Detecção de genes de resistência de Acinetobacter
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA Fernanda Lays Souza Góes Santos Detecção de genes de resistência de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes e caracterização clínica dos pacientes em hospital público de Sergipe São Cristóvão – SE 2015 i Fernanda Lays Souza Góes Santos Detecção de genes de resistência de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes e caracterização clínica dos pacientes em hospital público de Sergipe Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe como requisito para obtenção do título de Mestre, sob a orientação da professora Dr.ª Tânia Maria de Andrade Rodrigues e Co-orientação da Dr.ª Iza Maria Fraga Lobo São Cristóvão – SE 2015 ii TERMO DE APROVAÇÃO Fernanda Lays Souza Góes Santos Detecção de genes de resistência de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes e caracterização clínica dos pacientes em hospital público de Sergipe Dissertação de mestrado defendida e aprovada em 30/09/2015, pela banca examinadora: _________________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Tânia Maria de Andrade Rodrigues (Presidente) Universidade Federal de Sergipe ________________________________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Ângela Maria da Silva Universidade Federal de Sergipe _________________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Maria Regina Pires Carneiro Universidade Federal de Sergipe iii RESUMO Detecção de genes de resistência de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes e caracterização clínica dos pacientes em hospital público de Sergipe As infecções causadas por Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes são responsáveis pela alta morbidade e mortalidade, falência da terapia medicamentosa, aumento do período de internação e consequentemente impacto financeiro no sistema de saúde. Todavia, embora a ocorrência destas bactérias se configure um problema de saúde pública, inúmeros estudos revelam que é escasso o conhecimento acerca dos genes de resistência presentes nas bactérias multirresistentes. Essa realidade associada ao impacto negativo destas na sociedade, justifica a importância de detectar os genes de resistência de A. baumannii e P. aeruginosa multirresistentes e caracterizar clinicamente os pacientes de um hospital público de Sergipe. Trata-se de um estudo analítico de coorte prospectiva e abordagem quantitativa. A coleta dos dados clínicos dos pacientes foi realizada através de um formulário especificamente elaborado. As cepas de A. baumannii foram submetidas à técnica PCR para identificação dos genes de resistência (blaIMP, blaVIM, blaSIM, bla OXA-51, blaOXA-58, blaOXA-23 e blaOXA-24) e em P. aeruginosa os genes blaSPM, blaVIM, blaIMP, blaKPC. Foram realizadas análises descritivas, os testes de Qui-Quadrado e Exato de Fisher, com nível de significância de 5%. O software utilizado foi o R versão 3.1.2. A amostra foi constituída de 119 pacientes. Dos 43 pacientes com isolados de P.aeruginosa, 33 eram do sexo masculino (76,7%), com idade média de 46,2 anos. Vinte e oito estavam internados na UTI (65,1%) e 13 (30,2%) com diagnóstico de trauma crânio encefálico (TCE). Dos 76 pacientes com isolados de A. baumannii, 59 (77,6%) era do sexo masculino, média de idade de 44,4 anos. Cinquenta pacientes (65,8%) eram procedentes da UTI e 18 (23,7%) com diagnóstico de TCE. A mediana de dias de internamento foi estatisticamente significante entre as bactérias. Dentre os sítios de isolamento, destaca-se a urina para P. aeruginosa, com 16 amostras (37,2%) e o aspirado traqueal para A. baumannii com 32 (42,1%) cepas. A sonda vesical foi o dispositivo mais usado nos pacientes com isolados de A. baumannii (93,4% 71) e o cateter venoso central nos pacientes com P. aeruginosa (93% - 40). Todos os pacientes com isolados de P.aeruginosa fizeram uso dos carbapenêmicos e 98,6% (75) dos A. baumannii. Foi encontrado diferença estatisticamente significante entre as bactérias quanto ao uso dos aminoglicosídeos, cefalosporinas de 3ª geração e tigeciclina. Em P. aeruginosa houve diferença significativa no uso da oxacilina e cefalosporinas de 1ª e 3ª gerações e polimixina nos diversos setores do hospital. Todos as amostras de A. baumannii e P. aeruginosa apresentaram sensibilidade à colistina, com variação da MIC entre < = 0,5 e 2. A maioria (55,8% - 24) dos pacientes com P. aeruginosa e A. baumannii (52,6% - 40) foram a óbito. Dentre as 76 cepas de A. baumannii, 56 (73,6%) apresentaram concomitantemente os dois genes blaOXA-51 e blaOXA-23. Dentre as 43 cepas de P. aeruginosa, 28 (65,1%) apresentaram o gene blaSPM. Concluiu-se que o A.baumannii foi mais frequente do que a P.aeruginosa. Houve predomínio significante da Pseudomonas na urina e do Acinetobacter na secreção traqueal. Os carbapenêmicos foi amplamente utilizado ao longo da internação dos pacientes com isolados de Acinetobacter e Pseudomonas nos diversos setores do hospital. A maioria das cepas de Pseudomonas apresentaram gene de resistência blaSPM e Acinetobacter os genes blaOXA-23 e blaOXA-51 concomitantemente. A mortalidade dos pacientes com Acinetobacter e Pseudomonas foi superior a 50%. Palavras-chaves: Acinetobacter baumannii; Pseudomonas aeruginosa; multirresistência; metalo-β-lactamase. Tânia Maria de Andrade Rodrigues- Orientadora do PROBP- Universidade Federal de Sergipe. iv ABSTRACT Detection of Acinetobacter baumannii resistance genes and multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa and clinical characterization of patients in public hospital in Sergipe Infections caused by Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa multiresistant are responsible for high morbidity and mortality, failure of drug therapy, increased hospital stay and consequently the financial impact on the health system. However, while the occurrence of these bacteria to configure a public health problem, numerous studies reveal that it is scarce information about the resistance genes present in multi-drug resistant bacteria. This reality associated with the negative impact of these on society, justifies the importance of detecting the resistance genes of A. baumannii and P. aeruginosa multiresistant and clinically characterize patients from a public hospital in Sergipe. It is an analytical prospective cohort study and a quantitative approach. The collection of clinical data of patients was carried out through a specifically designed form. Strains of A. baumannii were subjected to PCR for identification of resistance genes (blaIMP, blaVIM, blaSIM, bla OXA-51, blaOXA-58, blaOXA-23 and blaOXA-24) and P. aeruginosa the blaSPM genes, blaVIM, blaIMP, blaKPC. Descriptive analyzes were performed, the Chi-square and Fisher exact tests, with 5% significance level. The software used was R version 3.1.2. The sample consisted of 119 patients. Of the 43 patients with P. aeruginosa isolates, 33 were male (76.7%) with mean age of 46.2 years. Twenty-eight were admitted to the ICU (65.1%) and 13 (30.2%) diagnosed with head trauma (TBI). Of the 76 patients with isolates of A. baumannii, 59 (77.6%) were male, mean age of 44.4 years. Fifty patients (65.8%) were from the ICU and 18 (23.7%) diagnosed with TBI. The median number of days of hospitalization was statistically significant between bacteria. Among the isolation sites, there is urine to P. aeruginosa, with 16 samples (37.2%) and tracheal aspirate for A. baumannii with 32 (42.1%) strains. A urinary catheter was the most used device in patients with isolates of A. baumannii (93.4% - 71) and the central venous catheter in patients with P. aeruginosa (93% - 40). All patients with P. aeruginosa isolates made use of carbapenems and 98.6% (75) of A. baumannii. It found statistically significant differences between bacteria in the use of aminoglycosides, 3rd generation cephalosporins and tigecycline. In P. aeruginosa was no significant difference in the use of oxacillin and cephalosporins of 1st and 3rd generations and polymyxin in the various sectors of the hospital. All the samples of A. baumannii and P. aeruginosa were susceptible to colistin, ranging between MIC <= 0.5 and 2. The majority (55.8% - 24) patients with P. aeruginosa and A. baumannii (52.6% - 40) died. Among the 76 strains of A. baumannii, 56 (73.6%) had concomitant both blaOXA-51 and blaOXA-23 genes. Among the 43 strains of P. aeruginosa, 28 (65.1%) had the blaSPM gene. It was concluded that the A.baumannii was more frequent than P. aeruginosa. There was a significant predominance of Pseudomonas and Acinetobacter in the urine in tracheal aspirates. Carbapenems was widely used throughout the hospital stay of patients with Acinetobacter and Pseudomonas isolates in different hospital departments. Most Pseudomonas strains showed blaSPM resistance gene and Acinetobacter blaOXA-23 genes and blaOXA-51 concurrently. The mortality of patients with Acinetobacter and Pseudomonas was greater than 50%. Key-words: Acinetobacter baumannii; Pseudomonas aeruginosa; multidrug resistance; Metallo-β-lactamase. Sumário 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1 2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 3 2.1 Microbiologia............................................................................................................... 3 2.1.1 Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa ......................................... 3 2.1.2 Acinetobacter baumannii ...................................................................................... 3 2.1.3 Pseudomonas aeruginosa ...................................................................................... 4 2.2 Bactérias Multirresistentes ........................................................................................... 4 2.3 Genes de Resistência.................................................................................................... 5 3 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 8 3.1 Objetivo Geral .............................................................................................................. 8 3.2 Objetivo Específico:..................................................................................................... 8 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 9 4.1 Delineamento do estudo ............................................................................................... 9 4.2 Procedimentos éticos ................................................................................................... 9 4.3 Local do estudo ............................................................................................................ 9 4.4 População e Amostra ................................................................................................. 10 4.5 Coleta de dados .......................................................................................................... 10 4.5.1 Instrumento de coleta de dados ........................................................................... 10 4.6 Identificação da amostra e teste de susceptibilidade ao antimicrobiano.................... 11 4.7 Identificação dos genes de resistência ....................................................................... 11 4.7.1 Teste fenotípico ................................................................................................... 12 4.7.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ............................................................. 12 4.8 Processamento e análise dos dados ............................................................................ 15 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................... 16 6 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 26 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 27 APÊNDICE A...................................................................................................................... 35 APÊNDICE B ...................................................................................................................... 37 1 1 INTRODUÇÃO Nos diversos setores do hospital, principalmente na unidade de terapia intensiva (UTI) encontram-se pacientes críticos, com várias comorbidades, imunossuprimidos e em uso de vários dispositivos invasivos, como cateteres e tubos (HERNÁNDEZ – GÓMEZ et al., 2014). Com isso estes ficam mais susceptíveis a adquirir infecção (CURCIO, 2011). Nos últimos anos houve aumento mundial no número de microrganismos multirresistentes aos antimicrobianos, principalmente os gram-negativos como Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa. (ROTH; HANSON et al., 2013; SOLTANI et al., 2014). Estes causam grande impacto nos hospitais (VILLEGAS et al., 2011) e são os principais responsáveis pelas infecções, a exemplo da sepse, pneumonia, infecção das vias urinárias, bem como no pós-cirúrgico (HUI et al., 2014). As altas taxas de infecção causada por esses microrganismos são responsáveis pela elevada morbidade (GUEVARA; WAARD; ARAQUE et al., 2009), mortalidade que pode chegar a uma taxa de 50 % (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2013; TUMBARELLO et al., 2012), falência da terapia medicamentosa, aumento do período de internação e consequentemente impacto financeiro no sistema de saúde (ROBLEDO; AQUINO; VÁZQUEZ, 2011). No mercado estão disponíveis diversas classes de antimicrobianos utilizados no tratamento do paciente com quadro infeccioso. Os carbapenêmicos configuram a principal escolha no tratamento de microrganismo multirresistentes, no entanto, o surgimento de cepas resistentes a esta classe de antibióticos, torna o cenário um problema de saúde pública e a instituição do tratamento um desafio (WIRTH et al., 2009). O uso inadequado de antimicrobianos é considerado um dos principais fatores que contribuem para o surgimento dessas cepas multirresistentes e a dificuldade de detectar nas bactérias as causas intrínsecas de resistência aos carbapenêmicos elevam as taxa de mortalidade. (ROTH; HANSON, 2013). As bactérias resistentes aos carbapenêmicos usam como principal mecanismo de resistência a produção de enzimas denominadas carbapenemases (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2013). No Brasil e em outros países são encontradas algumas classes de carbapenemases, como as oxacilinases (POLOTTO, et al., 2012). No nosso país, já foram detectados os genes em Pseudomonas aeruginosa dos tipos blaIMP, 2 blaVIM, blaSPM (JÁCOME et al., 2012) e blaKPC (RIZEK et al., 2014). Quanto a Acinetobacter baumannii, estudos comprovam a presença das oxacilinases dos tipos blaOXA-23 e blaOXA-51. (GUSATTI et al., 2012). Devido a elevada frequência de cepas de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos nos hospitais do nosso país (HERNÁNDEZ – GÓMEZ et al., 2014) e o impacto causado por essas, é necessário detectar as mudanças que favorecem o surgimento destas bactérias (HUI et al., 2014). Diante do exposto, se justifica a importância de detectar os genes de resistência de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes e caracterizar clinicamente os pacientes em hospital público, a fim de traçar um perfil destes e consequentemente contribuir para redução da disseminação dessas bactérias no ambiente hospitalar. 3 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Microbiologia 2.1.1 Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa Dentre as características apresentadas pelas bactérias Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa destacam-se aquelas comuns às duas espécies, pois ambas são gram-negativas, não fermentadoras, encontradas abundantemente no ambiente hospitalar e outros locais da natureza. Possuem mecanismos que possibilitam a sobrevivência em locais, temperaturas e pH variados (FIGUEIREDO et al., 2009). 2.1.2 Acinetobacter baumannii Trata-se de uma bactéria da família Moraxellaceae, estritamente aeróbia. Acinetobacter baumannii é a espécie mais importante clinicamente, sendo responsável por diferentes tipos de infecções, especialmente em pacientes imunocomprometidos, sendo considerado um patógeno oportunista de grande importância nas infecções nosocomiais (GIAMARELLOU; ANTONIADOU; KANELLAKOPOULOU, 2008; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Podemos citar três mecanismos de colonização que aparentam estar relacionados a persistência dessa bactéria no ambiente hospitalar: resistência a antimicrobianos, resistência a desinfetantes e capacidade de sobreviver por longos períodos em ambientes secos (MARTINS; BARTH, 2013; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). A formação de biofilme facilita a adesão bacteriana tanto nos cateteres e tubos de ventilação mecânica, como também nas células hospedeiras. Essa adesão é propiciada pela interação entre os pili bacterianos e o lipopolissacarídio (LPS) (JOLY-GUILLOU, 2005). 4 2.1.3 Pseudomonas aeruginosa É uma bactéria gram-negativa versátil, capaz de formar biofilmes em superfícies úmidas. Seu recente destaque como importante agente patogênico humano oportunista pode estar associado à resistência aos antimicrobianos e aos desinfetantes (STOVER et al., 2000). Esse microrganismo possui uma série de fatores de virulência que irão desencadear sua patogenicidade, como o flagelo, o pili, o LPS e alginato que atuam como adesinas, facilitando a adesão às células do hospedeiro. O alginato forma também uma cápsula protetora, que dificulta a fagocitose e a ação dos antimicrobianos. Destacam-se também a piocianina, a pioverdina, a serino protease (LasA), zinco metaloprotease (LasB), protease alcalina, fosfolipase C e exoenzimas S e T. A injeção dessas toxinas é potencializada pelo sistema de secreção do tipo III, presente na P. aeruginosa. (JÁCOME et al., 2012). 2.2 Bactérias Multirresistentes A escolha do antimicrobiano para o tratamento de uma infecção causada por Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii multirresistentes está diretamente relacionada ao profundo conhecimento do microrganismo causador de diversas infecções hospitalares (CORTES et al., 2013). Estas são as principais causas de morte em pacientes internados nas Unidades de Terapia Intensiva (UTI) (POZA et al, 2012). Dentre os medicamentos administrados nas unidades de terapia intensiva (UTI) destacam-se os antimicrobianos, pois são utilizados dez vezes mais que os demais setores do hospital (CURCIO, 2011). No entanto, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii possuem fatores de virulência, possibilitando a resistência a diversas classes de antibióticos utilizados no tratamento (WIRTH et al., 2009). Nos últimos anos foram identificadas com mais frequência as bactérias gramnegativas Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistentes a imipenem e meropenem que são betalactâmicos de amplo espectro e principais drogas de escolha para tratamento. (ROBLEDO; AQUINO; VÁZQUEZ, 2011; RAMOS et al., 2012). Estudo epidemiológico realizado pelo SENTRY em 12 hospitais de quatro estados brasileiros revelou que Pseudomonas aeruginosa apresentou 30,2% de resistência ao 5 imipenem. Já um estudo realizado pelo MISTYC mostrou uma taxa de 36,6% de resistência ao antibiótico. Outro estudo realizado nas regiões sul e centro-oeste revelam taxas maiores de resistência com 58,9% e 82,7%, respectivamente (NEVES et al., 2011). Alguns mecanismos são responsáveis pela resistência das bactérias ao imipenem e meropenem, como perda de porinas, superexpressão de bomba de efluxo, presença de proteínas de ligação às penicilinas (PBS) com baixa afinidade para os carbapenêmicos e hidrólise enzimática. As bactérias podem apresentar naturalmente esses mecanismos de resistência ou podem adquirir através de troca de material genético entre elas. (NEVES et al., 2011) Para minimizar o impacto causado pelas bactérias Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, que são responsáveis pelas infecções hospitalares, demandando progressivo desenvolvimento de novas drogas para vencer os mecanismos de resistência, é fundamental entender os aspectos que contribuem para a multirresistência desses patógenos. (ALEMAYEHU et al., 2012). 2.3 Genes de Resistência Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa desenvolvem diversos mecanismos de resistência aos antimicrobianos, principalmente aos carbapenêmicos. (GUEVARA; WAARD; ARAQUE, 2009). Dentre os mecanismos de resistência a esta classe de antibiótico está a produção de enzimas metalo-β-lactamases (MBL) ou carbapenemases codificadas por genes presentes nas bactérias (MACHADO et al., 2011). De acordo com o estudo do arranjo genético das bactérias é possível determinar a localização dos genes responsáveis pela produção das MBL e averiguar as características estruturais destas enzimas. (GUEVARA; WAARD; ARAQUE, 2009; FUENTEFRIA et al., 2009). Na América Latina, o Brasil se destaca pela alta prevalência de bactérias produtoras de metalo-β-lactamases. O país foi responsável, entre 1997-2001, por 70% de cepas de Pseudomonas aeruginosa produtoras destas enzimas (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008). As MBL podem ser divididas em subclasses de A a D, destacando-se a produção de beta lactamases do tipo D, no qual as oxacilinases fazem parte (OPAZO et al., 2012). 6 A literatura relata quatro famílias do gene OXA, como bla OXA-23, bla OXA-24; bla OXA51 e por fim o gene bla OXA-58 (AMUDHAN et al., 2011; MARTINS et al., 2013). Estes genes quando expressos indicam alta resistência da bactéria, como resultado da associação com elementos móveis (ISAba1), responsável pelo transporte de um promotor forte (FONSECA et al., 2013). Além da subclasse D, também já foi detectado em cepas de Acinetobacter baumannii carbapenemases da subclasse D, como IMP, VIM e SIM. Estas são codificadas pelos genes blaIMP, blaVIM, blaSIM, respectivamente. Além de A. baumannii, os genes blaIMP, blaVIM foram encontradas em P. aeruginosa (MENDES et al., 2007). Pseudomonas aeruginosa pode ter mecanismos intrínsecos de resistência a diversas classes de antibióticos, no entanto também pode adquirir esta resistência através da transferência de genes ou até por mutação cromossômica (VOOR IN ‘T HOLT et al., 2014). A produção de metalo-beta-lactamases por essas bactérias recebe destaque, visto que estão associadas às elevadas taxas de infecção hospitalar e resistência aos carbapenêmicos (SANTOS, BREZOLIN, HORNER, 2014). Na literatura está descrito nove subclasses de metalo-beta-lactamases da subclasse B, como a imipenemases (IMP-1), verona imipenemase (VIM-1), São Paulo metalo-betalactamase (SPM-1), GIM-1 (German imipenemase), SIM-1 (Seoul imipenemase), AIM-1 (Australian imipenemase) KHM-1 (Kyorin Hospital metallo-β-lactamase), NDM-1 (New Delhi metallo-β lactamase) e DIM-1 (Dutch imipenemase) (JÁCOME et al., 2012). Estas subclasses foram identificadas em diversos países, como a IMP descrita pela primeira vez no Japão; VIM detectada na Itália; GIM identificada em Pseudomonas aeruginosa nos hospitais da Alemanha; Seoul imipenemase (SIM-1) isolada de amostras de Acinetobacter baumannii; Australian imipenemase (AIM) descrita em 2007 na Austrália. No Brasil, em 1997, foi identificada no Hospital São Paulo da Universidade Federal de São Paulo (HSP/UNIFESP) a SPM-1 em Pseudomonas aeruginosa (FIGUEIREDO et al., 2009). Também está descrito na literatura as MBL PIM-1 (imipenemase), KHM- 1 (Hospital Kyorin metalo-beta-lactamase), NDM-1 (Nova Deli metalo-beta-lactamase) e DIM (imipenemase holandês) (JÁCOME et al., 2012). Os genes blaSPM, blaVIM e blaIMP são amplamente disseminadas no Brasil e o blaSPM parece estar restrito ao nosso país (MACHADO et al., 2011). Estudos demonstram sua detecção em isolados na região Nordeste, como na cidade de Salvador (BA) e Fortaleza (CE); região Sudeste na cidade de São Paulo (SP) e Santo André (SP); região Centro-oeste 7 na cidade de Brasília (DF) e região Sul nas cidades de Londrina, Curitiba e Maringá (GALES et al., 2003). Já o gene blaVIM foi detectado na cidade de São Paulo e o gene bla IMP nas cidades de Brasília, São Paulo, Rio de Janeiro e Porto Alegre (FIGUEIREDO et al., 2009). A KPC se configura como uma carbapenemase do grupo A e apesar de ser comumente detectada em Enterobactérias, foi identificado o gene blaKPC em Pseudomonas aeruginosa (VANEGAS et al., 2014). Diversos estudos são realizados objetivando ampliar o conhecimento acerca dos genes de resistência presentes nestas bactérias multirresistentes, no entanto os dados ainda são escassos (RAMIREZ et al., 2014). 8 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Detectar os genes de resistência presentes nas bactérias Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenêmicos, caracterizando clinicamente os pacientes. 3.2 Objetivo Específico: Avaliar as diferenças clínicas entre os isolados de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa, referentes a: uso de dispositivos invasivos, sítios de isolamento, distribuição por setores do hospital, antimicrobianos usados, perfil de sensibilidade e desfecho 9 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Delineamento do estudo Trata-se de um estudo analítico de coorte prospectiva e abordagem quantitativa para detecção dos genes de resistência em cepas de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos e as características clínicas dos pacientes dos quais os isolados foram obtidos. 4.2 Procedimentos éticos Inicialmente o projeto foi cadastrado na Plataforma Brasil e encaminhado ao Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de Sergipe (UFS), seguindo as normas que regulamentam a realização de pesquisas envolvendo seres humanos (CNS, 2012). O diretor do hospital participante do estudo foi devidamente esclarecido sobre a pesquisa, direito e cuidados a ele garantido. Após concordância em participar do estudo o mesmo assinou o termo (Apêndice A). Para a coleta dos dados utilizamos um instrumento com perguntas estruturadas (Apêndice B). Eventuais esclarecimentos foram feitos pela pesquisadora quando solicitado. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Sergipe sob cadastro nº 37689614.4.0000.5546. 4.3 Local do estudo O estudo foi desenvolvido no Hospital de Urgência de Sergipe Governador João Alves Filho (HUSE). Trata-se do maior hospital do Estado composto por 13 alas de internação e capacidade física instalada de 421 leitos. Também faz parte da sua estrutura a 10 Unidade de Terapia Intensiva – UTI adulto I e II e o Centro de Tratamento Intensivo Pediátrico (CTI Pediátrica), totalizando 64 leitos, além de centro cirúrgico e de emergência de adultos e pediatria. Conta ainda com unidades de tratamento de queimados e hematooncologia. As culturas dos pacientes internados foram realizadas em laboratório próprio de microbiologia do HUSE, equipado com sistema automatizado Vitek 2 compact (Fabricante bioMérieux). 4.4 População e Amostra A população do estudo foi obtida das culturas positivas para as bactérias nãofermentadoras Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos isoladas consecutivamente de pacientes internados no hospital, sendo incluída na pesquisa apenas uma amostra de cada bactéria por paciente. A espécie e a resistência aos carbapenêmicos foi definida através do equipamento automatizado Vitek 2 compact (Fabricante bioMérieux), com confirmação fenotípica através de Etest® (Fabricante bio Mérieux). 4.5 Coleta de dados A coleta de dados foi realizada nos meses de novembro de 2014 a julho de 2015 após aprovação do CEP e assinatura do termo de autorização pelo diretor da Instituição que fez parte da pesquisa. 4.5.1 Instrumento de coleta de dados Os dados dos pacientes foram coletados em um formulário de pesquisa especificamente elaborado (Apêndice B). As informações clínicas foram obtidas da ficha de 11 vigilância epidemiológica de infecções relacionadas a assistência à saúde utilizada pela Serviço de Controle de Infecção Hospital (SCIH) do HUSE para identificação de casos de infecção hospitalar nas diversas topografias segundo a metodologia NHSN (CDC-USA). As informações reunidas de cada paciente com isolamento de Acinetobacter baumannii ou Pseudomonas aeruginosa foram agrupadas como segue-se: dados demográfico – idade, sexo; data de admissão no hospital, data de admissão na UTI (para aqueles que estavam internados nesse setor) e procedência. Dados clínicos e epidemiológicos – setor de internação, diagnóstico de admissão, uso de dispositivos invasivos; uso de antibiótico. Dados dos isolados – bactéria isolada; perfil de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos e sítio de isolamento. Desfecho do paciente (Apêndice B). 4.6 Identificação da amostra e teste de susceptibilidade ao antimicrobiano A identificação e o teste de sensibilidade aos antimicrobianos foram realizados através de equipamento automatizado Vitek 2 compact (Fabricante bioMérieux) utilizando os cartões GN, AST N238 e N239. O equipamento Vitek 2 compact possui um sistema constituído por computador, leitor/incubadora, sendo capaz de identificar e realizar teste de sensibilidade em bactérias gram-negativas, bactérias gram-positivas e leveduras. Opera em faixa de temperatura ambiente (15°C a 30°C) e possui a capacidade de 15, 30 ou 60 cartões. O equipamento foi desenvolvido para fornecer resultados em poucas horas (até 5 horas). Testes adicionais fenotípicos confirmatórios do perfil de sensibilidade através de Etest® (Fabricante bio Mérieux) foram realizados para confirmar a resistência aos carbapenêmicos. 4.7 Identificação dos genes de resistência Os isolados positivos para Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos identificados pelo Vitek 2-compact foram repicados e cultivados em placas agar sangue, cled, MacConkey e agar chocolate, separados pelo 12 Laboratório de Microbiologia do HUSE e fornecidos à pesquisadora. O laboratório possui instalações e equipe qualificada para realização dos ensaios. As placas foram preservadas em um isopor com gelo e transportadas para a Universidade Federal de Sergipe-UFS. Uma alíquota da colônia de bactéria foi armazenada em um tubo cônico de 1,5 ml contendo o meio de cultura LB broth e glicerol e realizado triplicata. Posteriormente as amostras foram estocadas no freezer menos 80 graus (imortalizadas), 4.7.1 Teste fenotípico A resistência aos carbapenêmicos foi detectada fenotipicamente através da fita Etest® MBL IP/IPI. Esta consiste em um gradiente predefinido, estável, contendo 15 concentrações de antimicrobianos em uma tira de plástico. Trata-se de uma ferramenta simples, baixo custo, oferece resultados precisos e apresenta alta sensibilidade e especificidade. Após sua incubação foi realizado a leitura das placas através da MIC, menor concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano. Com isso, as amostras foram classificadas como resistentes ou sensíveis aos antimicrobianos. Os isolados eram selecionados quando apresentavam resistência aos antimicrobianos imipenem e meropenem. 4.7.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) As cepas de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni com triagem positiva para resistência aos carbapenêmicos pelo Etest® e Vitek 2-compact foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para pesquisa dos genes de resistência. O procedimento foi realizado no laboratório 24 Multiusuário, Departamento de Morfologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Sergipe (UFS), São Cristóvão-Sergipe. 13 O laboratório 24 multiusuário é constituído de uma área de 40 m², possui infraestrutura para armazenagem de amostras no freezer -80º C, além de dois freezers, um micro-ondas, duas centrífugas, dois microscópios e um banho-maria. Para a extração do DNA, inicialmente, as cepas foram retiradas do freezer -80º C e cultivadas no meio Extrato de carne (Kasvi®) e incubadas por 24 horas (37º C). Posteriormente foram centrifugadas, obtido o pellet e utilizado o kit Purelink genomic DNA mini kit (Invitrogen®) para extração do DNA. Estes foram quantificados e estocados no freezer -20º C para procedimentos posteriores. Para detecção do gene blaVIM, blaIMP, blaSPM em Pseudomonas aeruginosa foi desenvolvida a técnica multiplex PCR. Quanto ao gene blaKPC foi utilizada a técnica PCR específico. Os oligonucleotídeos utilizados estão descritos conforme demonstra a Tabela 1. Tabela 1: Sequência de primers utilizados para o multiplex PCR e PCR específico para detecção dos genes de resistência em isolados de Pseudomonas aeruginosa. Primer Sequência VIM-F 5’GTCTATTTGACCGCGTC 3’ VIM-R 5’ CTACTCAACGACTGAGCG 3’ IMP-F 5’ ATGAGCAAGTTATCTGTATTC 3’ IMP-R 5’GTCGCAACGACTGTGTAG 3’ SPM-F 5’ CCTACAATCTAACGGCGACC 3’ SPM-R 5’ TCGCCGTGTCCAGGTATAAC 3’ KPC-F CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG KPC-R CTTGTCATCCTTGTTAGGCG pb Referência 775 TOLEMAN et al., 2002 580 TOLEMAN et al., 2002 650 GALES et al., 2003 798 POIREL et al., 2011 As reações de amplificação foram preparadas no volume total de 50μƖ por tubo, compreendendo: 0,25 µM de cada primer, 20ng de DNA e 25 microlitros de PCR Master Mix (Ampliqon®). Os parâmetros utilizados para o multiplex PCR foram: Inicialmente 95 graus por 5 minutos, em seguida desnaturação (35 ciclos) - 95 graus durante 1 minuto, anelamento na temperatura de 40 graus por 1 minuto e extensão de 72 graus por 1 minuto (CEZÁRIO et al., 2009). Para o PCR específico foram utilizados os seguintes parâmetros: 94º por 10 minutos, 36 ciclos de amplificação (94º por 30 segundos, 52º por 40 segundos e 72º por 50 segundos) e extensão na temperatura de 72º por 5 minutos (POIREL et al., 2011). 14 Para detecção dos genes blaOXA-24, blaOXA-23, blaOXA-51 e blaOXA-58, blaVIM, blaIMP e blaSIM em cepas de Acinetobacter baumannii também foi realizada a técnica multiplex PCR, conforme apresentado na tabela abaixo (Tabela 2). Tabela 2: Sequência de primers utilizados para o multiplex PCR para detecção dos genes de resistência em isolados de Acinetobacter baumannii. Primer Sequência pb oxa-24-F 5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’ oxa-24-R 5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’ oxa-23-F 5’-GATCGGATTGGAGAACCAGA-3’ oxa-23-R 5’-ATTTCTGACCGCATTTCCAT-3’ oxa-51-F 5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’ oxa-51-R 5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’ oxa-58-F 5’-AAGTATTGGGGCTTGTGCTG-3’ oxa-58-R 5’-CCCCTCTGCGCTCTACATAC-3’ Imp-F 5’-GAATAGAATGGTTAACTCTC-3’ Imp-R 5’-CCAAACCACTAGGTTATC-3’ Vim-F 5’-GTTTGGTCGCATATCGCAAC-3’ VimR 5’-AATGCGCAGCACCAGGATAG-3’ Sim- F 5’-GTACAAGGGATTCGGCATCG-3’ Sim- R 5’-GTACAAGGGATTCGGCATCG-3’ Referência WOODFORD et al., 246 2006 WOODFORD et al., 501 2006 WOODFORD et al., 353 2006 WOODFORD et al., 599 2006 MENDES et al. 2007 188 MENDES et al. 2007 382 MENDES et al. 2007 569 As reações de amplificação foram preparadas no volume total de 50μƖ por tubo, compreendendo: 0,25 µM de cada primer, 20ng de DNA e 25 microlitros de PCR Master Mix (Ampliqon®). Foram estabelecidas as condições para o PCR: Inicialmente realizada a desnaturação em uma temperatura de 94 graus durante 5 minutos, 33 ciclos de 94 graus por 25 segundos, 53 graus por 40 segundos e 72 graus por 6 minutos (MOSTACHIO et al., 2009). Como controles positivos foram incluídas as cepas CCBH 16841 (Pseudomonas aeruginosa produtora do gene blaSPM) e a cepa de Acinetobacter baumannii CCBH 3174, produtora dos genes bla OXA-23 e bla OXA-51. Para o controle negativo foi utilizado água e o mesmo foi realizado em todas as reações de PCR. 15 Os produtos de PCR foram corados com brometo de etídio e visualizados por eletroforese em gel de agarose (1% - Pseudomonas aeruginosa e 2% Acinetobacter baumannii). Posteriormente os produtos de PCR foram purificados, utilizando o Kit Purelink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo (Invitrogen®) e estocado para sequenciamento do DNA. 4.8 Processamento e análise dos dados Após a coleta de dados, foi construído um banco de dados utilizando o programa Excel versão 2010. Realizou-se uma análise descritiva univariada, procedendo-se à categorização dos dados extraídos dos estudos selecionados em grupos temáticos, onde foram obtidas medidas de tendência central (média) e de variabilidade (desvio padrão) das variáveis contínuas, e frequências e proporções para as variáveis categóricas. Também foram realizadas análises bivariadas, onde buscou-se verificar a existência de uma relação entre as diferentes variáveis observadas com o tipo bactéria observado (Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa). Nesta segunda etapa foram utilizados os testes de Qui-Quadrado (PEARSON, 1900) e Exato de Fisher (FISHER, 1922) como estatísticas de teste. Em todos os testes realizados foi adotado um nível de significância de 5% como limiar de decisão, e o software utilizado foi o R versão 3.1.2. 16 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES Foram obtidas 128 amostras de Acinetobacter e Pseudomonas resistentes aos carbapenêmicos de pacientes internados no Hospital de Urgência de Sergipe Governador João Alves Filho (HUSE). Oito isolados foram excluídos por ser cultura do mesmo paciente e uma por não confirmação da resistência aos carbapenêmicos quando aplicado o teste fenotípico (Etest®). No total, foram estudados 76 isolados positivos para Acinetobacter baumannii e 43 para Pseudomonas aeruginosa. As infecções causadas por bactérias multirresistentes estão difundidas em todo o mundo, com destaque para as não fermentadoras Acinetobacter baumanni e Pseudomonas aeruginosa. Trata-se de cenário preocupante, pois acarreta no aumento das taxas de morbimortalidade e consequentemente impacto no sistema de saúde (DALBEN et al., 2013; CARVALHO; FILHO, 2008). Esses patógenos são os principais causadores de infecções associadas à assistência à saúde, comumente isolados nas unidades de terapia intensiva (UTI) (OSSA-GIRALDO et al., 2014; KIM et al., 2013) e responsáveis pelo aumento do período de hospitalização (DALBEN et al., 2013). Nos hospitais, são os principais isolados e preponderam sobre as bactérias gram-positivas (VILLEGAS et al., 2011). Estudo realizado em um hospital terciário no sul do Brasil também demonstra que a maior taxa de isolados de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii multirresistentes encontrava-se neste setor. (MACHADO, 2011). As bactérias gram-negativas Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii destacam-se por sua rápida disseminação no ambiente hospitalar (HERNÁNDEZ – GÓMEZ et al., 2014). No Brasil, dentre os pacientes hospitalizados, um em cada dez é acometido por infecções causadas por bactérias multirresistentes (MORAES et al., 2013), atingindo adultos e crianças (ATTI et al., 2014). Estudo realizado pelo SENTRY em hospitais brasileiros revela que Pseudomonas aeruginosa é o terceiro microrganismos mais isolado de pacientes (NEVES et al., 2011). 17 Dos 76 pacientes acometidos por Acinetobacter baumannii, 59 era do sexo masculino (77,6%), com apenas três pacientes pediátricos; a média de idade de 44,4 anos. Cinquenta pacientes (65,8%) eram procedentes da unidade de terapia intensiva (UTI), 18 deles (23,7%) com diagnóstico de trauma crânio encefálico (TCE), com mediana de internamento de 30,5 dias (2 - 580) [Tabela 3]. Dos 43 pacientes em que foram isolados a Pseudomonas aeruginosa, 33 eram do sexo masculino (76,7%) e adultos, apenas três pacientes pediátricos, com idade média de 46,2 anos. Vinte e oito estavam internados na UTI (65,1%); 13 deles (30,2%) com diagnóstico de trauma crânio encefálico e mediana de internamento de 55 dias (5 - 112). Esta última variável foi estatisticamente significante entre as bactérias [Tabela 3]. Tabela 3: Avaliação comparativa dos dados demográficos e diagnósticos de admissão dos 119 pacientes com Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. HUSE, 2014-2015 Variável Sexo Masculino Idade (anos) / M (D.P.) Setor UTI Outros setores Duração da internação (dias) Mediana (variação) Diagnóstico clínico à admissão Trauma Crânio encefálico (TCE) Acidente Vascular encefálico (AVE) Politraumatismo Choque séptico Ferimento por arma de fogo (FAF) Queimadura Insuficiência Respiratória Crônica (IRC) Neoplasia Erisipela Infarto agudo do miocárdio Insuficiência respiratória aguda Abdomen agudo Outros M: média/ D.P: Desvio padrão A-Teste Qui-Quadrado B-Teste Exato de Fisher Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Valor p 33 (76,7%) 46,2 (21,9) 59 (77,6%) 44,4 (20,7) 1,00a 28 (65,1%) 15 (34,9%) 55 (5-112) 50 (65,8%) 26 (34,2%) 30,5 (2-580) 1,00a 0,007 13 (30,2%) 5 (11,6%) 3 (7,0%) 3 (7,0%) 1 (2,3%) 1 (2,3%) 5 (11,6%) 18 (23,7%) 13 (17,1%) 12 (15,8) 5 (6,6%) 5 (6,6%) 4 (5,3%) 4 (5,3%) 0,572a 0,593a 0,251b 1,000b 0,416b 0,652b 0,281b 1 (2,3%) 0 (0,0%) 1 (2,3%) 0 (0,0%) 2 (4,6%) 8 (18,6%) 2 (2,6%) 2 (2,6%) 2 (2,6%) 2 (2,6%) 0 (0,0%) 6 (7,9%) 1,000b 0,534b 1,000b 0,534b 0,129b 0,148a 18 Pseudomonas e Acinetobacter foram isoladas de todos os tipos de amostras corporais com frequências similares, exceto na urina para a Pseudomonas e secreção traqueal para o Acinetobacter. Só foi encontrada diferença estatisticamente significante entre as duas bactérias na urina (p = 0,015) [Tabela 4]. Tabela 4: Distribuição comparativa de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii por sítio de isolamento. HUSE, 2014-2015 Sítio Sangue Urina Ponta de cateter Aspirado traqueal Úlcera de pressão Ferida operatória Secreção – óstio GTT Fixador fêmur Secreção- abdômen Líquido Pericárdio Swab retal A-Teste Qui-Quadrado B-Teste Exato de Fisher Pseudomonas aeruginosa 4 (9,3%) 16 (37,2%) 7 (16,2%) 12 (27,9%) 0 (0,0%) 3 (6,9%) Acinetobacter baumannii 11 (14,4%) 12 (15,7%) 6 (7,8%) 32 (42,1%) 2 (2,6%) 9 (11,8%) Valor p 0,568b 0,015a 0,270a 0,179a 0,535b 0,533b 0 (0,0%) 1 (1,3%) 1.000b 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (2,3%) 1 (1,3%) 1 (1,3%) 1 (1,3%) 0 (0,0%) 1.000b 1.000b 1.000b 0,361b A Pseudomonas aeruginosa é responsável por diversas infecções hospitalares, como bacteremia, infecções do sistema urinário e infecções em soluções de continuidade (CEZÁRIO et al., 2009). O Acinetobacter baumanni também faz parte deste cenário, principal causador da pneumonia, bacteremia, meningite, infecção das vias urinárias, peritonite e infeções na pele (RAMOS et al., 2012). Corroborando com os dados encontrados na nossa pesquisa, estudo realizado com amostras de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii isoladas de pacientes internados em um hospital estadual do Rio de Janeiro, demonstrou que a maioria das amostras de Pseudomonas aeruginosa foi isolada da urina (48%) (FIGUEIREDO et al., 2009). Nos isolados de Acinetobacter baumannii, 25% dos isolados foram na urina e 20% no sangue (FIGUEIREDO et al., 2009), diferindo dos nossos resultados. Outro estudo desenvolvido em dois hospitais do sul do Brasil, mostrou uma taxa ainda maior - 50% das amostras de Pseudomonas aeruginosa foram obtidas da urina (WIRTH et al., 2009). Já na 19 pesquisa desenvolvida no Hospital Universitário de Santa Maria, o principal sítio de isolamento destas bactérias foi aspirado traqueal (SANTOS, BREZOLIN, HORNER, 2014). Os dispositivos invasivos foram muito utilizados, com frequências maiores que 70%, excetuando-se a gastrostomia e a nutrição parenteral. A sonda vesical foi o dispositivo mais usado nos pacientes com isolados de A. baumannii (93,4% - 71) e o cateter venoso central nos pacientes com P. Aeruginosa (93% - 40). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes para a frequência e razão de uso dos dispositivos invasivos utilizados pelos pacientes com Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa [Tabela 5]. Tabela 5: Distribuição comparativa de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa por frequência e razão de uso de dispositivo invasivo. HUSE, 2014-2015 Dispositivo Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Valor p Pseudomonas aeruginosa (RU) Acinetobacter baumannii (RU) Valor p 0,45 0,479a 0,43 0,54 0,471a 0,475a 0,59 0,240a 0,65 0,546a 0,11 0,193a 0,05 0,721b Ventilação 35 (81,3%) 60 (78,9%) 0,999a 0,51 mecânica Traqueostomia 32 (74,4%) 54 (71%) 0,856a 0,37 Sonda vesical 39 (90,6%) 71 (93,4%) 0,721b 0,60 Cateter venoso 40 (93%) 66 (86,8%) 0,372b 0,68 central Sonda 39 (90,6%) 69 (90,7%) 1,000b 0,70 nasoenteral Gastrostomia 5 (11,6%) 7 (9,2%) 0,917a 0,05 Nutrição 5 (11,6%) 9 (11,8%) 1,000a 0,03 parenteral A-Teste Qui-Quadrado B-Teste Exato de Fisher RU = razão de utilização (total de dispositivo-dia/total de pacientes-dia) A maioria dos pacientes internados com infecção causada pelas bactérias multirresistentes, apresenta deficiência do sistema imunológico, comorbidades e são submetidos constantemente a procedimentos invasivos, situações estas, que favorecem a instalação destes microrganismos (HERNÁNDEZ – GÓMEZ et al., 2014). Diversas drogas são recomendadas no tratamento de infecções causadas por cepas de Acinetobacter baumannii multirresistentes, dentre elas estão a polimixina, os aminoglicosídeos e tigeclicina. Esta última é considera uma droga mais recente e pode ser 20 indicada eventualmente como primeira opção para tratamento dessas cepas (CHOPRA et al., 2013). Pacientes acometidos por infecções causadas pelas bactérias multirresistentes recebem frequentemente terapêutica com carbapenêmicos, tais como o doripenem, ertapenem, imipenem e meropenem (JÁCOME et al., 2014, CHOPRA et al., 2013). O presente estudo confirma o frequente uso dos antibióticos carbapenêmicos durante a internação. Todos os pacientes positivos para Pseudomonas aeruginosa usaram carbapenêmicos (100%); e 98,6% dos pacientes portadores de Acinetobacter baumannii. Não houve diferença estatística na utilização desta classe de antibióticos entre os grupos. Já para outras classes de antibióticos - aminoglicosídeos, cefalosporinas de 3ª geração e tigeciclina, foi encontrada diferença estatisticamente significante [Tabela 6]. Tabela 6: Uso de antimicrobianos observado ao longo da internação de pacientes com isolados positivos para Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. HUSE, 20142015 Antimicrobianos Aminoglicosídeos Oxacilina + cefalosporinas 1ª geração Cefalosporinas 3ª geração Quinolona Glicopeptídeos Carbapenêmicos Polimixina Tigeciclina A-Teste Qui-Quadrado B- Teste Exato de Fisher Pseudomonas aeruginosa 41(95,3%) Acinetobacter baumannii 59 (77,6%) Valor p 0,017b 4 (9,3%) 15 (19,7%) 0,193b 22 (51,1%) 10 (23,2%) 29 (67,4%) 43 (100%) 24 (55,8%) 5 (11,6%) 58 (76,3%) 20 (26,3%) 37 (48,6%) 75 (98,6%) 35 (46%) 23 (30,2%) 0,009a 0,881a 0,074a 1,000b 0,405a 0,038a Nos pacientes com isolados de Acinetobacter baumannii, quando comparado o uso das classes de antimicrobianos ao longo da internação, verificou-se que os carbapenêmicos foram os mais utilizados no tratamento dos pacientes não importando se estivessem em unidades de terapia intensiva ou não. [Tabela 7] 21 Tabela 7: Comparação do uso de antimicrobianos em pacientes positivos para Acinetobacter baumannii de amostras obtidas das UTIs versus demais setores do HUSE, em 2014-2015. Antimicrobianos Aminoglicosídeos Oxacilina + cefalosporinas 1ª geração Cefalosporinas 3ª geração Quinolona Glicopeptídeos Carbapenêmicos Polimixina Tigeciclina A- Teste Qui-Quadrado B-Teste Exato de Fisher UTI 38 (76%) 8 (16%) 38 (76%) 10 (20%) 27 (54%) 43 (86%) 27 (54%) 17 (34%) NÃO UTI 22 (84,6) 7 (26,9%) 20 (76,9%) 10 (38,4%) 10 (38,4%) 24 (92,3%) 8 (30,7%) 6 (23%) Valor p 0,555b 0,406a 1,000a 0,144a 0,296a 0,710b 0,091a 0,471a Já na análise destas mesmas variáveis em Pseudomonas aeruginosa demonstrou que houve diferença estatisticamente significante para o uso da oxacilina e cefalosporinas de 1ª geração, cefalosporinas de 3ª geração e polimixina [Tabela 8]. Tabela 8: Comparação do uso de antimicrobianos em pacientes positivos para Pseudomonas aeruginosa de amostras obtidas das UTIs versus demais setores do HUSE, em 2014-2015. Antimicrobianos Aminoglicosídeos Oxacilina + cefalosporinas 1ª geração Cefalosporinas 3ª geração Quinolona Glicopeptídeos Carbapenêmicos Polimixina Tigeciclina A-Teste Qui-Quadrado B-Teste Exato de Fisher UTI 25 (89,2%) 0 (0,0%) 15 (53,5%) 6 (21,4%) 22 (78,5%) 28 (100%) 21 (75%) 4 (14,2%) NÃO UTI 15(100%) 4 (26,6%) 7 (46,6%) 4 (26,6%) 7 (46,6%) 14 (93,3%) 3 (20%) 1 (6,6%) valor p 0,541b 0,011b 0,012a 0,719b 0,074a 0,349b 0,001b 0,643b As bactérias resistentes aos carbapenêmicos, como a Pseudomonas aeruginosa tornaram-se um problema mundial, acarretando diminuição das opções terapêuticas (VILLEGAS et al, 2011). Com isso, antibióticos que causam elevada toxicidade, a exemplo das polimixinas, começam a ser utilizados no tratamento do paciente (TAKAGI, et al., 2009; SANTOS, BREZOLIN, HORNER, 2014). Uma revisão sistemática e meta-análise demonstraram que o uso de carbapenêmicos e dispositivos invasivos são os principais fatores de risco para resistência a esta classe de 22 antibiótico em cepas de Pseudomonas aeruginosa. Além disso, também se configuram como fatores de risco o uso de vários antibióticos e admissão na UTI (VOOR IN ‘T HOLT et al., 2014). A avaliação da susceptibilidade das bactérias aos antimicrobianos testados no isolados mostrou que todos as amostras de A. baumannii e P. aeruginosa apresentaram sensibilidade à colistina, com variação da MIC entre < = 0,5 e 2. Já para a ceftazidima nossos achados foram muito ruins – apenas 20,9% (9) das Pseudomonas aeruginosa e 1,3% (1) dos Acinetobacter baumannii foram sensíveis [Tabela 9]. Estes achados diferiram de pesquisa realizada em cinco hospitais da cidade de Recife em que a maioria das cepas foram sensíveis à ceftazidima (JÁCOME et al., 2012). O mesmo foi relatado para piperacilina/tazobactam em um hospital universitário de Santa Catarina – alta sensibilidade (96,7%) para as Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos. Neste mesmo estudo, as cepas apresentaram sensibilidade a cefepima (6%), ciprofloxacina (10%), amicacina (16,7%) e 43% à ceftazidima (SCHEFFER et al., 2010). Tabela 9: Comparação da sensibilidade aos antimicrobianos testada dos isolados de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii obtidos de pacientes internados no HUSE, 2014-2015. Antimicrobiano Pseudomonas aeruginosa Colistina 43 (100%) Amicacina 16 (37,2%) Ceftazidima 9 (20,9%) Ciprofloxacina 6 (13,9%) Cefepima 5 (11,6%) Gentamicina 6 (13,9%) Piperacilina/Tazobactam 2 (4,6%) Tigeciclina Ampicilina/Sulbactam Ceftriaxona - Variação da MIC < = 0,5 - 2 < = 2 - 16 4-8 < = 0,25 – 0.5 2–8 <=1-4 8 - Acinetobacter baumannii 76 (100%) 38 (50%) 1 (1,3%) 4 (5,2%) 2 (2,6%) 45 (59,2%) 52 (68,4%) 15 (19,7%) 2 (2,6%) Variação da MIC < = 0,5 - 2 < = 2 - 16 4 < = 0,25 2-8 <=1-4 < = 0,5 - 2 <=2-8 8 Diante do exposto é fundamental conhecer o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, visto que o aumento das taxas de resistência aos carbapenêmicos reflete na escolha de outras opções, considerando que são poucas, para tratamento dos pacientes- fonte (SANTOS, BREZOLIN, HORNER, 2014), a exemplo da colistina (NEVES et al., 2011). A maioria (55,8% - 24) dos pacientes com Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii (52,6% - 40) foram a óbito, demonstrando assim a gravidade do quadro 23 apresentado pelos pacientes quando isolados com estas bactérias. Não houve diferença estatisticamente significante (p=0,888). Dentre as 76 cepas de Acinetobacter baumannii, 75 (98,6%) apresentaram genes de resistência do tipo blaOXA [Figura 1]. Dezoito foram positivos apenas para o gene blaOXA-51 (23,6%), uma cepa para o gene blaOXA-23 (1,3%) e 56 (73,6%) apresentaram concomitantemente os dois genes. blaOXA-23 501pb blaOXA-51 353pb Figura 1: Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio. Produtos de amplificação por PCR em DNA de amostras de A. baumannii. Poço 1: Peso molecular (PM); Poços 2-17 amostras; Poço 18: Controle negativo; Poço 19: Controle positivo (CCBH 3174); Poço 20: Controle negativo. Diferente da nossa pesquisa, estudo realizado com cepas de Acinetobacter baumannii coletadas durante Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP), todas apresentavam o gene blaOXA-51, enquanto que o gene blaOXA-23 em 94,4% das cepas (KIM et al., 2013). O gene blaOXA-23 é amplamente disseminada no mundo, visto que foi detectado no Brasil, Argentina, Colômbia, Estados Unidos, Europa, Austrália, China e Coreia (OPAZO et al., 2012). É encontrada em elementos móveis do Acinetobacter baumannii e acredita-se ser um fator intrínseco (TEIXEIRA et al., 2013). Também merece destaque o gene blaOXA-51, pois assim como o blaOXA-23, também já foi detectado em vários países como a Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Colômbia e Venezuela (OPAZO et al., 2012). Este gene pode estar localizado nos cromossomos (LEE et al., 2012; TEIXEIRA et al., 2013) ou nos plasmídeos, possibilitando desta forma a sua transmissão para outras cepas (ANTUNES et al., 2014). Diferente do gene blaOXA-23, a presença do blaOXA-51 está associado à resistência aos carbapenêmicos (TEIXEIRA et al., 2013). 24 Dentre as 43 cepas de Pseudomonas aeruginosa, 28 (65,1%) apresentaram o gene blaSPM [Figura 2], uma o blaVIM (2,3%) e uma (2,3%) cepa o gene blaSPM e blaKPC [Figura 3] concomitantemente. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 blaSPM 650pb Figura 2: Eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio. Produtos de amplificação por PCR em DNA de amostras de P. aeruginosa. Poço 1: Peso molecular (PM); Poços 2-13 amostras; Poço 14: Controle negativo; Poço 15: Controle positivo (CCBH 16841). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 blaKPC 798pb Figura 3: Eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio. Produtos de amplificação por PCR em DNA de amostras de P. aeruginosa. Poço 1: Peso molecular (PM); Poços 2-22 amostras; Poço 23: Controle negativo; Poço 24: Controle positivo. Estudo realizado com 27 cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas de crianças internadas em um hospital terciário da Itália, detectou duas cepas produtoras de metalo-betalactamases, ocasionado pela presença do gene blaVIM. (ATTI et al., 2014), corroborando assim como nosso estudo, visto que uma cepa (2,3%) apresentou este gene. 25 Outra pesquisa desenvolvida com 29 cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas em cinco hospitais públicos em Recife revela que a maioria apresentou o gene blaSPM. Já os genes blaVIM e blaIMP não foram detectados (JÁCOME et al., 2012). Resultado semelhante foi encontrado em estudo realizado no Instituto de Oncologia Pediátrica da UNIFESP (FERNANDES, 2010), já que também não foi detectado o gene blaVIM. Corroborando com nosso estudo, pesquisa realizada com 29 cepas de Pseudomonas aeruginosa do Hospital Universitário de Santa Catarina demonstrou a prevalência do gene blaSPM nas amostras (SCHEFFER et al., 2010). No nosso estudo uma cepa (2,3%) foi detectada com dois genes concomitantemente, blaSPM e blaKPC. Durante um surto na unidade de transplante de medula, localizado na cidade de São Paulo, foi descrito novo clone que carreava estes dois genes. Além do Brasil, o gene blaKPC já foi encontrado na Argentina e Irã, demonstrando dessa forma a facilidade de disseminação deste mecanismo de resistência (RIZEK et al., 2014). Corroborando com nossa pesquisa, estudo realizado pelo Instituto Central do Hospital das Clinicas de São Paulo demonstrou predominância do gene blaSPM, no entanto também foi encontrado o gene blaKPC. Este estudo foi realizado com 129 cepas de Pseudomonas aeruginosa, entretanto 79 não apresentaram genes de resistência (RIZEK et al., 2014). O presente estudo selecionou bactérias resistentes aos carbapenêmicos, no entanto os genes de resistência não foram detectados em 14 cepas (32,5%) de Pseudomonas aeruginosa. Provavelmente isso aconteceu porque estas bactérias podem estar utilizando outros mecanismos de resistência como a perda ou alteração de porinas ou superexpressão de bombas de efluxo (LUYT et al., 2014; VOOR IN ‘T HOLT et al., 2014) ou até mesmo carrear gene não investigado no estudo. Outra possibilidade é a presença de carbapenemase ainda não identificada (RIZEK et al., 2014). 26 6 CONCLUSÕES O Acinetobacter baumannii foi mais frequente do que a Pseudomonas aeruginosa nos isolados de pacientes internados no HUSE no período de estudo, sem diferenças entre áreas intensivas e não intensivas. Houve predomínio significante da Pseudomonas aeruginosa na urina e do Acinetocabter baumannii na secreção traqueal. Os antimicrobianos da classe dos carbapenêmicos foi ampla e similarmente utilizado ao longo da internação dos pacientes com isolados de P. aeruginosa e A. baumannii nos diversos setores do hospital. No entanto, houve diferença significante entre as bactérias quanto ao uso dos aminoglicosídeos, cefalosporinas de 3ª geração e tigeciclina. Todos os isolados apresentaram sensibilidade à colistina (MIC < = 0,5 – 2). A maioria das cepas de Pseudomonas aeruginosa apresentaram gene de resistência blaSPM e Acinetobacter baumannii os genes blaOXA-23 e blaOXA-51 concomitantemente. A mortalidade dos pacientes com Acinetobacter e Pseudomonas foi superior a 50%, não havendo diferença significante entre os isolados. 27 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Nota técnica nº 01/2013Medidas de prevenção e controle de infecções por enterobactérias multiresistentes. Brasília, p.3, 2013. ALEMAYEHU, D., QUINN, J., COOK, J., KUNKEL, M., KNIRSCH, C.A. A Paradigm Shift in Drug Development for Treatment of Rare Multidrug-Resistant Gram-Negative Pathogens. Clinical Infectious Diseases, v.55, n.4, p. 562-7, ago.,2012. AMUDHAN, S.M., SEKAR, U., ARUNAGIRI, K., SEKAR, B. 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Este projeto de pesquisa atendendo o disposto na Resolução CNS 466 de 2012 e a qualquer momento vossa senhoria poderá solicitar esclarecimento sobre o desenvolvimento do projeto de pesquisa que está sendo realizado e, sem qualquer tipo de cobrança, poderá retirar sua autorização. Os pesquisadores estarão aptos a esclarecer quaisquer pontos e, em caso de necessidade, darem indicações para solucionar ou contornar qualquer mal-estar que possa surgir em decorrência da pesquisa. Os dados obtidos nesta pesquisa serão utilizados na publicação de artigos científicos e que, assumimos a total responsabilidade de não publicar qualquer dado que comprometa o sigilo da participação dos integrantes de vossa instituição como nome, endereço e outras informações pessoais não serão em hipótese alguma publicados. Na eventualidade da participação nesta pesquisa causar qualquer tipo de dano aos participantes, nós pesquisadores, nos comprometemos em reparar este dano, e ou ainda prover meios para a reparação. A participação será voluntária, não fornecemos por ela qualquer tipo de pagamento. 36 Autorização institucional Eu, Diretor do Hospital de Urgência de Sergipe Governador João Alves Filho (HUSE), declaro que fui informado dos objetivos da pesquisa acima, e concordo em autorizar a execução da mesma nesta instituição. Caso necessário, a qualquer momento desta pesquisa poderemos revogar esta autorização, se comprovada atividades que causem algum prejuízo a esta instituição ou ainda, a qualquer dado que comprometa o sigilo da participação dos integrantes desta instituição. Declaro também, que não recebemos qualquer pagamento por esta autorização bem como os participantes também não receberão qualquer tipo de pagamento. Pesquisador Diretor do HUSE ____________________________ Fernanda Lays Souza Góes Santos Orientador ____________________________ Prof. Dr. Tânia Maria de Andrade Rodrigues ______________________________ 37 APÊNDICE B UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE CENTRO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA INSTRUMENTO DE COLETA DE DADOS I- Dados demográficos: Data: ___/____/____ Nome do paciente: __________________________________________ Sexo: ( ) Feminino Data de Nascimento: ___/___/___ Idade: _____ Data de admissão no hospital: ____/_____/_____ Data de admissão na UTI: _____/_____/______ Procedência: _______________________________________________ ( ) Masculino II- Dados clínicos e epidemiológicos: Setor de internação:_____________________________ Diagnóstico admissão:_____________________________ Dispositivos invasivos: Uso de dispositivo invasivo VM/TQT SVD CVC NPP SNE/GTT OUTROS Permanência (dias) 38 Uso de antibiótico(s): ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ III- Dados dos isolados: Bactéria isolada: ( ) Pseudomonas aeruginosa ( ) Acinetobacter baumannii Sítio de isolamento__________________________ Perfil de sensibilidade e resistência a antibióticos: Antibiótico Perfil de Sensibilidade (MIC Vitek) Perfil de sensibilidade (MIC Etest) Perfil de resistência (MIC Vitek) Perfil de resistência (MIC Etest) IV- Desfecho Alta: Data ____/____/____ Para:_________________________ Óbito: Data _____/_____/_____
