UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE

UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ-UNOCHAPECÓ
Área das Ciências da Saúde
Curso de Graduação em Farmácia
Eron Sampaio
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE BACTERIOCINAS POR BACTÉRIAS
ISOLADAS DO INTESTINO DO PEIXE DA ESPECIE DE CARPA (CYPRINUS
CARPIO) COMERCIALIZADOS EM PESQUE-PAGUE DO MUNICÍPIO DE
CHAPECÓ-SC
CHAPECÓ-SC, 2010.
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ERON SAMPAIO
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE BACTERIOCINAS POR BACTÉRIAS
ISOLADAS DO INTESTINO DO PEIXE DA ESPECIE DE CARPA (CYPRINUS
CARPIO) COMERCIALIZADOS EM PESQUE-PAGUE DO MUNICÍPIO DE
CHAPECÓ-SC
Monografia de Conclusão de Curso
apresentado à Universidade Comunitária
da Região de Chapecó - UNOCHAPECÓ
como parte dos requisitos para obtenção
do grau de Bacharel em Farmácia.
Orientadora: Raquel Zeni Ternus
Co-orientador: Mário Lettieri Teixeira
Chapecó-SC, Maio de 2010.
3
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, por me dar sabedoria, entendimento,
paciência para terminar esse trabalho.
Agradeço aos meus pais, Luiz e Claudete, pois sempre me deram o apoio
necessário nessa jornada tão difícil e trabalhosa.
Obrigado a minha orientadora, pela competência, confiança e dedicação ao
ensinar.
Agradeço
também
as
técnicas
do
laboratório
de
Microbiologia
UNOCHAPECÓ/SC, pela dedicação e auxilio em todas as partes que foram
necessárias.
Não posso deixar de agradecer também a todos os professores e pessoas
que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho e também
durante toda a jornada acadêmica.
4
Cada um é forjador do seu próprio sucesso.
Cayo Salústio.
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BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
RAQUEL ZENI TERNUS
Bióloga, Mestre em Ciências Ambientais
Professora Orientadora
_________________________________________
ROSE MARIA DE OLIVEIRA MENDES
Química, Mestre em Engenharia Química
Professora UNOCHAPECÓ
_________________________________________
SCHEILA MARCON
Farmacêutica-Bioquímica, Especialista em Farmácia Clínica e
Farmacoterapia
Professora UNOCHAPECÓ
Chapecó-SC, Maio de 2010.
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RESUMO
Cada ser vivo possui microrganismos em vários setores biológicos do corpo; são
bactérias, parasitas, fungos e vírus que convivem em harmonia e muitos auxiliam
na digestão e absorção dos alimentos (intestino), proteção e digestão (nasofaringe
e boca), limpeza e controle de outros microrganismos (pele e cavidades). Os
peixes possuem em sua flora normal uma grande população de microrganismos, e
convivem em um mutualismo, onde não há infecções ou doenças. Mas esses
diferem de espécie para espécie, e de gênero para gênero e aqueles que são
comuns aos peixes não são comuns aos humanos. Levando em conta essas
bactérias produzidas pelos peixes e o constante avanço da biotecnologia, já se
utilizam bactérias produtoras de bacteriocinas para diversos fins, como
conservante em alimentos e laticínios. As bacteriocinas são caracterizadas pelo
seu alto poder antimicrobiano, e tornando os alimentos como uma vida de
prateleira mais longa, chamando assim a atenção da indústria alimentícia. Este
trabalho teve como objetivo a avaliação da produção de bacteriocinas por bactérias
isoladas do intestino do peixe da espécie de carpa (Cyprinus carpio)
comercializadas em pesque-pague de Chapecó-Sc, avaliando também a atividade
bacteriocinogênica, de colônias isoladas. Foram obtidas cinco amostras de peixes,
todas elas no município de Chapecó/SC. As amostras foram encaminhadas ao
laboratório de Microbiologia de Alimentos da Unochapecó, para a realização dos
experimentos. No presente trabalho verificou-se resistência da Listeria
monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus e Salmonella sp a
substancias antagonistas produzidas pelas bactérias presentes no intestino e nas
brânquias da carpa (Cyprinus carpio) comercializados em pesque-pagues de
Chapecó.
Palavras-chave: bacteriocina, peixes, microbiologia.
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ABSTRACT
Every living being has biological microorganisms in various sectors of the body, are
bacteria, parasites, fungi and viruses that live in harmony and many aid digestion
and absorption of food (gut), protection and digestion (nasopharynx and mouth),
cleaning and control other microorganisms (skin and sinuses). The fish have in their
normal flora a large population of microorganisms, and live in a mutualistic, where
no infections or diseases. But these differ from species to species and genus to
genus and those that are common to fish are not common to humans. Taking into
account these bacteria produced by the fish and the constant advancement of
biotechnology, already use bacteria producing bacteriocins for various purposes, as
a preservative in food and dairy. The bacteriocins are characterized by high
antimicrobial and making food as a longer shelf life, thus drawing the attention of
food industry. This study aimed to evaluate production of bacteriocins by bacteria
isolated from the intestine of fish species of carp (Cyprinus carpio) marketed in
feefishing Chapecó-Sc, also evaluating the bacteriocin activity of isolated colonies.
We obtained five samples of fish, all in Chapecó / SC. The samples were sent to
the laboratory of Food Microbiology Unochapecó for the conduct of experiments. In
the present study was the resistance of Listeria monocytogenes, Klebsiella
pneumoniae, Staphylococcus aureus and Salmonella sp. antagonists to substances
produced by bacteria in the intestine and gills of carp (Cyprinus carpio) sold in fishpay enterprises Chapecó.
Key words: bacteriocin, fish, microbiology.
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LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA: Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
BAL: Bactérias ácido-láticas
BLI: Bactérias Láticas Iniciadoras
BLNI: Bactérias Láticas Não-Iniciadoras
DETEM: Departamento de Técnicas Normativas
DNA: Acido desoxirribonucléico
DINAL: Divisão Nacional de Alimentos
FAO: Food and Agriculture Organization
FDA: Food and Drug Administration
GRAS: Generally Regarded as Safe
INS: Numero de identificação internacional
KDa: Quilodaltons
Kg: Quilogramas
Mg: Miligrama
mL: Mililitro
pH: Logaritmo decimal do inverso da atividade de íons hidrogênio numa solução
rpm: Rotações por minuto
TSA: Agar tríptona de soja
TSB: Caldo
UFC: Unidades formadoras de colônias
µg: Micrograma
µL: Microlitro
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Placa com o meio TSA ilustrando o crescimento de bactérias após a
duplicata das 5 amostras diferentes das vísceras do peixe.....................................24
Figura 2: Placa com o meio TSA ilustrando o crescimento de bactérias após a
triplicatas das 5 amostras diferentes das vísceras do peixe.....................................24
Figura 3: Mostra o esgotamento de 4 amostras que apresentaram um maior
crescimento de bactérias: 1A, 1B, 6E, 7E.................................................................25
Figura 4: Lâmina ilustrando coloração de Gram, com presença de a) cocos Grampositivo nas amostras 1A e 6 e b) com presença de cocos Gram-negativo na
amostra 7..................................................................................................................27
Figura 5: Lâmina ilustrando coloração de Gram, com presença de cocos Grampositivo na amostra 1 B............................................................................................27
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Expõe o crescimento de colônias das bactérias do intestino dos peixes
em placas de petry com meio TSA. (+): 1 a 5 UFC /mL. (++): 6 a 10 UFC/ml.
(+++): 11 a 20 UFC/ml.......................................................................................... 26
11
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO......................................................................................................12
2.OBJETIVOS..........................................................................................................14
2.1 Objetivo geral..................................................................................................14
2.2 Objetivo específico.........................................................................................14
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA............................................................................15
3.1 Peixes................................................................................................................15
3.1.1. Carpa.............................................................................................................15
3.2 Bactérias...........................................................................................................15
3.3 Bacteriocinas ...................................................................................................18
3.3.1 História e definição .........................................................................................18
3.3.2 Mecanismo de ação das bacteriocinas ..........................................................19
3.3.3 Classificação ..................................................................................................19
3.3.4 Imunidade do produtor de bacteriocina...........................................................19
3.3.5 Utilização das bacteriocinas nos alimentos....................................................20
4. MÉTODOS ..........................................................................................................22
4.1 Amostragem ....................................................................................................22
4.2 Local de análises ............................................................................................22
4.3 Isolamento da cultura bacteriana ..................................................................22
4.4 identificação e produção de bacteriocinas...................................................23
4.5 Determinação da atividade bacteriocinogênica ...........................................23
5. RESULTADOS ...................................................................................................24
6. DISCUSSÕES .....................................................................................................29
7. CONCLUSÃO......................................................................................................34
8.REFERÊNCIAS....................................................................................................35
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1.INTRODUÇÃO
Na avaliação da atividade das bacteriocinas, a sua ação farmacológica é
uma das mais importantes funções de estudo. Ela poderá ser utilizada futuramente
como forma ativa contra importantes bactérias patogênicas e deteriorantes de
alimentos, e também contra patógenos diversos.
É importante destacar também que, no entanto, a velocidade de
reprodução e seu maior efeito ativo é um dos fatores que determina a intensidade
de utilização da bactéria. Portanto, à medida que a velocidade de reprodução das
bactérias aumenta, a produção de bactérias consequentemente também irá
aumentar e novas bacteriocinas serão geradas (BRUNO ; MONTVILLE, 1993).
No entanto, esta atividade farmacológica é pouco estudada, e possui uma
relação mínima evidenciada sobre as bacteriocinas na produção de alimentos.
A
detecção
de
bactérias
contendo
plasmídios,
inclusive
bacteriocinogênicos, tornou-se extremamente importante, pois, sendo eles
potenciais veículos ou vetores de genes, a descoberta e posterior isolamento
desses plasmídios em bactérias pouco exploradas geneticamente, poderiam
permitir um estudo mais aprofundado das mesmas por novas tecnologias.
Revisões sobre a importância de plasmídios como vetores em Engenharia
Genética, são encontrados em Azevedo (1985). Além disso, tem-se também
preconizado o uso de bactérias produtoras de bacteriocinas, no controle de
bactérias patogênicas, desde que sua patogenicidade seja atenuada. Finalmente,
com a possibilidade de manipulação genética em microrganismos endofíticos,
genes para produção de bacteriocinas têm possibilidade de serem introduzidos no
mesmo ou nas plantas, conferindo uma proteção contra outros microrganismos
patogênicos (EIJSINK, 2002).
Assim, não só do ponto de vista acadêmico como também aplicado,
linhagens produtoras de bacteriocinas têm recebido especial atenção, e sua
detecção das mesmas vem adquirindo importância cada vez maior. Sabe-se que a
produção e liberação dessas substâncias podem ser influenciadas em diferentes
espécies por fatores como: tipo de meio de cultivo, aeração, ciclo de crescimento e
fatores físicos como luz ultravioleta, entre outros.
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As bacteriocinas também fazem parte da Biotecnologia, que tenta descobrir
um novo conservante ou um novo antibiótico. Tendo em vista que a todo o
momento surgem novos tipos de microorganismos, bactérias e vírus que atingem a
população em geral, percebe-se a necessidade de elaboração de uma pesquisa a
fim de identificar bactérias produtoras de bacteriocinas que são maléficas para a
população em geral. Com a descoberta dessas bactérias será possível isolar as
bacteriocinas que elas produzem e assim produzir novas vacinas, fármacos,
conservantes para a indústria ou melhoramento genético para plantas (HUGAS,
2003).
14
2.OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Identificar bactérias presentes no intestino e brânquias do peixe (Cyprinus
carpio L) comercializados em pesque-pagues no município de Chapecó-SC e as
possíveis bacteriocinas produzidas por essas, que poderão inibir o crescimento de
bactérias patogênicas.
2.2 Objetivos específicos
Identificar a produção de bacteriocinas a partir de bactérias presentes no
intestino e nas brânquias do peixe (Cyprinus carpio L), que sejam capazes de inibir
o crescimento de outras bactérias patogênicas para o homem ou deteriorantes.
15
3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Peixes
3.1.1 Carpa
As carpas encontram-se hoje com uma área de criação amplamente
distribuída por todo o mundo, devido à sua rusticidade, ao seu rápido crescimento,
ao regime alimentar onívoro (detritófago), à propagação natural e fácil adaptação
em tanques e viveiros, além de outras qualidades desejáveis (FAO, 2005).
As carpas são atualmente consideradas como o grupo de peixes mais
cultivados em todo o mundo, representando cerca de 40% da produção. Dentre
elas, destaca-se a carpa húngara (Cyprinus carpio), espécie de acelerado
crescimento e fácil adaptação às condições de cativeiro (POLI , 2004).
Já se cultivam carpas há mais de 3000 anos, na Ásia e no Oriente Médio, e
há cerca de 600 anos na Europa (BARRETO, 2004).
No Brasil, a carpa foi introduzida por volta de 1882, e foi trazida dos
Estados Unidos para o Rio de Janeiro. Chegou a São Paulo por volta de 1904 E no
ano de 1934, implantou-se o sistema de produção de alevinos de carpa e sua
distribuição para interessados, dando início à criação da carpa em água parada no
Brasil (MAKINOUCHI, 2006).
3.2 Bactérias
As bactérias são agentes importantes como indicadores de contaminação
em alimentos e, em particular, em peixes, como um veículo de transmissão desta
contaminação ao homem, causando diversos tipos de doenças.
Considerando o grande número de bactérias existentes, podemos dizer
que são poucas as utilizadas na área de alimentos. Entre essas bactérias
importantes na área alimentar podemos citar: 1 ) Escherichia coli 2) Aeromonas sp
3) Staphylococcus sp
4) Renibacterium salmoninarum 5) Carnobacterium
16
piscicola. Estas são as principais bactérias que são encontradas em amostras de
peixes (FRANCO, 2005).
Os gêneros bacterianos que são importantes na área de alimentos também
podem ser separados em sete grupos: 1- bactérias Gram-negativas, aeróbias e
microaerobias; 2- bactérias Gram-negativas aeróbias estritas; 3- bactérias Gramnegativas anaeróbias facultativas; 4- cocos Gram-positivos; 5-bacilos Grampositivos produtores de esporos; 6- bacilos Gram-positivos não esporulados; 7outros (JACK et al., 1995).
Escherichia: cuja principal espécie é a E.coli e esta inserida no grupo dos
coliformes fecais, que indicam uma contaminação fecal nos alimentos. A E.coli
pode causar reações indesejáveis nos alimentos e em conseqüência disso uma
serie de doenças patogênicas ao homem (FRANCO, 2005).
A E.coli atravessa a barreira gástrica e vai aderir as mucosas do intestino
delgado e também do grosso, causando alterações que levam a diarréia. Esse
processo se da em duas fases, a primeira ocorre apenas na superfície e a segunda
nas camadas intimas do intestino (TRABULSI, 2004).
Por não ajudarem no tratamento a administração de antibióticos não é
indicada, pois não minimiza a duração e tão pouco os efeitos da diarréia. O
tratamento mais indicado nesses casos é a hidratação o mais rápido possível que
vai ajudar a reduzir o número de mortos (TRABULSI, 2004).
Aeromonas são bacilos móveis e oxidase e catalase positivos, possuem
características bioquímicas semelhantes às enterobactérias. São facilmente
encontradas em ambientes aquáticos, sendo facilmente identificadas em intestinos
de peixes, também são encontradas em muitos alimentos, principalmente em
produtos frescos refrigerados (FRANCO, 2005).
Para Popoff (1984), as Aeromas são classificadas como bacilo Gram
negativo de anaerobiose facultativa. E para a piscicultura a espécie de maior
importância é a Aeromas hidrophila.
São freqüentemente isoladas de répteis, anfíbios, peixes e de alguns
pássaros. As espécies Aeromonas hydrophila e Aeromonas salmonicida são
agentes patológicos importantes para peixes. Apresentam boa habilidade de
crescer e reproduzir exotoxinas em temperaturas baixas, o consumo de água e
alimentos contaminados são a forma mais comum de adquirir uma gastroenterite.
As manifestações clínicas mais comuns são diarréias aguda aquosa autolimitada e
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de curta duração, podendo ser acompanhada de vômitos, febre e dor epigástrica
em indivíduos saudáveis ou septicemia em indivíduos com sistemas imunes
prejudicados (TRABULSI, 2004).
A contaminação por A.hydrophila apresenta características semelhantes a
da cólera, com diarréia aquosa e febre. Às vezes podem ocorrem casos severos de
gastrenterites, outras infecções como septicemia, meningite e infecções em feridas
e tratos respiratórios e urinários também podem ser causadas por Aeromas sp.
(FRANCO, 2005).
As bactérias do gênero Staphylococcus são Gram-positivas e quando são
visualizadas no microscópio apresentam a forma de cachos de uva, apresentam
melhor grau de crescimento em condições aeróbias. A espécie Staphylococcus
aureus é a mais importante e esta associada a doenças estafilocócicas que provem
de alimentos ou não (FRANCO, 2005).
O quadro clínico das infecções causadas por Staphylococcus aureus pode
ser dividido em quatro partes principais: infecções superficiais que são erupções
cutâneas e as feridas; infecções sistêmicas como miosite, endocardite, pneumonia
e septicemia; quadros tóxicos como choque tóxico e síndrome de pele escaldada e
por ultimo a infecção alimentar propriamente dita (KAISER et al., 1996).
A penicilina, meticilina, vancomicina e mupirocina são alguns antibióticos
utilizados para o tratamento e controle do S.aureus, mas para prevenir a
intoxicação é importante manter os alimentos suscetíveis sob refrigeração
adequada. O resfriamento rápido dos alimentos é uma boa forma de evitar a
contaminação (CLEVELAND et al., 2001).
Carnobacterium era conhecida anteriormente como Lactobacillus, no
entanto não pode utilizar citrato e não produz acido oléico. Pode ser encontrado em
carnes diversas e seus derivados que são embalados a vácuo, destacam-se peixes
e aves (CLEVELAND et al., 2001).
São bacilos Gram-positivos, catalase negativa, apresentam quatro
espécies reconhecidas: C. divergens, C. piscicola, C. gallinarum e C. mobile. A
maioria das espécies cresce a 0°C e não há crescimento em 45°C, são
heterofermentadoras e produzem gás a partir de glicose. Não são capazes de
crescer e se reproduzirem em meio com acetato (BISWAS et al., 1991).
Renibacterium salmoninarum é um pequeno bacilo gram positivo
difteróide, que afeta os salmonideos de natureza e os cultivados em cativeiros,
18
esse pequeno bacilo pode causar Corinebacteriose, que é uma enfermidade
bacteriana renal, quando ingerido (MEYER e COLLAR, 1994).
Essa bactéria deixa os peixes com uma coloração escura, e presença de
pequenas vesículas, localizadas em cima da espinha dorsal e que contem um
material cremoso e com coloração avermelhada, com restos de tecido e grande
numero de bactérias coriniformes encontradas (MEYER e COLLAR, 1994).
3.3 Bacteriocinas
3.3.1 História e definição
As bacteriocinas foram descobertas por volta de 1925, na Bélgica, quando
o pesquisador Gratia percebeu que o filtrado de uma amostra de Escherichia coli
inibia o crescimento de uma outra amostra da mesma espécie, demonstrando
assim, a sua letalidade, sendo denominada de colicina. Porém o termo bacteriocina
só foi proposto anos mais tarde por Jacob et al. (1953), para descrever a atividade
inibitória exibida por certas bactérias por espécies afins (BARRETO, 2004).
Bacteriocinas são proteínas produzidas por bactérias que possuem
elementos chamados plasmídios bacteriogenicos. Essas proteínas atacam
somente bactérias que sejam da mesma espécie ou espécies semelhantes, sendo
considerada então um antibiótico de espectro muito reduzido (DAY, 1990).
As bacteriocinas podem ser peptídeos ou proteínas que são sintetizadas
no ribossomo e transportadas para o exterior da célula, elas apresentam ação
bactericida e também bacteriostática sobre as bactérias Gram-positivas, como
Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Bacillus cereus e Staphylococcus
aureus. São patógenos importantes e que frequentemente são encontrados em
produtos alimentares (HERNÁNDEZ et al., 2003).
Alguns tipos de bacteriocinas são proteínas simples, outras apresentam
lipídios e açúcares em sua composição. São classificadas como lantibióticos e nãolantibióticos, de acordo com suas estruturas. As primeiras contêm deidroalanina,
deidrobutirina e anéis de lantionina como aminoácidos em comum em sua
19
composição. As não-lantibióticas apresentam apenas antibióticos não modificados
(FRANCO, 2005).
3.3.2 Mecanismo de ação das bacteriocinas
Os seus mecanismos de ação ainda não são bem compreendidos, mas
sabe-se que a porção protéica é essencial para o seu efeito. A produção de
bacteriocinas depende dos plasmídios, assim também a resistência a bacteriocinas
também é plasmidial. A nisina que é uma bacteriocina, é a única autorizada pelo
United States Food and Drug Administration a ser utilizada em alimentos, é
produzida pelo Lactobacillus lactis spp. (BRUNO ; MONTVILLE, 1993).
3.3.3 Classificação
Para Klaenhammer (1993), as bacteriocinas estão distribuídas em 4
classes. Em geral, a classe I, ou lantibióticos, é representada pela nisina, e
constituída por peptídeos termoestáveis de baixo peso molecular (<5 kDa),
diferenciados dos demais pela presença de lantionina e derivados; a classe II é
composta por pequenos peptídeos (<10 kDa) termoestáveis divididos em três
subclasses: IIa (pediocina e enterocina), IIb (lactocina G) e IIc (lactocina B); a
classe III é representada por peptídeos termolábeis de alto peso molecular (>30
kDa) como helveticina J; já na classe IV encontram-se os grandes complexos
peptídicos contendo carboidrato ou lipídio em sua estrutura.
3.3.4 Imunidade do produtor de bacteriocina
Cada bacteriocina apresenta em sua composição uma proteína que lhe
confere imunidade e a mesma é expressa simultaneamente com a bacteriocina.
Essas proteínas da imunidade possuem em media de 51 a 150 aminoácidos e, por
incrível que pareça não apresentam uma homologia significativa entre si, enquanto
as bacteriocinas apresentam de 38 a 55 % de similaridade. Essas proteínas vão se
20
ligar às proteínas de membrana da bactéria, impedindo assim a ação da sua
própria bacteriocina (QUADRI et al., 1995).
3.3.5 Utilização das bacteriocinas nos alimentos
Para a utilização de bacteriocinas no biocontrole de alimentos e
consequentemente sua utilização na industria, segue-se dois caminhos: 1- uso de
Bacterias produtoras de bacteriocinas. 2- a adição direta de preparações de
bacteriocinas, sintética ou purificada de um sobrenadante
de cultura da cepa
produtora. A produção em grande quantidade da bacteriocina pode acarretar o
aumento da competitividade da cepa produtora na matriz do alimento e contribuir
para a prevenção da degradação do alimento. Vale salientar que na microbiota
endógena, a fórmula e a tecnologia empregada podem influenciar diretamente no
desempenho da cultura produtora (CASAUS, 1997).
Com o constante avanço na tecnologia envolvendo o DNA recombinante, a
identificação de bactérias que contêm plasmídios, inclusive bacteriogenicos, tem se
tornado extremamente importante, pois eles são potencias veículos e vetores de
genes, por isso a sua descoberta e conseqüente identificação dos plasmídios em
bactérias permitem um estudo aprofundado de seus benefícios (AZEVEDO, 1985).
Uma das principais funções de se aplicar bacteriocinas em produtos
alimentícios e derivados de carnes é para inibir patógenos como a Listeria
monocytogenes e Clostridium botulinum. Os gêneros Lactobacillus, Pediococcus e
Leuconostoc, são bons produtores de bacteriocinas. O Clostridium botulinum pode
ser inibido por bactérias do gênero L. plantarum, L. acidophilus e P. pentosaceus
(CRANDALL; MONTVILLE, 1993).
As Bactérias que produzem ácido lático e as respectivas bacteriocinas
produzidas por elas têm sido aplicadas com sucesso como antimicrobianos em
carnes. Essas bacteriocinas ou espécies produtoras de bacteriocinas podem ser
usadas como conservantes naturais em alimentos industrializados a fim de
melhorar a segurança. Outros produtos como derivados do leite e da carne
também poderão ser beneficiados pela produção de bacteriocinas, enquanto que
os antibióticos não são permitidos em alimentos (VIGNOLLO, 1993).
21
Nitratos e nitritos têm sido amplamente utilizados em produtos derivados
de carnes com a finalidade de manter o aspecto avermelhado e inibir o
desenvolvimento do Clostridium botulinum. Mas conseqüentemente seu uso pode
levar a formação de nitrosaminas que são substâncias carcinogênicas. É em razão
disso que entram em cena as bactérias ácido láticas que vão atuar na redução
dessas substâncias ate nitrogênio alimentar e diminuindo assim o risco de
desenvolver câncer nos consumidores de produtos cárneos (GELLI, 2002)
22
4. MÉTODOS
A metodologia foi modificada de acordo com Teixeira (2007).
4.1 Amostragem
Foram obtidas cinco amostras diferentes de peixe e duas amostras de
cada peixe, de diferentes pesque-pagues da cidade, totalizando dez amostras de
peixes de pesque-pagues comercializados no município de Chapecó – SC. O
estudo foi realizado em triplicata.
4.2 Local de análises
Os experimentos deste trabalho foram desenvolvidos no laboratório de
Microbiologia de Alimentos da Universidade Comunitária da Região de Chapecó –
UNOCHAPECÓ.
4.3 Isolamento da cultura bacteriana
Uma fração das víceras e brânquias de cada peixe (25g) foi cortada com
faca e colocada em um saco plástico estéril que previamente continha água estéril,
então foi lacrado e deixado repousar por 24 horas. 100 µl desta solução foi
semeada com alça de Drigalski em placas de ágar TSA (Agar Triptona de Soja) e
incupadas a temperatura de 37° C por 72 horas.
23
4.4 Identificação e produção de bacteriocinas
As diversas colônias crescentes no meio TSA foram submetidas à
coloração de Gram. Após as colônias foram isoladas através de duplicatas,
triplicatas e diluições em meio TSA a 37 ° C por 72 horas.
4.5 Determinação da atividade bacteriocinogênica
As colônias crescentes no meio TSA foram isoladas e inoculadas em
placas com meio TSA previamente contendo Listeria monocytogenes, Klebsiella
pneumoniae, Staphylococcus aureus e Salmonella sp, na sequencia foram
incubadas por 37 °C por 48 horas.
Tanto as amostras, quanto as bactérias inoculas em TSA foram diluídas
em água contendo 107 UFC/mL ( correspondente a 0,5 na escala McFarland), após
a colocação das amostras nas bactérias inoculadas em TSA incubou-se por 48
horas, isso para as 5 amostras. Sendo cada inoculado identificado com numeração
no fundo da placa para ter o controle de quais amostras formaria halo de inibição.
Após esse período de incubação foi avaliada a presença ou ausência de
halo de inibição não bactérias testadas.
24
5. RESULTADOS
As Figuras 1 e 2 mostram o grande crescimento de bactérias das vísceras
do peixe, com nenhuma colônia isolada. Sendo que todas as placas apresentaram
crescimento, sendo identificadas pelo método de coloração de Gram.
Figura 1: Placa com o meio TSA ilustrando o crescimento de bactérias
após a duplicata das 5 amostras diferentes das vísceras do peixe.
Figura 2: Placa com o meio TSA ilustrando o crescimento de bactérias
após a triplicatas das 5 amostras diferentes das vísceras do peixe.
25
Mesmo após a triplicata ainda era grande o número de bactérias em todas
as placas de TSA, então foi feito esgotamento de algumas colônias de bactérias
para conseguir deixar elas isoladas (Figura 3).
Figura 3: Mostra o esgotamento de 4 amostras que apresentaram um
maior crescimento de bactérias: 1A, 1B, 6E, 7E.
Após esgotamento foi possível isolar pequenas colônias das bactérias, em
seguida foi feita diluição seriada das bactérias para podermos testar a inibição das
bacteriocinas frente a outras bactérias.
Na Tabela 1 pode-se observar um grande crescimento, verificado nas cinco
amostras analisadas.
26
Tabela 1: Crescimento de colônias das bactérias do intestino dos peixes em placas de petry com
meio TSA. (+): 1 a 5 UFC /mL. (++): 6 a 10 UFC/mL. (+++): 11 a 20 UFC/mL
Crescimento de colônias em meio TSA
1 A +++
2 A +++
3 A +++
4 A +++
5 A +++
Diante do apresentado é notável a presença de crescimento de vários
microrganismos em meio TSA de todas as amostras de vísceras de peixes.
Todas as amostras apresentaram uma grande variedade de colônias
grandes, amarelo fraco e amarelo forte que cobriram todas as placas com meio
TSA.
A atividade antimicrobiana das colônias que foram isoladas através de
triplicatas, esgotamento e foram testadas contra Listeria monocytogenes, Klebsiella
pneumoniae, Staphylococcus aureus e Salmonella sp, não havendo formação de
halos de inibição de nenhuma colônia isolada das amostras.
As bactérias das vísceras da amostra número 1, apresentaram colônias
amarelas e brancas nas placas de TSA, após a coloração pelo método de Gram
percebe-se que uma das amostras (1 B) continha bactéria (Figura 4) e fungo
(Figura 5).
27
a)
b)
Figura 4: Lâmina ilustrando coloração de Gram, com presença de a) cocos Gram-positivo nas
amostras 1A e 6 e b) com presença de cocos Gram-negativo na amostra 7
Figura 5: Lâmina ilustrando a presença de um
fungo na amostra 1 B.
A inibição seria desejável para a não sobrevivência dos microorganismos em
ambientes que apresentam microbiota diversificada e complexa. O presente
trabalho também não avaliou a natureza das possíveis substâncias antagonistas
produzidas pelas culturas produtoras.
28
6. DISCUSSÕES
A
indústria
alimentícia
vem
buscando
alternativas
de
agentes
antimicrobianos natural para conservar os alimentos. A biopreservação é uma
técnica utilizada para aumentar a vida útil e a segurança dos alimentos por meio do
emprego de microbiota protetora e/ou seus peptídeos antimicrobianos, as
bacteriocinas. Estes compostos são sintetizados no ribossomo e apresentam
espectro de ação dependente da espécie alvo. Na última década, uma grande
variedade de bacteriocinas foi identificada e caracterizada, o que promove uma
constante variação na classificação destas. A bacteriocina mais conhecida é a
Nisina, que foi aprovada para ser utilizada na conservação dos alimentos a mais de
50 anos, em vários países. As bacteriocinas da classe II mais estudadas são as
pediocinas e as enterocinas, principalmente devido à sua ação anti-Listeria.
A ação das bacteriocinas produzidas pelas bactérias lácticas de diferentes
espécies não é uniforme e vai depender de vários fatores, entre eles: condições
físicas em que se encontram os alimentos e sua composição química. Esta
atividade fica reduzida devido a ação do pH, atividade das proteases e outras
enzimas degradadoras, entre outros fatores (SCHILLINGER et al., 1996). Em
virtude disso seu campo de ação fica reduzido, e somente algumas bacteriocinas
conseguem inibir vários grupos de microorganismos (MARIGONI, KUROZAWA,
2002).
As placas cultivadas com bactérias em meio TSA permitiram a observação
de uma microbiota com diferentes tipos de colônias. Estas apresentaram coloração
amarela, esbranquiçadas e cremosas. No método de Gram foram tanto positivo
quanto negativo.
As culturas que produziram substâncias antagonistas não inibiram a
Listeria
monocytogenes,
klebsiella
pneumoniae,
staphylococcus
aureus
e
Salmonella sp, as quais são as culturas indicadoras no presente trabalho.
L. monocytogenes é um Gram-positivo mótil, que causa infecções em
humanos por serovars I/2a, I/2b e 4b. A dose infectiva é desconhecida, mas,
acredita-se, variar conforme a cepa e a susceptibilidade da vítima. Em casos
contraídos através de leite pasteurizados ou crus afirma-se que em pessoas
suscetíveis, menos de 1.000 organismos podem causar a doença (MITEVA et al.,
1998).
29
O principal habitat do organismo é o solo, lodo, forragem e água. Alguns
estudos mostram que 1-10% de humanos podem carregar no intestino a L.
monocytogenes. Foram encontradas em pelo menos 37 espécies de mamíferos
(domésticos e selvagens), 17 espécies de pássaros e em algumas espécies de
peixes e frutos do mar. É resistente a baixas temperaturas, secagem e calor, ainda
que seja uma bactéria não formadora de esporos. Infecções em raposa produzem
uma encefalite simulando a raiva. Queijos em processo de maturação podem
constituir meio para o crescimento de Listeria e é freqüentemente a causa de
surtos (GERMANO;GERMANO, 2003).
Para evitar sua entrada e contaminação em alimentos deve-se fazer um
controle rigoroso na aquisição das matérias primas para que as mesmas não
venham a se contaminar com esse microrganismo.
A Klebsiella pneumoniae é um bacilo Gram-negativo da família
Enterobacteriaceae, podendo ser encontrada em trato respiratório alto e trato
gastro-intestinal e urinário, causando pneumonia lobar e infecção urinária e
septicemia.
O Staphylococcus aureus é um importante patógeno em virtude a sua
virulência, resistência aos antimicrobianos e associação a várias doenças,
incluindo enfermidades sistêmicas potencialmente fatais, infecções cutâneas,
infecções oportunistas e intoxicação alimentar. Esta bactéria habita com frequência
a nasofaringe do ser humano, a partir da qual pode facilmente contaminar as mãos
do
homem
e
penetrar
no
alimento,
causando
a
intoxicação
alimentar
estafilocócicas. Em vários paises, o Staphylococcus aureus é considerado o
segundo ou terceiro mais comum patógeno causador de intoxicação alimentar,
perdendo em número apenas para Salmonella sp, e competindo com o Clostridium
perfringens (BEAN et al., 1996). Após a contaminação dos estafilococos no
alimento, em temperatura ambiente ou mais elevada, ocorrera a liberação das
enterotoxinas que causam a intoxicação. Os sorotipos A e D são os mais
comumente associados com a intoxicação alimentar. Estas enterotoxinas são
resistentes às enzimas proteolíticas do trato intestinal humano e são proteínas
termoestáveis (BALABAN; RASOOLY, 2000).
A salmonela é uma bactéria comum no trato intestinal, que se mantém no
ambiente passando de um animal para outro. Essa bactéria é mais comumente
encontrada em aves poedeiras. Animais contaminados tornam-se propagadores da
30
bactéria. Ela é eliminada junto com as fezes, que contaminam o solo e a água por
onde passam, afetando outros animais (GERMANO;GERMANO, 2003).
As Salmonelas são bactérias Gram-negativas e constituem um gênero
extremamente heterogêneo, composto por duas espécies, Salmonella bongori e S.
enterica, essa última possuindo quase 2000 sorotipos. Dentre os de maior
importância para a saúde humana destacam-se Salmonella enterica sorotipo Typhi
(S. typhi), que causa infecções sistêmicas e febre tifóide – doença endêmica em
muitos países em desenvolvimento – e Salmonella enterica sorotipo Typhimurium
(S. typhimurium), um dos agentes causadores das gastroenterites (FRANCO,
2005).
As bactérias que apresentam resistência as bacteriocinas podem estar
relacionadas a uma série de fatores como: mudanças ocorridas na membrana e na
parede celular, alterações do potencial elétrico, da fluidez, da composição lipídica
da membrana e alterações de carga ou espessura da parede celular, ou ainda pela
combinação de todos esses fatores (MONTOVANI e RUSSELL, 2001). Essas
mudanças podem surgir logo após uma exposição da célula a baixas
concentrações de bacteriocinas ou como parte de uma resposta adaptativa a
algum outro estresse (VAN SCHAIK, GAHAN e HILL, 1999).
A resistência que as bactérias tanto Gram-positivas quanto Gramnegativas, têm a sua bacteriocina ainda não é bem compreendida, mas esse
mecanismo de resistência mostra-se diferente do mecanismo da imunidade
apresentado pelas linhagens produtoras e sua própria bacteriocina. Supõe-se que
a perda de receptores celulares confere uma resistência a bacteriocina por parte da
bactéria (TAGG et al., 1995).
A
eficiência
inibitória
das
bacteriocinas
depende
dos
níveis
de
contaminação do alimento por parte do microrganismo-alvo. Se a contaminação
inicial for de grande concentração, a atividade da bacteriocina será ineficiente, não
impedindo o desenvolvimento de microorganismo. Alem das interações com
componentes dos alimentos, as bacteriocinas podem ser adversamente afetadas
pelas condições de processamento e estocagem, como pH e temperatura do
produto (RILLA et al, 2004).
O desenvolvimento de bacteriocinas em laboratório, depende de vários
fatores que influenciam diretamente a sua produção como: linhagens bacterianas,
31
composição do meio de cultura utilizado, e as condições de incubação como: pH,
temperatura e agitação. Em geral, a produção de bacteriocina é boa na
temperatura ótima para o crescimento e desenvolvimento da linhagem produtora.
Pois seu crescimento em altas temperaturas pode dificultar sua produção ou alterar
sua ação antagonista. Consequentemente, para cada bacteriocina deve ser
desenvolvido um protocolo especificado, ideal para o isolamento e purificação da
mesma. A produção de bacteriocinas pode ser realizada tanto em meio sólido,
como em liquido e semi-sólido, através da inibição do microrganismo sensível
(MATARAGAS, et al., 2003).
Os métodos mais utilizados são antagonismo direto ou sobrecamada,
difusão em poços ou em discos de papel e pelo método de estrias cruzadas. No
antagonismo direto, a linhagem produtora de bacteriocina é inoculada em meio de
cultura sólida, incubada e em seguida colocada uma sobrecamada semi-sólida préincubada com a linhagem indicadora. No método de difusão, o sobrenadante da
linhagem produtora é adicionado nos discos de papel ou nos poços perfurados no
meio de cultura sólida, previamente semeada com o microrganismo indicador. Já
no método de estrias cruzadas a linhagem produtora é inoculada com alça no meio
de cultura sólido e após crescimento o microrganismo indicador é inoculado
também por estria, perpendicularmente a linhagem produtora de bacteriocina
(HOOVER; HARLANDER, 1993).
A produção de algumas bacteriocinas também pode ser feita por
tratamentos físicos ou químicos como a irradiação ultravioleta ou com micotoxica
C. A atividade biológica das bacteriocinas é determinada por um componente
protéico, sendo assim, a determinação de sua natureza protéica é realizada
através de testes de sensibilidade com enzimas proteolíticas (ALLISON;
KLAENHAMMER, 1994).
32
7. CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho apresentam bactérias resistentes à
ação de substâncias antagonistas. Em todos os ensaios realizados, não foi obtido
inibição da Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus
e Salmonella sp, por substâncias antagonistas que foram produzidas por bactérias
que estavam presentes nas 10 amostras de peixes.
Em virtude disso, é necessário realizar estudos mais aprofundados onde se
possa ver a potencialidade dessas substâncias antagonistas contra essas e outras
bactérias, garantindo assim o seu poder inibitório frente às patologias. Sendo que
pesquisas recentes vêm buscando identificar as possíveis alterações nas
condições do meio de atuação das bacteriocinas, ampliando assim seu espectro de
ação e sua futura utilização.
Como não houve em momento nenhuma formação de halos de inibição
contra as bactérias testadas, não se fez necessário à identificação das diversas
bactérias crescentes das vísceras do peixe em meio TSA.
33
8.REFERÊNCIAS
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