Garcez PP, Loiola EC, Madeiro da Costa R et al

Zika virus prejudica o crescimento em
neuroesferas humanas e organóides
cerebrais
Zika virus impairs growth in human neurospheres and
brain organoids
Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.
Garcez PP, Loiola EC, Madeiro da Costa R, Higa LM, Trindade P, Delvecchio R, Nascimento JM, Brindeiro R,
Tanuri A, Rehen SK.
Science. 2016 Apr 10.
Artigo Integral!
Patricia P. Garcez,2,1* Erick Correia Loiola,1† Rodrigo Madeiro da Costa,1†
Luiza M. Higa,3† Pablo Trindade,1†
Rodrigo Delvecchio,3 Juliana Minardi Nascimento, 1,4 Rodrigo Brindeiro,3
Amilcar Tanuri,3 Stevens K. Rehen1,2*
1D'Or Institute for Research and Education (IDOR), Rio de Janeiro, Brazil. 2Institute of
Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
3Institute of Biology, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
4Institute of Biology, State University of Campinas, Campinas, Brazil.
*Corresponding author. Email: [email protected] (P.P.G.); [email protected]
(S.K.R.)
Science. 2016 Apr 10. pii: aaf6116. [Epub ahead of print]
Realizado por Paulo R. Margotto, Prof. de Neonatologia (6a Série) da Faculdade de
Medicina da Universidade Católica de Brasília)
Introdução
Microcefalia primária é uma malformação cerebral grave caracterizada pela
redução da circunferência da cabeça. Pacientes exibem uma gama heterogênea de
deficiências cerebrais, comprometendo motor, visual, auditivo e das funções cognitivas
(1).
Microcefalia está associada com a produção diminuída neurônios como
consequência de defeitos proliferativas e morte de células progenitoras corticais (2).
Durante a gravidez, a etiologia primária da microcefalia varia de mutações genéticas a
insultos externos. Os chamados fatores TORCHS (toxoplasmose, rubéola,
citomegalovírus, herpes, sífilis) são as principais infecções congênitas que
comprometem o desenvolvimento do cérebro no útero (3).
O aumento da taxa de microcefalia no Brasil tem sido associada com o recente
surto do vírus Zika (ZIKV) (4, 5), um flavivírus que é transmitido por mosquitos (6) e
sexualmente (7-9). Até agora, tem sido descrito ZIKV na placenta e no fluido amniótico
de fetos microcéfalos (10-13) e no sangue de recém-nascidos microcéfalos (11,14).
ZIKV também foi detectado no cérebro de fetos microcefálicos (13,14), e, recentemente,
existe evidência direta de que o ZIKV é capaz de infectar e causar a morte das células
estaminais neurais (15).
Aqui, usamos células tronco humanas puripotentes induzidas cultivadas
(iPS) como células tronco neurais (NSC), neuroesferas (agrupamento de células
tronco neurais; nas neuroesferas dá para perceber as fases bem iniciais da
neurogênese ) e organóides cerebrais (estruturas de neurônios com cerca de 2mm e
que simulam os processos celulares e moleculares que ocorrem no cérebro durante o
primeiro trimestre da gravidez) para explorar as consequências da infecção pelo ZIKV
durante a neurogênese e crescimento com modelos de cultura 3D. NSC derivadas de iPS
humanas foram expostas ao ZIKV (MOI 0,25-,0025). Após 24 horas, o ZIKV foi
detectado nas NSC (Fig. 1, A a D), quando a proteína do envelope viral foi mostrado em
10,10% (MOI 0,025) e 21,7% (MOI de 0,25) nas células expostas ao ZIKV (Fig. 1E). O
RNA viral foi também detectado no supernadante de NSC infectadas (MOI 0,0025) por
qRT-PCR (Fig. 1F), suportando a infecção produtiva.
CONTROLE
FIG. 1. ZIKV infecta as células tronco neurais. A microscopia mostra
imagens de iPS derivadas NSCs duplamente coradas para (A) ZIKV no citoplasma,
e (B) nos núcleos SOX2, um dia após infecção pelo vírus. (C) Coloração DAPI, (D)
canais incorporados mostram a localização perinuclear do ZIKV. Barra = 100 um. (E)
Percentagem de células infectadas positivas pelo ZIKV SOX2 (MOI 0,25 e 0,025). (F)
A análise de RT-PCR do ZIKV RNA extraído de sobrenadantes de neuroesferas não
infectadas e infectadas com ZIKV (MOI 0,0025) após 3 DIV, mostrando
amplificação apenas nas células infectadas. O RNA foi extraído, qPCR realizado
e produção de vírus normalizado com 12h pós -infecção controles. Dados
apresentados como média ± SEM, n = 5, teste t de Student, * p <0,05, ** p <0,01.
Para investigar os efeitos do ZIKV durante a diferenciação neuronal, NSCs
controle e NSCS infectadas pelo ZIKV foram cultivadas como neuroesferas. Após 3
dias in vitro, NSCs controles geraram neuroesferas No entanto, NSCs infectadas pelo
ZIKVs geraram neuroesferas com anormalidades morfológicas e desprendimento de
células (Fig. 2B). Após 6 dias in vitro (DIV), centenas de neuroesferas controles
cresceram (Fig. 2, C e E). Surpreendentemente, as NSC infectadas pelo ZIKV (MOI de
2,5-0,025) apenas algumas neuroesferas sobreviveram (Fig. 2, D e E).
FIG. 2. ZIKV altera a morfologia e pára o crescimento da neuroesferas humanos. (A)
Neuroesfera controle exibe morfologia esférica após 3 DIV. (B) Neuroesferas
infectadas apresentaram anormalidades morfológicas e despreendimento celular após
3 DIV. (C) Cultura contendo centenas de neuroesferas não infectadas após 6 DVV)
ZIKA-infectados bem-placa (MOI 2.5-0.025) contendo alguns neuroesferas após 6 DIV.
Barra = 250 um em (A) e (B), e 1 cm em (C) e (D). (E) A quantificação do número
de neuroesferas em diferentes MOI. Os dados apresentados como média ± EPM, N = 3,
teste t de Student, *** p <0,01.
Neuroesferas sob condições de controle apresentaram morfologia esperada na
ultra-estrutura do núcleo e mitocôndrias (Fig. 3A). Neuroesferas infectadas pelo ZIKV
revelou a presença de partículas virais, de modo semelhante aos observados em células
gliais de murino e células neuronais (16). ZIKV ligou-se às membranas e nas
mitocôndrias e vesículas de células dentro de neuroesferas infectadas (Fig. 3, B e F,
setas). Núcleos apoptóticos, uma característica da morte celular, foram observados em
todas as neuroesferas infectados com ZIKV analisadas (Fig. 3b). Digno de nota, as
células infectadas com ZIKV nas neuroesferas apresentavam estruturas de membranas
lisas (SMS) (fig. 3, B e F), semelhante aos descritos anteriormente em outros tipos de
células infectadas com o vírus do dengue (17). Estes resultados sugerem que ZIKV
induz a morte celular em células tronco neurais humanas e assim prejudica a formação
de neuroesferas.
FIG. 3. ZIKB induz morte em neuroesferas humanas. Ultra-estrutura das neuroesferas controle e
ZIKV infectada após 6 dias in vitro. (A) neuroesfera falsamente infectada mostra os processos
celulares e organelas, (B) neuroesfera ZIKV-infectada mostra núcleo picnótic, mitocôndria
edemaciada, as estruturas de membrana lisa e os envelopes virais (seta). As setas apontam
envelopes virais na superfície das células (C), dentro de mitocôndrias (D), retículo endoplasmático
(E) e próximo a estruturas lisas da membrana (F). Bar = 1 um em (A) e (B) e 0,2 uM em (C) a (F). m
= mitocôndrias; n = núcleo; sms = estruturas de membrana lisas.
Para investigar mais o impacto da infecção ZIKV durante a neurogênese, iPS
humanas derivadas de organóides cerebrais (18) foram expostas ao ZIKV, e seguido
por 11 dias in vitro (Fig. 4). A taxa de crescimento de 12 organóides individuais (6) por
cada condição foi medida durante este período (Fig. 4, A e D). Como resultado da
infecção pelo ZIKV, a área média dos organóides foi reduzida em 40% quando
comparado com organóides cerebrais sob condições de controle, ou seja, não expostos à
infecção pelo ZIKV (0,624 mm2 ± 0,064 organóides ZIKV-expostos contra 1.051 mm2
± 0,1084 organóides não infectados, a Fig. 4E).
.
FIG. 4. ZIKV reduz a taxa de crescimento dos organóides cerebrais humanos. 35 dias de idade os
organóides cerebrais foram infectadas com (A) controle (falsa infecção) (B) ZIKB durante 11 dias in
vitro. Os organóides cerebrais infectados com ZIKV mostram redução no crescimento em
comparação com o controle. As setas indicam as células destacadas. (C) controle e (D) ZIKV in vitro.
plotados representam a quantificação da taxa de crescimento. (E) Quantificação da média do
controle e da área dos organóides infectados pelo ZIKV 11 dias após a infecção in vitro. Dados
apresentados como média ± EPM, N = 6, o teste t de Student, * p <0,05.
Além do uso do controle, utilizou-se o vírus da dengue 2 (DENV2), um
flavivirus com semelhanças genéticas com o ZIKV (11, 19), como um controle. Um
dia após à exposição viral, DENV2 infectou NSC com uma taxa semelhante ao ZIKV.
No entanto, ao fim de 3 dias in vitro, não houve aumento na caspase 3/7 que mediam a
morte celular mediada induzida por DENV2 com o mesmo 0,025 MOI usado para
infecção ZIKV. Por outro lado, a ZIKV induziu a caspase 3/7 que media a morte nas
NSC, de modo semelhante aos resultados descritos por Tang et al (15). Após 6 dias in
vitro, existe uma diferença significativa na viabilidade celular entre as NSC-ZIKV
expostas em comparação com as NSC-DENV2 expostas. Além disso, as neuroesferas
expostas a DENV2 exibiram uma morfologia redonda, tais como as neuroesferas não
infectadas após 6 dias in vitro. Finalmente, não houve redução do crescimento nos
organóides cerebrais expostos a DENV2 por 11 dias em comparação com o controle
(1.023 mm2 ± 0.1308 organóides infectados com DENV2 contra 1.011 mm2 ± 0,2471
organóides não infectados. Estes resultados sugerem que as conseqüências deletérias
da infecção pelo ZIKV em NSCs humanas, neuroesferas e organóides cerebrais
não são uma característica geral da família flavivírus. Neuroesferas e organóides
cerebrais são modelos complementares para estudar o desenvolvimento do cérebro
embrionário in vitro (20, 21). Enquanto as neuroesferas apresentam as características
muito precoces da neurogênese, os organóides cerebrais recapitulam os primeiros
eventos celulares e moleculares do neocórtex fetal no primeiro trimestre, incluindo a
expressão gênica e as camadas corticais (18, 22). Os presentes resultados demonstram
que o ZIKV induz a morte celular de células tronco humanas puripotentes
induzidas cultivadas como células tronco neurais, perturba a formação de
neuroesferas e reduz o crescimento de organóides cerebrais, indicando que a infecção
pelo ZIKV em modelos que imita o primeiro trimestre de desenvolvimento do cérebro
pode resultar em danos graves. Outros estudos são necessários para caracterizar melhor
as consequências da infecção pelo
ZIKV durante as diferentes fases de
desenvolvimento fetal.
A morte celular prejudicando o cérebro, calcificação e microcefalia é bem
descrito em infecções congênitas com TORCHS (3, 23, 24). Os presentes resultados,
juntamente com relatos recentes que mostram a calcificação cerebral em fetos e recémnascidos microcéfalos infectadas com ZIKV (10, 14) reforçam o crescente corpo de
evidências que liga o surto do ZIKV congênito ao aumento do número de relatos de
malformações cerebrais no Brasil.
Abstract
Desde o surgimento do Zika virus (ZIKV), relatos de microcefalia têm aumentado
significativamente no Brasil; no entanto, a causalidade entre a epidemia viral e
malformações fetais nos cérebros precisa ser confirmada posteriormente. Aqui, nós
examinamos os efeitos da infecção pelo ZIKV em células-tronco neurais em
crescimento como neuroesferas e organóides cerebrais. Usando a imunohistoquímica e
a microscopia eletrônica, mostramos que o ZIKV ataca as células do cérebro humano,
reduzindo a sua viabilidade e crescimento como neuroesferas e organóides cerebrais.
Estes resultados sugerem que o ZIKV abole a neurogênese durante o desenvolvimento
do cérebro humano.
REFERENCES AND NOTES
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Nota do Editor do site, Dr. Paulo R. Margotto. Consultem
também! Aqui e Agora! Estudando Juntos!
1) Visão na mídia
Células tronco neurais infectadas pelo ZIKV
“Os nossos resultados demonstram que o zika induz a morte celular, perturba a
formação de neuroesferas e reduz o crescimento de organoides, indicando que a
infecção em modelos que imitam o primeiro trimestre de desenvolvimento do cérebro
pode resultar em danos graves”, detalharam os autores no artigo divulgado. Fazem parte
da pesquisa cientistas da UFRJ, do Instituto D’Or de Pesquisa e Ensino (Idor) e da
Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).
No novo experimento, conduzido por Patrícia Garcez, professora da UFRJ,
foram usados dois modelos de estudo: os minicérebros e as neuroesferas. Os primeiros,
também chamados de organoides cerebrais, são estruturas de neurônios com cerca de 2
milímetros e que simulam os processos celulares e moleculares que ocorrem no cérebro
durante o primeiro trimestre da gestação. Nas neuroesferas, agrupamentos de
célulastronco neurais, dá para perceber as fases bem iniciais da neurogênese - o
processo de formação dos neurônios.
Ambas as estruturas foram infectadas pelo vírus retirado de uma brasileira. O
zika matou boa parte das neuroesferas em pouco dias e causou anomalias em muitas das
que resistiram a ele. Sob condições de controle, centenas de estruturas cresceram. Em
um segundo experimento, feito com os minicérebros, o crescimento dos órgãos foi de
40% se comparado aos não infectados. Nessa etapa do desenvolvimento fetal, ocorre,
por exemplo, a formação do córtex, área cerebral rica em neurônios — mais de 20
bilhões — e tida como a sede da razão do órgão. “Esses resultados únicos podem
desvendar algumas das principais características da infecção do zika no cérebro em
desenvolvimento”, ressaltou a também
neurocientista Patricia Garcez.
Em março, Stevens Rehen e a equipe mostraram que as células-tronco neurais,
principalmente as que dão origem aos neurônios do córtex, são o alvo do vírus zika. Na
pesquisa, eles tentaram flagar a ação do micro-organismo em diferentes etapas da
gestação humana. “Isso não significa que o zika não ataque outras células, mas seu alvo
parece ser as células-tronco do córtex. Com isso, ele provoca uma cascata de destruição
no cérebro, onde essas células-tronco se proliferam”, disse Rehen, à época, ao jornal O
Globo.
Dengue
Os experimentos da pesquisa divulgada nesta semana foram repetidos com o
vírus da dengue, um microrganismo muito semelhante ZIKV. Nesse caso, houve uma
diferença “signiticativa da viabilidade celular após seis dias, com células infectadas com
dengue sobrevivendo muito melhor”. Também de acordo com o artigo divulgado na
Science, os minicérebros não sofreram redução no crescimento quando comparados aos
do grupo de controle.
2) Efeitos teratogênicos do Zika vírus e o papel
da placenta
Adibi JJ, Marques ET Jr, Cartus A, Beigi RH. Realizado por
Paulo R. Margotto
O ZIKA VÍRUS INFECTA PROGENITORES DA CÓRTEX NEURAL
HUMANA E ATENUA SEU CRESCIMENTO
Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates
Their Growth. Tang H, Hammack C, Ogden SC, Wen Z, Qian X, Li Y, Yao B, Shin J, Zhang F, Lee EM, Christian
KM, Didier RA, Jin P, Song H, Ming GL.
Cell Stem Cell. 2016 Mar 3. ARTIGO
INTEGRAL!
A suspeita de ligação entre infecção pelo ZIKV e microcefalia é um problema
urgente de saúde global. Tang et al. relataram que o ZIKV infecta diretamente as células
progenitores do córtex neural com alta eficiência, resultando em um retardo do crescimento
desta população de células e uma desregularão transcripcional. O ZIKV (Flavivirus
transmitidos por mosquitos), agora é relatado estar circulando em 26 países e territórios da
América Latina e Caribe (Petersen et al., 2016). Enquanto indivíduos infectados muitas
vezes podem estar assintomáticos ou têm apenas sintomas leves, a maior preocupação são os
relatos que ligam infecção ZIKV com a microcefalia fetal e graves complicações
neurológicas como a síndrome de Guillain -Barré (Patersen et al, 2016).
ZIKV infecta células da pele humana, de acordo com a sua principal via de
transmissão (Hamel et al, 2015). ZIKV foi detectado no líquido amniótico de duas mulheres
grávidas cujos fetos tinham sido diagnosticados com microcefalia (Calvet et al, 2016),
sugerindo que o ZIKV pode atravessar a barreira placentária. ZIKV também foi encontrado
no tecido cerebral do feto com microcefalia (Mlakar et al., 2016). Devido ao pouco
conhecimento sobre os alvos celulares direto e mecanismos do ZIKV e o acesso ao tecido
cerebral fetal humano ser limitado, há uma necessidade urgente de desenvolver uma nova
estratégia para determinar se existe uma relação causal entre a infecção pelo ZIKV e
microcefalia. Neste estudo, os autores usaram células-tronco pluripotentes (hiPSCs) como
um modelo in vitro para investigar se o ZIKV infecta diretamente as células progenitoras
neurais humanas (hNPCs) e a natureza do seu impacto.
As células progenitoras neurais humanas (hNPCs) infectadas liberam ainda mais
partículas Zika infecciosas. Importante, a infecção pelo ZIKV aumenta morte celular e
desregula a progressão do ciclo celular, resultando em um atenuado crescimento das células
progenitoras neurais humanas. A análise da expressão gênica global da hNPCs infectadas
revela desregulação transcricional, nomeadamente das vias relacionadas com o ciclo celular.
Os presentes resultados identificam hNPCs como um alvo direto do ZIKV.
Não se sabe se cepas específicas de ZIKV circulando em diversas partes do mundo
diferem em sua capacidade de impacto do desenvolvimento neural e a cepa aqui usada
(MR766) tenha sido descoberto antes dos relatos
atuais de um potencial vínculo
epidemiológico entre ZIKV e microcefalia. No entanto, os presentes resultados demonstram
claramente que ZIKV pode infectar diretamente hNPCs in vitro, com elevada eficiência e
que a infecção de hNPCs leva a atenuação do crescimento populacional através da apoptose
viralmente induzida mediada pela caspase-3 e desregulação do ciclo celular.
hNPCs
infectadas também libertam partículas virais infecciosas, que apresentam um desafio clínico
significativo para o desenvolvimento de terapêuticas eficazes para atrasar ou bloquear o
impacto da infecção. Estudos futuros utilizando o modelo hiPSC / hNPC pode determinar se
várias estirpes do ZIKV impactam as hNPCs de forma diferente e, inversamente, se uma
única estirpe ZIKV afeta diferencialmente hNPCs de hiPSCs de várias populações humanas.
Flavivírus tendem a ter grandes tropismos celulares e vários fatores contribuem para
os resultados patogênicos, incluindo resposta celular específica e acessibilidade dos tecidos.
O vírus da dengue infecta as células de várias linhagens hematopoiéticas e células que
desempenham um papel essencial na patogênese associada (Pham et al., 2012). O vírus do
Nilo Ocidental infecta as células epiteliais de vários tecidos e pode ser neuroinvasivo (Suthar
et al., 2013). Os autores notaram que o ZIKV também infecta outros tipos de células
humanas, incluindo células e fibroblastos da pele (Hamel et al., 2015) e permanece
desconhecido como ZIKV pode ter acesso ao cérebro fetal (Mlakar et al., 2016). A
capacidade de ZIKV para infectar hNPCs e atenuar o seu crescimento demonstra a
necessidade urgente de mais investigação sobre o papel destas células na neuropatologia
relacionados com o ZIKV. A constatação de que o ZIKV também infecta neurônios imaturos
levanta questões delicadas quanto efeitos patológicos sobre os neurônios e outros tipos de
células neurais no cérebro, bem como potenciais consequências a longo prazo. Curiosamente,
um estudo animal mostrou infecção precoce pelo ZIKV de neurônios e astrócitos em ratos
sendo mostrados astrócitos alargados (Bell et al., 1971).
Em resumo, os presentes resultados preencher uma grande lacuna no nosso
conhecimento sobre a biologia do ZIKV e serve como um ponto de entrada para estabelecer
uma ligação mecânica entre o ZIKV e microcefalia. Este estudo também fornece um
sistema experimental tratável para modelar o impacto da ZIKV no desenvolvimento neural e
para a investigação subjacente e mecanismos celulares e moleculares. De igual importância,
o este modelo de hNPC e fenótipo celular robusto compreendem uma plataforma facilmente
escalável de alta capacidade para prevenir a infecção das hNPCs pelo do ZIKV e atenuar
seus efeitos patológicos durante o desenvolvimento neural.
Destaques
-ZIKV infecta células do córtex neural
embriônico humano (hNPCs)
-Produtos das hNPCs infectadas pelo
ZIKV produz partículas ZIKV infecciosas
-Infecção pelo ZIKV leva a um aumento
da morte celular de hNPCs
-Infecção pelo ZIKV desregula ciclo
celular e a transcripção nas hNPCs
E mais....
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Bispo de Filippis AM. Realizado por Paulo R. Margotto
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"Não há mais qualquer dúvida", disse o diretor da instituição norte-americana
(em 13/4/2016)
Consultem Artigo Integral!
Zika Virus and Birth Defects - Reviewing the Evidence for Causality.
Rasmussen SA, Jamieson DJ, Honein MA, Petersen LR.
N Engl J Med. 2016 Apr 13
Paulo R. Margotto
Belo Horizonte, 15 de abril de 2016
Belo Horizonte, 15 de abril de 2016
Paulo R. Margotto