika virus (ZIKV) Resposta primária a flavivírus Resposta secundária a flavivírus Fonte: http://www.zikavirus.com.br/ - Sorológico: Teste de Inibição da Hemaglutinação (IH) Hemaglutinação Inibição da Hemaglutinação - Painel 19 tipos diferentes de Arbovírus Gênero Alphavirus Gênero Flavivirus EEEV WEEV MAYV MUCV CHIK WNV YFV + + + + + + 20 + + + + + + + 20 + + + + + + + 80 + + + + + + + 40 + + + + + + + 320 + ≥320 ≥320 20 ≥320 + 80 ≥320 ≥320 ≥640 ≥640 20 ≥640 20 320 ≥640 ≥640 Gênero Orthobunyavirus 17D ILHV DEN4 SLEV DEN2 ROCV DEN1 DEN3 ZIKV TCMV OROV CATV ≥640 ≥640 40 ≥640 20 160 ≥640 ≥640 ≥640 ≥640 80 ≥640 40 ≥640 ≥640 ≥640 ≥640 ≥640 20 ≥640 20 80 ≥640 ≥640 ≥1280 ≥1280 ≥1280 ≥1280 ≥1280 ≥1280 20 20 + ≥1280 ≥1280 640 20 20 + 160 320 20 ≥1280 640 320 ≥1280 ≥1280 320 Anticorpo específico Anticorpo não específico Antígeno Hemácias de Ganso ≥640 ≥640 40 320 20 ≥640 ≥640 320 ≥640 ≥640 20 ≥640 20 320 ≥640 ≥640 ≥1280 ≥1280 20 ≥1280 + 640 640 ≥1280 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Detecção de anticorpos IgM Ensaio imunoenzimático (ELISA) Microplaca para teste de ELISA Anti-IgM humana IgM humana (soro do paciente) Antígeno Conjugado ( peroxidase) Substrato (Sistema ABTS) Reatividade cruzada com outros Flavivírus DENV -0.169 NEG NEG POS FA -0.164 NEG NEG POS ZIK -0.207 POS POS POS ZIK ILH VNO SLE ROC 0.534 1.133 1.203 -0.007 2.247 0.429 -0.019 1.264 0.561 -0.030 0.590 0.624 -0.091 0.825 0.841 CONCLUSÃO NEG ZIKA -0.123 -0.122 FLAVI/INDETERM -0.079 FLAVI/INDETERM CCN ELISA IgM para Flavivírus DENV FAV ZIKAV ILHV ROCV WNV 536 amostras DENV 23 205 Reação Cruzada ZIKAV 6 302 Negativo 104 (DEN, ZIK) 44 (DEN, FA, ZIK) 21 (DEN, FA) 13 (FA, ZIK) 4 (ILH, ZIK) 2 (ZIK, ROC) 1 (DEN, FA, SLE) 1 (DEN, ZIK, SLE) 1 (DEN, ZIK, SLE, FA) 1 (ILH, DEN) 1 (ILH, ROC, FA) 1 (SLE, VNO, ZIK) 1 (SLE, ZIK) Caso com amostras pareadas: 1º Amostra: isolamento e RT-qPCR positivos para DENV4 2º Amostra: Indeterminada (reação cruzada entre DENV e ZIKAV Fonte: IEC/SVS/MS ELISA – anticorpos IgM DEN 21% Diferença entre OD de 3X DEN/ZIKA 52% ZIKA 27% N=573 Roc 17% Ilheus 33% N=53 VNO 23% SLE 27% Região codificante (ORF) Região Estrutural (C-PrM-E) CLADO (0,81) 100% (1) (0,88) 100% (1) 100% (1) 100% (1) 65,8% (1) 89,6% (0,98) 87,4% (0,93) 100% (1) 72,3% (0,90) 97,2% (1) 100% (1) 100% (1) 100% (1) 100% (1) 100% (1) 100% (1) 100% (1) 100% (1) 100% (1) 95,8% (1) 99,7% (1) 100% (1) 100% (1) 100% (1) Medeiros, 2009 VDEN2 VDEN4 VSEP VWES VFA VLI VTBE VOHF VLGT VPOW VMML VRB VMOD VAPOI VKR VCFA II I VALFUY 76,6% (0,96) VNO 91,3% (1) VESL 100% 100% (1) VROC II VILH 95,5% (1) Flavivírus transmitidos por mosquitos IV V 91,3% VBAG III VKOK IV VBSQ VIGU 100% (1) 99,8% (1) 92,8% (0,83) VI VIII VEJ 100% (1) III VII VEMV VUSU 87,9% (0,82) 100% (0,94) Aedes viscerotrópicos 100% (1) 99,7% (1) VNO VESL VROC VILH VBAG VIGU VBSQ VKOK VZIK VKED VDEN3 VDEN1 84,9% (0,97) Culex neurotrópicos 79,3% (0,83) VEMV VALFUY I VEJ VUSU GRUPO 85% (0,80) V VDEN1 VDEN3 Flavivírus transmitidos por mosquitos VI VDEN2 VDEN4 79,4% (0,81) 100% (1) 100% (1) IX VZIK VII VKED VIII VSEP VWES IX VFA 100% (1) 100% (1) Flavivírus transmitidos por carrapatos 98,6% (0,99) 100% (0,95) VTBE VLI VOHF VLGT Flavivírus transmitidos por carrapatos VPOW 77,6% 88% (0,90) Agentes Zoonóticos com vetores desconhecido Flavivírus de insetos 91,6% (0,98) 100% (1) VRB VMML VMOD Agentes Zoonóticos com vetores desconhecido VAPOI 100% (1) VCFA VKR Flavivírus de insetos PRNT / TN em camundongos recém-nascidos - Confirmação para os achados sorológicos, devido maior especificidade do teste; - Contudo, ocorrem resultados inconclusivos (cruzamento sorológico) F Diluições da amostra de soro do paciente são incubadas com quantidades definidas dos vírus. Fonte: Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz. DESAFIOS - Ampliação e capacitação da rede de diagnóstico laboratorial; - Produção e validação de testes rápidos (virológicos e sorológicos); - Revalidar os kits utilizados para diagnóstico de dengue apoós entrada do Zika; - Padronização diagnóstico; dos - Controle de qualidade protocolos utilizados para o Diagnóstico do vírus Zika Primeira escolha: teste rápido anti-Zika IgM/IgG (Imunocromatografia) Confirmação com sorologia IgM ou IgG (alta especificidade) Parâmetros (INCQS): Sensibilidade IgM = 97% Sensibilidade IgG = 100% Especificidade IgM = 96% Especificidade IgG = 98% Diagnóstico do vírus Zika/Chikungunya Parâmetros da Sorologia IgM Euroimmun (INCQS): Sensibilidade 97% Especificidade 100% Parâmetros da Sorologia IgG Euroimmun (INCQS): Sensibilidade 98,2% Especificidade 88,2% Treinamento promovido pela OPAS/OMS -Países da América do Sul: Bolívia, Equador, Paraguai e Peru; - Laboratórios sentinelas: IAL, FIOCRUZ-PE, FIOCRUZ-PR, FIOCRUZ-RJ QUANTITATIVO DE EXAMES SOLICITADOS PARA SAARB DISTRIBUIDOS POR AGRAVO, JAN/2015 A DEZ*/2015 306 Febre Amarela Total Exames = 18.626 Dengue 2617 135 4487 Chikungunya Zika Mayaro 3344 Nilo ocidental Oropouche Pesquisa de Arbovírus 58 985 390 4606 1698 Hantavírus Raiva *Dados obtidos até o dia 09/12/15. Fonte: Gerenciador de Ambiente Laboratorial (GAL) STATUS DOS EXAMES SOLICITADOS: Resultado Liberado = 14.860 (79,8%) Resultado em Análise = 1.944 (12,3%) Resultado Cadastrado = 686 (4,3%) Aguardando Triagem = 1.136 (7,1%) EXAMES REALIZADOS PELA SAARB NOS ANOS DE 2013, 2014 DEZ*/2015. DEN FA MAY ORO CHIK (Set/14) VNO (Ago/14) 7000 6000 5000 4000 DEN FA MAY ORO DEN FA MAY ORO CHIK VNO ZIK 2016: 35.000 2016: 13.000 RT-qPCR 3000 2000 1000 0 2013 IH ELISA IgM Arbo 2014 Isolamento Viral RT-qPCR Dez*/2015 ELISA IgM/IgG Hantavírus Raiva *Dados obtidos até o dia 09/12/15. Fonte: Gerenciador de Ambiente Laboratorial (GAL) Demanda em 2013 = 10.278 exames; em 2014= 14.005 exames; Dez*/2015 = 18.626 exames. Em 2014 houve aumento da demanda de 36,3% em relação a 2013. Em 2015 aumento da demanda de 33% em relação a 2014 e de 81,2% em relação a 2013. INSTITUTO EVANDRO CHAGAS – CAMPUS ANANINDEUA SEÇÃO DE ARBOVIROLOGIA E FEBRES HEMORRÁGICAS [email protected]
