Variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
Variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão-caupi
analisada por marcadores ISSR
Raul Ferreira de Miranda Mendes
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Piauí como parte das exigências
do Programa de Pós-graduação em
Genética
e
Melhoramento,
área
de
concentração em Genética e Melhoramento,
para obtenção do título de “Mestre”.
TERESINA
2014
Raul Ferreira de Miranda Mendes
Biólogo
Variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão-caupi analisada por
marcadores ISSR
Orientador:
Dr. Paulo Sarmanho da Costa Lima
Coorientador
Dr. Francisco Rodrigues Freire Filho
Dissertação apresentada à Universidade Federal
do Piauí como parte das exigências do Programa
de Pós-graduação em Genética e Melhoramento,
área
de
concentração
em
Genética
e
Melhoramento, para obtenção do título de
“Mestre”.
Teresina
2014
À minha mãe,
Marlucia Ferreira de Miranda Mendes
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Precipuamente quero agradecer a Deus pela saúde, pela garra, família, amigos,
profissionais de qualidade que fazem ou fizeram parte dessa caminhada. Não vejo a
finalização de um trabalho como este sem a benção de Deus e a ajuda de todos.
Á minha mãe, Marlucia Ferreira de Miranda Mendes, que para agradecer tudo que
recebo e recebi dessa admirável genitora seriam necessárias muitas folhas. Mas
quero deixar meu imenso agradecimento, admiração e respeito por tudo, pois o que
sou, penso, faço é baseado nos seus ensinamentos.
Ao meu pai, o pedagogo José Mendes do Vale (em memória), que apesar da curta
presença foi essencial e gratificante, e nos permitiu (a mim e meus irmãos)
educação familiar e escolar de qualidade.
À minha Tia, Maria Eunice, que a chamo carinhosamente de “Melo” por sua
dedicação, apoio, carinho e amor desde quando ainda arrastava a merendeira para
ir à pré-escola.
Aos meus irmãos, Ramon, Renê e Renata pelo apoio, companheirismo e
simplesmente por existir em minha vida.
À minha namorada Monalisa Ravena, que sempre me fez feliz com seu jeito de ser
(único e autêntico), permitindo que sempre continuasse e atingisse os meus
objetivos e sonhos.
Ao Dr. Paulo Sarmanho da Costa Lima por ensinar tudo que sei hoje sobre
pesquisa, pois me orientou desde o 4º bloco do meu curso de graduação. Já vai
completar seis anos de convivência. Relação esta que não tenho nada a reclamar,
pois sempre fui prontamente atendido e guiado com muito esmero e dedicação
desse grande pesquisador.
Ao pessoal do Laboratório de Biologia Molecular e Biotecnologia da Embrapa MeioNorte pelos ensinamentos, apoio, solidariedade e força que nunca faltou naquele
ambiente de trabalho. Valeu mesmo Michelli, Isis, Geice, Suly, Leonardo, Jailson e
“Seu” Manoel do caupi.
Ao Dr. Freire pela concessão do material vegetal e pelo apoio e ensinamentos que
recebi desse admirável pesquisador, não só pela sua brilhante carreira, mas também
pela sua imensa humildade, que dificilmente se ver numa caminhada como esta.
À Embrapa Meio-Norte pelo financiamento de todo o trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de Mestrado.
À Dra. Angela Celis que nos acolhe como uma mãe no Programa de Pós-graduação
em Genética e Melhoramento. Tem um coração enorme que a torna muito solidária.
A meu ver deveria ser coorientadora em todas as dissertações que por ali passou.
Ao Dr. Fábio Barros Britto e Dr. Paulo Fernando de Melo Jorge Vieira por aceitar e
contribuir no presente trabalho.
E a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para a realização desse
trabalho.
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................... V
ABSTRACT ....................................................................................................... VI
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 7
2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 9
2.1 Feijão-caupi ................................................................................................. 9
2.2 Diversidade genética ................................................................................... 11
2.3 Análise fingerprinting ................................................................................... 13
2.4 Marcadores moleculares ............................................................................. 14
2.4.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) .................................................... 15
2.5 Análises populacionais ............................................................................... 17
3 MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................19
3.1 Material vegetal ........................................................................................... 19
3.2 Extração e quantificação de DNA ............................................................... 21
3.3 Seleção de primers e reação em cadeia de polimerase ............................. 21
3.4 Análise de dados ISSR ............................................................................... 23
3.4.1 Dendrograma ........................................................................................... 23
3.4.2 Análise populacional ................................................................................ 23
4 RESULTADOS................................................................................................ 24
4.1 Análise da divergência genética .................................................................. 24
4.2 Análise de agrupamento .............................................................................. 25
4.3 Estrutura genética ........................................................................................ 29
5 DISCUSSÃO ................................................................................................... 30
6 CONCLUSÕES ............................................................................................... 34
7 REFERÊNCIAS ............................................................................................... 35
V
RESUMO
MENDES, R. F. M. Variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão-caupi
analisada por marcadores ISSR. 2014. 42 p. Dissertação (Mestrado em Genética e
Melhoramento) – UFPI, Teresina-PI, 2014.
A disponibilidade de água na região semiárida do nordeste do Brasil é severamente
limitada. Assim é grande a busca por cultivares mais produtivas e tolerantes a
estresse hídrico. Nessa busca a compreensão da variabilidade genética de uma
espécie torna-se importante conhecimento primário para orientar a seleção e
aperfeiçoamento em programas de melhoramento. Nessa perspectiva o feijão-caupi
possui grande variabilidade genética que o torna versátil, sendo usado em diversos
sistemas de produção. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho estimar a
variabilidade de genótipos crioulos de feijão-caupi coletados no Rio Grande do Norte
através de marcadores ISSR. Foram caracterizados 64 genótipos, sendo 60 crioulos
e quatro cultivares comerciais de feijão-caupi pertencentes à Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária (Embrapa). Os 60 genótipos crioulos foram coletados em 13
microrregiões do Estado do Rio Grande do Norte. O conjunto de 13 primers
selecionados para avaliação gerou 257 locos ISSR, dos quais 247 foram
polimórficos (96,11%). O tamanho dos fragmentos variou de 200 a 2000 pb. O
dendrograma (UPGMA) formou três grupos. Não houve relação entre a distância
genética e a distância geográfica. Para melhor análise dos agrupamentos foi usado
o programa Structure, baseado na estatística Bayesiana. Houve diferenciação
genética entre as 14 populações de feijão-caupi na análise de variância molecular
(AMOVA), sendo a diversidade genética total dividida em 8,18% entre as populações
e 91,82% dentro das populações. O índice de fixação (FST) foi de 0,0818. Diante dos
resultados é possível cruzamentos entre genótipos com coeficiente de similaridade
menor que 25%.
Palavras – chaves: Vigna unguiculata, Diversidade genética, Melhoramento
genético, estresse hídrico.
7
ABSTRACT
MENDES, R. F. M. Genetic variability of Creoles of cowpea genotypes analyzed
by ISSR. 2012. 42p. Dissertation (Master in Genetics and Breeding) – Federal
University of Piauí, Teresina, 2014.
Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] is cultivated widely by small farmers in the
semiarid region of northeastern Brazil for subsistence purposes and to complement
the family income. However, owing to the limited availability of water in this region,
there is an urgent need for novel highly productive drought-tolerant cultivars. The aim
of the present study was to establish the genetic variability of 14 cowpea populations
(60 indigenous genotypes from 13 microregions of Rio Grande do Norte and 4
domesticated cultivars produced by Embrapa) using inter-simple sequence repeats
(ISSR) markers. The set of 13 selected primers generated a total of 257 loci, 247
(96.11%) of which were polymorphic, with sizes ranging between 200 and 2000 bp.
Genetic similarities between accessions were estimated from Jaccard coefficients
and genetic relationships were determined from the dendrogram constructed using
the unweighted pair group method with arithmetic average (UPGMA) technique.
Bayesian statistics coupled with the Markov chain Monte Carlo technique was
applied to determine population structure, while the genetic variability was
established by analysis of molecular variance. UPGMA analysis allowed the
separation of the genotypes into three groups, but no relationship between the
genetic and geographical distances was observed. The fixation index was considered
intermediary (FST = 0.0818), the average heterozygosity was low (HS = 0.39) and the
coefficient of endogamy was high (f = 92.6%). The results showed the presence of
genetic diversity among the studied populations and revealed that such variability
could be attributed mainly to intra-population variability (91.82%).
Keywords
stress
Vigna unguiculata • Genetic diversity • Plant improvement • Drought
8
1 INTRODUÇÃO
A disponibilidade de água na região semiárida do nordeste do Brasil é
severamente limitada por causa da precipitação escassa e irregular e às
temperaturas elevadas. Segundo Barteko et al. (2010) a temperatura e as chuvas
são os elementos climáticos que mais influenciam na produção de feijão. Assim é
grande a busca por cultivares mais produtivas e tolerantes a estresse hídrico para
serem recomendadas aos agricultores estabelecidos em regiões com baixa
precipitação pluviométrica, como é o caso do Estado do Rio Grande do Norte, local
de coleta dos acessos do presente trabalho.
Nessa busca o feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) torna-se uma grande
alternativa, pois possui grande variabilidade genética que o torna versátil, sendo
usado para várias finalidades e em diversos sistemas de produção (FREIRE FILHO
et al., 2005). Além dessa espécie constituir uma das principais fontes proteicas das
populações, principalmente, das regiões Norte e Nordeste do Brasil onde é uma
alternativa de renda para pequenos produtores com pouco ou nenhum acesso a
tecnologias de produção.
A compreensão da variabilidade genética de uma espécie, ou seja, a
proximidade e diversidade de genótipos dentro da mesma espécie representa
importante conhecimento primário para orientar a seleção e aperfeiçoamento em
programas de melhoramento. Dessa forma podem-se identificar genótipos
divergentes e complementares que possam ser utilizados como progenitores em
programas de melhoramento e assim aumentar as chances de seleção de genótipos
superiores nas gerações segregantes (CRUZ e REGAZZI, 2001).
Como esses produtores trabalham na maioria das vezes com cultivares
crioulas, há uma conservação dos recursos genéticos da espécie, e existe a
possibilidade desta variabilidade genética ser explorada pelos programas de
melhoramento da cultura do feijão. Mesmo porque é possível a transferência de
características genéticas desejáveis das espécies crioulas às cultivares comercial.
Para estimar a variabilidade de uma espécie tem se observado uma grande
contribuição dos marcadores moleculares, e entre estes marcadores, os ISSR - Inter
Simple Sequence Repeats (ZIETKIEWICZ et al., 1994) têm sido amplamente
utilizados devido à sua repetibilidade e reprodutividade
(GOMES et al., 2012;
9
MENDES et al., 2012) bem como à simplicidade na execução. Muitos trabalhos com
feijão-caupi têm utilizado os marcadores ISSR (GHALMI et al. 2010; SILVA et al.
2010; SANTOS et al. 2013). Diante disso estes marcadores constituem-se em uma
ferramenta para caracterização molecular de genótipos de feijão-caupi. Então se
objetivou com esse trabalho estimar a variabilidade de genótipos crioulos de feijãocaupi coletados no Rio Grande do Norte através de marcadores ISSR.
10
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Feijão-caupi
O gênero Vigna constitui-se um grande e heterogêneo grupo distribuído nos
trópicos e subtrópicos na África, América Central e do Sul e Ásia (BA et al., 2004;
MAYOR et al., 2009). Este gênero contém várias importantes espécies cultivadas,
incluindo o feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp), o bambara amendoim (V.
subterrânea L. Verdc.), feijão-mungo (V. radiata (L.) Wilczeck), grão-preto (V. Mungo
(L.) Hepper), feijão-azuqui (V. angularis (Willd.) Ohwi & Ohashi) e feijão-arroz (V.
umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi). Entre estes, o feijão-caupi é o de maior
importância econômica (WETZEL e FAIAD, 2001). A cultura do feijão-caupi tem
fundamental importância socioeconômica para o Nordeste e Norte do Brasil,
constituindo-se uma das principais fontes proteicas das populações dessas regiões.
(SINGH et al., 2002; FREIRE FILHO et al., 2004; ZILLI et al., 2009).
A produção mundial de feijão, incluindo o feijão-comum e o feijão-caupi,
aumentou 59,1% no período compreendido entre 1961 e 2005 (BOVESPA, 2012).
Países como os Estados Unidos, Perú, Brasil, Níger, Mali, Burkina Faso, Benin,
Chade, Camarões, Myanmar e Tailândia são os principais exportadores de feijãocaupi. Já os maiores importadores são Estados Unidos, Canadá, Portugal, Espanha,
Grécia, Reino Unido, Bélgica, Argélia,
Egito, Nigéria, Gana, Costa do Marfim, Togo, Gabão, Emirados Árabes Unidos,
Israel, Índia e Turquia (FREIRE FILHO et al., 2011b).
É uma espécie autógama, que apresenta cleistogamia, ou seja, a polinização
do estigma ocorre antes da abertura do botão floral ou antese (BESPALHOK et al.,
2007a). Reproduz-se preferencialmente por autofecundação, com a ocorrência de
baixa taxa de cruzamento natural, geralmente abaixo de 1% (EHLERS e HALL,
1997). É uma dicotiledônea pertencente à ordem Fabales, família Fabaceae,
subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae, subtribo Phaseolinea, gênero Vigna, secção
Catiang e espécie Vigna unguiculata (Verdecourt, 1970; Maréchal et al., 1978;
Padulosi e Ng, 1997).
O feijão-caupi, também conhecido como feijão de macassar, feijão da colônia,
feijão de praia e feijão-miúdo é uma leguminosa comestível, dotada de alto conteúdo
proteico, boa capacidade de fixar nitrogênio. É menos exigente em nutrientes,
11
fertilidade do solo e quantidades de adubo em comparação à soja e ao feijão-comum
(SAMPAIO e BRASIL, 2009). Exibe ainda reconhecida capacidade de adaptação a
estresses hídrico, térmico e salino (ZILLI et al., 2009; FREIRE FILHO et al., 2004).
Segundo a Companhia Nacional de Abastecimento - CONAB (2011) não
existe divisão entre os dados estatísticos do feijão comum (Phaseolus vulgares L.) e
os do feijão-caupi. Para fins de preços mínimos de garantia, a CONAB (2011)
classifica em duas tipificações: feijão anão (Phaseolus vulgaris) e feijão macassar
(Vigna unguiculata). O feijão anão é cultivado em todo o território nacional (SEAB,
2012) já o cultivo do feijão macassar, ou caupi, está localizado principalmente na
região do Nordeste brasileiro, mas vem se expandindo para outras regiões do Brasil,
principalmente para o Centro-Oeste, em razão da sua ampla adaptabilidade às
condições tropicais, precocidade e ao baixo custo de produção, e em decorrência do
intenso trabalho de melhoramento aplicado à cultura nos últimos 20 anos (FREIRE
FILHO et al., 2011a)
De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2009),
o consumo alimentar da população brasileira combina a tradicional dieta à base de
arroz e feijão com alimentos com poucos nutrientes e muitas calorias. Estudos
encomendados pelo IBGE em parceria com o Ministério da Saúde - Pesquisa de
Orçamentos Familiares (POF) 2008-2009 indicam um consumo alimentar médio de
feijão per capita de 182,9 g/dia. No entanto, essa pesquisa não diferenciou o
consumo entre as espécies de feijão.
Tanto a produtividade nordestina como a brasileira está aquém do potencial
produtivo do feijão-caupi. De acordo com Mousinho et al. (2008), a sensibilidade do
feijão-caupi à escassez de água no solo, juntamente com as incertezas climáticas,
principalmente relacionadas à distribuição irregular de chuvas a partir de um ano
para outro e de um região para outra, determinam a oscilação na safra anual da
produção no Piauí.
No entanto, Lima (2008) analisou respostas fisiológicas de cultivares de feijão
comum e caupi submetidas à deficiência hídrica, e concluiu que as cultivares de
feijão-caupi submetidas à deficiência hídrica apresentaram melhor desempenho no
que concerne à eficiência instantânea de transpiração e à eficiência intrínseca do
uso da água quando comparadas com a cultivar de feijão-comum.
No mercado brasileiro podem-se identificar três segmentos: grãos secos,
feijão-verde (vagem verde ou grão verde debulhado) e sementes. No mercado dos
12
grãos secos, nas regiões Norte e Nordeste, o feijão-comum e o feijão-caupi embora
não competindo no campo, competem por mercado e sempre que há uma queda na
oferta de feijão-caupi o mercado é suprido por feijão-comum de outras regiões do
País e, às vezes, importado (FREIRE FILHO et al., 2011a).
No Brasil, os programas de melhoramento de feijão-caupi buscam o aumento
da produtividade e melhoria da qualidade visual, culinária e nutricional dos grãos,
aumento da adaptabilidade e estabilidade; tolerância a estresse hídrico; arquitetura
adequada ao cultivo mecanizado e à agricultura familiar; incorporação de resistência
a doenças e pragas; desenvolvimento de cultivares com grãos de cor verde
persistente à secagem para enlatamento e congelamento; desenvolvimento de
variedades com características para o processamento industrial, utilizados na
produção de farinha e sopa pré-cozida (FREIRE FILHO et al., 2005).
Diante dessa busca os genótipos crioulos de feijão podem ser uma
alternativa, pois apresentam variabilidade genética inter e intrapopulacional, que se
pode traduzir fenotipicamente tanto nas características da semente como da planta.
Isso é devido aos diversos ambientes a que são submetidas (MATOS et al., 2013). É
considerado cultivar crioula, a veriedade que não seja oriunda de manipulação por
engenharia genética nem outros processos de desenvolvimento industrial ou
manipulação em laboratório, não contenha transgenes e não envolva processos de
hibridação (MINISTÉRIO DO DESENVOLVIMENTO AGRÁRIO, 2007).
2.2 Diversidade Genética
A divergência genética existe na natureza, e pode ser quantificada tanto por
marcadores moleculares como por técnicas multivariadas, além de estar associada à
heterose. As análises de variabilidade genética podem ser úteis para obter a relação
entre os genótipos, caracterizar grupos heteróticos, predizer preliminarmente
cruzamentos que otimizem a heterose, viabilizando a obtenção de genótipos
superiores nas gerações segregantes. Desse modo, o estudo da diversidade entre e
dentro de populações fornece as bases para a identificação de indivíduos
divergentes, auxiliando o melhorista na seleção de combinações mais promissoras e
favoráveis aos cruzamentos (MELCHINGER, 1999; FALEIRO et al., 2011).
A estimativa de distância genética entre genótipos possibilita a obtenção de
informações a respeito de organização de germoplasma, aumento na eficiência da
amostragem de genótipos, auxílio na definição de cruzamentos artificiais, a
13
incorporação de genes de germoplasma exótico e até na indicação de cultivares
para determinada região, quando o objetivo é aumentar a base genética das
cultivares (MOHAMMADI e PRASANNA, 2003).
Soares (2012) utilizou setenta cultivares crioulas coletadas no Estado do Rio
Grande do Norte, quatro cultivares melhoradas e três linhagens procedentes do
International Institute of Tropical Agriculture (IITA) para avaliar a resistência de
genótipos de feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp.) ao ataque do caruncho
Callosobruchus maculatus (Fabr.). As cultivares AM-63-3-Lizão Carioquinha ou Lizão
e AM-1-2-Quarentinha destacaram-se dentre as cultivares crioulas em resistência
por antibiose.
Antunes et al. (2007) também realizaram um estudo com genótipos crioulos
de feijão-comum (P. vulgaris), introduzidos do estado do Rio Grande do Sul.
Coletaram 32 progênies de plantas individuais selecionadas em 17 populações de
feijão, quanto ao seu potencial de produtividade, resistência às doenças
naturalmente ocorrentes em campo e uniformidade de grãos. A estratégia adotada
pelo autor implica em que, vindo a ser alguma das progênies selecionadas
consideradas como apta a constituir uma nova cultivar, prioritariamente deverá esta,
ser encaminhada à comunidade de produtores de onde proveio a população original.
Xavier et al. (2005) analisaram genótipos de feijão-caupi do Brasil, EUA e
Nigéria. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genética em 45
genótipos de feijão-caupi por meio de marcadores RAPD. Estes se agruparam em
razão de suas respectivas origens (Brasil, EUA e Nigéria).
Na mesma linha de pesquisa Oliveira et al. (2003) analisaram a divergência
genética entre 16 genótipos de feijão-caupi coletados no Brasil e na Nigéria e
empregou-se as técnicas multivariadas, conforme Cruz e Regazzi (1997). Na
aplicação da técnica de agrupamento dos genótipos, foi adotada a distância
generalizada de Mahalanobis (1936), como medida de dissimilaridade por levar em
consideração o grau de dependência entre as variáveis estudadas. O máximo valor
de divergência genética (D2 = 253,04) foi obtido para os pares V-4 Alagoas e TVx337-3F, de origem geográfica diferente (Brasil e Nigéria, respectivamente), o que
pode ter contribuído para a maior dissimilaridade observada. Os menores valores de
D2 foram apresentados pelos pares TVx-337-3F com Vita-4 (TVu 1977-OD) e V-4
Alagoas com Bengala, de mesma origem geográfica, respectivamente, 5,06 e 5,62,
significando maior similaridade entre os caracteres considerados.
14
Souframanien e Gopalakrishna (2004) analisaram a diversidade genética
comparativa em 18 genótipos de Vigna mungo, usaram 25 primers RAPD e 16 ISSR
e obtendo 42,7% de polimorfismo nos fragmentos amplificados pelos iniciadores
RAPD e 57,5% quando amplificados por iniciadores ISSR. Os dendrogramas não
indicaram qualquer padrão claro de aglomeração de acordo com o local em que elas
foram coletadas. Resultados semelhantes foram obtidos em feijão-azuqui (YEE et
al., 1999) e em amendoim (DWIVEDI et al., 2001).
A distância geográfica como indicadora de divergência genética já foi foco de
críticas, pelo fato de nem sempre quantificar a divergência entre as populações, e
que, em muitos casos não se verifica relação entre diversidade genética e distância
geográfica (CRUZ, 1990; CRUZ e CARNEIRO, 2003). Vidal et al., (2006) justifica
esse mesmo problema, em seu trabalho, em razão de que nem sempre a região de
coleta é a região de origem.
2.3 Análise fingerprinting
Cada genótipo possui uma sequência de nucleotídeos que compõe seu DNA.
A detecção de diferenças entre essas sequências revela um padrão único, ou seja,
uma impressão digital genética (genetic fingerprinting) que pode ser utilizada na
identificação de indivíduos e também para testes de paternidade. Essas impressões
digitais podem ser detectadas através de marcadores moleculares, medindo a
distância genética entre os genótipos em estudo (SOUZA, 2001; OLIVEIRA et al.,
2007).
A correta identificação de um genótipo em um banco de germoplasma é
essencial. No entanto podem ocorrer erros nessa localização de genótipos. Isso
pode ser causado devido a problemas de homonímia (o mesmo nome para
diferentes genótipos), sinonímia (diferentes nomes para os mesmo genótipos) e até
devido ao controle inadequado da coleção. A análise de fingerprinting de DNA é uma
ferramenta poderosa na identificação desses erros. Praticamente todos os
marcadores moleculares de DNA podem ser utilizados na identificação de genótipos
por fingerprinting (FALEIRO, 2007; SAJIB et al., 2012).
Essa ferramenta também pode auxiliar os melhoristas na identificação de
prováveis parentais de híbridos, cuja origem é desconhecida, bem como na
estruturação da variabilidade genética no sentido de direcionar cruzamentos entre
grupos que favoreça a heterose. Estas aplicações podem ser ilustradas pelo
15
trabalho de Tantasawat et al. (2010) que analisaram a diversidade e a relação
genética de vinte e três genótipos de feijão-chicote (Vigna unguiculata spp.
sesquipedalis ) e sete acessos de um híbrido entre feijão-caupi (V. unguiculata spp.
unguiculata ) e feijão-chicote, na Tailândia. Foram usados caracteres morfológicos e
marcadores moleculares SSR e ISSR, obtendo-se 90,91% e 91,03% de polimorfismo
com os marcadores SSR e ISSR respectivamente.
Silva (2011) utilizou 12 locos microssatélites para estimar a diversidade
genética de 192 genótipos de feijão-fava (Phaseolus lunatus L.) O número de alelos
por loco foi elevado, variando de 5 (Bm155) a 15 (Bm170), com média igual a 8,33,
resultando em um total de 100 alelos. A heterozigosidade esperada (He), com média
igual a 0,68, foi alta e a heterozigosidade observada (Ho), com valor médio de 0,025,
foi significativamente menor, indicando alta endogamia nas subamostras estudadas,
verificada pelos valores índices de fixação ( f ).
2.4 Marcadores Moleculares
Entende-se por marcadores moleculares as diferenças genéticas entre dois
ou mais indivíduos e que são herdadas de parentais, correspondendo a regiões
expressas ou não do genoma. Essas regiões são segmentos específicos de DNA,
cuja sequência básica difere para diferentes genótipos (polimorfismo) e, portanto,
permite diferenciá-los (ZIMMER et al., 2005). Diferenças genéticas no DNA
significam, na maioria das vezes, diferenças fenotípicas (FALEIRO, 2007).
Os
marcadores
moleculares
possuem
vantagens
com
relação
aos
marcadores morfológicos. Eles não sofrem influências ambientais, obtém um número
praticamente ilimitado de polimorfismos genéticos e a possibilidade de detecção de
tais polimorfismos em qualquer estágio do desenvolvimento da planta (XU, 2010).
Existem duas classes de marcadores moleculares. Aqueles baseados em hibridação
(RFLP e minissatélites) e os que são baseados em PCR (Polymerase Chain
Reaction), que inclui RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA); Microssatélites –
SSR
(Simple
Sequence
Repeats);
AFLP
(Amplified
Fragment
Length
Polymorphism); ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) e os marcadores SNPs
(Single Nucleotide Polymorphism).
De acordo com Faleiro (2007) o uso de um ou de outro marcador vai
depender, entre outros fatores, do objetivo do trabalho, da infraestrutura, dos
16
recursos financeiros disponíveis, da disponibilidade dos recursos humanos e da
espécie a ser estudada.
As metodologias para detectar e analisar a variabilidade genética em nível
molecular oferecem informações adicionais a outros estudos relativos à conservação
e ao uso de bancos de germoplasma (SAJIB et al., 2012; FALEIRO, 2007). Os
marcadores moleculares são utilizados com sucesso na definição de grupos
heteróticos em várias espécies vegetais, na caracterização de acessos de
germoplasma e nos retrocruzamentos, auxilia na seleção para o genitor recorrente e
aumenta a eficiência do processo (RUMIN, 2005).
A avaliação da diversidade genética promove o uso eficiente de variações
genéticas em programa de melhoramento (ROCHA et al., 2003; SINGH, 2007).
Marcadores de DNA proporcionam uma oportunidade para caracterizar genótipos e
para medir relações genéticas precisas com relação a outros marcadores.
(BECKMANN e SOLLER, 1983; FALEIRO, 2007).
Marcadores moleculares vêm sendo utilizados para a identificação de
cultivares e para avaliar a diversidade genética entre genótipos de feijão, como Silva
et al. (2013) que utilizou 62 primers SSR para análise molecular em feijão-caupi;
Assunção Filho (2012) também utilizou marcadores SSR e marcadores morfológicos
para caracterizar populações da variedade crioula Boca de Moça de feijão-fava
(Phaseolus lunatus); Marçal et al. (2011) caracterizaram 500 genótipos de feijão
comum (Phaseolus vulgaris) com marcadores SSRs; Nkongolo (2003) e Xavier et al.
(2005) utilizaram RAPD para caracterizar geneticamente genótipos de
V.
unguiculata. Já Coulibaly et al. (2002) analisaram a diversidade genética em Vigna
unguiculata com marcadores AFLP; com o mesmo objetivo Gillaspie et al. (2005)
utilizaram AFLP e SSR (microssatélites); Com marcadores ISSR Ajibade et al.
(2000) analisaram a relação genética entre diferentes espécies do gênero Vigna.
2.4.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
É uma técnica baseada em PCR, que envolve a amplificação de sequências
de DNA presente numa região de distância amplificável entre duas regiões repetidas
idênticas de microssatélites orientadas em direções opostas. A técnica utiliza
microssatélites, geralmente 16-25 pb de comprimento, como primers em uma reação
de PCR para amplificar principalmente as sequências inter-SSR de diferentes
tamanhos. Os produtos amplificados são usualmente 200-2.000 pb de comprimento
17
e passíveis de detecção tanto na eletroforese em gel de agarose como em gel de
poliacrilamida (REDDY et al., 2002).
As repetições de microssatélites utilizadas como primers podem ser dinucleotídico, tri-nucleotídico, tetra-nucleotídico ou penta-nucleotídico. Os primers
utilizados podem ser ou não ancorados (MEYER et al., 1993; GUPTA et al., 1994).
Marcadores ISSRs têm alta reprodutibilidade e repetibilidade (MENDES et al., 2012;
GOMES et al., 2012), possivelmente, devido à utilização de iniciadores mais longos
(16-25 pb) que permite a utilização de alta temperatura de anelamento (45–60ºC),
proporcionou maior especificidade em comparação com primers RAPD (que têm em
média 10 pb).
Os estudos sobre a reprodutibilidade mostra que apenas as bandas mais
fracas não são reproduzíveis. Mendes et al. (2012) obtiveram média de 83,3% de
reprodutibilidade quando usaram marcadores ISSR em pinhão manso (Jatropha
curcas L.), mesmo com o uso de termocicladores com diferentes curvas de rampa de
temperatura. Também se constatou que os padrões de amplificação dos diferentes
acessos e primers, não tiveram grandes diferenças quanto à intensidade das
bandas.
A taxa evolutiva de mudança dentro de microssatélites é consideravelmente
mais elevada do que a maioria dos outros tipos de DNA, assim a probabilidade de
polimorfismo nestas sequências é maior. A fonte de variabilidade nos ISSRs pode
ser atribuída ao deslizamento da DNA polimerase durante a replicação do DNA e
falha em reparar erros no pareamento das bases nitrogenadas, isso é considerado
como um mecanismo de criação, e hipervariabilidade SSRs (AGA, 2005; LEVINSON
e GUTMAN, 1987).
Dependendo do evento de inserção/deleção dentro da região SSR ou na
região amplificada pode resultar na ausência de um produto ou polimorfismo de
comprimento, dependendo da amplificação do tamanho do fragmento resultante. O
grau de polimorfismo também varia de acordo com o natureza do primer (que pode
ser não ancorado, 3'-ancorado, ou 5'-ancorado) e com a sequência das repetições
(motivo) no primer empregado. Uma vez que o primer é uma sequência SSR, a
frequência e a distribuição dos microssatélites repetidos em diferentes espécies
também influencia o padrão de bandas (REDDY et al., 2002).
Por ser uma técnica simples, rápida e eficiente, os marcadores ISSR vêm
sendo utilizados com sucesso para estimar o grau de diversidade genética em níveis
18
inter e intra-específico em uma ampla gama de espécies de plantas, que incluem
mulungu (GONÇALVES, 2014), pinhão-manso (GOMES, 2013), batata-doce
(MOULIN et al., 2012), abacaxi (AMARAL et al., 2011), milho (OLIVEIRA, 2010).
O uso em feijão também é amplo, Ghalmi et al. (2010) avaliaram vinte
variedades crioulas de feijão-caupi da Argélia com marcadores ISSR e RAPD;
Muthusamy
et al. (2008) analisaram a variação genética entre 10 populações
crioulas de feijão-arroz (Vigna umbellata), utilizando marcadores RAPD e ISSR; ElHady et al. (2010) também avaliaram as variações genéticas em algumas espécies
do gênero Vigna por marcadores RAPD e ISSR; Silva et al. (2010) avaliaram a
variabilidade genética em quarenta e seis acessos de feijão-caupi de porte ereto e
ciclo precoce por meio de marcadores ISSR.
2.5 Análises populacionais
A maioria das populações é agrupada em subpopulações menores, nas quais
geralmente ocorrem os cruzamentos. Esse agrupamento é chamado de estrutura
populacional. A análise genética de populações tem como objetivos, dentre outros,
melhoria no desempenho de animais domésticos e plantas cultivadas; interpretação
de diferenças nas sequências de nucleotídeos de genes entre membros da mesma
espécie ou de espécies proximamente relacionadas. Também tem como objetivo a
análise de genes e genomas entre diversas espécies para determinar as suas
relações evolutivas e para testar hipóteses sobre o processo evolutivo (HARTL e
CLARK, 2010).
A abordagem genética e evolutiva procura quantificar a variabilidade
morfológica e quantitativa existente entre os indivíduos, seu sistema reprodutivo,
fluxo gênico, e as adaptações aos ambientes locais. São estas, em conjunto, as
principais características da estrutura de uma população local (PRITCHARD e
ROSENBERG 1999).
Muitos softwares estimam as estatísticas F a partir de marcadores
codominantes e a partir de dados de marcadores dominantes. Essas estatísticas são
utilizadas para quantificar o efeito de endocruzamento da subdivisão populacional,
que tem sido denominado índice de fixação. Esse índice é um útil indicador de
diferenciação genética, pois permite uma comparação objetiva do efeito geral da
estrutura populacional entre diferentes organismos (HARTL e CLARK, 2010).
19
Segundo Hartl e Clark (2010) o símbolo genético para o índice de fixação é F,
acrescido de subscritos que denotam os níveis hierárquicos a serem comparados:
FSR (Fixação das subpopulações relativas aos agregados regionais)
FSR =
HR - HS
HR
HS: É a heterozigosidade média, supondo EHW (equilíbrio de Hardy-Weinberg) entre
os organismos dentro das subpopulações de cruzamento aleatório;
HR: É a heterozigosidade média, supondo EHW entre os organismos dentro das
regiões;
HT: É a heterozigosidade média, supondo EHW (equilíbrio de Hardy-Weinberg) entre
os organismos dentro das subpopulações de cruzamento aleatório.
FRT (redução proporcional da heterozigosidade dos agregados regionais, em
relação à população combinada total)
FRT =
HT - HR
HT
FST (mede todos os efeitos da estrutura populacional combinada)
FST =
HT - HS
HT
20
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
Foram caracterizados 64 genótipos, sendo 60 crioulos e 4 cultivares
comerciais de feijão-caupi pertencentes à Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (Embrapa). Os 60 genótipos crioulos foram coletados em 13
microrregiões do Estado do Rio Grande do Norte (Figura 1), distribuídas nas quatro
mesorregiões do estado (Tabela 1). O estudo foi desenvolvido no Laboratório de
Biotecnologia e Biologia Molecular, da Embrapa Meio-Norte, em Teresina, PI.
4
3
6
7
5
10
11
8
9
1 2
12
1 - Serra de São Miguel (4)
6 – Macau (3)
11 – Macaíba (3)
2 - Pau dos Ferros (5)
7 – Angicos (7)
12 – Agreste Potiguar (14)
3 - Chapada do Apodi (2)
8 - Serra de Santana (3)
13 - Litoral Sul (2)
4 – Mossoró (5)
9 – Borborema Potiguar (8)
13
5 - Vale do Açú (2)
10 – Baixa Verde (2)
Figura 1 - Localização das microrregiões do Rio Grande do Norte indicando os locais de procedência
dos genótipos. O número de indivíduos de cada população está entre parênteses.
Tabela 1 - Genótipos de feijão-caupi, com a respectiva procedência quanto à
mesorregião e microrregião do Estado do Rio Grande do Norte.
Microrregião
Chapada do Apodi
Chapada do Apodi
Mossoró
Mossoró
Mossoró
Mossoró
Mossoró
Pau dos Ferros
Pau dos Ferros
Pau dos Ferros
Pau dos Ferros
Pau dos Ferros
Serra de São Miguel
Código da amostra
22-1
61-1
14-1
28-1
31-1-2
47-1
59-1
20-1
21-1
27-1
44-1
50-1
24-1
Mesorregião
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
Oeste Potiguar
21
Continuação Tabela 1
Tabela 1 - Genótipos de feijão-caupi, com a respectiva procedência quanto à
mesorregião e microrregião do Estado do Rio Grande do Norte.
Código da
Microrregião
Mesorregião
amostra
Serra de São Miguel
36-1
Oeste Potiguar
Serra de São Miguel
39-1
Oeste Potiguar
Serra de São Miguel
57-1
Oeste Potiguar
Vale do Açú
23-1
Oeste Potiguar
Vale do Açú
30-1
Oeste Potiguar
10-1
Angicos
Central Potiguar
10-2
Angicos
Central Potiguar
17-2
Angicos
Central Potiguar
54-1
Angicos
Central Potiguar
67-1
Angicos
Central Potiguar
67-2
Angicos
Central Potiguar
68-2
Angicos
Central Potiguar
63-1
Macau
Central Potiguar
69-1
Macau
Central Potiguar
69-2
Macau
Central Potiguar
33-1
Serra de Santana
Central Potiguar
46-1
Serra de Santana
Central Potiguar
65-1
Serra de Santana
Central Potiguar
1-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
2-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
4-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
5-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
6-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
8-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
11-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
12-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
19-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
25-1-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
56-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
60-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
73-1
Agreste Potiguar
Agreste Potiguar
74-1
Agreste Potiguar
Baixa Verde
42-1
Agreste Potiguar
Baixa Verde
49-1
Agreste Potiguar
Borborema Potiguar
3-1
Agreste Potiguar
Borborema Potiguar
13-1
Agreste Potiguar
Borborema Potiguar
15-1
Agreste Potiguar
Borborema Potiguar
45-1
Agreste Potiguar
Borborema Potiguar
48-1
Agreste Potiguar
Borborema Potiguar
58-1
Agreste Potiguar
Borborema Potiguar
66-2
Agreste Potiguar
Borborema Potiguar
71-1
Agreste Potiguar
Litoral Sul
7-1
Leste Potiguar
Litoral Sul
7-2
Leste Potiguar
Macaíba
37-1
Leste Potiguar
Macaíba
37-3
Leste Potiguar
Macaíba
64-2
Leste Potiguar
Testemunha
BR17-GURGUÉIA Testemunha
22
Continuação Tabela 1
Tabela 1 - Genótipos de feijão-caupi, com a respectiva procedência quanto à
mesorregião e microrregião do Estado do Rio Grande do Norte.
Código da
Microrregião
Mesorregião
amostra
Testemunha
BRS-GUARIBA
Testemunha
Testemunha
BRS-MARATAOÃ Testemunha
Testemunha
BRS-NOVA ERA
Testemunha
3.2 Extração e quantificação de DNA
As extrações de DNA genômico foram realizadas a partir de folhas jovens
coletadas na fase ativa de crescimento das plantas. As amostras foram
acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados e armazenados em
isopor com gelo, sendo transportados até o Laboratório de Biotecnologia e Biologia
Molecular da Embrapa Meio-Norte, onde foram mantidas em freezer até o início da
extração que foi realizado conforme recomendações do Kit de purificação Invitek
(INVISORB, 2008). A quantificação do DNA extraído foi verificada em gel de agarose
a 0,8%, preparado em tampão TBE 0,5X (Tris-Borato-EDTA), corado com GelRedBiotium® 10.000X (adicionou-se 0,4 µl de GelRed 10.000X para cada 100 ml de gel
de agarose) e comparado a resolução do DNA das amostras com o DNA-λ diluído na
concentração de 50 e 100 ng. A qualidade e quantidade de DNA extraído também foi
verificada através do espectrofotômetro NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo
Scientific). O DNA foi diluído à concentração de 7,0 ng/μL e estocado à -20ºC.
3.3 Seleção de primers e reação em cadeia de polimerase
Foram avaliados 40 primers desenvolvidos pela University of British Columbia
(UBC), Vancouver, Canadá, em cinco genótipos de feijão-caupi com a finalidade de
selecionar aqueles com maior polimorfismo, maior número e melhor resolução de
bandas para serem utilizados na caracterização molecular dos 64 genótipos (Tabela
2).
23
Tabela 2 - Primers utilizados na caracterização molecular, temperatura de melting (Tm), temperatura
de anelamento (Ta), sequência e percentual de GC.
a
a
Primers
Tm (ºC)
Ta (ºC)
Sequência 5'-------3'
% GC
UBC 810
45,40
50,00
GAG AGA GAG AGA GAG AT
47,06
UBC 811
46,80
49,00
GAG AGA GAG AGA GAG AC
52,94
UBC 816
50,01
49,00
CAC ACA CAC ACA CAC TA
47,06
UBC 822
47,00
47,00
TCT CTC TCT CTC TCT CA
47,06
UBC 826
52,80
54,00
ACA CAC ACA CAC ACA CC
52,94
UBC 827
53,00
57,00
ACA CAC ACA CAC ACA CG
52,94
UBC 828
51,30
50,00
TGT GTG TGT GTG TGT GA
47,06
UBC 834
49,20
53,00
AGA GAG AGA GAG AGA GYT
50,00
UBC 840
47,40
49,00
GAG AGA GAG AGA GAG AYT
50,00
UBC 846
51,80
55,00
CAC ACA CAC ACA CAC ART
50,00
UBC 857
54,30
55,00
ACA CAC ACA CAC ACA CYG
55,55
UBC 880
47,90
52,00
GGA GAG GAG AGG AGA
60,00
UBC 885
48,30
55,00
BHB GAG AGA GAG AGA GA
58,82
Y- (C,T); B- (C,G, T); H- (A, G, T); R- (A,G)
O programa do termociclador (eppendorf) e a composição das reações foram
obtidos a partir do trabalho realizado por Silva et al. (2010). As reações foram
realizadas em volume final de 10 µL, contendo os seguintes componentes: tampão
1,0x [20 mM Tris HCl, pH 8,0; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50% (v/v) glicerol], MgCl 2 a
2,0 mM, 0,8 mM de dNTP, 0,8 µM do primer, 1 U de Taq DNA polimerase
(Invitrogen) e 0,5 µL de DNA genômico (7 ng/µl).
As amplificações foram realizadas em termociclador de capacidade para 96
amostras, com uma fase inicial de desnaturação a 94 ºC por 4 minutos, seguidas de
40 ciclos nas seguintes condições: 1 minuto para desnaturação a 94 ºC; 1 minuto
para anelamento à temperatura de acordo com o primer e 1 minuto para extensão a
72 ºC. A extensão final foi realizada a 72 ºC por cinco minutos. Os produtos das
amplificações foram separados por eletroforese horizontal, com tampão TBE 0,5X,
em gel de agarose a 1,5% e corado com GelRed™. Em seguida, foram visualizados
em transluminador UV e fotodocumentados, sendo o tamanho dos fragmentos
amplificados calculados por comparação com os padrões de peso molecular
(Ladder) 100 pb e 1 Kb (Invitrogen).
24
3.4 A análise de dados ISSR
3.4.1 Dendrograma
A análise do padrão de bandas gerada por cada primer possibilitou a
montagem da matriz binária, em que foi conferido o valor (1) para a presença da
banda e (0) para a ausência. Todos os genótipos geraram amplificações de loci em
todos os primers. A partir desses dados, foi estimada a similaridade genética entre
os genótipos das diferentes populações, utilizando-se o coeficiente de similaridade
de Jaccard (sgij), conforme a expressão de Rohlf (1992) calculado pelo programa
PAST v. 1. 34 (HAMMER et al., 2001).
Em seguida, foi realizada a análise de agrupamento pelo método de Ligação
Média entre Grupos (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean UPGMA). O coeficiente de correlação cofenético (r) foi calculado pelo ajuste da
matriz de similaridade e do dendrograma gerado. O índice de confiabilidade de
bootstrap foi calculado a partir de 1.000 permutações.
3.4.2 Análise populacional
Uma segunda análise foi realizada no programa Structure 2.3.4 (PRITCHARD
et al., 2000), que se fundamenta no modelo bayesiano e gera uma distribuição
posterior com base na cadeia de Markov que identifica a presença de estrutura na
população, bem como a proporção do genoma de cada genótipo advindo de outros
grupos. Para essa análise, foi considerado o modelo de informação a priori da
população para a definição dos grupos. Considerou-se, em todas as análises
efetuadas, um número fixo de 300 mil iterações MCMC (“Monte Carlo Markov
Chain”) com descarte (“burn-in”) das 50 mil iterações, com 10 arquivos de
parâmetros contendo valores de K=1 a K= 14 e três corridas para cada valor de K. O
modelo utilizado foi com mistura (admixture model).
A determinação do número K mais provável em relação aos propostos foi
realizada utilizando-se valores de ΔK (EVANNO et al., 2005). A partir do valor do k
selecionado, foi gerado um gráfico utilizando o programa Structure.
Os componentes de variância, atribuídos às diferenças entre as 14
populações (microrregiões), entre locais dentro de microrregiões e entre indivíduos
dentro de locais, foram estimados pelo programa Arlequin v.3.0 (EXCOFFIER et al.,
1992). As significâncias dos componentes de variâncias foram obtidas por meio de
1000 permutações.
25
4 RESULTADOS
4.1 Análise da diversidade genética
O conjunto de 13 primers selecionados para avaliação de 64 genótipos gerou
257 locos ISSR, dos quais 247 foram polimórficos, correspondendo a 96,11% de
polimorfismo, obtendo-se média de 19,77 marcadores por primer, cujo tamanho dos
fragmentos variou de 200 a 2.000 pb (Tabela 3).
Tabela 3 - Locos amplificados e polimórficos gerados por 13 primers ISSR.
Primers
Total de Locos
Locos
polimórficos
Polimorfismo %
Tamanho dos
fragmentos (pb)*
810
25
25
100
270 - 1850
811
24
22
91,67
320 - 1750
816
10
9
90
400 - 1450
822
15
15
100
490 - 1650
826
10
5
50
500 - 1350
827
12
12
100
300 - 1300
828
12
12
100
400 - 1650
834
27
27
100
200 - 1825
840
26
26
100
200 - 1950
846
22
21
95,45
300 - 2000
857
22
22
100
300 - 2000
880
24
24
100
250 - 2000
885
28
27
96,43
200 - 1200
TOTAL
257
*pb: pares de bases
247
94,12
Os primers 810, 822, 827, 828, 834 (Figura 2), 840, 857 e 880 produziram
todos os locos polimórficos. Já o primer 826 foi o menos polimórfico, com 50% de
polimorfismo.
26
Figura 2 - Perfil de amplificação do primer UBC 834 em 17 genótipos de feijão-caupi. B é o
controle.
4.2 Análise de agrupamento
As similaridades genéticas entre os genótipos de cada população de feijãocaupi calculadas com base no coeficiente de Jaccard variaram de 0,203 a 0,796. No
dendrograma (método UPGMA) (Figura 3) obtido a partir dos 257 locos amplificados
foi definido o ponto de corte pela média de similaridade entre os genótipos, que foi
de 0,40. Nas 14 populações avaliadas os marcadores ISSR possibilitaram a
discriminação de diferentes genótipos sendo capaz de formar três grupos.
O desempenho da análise do agrupamento, com base nos dados
moleculares, foi revelado através do coeficiente de correlação cofenético, que
apresentou um valor elevado (r= 0,92). Isso mostra estreita relação entre o
dendrograma e a matriz de similaridade.
27
Figura 3 - Dendrograma de similaridade genética a partir do coeficiente de Jaccard com agrupamento
pelo método UPGMA entre 64 genótipos de Vigna unguiculata (L.) Walp. oriundos do Estado do Rio
Grande do Norte. O número entre parênteses de cada genótipo indica o local de coleta.
28
O grupo I reuniu populações de todas as 13 microrregiões do Estado do Rio
Grande do Norte e as testemunhas. Isso evidência a proximidade e uma possível
complementaridade entre os genótipos crioulos e as testemunhas. Isso também
pode evidenciar as trocas de sementes entre os pequenos agricultores do Estado do
Rio Grande do Norte. O grupo II reuniu genótipos de cinco microrregiões: Pau dos
Ferros, Chapada do Apodi, Mossoró, Borborema Potiguar e do Agreste Potiguar, que
são distantes uma da outra, que chega atingir o máximo aproximado de 400 km.
Finalmente o grupo III reuniu genótipos das microrregiões de Angicos, Borborema
Potiguar, Agreste Potiguar e Litoral Sul. Neste grupo foi observada a maior relação
entre distância genética e distância geográfica, pois essas microrregiões são
próximas geograficamente.
A maior similaridade foi observada entre os genótipos de Serra de São Miguel
(39-1) e de Baixa Verde (42-1) com valor igual a 0,796, cujos municípios de coleta
ficam a uma distância de aproximadamente 380 km. Isso pode ser mais uma
evidência que houve troca entre materiais de feijão-caupi, prática que é muito
comum entre os pequenos agricultores. Já a menor similaridade foi registrada entre
os genótipos 1-1 (Agreste Potiguar) e 50-1 (Pau dos Ferros) com 0,203, cuja
distância de coleta é de 441 km.
Para melhor entendimento dos agrupamentos foi utilizado o programa
Structure, baseado na estatística bayesiana, que permitiu entender melhor os grupos
formados no dendrograma, pois os resultados do Structure mostraram uma mistura
entre os genótipos, como também mostrou o dendrograma. Dos 64 indivíduos
avaliados, cinco possuem ancestral em outras populações, pois possuem cores
diferentes no mesmo indivíduo (Figura 4). Os resultados também permitiram a
identificação de relações de parentescos entre os indivíduos avaliados.
Entre os valores de K testados verificou-se que o valor ótimo é k=2 (Figura 5).
29
Figura 4. Estrutura genética das populações de feijão-caupi (Vigna unguiculata), com as microrregiões
de coleta. Os genótipos estão representados no eixo X por barras verticais, cujo tamanho é proporcional
(eixo Y) à população a que pertence. A mesma cor em genótipos diferentes indica que eles pertencem
ao mesmo grupo. Cores diferentes no mesmo indivíduo indicam a porcentagem do genoma
compartilhado com cada grupo.
Figura 5. Valores de Δk para cada valor de k, calculado de acordo com o
proposto por Evanno et al. (2005). O maior valor de k corresponde ao k ótimo.
30
As microrregiões de Serra de São Miguel, Vale do Açú, Macau, Baixa Verde,
Macaíba agruparam com as testemunhas como ocorreu no dendrograma. Todas as
outras microrregiões indicaram porcentagem do genoma compartilhado pelos dois
grupos formados.
4.3 Estrutura genética
Também foi verificada a estrutura genética, que foi avaliada utilizando-se a
metodologia de Excoffier et al. (1992). Houve diferenciação genética entre as 14
populações de feijão-caupi, sendo a diversidade genética total dividida em 8,18%
entre as populações e 91,82% dentro das populações (Tabela 6). O índice de
fixação (FST) foi de 0,0818 e todos os valores foram positivos nas 14 populações.
Tabela 4 - Análise de variância molecular (AMOVA) em 14 populações de feijão-caupi.
Fonte de
variação
Entre
populações
Dentro das
populações
Total
a
Componentes Variação
FST
Pa
GL
SQ
de variância
(%)
13
584,703
2, 87746
8,18
50
1615,61
32,31219
91,82
-
-
63
2200,312
35,18965
100
-
-
0,0818 0,001
Testes significantes depois de 1000 permutações; GL: grau de liberdade; SQ: soma dos quadrados;
FST: índice de fixação.
31
5 DISCUSSÃO
Conforme Grativol et al. (2011), a eficiência de um marcador molecular pode
ser medida pela quantidade de polimorfismo que o mesmo é capaz de detectar. Tal
eficiência foi evidenciada por Muthusamy et al. (2008), que usaram todos os primers
do presente trabalho (com exceção do 822) em seu estudo de diversidade genética
em feijão-arroz (Vigna umbellate), no qual quatro primers ISSR obtiveram 100% de
bandas polimórficas, registrando polimorfismo de 61,79%.
Silva et al. (2010) utilizaram oito primers ISSR para avaliar a variabilidade
genética em 46 genótipos de feijão-caupi de porte ereto e ciclo precoce, produzindo
62 locos, destes 49 foram polimórficos (79,04%) com 6,12 marcadores por primer.
No presente trabalho obteve-se uma média de 19,77 marcadores por primer. Isso
indica que os dados gerados por esses iniciadores pode explicar melhor a
diversidade genética entre os genótipos analisados. Visto que amplificaram um
número bem superior de marcadores ISSR.
O alto polimorfismo apresentado (96,11%) pelos 64 genótipos de feijão-caupi
também é devido principalmente aos genótipos crioulos, pois não sofreram nenhuma
seleção anterior. Quando uma espécie é domesticada, alelos de caracteres de
interesse aumentam na frequência, até serem fixados. Dessa forma, quando a
seleção é fortemente exercida sobre uma espécie, a diversidade genética é
drasticamente reduzida (WANG et al., 1999). A seleção é uma das principais
ferramentas do melhorista independente do tipo de método de melhoramento
utilizado. Para o uso dessa técnica ou método deve se ter populações com
variabilidade genética (diferentes genótipos), como as variedades crioulas,
(BESPALHOK et al., 2007b) o que é observado no presente estudo.
Assim a riqueza genética desses genótipos de feijão-caupi pode ser utilizada
para as mais diversas aplicações, tanto no estudo de genética como no
melhoramento da espécie, pois o cruzamento entre genitores mais divergentes pode
maximizar a heterose, que aumenta a possibilidade de lançamento de cultivares com
novas características de interesse no mercado de feijão.
A maioria dos genótipos (46), oriundos das 14 populações, incluindo as
cultivares domesticadas, se reuniu em um único grupo (I). Esse agrupamento pode
levantar várias dúvidas quanto à proximidade genética entre os indivíduos. Mas se
levar em consideração que esses genótipos foram coletados em pequenas
32
plantações de subsistência, onde há grande troca de sementes entre os agricultores,
esclarece-se esse agrupamento.
Diante desses dados percebe-se que as cultivares domesticadas tem relação
estreita com esses genótipos crioulos do Rio Grande do Norte. Por consequência,
um cruzamento entre estes genótipos poderia haver uma transferência de caracteres
de interesse. Já que os genótipos crioulos podem ter uma característica importante
no cultivo de feijão-caupi que não se apresenta nas cultivares melhoradas.
Como foi observado por Soares (2012), que identificou uma cultivar crioula
(AM-63-3-Lizão carioquinha ou Lizão) com o maior nível de resistência (antibiose) ao
Caruncho Callosobruchus maculatus (FABR.) (Coleoptera: Crysomelidae) dentre o
grupo
de
cultivares
analisadas.
Enquanto
que
as
cultivares
melhoradas
apresentaram baixa resistência. Essa cultivar crioula foi coletada na mesma
microrregião (Macau) que algumas cultivares crioulas do presente trabalho.
O grupo II reuniu genótipos, como o 20-1 (coletado no município de Itaú) e o
12-1 (coletado no município de Passa e Fica) que possuem uma distância
aproximada de 400 km entre elas. Mas também agrupou genótipos, como o 20-1 e
21-1, coletados respectivamente nos municípios de Itaú e Severino Melo, que distam
em aproximadamente 13 km. Evidenciado que os pequenos agricultores estariam
cultivando sementes de diversas origens na mesma área geográfica.
Esse genótipo (20-1) apresentou, segundo Soares (2012), resistência
moderada ao Caruncho (C. maculatus). Diante disso pode-se sugerir um cruzamento
entre esse genótipo e umas das cultivares melhoradas, pois a similaridade do 20-1
em relação a cada uma das cultivares melhoradas foi inferior a 30%.
Em diversos trabalhos observa-se que nem sempre há relação entre a
distância genética e a distância geográfica. Oliveira et al. (2003) analisaram a
divergência genética entre 16 genótipos de feijão-caupi oriundos do Brasil e da
Nigéria e concluiu que genótipos de mesma origem geográfica corresponderam a
maior distância genética. Resultados semelhantes foram obtidos por Bezerra (1997)
também com feijão-caupi. Vidal et al. (2006) justificam esse mesmo problema, em
seu trabalho, afirmam que nem sempre a região de coleta é a região de origem.
A distância geográfica como indicadora de divergência genética tem recebido
críticas, pelo fato de nem sempre quantificar a divergência entre as populações, e
que, em muitos casos não se verifica relação entre diversidade genética e distância
geográfica (CRUZ, 1990; CRUZ e CARNEIRO, 2003).
33
Para um melhor entendimento das distâncias genéticas entre os genótipos de
feijão-caupi usou-se o programa Structure. Inúmeros estudos tem usado esse
software para verificar a formação dos grupos gerados pelos dendrogramas em
feijão (BLAIR et al., 2007; BURLE et al., 2010; SILVA, 2011). Os resultados obtidos
podem ser de grande valia para a identificação de genitores, que quando cruzados,
aumentam as chances de seleção de genótipos superiores nas gerações
segregantes (CRUZ e REGAZZI, 2001).
Em contraste com o dendrograma o valor ótimo de k foi igual a dois, ou seja,
o programa Structure sugeriu a formação de apenas dois grupos. No entanto os
genótipos que se reuniram nos grupos II e III do dendrograma agruparam no mesmo
grupo segundo os resultados do Structure. São os genótipos que tem como
predominância a cor laranja (Figura 4). Dessa forma apesar de o dendrograma
indicar a separação entre os genótipos dos grupos II e III observa-se que na verdade
eles são bem próximos, podendo formar apenas um grupo. Isso indica congruência
nos resultados do dendrograma e do Structure.
As cultivares domesticadas mostraram-se com alta taxa de dissimilaridade
com genótipos de algumas microrregiões. Assim, essas cultivares já domesticadas
podem
ser utilizadas em
cruzamentos com
genótipos crioulos
diferentes
geneticamente e que tenham características de interesse (como rendimento, porte,
resistência a estresses bióticos e abióticos e boa qualidade dos grãos) para o
desenvolvimento de novas variedades de feijão-caupi.
Diante disso e baseado na matrix de similaridade podem ser sugeridos
cruzamentos entre os seguintes genótipos: 1-1 (Agreste Potiguar) e 50-1 (Pau dos
Ferros); 21-1 (Pau dos Ferros) e Guariba; Marataoã e 21-1 (Pau dos Ferros); Nova
era e 4-1 (Agreste Potiguar); 24-1 (Serra de São Miguel) e 10-1 (Angicos); 20-1 e
Marataoã. Já que possuem respectivamente os seguintes coeficientes de
similaridade: 0,203; 0,221; 0,227; 0,239; 0,240 e 0,230 (dados não mostrados).
Quanto aos resultados da estrutura genética, houve diferenciação genética
entre as 14 populações de feijão-caupi, sendo a maior parte da diversidade genética
dentro das populações (91,82%). Essa elevada diferenciação entre os indivíduos da
mesma população pode ser explicada pelo tamanho de quatro populações (Chapada
do Apodi, Vale do Açú, Baixa Verde e Litoral Sul) que só foi possível obter dois
genótipos de cada uma dessas populações. Assim tomam-se dois indivíduos ao
34
acaso pode se ter grande diferença entre esses dois, o que pode ter influenciado
nos resultados.
A divergência entre populações (FST), que foi de 8,18%, também pode ter sido
subestimada devido ao pequeno número de indivíduos em algumas populações,
pois não se esperava um valor tão baixo. Tendo em vista o modo de reprodução da
espécie, que é predominantemente autógama, pois apresenta cleistogamia, ou seja,
a polinização do estigma ocorre antes da abertura do botão floral ou antese
(BESPALHOK et al., 2007), como também ocorrência de baixa taxa de cruzamento
natural, geralmente abaixo de 1% (EHLERS e HALL, 1997). Segundo Carvalho
(2009) os padrões de distribuição da variabilidade genética estão correlacionados
com os sistemas reprodutivos.
Assim esperava-se divergência maior entre populações, como ocorreu no
estudo de Ghalmi et al. (2010), que encontraram a maior parte (71,50%) da
diversidade genética entre as populações crioulas de feijão-caupi da Argélia e
28,50% dentro das populações, também com marcadores ISSR.
No entanto a dissimilaridade genética mostrou-se mediana. Mesmo que o
FST tenha um valor mínimo teórico de zero (indicando nenhuma divergência
genética) e um máximo teórico de 1 (indicando fixação de alelos alternativos em
diferentes subpopulações), o máximo observado geralmente é muito menor do que 1
(HARTL e CLARK, 2010). Segundo Wright (1978) uma amplitude de 0,05 a 0,15
pode ser considerada indicativa de moderada diferenciação genética, como foi
observado nas populações de feijão-caupi avaliadas.
A análise estatística dos valores do FST mostrou-se significativa, o que
evidencia a diferença genética existente nas populações estudadas. Neste estudo, o
uso dos marcadores ISSR foi bastante eficiente na busca pela melhor compreensão
da diversidade e estruturação genética das populações de feijão-caupi oriundas do
Estado do Rio Grande do Norte e das testemunhas, sendo capaz de detectar a
existência de variabilidade entre os genótipos analisados.
35
6 CONCLUSÕES
 A maior variabilidade genética está presente dentro das populações e não
houve relação entre a distância genética e a distância geográfica;
 Os cruzamentos seguintes genótipos: 1-1 (Agreste Potiguar) e 50-1 (Pau dos
Ferros); 21-1 (Pau dos Ferros) e Guariba; Marataoã e 21-1 (Pau dos Ferros);
Nova era e 4-1 (Agreste Potiguar); 24-1 (Serra de São Miguel) e 10-1
(Angicos); 20-1 e Marataoã constituem a melhor combinação para programas
de melhoramento;
 A divergência entre populações (FST) foi bem abaixo do esperado,
possivelmente devido ao compartilhamento das sementes entre os pequenos
agricultores do estado do Rio Grande do Norte. Já que os genótipos em
análise foram coletados em pequenas propriedades.
 Observou-se moderada diferenciação genética entre as 14 populações
avaliadas.
 Pode-se sugerir uma futura análise morfológica dessas cultivares para avaliar
as diferenças detectadas na análise molecular, e assim confirmar ou não os
cruzamentos sugeridos no presente trabalho.
36
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