POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE ÓLEOS ESSENCIAIS

POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE ÓLEOS ESSENCIAIS
DE Myrcia ovata Cambessedes FRENTE A BACTÉRIAS
PATOGÊNICAS DE ALIMENTOS
I.C. Jesus1, A.F. Blank2, L.C.L.A. Santana1*
1- Departamento de Tecnologia de Alimentos – Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, s/n – CEP:
49100-000 – São Cristóvão – SE – Brasil, Telefone: (79) 2105-7420 – *E-mail: ([email protected])
2-Departamento de Agronomia – Universidade Federal de Sergipe – CEP: 49100-000 – São Cristóvão – SE –
Brasil.
RESUMO – Os óleos essenciais são considerados de grande interesse para as indústrias alimentícias e
farmacêuticas desde que o uso de aditivos naturais ganhou importância como tendência na substituição
dos conservantes sintéticos artificiais. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o
potencial antimicrobiano de óleos essenciais extraídos da planta Myrcia ovata Cambessedes frente a 8
bactérias patogênicas de alimentos. A atividade antimicrobiana dos óleos foi testada in vitro através da
técnica de difusão em discos e os valores de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração
bactericida mínima (CBM) foram também determinados.Os óleos essenciais apresentaram halos de
inibição entre diâmetros 7,0 e 30,0 mm, valores de CIM entre 0,78 e 400 µL/mL e valores de CBM entre
3,13 a >400 µL/mL. As bactérias P. aeruginosa e B. subtilis foram as mais sensíveis aos óleos,
especialmente ao MYRO-157. Os óleos essenciais de Myrcia ovata Cambessedes demonstraram
potencial para aplicações futuras como antimicrobianos naturais em alimentos.
ABSTRACT- Essential oils are considered of great interest to the pharmaceutical and food industries,
since the use of natural additives has gained importance as a trend in the replacement of artificial
synthetic preservatives. In this context, this study aimed to evaluate the antimicrobial potential of
essential oils extracted from Myrcia ovata Cambessedes plants against 8 foodborne bacteria. The in vitro
antimicrobial activity of the oils was tested by disk diffusion test and the values of minimum inhibitory
concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were also determined. The
essential oils showed diameters of inhibition zone ranged from 7.0 and 30.0mm, MIC values between
0.78 and 400 µL/mL and MBC values ranging from 3.13 to> 400 µL/mL. Bacteria P. aeruginosa and
B. subtilis were the more sensitive to oils, especially to MYRO-157. The essential oils of Myrcia ovata
Cambessedes showed potential for future applications as natural antimicrobials in food.
PALAVRAS-CHAVE: antimicrobiano natural; controle de qualidade; óleo essencial.
KEYWORDS: antimicrobial natural; quality control; essential oil.
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, a investigação sobre produtos naturais com atividade antimicrobiana aumentou
significativamente nos últimos anos. Óleos essenciais de plantas há muito tempo têm servido de base
para diversas aplicações na medicina popular, entre elas, a produção de antissépticos tópicos. Os óleos
essenciais são caracterizados por um forte odor e constituídos por complexas misturas de substâncias
voláteis, geralmente lipofílicas cujos componentes incluem hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples,
aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, ácidos orgânicos fixos, entre outros, em diferentes concentrações.
(Bakkali et al., 2008; Burt, 2004). Em geral, a atividade antimicrobiana de óleos essenciais está
associada a presença de compostos como o carvacrol, o timol e o eugenol (fenóis). Logo após os fenóis,
em ordem decrescente de funcionalidade, situam-se os álcoois monoterpênicos (Exs: linalol, geraniol,
terpineol e mentol), aldeídos (Exs: citral, geranial, citronelal e cuminal), cetonas (Exs: verbenona,
tujona, mentona e carvona) e ésteres, (Exs: estragol e aneto) (Novacosk e Torres, 2006).
As doenças veiculadas por alimentos (DVA’s) ganharam destaque desde que o homem
começou a elaborar seu próprio alimento. Estas, podem ser causadas pela ingestão de micro-organismos
viáveis (infecção) ou de toxinas, por eles, produzidas (intoxicação) em quantidades suficientes para o
desenvolvimento de quadro patológico. Como consequência, um dos grandes problemas da indústria de
alimentos, além de garantir a qualidade microbiológica dos alimentos, é aumentar a vida de prateleira
dos mesmos, já que a maior parte dos alimentos são de origem vegetal ou animal e se deterioram com
facilidade (Jay, 2005). Aliado a isto, tem sido crescente a exigência dos consumidores pelo consumo de
produtos naturais. Neste contexto, o potencial uso de óleos essenciais como antimicrobianos naturais
tem sido foco de várias pesquisas nos últimos anos.
Particularmente, o óleo essencial de Myrcia ovata Cambessedes (Cambess.) tem demonstrado
ação larvicida contra o Aedes aegypti (Furtado et al., 2005; Lima et al., 2011), atividade anti-inflamatória
(Santos et al., 2014) e antimicrobiana frente a micro-organismos tais como: Enterococcus faecalis,
Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis,
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia e Candida parapsilosis (Candido et al., 2010). A M.
ovata Cambess., popularmente conhecida como laranjinha do mato, é um arbusto de cerca de 8 m de
altura, que pertence a Família Myrtaceae, apresenta cerca de 140 Gêneros, e aproximadamente 3000
espécies. O gênero Myrcia corresponde a cerca de 14,6% de todas as espécies vegetais conhecidas desta
família. Distribuída principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do planeta, as espécies de
Myrtaceae são amplamente encontradas no Brasil, sendo uma das famílias de árvores dominantes na
Mata Atlântica. Algumas espécies de Myrcia são utilizadas na medicina popular, suas folhas são
comumente usadas como chá para o tratamento de doenças gástricas, gastrite e diarréia (Lucas et al.,
2011). Contudo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antibacteriano de 7 óleos essenciais de
plantas de M. ovata Cambess. oriundas do estado de Sergipe frente a 8 bactérias patogênicas de
alimentos.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Óleos essenciais
Os óleos essenciais (MYRO-154, MYRO-155, MYRO-156, MYRO-157, MYRO-158,
MYRO-159 e MYRO-173) foram doados pelo Laboratório de Fitotecnia do Departamento de
Engenharia Agronômica da Universidade Federal de Sergipe (UFS). As plantas de Myrcia ovata
Cambess. foram coletadas em diferentes localizações no município de Japaratuba-SE e os óleos foram
extraídos por hidrodestilação utilizando aparelho do tipo Clevenger conforme descrito por Sampaio et
al. (2016).
2.2 Micro-organismos
As bactérias Pseudomonas aeruginosa (INCQS 00025), Staphylococcus aureus (INCQS
00014), Bacillus cereus (INCQS 00003), Bacillus subtilis (INCQS 00002), Serratia marcescens
(INCQS 00131), Escherichia coli (INCQS 00032), Enterococcus faecalis (ATCC 51299) e Salmonella
enteritidis (INCQS 00258) foram adquiridas da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz, Manguinhos, Rio de
Janeiro). As estirpes foram armazenadas em caldo de infusão de cérebro coração (BHI) e solução de
glicerol a 20% à -80ºC em Ultrafreezer.
2.3 Técnica de difusão em discos
O potencial antimicrobiano dos óleos essenciais frente às bactérias patogênicas foi avaliado
pela técnica de difusão em disco segundo protocolo descrito pelo National Committee for Clinical
Laboratory Standards (NCCLS, 2012). Suspensões bacterianas foram preparadas em caldo MullerHinton correspondendo a 0,5 da escala de McFarland. As bactérias foram semeadas em ágar mullerhinton e discos de 6 mm de diâmetro contendo cada óleo essencial foi colocado em cada placa contendo
o micro-organismo. Os testes foram realizados em triplicata e as placas foram incubadas a 35ºC ± 2
durante 24 h. Após a incubação os halos de inibição foram medidos e os resultados expressos em
milímetros. A sensibilidade das bactérias aos óleos foi classificada pelo diâmetro dos halos de inibição
como segue: não sensível, para diâmetros inferiores a 8 mm; sensível para diâmetros de 9-14 mm; muito
sensível para diâmetros de 15-19 mm; e extremamente sensível para diâmetros maiores de 20 mm
(Djenane et al., 2011).
2.4 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração
bactericida mínima (CBM)
A CIM dos óleos essenciais foi determinada em placas de microtitulação, estéreis contendo 96
poços com fundo em formato U conforme metodologia preconizada pelo NCCLS (2012). O meio de
cultura utilizado foi o caldo Muller-Hinton e agente emulsificante, Tween 80 a 1%. As microplacas
foram incubadas a 35ºC ± 2 durante 24 h. Os experimentos foram realizados em triplicata. Dos poços
onde não houve crescimento microbiano visível foram retirados 100 μL de amostras e semeados em
placas de Petri contendo Agar Mueller-Hinton. As placas foram incubadas à temperatura de 35ºC ± 2
durante 24h. A CBM foi aquela onde se observou ausência de crescimento de colônias bacterianas nas
placas.
2.5 Análise estatística
Os halos de inibição foram expressos em média ± desvio padrão através da análise de variância
usando o programa Assistat 7.7 beta.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os óleos essenciais apresentaram halos de inibição entre diâmetros 7,0 e 30,0 mm (Tabela 1).
O S. aureus foi extremamente sensível ao MYRO-154 e de sensível a muito sensível aos demais óleos.
B. cereus e E. faecalis foram de sensíveis a muito sensíveis aos óleos. A P. aeruginosa e o B. subtilis
foram os mais sensíveis ao óleo MYRO-157 onde obteve-se halo de inibição de 30,0 mm. E. coli e S.
enteritidis foram os menos sensíveis, enquanto que a S. marcescens não foi sensível a nenhum dos óleos
testados.
Candido et al. (2010), utilizaram o óleo essencial de M. ovata proveniente do Ceará e também
verificaram o potencial antimicrobiano frente a E. faecalis, E. coli, S. aureus e P. aeruginosa. Porém
particularmente a P. aeruginosa demonstrou maior sensibilidade aos óleos testados no presente estudo.
De forma geral, as bactérias gram-positivas foram mais sensíveis aos óleos do que as gram-negativas.
Segundo Burt (2004), isto se deve ao fato das bactérias gram-negativas serem menos susceptíveis a ação
de antimicrobianos devido a presença da membrana externa, a qual restringe a difusão de grupos
hidrofóbicos através da camada lipopolissarídica.
Na Tabela 2 estão demonstradas as concentrações inibitórias mínimas e as concentrações
bactericidas mínimas de cada óleo frente às oito bactérias testadas. Os óleos MYRO-154 e MYRO-156
apresentaram o menor valor de CIM (0,78 µL/mL) para as bactérias B. cereus e E. faecalis,
respectivamente e os óleos MYRO-154 e MYRO-159 para P. aeruginosa. Os valores de CBM variaram
de 3,13 a >400 µLmL, sendo o menor valor obtido para o MYRO-154 frente ao B. cereus. Candido et.
al (2010) obtiveram valores de CIM e CBM superiores aos obtidos neste trabalho frente a E. faecalis,
E. coli e P. aeruginosa (31, 1000 µg/mL e >1000 µg/mL, respectivamente).
Tabela 1: Diâmetros dos halos de inibição dos óleos essenciais da Myrcia ovata Cambess. frente à
bactérias patogênicas de alimentos.
Halos de inibição (mm)
Óleos essenciais (MYRO)
Bactérias
154
155
156
157
158
159
173
S. aureus
28,5±1,2
13,0±1,5
16,0±1,0
20,0±2,0
11,5±0,5
12,5±0,5
11,0±0,0
B. cereus
13,5±0,5
10,0±0,8
13,0±0,8
20,0±0,0
16,5±0,9
15,0±1,4
17,0±1,0
B. subtilis
25,0±2,0
16,0±0,0
17,0±2,0
30,0±2,5
13,5±0,5
17,5±1,5
16,5±0,7
E. faecalis
20,0±0,0
8,5±0,5
13,0±0,8
17,0±2,0
8,5±0,5
7,5±0,5
12,5±0,7
P. aeruginosa
11,0±0,0
16,5±0,5
16,5±1,2
30,0±0,9
13,0±0,5
15,5±0,5
19,0±1,4
S. marcensces
8,0±0,2
7,0±0,0
8,0±0,4
7,6±0,2
7,0±0,0
7,0±0,2
7,5±0,5
E. coli
10,5±1,2
10,0±0,0
8,0±0,0
9,5±0,5
8,5±0,5
8,6±0,5
8,0±0,0
S. enteritidis
13,0±0,8
9,5±1,2
9,6±0,5
10,5±0,5
8,0±0,0
8,5 ±0,5
7,5±0,5h
Tabela 2: Concentrações inibitórias mínimas (CIM) e concentrações bactericidas mínimas (CBM)
(µL/mL) dos óleos essenciais de Myrcia ovata Cambess. frente à bactérias patogênicas de alimentos.
Bactérias
MYRO
1
2
3
4
5
6
7
8
154
CIM
CBM
3,13
6,25
0,78
3,13
1,56
400
400
>400
0,78
25
50
200
12,5
50
12,5
100
CIM
50
50
6,25
400
50
200
200
200
155
CBM
CIM
200
25
50
50
25
50
>400
0,78
100
3,13
>400
50
>400
100
>400
12,5
156
CBM
25
200
400
400
>400
400
400
>400
157
CIM
CBM
12,5
50
12,5
50
6,25
12,5
200
100
6,25
>400
200
>400
200
>400
25
>400
CIM
25
50
12,5
400
12,5
400
100
50
158
CBM
200
25
100
>400
100
400
>400
>400
159
CIM
CBM
CIM
6,25
>400
50
25
>400
25
25
>400
12,5
3,13
>400
200
0,78
>400
3,13
25
>400
400
12,5
>400
100
6,25
>400
25
CBM
50
100
25
>400
>400
>400
>400
100
173
1= S. aureus; 2= B. cereus; 3=B. subtilis; 4= E. faecalis; 5= P. aeruginosa; 6= S. marcensces;7=E. coli; 8= S. enteritidis
4. CONCLUSÕES
Os óleos essenciais da planta Myrcia ovata Cambess. apresentaram excelente potencial para a
inibição de 8 bactérias patogênicas de alimentos, desde que estas variaram de sensíveis a extremamente
sensíveis aos óleos testados. Particularmente a P. aeruginosa e o B. subtilis foram as bactérias mais
sensíveis, especialmente ao MYRO-157. A utilização destes óleos como antimicrobianos naturais
representa uma interessante alternativa como substituição aos aditivos químicos em alimentos. Estudos
futuros são necessários para aplicação dos mesmos em sistemas de alimentos.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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