Recent Progress in Avian Virology

X Simpósio de Sanidade Avícola
"Bronquite Infecciosa - Aspectos
Moleculares"
Nilo Ikuta
Docente - Laboratório de Diagnóstico Molecular (ULBRA)
P&D - Simbios Biotecnologia
BRONQUITE INFECCIOSA
 Doença respiratória infecto-contagiosa, aguda de origem viral
 Aumento da mortalidade
 Quadros respiratórios e renais
 Afeta os indicadores zootécnicos
 Predispõe a infecções secundárias
 Condenação de carcaças
 Diminuição da produção de ovos
 Alterações de conteúdo interno e da casca do ovo
AVICULTURA DE CORTE
REPRODUTORAS – BISAVÓS, AVÓS, MATRIZES
A vida das matrizes é dividida em três etapas:
 Cria: 0 a 4 semanas
 Recria: 5 a 21 semanas
 Reprodução: após 21 semanas de vida até abate
FRANGOS DE CORTE (integração)
Abate Frangos de corte varia de 31 dias até 61 dias conforme a
demanda comercial
BRONQUITE INFECCIOSA
 Família: Coronaviridae
• RNA fita simples,
• Sentido positivo,
•~27.000 nucleotídeos
• Envelopado,
• Arredondado,
• Espículas na superfície
vírus da bronquite infecciosa - VBI
DIAGNÓSTICO
 Isolamento de vírus em ovos embrionados
 Cultivo celular
 Imunofluorescência
 Microscopia eletrônica
 Provas de inibição de hemaglutinação
 ELISA
 PCR
TIPIFICAÇÃO
BASEADO NO POLIMORFISMO ESPÍCULA S1
 vírus neutralização
 PCR-RFLP
 Sequenciamento
PREVENÇÃO
Vacinas atenuadas (vivas) e inativadas.
Sorotipo Massachusetts – única cepa vacinal permitida no Brasil até 2015
VBI
 Ampla distribuição geográfica no Brasil
 Sorotipo Massachussetts – 1957
 Connecticut, 4/91 e D207
 Ocorrência de variantes (BR) diversas regiões brasileiras
OBJETIVO
Determinar a frequência do VBI em diferentes regiões, idades e
sistemas
fisiológicos
caracterizando
a
de
matrizes
diversidade
e
frangos
molecular
sequenciamento parcial do gene da espícula S1
com
de
base
corte
em
AMOSTRAS DO ESTUDO
Amostras clínicas: janeiro de 2010 a dezembro de 2011
1294 POOLS
DETECÇÃO DO VBI
Extração do RNA
Análise dos resultados
Amplificação
PCR
Detecção gene 5´UTR
DISTRIBUIÇÃO DE VBI
SEQUENCIAMENTO S1
amostras de frangos
amostras de matrizes
RT-PCR – NESTED Gene S1 Reações de Sequenciamento
Sequeciador
Detecção - Gel de Agarose
Purificação Amplicons
Análise
LM
1
C-
2
3
4
5
C- C+
GENÓTIPOS
Frequência genótipos Mass e variantes em lotes de frangos
e matrizes.
FILOGENIA
Relações filogenéticas (SB, USP, UNICAMP)
MEGA 5.0 with the Clustal W method.
FILOGENIA
Similaridade da sequência de aminoácidos de S1
85 a 100% entre todas variantes brasileiras;
97 a 100% entre as variantes BR-II;
< 75% com cepas vacinais (Mass).
-B
GENÓTIPOS BR
R
-
I
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
120
180
SB-A1971 PLTGLIPQNHIRISAMKGGNTGPSGLFYNLTVSVTKYSRFKSLQCVNNQTSVYLNGDLVF
SB-1994
PLTGLIPQNHIRISAMKIGNTGPSGLFYNLTVPVTKYSKFKSLQCVNNQTSVYLNGDLIF
SB-A2160 PLTGLIPQNHIRISAMKQGNNGPSGLFYNLTVPVTKYSKFKSLQCVNNQTSVYLNGDLVF
SB-A2360 PLTGLIPQHHIRISAMKQGNNGPSGLFYNLTVPVTKYSKFKSLQCVNNQTSVYLNGDLVF
-B
SB-A2960 PLTGLIPSGHIRIAAMKNNGTGPSDLFYNLTVPVTKYSRFRSLQCVNNQTSVYLNGDLVF
R
SB-A2962 PLTGLIPSGHIRIAAMKNNGTGPSDLFYNLTVPVTKYSRFRSLQCVNNQTSVYLNGDLVF
4-91
PLTGMIPQNHIRISAMRSG-----FLFYNLTVSVSKYPKFKSLQCVGNSTSVYLNGDLVF
I
D274
PLTGLIPQNHIRISAMKNS-----SLFYNLTVAVTKYPRFKSLQCVNNMTSVYLNGDLVF
I
H120
PITGMLQQHSIRVSAMKNG-----QLFYNLTVSVAKYPTFKSFQCVNNLTSVYLNGDLVY
M41
PITGMLQKNFLRVSAMKNG-----QLFYNLTVSVAKYPTFKSFQCVNNLTSVYLNGDLVY
QX
PITGMIPRDHIRISAMKNG-----SLFYNLTVSVSKYPNFKSFQCVNNFTSVYLNGDLVF
-M
a
GNXGPS
Glicina – Arginina – X – Glicina – Prolina - Serina
s
s
GENÓTIPOS X IDADE
VBI FRANGOS
 Maior
incidência Genótipo Mass em frangos de corte com
idades mais precoces (63%) = programas de vacinação contra
BI no primeiro dia de vida dos pintos
VBI - MATRIZES
 Surpreendente - 90% do genótipo BR independente da idade
 Vias de vacinações: ocular, spray de gota grossa e água de
bebida
 CAVANAGH e GELB JR, 2008 – Programa de vacinação:
 entre 10 e 18 semanas de idade, com vacinas inativadas
 mais 3 ou 4 vacinações com cepas atenuadas na fase de
postura
VBI - MATRIZES
 Consulta
informal (com 5 empresas) recomendam:
 além da vacinação com cepa inativada
 3 a 6 vacinações atenuadas até a idade de recria
 mais vacinações periódicas em intervalos de 4 a 6
semanas na fase de postura
 Variações
entre regiões conforme desafio
 Muitas vacinações em matrizes X baixa frequência de
genótipos Mass (10%) em todas as idades
VBI – %SISTEMA
Caracterização do n° de lotes de matrizes e frangos (e respectivos
porcentuais) de acordo com o processamento individual de cada sistema.
VBI – %SISTEMA
Detecção e tipificação de VBI em lotes de matrizes e frangos individualizados quanto
aos sistemas digestório, respiratório e urogenital
VBI – %SISTEMA
 Relatam ter encontrado VBI em diferentes sistemas das aves,
sendo o sistema digestório o mais consistente (DHINAKAR e
JONES,
1997;
DE
WIT,
2000;
COOK
et
al.,
2012;
MACLACHLAN e DUBOVI, 2011; BOROOMAND, et al., 2011;
DOLZ et al., 2012)
CONCLUSÕES - DETECÇÃO
 Frequência de VBI maior em frangos (54%) que em matrizes
(30,8%)
 Frequências semelhantes nas 3 regiões
 Em matrizes maior frequência de VBI no sistema digestório
 Em frangos frequência semelhante de VBI no sistema
digestório e respiratório
CONCLUSÕES - GENÓTIPOS
 Não detectados genótipos Connecticut, 4/91 e D207 descrito
previamente por outros autores
 Nas 3 regiões (frangos e matrizes) mais disseminado o
genótipo BR
 Em matrizes apenas 9% do genótipo Mass
 Em frangos até 4,5 semanas 63% Mass e 12% nos lotes com
idade superior
 Para uma análise laboratorial mais assertiva deve-se associar
a coleta de material do sistema respiratório e digestório
Muito obrigado!
Laboratório de Diagnóstico Molecular
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e
Molecular Aplicada à Saúde
Universidade Luterana do Brasil (ULBRA)