PCR-RFLP de sequências do DNA de cloroplasto como ferramenta

55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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PCR-RFLP de sequências do DNA de cloroplasto como
ferramenta na identificação genética de espécies de
Piperaceae
Vilela, FC1; Dias, DC1; Nakamura, SS2; Santos, RL2; Linde, GA3; Colauto, NB3; Valle, JS3
Acadêmica de Farmácia – PIBIC – Universidade Paranaense – UNIPAR; 2Acadêmico de Farmácia – PIC – UNIPAR; 3Laboratório de
Biologia Molecular – UNIPAR.
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Palavras-chave: Piper, PCR-RFLP, caracterização genética, DNA de cloroplasto.
O gênero Piper é o maior da família Piperaceae e inclui mais de mil espécies diferentes, sendo aproximadamente
270 de ocorrência no Brasil. Espécies de Piper apresentam grande importância econômica e ecológica, além de
potencial medicinal. A combinação de características vegetativas e reprodutivas torna o reconhecimento desse
gênero relativamente simples, contudo, a uniformidade de suas flores e de outras características morfológicas
representa um grande desafio para a classificação de espécies. Seqüências curtas e padronizadas de DNA podem
ser empregadas como ferramenta auxiliar na identificação de espécies. Tal uso representa uma alternativa rápida e
de baixo custo que contribui com estudos ecológicos e conservacionistas. Para a efetividade da técnica é necessário
que as seqüências apresentem variação interespecífica, porém, baixo nível de variação intra-específica. Seqüências
de DNA de cloroplasto (cpDNA) podem ser empregadas na discriminação de espécies e o gene maturase K (matK) e
o espaçador intergênico trnH-psbA têm sido empregados com sucesso em estimativas de biodiversidade. A análise
dessas sequências poderia auxiliar na identificação de espécies de Piper. Nesse trabalho avaliamos o potencial
da análise por PCR-RFLP de matK e trnH-psbA do cpDNA na caracterização genética de espécies de Piper do
Horto Medicinal do Campus II da Universidade Paranaense - UNIPAR. Amostras de quatro espécies de Piper e uma
espécie de Pothomorphe foram coletadas no Horto Medicinal da UNIPAR. Após a extração do DNA amplificouse matK e trnH-psbA (25ng de DNA; 0,2uM de cada primer; 1,5U de Taq DNA polimerase; tampão (1x); 100μM de
dNTPs e 1,5mM MgCl2) empregando-se primers universais. Os produtos da amplificação de matK foram digeridos
com cinco endonucleases de restrição (HaeIII, HindIII, HinfI, HhaI e PstI) e o de trnH-psbA com seis (EcoRI, HaeIII,
HindIII, HinfI, PstI e RsaI). Os primers utilizados na amplificação de trnH-psbA geraram um único fragmento de 350
pb para todas as amostras analisadas enquanto a amplificação de matK gerou um fragmento de 850 pb. Nenhuma
das endonucleases testadas reconheceu sítios de restrição na sequência trnH-psbA e somente HinfI foi capaz de
cortar a sequência gênica matK, gerando um único padrão de restrição. A metodologia e os primeirs universais
empregados na amplificação das seqüências do cpDNA de Piper mostraram-se adequados. São necessárias
análises com outras endonucleases na tentativa de produzir marcadores que revelem polimorfismos de seqüência,
permitindo a identificação consistente das espécies analisadas. Entretanto, esses resultados preliminares indicam
que a técnica de PCR-RFLP empregada às sequências aqui analisadas não tem sensibilidade suficiente para
distinguir as diferentes espécies de Piper ou gêneros de Piperaceae. A alternativa seria realizar o sequênciamento
desses amplicons, o que poderia revelar diferenças diagnósticas capazes de auxiliar na distinção de espécies de
Piperaceae.
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