Detecção de genes de resistência de Acinetobacter

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
PARASITÁRIA
Fernanda Lays Souza Góes Santos
Detecção de genes de resistência de Acinetobacter
baumannii e Pseudomonas aeruginosa
multirresistentes e caracterização clínica dos pacientes
em hospital público de Sergipe
São Cristóvão – SE
2015
i
Fernanda Lays Souza Góes Santos
Detecção de genes de resistência de Acinetobacter
baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes
e caracterização clínica dos pacientes
em hospital público de Sergipe
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Biologia
Parasitária
da
Universidade Federal de Sergipe como requisito
para obtenção do título de Mestre, sob a
orientação da professora Dr.ª Tânia Maria de
Andrade Rodrigues e Co-orientação da Dr.ª Iza
Maria Fraga Lobo
São Cristóvão – SE
2015
ii
TERMO DE APROVAÇÃO
Fernanda Lays Souza Góes Santos
Detecção de genes de resistência de Acinetobacter
baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes
e caracterização clínica dos pacientes
em hospital público de Sergipe
Dissertação de mestrado defendida e aprovada em 30/09/2015, pela banca
examinadora:
_________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Tânia Maria de Andrade Rodrigues (Presidente)
Universidade Federal de Sergipe
________________________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Ângela Maria da Silva
Universidade Federal de Sergipe
_________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Maria Regina Pires Carneiro
Universidade Federal de Sergipe
iii
RESUMO
Detecção de genes de resistência de Acinetobacter baumannii e
Pseudomonas aeruginosa multirresistentes e caracterização clínica dos
pacientes em hospital público de Sergipe
As infecções causadas por Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa
multirresistentes são responsáveis pela alta morbidade e mortalidade, falência da terapia
medicamentosa, aumento do período de internação e consequentemente impacto financeiro
no sistema de saúde. Todavia, embora a ocorrência destas bactérias se configure um
problema de saúde pública, inúmeros estudos revelam que é escasso o conhecimento acerca
dos genes de resistência presentes nas bactérias multirresistentes. Essa realidade associada
ao impacto negativo destas na sociedade, justifica a importância de detectar os genes de
resistência de A. baumannii e P. aeruginosa multirresistentes e caracterizar clinicamente os
pacientes de um hospital público de Sergipe. Trata-se de um estudo analítico de coorte
prospectiva e abordagem quantitativa. A coleta dos dados clínicos dos pacientes foi realizada
através de um formulário especificamente elaborado. As cepas de A. baumannii foram
submetidas à técnica PCR para identificação dos genes de resistência (blaIMP, blaVIM, blaSIM,
bla OXA-51, blaOXA-58, blaOXA-23 e blaOXA-24) e em P. aeruginosa os genes blaSPM, blaVIM, blaIMP,
blaKPC. Foram realizadas análises descritivas, os testes de Qui-Quadrado e Exato de Fisher,
com nível de significância de 5%. O software utilizado foi o R versão 3.1.2. A amostra foi
constituída de 119 pacientes. Dos 43 pacientes com isolados de P.aeruginosa, 33 eram do
sexo masculino (76,7%), com idade média de 46,2 anos. Vinte e oito estavam internados na
UTI (65,1%) e 13 (30,2%) com diagnóstico de trauma crânio encefálico (TCE). Dos 76
pacientes com isolados de A. baumannii, 59 (77,6%) era do sexo masculino, média de idade
de 44,4 anos. Cinquenta pacientes (65,8%) eram procedentes da UTI e 18 (23,7%) com
diagnóstico de TCE. A mediana de dias de internamento foi estatisticamente significante
entre as bactérias. Dentre os sítios de isolamento, destaca-se a urina para P. aeruginosa, com
16 amostras (37,2%) e o aspirado traqueal para A. baumannii com 32 (42,1%) cepas. A sonda
vesical foi o dispositivo mais usado nos pacientes com isolados de A. baumannii (93,4% 71) e o cateter venoso central nos pacientes com P. aeruginosa (93% - 40). Todos os
pacientes com isolados de P.aeruginosa fizeram uso dos carbapenêmicos e 98,6% (75) dos
A. baumannii. Foi encontrado diferença estatisticamente significante entre as bactérias
quanto ao uso dos aminoglicosídeos, cefalosporinas de 3ª geração e tigeciclina. Em P.
aeruginosa houve diferença significativa no uso da oxacilina e cefalosporinas de 1ª e 3ª
gerações e polimixina nos diversos setores do hospital. Todos as amostras de A. baumannii
e P. aeruginosa apresentaram sensibilidade à colistina, com variação da MIC entre < = 0,5
e 2. A maioria (55,8% - 24) dos pacientes com P. aeruginosa e A. baumannii (52,6% - 40)
foram a óbito. Dentre as 76 cepas de A. baumannii, 56 (73,6%) apresentaram
concomitantemente os dois genes blaOXA-51 e blaOXA-23. Dentre as 43 cepas de P. aeruginosa,
28 (65,1%) apresentaram o gene blaSPM. Concluiu-se que o A.baumannii foi mais frequente
do que a P.aeruginosa. Houve predomínio significante da Pseudomonas na urina e do
Acinetobacter na secreção traqueal. Os carbapenêmicos foi amplamente utilizado ao longo
da internação dos pacientes com isolados de Acinetobacter e Pseudomonas nos diversos
setores do hospital. A maioria das cepas de Pseudomonas apresentaram gene de resistência
blaSPM e Acinetobacter os genes blaOXA-23 e blaOXA-51 concomitantemente. A mortalidade dos
pacientes com Acinetobacter e Pseudomonas foi superior a 50%.
Palavras-chaves: Acinetobacter baumannii; Pseudomonas aeruginosa; multirresistência;
metalo-β-lactamase.
Tânia Maria de Andrade Rodrigues- Orientadora do PROBP- Universidade Federal de Sergipe.
iv
ABSTRACT
Detection of Acinetobacter baumannii resistance genes and multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa and clinical characterization of patients
in public hospital in Sergipe
Infections caused by Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa multiresistant
are responsible for high morbidity and mortality, failure of drug therapy, increased hospital
stay and consequently the financial impact on the health system. However, while the
occurrence of these bacteria to configure a public health problem, numerous studies reveal
that it is scarce information about the resistance genes present in multi-drug resistant
bacteria. This reality associated with the negative impact of these on society, justifies the
importance of detecting the resistance genes of A. baumannii and P. aeruginosa
multiresistant and clinically characterize patients from a public hospital in Sergipe. It is an
analytical prospective cohort study and a quantitative approach. The collection of clinical
data of patients was carried out through a specifically designed form. Strains of A. baumannii
were subjected to PCR for identification of resistance genes (blaIMP, blaVIM, blaSIM, bla
OXA-51, blaOXA-58, blaOXA-23 and blaOXA-24) and P. aeruginosa the blaSPM genes,
blaVIM, blaIMP, blaKPC. Descriptive analyzes were performed, the Chi-square and Fisher
exact tests, with 5% significance level. The software used was R version 3.1.2. The sample
consisted of 119 patients. Of the 43 patients with P. aeruginosa isolates, 33 were male
(76.7%) with mean age of 46.2 years. Twenty-eight were admitted to the ICU (65.1%) and
13 (30.2%) diagnosed with head trauma (TBI). Of the 76 patients with isolates of A.
baumannii, 59 (77.6%) were male, mean age of 44.4 years. Fifty patients (65.8%) were from
the ICU and 18 (23.7%) diagnosed with TBI. The median number of days of hospitalization
was statistically significant between bacteria. Among the isolation sites, there is urine to P.
aeruginosa, with 16 samples (37.2%) and tracheal aspirate for A. baumannii with 32 (42.1%)
strains. A urinary catheter was the most used device in patients with isolates of A. baumannii
(93.4% - 71) and the central venous catheter in patients with P. aeruginosa (93% - 40). All
patients with P. aeruginosa isolates made use of carbapenems and 98.6% (75) of A.
baumannii. It found statistically significant differences between bacteria in the use of
aminoglycosides, 3rd generation cephalosporins and tigecycline. In P. aeruginosa was no
significant difference in the use of oxacillin and cephalosporins of 1st and 3rd generations
and polymyxin in the various sectors of the hospital. All the samples of A. baumannii and P.
aeruginosa were susceptible to colistin, ranging between MIC <= 0.5 and 2. The majority
(55.8% - 24) patients with P. aeruginosa and A. baumannii (52.6% - 40) died. Among the
76 strains of A. baumannii, 56 (73.6%) had concomitant both blaOXA-51 and blaOXA-23
genes. Among the 43 strains of P. aeruginosa, 28 (65.1%) had the blaSPM gene. It was
concluded that the A.baumannii was more frequent than P. aeruginosa. There was a
significant predominance of Pseudomonas and Acinetobacter in the urine in tracheal
aspirates. Carbapenems was widely used throughout the hospital stay of patients with
Acinetobacter and Pseudomonas isolates in different hospital departments. Most
Pseudomonas strains showed blaSPM resistance gene and Acinetobacter blaOXA-23 genes
and blaOXA-51 concurrently. The mortality of patients with Acinetobacter and
Pseudomonas was greater than 50%.
Key-words: Acinetobacter baumannii; Pseudomonas aeruginosa; multidrug resistance;
Metallo-β-lactamase.
Sumário
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1
2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 3
2.1 Microbiologia............................................................................................................... 3
2.1.1 Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa ......................................... 3
2.1.2 Acinetobacter baumannii ...................................................................................... 3
2.1.3 Pseudomonas aeruginosa ...................................................................................... 4
2.2 Bactérias Multirresistentes ........................................................................................... 4
2.3 Genes de Resistência.................................................................................................... 5
3 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 8
3.1 Objetivo Geral .............................................................................................................. 8
3.2 Objetivo Específico:..................................................................................................... 8
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 9
4.1 Delineamento do estudo ............................................................................................... 9
4.2 Procedimentos éticos ................................................................................................... 9
4.3 Local do estudo ............................................................................................................ 9
4.4 População e Amostra ................................................................................................. 10
4.5 Coleta de dados .......................................................................................................... 10
4.5.1 Instrumento de coleta de dados ........................................................................... 10
4.6 Identificação da amostra e teste de susceptibilidade ao antimicrobiano.................... 11
4.7 Identificação dos genes de resistência ....................................................................... 11
4.7.1 Teste fenotípico ................................................................................................... 12
4.7.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ............................................................. 12
4.8 Processamento e análise dos dados ............................................................................ 15
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................... 16
6 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 26
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 27
APÊNDICE A...................................................................................................................... 35
APÊNDICE B ...................................................................................................................... 37
1
1 INTRODUÇÃO
Nos diversos setores do hospital, principalmente na unidade de terapia intensiva
(UTI) encontram-se pacientes críticos, com várias comorbidades, imunossuprimidos e em
uso de vários dispositivos invasivos, como cateteres e tubos (HERNÁNDEZ – GÓMEZ et
al., 2014). Com isso estes ficam mais susceptíveis a adquirir infecção (CURCIO, 2011).
Nos últimos anos houve aumento mundial no número de microrganismos
multirresistentes
aos
antimicrobianos,
principalmente
os
gram-negativos
como
Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa. (ROTH; HANSON et al., 2013;
SOLTANI et al., 2014). Estes causam grande impacto nos hospitais (VILLEGAS et al.,
2011) e são os principais responsáveis pelas infecções, a exemplo da sepse, pneumonia,
infecção das vias urinárias, bem como no pós-cirúrgico (HUI et al., 2014).
As altas taxas de infecção causada por esses microrganismos são responsáveis pela
elevada morbidade (GUEVARA; WAARD; ARAQUE et al., 2009), mortalidade que pode
chegar a uma taxa de 50 % (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA,
2013; TUMBARELLO et al., 2012), falência da terapia medicamentosa, aumento do período
de internação e consequentemente impacto financeiro no sistema de saúde (ROBLEDO;
AQUINO; VÁZQUEZ, 2011).
No mercado estão disponíveis diversas classes de antimicrobianos utilizados no
tratamento do paciente com quadro infeccioso. Os carbapenêmicos configuram a principal
escolha no tratamento de microrganismo multirresistentes, no entanto, o surgimento de cepas
resistentes a esta classe de antibióticos, torna o cenário um problema de saúde pública e a
instituição do tratamento um desafio (WIRTH et al., 2009).
O uso inadequado de antimicrobianos é considerado um dos principais fatores que
contribuem para o surgimento dessas cepas multirresistentes e a dificuldade de detectar nas
bactérias as causas intrínsecas de resistência aos carbapenêmicos elevam as taxa de
mortalidade. (ROTH; HANSON, 2013).
As bactérias resistentes aos carbapenêmicos usam como principal mecanismo de
resistência a produção de enzimas denominadas carbapenemases (AGÊNCIA NACIONAL
DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2013). No Brasil e em outros países são encontradas
algumas classes de carbapenemases, como as oxacilinases (POLOTTO, et al., 2012). No
nosso país, já foram detectados os genes em Pseudomonas aeruginosa dos tipos blaIMP,
2
blaVIM, blaSPM (JÁCOME et al., 2012) e blaKPC (RIZEK et al., 2014). Quanto a Acinetobacter
baumannii, estudos comprovam a presença das oxacilinases dos tipos blaOXA-23 e blaOXA-51.
(GUSATTI et al., 2012).
Devido a elevada frequência de cepas de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter
baumannii resistentes aos carbapenêmicos nos hospitais do nosso país (HERNÁNDEZ –
GÓMEZ et al., 2014) e o impacto causado por essas, é necessário detectar as mudanças que
favorecem o surgimento destas bactérias (HUI et al., 2014).
Diante do exposto, se justifica a importância de detectar os genes de resistência de
Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes e caracterizar
clinicamente os pacientes
em hospital público, a fim de traçar um perfil destes
e consequentemente contribuir para redução da disseminação dessas bactérias no ambiente
hospitalar.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Microbiologia
2.1.1 Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa
Dentre as características apresentadas pelas bactérias Acinetobacter baumannii e
Pseudomonas aeruginosa destacam-se aquelas comuns às duas espécies, pois ambas são
gram-negativas, não fermentadoras, encontradas abundantemente no ambiente hospitalar e
outros locais da natureza. Possuem mecanismos que possibilitam a sobrevivência em locais,
temperaturas e pH variados (FIGUEIREDO et al., 2009).
2.1.2 Acinetobacter baumannii
Trata-se de uma bactéria da família Moraxellaceae, estritamente aeróbia.
Acinetobacter baumannii é a espécie mais importante clinicamente, sendo responsável por
diferentes tipos de infecções, especialmente em pacientes imunocomprometidos, sendo
considerado um patógeno oportunista de grande importância nas infecções nosocomiais
(GIAMARELLOU; ANTONIADOU; KANELLAKOPOULOU, 2008; PELEG; SEIFERT;
PATERSON, 2008).
Podemos citar três mecanismos de colonização que aparentam estar relacionados a
persistência dessa bactéria no ambiente hospitalar: resistência a antimicrobianos, resistência
a desinfetantes e capacidade de sobreviver por longos períodos em ambientes secos
(MARTINS; BARTH, 2013; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008).
A formação de biofilme facilita a adesão bacteriana tanto nos cateteres e tubos de
ventilação mecânica, como também nas células hospedeiras. Essa adesão é propiciada pela
interação entre os pili bacterianos e o lipopolissacarídio (LPS) (JOLY-GUILLOU, 2005).
4
2.1.3 Pseudomonas aeruginosa
É uma bactéria gram-negativa versátil, capaz de formar biofilmes em superfícies
úmidas. Seu recente destaque como importante agente patogênico humano oportunista pode
estar associado à resistência aos antimicrobianos e aos desinfetantes (STOVER et al., 2000).
Esse microrganismo possui uma série de fatores de virulência que irão desencadear
sua patogenicidade, como o flagelo, o pili, o LPS e alginato que atuam como adesinas,
facilitando a adesão às células do hospedeiro. O alginato forma também uma cápsula
protetora, que dificulta a fagocitose e a ação dos antimicrobianos. Destacam-se também a
piocianina, a pioverdina, a serino protease (LasA), zinco metaloprotease (LasB), protease
alcalina, fosfolipase C e exoenzimas S e T. A injeção dessas toxinas é potencializada pelo
sistema de secreção do tipo III, presente na P. aeruginosa. (JÁCOME et al., 2012).
2.2 Bactérias Multirresistentes
A escolha do antimicrobiano para o tratamento de uma infecção causada por
Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii multirresistentes está diretamente
relacionada ao profundo conhecimento do microrganismo causador de diversas infecções
hospitalares (CORTES et al., 2013). Estas são as principais causas de morte em pacientes
internados nas Unidades de Terapia Intensiva (UTI) (POZA et al, 2012).
Dentre os medicamentos administrados nas unidades de terapia intensiva (UTI)
destacam-se os antimicrobianos, pois são utilizados dez vezes mais que os demais setores do
hospital (CURCIO, 2011). No entanto, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii
possuem fatores de virulência, possibilitando a resistência a diversas classes de antibióticos
utilizados no tratamento (WIRTH et al., 2009).
Nos últimos anos foram identificadas com mais frequência as bactérias gramnegativas Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistentes a imipenem e
meropenem que são betalactâmicos de amplo espectro e principais drogas de escolha para
tratamento. (ROBLEDO; AQUINO; VÁZQUEZ, 2011; RAMOS et al., 2012).
Estudo epidemiológico realizado pelo SENTRY em 12 hospitais de quatro estados
brasileiros revelou que Pseudomonas aeruginosa apresentou 30,2% de resistência ao
5
imipenem. Já um estudo realizado pelo MISTYC mostrou uma taxa de 36,6% de resistência
ao antibiótico. Outro estudo realizado nas regiões sul e centro-oeste revelam taxas maiores
de resistência com 58,9% e 82,7%, respectivamente (NEVES et al., 2011).
Alguns mecanismos são responsáveis pela resistência das bactérias ao imipenem e
meropenem, como perda de porinas, superexpressão de bomba de efluxo, presença de
proteínas de ligação às penicilinas (PBS) com baixa afinidade para os carbapenêmicos e
hidrólise enzimática. As bactérias podem apresentar naturalmente esses mecanismos de
resistência ou podem adquirir através de troca de material genético entre elas. (NEVES et
al., 2011)
Para minimizar o impacto causado pelas bactérias Pseudomonas aeruginosa e
Acinetobacter baumannii, que são responsáveis pelas infecções hospitalares, demandando
progressivo desenvolvimento de novas drogas para vencer os mecanismos de resistência, é
fundamental entender os aspectos que contribuem para a multirresistência desses patógenos.
(ALEMAYEHU et al., 2012).
2.3 Genes de Resistência
Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa desenvolvem diversos
mecanismos de resistência aos antimicrobianos, principalmente aos carbapenêmicos.
(GUEVARA; WAARD; ARAQUE, 2009). Dentre os mecanismos de resistência a esta
classe de antibiótico está a produção de enzimas metalo-β-lactamases (MBL) ou
carbapenemases codificadas por genes presentes nas bactérias (MACHADO et al., 2011).
De acordo com o estudo do arranjo genético das bactérias é possível determinar a
localização dos genes responsáveis pela produção das MBL e averiguar as características
estruturais destas enzimas. (GUEVARA; WAARD; ARAQUE, 2009; FUENTEFRIA et al.,
2009).
Na América Latina, o Brasil se destaca pela alta prevalência de bactérias produtoras
de metalo-β-lactamases. O país foi responsável, entre 1997-2001, por 70% de cepas de
Pseudomonas aeruginosa produtoras destas enzimas (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008).
As MBL podem ser divididas em subclasses de A a D, destacando-se a produção de
beta lactamases do tipo D, no qual as oxacilinases fazem parte (OPAZO et al., 2012).
6
A literatura relata quatro famílias do gene OXA, como bla OXA-23, bla OXA-24; bla OXA51
e por fim o gene bla OXA-58 (AMUDHAN et al., 2011; MARTINS et al., 2013). Estes genes
quando expressos indicam alta resistência da bactéria, como resultado da associação com
elementos móveis (ISAba1), responsável pelo transporte de um promotor forte (FONSECA
et al., 2013).
Além da subclasse D, também já foi detectado em cepas de Acinetobacter baumannii
carbapenemases da subclasse D, como IMP, VIM e SIM. Estas são codificadas pelos genes
blaIMP, blaVIM, blaSIM, respectivamente. Além de A. baumannii, os genes blaIMP, blaVIM foram
encontradas em P. aeruginosa (MENDES et al., 2007).
Pseudomonas aeruginosa pode ter mecanismos intrínsecos de resistência a diversas
classes de antibióticos, no entanto também pode adquirir esta resistência através da
transferência de genes ou até por mutação cromossômica (VOOR IN ‘T HOLT et al., 2014).
A produção de metalo-beta-lactamases por essas bactérias recebe destaque, visto que estão
associadas às elevadas taxas de infecção hospitalar e resistência aos carbapenêmicos
(SANTOS, BREZOLIN, HORNER, 2014).
Na literatura está descrito nove subclasses de metalo-beta-lactamases da subclasse B,
como a imipenemases (IMP-1), verona imipenemase (VIM-1), São Paulo metalo-betalactamase (SPM-1), GIM-1 (German imipenemase), SIM-1 (Seoul imipenemase), AIM-1
(Australian imipenemase) KHM-1 (Kyorin Hospital metallo-β-lactamase), NDM-1 (New
Delhi metallo-β lactamase) e DIM-1 (Dutch imipenemase) (JÁCOME et al., 2012).
Estas subclasses foram identificadas em diversos países, como a IMP descrita pela
primeira vez no Japão; VIM detectada na Itália; GIM identificada em Pseudomonas
aeruginosa nos hospitais da Alemanha; Seoul imipenemase (SIM-1) isolada de amostras de
Acinetobacter baumannii; Australian imipenemase (AIM) descrita em 2007 na Austrália. No
Brasil, em 1997, foi identificada no Hospital São Paulo da Universidade Federal de São
Paulo (HSP/UNIFESP) a SPM-1 em Pseudomonas aeruginosa (FIGUEIREDO et al., 2009).
Também está descrito na literatura as MBL PIM-1 (imipenemase), KHM- 1 (Hospital
Kyorin metalo-beta-lactamase), NDM-1 (Nova Deli metalo-beta-lactamase) e DIM
(imipenemase holandês) (JÁCOME et al., 2012).
Os genes blaSPM, blaVIM e blaIMP são amplamente disseminadas no Brasil e o blaSPM
parece estar restrito ao nosso país (MACHADO et al., 2011). Estudos demonstram sua
detecção em isolados na região Nordeste, como na cidade de Salvador (BA) e Fortaleza
(CE); região Sudeste na cidade de São Paulo (SP) e Santo André (SP); região Centro-oeste
7
na cidade de Brasília (DF) e região Sul nas cidades de Londrina, Curitiba e Maringá (GALES
et al., 2003).
Já o gene blaVIM foi detectado na cidade de São Paulo e o gene bla IMP nas cidades de
Brasília, São Paulo, Rio de Janeiro e Porto Alegre (FIGUEIREDO et al., 2009).
A KPC se configura como uma carbapenemase do grupo A e apesar de ser
comumente detectada em Enterobactérias, foi identificado o gene blaKPC em Pseudomonas
aeruginosa (VANEGAS et al., 2014).
Diversos estudos são realizados objetivando ampliar o conhecimento acerca dos
genes de resistência presentes nestas bactérias multirresistentes, no entanto os dados ainda
são escassos (RAMIREZ et al., 2014).
8
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Detectar os genes de resistência presentes nas bactérias Pseudomonas aeruginosa e
Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenêmicos, caracterizando clinicamente os
pacientes.
3.2 Objetivo Específico:
Avaliar as diferenças clínicas entre os isolados de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas
aeruginosa, referentes a: uso de dispositivos invasivos, sítios de isolamento, distribuição por
setores do hospital, antimicrobianos usados, perfil de sensibilidade e desfecho
9
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo analítico de coorte prospectiva e abordagem quantitativa para
detecção dos genes de resistência em cepas de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter
baumannii resistentes aos carbapenêmicos e as características clínicas dos pacientes dos
quais os isolados foram obtidos.
4.2 Procedimentos éticos
Inicialmente o projeto foi cadastrado na Plataforma Brasil e encaminhado ao Comitê
de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de Sergipe (UFS), seguindo as normas que
regulamentam a realização de pesquisas envolvendo seres humanos (CNS, 2012).
O diretor do hospital participante do estudo foi devidamente esclarecido sobre a
pesquisa, direito e cuidados a ele garantido. Após concordância em participar do estudo o
mesmo assinou o termo (Apêndice A). Para a coleta dos dados utilizamos um instrumento
com perguntas estruturadas (Apêndice B). Eventuais esclarecimentos foram feitos pela
pesquisadora quando solicitado.
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade
Federal de Sergipe sob cadastro nº 37689614.4.0000.5546.
4.3 Local do estudo
O estudo foi desenvolvido no Hospital de Urgência de Sergipe Governador João
Alves Filho (HUSE). Trata-se do maior hospital do Estado composto por 13 alas de
internação e capacidade física instalada de 421 leitos. Também faz parte da sua estrutura a
10
Unidade de Terapia Intensiva – UTI adulto I e II e o Centro de Tratamento Intensivo
Pediátrico (CTI Pediátrica), totalizando 64 leitos, além de centro cirúrgico e de emergência
de adultos e pediatria. Conta ainda com unidades de tratamento de queimados e hematooncologia.
As culturas dos pacientes internados foram realizadas em laboratório próprio de
microbiologia do HUSE, equipado com sistema automatizado Vitek 2 compact (Fabricante
bioMérieux).
4.4 População e Amostra
A população do estudo foi obtida das culturas positivas para as bactérias nãofermentadoras Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistentes aos
carbapenêmicos isoladas consecutivamente de pacientes internados no hospital, sendo
incluída na pesquisa apenas uma amostra de cada bactéria por paciente. A espécie e a
resistência aos carbapenêmicos foi definida através do equipamento automatizado Vitek 2
compact (Fabricante bioMérieux), com confirmação fenotípica através de Etest®
(Fabricante bio Mérieux).
4.5 Coleta de dados
A coleta de dados foi realizada nos meses de novembro de 2014 a julho de 2015 após
aprovação do CEP e assinatura do termo de autorização pelo diretor da Instituição que fez
parte da pesquisa.
4.5.1 Instrumento de coleta de dados
Os dados dos pacientes foram coletados em um formulário de pesquisa
especificamente elaborado (Apêndice B). As informações clínicas foram obtidas da ficha de
11
vigilância epidemiológica de infecções relacionadas a assistência à saúde utilizada pela
Serviço de Controle de Infecção Hospital (SCIH) do HUSE para identificação de casos de
infecção hospitalar nas diversas topografias segundo a metodologia NHSN (CDC-USA).
As informações reunidas de cada paciente com isolamento de Acinetobacter
baumannii ou Pseudomonas aeruginosa foram agrupadas como segue-se: dados
demográfico – idade, sexo; data de admissão no hospital, data de admissão na UTI (para
aqueles que estavam internados nesse setor) e procedência. Dados clínicos e
epidemiológicos – setor de internação, diagnóstico de admissão, uso de dispositivos
invasivos; uso de antibiótico. Dados dos isolados – bactéria isolada; perfil de sensibilidade
e resistência aos antimicrobianos e sítio de isolamento. Desfecho do paciente (Apêndice B).
4.6 Identificação da amostra e teste de susceptibilidade ao antimicrobiano
A identificação e o teste de sensibilidade aos antimicrobianos foram realizados
através de equipamento automatizado Vitek 2 compact (Fabricante bioMérieux) utilizando
os cartões GN, AST N238 e N239.
O equipamento Vitek 2 compact possui um sistema constituído por computador,
leitor/incubadora, sendo capaz de identificar e realizar teste de sensibilidade em bactérias
gram-negativas, bactérias gram-positivas e leveduras. Opera em faixa de temperatura
ambiente (15°C a 30°C) e possui a capacidade de 15, 30 ou 60 cartões. O equipamento foi
desenvolvido para fornecer resultados em poucas horas (até 5 horas).
Testes adicionais fenotípicos confirmatórios do perfil de sensibilidade através de
Etest® (Fabricante bio Mérieux) foram realizados para confirmar a resistência aos
carbapenêmicos.
4.7 Identificação dos genes de resistência
Os isolados positivos para Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa
resistentes aos carbapenêmicos identificados pelo Vitek 2-compact foram repicados e
cultivados em placas agar sangue, cled, MacConkey e agar chocolate, separados pelo
12
Laboratório de Microbiologia do HUSE e fornecidos à pesquisadora. O laboratório possui
instalações e equipe qualificada para realização dos ensaios.
As placas foram preservadas em um isopor com gelo e transportadas para a
Universidade Federal de Sergipe-UFS. Uma alíquota da colônia de bactéria foi armazenada
em um tubo cônico de 1,5 ml contendo o meio de cultura LB broth e glicerol e realizado
triplicata. Posteriormente as amostras foram estocadas no freezer menos 80 graus
(imortalizadas),
4.7.1 Teste fenotípico
A resistência aos carbapenêmicos foi detectada fenotipicamente através da fita
Etest® MBL IP/IPI. Esta consiste em um gradiente predefinido, estável, contendo 15
concentrações de antimicrobianos em uma tira de plástico. Trata-se de uma ferramenta
simples, baixo custo, oferece resultados precisos e apresenta alta sensibilidade e
especificidade.
Após sua incubação foi realizado a leitura das placas através da MIC, menor
concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano. Com isso, as
amostras foram classificadas como resistentes ou sensíveis aos antimicrobianos.
Os isolados eram selecionados quando apresentavam resistência aos antimicrobianos
imipenem e meropenem.
4.7.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
As cepas de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni com triagem
positiva para resistência aos carbapenêmicos pelo Etest® e Vitek 2-compact foram
submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para pesquisa dos genes de resistência.
O procedimento foi realizado no laboratório 24 Multiusuário, Departamento de Morfologia,
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Sergipe (UFS), São
Cristóvão-Sergipe.
13
O laboratório 24 multiusuário é constituído de uma área de 40 m², possui
infraestrutura para armazenagem de amostras no freezer -80º C, além de dois freezers, um
micro-ondas, duas centrífugas, dois microscópios e um banho-maria.
Para a extração do DNA, inicialmente, as cepas foram retiradas do freezer -80º C e
cultivadas no meio Extrato de carne (Kasvi®) e incubadas por 24 horas (37º C).
Posteriormente foram centrifugadas, obtido o pellet e utilizado o kit Purelink genomic DNA
mini kit (Invitrogen®) para extração do DNA. Estes foram quantificados e estocados no
freezer -20º C para procedimentos posteriores.
Para detecção do gene blaVIM, blaIMP, blaSPM em Pseudomonas aeruginosa foi
desenvolvida a técnica multiplex PCR. Quanto ao gene blaKPC foi utilizada a técnica PCR
específico. Os oligonucleotídeos utilizados estão descritos conforme demonstra a Tabela 1.
Tabela 1: Sequência de primers utilizados para o multiplex PCR e PCR específico para
detecção dos genes de resistência em isolados de Pseudomonas aeruginosa.
Primer
Sequência
VIM-F
5’GTCTATTTGACCGCGTC 3’
VIM-R
5’ CTACTCAACGACTGAGCG 3’
IMP-F
5’ ATGAGCAAGTTATCTGTATTC 3’
IMP-R
5’GTCGCAACGACTGTGTAG 3’
SPM-F
5’ CCTACAATCTAACGGCGACC 3’
SPM-R
5’ TCGCCGTGTCCAGGTATAAC 3’
KPC-F
CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG
KPC-R
CTTGTCATCCTTGTTAGGCG
pb
Referência
775
TOLEMAN et al.,
2002
580
TOLEMAN et al.,
2002
650
GALES
et
al.,
2003
798
POIREL et al.,
2011
As reações de amplificação foram preparadas no volume total de 50μƖ por tubo,
compreendendo: 0,25 µM de cada primer, 20ng de DNA e 25 microlitros de PCR Master
Mix (Ampliqon®).
Os parâmetros utilizados para o multiplex PCR foram: Inicialmente 95 graus por 5
minutos, em seguida desnaturação (35 ciclos) - 95 graus durante 1 minuto, anelamento na
temperatura de 40 graus por 1 minuto e extensão de 72 graus por 1 minuto (CEZÁRIO et
al., 2009). Para o PCR específico foram utilizados os seguintes parâmetros: 94º por 10
minutos, 36 ciclos de amplificação (94º por 30 segundos, 52º por 40 segundos e 72º por 50
segundos) e extensão na temperatura de 72º por 5 minutos (POIREL et al., 2011).
14
Para detecção dos genes blaOXA-24, blaOXA-23, blaOXA-51 e blaOXA-58, blaVIM, blaIMP e
blaSIM em cepas de Acinetobacter baumannii também foi realizada a técnica multiplex PCR,
conforme apresentado na tabela abaixo (Tabela 2).
Tabela 2: Sequência de primers utilizados para o multiplex PCR para detecção dos genes de
resistência em isolados de Acinetobacter baumannii.
Primer
Sequência
pb
oxa-24-F
5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’
oxa-24-R
5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’
oxa-23-F
5’-GATCGGATTGGAGAACCAGA-3’
oxa-23-R
5’-ATTTCTGACCGCATTTCCAT-3’
oxa-51-F
5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’
oxa-51-R
5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’
oxa-58-F
5’-AAGTATTGGGGCTTGTGCTG-3’
oxa-58-R
5’-CCCCTCTGCGCTCTACATAC-3’
Imp-F
5’-GAATAGAATGGTTAACTCTC-3’
Imp-R
5’-CCAAACCACTAGGTTATC-3’
Vim-F
5’-GTTTGGTCGCATATCGCAAC-3’
VimR
5’-AATGCGCAGCACCAGGATAG-3’
Sim- F
5’-GTACAAGGGATTCGGCATCG-3’
Sim- R
5’-GTACAAGGGATTCGGCATCG-3’
Referência
WOODFORD et al.,
246
2006
WOODFORD et al.,
501
2006
WOODFORD et al.,
353
2006
WOODFORD et al.,
599
2006
MENDES et al. 2007
188
MENDES et al. 2007
382
MENDES et al. 2007
569
As reações de amplificação foram preparadas no volume total de 50μƖ por tubo,
compreendendo: 0,25 µM de cada primer, 20ng de DNA e 25 microlitros de PCR Master
Mix (Ampliqon®).
Foram estabelecidas as condições para o PCR: Inicialmente realizada a desnaturação
em uma temperatura de 94 graus durante 5 minutos, 33 ciclos de 94 graus por 25 segundos,
53 graus por 40 segundos e 72 graus por 6 minutos (MOSTACHIO et al., 2009).
Como controles positivos foram incluídas as cepas CCBH 16841 (Pseudomonas
aeruginosa produtora do gene blaSPM) e a cepa de Acinetobacter baumannii CCBH 3174,
produtora dos genes bla
OXA-23
e bla
OXA-51.
Para o controle negativo foi utilizado água e o
mesmo foi realizado em todas as reações de PCR.
15
Os produtos de PCR foram corados com brometo de etídio e visualizados por
eletroforese em gel de agarose (1% - Pseudomonas aeruginosa e 2% Acinetobacter
baumannii).
Posteriormente os produtos de PCR foram purificados, utilizando o Kit Purelink
Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo (Invitrogen®) e estocado para
sequenciamento do DNA.
4.8 Processamento e análise dos dados
Após a coleta de dados, foi construído um banco de dados utilizando o programa
Excel versão 2010. Realizou-se uma análise descritiva univariada, procedendo-se à
categorização dos dados extraídos dos estudos selecionados em grupos temáticos, onde
foram obtidas medidas de tendência central (média) e de variabilidade (desvio padrão) das
variáveis contínuas, e frequências e proporções para as variáveis categóricas.
Também foram realizadas análises bivariadas, onde buscou-se verificar a existência
de uma relação entre as diferentes variáveis observadas com o tipo bactéria observado
(Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa). Nesta segunda etapa foram
utilizados os testes de Qui-Quadrado (PEARSON, 1900) e Exato de Fisher (FISHER, 1922)
como estatísticas de teste. Em todos os testes realizados foi adotado um nível de significância
de 5% como limiar de decisão, e o software utilizado foi o R versão 3.1.2.
16
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Foram obtidas 128 amostras de Acinetobacter e Pseudomonas resistentes aos
carbapenêmicos de pacientes internados no Hospital de Urgência de Sergipe Governador
João Alves Filho (HUSE). Oito isolados foram excluídos por ser cultura do mesmo paciente
e uma por não confirmação da resistência aos carbapenêmicos quando aplicado o teste
fenotípico (Etest®). No total, foram estudados 76 isolados positivos para Acinetobacter
baumannii e 43 para Pseudomonas aeruginosa.
As infecções causadas por bactérias multirresistentes estão difundidas em todo o
mundo, com destaque para as não fermentadoras Acinetobacter baumanni e Pseudomonas
aeruginosa. Trata-se de cenário preocupante, pois acarreta no aumento das taxas de
morbimortalidade e consequentemente impacto no sistema de saúde (DALBEN et al., 2013;
CARVALHO; FILHO, 2008).
Esses patógenos são os principais causadores de infecções associadas à assistência à
saúde, comumente isolados nas unidades de terapia intensiva (UTI) (OSSA-GIRALDO et
al., 2014; KIM et al., 2013) e responsáveis pelo aumento do período de hospitalização
(DALBEN et al., 2013). Nos hospitais, são os principais isolados e preponderam sobre as
bactérias gram-positivas (VILLEGAS et al., 2011).
Estudo realizado em um hospital terciário no sul do Brasil também demonstra que a
maior taxa de isolados de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii
multirresistentes encontrava-se neste setor. (MACHADO, 2011).
As bactérias gram-negativas Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii
destacam-se por sua rápida disseminação no ambiente hospitalar (HERNÁNDEZ – GÓMEZ
et al., 2014). No Brasil, dentre os pacientes hospitalizados, um em cada dez é acometido por
infecções causadas por bactérias multirresistentes (MORAES et al., 2013), atingindo adultos
e crianças (ATTI et al., 2014). Estudo realizado pelo SENTRY em hospitais brasileiros
revela que Pseudomonas aeruginosa é o terceiro microrganismos mais isolado de pacientes
(NEVES et al., 2011).
17
Dos 76 pacientes acometidos por Acinetobacter baumannii, 59 era do sexo masculino
(77,6%), com apenas três pacientes pediátricos; a média de idade de 44,4 anos. Cinquenta
pacientes (65,8%) eram procedentes da unidade de terapia intensiva (UTI), 18 deles (23,7%)
com diagnóstico de trauma crânio encefálico (TCE), com mediana de internamento de 30,5
dias (2 - 580) [Tabela 3].
Dos 43 pacientes em que foram isolados a Pseudomonas aeruginosa, 33 eram do sexo
masculino (76,7%) e adultos, apenas três pacientes pediátricos, com idade média de 46,2
anos. Vinte e oito estavam internados na UTI (65,1%); 13 deles (30,2%) com diagnóstico de
trauma crânio encefálico e mediana de internamento de 55 dias (5 - 112). Esta última variável
foi estatisticamente significante entre as bactérias [Tabela 3].
Tabela 3: Avaliação comparativa dos dados demográficos e diagnósticos de admissão dos
119 pacientes com Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. HUSE, 2014-2015
Variável
Sexo
Masculino
Idade (anos) / M (D.P.)
Setor
UTI
Outros setores
Duração da internação (dias)
Mediana (variação)
Diagnóstico clínico à admissão
Trauma Crânio encefálico (TCE)
Acidente Vascular encefálico (AVE)
Politraumatismo
Choque séptico
Ferimento por arma de fogo (FAF)
Queimadura
Insuficiência Respiratória Crônica
(IRC)
Neoplasia
Erisipela
Infarto agudo do miocárdio
Insuficiência respiratória aguda
Abdomen agudo
Outros
M: média/ D.P: Desvio padrão
A-Teste Qui-Quadrado
B-Teste Exato de Fisher
Pseudomonas
aeruginosa
Acinetobacter
baumannii
Valor
p
33 (76,7%)
46,2 (21,9)
59 (77,6%)
44,4 (20,7)
1,00a
28 (65,1%)
15 (34,9%)
55 (5-112)
50 (65,8%)
26 (34,2%)
30,5 (2-580)
1,00a
0,007
13 (30,2%)
5 (11,6%)
3 (7,0%)
3 (7,0%)
1 (2,3%)
1 (2,3%)
5 (11,6%)
18 (23,7%)
13 (17,1%)
12 (15,8)
5 (6,6%)
5 (6,6%)
4 (5,3%)
4 (5,3%)
0,572a
0,593a
0,251b
1,000b
0,416b
0,652b
0,281b
1 (2,3%)
0 (0,0%)
1 (2,3%)
0 (0,0%)
2 (4,6%)
8 (18,6%)
2 (2,6%)
2 (2,6%)
2 (2,6%)
2 (2,6%)
0 (0,0%)
6 (7,9%)
1,000b
0,534b
1,000b
0,534b
0,129b
0,148a
18
Pseudomonas e Acinetobacter foram isoladas de todos os tipos de amostras
corporais com frequências similares, exceto na urina para a Pseudomonas e secreção traqueal
para o Acinetobacter. Só foi encontrada diferença estatisticamente significante entre as duas
bactérias na urina (p = 0,015) [Tabela 4].
Tabela 4: Distribuição comparativa de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii
por sítio de isolamento. HUSE, 2014-2015
Sítio
Sangue
Urina
Ponta de cateter
Aspirado traqueal
Úlcera de pressão
Ferida operatória
Secreção – óstio
GTT
Fixador fêmur
Secreção- abdômen
Líquido Pericárdio
Swab retal
A-Teste Qui-Quadrado
B-Teste Exato de Fisher
Pseudomonas
aeruginosa
4 (9,3%)
16 (37,2%)
7 (16,2%)
12 (27,9%)
0 (0,0%)
3 (6,9%)
Acinetobacter
baumannii
11 (14,4%)
12 (15,7%)
6 (7,8%)
32 (42,1%)
2 (2,6%)
9 (11,8%)
Valor
p
0,568b
0,015a
0,270a
0,179a
0,535b
0,533b
0 (0,0%)
1 (1,3%)
1.000b
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
1 (2,3%)
1 (1,3%)
1 (1,3%)
1 (1,3%)
0 (0,0%)
1.000b
1.000b
1.000b
0,361b
A Pseudomonas aeruginosa é responsável por diversas infecções hospitalares, como
bacteremia, infecções do sistema urinário e infecções em soluções de continuidade
(CEZÁRIO et al., 2009). O Acinetobacter baumanni também faz parte deste cenário,
principal causador da pneumonia, bacteremia, meningite, infecção das vias urinárias,
peritonite e infeções na pele (RAMOS et al., 2012).
Corroborando com os dados encontrados na nossa pesquisa, estudo realizado com
amostras de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii isoladas de pacientes
internados em um hospital estadual do Rio de Janeiro, demonstrou que a maioria das
amostras de Pseudomonas aeruginosa foi isolada da urina (48%) (FIGUEIREDO et al.,
2009).
Nos isolados de Acinetobacter baumannii, 25% dos isolados foram na urina e 20%
no sangue (FIGUEIREDO et al., 2009), diferindo dos nossos resultados. Outro estudo
desenvolvido em dois hospitais do sul do Brasil, mostrou uma taxa ainda maior - 50% das
amostras de Pseudomonas aeruginosa foram obtidas da urina (WIRTH et al., 2009). Já na
19
pesquisa desenvolvida no Hospital Universitário de Santa Maria, o principal sítio de
isolamento destas bactérias foi aspirado traqueal (SANTOS, BREZOLIN, HORNER, 2014).
Os dispositivos invasivos foram muito utilizados, com frequências maiores que 70%,
excetuando-se a gastrostomia e a nutrição parenteral. A sonda vesical foi o dispositivo mais
usado nos pacientes com isolados de A. baumannii (93,4% - 71) e o cateter venoso central
nos pacientes com P. Aeruginosa (93% - 40).
Não foram encontradas diferenças
estatisticamente significantes para a frequência e razão de uso dos dispositivos invasivos
utilizados pelos pacientes com Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa [Tabela
5].
Tabela 5: Distribuição comparativa de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa por frequência
e razão de uso de dispositivo invasivo. HUSE, 2014-2015
Dispositivo
Pseudomonas
aeruginosa
Acinetobacter
baumannii
Valor p
Pseudomonas
aeruginosa
(RU)
Acinetobacter
baumannii
(RU)
Valor
p
0,45
0,479a
0,43
0,54
0,471a
0,475a
0,59
0,240a
0,65
0,546a
0,11
0,193a
0,05
0,721b
Ventilação
35 (81,3%)
60 (78,9%)
0,999a
0,51
mecânica
Traqueostomia
32 (74,4%)
54 (71%)
0,856a
0,37
Sonda vesical
39 (90,6%)
71 (93,4%)
0,721b
0,60
Cateter venoso
40 (93%)
66 (86,8%)
0,372b
0,68
central
Sonda
39 (90,6%)
69 (90,7%)
1,000b
0,70
nasoenteral
Gastrostomia
5 (11,6%)
7 (9,2%)
0,917a
0,05
Nutrição
5 (11,6%)
9 (11,8%)
1,000a
0,03
parenteral
A-Teste Qui-Quadrado
B-Teste Exato de Fisher
RU = razão de utilização (total de dispositivo-dia/total de pacientes-dia)
A maioria dos pacientes internados com infecção causada pelas bactérias
multirresistentes, apresenta deficiência do sistema imunológico, comorbidades e são
submetidos constantemente a procedimentos invasivos, situações estas, que favorecem a
instalação destes microrganismos (HERNÁNDEZ – GÓMEZ et al., 2014).
Diversas drogas são recomendadas no tratamento de infecções causadas por cepas de
Acinetobacter baumannii
multirresistentes, dentre elas estão a polimixina, os
aminoglicosídeos e tigeclicina. Esta última é considera uma droga mais recente e pode ser
20
indicada eventualmente como primeira opção para tratamento dessas cepas (CHOPRA et al.,
2013).
Pacientes acometidos por infecções causadas pelas bactérias multirresistentes
recebem frequentemente terapêutica com carbapenêmicos, tais como o doripenem,
ertapenem, imipenem e meropenem (JÁCOME et al., 2014, CHOPRA et al., 2013).
O presente estudo confirma o frequente uso dos antibióticos carbapenêmicos
durante a internação. Todos os pacientes positivos para Pseudomonas aeruginosa usaram
carbapenêmicos (100%); e 98,6% dos pacientes portadores de Acinetobacter baumannii.
Não houve diferença estatística na utilização desta classe de antibióticos entre os grupos. Já
para outras classes de antibióticos - aminoglicosídeos, cefalosporinas de 3ª geração e
tigeciclina, foi encontrada diferença estatisticamente significante [Tabela 6].
Tabela 6: Uso de antimicrobianos observado ao longo da internação de pacientes com
isolados positivos para Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. HUSE, 20142015
Antimicrobianos
Aminoglicosídeos
Oxacilina + cefalosporinas 1ª
geração
Cefalosporinas 3ª geração
Quinolona
Glicopeptídeos
Carbapenêmicos
Polimixina
Tigeciclina
A-Teste Qui-Quadrado
B- Teste Exato de Fisher
Pseudomonas
aeruginosa
41(95,3%)
Acinetobacter
baumannii
59 (77,6%)
Valor
p
0,017b
4 (9,3%)
15 (19,7%)
0,193b
22 (51,1%)
10 (23,2%)
29 (67,4%)
43 (100%)
24 (55,8%)
5 (11,6%)
58 (76,3%)
20 (26,3%)
37 (48,6%)
75 (98,6%)
35 (46%)
23 (30,2%)
0,009a
0,881a
0,074a
1,000b
0,405a
0,038a
Nos pacientes com isolados de Acinetobacter baumannii, quando comparado o uso
das classes de antimicrobianos ao longo da internação, verificou-se que os carbapenêmicos
foram os mais utilizados no tratamento dos pacientes não importando se estivessem em
unidades de terapia intensiva ou não. [Tabela 7]
21
Tabela 7: Comparação do uso de antimicrobianos em pacientes positivos para Acinetobacter
baumannii de amostras obtidas das UTIs versus demais setores do HUSE, em 2014-2015.
Antimicrobianos
Aminoglicosídeos
Oxacilina + cefalosporinas 1ª geração
Cefalosporinas 3ª geração
Quinolona
Glicopeptídeos
Carbapenêmicos
Polimixina
Tigeciclina
A- Teste Qui-Quadrado
B-Teste Exato de Fisher
UTI
38 (76%)
8 (16%)
38 (76%)
10 (20%)
27 (54%)
43 (86%)
27 (54%)
17 (34%)
NÃO UTI
22 (84,6)
7 (26,9%)
20 (76,9%)
10 (38,4%)
10 (38,4%)
24 (92,3%)
8 (30,7%)
6 (23%)
Valor p
0,555b
0,406a
1,000a
0,144a
0,296a
0,710b
0,091a
0,471a
Já na análise destas mesmas variáveis em Pseudomonas aeruginosa demonstrou que
houve diferença estatisticamente significante para o uso da oxacilina e cefalosporinas de 1ª
geração, cefalosporinas de 3ª geração e polimixina [Tabela 8].
Tabela 8: Comparação do uso de antimicrobianos em pacientes positivos para Pseudomonas
aeruginosa de amostras obtidas das UTIs versus demais setores do HUSE, em 2014-2015.
Antimicrobianos
Aminoglicosídeos
Oxacilina + cefalosporinas 1ª geração
Cefalosporinas 3ª geração
Quinolona
Glicopeptídeos
Carbapenêmicos
Polimixina
Tigeciclina
A-Teste Qui-Quadrado
B-Teste Exato de Fisher
UTI
25 (89,2%)
0 (0,0%)
15 (53,5%)
6 (21,4%)
22 (78,5%)
28 (100%)
21 (75%)
4 (14,2%)
NÃO UTI
15(100%)
4 (26,6%)
7 (46,6%)
4 (26,6%)
7 (46,6%)
14 (93,3%)
3 (20%)
1 (6,6%)
valor p
0,541b
0,011b
0,012a
0,719b
0,074a
0,349b
0,001b
0,643b
As bactérias resistentes aos carbapenêmicos, como a Pseudomonas aeruginosa
tornaram-se um problema mundial, acarretando diminuição das opções terapêuticas
(VILLEGAS et al, 2011). Com isso, antibióticos que causam elevada toxicidade, a exemplo
das polimixinas, começam a ser utilizados no tratamento do paciente (TAKAGI, et al., 2009;
SANTOS, BREZOLIN, HORNER, 2014).
Uma revisão sistemática e meta-análise demonstraram que o uso de carbapenêmicos
e dispositivos invasivos são os principais fatores de risco para resistência a esta classe de
22
antibiótico em cepas de Pseudomonas aeruginosa. Além disso, também se configuram
como fatores de risco o uso de vários antibióticos e admissão na UTI (VOOR IN ‘T HOLT
et al., 2014).
A avaliação da susceptibilidade das bactérias aos antimicrobianos testados no
isolados mostrou que todos as amostras de A. baumannii e P. aeruginosa apresentaram
sensibilidade à colistina, com variação da MIC entre < = 0,5 e 2. Já para a ceftazidima
nossos achados foram muito ruins – apenas 20,9% (9) das Pseudomonas aeruginosa e 1,3%
(1) dos Acinetobacter baumannii foram sensíveis [Tabela 9]. Estes achados diferiram de
pesquisa realizada em cinco hospitais da cidade de Recife em que a maioria das cepas foram
sensíveis à ceftazidima (JÁCOME et al., 2012). O mesmo foi relatado para
piperacilina/tazobactam em um hospital universitário de Santa Catarina – alta sensibilidade
(96,7%) para as Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos. Neste mesmo
estudo, as cepas apresentaram sensibilidade a cefepima (6%), ciprofloxacina (10%),
amicacina (16,7%) e 43% à ceftazidima (SCHEFFER et al., 2010).
Tabela 9: Comparação da sensibilidade aos antimicrobianos testada dos isolados de
Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii obtidos de pacientes internados no
HUSE, 2014-2015.
Antimicrobiano
Pseudomonas
aeruginosa
Colistina
43 (100%)
Amicacina
16 (37,2%)
Ceftazidima
9 (20,9%)
Ciprofloxacina
6 (13,9%)
Cefepima
5 (11,6%)
Gentamicina
6 (13,9%)
Piperacilina/Tazobactam
2 (4,6%)
Tigeciclina
Ampicilina/Sulbactam
Ceftriaxona
-
Variação da
MIC
< = 0,5 - 2
< = 2 - 16
4-8
< = 0,25 – 0.5
2–8
<=1-4
8
-
Acinetobacter
baumannii
76 (100%)
38 (50%)
1 (1,3%)
4 (5,2%)
2 (2,6%)
45 (59,2%)
52 (68,4%)
15 (19,7%)
2 (2,6%)
Variação
da MIC
< = 0,5 - 2
< = 2 - 16
4
< = 0,25
2-8
<=1-4
< = 0,5 - 2
<=2-8
8
Diante do exposto é fundamental conhecer o perfil de sensibilidade aos
antimicrobianos, visto que o aumento das taxas de resistência aos carbapenêmicos reflete na
escolha de outras opções, considerando que são poucas, para tratamento dos pacientes- fonte
(SANTOS, BREZOLIN, HORNER, 2014), a exemplo da colistina (NEVES et al., 2011).
A maioria (55,8% - 24) dos pacientes com Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter
baumannii (52,6% - 40) foram a óbito, demonstrando assim a gravidade do quadro
23
apresentado pelos pacientes quando isolados com estas bactérias. Não houve diferença
estatisticamente significante (p=0,888).
Dentre as 76 cepas de Acinetobacter baumannii, 75 (98,6%) apresentaram genes de
resistência do tipo blaOXA [Figura 1]. Dezoito foram positivos apenas para o gene blaOXA-51
(23,6%), uma cepa para o gene blaOXA-23 (1,3%) e 56 (73,6%) apresentaram
concomitantemente os dois genes.
blaOXA-23
501pb
blaOXA-51
353pb
Figura 1: Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio.
Produtos de amplificação por PCR em DNA de amostras de A. baumannii.
Poço 1: Peso molecular (PM); Poços 2-17 amostras; Poço 18: Controle
negativo; Poço 19: Controle positivo (CCBH 3174); Poço 20: Controle
negativo.
Diferente da nossa pesquisa, estudo realizado com cepas de Acinetobacter baumannii
coletadas durante Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP), todas
apresentavam o gene blaOXA-51, enquanto que o gene blaOXA-23 em 94,4% das cepas (KIM et
al., 2013).
O gene blaOXA-23 é amplamente disseminada no mundo, visto que foi detectado no
Brasil, Argentina, Colômbia, Estados Unidos, Europa, Austrália, China e Coreia (OPAZO
et al., 2012). É encontrada em elementos móveis do Acinetobacter baumannii e acredita-se
ser um fator intrínseco (TEIXEIRA et al., 2013).
Também merece destaque o gene blaOXA-51, pois assim como o blaOXA-23, também já
foi detectado em vários países como a Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Colômbia e
Venezuela (OPAZO et al., 2012). Este gene pode estar localizado nos cromossomos (LEE
et al., 2012; TEIXEIRA et al., 2013) ou nos plasmídeos, possibilitando desta forma a sua
transmissão para outras cepas (ANTUNES et al., 2014). Diferente do gene blaOXA-23, a
presença do blaOXA-51 está associado à resistência aos carbapenêmicos (TEIXEIRA et al.,
2013).
24
Dentre as 43 cepas de Pseudomonas aeruginosa, 28 (65,1%) apresentaram o gene
blaSPM [Figura 2], uma o blaVIM (2,3%) e uma (2,3%) cepa o gene blaSPM e blaKPC [Figura 3]
concomitantemente.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
blaSPM
650pb
Figura 2: Eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de
etídio. Produtos de amplificação por PCR em DNA de amostras de P.
aeruginosa. Poço 1: Peso molecular (PM); Poços 2-13 amostras; Poço
14: Controle negativo; Poço 15: Controle positivo (CCBH 16841).
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
blaKPC
798pb
Figura 3: Eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio.
Produtos de amplificação por PCR em DNA de amostras de P. aeruginosa.
Poço 1: Peso molecular (PM); Poços 2-22 amostras; Poço 23: Controle
negativo; Poço 24: Controle positivo.
Estudo realizado com 27 cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas de crianças
internadas em um hospital terciário da Itália, detectou duas cepas produtoras de metalo-betalactamases, ocasionado pela presença do gene blaVIM. (ATTI et al., 2014), corroborando
assim como nosso estudo, visto que uma cepa (2,3%) apresentou este gene.
25
Outra pesquisa desenvolvida com 29 cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas em
cinco hospitais públicos em Recife revela que a maioria apresentou o gene blaSPM. Já os
genes blaVIM e blaIMP não foram detectados (JÁCOME et al., 2012). Resultado semelhante
foi encontrado em estudo realizado no Instituto de Oncologia Pediátrica da UNIFESP
(FERNANDES, 2010), já que também não foi detectado o gene blaVIM.
Corroborando com nosso estudo, pesquisa realizada com 29 cepas de Pseudomonas
aeruginosa do Hospital Universitário de Santa Catarina demonstrou a prevalência do gene
blaSPM nas amostras (SCHEFFER et al., 2010).
No nosso estudo uma cepa (2,3%) foi detectada com dois genes concomitantemente,
blaSPM e blaKPC. Durante um surto na unidade de transplante de medula, localizado na cidade
de São Paulo, foi descrito novo clone que carreava estes dois genes. Além do Brasil, o gene
blaKPC já foi encontrado na Argentina e Irã, demonstrando dessa forma a facilidade de
disseminação deste mecanismo de resistência (RIZEK et al., 2014).
Corroborando com nossa pesquisa, estudo realizado pelo Instituto Central do
Hospital das Clinicas de São Paulo demonstrou predominância do gene blaSPM, no entanto
também foi encontrado o gene blaKPC. Este estudo foi realizado com 129 cepas de
Pseudomonas aeruginosa, entretanto 79 não apresentaram genes de resistência (RIZEK et
al., 2014).
O presente estudo selecionou bactérias resistentes aos carbapenêmicos, no entanto os
genes de resistência não foram detectados em 14 cepas (32,5%) de Pseudomonas
aeruginosa. Provavelmente isso aconteceu porque estas bactérias podem estar utilizando
outros mecanismos de resistência como a perda ou alteração de porinas ou superexpressão
de bombas de efluxo (LUYT et al., 2014; VOOR IN ‘T HOLT et al., 2014) ou até mesmo
carrear gene não investigado no estudo. Outra possibilidade é a presença de carbapenemase
ainda não identificada (RIZEK et al., 2014).
26
6 CONCLUSÕES
O Acinetobacter baumannii foi mais frequente do que a Pseudomonas aeruginosa
nos isolados de pacientes internados no HUSE no período de estudo, sem diferenças entre
áreas intensivas e não intensivas. Houve predomínio significante da Pseudomonas
aeruginosa na urina e do Acinetocabter baumannii na secreção traqueal.
Os antimicrobianos da classe dos carbapenêmicos foi ampla e similarmente utilizado
ao longo da internação dos pacientes com isolados de P. aeruginosa e A. baumannii nos
diversos setores do hospital. No entanto, houve diferença significante entre as bactérias
quanto ao uso dos aminoglicosídeos, cefalosporinas de 3ª geração e tigeciclina. Todos os
isolados apresentaram sensibilidade à colistina (MIC < = 0,5 – 2).
A maioria das cepas de Pseudomonas aeruginosa apresentaram gene de resistência
blaSPM e Acinetobacter baumannii os genes blaOXA-23 e blaOXA-51 concomitantemente.
A mortalidade dos pacientes com Acinetobacter e Pseudomonas foi superior a 50%,
não havendo diferença significante entre os isolados.
27
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35
APÊNDICE A
TERMO DE AUTORIZAÇÃO INSTITUCIONAL
Aracaju, __ de___ de 2014
[Ilustríssimo Diretor do HUSE]
Eu, Tânia Maria de Andrade Rodrigues, responsável principal pelo projeto de
mestrado de Fernanda Lays Souza Góes Santos pela Universidade Federal de Sergipe
(UFS), venho pelo presente, solicitar vossa autorização para realizar um projeto de
pesquisa nesta Instituição, como trabalho de mestrado sob o título " Caracterização clínica
e identificação de genes de resistência de isolados de Acinetobacter baumannii e
Pseudomonas aeruginosa multirresistentes em um hospital público do nordeste
brasileiro”, o qual envio em apenso.
Este projeto de pesquisa atendendo o disposto na Resolução CNS 466 de 2012 e
a qualquer momento vossa senhoria poderá solicitar esclarecimento sobre o
desenvolvimento do projeto de pesquisa que está sendo realizado e, sem qualquer tipo de
cobrança, poderá retirar sua autorização. Os pesquisadores estarão aptos a esclarecer
quaisquer pontos e, em caso de necessidade, darem indicações para solucionar ou
contornar qualquer mal-estar que possa surgir em decorrência da pesquisa.
Os dados obtidos nesta pesquisa serão utilizados na publicação de artigos
científicos e que, assumimos a total responsabilidade de não publicar qualquer dado que
comprometa o sigilo da participação dos integrantes de vossa instituição como nome,
endereço e outras informações pessoais não serão em hipótese alguma publicados. Na
eventualidade da participação nesta pesquisa causar qualquer tipo de dano aos
participantes, nós pesquisadores, nos comprometemos em reparar este dano, e ou ainda
prover meios para a reparação. A participação será voluntária, não fornecemos por ela
qualquer tipo de pagamento.
36
Autorização institucional
Eu, Diretor do Hospital de Urgência de Sergipe Governador João Alves Filho
(HUSE), declaro que fui informado dos objetivos da pesquisa acima, e concordo em
autorizar a execução da mesma nesta instituição. Caso necessário, a qualquer momento
desta pesquisa poderemos revogar esta autorização, se comprovada atividades que
causem algum prejuízo a esta instituição ou ainda, a qualquer dado que comprometa o
sigilo da participação dos integrantes desta instituição. Declaro também, que não
recebemos qualquer pagamento por esta autorização bem como os participantes também
não receberão qualquer tipo de pagamento.
Pesquisador
Diretor do HUSE
____________________________
Fernanda Lays Souza Góes Santos
Orientador
____________________________
Prof. Dr. Tânia Maria de Andrade
Rodrigues
______________________________
37
APÊNDICE B
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CENTRO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
INSTRUMENTO DE COLETA DE DADOS
I- Dados demográficos:

Data: ___/____/____

Nome do paciente: __________________________________________

Sexo: ( ) Feminino

Data de Nascimento: ___/___/___

Idade: _____

Data de admissão no hospital: ____/_____/_____

Data de admissão na UTI: _____/_____/______

Procedência: _______________________________________________
( ) Masculino
II- Dados clínicos e epidemiológicos:
 Setor de internação:_____________________________
 Diagnóstico admissão:_____________________________
 Dispositivos invasivos:
Uso de dispositivo invasivo
VM/TQT
SVD
CVC
NPP
SNE/GTT
OUTROS
Permanência (dias)
38

Uso de antibiótico(s):
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
III- Dados dos isolados:

Bactéria isolada:
(
) Pseudomonas aeruginosa
( ) Acinetobacter baumannii

Sítio de isolamento__________________________

Perfil de sensibilidade e resistência a antibióticos:
Antibiótico
Perfil de
Sensibilidade
(MIC Vitek)
Perfil de
sensibilidade
(MIC Etest)
Perfil de
resistência
(MIC
Vitek)
Perfil de
resistência
(MIC
Etest)
IV- Desfecho


Alta: Data ____/____/____ Para:_________________________
Óbito: Data _____/_____/_____