BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS ASSOCIADAS A VARIEDADES DE

BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS ASSOCIADAS A
VARIEDADES DE CANA-DE-AÇÚCAR
CULTIVADAS NO NORDESTE
Michelangelo de Oliveira Silva1, Fernando José Freire2, Júlia Kuklinsky-Sobral3, Mario de Andrade Lira
Júnior4, Diogo Paes da Costa5, Marisângela Viana Barbosa5, Maria Camila de Barros Silva5 & Pedro
Avelino Maia de Andrade5

Introdução
As plantas podem ser consideradas um
microecossistema complexo onde diferentes nichos são
explorados por uma extensa variedade de bactérias,
inclusive bactérias promotoras de crescimento vegetal.
Dentre os diversos mecanismos de interação bactériaplanta, um de grande interesse para a cultura da canade-açúcar é a fixação biológica do nitrogênio (FBN)
por bactérias endofíticas, pois se estima que a FBN
pode alcançar níveis de até 60% do nitrogênio total
acumulado por esta cultura [1, 2, 3]. Isto pode
significar que em solos com baixos teores de nitrogênio
disponível, a FBN poderá ser suficiente para satisfazer
a exigência de N para a produção da cana-de-açúcar,
que normalmente são suplementadas pelo uso de
fertilizantes industriais [2, 3, 4, 5].
Do ponto de vista biotecnológico, bactérias que
possuam mais de uma característica para a promoção
de crescimento vegetal, como, por exemplo, fixar N2 e
solubilizar fosfato ou produzir auxina e sideróforos,
entre outras, são almejadas e rastreadas para uma
possível aplicação no campo objetivando o aumento da
produção agrícola. Desta forma, torna-se evidente a
necessidade de um melhor conhecimento sobre estes
mecanismos de interação bactéria-planta, pois assim
será possível a utilização prática destes microrganismos
[3, 6, 7].
Neste contexto, o presente trabalho teve o objetivo
de isolar e selecionar bactérias (endofíticas e do
rizoplano) fixadoras de N2 de diferentes variedades de
cana-de-açúcar cultivadas no Nordeste.
Material e métodos
A. Material vegetal
Bactérias endofíticas, de folha e raiz, e bactérias do
rizoplano foram isoladas de três variedades comerciais
(RB 867515, RB 92579 e RB 863129) de cana-de-
açúcar (Saccharum spp.), cultivadas na Estação
Experimental de Cana-de-Açúcar de Carpina/PE
(EECAC) da Universidade Federal Rural de
Pernambuco (UFRPE). As amostras vegetais, quatro
plantas de cada variedade, foram coletadas entre quatro
e cinco meses de cultivo, sendo identificadas e levadas
ao Laboratório de Genética e Biotecnologia
Microbiana (LGBM) da Unidade Acadêmica de
Garanhuns (UAG/UFRPE) para processamento das
análises.
B. Isolamento de Bactérias Diazotróficas
Associadas à Cana-de-Açúcar
Após a coleta, as amostras vegetais foram lavadas
em água corrente e separadas em folha e raiz. Para o
isolamento de bactérias do rizoplano, segundo
Kuklinsky-Sobral et al. [6], cerca de 3g de raiz foram
colocados em frascos Erlenmeyer (500ml) contendo
25g de pérolas de vidro (0,1cm de diâmetro) e 50ml de
tampão fosfato salino (Phosphate Buffered Saline –
PBS: 1,44g/l de Na2HPO4; 0,24g/l de KH2PO4; 0,20g/l
de KCl; 8,00g/l de NaCl; pH 7,4). Estes frascos foram
mantidos sob agitação (90rpm) a 28oC por 1h. Em
seguida, diluições apropriadas em tampão PBS foram
inoculadas, em triplicatas, em meio semi-sólido NFb,
segundo Dobereiner et al. [8].
Para o isolamento de bactérias endofíticas de folha e
raiz, foram utilizadas as amostras de raízes oriundas do
isolamento de bactérias do rizoplano e, também, cerca
de 3g de tecido vegetal de folhas. Para tanto, foi
necessário um processo de desinfecção superficial,
eliminando os possíveis microrganismos que se
encontrem nas camadas mais superficiais do tecidos
vegetais, que se consistiu nas seguintes etapas: lavagem
por 1min em etanol 70%; 3min em hipoclorito de sódio
(NaOCl) a 2% de cloro ativo (v/v) e 30seg em etanol
70%, seguido de duas lavagens em água destilada
esterilizada. Os tecidos foram cortados, assepticamente,
________________
1 Doutorando do PPG em Ciência do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE,
CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
2. Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manuel de Medeiros, Dois Irmãos,
Recife, PE, CEP 52171-900.
3. Professora Adjunta da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista,
Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
4. Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manuel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos,
Recife, PE, CEP 52171-900.
5. Alunos de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n,
Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e FACEPE.
em pequenos fragmentos e triturados em 10ml de
tampão PBS com o auxílio de cadinhos e almofarizes.
Em seguida, todo o material foi transferido para tubos
de 15ml e incubados sob agitação (120rpm) a 28oC por
40min. Após esta etapa, diluições apropriadas em
tampão PBS foram inoculadas, em triplicatas, em meio
semi-sólido NFb, segundo Dobereiner et al. [8].
Todos os inóculos do meio NFb foram incubados a
28°C por 8 dias. Após a formação de um halo de
crescimento no interior do meio de cultura, transferiuse uma amostra da cultura para um novo meio semisólido NFb e incubou-se por mais 8 dias, nas mesmas
condições. Após este período, o crescimento bacteriano
foi purificado por esgotamento em meio NFb sólido,
acrescido com 20mg/l de extrato de levedura, e
incubado a 28°C por 4-5 dias. Colônias isoladas foram
armazenadas em meio NFb sólido com extrato de
levedura e acondicionadas a 4°C, além de serem
estocadas a -20°C, em meio líquido NFb, acrescido de
glicerol 20%.
Resultados e Discussão
Durante os experimentos de isolamento em meio
NFb, seletivo para bactérias fixadoras de nitrogênio,
foram coletados 78 isolados bacterianos de folha, raiz e
do rizoplano das variedades RB 867515, RB 92579 e
RB 863129 de cana-de-açúcar cultivadas no Nordeste.
Foi observado o surgimento de diferentes grupos
morfológicos,
sendo
selecionados
isolados
representantes de cada grupo.
Foi possível observar uma interação entre os grupos
morfológicos observados e as variedades de cana-deaçúcar avaliadas. Houve uma predominância de
colônias de cor amarela e de cor verde nas três
variedades de cana (Figura 1), sugerindo serem grupos
bacterianos de importância na associação com a planta
hospedeira, neste caso, a cana-de-açúcar. Além disso,
colônias de cor branca também foram isoladas das três
variedades analisadas, mas em porcentagem menor,
variando entre 12 e 19%, dependendo do genótipo da
planta (Figura 1). Colônias de cor esverdeada foram
isoladas das variedades RB 867515 e RB 863129, 8% e
4%, respectivamente, não sendo encontradas apenas na
variedade RB 92579, sugerindo uma interação bactériaplanta mais estreita (Figura 1).
Em relação ao potencial para fixar N2, foi observado
interação entre os tecidos vegetais e as variedades de
cana avaliadas. As bactérias isoladas em NFb foram
coletadas em maior percentagem das folhas e do
rizoplano, para as três variedades de cana. Ressaltandose a variedade RB 867515, que apresentou 54% de
isolados fixadores de folha, seguida pela variedade RB
863129 com 46% (Figura 2). A fixação biológica de N2
tem sido um dos mecanismos envolvidos na interação
microrganismos-planta em diversos estudos [6, 9, 10],
mostrando que bactérias fixadoras de N2 se distribuem
em diferentes tecidos vegetais e apresentam interação
com o genótipo da planta hospedeira.
Estudos com biofertilizantes aumentaram a produção
de culturas agrícolas pelas combinações de FBN,
reguladores de crescimento vegetal (fitohormônios),
maior disponibilidade de nutrientes no solo e controle
de doenças [10]. Desde que o nitrogênio atmosférico é
uma fonte renovável, a FBN é uma fonte sustentável de
N2 em sistemas agrícolas.
Conclusões
As bactérias associadas a variedades de cana-deaçúcar, cultivadas no Nordeste, apresentam potencial
aplicação biotecnológica, mais especificamente para
promoção de crescimento vegetal, pois, possuem a
capacidade de fixar nitrogênio, destacando-se as
regiões da folha e rizoplano das variedades analisadas.
Portanto, são isolados adaptados à região Nordeste e
que podem ser, futuramente, aplicadas em campo, para
aumentar a fixação biológica do nitrogênio para a
planta hospedeira.
Referências
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[5] POLIDORO, J.C. 2001. O Molibdênio na Nutrição Nitrogenada
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[8] DOBEREINER, J.; BALDANI, V.L.D.; BALDANI, J.I. 1995.
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[9] REIS, V.M.; BALDANI, J.I.; BALDANI, V.L.D.;
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Figura 1. A) Frequência relativa (%) das características morfológicas (cor da colônia) dos isolados bacterianos associados a três
variedades de cana-de-açúcar: RB 92579, RB 867515 e RB 863129; B) Frequência relativa (%) do isolamento de bactérias
diazotróficas associadas a três variedades de cana-de-açúcar: RB 92579, RB 867515 e RB 863129, em meio seletivo NFb.