O efeito da noradrenalina no perfil de citocinas

Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Vencedor 2012
O efeito da noradrenalina no perfil de citocinas produzidas pelas células dendríticas
ativadas com LPS: impacto na diferenciação de células T CD4+
Maisa Carla Silveira Takenaka
Abstract: All immune organs receive sympathetic innervation, indicating that the sympathetic
nervous system (SNS) can modulate the immune response by releasing neurotransmitters such
as norepinephrine (NE). The sympathetic innervation in spleen and lymph nodes is restricted to
the T cell zones where dendritic cells (DC) are also present. It has been described that DC
express adrenergic receptors, which allows these cells to respond to NE. These data suggest
that the SNS can influence immune processes such as antigen presentation, T cell activation,
proliferation and differentiation. The priming of Th cell subsets is orchestrated by cytokines
produced by DC that sense PAMPs and local microenvironmental factors, being IL12p70 and
IL23 important to Th1 and Th17 immune responses, respectively. So, the aim of this project is
to verify how NE may modulate the ratio of IL12p70/IL23 production by LPS-DC and whether or
not this modulation impact T cell differentiation. DC will be generated from bone marrow cells
cultivated in DMEM and GM-CSF. To verify the influence of NE on DC activation, immature DC
(iDC) culture will be treated or not with NE and stimulated with LPS for 18h. In some
experiments, cells will be pre-treated with 2AR or 2AR specific antagonist and then
stimulated as mentioned above. The cytokines production will be analyzed by CBA flex (IL-6,
IL-12p70, IL-23 and IL-10). To evaluate the impact in the adaptive immune response we will
analyze the T cell proliferation and differentiation. Naïve T cells will be co-cultured with iDC or
LPS-DC (treated or not with 2AR agonist) plus anti-CD3 antibody. T cell proliferation will be
analyzed by FACS through BrdU dilution. The Th1/Th17 cell differentiation will be investigated
by measuring cytokine production and analyzing the transcription factors by FACS. Finally, we
will investigate the NE signaling pathway in LPS-DC via CREB phosphorylation using FACS.
INTRODUÇÃO: Mesmo sabendo da interação entre os sistemas nervoso (SN) e imune (SI)
ainda é pouco estudada a influência que o SN pode exercer no desfecho da resposta imune,
tanto no contexto da geração como da regulação das respostas imunes adaptativas. Uma das
vias pelas quais os sistemas imune e nervoso interagem é constituída pelo sistema nervoso
simpático (SNS). Anatomicamente os órgãos linfóides secundários, na região rica em linfócitos
T, recebem inervação simpática, ou seja, fibras nervosas que utilizam como principais
mediadores de suas ações neurotransmissores como as catecolaminas (noradrenalina e
dopamina), sugerindo que processos como apresentação antigênica, ativação e diferenciação
de células T podem ser influenciados pelo SNS1-3. Além disso, estudos mostram que várias
células do SI incluindo as células dendríticas (DC) expressam receptores adrenérgicos o que
as habilita a receber sinais oriundos da atividade do SNS4. As DC são células apresentadoras
de antígenos profissionais, que exercem um papel importante na indução tanto da resposta
imune efetora como da tolerância. Durante o processo de ativação e diferenciação das células
T CD4+ as citocinas produzidas pelas DC podem influenciar na polarização dos diferentes
subtipos de células T helper (Th), sendo IL12p70 e IL23 importantes para polarização das
respostas imunes Th1 e Th17, respectivamente5. Estudos mostram que a noradrenalina (NE)
é capaz de diminuir a produção de citocinas inflamatórias pelas DC ativadas com LPS 6,7. No
entanto, ainda não há estudos conclusivos mostrando se essa mudança no perfil de citocinas
R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br
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Projeto Vencedor 2012
produzidas pelas DC pode ter um efeito na diferenciação dos subtipos de células Th. Neste
projeto, temos como objetivo avaliar se a NE pode modular a razão IL12p70/ IL23 produzida
pelas DC ativadas com LPS e suas consequências na resposta imune adquirida.
Este projeto poderá contribuir para uma melhor compreensão da interação entre o SNS e SI,
assim como entender melhor possíveis mecanismos que o SNS pode desempenhar no
desfecho da resposta imune adquirida, através das DC.
OBJETIVO: Avaliar in vitro a capacidade da noradrenalina em modular diretamente a produção
de citocinas pelas células dendríticas provenientes da medula óssea e o impacto que essa
modulação pode ter na resposta imune adquirida, por meio da polarização de células T CD4+.
ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL
Experimento 1 – Avaliação do perfil de citocinas produzidas por DC estimuladas com LPS na
presença de noradrenalina.
O padrão de citocinas produzidas pelas DC é um dos principais fatores que determinam o perfil
de resposta imune adaptativa a ser gerada, ou seja, o subtipo de célula T CD4+ a se
diferenciar. Mais especificamente, a produção de IL-12, IL-23 e IL-6 por DCs é importante na
indução de respostas Th1 e Th17, respectivamente. Este experimento buscará avaliar se a NE
interfere no perfil de citocinas produzidas por DCs estimuladas com LPS. Primeiramente, DC
imaturas (iDC) obtidas a partir da medula óssea serão cultivadas na presença ou ausência de
NE e estimuladas com LPS.
Após 18 horas de estímulo os sobrenadantes das culturas serão coletados e a produção de IL12p70, IL-23, IL-6 e IL-10 será analisada por CBA flex. A expressão de MHC de classe II e de
moléculas co-estimuladoras (CD80, CD86, CD40) em DC CD11c+ será investigada por FACS.
Posteriormente, realizaremos a mesma estratégia experimental usando agonistas e/ ou
antagonistas de receptores adrenérgicos visando especificar quais receptores adrenérgicos
são responsáveis em modular a produção de citocinas pelas DC ativadas com LPS tratadas
com NE.
Experimento 2 - Avaliação da proliferação de células T CD4+ naive na presença das DC
estimuladas com LPS tratadas ou não com o agonista específico do receptor 2 adrenérgico (2
AR).
As DC são conhecidas como células apresentadoras de antígenos profissionais pela
capacidade de ativar os linfócitos T naive. Para avaliarmos se a presença do agonista do 2AR
durante a ativação das DCs com LPS pode alterar sua capacidade de ativar as células T CD4+
naive, nós iremos avaliar a proliferação de células T CD4+ naive co-cultivadas com DCs. Para
tanto, as iDC serão tratadas ou não com agonista específico do 2AR e ativadas com LPS por
6h. As DCs ativadas com LPS e iDCs serão lavadas com PBS e co-cultivadas com células T
naive (CD3+CD4+CD62L+), purificadas por citometria de fluxo (FACSAriaII) e marcadas com
BrdU, na presença do anticorpo solúvel anti-CD3. Após 3 dias, a proliferação será determinada
pela redução da intensidade de fluorescência do BrdU na população de células T (CD3+
CD4+CD45RB-).
Experimento 3 – Avaliação da diferenciação dos subtipos de células T CD4+.
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(Th1 e Th17) pelas células dendríticas tratadas com agonista
do 2 AR Este experimento visa avaliar o potencial das DC tratadas com agonista do 2AR na
diferenciação de células Th1 e Th17. Para tanto, células T CD3+CD4+CD62L+ naive serão
purificadas por citometria de fluxo (FACSAriaII) e colocadas em co-cultura com DC singenéicas
pré-tratadas ou não com agonista do 2AR e ativadas com LPS. A princípio usaremos como
estímulo anticorpo anti-CD3 para diferenciar as células T CD4+ em Th1 e Th17. Após 5 dias, a
diferenciação dos subtipos de células T CD4+ será avaliada pela produção de citocinas e
fatores de transcrição que as caracterizam: RORgT e IL-17 para Th17; T-bet e IFN-g para Th1.
A quantificação das citocinas será realizada por FACS, usando o kit CBA Th1, Th2 e Th17.
Também utilizando a citometria de fluxo avaliaremos a frequência de células T CD4+ Th1 e
Th17, através das seguintes marcações intracelulares: Th1 (CD4+ IL-17- RORgT- IFN-g + Tbet +) e Th17 (CD4+ IL- 17+ RORgT+ IFN-g - T-bet -).
Experimento 4 – Avaliação das vias de sinalização importantes para a modulação da
produção de citocinas pelas células dendríticas tratadas com o agonista do 2 AR.
Sabe-se que a via canônica da sinalização do receptor 2 adrenérgico, resulta no aumento
intracelular de AMPc, ativação de PKA e fosforilação de CREB. A princípio avaliaremos a
participação de PKA na modulação da produção de citocinas pelas DC tratadas com agonista
do 2AR, utilizando um inibidor específico de PKA. Para tanto, as iDCs serão pré-tratadas ou
não com inibidor específico de PKA e, posteriormente, tratadas com agonista do 2AR e
ativadas com LPS. Após 18h, os sobrenadantes serão coletados e as citocinas serão
quantificadas por FACS como descrito anteriormente. Além disso, avaliaremos a ativação de
PKA pela quantificação da fosforilação de por FACS.
O concurso BD Biosciences Pesquisador SBI visa o reconhecimento e apoio aos
pesquisadores que promovem o constante avanço científico através do incentivo à técnica
de Citometria de Fluxo com Múltipla Marcação no Brasil.
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