Volume 4 Número 2 - abctp

ISSN 1808-9909
Volume 4, Número 2, 2008
PLANT CELL CULTURE
&
MICROPROPAGATION
Cultura de Células
&
Micropropagação de Plantas
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 4, n. 2, p. 55-110, 2008
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation , editada semestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos
de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600
exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE
TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.
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Editores Associados
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José Eduardo Brasil Pereira Pinto UFLA
Natoniel Franklin de Melo EMBRAPA
Raírys Cravo Nogueira UFPA
ISSN 1808-9909
Plant Cell Culture & Micropropagation
CONTEÚDO
Aclimatização de mudas micropropagadas de Heliconia lingulata Ruiz & Pav. em ambiente
protegido, em função da lâmina de irrigação.
Acclimatization of micropropagated plants of Heliconia Lingulata Ruiz & Pav. in protected
environments as a function of irrigation depth.
Benito Moreira de Azevedo, Eliana Lee Jorge Rocha, Thales Vinícius de Araújo Viana, Albanise
Barbosa Mariho, Ana Cristina Portugal Pito de Carvalho, Denise Vieira Vasconcelos..................................
55
In vitro organogenesis of passion fruit (Passiflora edulis Sims. F. flavicarpa Deg.) affected by
irradiance, sucrose and explant position.
Organogênese in vitro do maracujazeiro (Passiflora edulis Sims. F. flavicarpa Degener) afetado por
irradiância, sacarose e posição dos explantes.
Rodrigo Sobreira Alexandre, Flávio Alencar D' Araújo Couto, José Maria Moreira Dias, Wagner
Campos Otoni, Rita De Cássia Mendes, Paulo Roberto Cecon.....................................................................
62
Avaliação de substratos na produção de mudas do abacaxizeiro ornamental [Ananas Comosus (L.)
Merr. Var. Bracteatus (Lindl.) Coppens & F. Leal] em condições de casa de vegetação.
Substrates evaluation for production of ornamental pineapple [Ananas Comosus (L.) Merr. Var.
Bracteatus (Lindl.) Coppens & F. Leal] plants under greenhouse conditions.
Francisco Nunes da Cunha Filho, Antonio Carlos Torres, João Maria Charchar..........................................
70
Efeito de isopenteniladenina por quatro subcultivos na multiplicação de brotações de abacaxizeiro
ornamental in vitro.
Effect of isopentenyl adenine in four subcultures during the in vitro multiplication of ornamental
pineapple shoot.
Maria do Desterro Mendes dos Santos, José Getúlio Da Silva Filho, Antonio Carlos Torres......................
76
Eficiência fotoquímica e características de crescimento da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum
L.) cultivada in vitro em diferentes concentrações de sacarose e qualidade de luz.
Photochemical efficiency and growth characteristics of sugar cane (Saccharum officinarum L.) plants
cultivated in vitro under different sucrose concentrations and light quality.
Geórgia Peixoto Bechara Mothé, Alena Netto Torres, Luis Eduardo Campos Crespo, Eliemar
Campostrini...................................................................................................................................................
84
Effects of auxins and cytokinins on in vitro development of Alpinia purpurata K. Schum and
phenolic compounds production.
Efeito de auxinas e citocininas no desenvolvimento in vitro de Alpinia purpurata K. Schum e produção
de substâncias fenólicas.
Cristiane Pimentel Victório, Iacinete Pamplona da Cruz, Alice Sato, Ricardo Machado Kuster, Celso
Luiz Salgueiro Lage......................................................................................................................................
92
Curva de crescimento, atividade da fenilalanina amônia-liase e teores de fenóis e taninos totais em
calos de Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (Fabaceae-Mimosoideae).
Growth curve, phenylalanine ammonia-lyase activity and total phenol levels in callus of
Stryphnodendron Adstringens (Mart.) Coville - (Fabaceae-Mimosoideae).
Ana Hortência Fonsêca Castro, Miller Marani Lima, Renato Paiva, Amauri Alves de Alvarenga, Mirelle
Oliveira Sóter................................................................................................................................................
99
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 55-110, 2008
Embriogênese somática direta de Coffea arabica L.: concentrações de NH4NO3 e de KNO3 no
desenvolvimento de embriões.
Direct somatic embryogenesis of Coffea arabica L.: concentrations of NH4NO3 and KNO3 on the
development of embryos.
Juliana Costa de Rezende, Moacir Pasqual, Samuel Pereira de Carvalho, Ester Alice Ferreira, Flavia
Carvalho Santos............................................................................................................................................
105
ACLIMATIZAÇÃOAclimatização
DE MUDAS
MICROPROPAGADAS
DE Heliconia55
de mudas micropropagadas
de Heliconia...
lingulata Ruiz & Pav. EM AMBIENTE PROTEGIDO, EM FUNÇÃO
DA LÂMINA DE IRRIGAÇÃO1
ACCLIMATIZATION OF MICROPROPAGATED PLANTS OF Heliconia lingulata Ruiz &
Pav. IN PROTECTED ENVIRONMENTS AS A FUNCTION OF IRRIGATION DEPTH
BENITO MOREIRA DE AZEVEDO2, ELIANA LEE JORGE ROCHA3, THALES VINÍCIUS DE ARAUJO VIANA4,
ALBANISE BARBOSA MARINHO5, ANA CRISTINA PORTUGAL PINTO DE CARVALHO6,
DENISE VIEIRAVASCONCELOS7
1
Parte da dissertação apresentada à Universidade Federal do Ceará pelo primeiro autor, para obtenção do título de Mestre em Irrigação
e Drenagem.
2
Doutor em Irrigação e Drenagem, Professor Associado Departamento de Engenharia Agrícola Universidade Federal do Ceará/
UFC [email protected]
3
Mestre em Irrigação e Drenagem (In memória).
4
Doutor em Irrigação e Drenagem, Professor Associado Departamento de Engenharia Agrícola Universidade Federal do Ceará/
UFC [email protected]
5
Doutora em Produção Vegetal Pesquisadora CNPq/FUNCAP [email protected]
6
Doutora, Embrapa Agroindústria Tropical Cx. P. l 3761 60511-110 Fortaleza, CE [email protected]
7
Engenheira Agrônoma, Mestre Universidade Federal do Ceará/UFC [email protected]
RESUMO
As helicônias são plantas ornamentais, que com sua beleza
e exotismo constituem uma das maiores riquezas da flora brasileira.
Em decorrência da alta demanda do mercado consumidor, as mudas
vêm sendo produzidas em escala comercial por meio da
micropropagação, uma técnica importante da cultura de tecidos
que apresenta diversas etapas. A etapa de aclimatização é a fase
mais crítica e importante, pois se não for bem executada pode
proporcionar altos índices de mortalidade e baixas taxas de
crescimento e desuniformidade das plantas, com conseqüente
queda na produção. Para minimizar esse problema e atender às
exigências do mercado consumidor, é preciso buscar informações
técnicas e científicas sobre o adequado manejo das plantas, na
fase de aclimatização. Objetivou-se, no presente trabalho, avaliar
o efeito de distintas lâminas de irrigação na aclimatização de
mudas micropropagadas de helicônia (Heliconia lingulata Ruiz
& Pav.). A pesquisa foi conduzida em um ambiente protegido
pertencente à Embrapa Agroindústria Tropical, Fortaleza CE
(3º44 S e 38º33 W). Foram analisadas quatro lâminas de irrigação:
1, 2, 3 e 4 mm de água. As variáveis agronômicas, avaliadas nos
experimentos foram altura da planta, número de folhas e diâmetro
do caule. Os resultados dos experimentos evidenciaram o melhor
desenvolvimento das mudas micropropagadas de helicônia,
quando irrigadas com lâmina de 2,5 mm dia-1.
Termos para indexação: Floricultura, Heliconia lingulata,
manejo de irrigação.
ABSTRACT
Heliconias are beautiful and exotic ornamental plants of
the wealthy Brazilian flora. Due to a high demand of the
consuming market, plants are being produced in a commercial
scale using the technique of micropropagation. In this technique,
acclimatization is the most important and critical phase for
promoting high rates of mortality, reduced growth and plant
uniformity which reduce its production. The objective of this
work was to evaluate the effect of different irrigation depth in
the acclimatization of micropropagated heliconia (Heliconia
lingulata). The experiments were in a protected environment
located at Embrapa Tropical Agroindustry, Fortaleza, Ceara,
Brazil (3º44 S and 38º33 W). The agronomic variables evaluated
were: plant height, leaf number and stem diameter. The results
showed the best development of micropropagated heliconia plants
using water depth of 2.5 mm day-1.
Index terms: floraculture, Heliconia lingulata, irrigation
management.
INTRODUÇÃO
As helicônias são plantas ornamentais que com
sua beleza e exotismo assemelham-se a verdadeiras
esculturas, lembrando em sua forma pirâmides, bicos de
aves, cascatas de flores, pinhais ou cachos de banana. As
helicônias constituem uma das maiores riquezas da flora
brasileira. Atualmente, sabe-se que o mercado internacional
tem proporcionado muitas oportunidades de negócios para
os produtores dessas flores tropicais.
A floricultura é uma atividade desenvolvida, em
geral, em ambientes protegidos, estufas ou túneis plásticos,
(Recebido em 17 de abril de 2008 e aprovado em 22 de julho de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 55-61, 2008
56
AZEVEDO, B. M. de et al.
combinando alta produtividade com maior qualidade,
garantindo ao agricultor uma colheita satisfatória e
reduzindo ao máximo as perdas por danos proporcionados
por variações climáticas adversas (GONDIM et al., 2004).
De acordo com Terceiro Neto et al. (2004), uma etapa
importante na produção de flores e plantas ornamentais
está relacionada à utilização de mudas de qualidade. Nesse
contexto, a produção de mudas através da
micropropagação, surge como uma alternativa viável para
obtenção de mudas em escala comercial com alta qualidade
genética e fitossanitária, em um curto espaço de tempo,
atendendo dessa forma, às necessidades dos produtores.
Dentre as etapas da micropropagação, pode-se destacar a
aclimatização, que é a fase mais crítica e importante.
A irrigação é uma prática de suma importância no
processo de aclimatização, já que a água é um dos fatores
que mais limitam a produção das plantas. Seu manejo, ou
seja, a quantidade de água e sua freqüência de aplicação é
um fator fundamental para o estabelecimento e o adequado
desenvolvimento das mudas micropropagadas. Para se
alcançar todos os objetivos da prática de irrigação, que
englobam a maximização da produção, racionalização do
uso da mão-de-obra, energia, água e fertilizante e a
aplicação correta da água, é imprescindível adotar um
correto manejo desse sistema (PEREIRA et al., 1997).
Para Pieter et al. (2007), os efeitos de aplicações
excessivas ou deficitárias são irreversíveis e variam de
acordo com a intensidade e tempo de duração do
procedimento imposto. Nesses casos, os processos
fisiológicos da planta relacionados ao crescimento são
afetados e, sob condições severas, o déficit pode provocar
a murcha permanente do vegetal. Conforme a Embrapa
(2007), em regiões de calor intenso com inverno ameno
normalmente, a exigência das mudas por água, em qualquer
fase de desenvolvimento, é maior que em regiões de clima
temperado. Por outro lado, alguns tipos de substrato, por
terem menor capacidade de retenção de água, exigem que
se aplique mais água a cada irrigação, ou que se aumente a
freqüência das mesmas. É recomendável que as lâminas
sejam aplicadas nas primeiras horas da manhã e ao
entardecer, uma vez que, irrigação nas horas mais quentes
pode danificar as mudas, principalmente quando
fertirrigadas (CESP, 2000).
Para Bernardo et al. (2005), é necessário conhecer o
comportamento da cultura em função das diferentes
quantidades de água fornecidas e identificar as fases de
desenvolvimento de maior consumo de água, e os períodos
críticos, quando a falta ou o excesso provocaria quedas de
produção. Objetivou-se, no presente trabalho, avaliar o
efeito de lâminas de irrigação sobre o desenvolvimento de
mudas micropropagadas de helicônia (Heliconia lingulata
Ruiz & Pav.), em fase de aclimatização, em ambiente
protegido.
MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi conduzido em um ambiente
protegido pertencente à Embrapa Agroindústria Tropical,
no período de fevereiro a abril de 2006. A área está situada
no município de Fortaleza, Ceará, com as coordenadas
geográficas correspondentes à 3º44 S, 38º33 W e 19,5 m
de altitude. De acordo com a classificação climática de
Koppen, o clima da região é do tipo Aw , caracterizado
como clima tropical chuvoso, de savana tropical, com a
época mais seca no inverno e máximo de chuvas no verãooutono.
O túnel alto de cultivo forçado, de formato
semicircular e orientação leste-oeste foi instalado com as
seguintes dimensões: 45 m de comprimento, 5 m de largura
e 2 m de altura, comportando aproximadamente uma área
de 225 m² e um volume de 357 m3. Toda a sua estrutura foi
completamente coberto por uma tela de sombreamento,
para reduzir 50% da luminosidade.
O sistema de irrigação empregado foi do tipo
microaspersão suspenso, sendo constituído por um
conjunto motobomba, uma linha principal, uma linha de
derivação e uma linha lateral de 10 m, com emissores
espaçados de 2,4 m e a uma altura de 0,5 m das bandejas.
Os microaspersores foram do tipo nebulizador, modelo
Tietze, com bocal violeta em posição invertida, a vazão do
emissor era de 43 l h-1, na pressão de 30 kgf cm-2.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 55-61, 2008
Aclimatização de mudas micropropagadas de Heliconia...
As mudas de helicônia (Heliconia lingulata)
utilizadas nesse experimento foram obtidas através do
processo de micropropagação, realizado no Laboratório
de Cultura de Tecidos e Genética Vegetal da Embrapa
Agroindústria Tropical. Na ocasião do plantio, as mudas
apresentavam-se completamente enraizadas e com alturas
variando de 2,6 a 3,5 cm.
As plantas provenientes do material in vitro foram
retiradas dos frascos e suas raízes, lavadas em água
corrente para a retirada do excesso do meio de cultura.
Após a lavagem, as mudas foram colocadas em bandejas e
suas raízes podadas com o auxílio de uma tesoura, com o
objetivo de uniformizar o material, facilitar o plantio e
estimular o desenvolvimento de um sistema radicular mais
funcional.
As mudas foram transplantadas para tubetes de
capacidade volumétrica de 180 cm3, contendo o substrato
formado pela mistura pó-de-coco seco + húmus de
minhoca + solo (PCS+H+S), na proporção de 1:1:1,
misturado no Laboratório de Solos da Embrapa, e sem
fornecimento de fertilizantes, durante o período
experimental. Para promover o completo umedecimento
do substrato e aumentar a umidade relativa do ambiente,
momentos antes da transferência das mudas para os
tubetes, o sistema de irrigação foi acionado
proporcionando assim um ambiente favorável ao
estabelecimento das mudas. Com os recipientes em seus
devidos lugares, as mudas foram acondicionadas e
levadas em bandejas até o túnel alto de cultivo forçado,
iniciando a etapa de plantio. As mudas foram inseridas
numa profundidade média de 5 cm, de forma que as raízes
e a parte inicial do caule ficaram enterradas. As mudas
foram transferidas para os respectivos substratos no dia
3 de fevereiro de 2006.
Para promover melhores condições para o
estabelecimento das mudas, do primeiro ao quadragésimo
quinto dia após o transplantio (DAT), essas receberam
uma irrigação padrão, com a aplicação de uma lâmina
correspondente a 3 mm de água, parcelada duas vezes ao
dia, sendo uma aplicação pela manhã, iniciando-se
57
aproximadamente às 9 h, e a outra à tarde, a partir das 16 h.
A partir do 45º DAT foi adotada a diferenciação das lâminas
de irrigação.
O delineamento experimental foi em blocos
casualizados, composto por quatro tratamentos e cinco
repetições, constituídas por cinco fileiras verticais com
cinco plantas cada, totalizando 25 plantas por tratamento,
num total de 100 plantas por experimento. Os tratamentos
consistiram de quatro níveis de irrigação, equivalentes às
lâminas de 1,0 (L1), 2,0 (L2), 3,0 (L3) e 4,0 (L4) milímetros de
água, também parcelada em duas aplicações diárias; às 9 h
e às 16h.
Os dados foram coletados em duas ocasiões após
a diferenciação das lâminas de irrigação. A primeira coleta
de dados ocorreu em 04 de abril, aos 60 dias após o
transplantio (DAT), e a segunda em 19 de abril (aos 75
DAT). As variáveis analisadas foram número de folhas
(NF), altura da planta (AP) e diâmetro do caule (DC). O
número de folhas foi contado visualmente em todas as
mudas transplantadas. Todas as folhas foram consideradas
na contagem, exceto as totalmente secas. A altura da planta
foi medida a partir da base até a abertura das folhas, por
meio de um escalímetro graduado em centímetros,
subdividido em milímetros. O diâmetro do caule foi
mensurado com o auxílio de um paquímetro digital,
graduado em centímetros, considerando a base do caule
como padrão de contagem.
As análises estatísticas foram realizadas com o
auxílio dos aplicativos Microsoft Office Excel e SISVAR
versão 4.6 (FERREIRA, 2003).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os valores médios mensais de temperatura do ar,
umidade relativa do ar, radiação solar global e velocidade
do vento a 2 m de altura, registrados durante o experimento
pela estação meteorológica automatizada da Universidade
Federal do Ceará (UFC), encontram-se na Tabela 1, cuja
temperatura média do período foi de 23 ºC e umidade relativa
média de 93%, caracterizando um período de temperaturas
amenas.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 55-61, 2008
58
AZEVEDO, B. M. de et al.
Nas condições em que foi realizado o experimento,
(AP) e diâmetro do caule (DC), aos 60 e 75 DAT estão
o desenvolvimento das mudas de helicônia (Heliconia
apresentadas na Tabela 2. Pôde-se verificar que as lâminas
lingulata) foi afetado pelos diferentes níveis de irrigação
de irrigação influenciaram as três variáveis analisadas ao
aplicados. As análises de variância das características de
nível de 5% de probabilidade pelo teste F.
desenvolvimento número de folhas (NF), altura da planta
Tanto o déficit quanto o excesso hídrico afetaram o
(AP) e diâmetro do caule (DC), aos 60 e 75 DAT estão
crescimento das mudas. Isso pode ter ocorrido pelo fato
apresentadas na Tabela 2. Pôde-se verificar que as lâminas
da deficiência hídrica ocasionar o fechamento dos
de irrigação influenciaram as três variáveis analisadas ao
estômatos, diminuindo a concentração intracelular de CO2
nível de 5% de probabilidade pelo teste F.
e, conseqüentemente, gerando decréscimo na assimilação
Nas condições em que foi realizado o experimento,
do mesmo (BERNARDO et al., 2005). Já o excesso hídrico
o desenvolvimento das mudas de helicônia (Heliconia
ocasiona a falta de oxigênio que provoca a redução da
lingulata) foi afetado pelos diferentes níveis de irrigação
fotossíntese e prejudica a conversão da matéria orgânica
aplicados. As análises de variância das características de
pelos microorganismos, em formas solúveis que a planta
desenvolvimento número de folhas (NF), altura da planta
possa reutilizar. Esses fatores podem proporcionar um
TABELA 1 Valores médios mensais de temperatura do ar, umidade relativa do ar, radiação solar global e velocidade
do vento a 2m de altura, Fortaleza-CE, 2006.
Temperatura (ºC)
U R (%)
Rad. solar global (W m-2)
Vel. do vento (m s-1)
Fevereiro
23
95
1329
1,73
Março
24
84
1291
1,25
Mês
Abril
23
99
1162
Fonte: Estação meteorológica automatizada da Universidade Federal do Ceará (UFC).
0,94
TABELA 2 Análise de variância das características de desenvolvimento: altura da planta (AP), diâmetro do caule
(DC) e número de folhas (NF) de mudas de helicônia (Heliconia lingulata), em função das laminas aplicadas, aos 60
e 75 DAT.
Variável
AP
DC
NF
FV
GL
Quadrado médio
60 DAT
75 DAT
ns
0,2946ns
Bloco
4
0,3966
Tratamento
3
2,3675*
3,1348*
Resíduo
12
0,3593
0,6279
ns
0,2754ns
Bloco
4
0,6407
Tratamento
3
1,6645*
4,1102*
Resíduo
12
0,6222
0,6728
*
0,1829ns
Bloco
4
0,4377
Tratamento
3
0,3421*
0,5204*
Resíduo
12
0,773
0,1081
(ns) não significativo;* significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 55-61, 2008
Aclimatização de mudas micropropagadas de Heliconia...
menor crescimento das plantas devido à diminuição da
eficiência de transformação de fotoassimilados, nessas
condições (REGO et al., 2004).
A análise de regressão indica que o modelo que
melhor se ajustou à relação altura de planta em função da
lâmina de irrigação, aos 60 e 75 DAT foi o polinomial
quadrático, apresentando valores para R2 de 0,997 e 0,966,
respectivamente (Figuras 1 e 2). Observa-se que aos 60 e 75
DAT, a altura da planta aumentou com a lâmina aplicada até
59
um ponto máximo de 2,47 e 2,50 mm dia-1, respectivamente,
representando a lâmina que proporcionou maior
desenvolvimento das mudas em relação à altura da planta,
sendo obtida 8,96 e 10,12 cm, respectivamente. Lâminas acima
desse valor causaram redução no crescimento,
possivelmente, devido ao excesso de água.
Soares et al. (1998) salientam que a água em excesso
proporciona aumentos nos custo de produção e do risco
de lixiviação da água e dos nutrientes nela diluídos, o que
9,40
Altura da planta(cm)
9,00
8,60
8,20
7,80
AP = -0,5934*LI2 + 2,9273*LI + 5,3519
R2 = 0,997
7,40
7,00
1,0
2,0
3,0
4,0
-1
Lâmina de irrigação (mm dia )
FIGURA 1 Altura de plantas de helicônia (Heliconia lingulata), em função das lâminas de irrigação, aos 60 DAT,
Fortaleza-CE, 2005. (ns: não significativo pelo teste F; *: significativo ao nível de 5%, pelo teste F).
10,4
Altura da planta (cm)
10,0
9,6
9,2
8,8
2
AP = -0,6728*L + 3,3294*L + 5,9869
8,4
2
R = 0,966
8,0
1,0
2,0
3,0
4,0
-1
Lâmina de irrigação (mm dia )
FIGURA 2 Altura de plantas de helicônia (Heliconia lingulata), em função das lâminas de irrigação, aos 75 DAT,
Fortaleza-CE, 2005. (*- significativo ao nível de 5% pelo teste F).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 55-61, 2008
60
AZEVEDO, B. M. de et al.
pode prejudicar o desenvolvimento radicular. Além disso,
o excesso de água compromete os processos de
fotossíntese e respiração, os quais envolvem a utilização
de determinadas concentrações de oxigênio (RAVEN et
al., 2001). Já em casos de déficit hídrico, podem ocorrer
problemas de ordem fisiológica, ou seja, afetar
negativamente o desenvolvimento das plantas.
Em ambos os períodos avaliados, observou-se que
as lâminas aplicadas influenciaram o diâmetro de caule
das mudas de helicônia, com valores médios de 9,7 e 10,3
cm aos 60 e 75 DAT, respectivamente. A análise de
regressão indicou que aos 60 DAT, o modelo polinomial
quadrático foi o que melhor representou o diâmetro do
caule em função das lâminas de irrigação, com R2 de 0,746
(Figura 3). O máximo valor do diâmetro de caule (10,22
cm), calculado por derivação da curva de ajuste, foi obtido
aplicando-se uma lâmina de 2,64 mm dia-1. A partir dessa
lâmina, houve uma diminuição no diâmetro de caule,
ocasionado possivelmente, pelo excesso de água. Aos
75 DAT, o modelo matemático ajustado para relacionar o
diâmetro de caule em função da lâmina de irrigação,
apresentou coeficiente de determinação (R2) muito baixo,
não sendo representativo.
Modelos polinomiais quadráticos para explicar o
efeito da lâmina de irrigação sobre a altura e diâmetro de
caule também foram obtidos por Pieter et al. (2007) na
produção da flor da fortuna, por Lopes et al. (2005) em
mudas de Eucalyptus grandis W. Hill, por Pereira et al.
(2003) e Rêgo et al. (2004), na cultura do crisântemo.
A análise de variância (Tabela2) indicou que o
número de folhas nas mudas de helicônia foi influenciado
pelas lâminas de irrigação, nas duas épocas analisadas (60
e 75 DAT), com valores médios de 3,25 e 3,45 folhas nas
respectivas épocas, porém o modelo matemático para
representar essa relação apresentou coeficiente de
determinação (R2) muito baixo e não foi estatisticamente
significativo.
As análises mostraram que, aos 60 e 75 DAT, a
lâmina de irrigação ideal, que proporcionou o melhor
desenvolvimento das plantas, encontra-se na faixa
compreendida de 2,47 a 2,64 mm dia -1 . Valores
semelhantes foram obtidos por Gomes et al. (2006), que
verificaram que a taxa de evapotranspiração média da
Heliconia psittacorum L. f. x H.Spatho-circinada
Aristeg, cultivada em ambiente protegido foi de 2,2 mm
dia-1.
11,0
Diâmetro do caule(cm)
10,5
10,0
9,5
9,0
2
DC= -0,4111*L + 2,1726*L + 7,3492
2
R = 0,746
8,5
8,0
1,0
2,0
3,0
4,0
-1
Lâmina de irrigação (mm dia )
FIGURA 3 Diâmetro de caule de mudas de helicônia (Heliconia lingulata), aos 60 DAT em função das lâminas de
irrigação, Fortaleza, CE. (*- significativo ao nível de 5% pelo teste F).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 55-61, 2008
Aclimatização de mudas micropropagadas de Heliconia...
CONCLUSÕES
As lâminas de irrigação influenciaram as
características de desenvolvimento avaliadas aos 60 e 75
DAT.
A altura de planta e o diâmetro de caule
apresentaram resposta quadrática em relação às lâminas
aplicadas.
Nas condições em que foi desenvolvido este
trabalho, para a aclimatização de mudas micropropagadas
de helicônia, recomenda-se irrigar com 2,5 mm dia-1, com o
intuito de se obter mudas mais vigorosas, para serem
transplantadas para condições de campo.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudo.
À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária,
CNPAT, pela oportunidade de realização desta pesquisa.
61
GONDIM, R. S.; GOMES, A. R. M.; BEZERRA, F. C.;
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Grande, v. 4, n. 2, p. 6, 2004.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 55-61, 2008
62IN
VITRO ORGANOGENESIS
OF R.PASSION
FRUIT (PASSIFLORA
ALEXANDRE,
S. et al.
EDULIS SIMS. F. FLAVICARPA DEG.) AFFECTED BY
IRRADIANCE, SUCROSE AND EXPLANT POSITION
ORGANOGÊNESE IN VITRO DO MARACUJAZEIRO (PASSIFLORA EDULIS SIMS.
F. FLAVICARPA DEGENER) AFETADO POR IRRADIÂNCIA, SACAROSE E
POSIÇÃO DOS EXPLANTES
RODRIGO SOBREIRAALEXANDRE1, FLÁVIO ALENCAR D ARAÚJO COUTO1, JOSÉ MARIA MOREIRA DIAS1,
WAGNER CAMPOS OTONI2, RITA DE CÁSSIA MENDES3, PAULO ROBERTO CECON4
1
Professor, Doutor, Departamento de Fitotecnia Universidade Federal de Viçosa/UFV Av. P.H. Rolfs, 36571-000 Viçosa, MG
[email protected]
2
Doutor, Departamento de Biologia Vegetal Universidade Federal de Viçosa/UFV Av. P.H. Rolfs, 36571-000 Viçosa, MG.
3
Técnica em Química, Graduanda em Agronomia, Departamento de Fitotecnia Universidade Federal de Viçosa/UFV Av. P.H.
Rolfs, 36571-000 Viçosa, MG.
4
Doutor, Departamento de Informática Universidade Federal de Viçosa/UFV Av. P.H. Rolfs, 36571-000 Viçosa, MG.
ABSTRACT
The culture of the tissues has helped considerably the
Passiflora genus development, achieving successfully the
morphogenic responses in different in vitro explants. The
objective this work was to assess the in vitro morphogenic
responses of hypocotyl segments of passion fruit collected from
5 positions (apical, sub-apical, median, sub-basal, and basal;
namely, 1-5, respectively) along the hypocotyls axis and cultured
in medium with different concentrations of sucrose and exposed
to irradiance levels. The experiments were performed as a
completely randomized blocks design with 15 repetitions in 4 x
4 x 5 factorial scheme (irradiance x sucrose x explant positions),
totalizing 80 treatments, on which every experimental parcel
was comprised of a flask containing five hypocotyls. The
hypocotyl segment from positions 1 and 3, at their extreme
distal ends, cultured onto medium of culture with 30 g L-1 sucrose
and under 100 µmol m-2 s-1 irradiance enable the greatest number
of buds and shoots differentiated. The distal extremity from the
segments of hypocotyl farthest from the cotyledonary nodes
(position 1), cultivated in 20 g L-1 sucrose and exposed to 50
µmol m-2 s-1 irradiance result in the best condition for shoot
development.
Index terms: Passiflora edulis f. flavicarpa, in vitro propagation,
yellow passion fruit.
RESUMO
A cultura de tecidos tem auxiliado no desenvolvimento
do gênero Passiflora, alcançando sucesso morfogênico em
diferentes explantes in vitro. Objetivou-se, neste trabalho, avaliar
respostas morfogênicas in vitro de segmentos de hipocótilo do
maracujazeiro coletados de 5 posições (apical, sub-apical,
mediana, sub-basal e basal; isto é, 1-5, respectivamente) ao longo
do eixo dos hipocótilos e cultivados em meios com diferentes
concentrações de sacarose e expostos a níveis de irradiância. O
experimento foi instalado em blocos casualizados, com 15
repetições, em esquema fatorial 4 x 4 x 5 (irradiância x sacarose x
posição dos explantes), totalizando 80 tratamentos nos quais
toda parcela experimental foi constituída de um frasco contendo
cinco hipocótilos. As posições 1 e 3, no extremo distal, dos
segmentos de hipocótilo, cultivados em meio de cultura com 30 g
L-1 de sacarose e sob 100 µmol m-2 s-1 de irradiância proporciona
maior número de brotos e brotos diferenciados. A extremidade
distal dos segmentos de hipocótilo extraídos mais distantes do
nó cotiledonar (posição 1), cultivados em 20 g L-1 de sacarose e
expostos à irradiância de 50 µmol m-2 s-1, resulta na melhor
condição para o desenvolvimento do broto.
Termos para indexação: Passiflora edulis f. flavicarpa,
propagação in vitro, maracujazeiro amarelo.
INTRODUCTION
The genus of Passiflora was originated at South
America and comprises more than 580 species, most of them
belonging to the Tropical America mainly from Brazil
(OLIVEIRA, 1987). Among them, the most commercially used
is the passion fruit plant P. edulis Sims. f. flavicarpa Deg.
The culture of the tissue has been reaching with
the Passiflora genus answers satisfactory morphogenic in
different in vitro explants (BIASI et al., 2000; DORNELAS
& VIEIRA, 1993, 1994; MORAN-ROBLES, 1979; SCORZA
& JANICK, 1980).
The explant morphogenic capability has
relationship with the polarity effect; such factor is
responsible for the shoot emergence. Several studies were
researched to assess the effect of the position of the
(Recebido em 4 de março de 2008 e aprovado em 1 de setembro de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 62-69, 2008
In vitro organogenesis of passion fruit...
explants extracted from the hypocotyl and roots of Citrus
plantlets during the shoot-bud proliferation (BURGER &
HACKETT, 1986; COSTA et al., 2004; DIAS, 1998;
GARCIA-LUIS et al., 1999), as well as the effect of the
polarity in the formation the buds and shoots
(McCLELLAND & SMITH, 1990; YAE et al., 1987).
In the in vitro organogenesis of plants of the genus
Passiflora, several factors influence, among them; among
them, the irradiance, for which different types of explants
were spared for the essays: 58 µmol m-2 s-1 in internodes
(MORAN-ROBLES, 1979); 20 µmol m-2 s-1 in mesophyllderived protoplasts (OTONI et al., 1995); 30 or 23 µmol m2 -1
s in leaf (KAWATA et al., 1995; APPEZZATO-DAGLÓRIA et al., 1999, respectively); 50 µmol m-2 s-1 in
endosperm (MOHAMED et al., 1996); 80, 30 or 24 µmol m2 -1
s in shoot cultures (FARIA & SEGURA, 1997;
KURIYAMA et al., 1998; BARBOSA et al., 2001,
respectively); 20-55 µmol m-2 s-1 in cotyledons (HALL et
al., 2000); 60 or 54 µmol m-2 s-1 in hipocotyl (COUCEIRO,
2002; FELISMINO, 2005, respectively). Although different
irradiances have been studied in these works, in none of
them the effect of difference irradiances was studied during
the in vitro organogenic process of passion fruit plant.
Other important factor for the in vitro
organogenesis is the source of carbon. The in vitro
organogenesis works affirm that sucrose has been the most
employed source of carbon in the culture for Passiflora
(APPEZZATO-DA-GLÓRIA et al., 1999; HALL et al., 2000);
its concentration varies from 10 to 30 g L-1.
The present work aimed to evaluate the in vitro
morphogenic responses of hypocotyledonary explants of
passion fruit plants throughout the use of different levels
of irradiance, sucrose concentration, and positions of the
segments of hypocotyls derived from in vitro germinated
plantlets.
MATERIALS AND METHODS
Axenic and vigorous etiolated plantlets were
obtained from in vitro germinated seeds, and used as
explants sources.
63
In vitro-grown seedlings (25-30 days-old) were
transversally cut into 1-1.2 cm long were cultured on
different conditions of incubation. The explants were
cultured in 300 mL glass flasks (Santa Marina, São Paulo,
Brazil) containing 30 mL aliquots of MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962) medium salts, 100 mg L-1 mio-inositol, 1.0
mg L-1 6-benzylaminopurine (BAP), vitamins of White
(1951), and 8.0 g L-1 of agar (Isofar®, Brazil). The medium
pH was adjusted to 5.7 ± 0.1, before the addition of agar.
Several concentrations of sucrose (0, 10, 20 or 30 g L-1)
were added to this medium. The culture flasks were sealed
with polypropylene lids, and the medium was autoclaved
at 121ºC, 1.5 kgf cm-2 during 20 minutes.
The segments of hypocotyls were cut in five
segments numbered from 1 to 5 follows: 1 basal: the first
segment adjacent to the root collar; 2 sub-apical: the
second segment adjacent to the hypocotyl root; 3 median:
the central segment in relation to the hypocotyl region; 4
sub-apical: the second segment that is adjacent to the
cotyledonary node; 5 - apical: the first segment that is
DE
PE
5
4
3
2
1
Axenic plantlets
5
4
3
1 2
Segments of hypocotyls in the
medium of culture
FIGURE 1 The segments of hypocotyls numbered from
1 to 5 were characterized as follows: 1 basal: the first
segment adjacent to the root collar; 2 sub-apical: the
second segment adjacent to the hypocotyl root; 3
median: the central segment in relation to the hypocotyl
region; 4 sub-apical: the second segment that is adjacent
to the cotyledonary node; 5 - apical: the first segment that
is adjacent to the cotyledonary node. (*): ED = distal
extremity; EP = proximal extremity.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 62-69, 2008
64
ALEXANDRE, R. S. et al.
adjacent to the cotyledonary node (Figure 1). In this order,
the five hypocotyl explants were placed horizontally on
the media, maintaining the proximal extremity towards the
wall of the flask, and having the distal extremity facing the
centre of the flask.
The flasks were distributed 5 cm far from each other
on the shelves at the growth room to avoid shadowiness
at these flasks. The explants were kept at the temperature
of 27 ± 2ºC, photoperiod of 16/8-h light/dark regime, and
irradiances of 25, 50, 100 and 150 µmol m-2 s-1.
The irradiance levels were provided by the
utilization of 40 W daylight fluorescent light tubes (Osram®,
Brazil), as follows: I - 25 µmol m-2 s-1 (1 light on; without
dislocating the luminous panel); II- 50 µmol m-2 s-1 (2 lights
on; without dislocating the luminous panel); III - 100 µmol
m-2 s-1 (4 lights on; setting the luminous panel at 20 cm
from the shelf surface); IV - 150 µmol m-2 s-1 (5 lights on;
setting the luminous panel at 16 cm from the shelf surface).
Copper strings were used to support the fluorescent
incandescent lamps.
After 45 days of incubation, regeneration frequencies
and number of shoots per explant were assessed, which
were formed at the distal and proximal ends. The
organogenesis was assessed regarding shoot lengths from
the evaluated positions at the proximal and distal ends.
The experiment was performed under complete
randomized blocks design with 15 replicates in a 4 x 4 x 5
factorial scheme (irradiance levels: 25, 50 100 and 150 ìmol
m-2 s-1 x sucrose concentrations: 0, 10, 20 and 30 g L-1 x
position of the explants at the hypocotyl: 1, 2, 3, 4 and 5)
totalizing 80 treatments, being the experiment plot
comprised of a flask containing five segments of
hypocotyl. Considering the three factors studied were made
by analysis of test average (Tukey) and regression to
concentrations of sucrose and levels of irradiance. The
experiments were repeated at least once.
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro organogenesis at the distal extremity: The
differentiation of buds and shoots as influenced by
irradiance levels and distinct positions of explants along
the hypocotyls axis, and the mean values and the standard
deviation of the total number of buds and shoots formed
at the distal extremity are shown in figures 2 and 3,
respectively.
Independently from the other factors, at the medium
without sucrose there was no morphogenic response in
the explants (Figure 2 Aa, Ba, Ca, Da).
The number of structures formed at the distal
extremity reached the highest means when there was added
30 g L-1 sucrose to the medium under 100 µmol m-2 s-1
irradiance, at the positions 1 and 3 (Figure 3a). Considering
the means of the five explant positions, an average of 5.92
structures per explant was obtained. Similarly, Couceiro
(2002) has obtained 5.90 structures per explant at the distal
extremity when cultivating them horizontally, under 60 µmol
m-2 s-1 of irradiance in MS medium, containing 5.0 mg L-1 of
BAP and 30 g L-1 of sucrose. Garcia-Luis et al. (1999) have
shown in Citrange Troyer that despite the explants being
horizontally placed on the medium surface, there was an
additional effect of polarity, evidenced by the larger number
of shoots differentiated at the apical extremity, and the
distance among the cotyledonary node has affected the
morphogenesis. These results confirmed the studies of
Ziv et al. (1970) and Fari & Czako (1981), evidencing that,
normally, in stem and root sections, the shoot-buds are
formed at the distal extremity and the roots at the proximal
extremity. In the present work, structures formed at both
explant extremities but in a higher degree at the distal
extremity.
The largest value found for the average length of
the shoot a was 3.64 mm for the explants that were extracted
farthest from the cotyledonary node (position 1) and
cultured in medium containing 20 g L-1 of sucrose and
submitted to 50 µmol m-2 s-1 of irradiance (Figure 4a).
However, in Passiflora actinia, the inclusion of auxins to
the medium favoured the development of the shoot-buds
that, consequently, presented larger lengths when the
hypocotyl segments were cultivated in MS medium
containing 0.01 mg L-1 de IBA (KOCH et al., 2001).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 62-69, 2008
In vitro organogenesis of passion fruit...
A
1
2 3 4 5
Distal extremity
a
1
2
3
4
5
b
1
2
3
4
5
c
65
1
2
3
4
5
d
Proximal extremity
B
a
b
c
d
C
a
b
c
d
D
a
b
c
d
FIGURE 2 In vitro organogenesis in hypocotyl segments that are characterized by the positions that varies
from 1 to 5, under effect of different irradiance levels: A: 25 µmol m-2 s-1; B: 50 µmol m-2 s-1; C: 100 µmol m-2 s-1 and
D: 150 µmol m-2 s-1 and sucrose concentrations (a: 0, b: 10, c: 20, d: 30 g L-1), for 45 days.
In vitro organogenesis at the proximal extremity:
The mean values and the standard deviation of the total
number of buds and shoots formed at the proximal extremity
of the explants are presented in Figure 3b. Likewise to the
distal extremity, the formation of buds and shoots did not
happen when the explants were cultured in medium without
sucrose (Figure 2 Aa, Ba, Ca, Da).
The differentiation and development of the buds
and shoots at the proximal extremity reached the highest
averages (3.5) at 25 µmol m-2 s-1 of irradiance in MS medium
containing 20 g L-1 sucrose for explants derived from the
position 4 (Figure 3b). Concurrently, the work by Baccarin
(1988) pointed out the best bud and shoot proliferation in
explants from the regions closer to the cotyledonary nodes.
The presence of BAP in the medium was essential to
the organogenic process as observed in works with Passiflora
spp. (BECERRA et al., 2004; BIASI et al., 2000; DORNELAS
& VIEIRA, 1994; FERNANDO, 2005; HALL et al., 2000).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 62-69, 2008
ALEXANDRE, R. S. et al.
Position 1
10
a
8
6
4
2
0
10
25
50
100
Position 2
150
8
6
4
2
0
10
25
50 Position 100
3
150
8
6
4
2
0
10
25
50
100
Position 4
150
8
6
4
2
0
10
25
50 Position100
5
150
8
6
4
2
0
25
50
100
-2
150
Número total de estruturas Número total de estruturas Número total de estruturas Número total de estruturasNúmero total de estruturas
Número total de estruturasNúmero total de estruturasNumber total of estrutures Número total de estruturasNúmero total de estruturas
66
5
Position 1
4
b
Sucrose
(g L-1)
10
3
20
2
30
1
0
5
25
50 Position 100
2
150
25
50
100
Position 3
150
25
50
100
Position 4
150
25
50
100
Position 5
150
25
50
100
150
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
-1
Irradiance (µmol m s )
-2
-1
Irradiance (µmol m s )
FIGURE 3 Mean values and standard deviation of the total number of structures (buds and shoots) formed at the
distal (a) and proximal (b) extremities of the explants, which were under the effect of different sucrose concentrations,
irradiance and explant positions at the hypocotyl. Bars are the averages and their standard deviation.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 62-69, 2008
0
25
50 Position 100
2
150
3
2
1
0
25
50 Position 100
3
150
3
2
1
Comprimento de brotos
(mm)
Comprimento de brotos
(mm)
0
4
25
50
100
Position 4
150
3
2
1
0
4
25
50
100
Position 5
150
3
2
1
0
25
50
100
-2
150
-1
Irradiance (µmol m s )
Comprimento de brotos Comprimento de brotos
(mm)
(mm)
1
Comprimento de brotos
(mm)
2
4
Length of shoots
(mm)
a
3
Comprimento de broto
(mm)
4
Position 1
Comprimento de brotos
(mm)
Comprimento de brotos
(mm)
4
Comprimento de brotos
(mm)
In vitro organogenesis of passion fruit...
67
3
Position 1
2
b
Sucrose
(g L-1)
10
20
30
1
0
3
25
50 Position 2100
150
25
50 Position100
3
150
25
50 Position 100
4
150
25
50
100
Position 5
150
25
50
100
150
2
1
0
3
2
1
0
3
2
1
0
3
2
1
0
-2
-1
Irradiance (µmol m s )
FIGURE 4 Mean values and standard deviation of the lengths of structures (buds and shoots) formed at the distal
(a) and proximal (b) extremities of the explants, which were under the effect of different sucrose concentrations,
irradiance and explant positions at the hypocotyl. Bars are the averages and their standard deviation.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 62-69, 2008
68
ALEXANDRE, R. S. et al.
Independently from the irradiance levels, different
sucrose concentrations and explant positions at the
hypocotyl, the shoot elongation was considered to be
lower (Figure 4b) than the minimum recommended
(approximately 2-3 cm) for the in vitro rooting process. It
highlights the need of previous submission of the explants
to an adequate medium for the elongation process.
CONCLUSIONS
The morphogenic response for bud and shoot
formation was remarkably superior at the distal extremity.
The maximum concentration among the sucrose
and the irradiance of 100 µmol m-2 s-1 has proportioned
better morphogenic responses at the distal extremity,
regardless the position of the explants.
The buds and shoots differentiated at the distal
extremity, farthest to the cotyledonary node, developed
better under 50 µmol m-2 s-1 of irradiance in medium
supplemented with 20 g L-1 sucrose.
The use of a carbon source is essential for in vitro
morphogenesis.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 62-69, 2008
70
AVALIAÇÃO DE SUBSTRATOS
DE MUDAS
CUNHA FILHO, F.NA
N. da PRODUÇÃO
et al.
DO ABACAXIZEIRO ORNAMENTAL [Ananás comosus (L.) Merr.
var. bracteatus (Lindl.) Coppens & F. Leal] EM CONDIÇÕES
DE CASA DE VEGETAÇÃO
SUBSTRATES EVALUATION FOR PRODUCTION OF ORNAMENTAL PINEAPPLE
[Ananas comosus (L.) Merr. var. bracteatus (Lindl.) Coppens & F. Leal] PLANTS
UNDER GREENHOUSE CONDITIONS
FRANCISCO NUNES DA CUNHA FILHO1, ANTONIO CARLOS TORRES1, JOÃO MARIA CHARCHAR1
1
Embrapa Hortaliças, Cx. P. 218 70359-970 Brasília, DF [email protected] ; [email protected]
RESUMO
A utilização de substratos na aclimatação de mudas
micropropagadas oferece considerável vantagem no custo e na
possibilidade de obtenção de alta porcentagem de sobrevivência
dos propágulos ex vitro aliado à obtenção de mudas mais
uniformes, vigorosas, precoces e com alta qualidade fitossanitária.
Avaliaram-se quatro diferentes tipos de substratos (fibra de coco
comercial, fibra de coco-verde da Embrapa Hortaliças, Plantmax
e substrato padronizado da Embrapa Hortaliças) na aclimatação
de mudas do abacaxizeiro ornamental. As variáveis massa fresca
total, massa fresca da parte aérea, massa fresca de raízes,
comprimento de raízes, altura de plantas e número total de folhas
foram avaliadas. O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado com quatro tratamentos e com quatro
repetições. Pela análise dos resultados o substrato padronizado
da Embrapa Hortaliças, o de fibra de coco comercial e o Plantmax
foram os mais eficientes na produção de mudas de abacaxizeiro
ornamental para fins comerciais. O substrato de coco-verde da
Embrapa Hortaliças foi o menos indicado.
Termos para indexação: Ananas comosus var. bracteatus, planta
ornamental, substrato.
Index terms: Ananas comosus var. bracteatus, ornamental plant,
growth substrate.
INTRODUÇÃO
Os abacaxizeiros ornamentais apresentam flores e
infrutescências de beleza atrativa, muito usadas em arranjos
decorativos e ornamentais no Brasil e exterior,
representando um segmento de grande potencial para
exportação (CABRAL, 2000; SOUZA et al., 2004). No
comércio de flores nativas, o abacaxi ornamental já obteve
valores agregados da ordem de 5.000%, em relação ao
abacaxi de fruta não ornamental (SOUZA et al., 2004).
A propagação vegetativa do abacaxizeiro ornamental
para fins de comercialização é feita por mudas oriundas da
planta-mãe. Porém, essa propagação apresenta o
inconveniente de disseminar agentes patogênicos e pragas
ABSTRACT
The use of substrate in the acclimatization of
micropropagated plants offers considerable cost advantages and
the possibility to obtain high percentage of ex vitro surviving
plants as well as in the production of uniform, vigorous, precocious
and healthy plants. Four different substrates (commercial coconut
fiber, green-coconut fiber from Embrapa Hortaliças, Plantmax
and the standardized substrate of Embrapa Hortaliças) were
evaluated for acclimatization of ornamental pineapple plants.
Total fresh mass, fresh mass of shoots, fresh mass of roots, root
length, plant height, and total number of leaves were obtained.
The experiment followed a complete randomized design with
four treatments and four replicates. The results showed that the
standardized substrate of Embrapa Hortaliças, commercial
coconut fiber and Plantmax were the most efficient for the
production of ornamental pineapple plants for commercial
purpose. Green-coconut fiber substrate from Embrapa was less
indicated.
pela utilização de mudas contaminadas. Dentre os patógenos
e pragas mais comuns, destacam-se o fungo Fusarium
subglutinans (Wollenw. & Reinking) P.E. Nelson (TOUSSON
& MARASAS, 1983) e a cochonilha Dysmicoccus brevipes
(Cockerell, 1983) (Hemiptera:Pseudococcidae) (REINHARDT
& CUNHA, 1999).
Outra limitação da propagação vegetativa de
plantas de abacaxizeiro ornamental é o baixo número de
mudas produzidas, obtendo-se no máximo dez mudas por
ano, número esse considerado insuficiente para atender o
mercado (CORREIA et al., 2000). Esse problema poderia
ser resolvido com a utilização das técnicas de cultura de
(Recebido em 15 de maio de 2008 e aprovado em 2 de setembro de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 70-75, 2008
Avaliação de substratos na produção de mudas...
tecidos para obtenção de mudas em grande quantidade,
uniformes, de maior vigor, precoces e com alta qualidade
fitossanitária. Vários protocolos de micropropagação têm
sido descritos para espécies do gênero Ananas (CORREIA
et al., 1999, 2000; MATHEWS & RANGAN, 1979; SANTOS,
2008; SILVA et al., 2002). Aliado ao processo de
multiplicação in vitro faz-se necessário o estabelecimento
de um substrato para o subseqüente crescimento ex vitro
das mudas, visando reduzir a mortalidade durante a
aclimatação. Diferentes substratos têm sido descritos na
literatura para o transplante e aclimatação de mudas
micropropagadas, destacando-se vermiculita, perlita, areia,
turfa, casca curtida de eucalipto ou Pinus, palha de arroz
carbonizada, pó de carvão (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998), casca de arroz carbonizada, pó de
casca de coco seco e verde (SANTOS et al., 2006); mistura
de areia/xaxim/húmus (SOUZA JUNIOR et al., 2001); solo,
esterco bovino, Plantmax e composto orgânico, em
diferentes proporções (MOREIRA et al., 2006), dentre
outros. Entretanto, para o genótipo em estudo as
tecnologias disponíveis necessitam de adequação para
serem mais eficientes e de baixo custo na produção
comercial de mudas.
Objetivou-se, neste trabalho, avaliar quatro
diferentes substratos na produção de mudas do
abacaxizeiro ornamental [Ananas comosus (L.) Merr. var.
bracteatus (Lindl.) Coppens & F. Leal] para fins comerciais,
utilizando-se propágulos produzidos in vitro.
71
solidificado com 0,6% de ágar e o pH do meio foi ajustado
para 5,7. O meio foi distribuído em tubos de ensaio de 25 x
150 mm, na quantidade de 12,5 mL por tubo.
Os tubos foram esterilizados em autoclave a 121ºC
e a 104 Kpa de pressão, por 15 minutos. Após a inoculação
as culturas foram mantidas em câmara de crescimento, com
fotoperíodo de 16 horas, irradiância de 32 mmol m-2 s-1,
temperatura de 27oC, durante 30 dias.
As mudas foram pré-aclimatizadas mediante
abertura das tampas dos frascos de cultura, cinco dias
antes do transplantio para os respectivos substratos.
Transplante e desenvolvimento de mudas micropropagadas
Mudas enraizadas e pré-aclimatizadas de
abacaxizeiro ornamental foram retiradas dos tubos de
cultura e transplantadas em bandejas de isopor com 72
células, contendo quatro diferentes substratos utilizados
como tratamentos: 1) substrato comercial de fibra de coco;
2) substrato de fibra de coco-verde da Embrapa Hortaliças;
3) substrato Plantmax; e 4) substrato padronizado da
Embrapa Hortaliças composto por solo de cerrado, areia
lavada, esterco de gado curtido e palha de arroz
carbonizada, em proporções de 3:1:1:1 v/v, com adição de
300 g de calcário dolomítico e de 300 g da formulação 430-16.
Apenas 30 células por bandeja foram
transplantadas com mudas de abacaxizeiro ornamental (uma
muda por célula), deixando-se 42 células livres (sem planta)
para que não houvesse competição entre plantas nas
MATERIAL E MÉTODOS
bandejas. As bandejas permaneceram cobertas com
Produção de mudas in vitro
envoltório plástico, nos primeiros três dias após o
Foram utilizados como fonte de explantes
propágulos produzidos in vitro, subcultivados a cada 60
dias, utilizando-se o método proposto por Correia et al.
(1999). Os explantes consistiram de brotações com 2 cm de
comprimento, transferidos para meio básico de cultura,
contendo sais minerais MS (MURASHIGE & SKOOG,
1962), acrescido de 3% de sacarose e, em mg L-1, incluíramse: i-inositol, 100; tiamina.HCl, 0,2; ácido nicotínico, 0,05;
piridoxina.HCl, 0,05 e glicina, 0,2. O meio de cultura foi
transplante.
O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado com 10 repetições para as variáveis
massa fresca total, massa fresca da parte aérea, massa fresca
de raiz e tamanho de raiz e 30 repetições para as variáveis
altura e número de folhas. Os dados foram coletados aos
90 dias, após o transplantio. A análise de variância do
experimento foi realizada com o auxílio do programa
estatístico SAS Institute Inc. (SAS INSTITUTE, 1988), e a
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 70-75, 2008
72
CUNHA FILHO, F. N. da et al.
diferenciação de médias pelo teste de Tukey, p 0,01 e
p 0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise conjunta do experimento indicou que
existiu homogeneidade de variância, não sendo necessária
a transformação de dados para a realização das análises. A
análise de variância (Tabelas 1 e 2) indicou que houve
efeito significativo dos diferentes substratos (teste de
Tukey, p 0,05) sobre a massa fresca total, massa fresca da
parte aérea, altura de plantas e número total de folhas, e
que não houve diferença significativa entre os diferentes
substratos, com relação à massa fresca de raízes e o
comprimento de raízes (Figuras 1 A-F).
Embora não tenha havido diferença significativa
(teste de Tukey, p 0,05) entre os valores de massa fresca
total e de massa fresca da parte aérea nos tratamentos com
os substratos padronizado da Embrapa Hortaliças,
comercial de fibra de coco e o Plantmax, os valores
absolutos mais elevados desses parâmetros foram obtidos
com o substrato padronizado da Embrapa Hortaliças
(Figuras 1 A-B).
No substrato de fibra de coco-verde da Embrapa
Hortaliças, as plantas de abacaxizeiro ornamental tiveram
sempre pior performance em produção de massa fresca
total e de massa fresca da parte aérea, não se diferenciando
estatisticamente dos valores obtidos com o uso dos
substratos comerciais da Plantmax e de fibra de coco.
Entretanto, esses substratos foram significativamente
inferiores (teste de Tukey, p 0,05), em relação aos valores
obtidos com o uso do substrato padronizado da Embrapa
Hortaliças (Figuras 1 A-B).
Os valores obtidos para as variáveis, massa fresca
de raízes e de comprimento de raízes, não diferiram
estatisticamente entre si (teste de Tukey, p 0,05), em
relação aos quatro tratamentos (substratos analisados).
Os maiores valores absolutos dessas variáveis foram obtidos
para a massa fresca de raízes no substrato padronizado da
Embrapa Hortaliças, e para o comprimento de raízes no
substrato comercial de fibra de coco (Figuras 1 C-D).
TABELA 1 Resumo da análise de variância para massa fresca total, massa fresca da parte aérea, massa fresca de
raízes e comprimento de raízes de A. comosus var. bracteatus.
Quadrado médio
Fontes de variação
GL
Massa fresca
total
Massa fresca
da parte aérea
Massa fresca
de raízes
Comprimento
de raízes
Tipo de substrato
03
67,3536**
51,8934**
0,2201ns
2,2382ns
Resíduo
36
11,5108
8,0557
0,1328
1,3107
Total
39
-
-
-
-
(**) significativo ao nível de 1% de probabilidade; (ns) não significativo.
TABELA 2 Resumo da análise de variância para altura e número de folhas de A. comosus var. bracteatus..
Fontes de variação
GL
Quadrado médio
Altura de plantas
Número total de folhas
Tipo de substrato
003
142,4357**
52,6854**
Resíduo
124
5,0188
1,6807
Total
127
-
-
(**) significativo ao nível de 1% de probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 70-75, 2008
Avaliação de substratos na produção de mudas...
A
12
Massa frsca da parte aérea (g)
Massa fresca total (g)
B
12
9,894+a 1,229
10
7,459+ab 1,414
8
73
6,254+ab 0,789
6
3,653+b 0,688
4
2
10
8,930+a 0,933
8
6,822+ab 1,152
6,002+ab 0,763
6
3,421+b 0,664
4
2
0
0
Plantmax
Embrapa
Hortaliças
Fibra de coco
Fibra de coco
verde
Plantmax
Embrapa Hortaliças
Fibra de coco
Fibra de coco verde
Tipo de substratos
Tipo de substratos
0,568 + 0,178 a
0,4
0,363 + 0,120 a
0,298 + 0,007 a
0,222 + 0,039 a
0,2
Comprimento de raizes (cm)
Massa fresca de raizes (g)
0,8
0,6
D
15
C
1
0
14
12,800 + 0,387 a
13
12,020 + 0,204 a
12
11
10
Plantmax
Embrapa
Hortaliças
Fibra de coco
Fibra de coco
verde
Plantmax
E
Fibra de coco
Fibra de coco
verde
F
12
13,800 + 0,406 b
11,789 + 0,412 a
Embrapa
Hortaliças
Tipo de substratos
11,088 + 0,381 a
8,797 + 0,385 c
Número total de folhas
Altura de plantas (cm)
Tipo de substratos
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
12,000 + 0,338 a
11,690 + 0,468 a
10
8,143 + 0,294 ab
8,818 + 0,259 a
7,727 + 0,191 b
8
5,882 + 0,173 c
6
4
2
0
Plantmax
Embrapa
Hortaliças
Fibra de coco
Fibra de coco
verde
Tipo de substratos
Plantmax
Embrapa
Hortaliças
Fibra de coco
Fibra de coco
verde
Tipo de substratos
FIGURA 1 Variáveis avaliadas na determinação de eficiência dos substratos Plantmax, Embrapa Hortaliças, fibra de
coco e fibra de coco-verde na produção de mudas do abacaxizeiro ornamental -em condições de casa de vegetação. A)
massa fresca total; B) massa fresca da parte aérea; C) massa fresca de raízes; D) comprimento de raízes; E) altura de
plantas e F) número total de folhas. Médias seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste
de Tukey, P<0,05.
Houve diferença significativa (teste de Tukey,
p 0,05) entre os valores médios obtidos para a altura de
plantas e para o número total de folhas nos quatro
tratamentos avaliados. As plantas tiveram,
significativamente, maior desenvolvimento em altura no
substrato padronizado da Embrapa Hortaliças. Não houve
diferença significativa entre os valores médios em altura
de plantas nos substratos comerciais da Plantmax e de
fibra de coco. Esses, porém, foram diferentes dos valores
obtidos no substrato de fibra de coco-verde, que
proporcionou, significativamente, o menor crescimento das
plantas (Figura 1 E).
Maiores médias da variável número total de folhas
foram obtidas com a utilização do substrato padronizado
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 70-75, 2008
74
CUNHA FILHO, F. N. da et al.
da Embrapa Hortaliças e do Plantmax. Não houve diferença
significativa entre os valores médios do número total de
folhas nos substratos Plantmax e de fibra de coco comercial,
mas esses diferiram estatisticamente dos obtidos no
substrato fibra de coco-verde. O substrato de fibra de cocoverde foi o que propiciou os menores valores da variável
número total de folhas (Figura 1 F). Esses resultados
contradizem os relatados por Carrijo et al. (2002), que
verificaram que os substratos contendo fibra de coco-verde
são os mais indicados para produção de mudas de
hortaliças e ornamentais em cultivo sem solo. Correia et al.
(2003) não observaram diferença significativa entre os
valores da massa fresca de raízes de mudas de cajueiro
anão precoce, crescidas em substratos com adição de pó
de coco-verde ou de pó de coco-maduro. Santos et al.
(2006) relataram que os substratos orgânicos contendo as
combinações de fibras de coco seco ou verde
proporcionaram baixo desenvolvimento na aclimatização
de mudas Heliconia rostrata Ruiz. & Pav. provenientes
da micropropagação. Porém, Bezerra et al. (2001) discordam
dos autores acima mencionados, informando que os
substratos contendo fibras de coco-verde ou seco foram
os mais indicados, respectivamente, para o enraizamento
de mudas de crisântemo (Chrysanthemum sp.) e de violeta
africana (Saintpaulia ionantha H. Wendl.).
Também substrato contendo casca de arroz
carbonizada tem sido utilizado na produção de mudas
micropropagadas. Weber et al. (2003) relataram que o
substrato contendo esse componente misturado com
vermiculita e vermicomposto em proporções de 1:1:1, foi a
melhor opção para aclimatação de mudas de abacaxizeiro
ornamental oriundas da cultura in vitro e transplantadas
para tubetes. Esses autores ainda observaram que o uso
da mistura contendo casca de arroz carbonizada e pó de
casca de coco em proporções de 1:1, resultou em baixo
desempenho de mudas do abacaxizeiro ornamental em
função da má agregação física, baixa retenção de água e
limitação nutricional da planta.
Neste trabalho, os resultados com o uso de substrato
contendo casca de arroz carbonizada sem a presença de
fibras de coco seco ou verde, também proporcionou
excelente desenvolvimento de mudas do abacaxizeiro
ornamental, o que indica uma provável incompatibilidade
das fibras de coco com outros componentes de substratos,
na produção de mudas dessa ornamental.
Não houve diferença significativa entre valores de
massa fresca de raízes e de comprimento de raízes de
abacaxizeiro ornamental em relação aos quatro substratos
analisados. Porém, o maior valor absoluto em massa fresca
de raízes foi obtido no substrato padronizado da Embrapa
Hortaliças, enquanto que o maior valor em comprimento
de raízes no substrato comercial de fibra de coco.
Com relação às demais variáveis analisadas,
observou-se que a massa fresca total e a massa fresca da
parte aérea tiveram performances mais significativas nos
substratos padronizado da Embrapa Hortaliças, comercial
de fibra de coco e o da Plantmax, enquanto que a altura de
plantas foi significativamente mais elevada no substrato
padronizado da Embrapa Hortaliças e o número total de
folhas mais significativo nos substratos padronizado da
Embrapa Hortaliças e o Plantmax.
CONCLUSÕES
Os substratos padronizado da Embrapa Hortaliças,
fibra de coco comercial e o da Plantmax são os mais
indicados para a produção de mudas do abacaxizeiro
ornamental para fins comerciais.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) as bolsas concedidas.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 70-75, 2008
76
EFEITO DE ISOPENTENILADENINA
POR QUATRO
SANTOS, M. do D. M. dos et al.
SUBCULTIVOS NA MULTIPLICAÇÃO DE BROTAÇÕES
DE ABACAXIZEIRO ORNAMENTAL IN VITRO
EFFECT OF ISOPENTENYL ADENINE IN FOUR SUBCULTURES DURING THE
IN VITRO MULTIPLICATION OF ORNAMENTAL PINEAPPLE SHOOT
MARIA DO DESTERRO MENDES DOS SANTOS1, JOSÉ GETÚLIO DA SILVA FILHO2,
ANTONIO CARLOS TORRES3
1
Bióloga, MSc em Botânica, Departamento de Botânica Universidade de Brasília/UnB Cx. P. 4.457 709190-970 Brasília, DF
[email protected]
2
Engenheiro Agrônomo, Especialista em Biotecnologia de Plantas Embrapa Hortaliças Cx. P. 218 70359-970 Brasília, DF
[email protected]
3
Engenheiro Agrônomo Embrapa Hortaliças Cx.P. 218 70359-970 Brasília, DF.
RESUMO
Objetivou-se, no presente trabalho, foi o de avaliar o
efeito da adição de concentrações de 2iP em diferentes subcultivos
na micropropagação do abacaxizeiro ornamental var. bracteatus.
Brotações com, aproximadamente, 1,0 cm de tamanho, oriundos
da cultura in vitro foram utilizados como explantes. Os explantes
foram inoculados em meio básico liquido contendo sais minerais
MS, 3% sacarose e, em mg L-1: i-inositol, 100; tiamina.HCl, 0,1;
piridoxina. HCl, 0,5; ácido nicotínico, 0,05 glicina 2,0, formulação
líquida. A esse meio foram adicionados: concentrações de 2iP
(0,0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg L-1) em combinação com quatro subcultivos
(30, 60, 90 e 120 dias). Máximo número de brotações por explante
(139) foi obtido em meio básico com 1,6 mg L-1 de 2iP e no quarto
subcultivo, aos 120 dias. Após a transferência de brotações
individualizadas para meio contendo ANA (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0;
2,5; 3,0 e 4,0 mg L-1), verificou-se a diferenciação de raízes
adventícias na porção basilar dos explantes.
Termos para indexação: Ananas comosus var. bracteatus;
micropropagação; cultivo in vitro.
ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate the effect of
2iP addition in different subcultures during the micropropagation
of ornamental pineapple var. bracteatus. Shoots with 1.0 cm in
length, originated from in vitro culture were used as explants.
The explants were inoculated in liquid basal medium containing
MS salts, 3% sucrose, 100 mg L -1 i-inositol, 0.1 mg L -1
thiamine.HCl,; 0.5 mg L-1 pyridoxine.HCl,; 0.05 mg L-1 nicotinic
acid and 2.0 mg L-1 glycine. Different concentrations of 2iP (0.0;
0.5; 1.0 and 2.0 mg L-1) in combination with four subcultures (30,
60, 90 e 120 days) were used. Maximum number of shoot formed
per explant (139) was observed in basal medium with 1.6 mg L-1
2iP at the fourth subculture (120 days). After transferring
individual shoots to medium containing different concentrations
of NAA (0.0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0 and 4.0 mg L-1), media
adventitious root formed in the basal portion of the explants.
Index terms: Ananas comosus var. bracteatus; micropropagation;
in vitro culture.
INTRODUÇÃO
O abacaxizeiro ornamental [Ananas comosus (L.)
Merr. var. bracteatus (Lindl.) Coppens & F. Leal] é uma
planta de propagação vegetativa, com grande potencial
ornamental (D EECKENBRUGGE & LEAL, 2003). A
qualidade fitossanitária do campo de produção dessa
espécie depende do material utilizado para sua propagação.
Assim sendo, pode haver acúmulo, entre plantios
sucessivos, de patógenos que são transmitidos de um ciclo
de produção a outro, via mudas contaminadas. A
micropropagação, em larga escala de mudas sadias, via
cultura de tecidos, é uma estratégia que possibilita
contornar a limitação de mudas com alta qualidade
fitossanitária, principalmente, isentas de fusariose
(REINHARDT & CUNHA, 1999).
Em espécies do gênero Ananás, os explantes mais
utilizados são as gemas axilares das mudas do tipo coroa
ou filhote embora outros tipos de mudas possam ser usadas.
A vantagem do uso de gemas axilares incluem boa
sobrevivência em meio de cultura e, com a quebra da
dominância apical do broto há estímulo para a formação de
gemas múltiplas (DREW, 1980). A adição de
fitorreguladores, em geral, é necessária para suprir as
possíveis deficiências dos níveis endógenos de hormônios
nos explantes in vitro. Assim sendo, recomenda-se a
combinação de uma auxina com uma citocinina (SKOOG &
MILLER, 1957). Em geral, a benzilaminopurina (BAP)
(Recebido em 8 de abril de 2008 e aprovado em 6 de outubro de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 76-83, 2008
Efeito de isopenteniladenina por quatro subcultivos...
(ALMEIDA et al., 2002; BARBOZA et al., 2001; BE &
DEBERG, 2006) ou essa substância em combinação auxina
e ácido naftalenoacético (ANA) (COSTA & ZAFFARI, 2005;
GUERRA et al., 1999) têm sido a(s) substância(s)
reguladora(s) de crescimento mais usada(s) na formação
de brotações de Ananas sp. Entretanto, em abacaxizeiro
ornamental a inclusão de BAP no meio pode induzir o
aparecimento de variações somaclonais (RODRIGUES et
al., 2007; SANTOS et al., 2008). Também a combinação de
cinetina, ANA e AIB (ácido indolbutírico) foi empregada
para proliferação de brotações em abacaxizeiro (KISS et
al., 1995; MATHEWS & RANGAN, 1979).
Dada a escassez de informações sobre o efeito de
isopenteniladenina (2iP) na propagação in vitro de espécies
do gênero Ananas, neste trabalho procurou-se otimizar a
concentração de 2iP na produção de brotações de
abacaxizeiro ornamental em diferentes subcultivos e seu
subseqüente enraizamento.
MATERIAL E MÉTODOS
Proliferação
de
brotações:
77
e quarto subcultivos foram utilizados frascos de 1000 mL,
com 100 mL de meio. As culturas foram mantidas em sala
de crescimento sob fotoperído de 16 horas com densidade
de fluxo de fótons de 32 mmol m-2 s-1, a 27±2oC. Em cada
subcultivo foi determinado o número e a massa de matéria
fresca das brotações formadas por explante inoculado.
Os dados foram transformados para X 1 e as
análises estatística foram realizadas com o auxílio dos
programas SAS/Stat e SISVAR versão 3.01. Aplicou-se a
análise de regressão polinomial até segundo grau para
avaliar o efeito da concentração de 2iP sobre o número e
massa da matéria fresca de brotações, em cada subcultivo.
Enraizamento das brotações: Foram utilizadas
brotações de abacaxizeiro ornamental regeneradas in vitro.
Os explantes com 1,0 a 2,0 cm de comprimento foram
inoculados em tubos de ensaio (25x150 mm) com 20 ml de
meio básico, 0,7% de ágar, suplementado com diferentes
concentrações de ácido naftalenoacético (ANA) (0,0; 0,5;
1,0 ; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 e 4,0 mg L-1).
Após inoculação, as culturas foram mantidas em
Brotações
câmara de crescimento nas condições descritas
individualizadas, com aproximadamente, 1 cm de
anteriormente. Após 30 dias da inoculação foram avaliados
comprimento, estabelecidas a partir da cultura de gemas
a percentagem de brotações enraizadas, número e massa
axilares de mudas tipo coroa, foram utilizadas como fonte
fresca das raízes desenvolvida por brotação, altura da
de explantes. Os explantes foram cultivados em meio básico
planta e massa da matéria fresca da parte aérea. O
líquido contendo sais minerais MS (MURASHIGE &
delineamento experimental foi inteiramente casualizado com
SKOOG, 1962), 3% sacarose e, em mg L-1: tiamina.HCl, 0,1;
29 repetições. Cada parcela foi constituída de um tubo de
piridoxina.HCl, 0,05; ácido nicotínico, 0,05 e glicina, 2,0
ensaio com um explante.
(SANTOS, 2008). O delineamento experimental empregado
As análises estatísticas foram realizadas com o
foi o inteiramente ao acaso, em esquema fatorial 4x4,
auxílio dos programas SAS/Stat e SISVAR versão 3.01.
referentes concentrações de 2iP e subcultivos. Ao meio
Aplicou-se a análise de regressão polinomial até segundo
básico foram adicionadas: quatro concentrações de BAP
grau para avaliar a variação das variáveis em função da
(0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg L-1), em combinação com quatro
concentração de ANA.
subcultivos (30, 60, 90 e 120 dias). O pH dos meios foi
ajustado a 5,7. Foram utilizadas nove repetições por
RESULTADOS E DISCUSSÃO
tratamento, sendo que cada parcela foi constituída por um
Proliferação de brotações: Na proliferação de
brotações, observou-se que os fatores concentração de
2iP e o subcultivo, isoladamente e em interação, afetam
significativamente (P 0,05) as variáveis número e massa
da matéria fresca das brotações formadas. A equação que
explante. Inicialmente, os explantes foram inoculados em
frascos de 250 mL de capacidade, com 40mL de meio. No
segundo subcultivo, os propágulos foram transferidos para
frascos idênticos com meio recém-preparado. No terceiro
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 76-83, 2008
78
SANTOS, M. do D. M. dos et al.
melhor se ajustou para explicar o efeito de 2iP nos diferentes
subcultivos para a variável número de brotações foi a de
segundo grau (Figuras 1 e 2). A multiplicação de brotações
de abacaxizeiro ornamental in vitro é dependente de 2iP,
no meio de cultura. O número de brotações por explante
responsivo de tamanho maior que 0,5 cm de comprimento
foi pequeno na primeira subcultura (30 dias), em todas as
concentrações de 2iP testadas, aumentando-se nos demais
subcultivos. Aos 30, 60, 90 e 120 dias estimou-se que a
concentração de 1,6 mg L-1 de 2iP produziu o máximo de
brotações por explante inoculado, respectivamente, 20; 42;
64 e 139 (Figuras 1 e 2). Esses resultados estão em
consonância com a importância da citocinina em vários
aspectos do crescimento e desenvolvimento da planta,
tais como divisão celular (SKOOG & MILLER, 1957), quebra
da dominância apical e desenvolvimento das gemas laterais
(SACHS & THIMMAN, 1964), indução e multiplicação de
brotações in vitro (GRATTAPAGLIA & MACHADO,
1998; JOSHI & DHAWAN, 2007; MURASHIGE, 1974).
Também, o tipo de citocinina e a sua concentração são
determinantes no processo de micropropagação
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998; MURASHIGE,
1974). Em Ananas sp. o BAP tem sido, preferencialmente,
usado na proliferação de brotações in vitro (ALMEIDA,
1994; ALMEIDA et al., 2002; CRUZ, 2000; ESCALONA et
al., 1999; FIROOZABADY & GUTTERSON, 2003;
GUERRA et al., 1999; MATHEWS et al., 1976). Entretanto,
Kiss et al. (1995) relataram que tanto o BAP quanto a
cinetina foram efetivos para formação de brotações, em
abacaxizeiro comercial. No presente trabalho, o 2iP foi
adicionado ao meio devido a sua maior atividade biológica
comparada com o BAP e a cinetina (MURASHIGE, 1974).
Também, para a variável massa da matéria fresca
foi constatada a resposta quadrática das doses de 2iP
(Figuras 3 e 4). Pelas equações de regressão, infere-se
que o 2iP estimula o acúmulo de massa fresca nas
brotações, com o máximo obtido com a concentração de
1,8 mgL-1 desse fator nos subcultivos de 30, 60 e 120 dias,
com a produção de, respectivamente, 9, 17, e 77 g por
explante inoculado. No terceiro subcultivo, aos 90 dias a
concentração de 1,7 g.L-1 de 2iP produziu o total de
biomassa de 45 g por explante. Essa observação está em
concordância com os trabalhos do efeito benéfico de
citocininas na produção de parte aérea, até uma
concentração ótima, acima da qual seu excesso é inibitório
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1988).
2
y (60y )dias
dias)60(=14,585x
14,585x=2 -- 47,661x
47,661x++3,1353
3,1353+
45
Número médio de botações por
explantes
2
R
R2 = 0,999
40
0,999 =
35
30
25
20
15
10
5
0
0
0,5
1
1,5
2
30 dias
-1
Concentração de 2ip (mg.L )-1
Concentração de 2iP (mg L )
60 dias
FIGURA 1 Efeito de concentrações de 2iP no número de brotações por explante, nos subcultivos de 30 e 60 dias.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 76-83, 2008
Efeito de isopenteniladenina por quatro subcultivos...
Número médio de brotação por
explante por explante
Número médio de brotação
160
79
y (120 dias) = 50,725x2 - 162,3x + 9,464
R2 = 0,954
140
120
2
y )dias 120(50,72x = - 162,3x + 9,464 +
100
2
R 0,954 =
80
60
40
2
y )d ias 9 0 ( 22,847x = -
73,196x + 5,5784
2
R 0,9477 =
20
0
0
0,5
1
1,5
-1
2
Concentração
de 2ip
)
Concentração
de (mg.L
2iP (mg
90 dias
-1
L )
120 dias
FIGURA 2 Efeito de concentrações de 2iP no número de brotações por explante, nos subcultivos de 90 e 120 dias.
2
y (60 dias) = -3,8745x + 13,957x + 4,9227
Massa fresca das brotações ( g)
20
+2
2
y (60 dias) = - 3,8745x + 13,957x R =4,9227
0,9999
R2 = 0,9999
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
0,5
1
1,5
2
30 dias
-1
(mg.L ) -1
Concentração de
de 2ip
Concentração
2iP (mg L )
60 dias
Massa fresca das brotações (g)
FIGURA 3 Efeito de concentrações de 2iP na massa fresca de brotações por explante, nos subcultivos de 30 e 60 dias.
2
2
(120
dias) == -19,075x
- 71,029x
+ 11,295
yy)dias
71,029x + 11,295
+
120(19,075x
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
R2 R=2 0,96
0,96
=
2
12,255x== 12,255x
- 43,239x 2+ -7,5847
+
yy )dias
(9090(dias)
43,239x
+ 7,5847
2
=
R2 R=0,9717
0,9717
0
0,5
1
1,5
-1
-1
Concentração
(mg
Concentração dede
2ip 2iP
(mg.L
) L )
2
90 dias
120 dias
FIGURA 4 Efeito de concentrações de 2iP na massa matéria fresca de brotações por explante, nos subcultivos de 90 e 120 dias.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 76-83, 2008
80
SANTOS, M. do D. M. dos et al.
Enraizamento das brotações: A indução,
emergência e alongamento das raízes ocorreram em todos
foi afetada pela concentração de ANA, sendo o valor
de F não significativo.
os tratamentos. Em meio sem regulador de crescimento,
Constatou-se uma relação quadrática entre as
os propágulos apresentaram raízes desenvolvendo-se
variáveis número e massa da matéria fresca das raízes e da
de maneira pontual na extremidade seccionada dos
parte aérea e a concentração de ANA. A estimativa da
explantes (Figura 5). Em meio com ANA as raízes
proliferação de raízes baseando-se no número de raízes
desenvolveram-se na porção basilar dos propágulos em
por explante aumentou com a concentração de ANA,
forma de roseta. Em geral, a auxina é utilizada na fase de
atingindo um máximo de 11,9 com 2,2 mg L-1 de ANA.
enraizamento de propágulos oriundos da cultura in vitro
Concentrações acima de 2,2 mg L-1 tendem a apresentar
de Ananas (BARBOZA et al., 2004; CORREIA et al.,
um efeito inibitório na produção de raízes (Figura 6).
2000; FIROOZABADY & GUTTERSON, 2003;
Também a massa da matéria fresca das raízes aumentou
PRAXEDES et al., 2001; TENG, 1997). Entretanto, o
com a concentração de ANA com um máximo de 0,23 g
enraizamento pode ser feito em meio sem regulador de
obtida com a concentração de 2,4 mg L-1 de ANA (Figura
crescimento (KISS et al., 1995; ZEPEDA & SAGAWA,
7). Essa tendência foi observada para a massa fresca da
1981). A utilização de uma auxina na fase de enraizamento
parte aérea onde a estimativa máxima da produção de
induz à formação de um sistema radicular mais
biomassa foi de 0,46 g por explante, em meio com 1,9 mg L-1
pronunciado que facilitará a fase de aclimatação (Figura
de ANA (Figura 8).
5). Observou-se que a concentração de ANA afetou
Com relação à altura das plantas não houve
significativamente (P 0,05) o número de raízes, massa
diferença significativa entre as diferentes concentrações
fresca das raízes e da parte aérea. A altura da planta não
de ANA e essa variável.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
4,0
FIGURA 5 Brotações enraizadas em meio MS contendo diferentes concentrações de ANA (mg L-1), aos 30 dias após
a inoculação.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 76-83, 2008
Efeito de isopenteniladenina por quatro subcultivos...
81
2
y = -1,202x + 5,291x + 6,1504
2
Nº de raízes
14
12
R = 0,6865
10
8
6
4
2
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
-1
Concentração
de de
ANA
( mg
Concentração
ANA
(mgLL-1))
FIGURA 6 Variação do número de raízes por explante em função da concentração de ANA.
2
y = -0,0282x + 0,1359x + 0,0704
0,3
Massa fresca das raízes
2
R = 0,7573
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
-1
Concentração
de ANA
ANA(mg
( mgL-1L) )
Concentração de
FIGURA 7
Variação na massa da matéria fresca de raízes por explante em função da concentração de ANA.
2
y = -0,0363x + 0,1407x + 0,3255
Massa fresca da parte aérea
0,6
2
R = 0,857
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Concentração de ANA (mg L-1)
FIGURA 8 Variação da massa de matéria fresca da parte aérea por explante em função da concentração de ANA.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 76-83, 2008
82
SANTOS, M. do D. M. dos et al.
CONCLUSÕES
No meio líquido, contendo MS, vitaminas, 3% de
sacarose e 1,6 mg L-1 de 2iP obtém-se uma estimativa média
de 139 brotações por explante inoculado, no final do quarto
subcultivo (120 dias).
Maior número de raízes adventícias por explante é
estimado com a concentração de 2,2 mg L-1 de ANA.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) pelas bolsas concedidas.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 76-83, 2008
EFICIÊNCIA FOTOQUÍMICA
DE
MOTHÉ, G. P.E
B. etCARACTERÍSTICAS
al.
CRESCIMENTO DA CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum officinarum L.)
CULTIVADA IN VITRO EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
SACAROSE E QUALIDADE DE LUZ
84
PHOTOCHEMICAL EFFICIENCY AND GROWTH CHARACTERISTICS OF SUGAR
CANE (Saccharum officinarum L.) PLANTS CULTIVATED IN VITRO UNDER
DIFFERENT SUCROSE CONCENTRATIONS AND LIGHT QUALITY
GEÓRGIA PEIXOTO BECHARA MOTHÉ1, ALENA TORRES NETTO2,
LUIS EDUARDO CAMPOS CRESPO2, ELIEMAR CAMPOSTRINI2
1
Bióloga Universidade Estadual do Norte Fluminense, Centro de Ciências Tecnológicas e Agrárias, UENF-CCTA Laboratório de
Melhoramento Genético Vegetal Departamento de Fisiologia Vegetal Sala 217 P4 Av. Alberto Lamego, 2000 28015-620
Campos dos Goytacazes, RJ [email protected]
2
Engenheiro Agrônomo Universidade Estadual do Norte Fluminense, Centro de Ciências Tecnológicas e Agrárias, UENF-CCTA
Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal Departamento de Fisiologia Vegetal Sala 217 P4 Av. Alberto Lamego, 2000
28015-620 Campos dos Goytacazes, RJ [email protected], [email protected], [email protected]
RESUMO
Dentre os diversos produtos agrícolas cultivados no
Estado do Rio de Janeiro, a cana-de-açúcar (Saccharum
officinarum L.) é a cultura de maior importância econômica.
Diante dessa importância, na região fluminense torna-se
necessária cada vez mais a busca na elevação da produtividade
dessa espécie. A produção em escala comercial de plantas de
cana-de-açúcar pode ser beneficiada pela obtenção de mudas de
alta qualidade e homogeneidade em curtos períodos de tempo, o
que pode ocorrer pelo uso da micropropagação. A presença de
carboidrato é essencial para o enraizamento de muitas espécies
in vitro, sendo a sacarose o açúcar mais utilizado na
micropropagação. Porém, a necessidade desse composto no
meio de cultivo vem sendo discutida por alguns autores.
Objetivou-se, neste trabalho, verificar o efeito da concentração
de sacarose no meio de cultivo e a qualidade da luz sobre a
capacidade fotossintética e as características de crescimento,
em plantas de cana de açúcar cultivadas in vitro. Para tanto, foi
quantificada a emissão da fluorescência da clorofila, determinada
a massa seca de raiz e da parte aérea, a massa foliar específica e
estimada a concentração de clorofilas. Os resultados obtidos
mostraram que em cana de açúcar cultivada in vitro, em frascos
fechados, a elevação na concentração de sacarose no meio de
cultivo promoveu aumentos na matéria seca da parte aérea e da
raiz, na massa foliar específica e na intensidade de cor verde das
folhas estudadas. Não houve modificação na capacidade
fotoquímica máxima do PSII. A justificativa para o nãocomprometimento da sacarose sobre as características
relacionadas à fotossíntese, estudadas neste trabalho, como o
teor de clorofilas (avaliada pelos valores do MPC) e o rendimento
quântico máximo do PSII, pode estar relacionada com a alta
capacidade dessa espécie em armazenar sacarose nos tecidos.
Termos para indexação: Saccharum officinarum, aclimatização,
meio de cultura, fotossíntese.
ABSTRACT
The State of Rio de Janeiro was one of the pioneers in
Brazil to set out the sugar cane activity, which still represents an
important segment in the regional economy. The production of
plants in commercial scale would be benefited by the attainment
of seedlings of high quality and homogeneity in short periods of
time, which can be obtained using the micropropagation. The
presence of carbohydrate is essential for in vitro rooting of many
species, with the sucrose being considered the most used sugar
during micropropagation, despite the discussion by some authors
regarding its requirement. The objective of this work was to
evaluate the effect of sucrose concentrations in the culture medium
and light quality on the photosynthetic capacity and biometric
characteristics on micropropagated sugar cane plants. Chlorophyll
fluorescence and contents were quantified, root and shoot dry
mass and specific leaf mass were determined and chlorophyll
concentrations were estimated. The results showed that the
increase in sucrose concentration during the in vitro cultivation
of sugar cane, in closed flasks, promotes increase in the shoot
and root dry matter, specific leaf mass and chlorophyll contents.
No modification of maximum PSII photochemistry capacity was
observed. The lack of sucrose effects on photosynthetic
characteristics such chlorophyll contents and PSII yield, may be
related to the high capacity of this specie to storage sucrose in
the tissues.
Index terms: Saccharum officinarum; aclimatization; culture
medium; photosynthesis.
Símbolos: PSII: fotossistema II, SPAD: Soil Plant Analysis
Development; BAP: benzilaminopurina; FFF: fluxo de fótons
fotossintéticos; MPC: medidor portátil de clorofilas; MFE: massa
foliar específica, Fv/Fmáx: Rendimento quântico máximo do
fotossistema II, MSPA: massa seca parte aérea, MSR: massa
seca raiz, AIB: acido indol butirico, ANA:acido naftaleno acético.
(Recebido em 25 de março de 2008 e aprovado em 6 de outubro de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 84-91, 2008
Eficiência fotoquímica e características de crescimento...
INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) foi
introduzida no Brasil no século XVII, com o objetivo de
quebrar o monopólio mundial exercido pela França no
comércio do açúcar produzido nas Ilhas do Caribe. O cultivo
da cana-de-açúcar teve um grande aumento quando, em
meados da década de 70, o Brasil criou o Programa Nacional
do Álcool, o qual teve como objetivo estimular a produção
do álcool, visando o atendimento das necessidades do
mercado interno e externo e da política de combustíveis
automotivos (MENEZES VEIGA et al., 2006).
Atualmente, a cana-de-açúcar é uma das principais
culturas do panorama brasileiro e continua crescendo em
função do consumo como fonte de energia e açúcar. Dentre
os diversos produtos agrícolas cultivados no estado do Rio
de Janeiro, a cana-de-açúcar é a cultura de maior importância
econômica (MENEZES VEIGA et al., 2006). Diante dessa
importância, na região fluminense torna-se necessária cada
vez mais a busca na elevação da produtividade dessa espécie.
Uma das alternativas para essa elevação é a formação de
lavouras, por meio do uso de mudas de excelente qualidade.
Assim, a micropropagação é uma técnica que pode contribuir
significativamente para a produção de mudas de cana de
açúcar de alta qualidade. Entre as diversas vantagens que
essa técnica apresenta está a produção rápida de mudas em
larga escala e a eliminação de microrganismos potencialmente
fitopatogênicos.
A micropropagação tradicional tem como premissa
a presença de sacarose no meio de cultivo, uma vez que
esse composto eleva a produção de biomassa e pode
contribuir para aumentar o enraizamento de muitas espécies
in vitro (GRATTAPAGALIA & MACHADO, 1990).
Entretanto, vários autores têm sugerido que a fonte de
carboidrato no meio de cultura inibe o metabolismo
fotossintético do carbono. A adição da sacarose ao meio
inibiu a fotossíntese potencial in vitro (LEES et al., 1991),
reduziu a atividade da Rubisco (GROUT & DONKIN, 1987),
inibiu o acúmulo de clorofila (LA ROSA et al., 1984) e
diminuiu a fixação do carbono inorgânico por meio da
inibição da atividade da carboxilase do fosfoenol-piruvato
85
e do Ciclo de Calvin (NEUMANN & BENDER, 1987).
Entretanto, Khan et al. (2006), trabalhando com cana-deaçúcar, relataram que a máxima taxa de multiplicação de
dois clones (AEC82-223 e NIA-2004) foi nas concentrações
de 4 e 6% de sacarose no meio, mostrando que nesses
clones cultivados em frascos fechados in vitro, a sacarose
foi de fundamental importância para a otimização do
crescimento da parte aérea. Esses autores mostraram que
a maior taxa de enraizamento foi em meio MS, com 1 mg L1
de AIB e 6% de sacarose.
Alguns autores, para facilitar a aclimatização da
planta micropropagada, sugerem adotar na última fase da
cultura in vitro, diminuir a concentração de sacarose, com
o objetivo de tentar elevar a taxa fotossintética e capacitar
a planta à nutrição autotrófica; uma vez que a fonte de
carboidrato no meio de cultura pode inibir o metabolismo
fotossintético do carbono. Em vista disso, Simmonds (1983)
obteve melhores resultados no enraizamento de portaenxerto de macieira, ao reduzir a concentração de sacarose
no meio de cultura para apenas 1%. Contudo, Wainwright
& Scrace (1989), sugerem manter a sacarose no nível
normalmente utilizado (3%), ou até mesmo aumentá-lo numa
fase anterior à aclimatização, visando melhorar a qualidade
da planta. Segundo esses autores, o pré-condicionamento
em altas concentrações de sacarose aumentaria as reservas
de carboidratos armazenadas pelas folhas, aumentando,
assim, a energia disponível para as plântulas durante o
processo de aclimatação. Para George & Sherrington (1984),
no desenvolvimento in vitro de muitas espécies, a
assimilação fotossintética é baixa, fazendo com que as
culturas sejam dependentes do suporte externo de
carboidratos.
Objetivou-se, neste trabalho, verificar o efeito da
concentração de sacarose no meio de cultivo e da qualidade
de luz sobre a eficiência fotoquímica e as características de
crescimento da cana-de-açúcar, cultivada in vitro.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado, na unidade de pesquisa
em fotossíntese de plantas in vitro, no Setor de Fisiologia
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 84-91, 2008
86
MOTHÉ, G. P. B. et al.
Vegetal, Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal
na UENF, Campos dos Goytacazes/RJ.
Como fonte de explante foram utilizadas plântulas
de cana-de-açúcar, com dois a três centímetros de altura
proveniente de material vegetal já em fase de multiplicação,
contendo meio MS modificado (0,2 mg L-1 de fonte de
nitrogênio combinado, 0,1 mg L-1 de cinetina, 0,2 mg L-1 de
BAP, 1 mg L-1 de Tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol e 20 g
L-1 de sacarose), em condições de perfilhamento. O material
foi obtido no Laboratório de Cultura de Tecido do Campus
Dr. Leonel Miranda, UFRRJ. O meio de cultura utilizado
para o recultivo foi o MS padrão (MURASHIGE & SKOOG,
1962), acrescido de 100 mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de
Agar (Vetec) e sem adição de reguladores de crescimento.
Os tratamentos consistiram de uma combinação bifatorial
de seis concentrações de sacarose no meio (0, 10, 20, 30,
40 e 50 g L-1), e dois tipos de luz (lâmpada fluorescente
branca 40w, luz branca com irradiância de 94,8 ìmol m-2 s1
e lâmpada fluorescente tipo Grolux 40w, luz vermelha
com irradiância de 96,6 ìmol m-2 s-1). O pH do meio foi
ajustado para 5,8 antes da inclusão do ágar e da
autoclavagem (1,5 atm a 120ºC por 20 min.) A parcela
experimental consistiu de frascos tipo baby food ,
contendo 50 mL do meio MS, nas diferentes
concentrações de sacarose. O delineamento experimental
foi inteiramente casualizado com três repetições, em que
cada parcela consistiu de um frasco com duas plantas.
Após a inoculação, os explantes foram cultivados em
sala de crescimento, a uma temperatura 25º C ± 1,0; a um
fluxo de fótons fotossintéticos de 120 a 150 ìmol m-2 s-1,
com 16h de fotoperíodo.
Aos vinte e oito dias após a inoculação (DAI), foi
utilizada a 2º e/ou 3º folha mais expandida para as análises
para determinação do rendimento quântico máximo do PSII
(Fv/Fmax), (após adaptação da folha ao escuro por 30
minutos com auxílio de pinças), por meio de um fluorímetro
não modulado PEA (Plant Efficiency Analyser - Hansatech
Ltd., King s Lynn, Norfolk, UK).
A medida de intensidade de verde, (relacionada com
o teor de clorofilas totais), foi feita nesta mesma época, por
meio do medidor portátil do teor de clorofila SPAD 502
Chlorophyll Meter Minolta, Japão. Os valores da
intensidade do verde foram provenientes da média de cinco
repetições em cada folha
A massa foliar específica feita aos 28 dias após o
cultivo in vitro, foi determinada a partir da divisão da massa
seca da folha de uma parte do limbo foliar pela respectiva
área dessa parte.
No final do experimento foi determinada a massa
seca das partes aérea e da raiz das plantas. Essas partes
foram colocadas em estufa com ventilação forçada a 70º C
por 48 h. A partir dos dados da massa seca, estimou-se a
relação parte aérea/raiz (massa seca da parte aérea / massa
seca das raízes).
Os dados experimentais foram submetidos a uma
análise de variância e para cada tratamento, foram
avaliados três frascos. Foram realizadas duas repetições
para cada frasco e seis plantas foram utilizadas,
provenientes de três frascos. Os dados de cada avaliação
foram analisados estatisticamente por teste Tukey, a 5%
e os resultados expressos como média (± erro-padrão) de
seis repetições.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os diferentes tratamentos de luz e dosagem de
sacarose no meio de cultura influenciaram a produção de
biomassa na parte aérea, mostrando que maiores
concentrações de sacarose produziram maior biomassa
(figuras 2 e 3) O tratamento controle (0 g L-1 de sacarose)
não produziu biomassa suficiente para as análises.
Portanto, as plantas-controle cultivadas nessas
condições requerem a adição de carboidratos para suprir
suas necessidades metabólicas, quer participando na
geração de energia, ou como fonte de esqueletos
carbônicos para vários processos bioquímicos, sugerindo
que as condições encontradas no frasco de cultivo e na
sala de crescimento foram ineficientes para as plantascontrole desenvolverem condições de realizar
fotossíntese e conseqüentemente produzir biomassa
(Figura 1).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 84-91, 2008
Eficiência fotoquímica e características de crescimento...
87
FIGURA 1 Plantas de cana-de-açúcar cultivada em diferentes concentrações de sacarose, após 28 dias de cultivo (A)
0 g L-1, (B) 10 g L-1, (C) 20 g L-1, (D) 30 g L-1, (E) 40 g L-1 e (F) 50 g L-1.
Os resultados obtidos por meio da análise de
variância, para as cinco diferentes concentrações de
sacarose (10; 20; 30; 40 e 50 g L-1) no meio, demonstraram
que, para a característica massa seca da parte aérea (MSPA),
houve uma resposta crescente, em que doses crescentes
de sacarose promoveram acréscimos de biomassa seca
(Figura 2A). A concentração 10 g L -1 diferenciou
significativamente das concentrações de 40 g L-1 e 50 g L1
, produzindo uma menor MSPA, 0,039; 0,101 e 0,135g
respectivamente (Figura 2A). Dados semelhantes foram
obtidos em morangueiros, batata, menta e videira por
(RIQUELME et al., 1991), e por (NICOLOSO, 2003), em que,
nesse trabalho, a elevação da concentração de sacarose
de 30 até 60 g L-1 promoveu maior produção de biomassa
dos órgãos de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen.
Com relação à matéria seca da raiz (MSR), as
diferenças de concentração de sacarose influenciaram
significativamente os resultados. As menores
concentrações (10, 20 e 30 g L-1) somente diferenciaram
significativamente da maior concentração (50 g L-1), que
produziu valores 0,084g de MSR (Figura 2b). Pelos
resultados, foi verificado que a presença de sacarose
mostrou-se fundamental para o desenvolvimento da parte
aérea e das raízes da cana-de-açúcar cultivadas in vitro.
De fato, Khan et al. (2008), mostraram que o meio MS com
meia força, suplementado com reguladores de crescimento
(AIB e ANA) e 60 g L-1 de sacarose, proporcionou maior
enraizamento em 3 variedades elite de cana-de-açúcar. Khan
et al. (2006) também indicaram a importância da sacarose
no crescimento da parte aérea, em clones dessa espécie.
George (1996) relata que, para formação de raízes in vitro
há necessidade de energia e carboidratos, sendo esses
fornecidos por meio da fotossíntese (em condições
autotróficas) ou oriunda de uma fonte exógena de açúcar
(em sistemas heterotróficos ou mixotróficos). O autor
verificou ainda, que o aumento da concentração de
sacarose, de modo geral, estimula o crescimento e a
formação de raízes de algumas espécies. Já em outros
trabalhos, na fase de enraizamento, a redução da
concentração de sacarose no meio de cultura vem sendo
citada como benéfica na melhoria da qualidade do sistema
radicular, bem como na sobrevivência das plântulas
transplantadas (ANDRADE, 1998).
Com relação à MSPA/MSR, os tratamentos não
apresentaram diferença significativa apontando uma
relação direta entre o crescimento das raízes e da parte
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 84-91, 2008
88
MOTHÉ, G. P. B. et al.
10 g/L
0,15
20 g/L
MSPA (g)
0,12
D
20 g/L
30 g/L
24,00
30 g/L
40 g/L
22,00
40 g/L
50 g/L
0,09
10 g/L
26,00
MFE (g/m2)
A
0,06
50 g/L
20,00
18,00
16,00
14,00
0,03
12,00
0
10,00
Concentração de Sacarose (g/L)
0,1
Concentração de Sacarose (g/L)
10 g/L
B
20 g/L
0,08
E
20 g/L
32
Valores de MPC
40 g/L
MSR (g)
10 g/L
34
30 g/L
30 g/L
0,06
36
50 g/L
0,04
40 g/L
30
50 g/L
28
26
24
0,02
22
20
0
Concentração de Sacarose (g/L)
Concentração de Sacarose (g/L)
6,00
C
10 g/L
F
20 g/L
40 g/L
4,00
50 g/L
3,00
10 g/L
0,76
20 g/L
30 g/L
0,74
30 g/L
40 g/L
0,72
Fv/Fm
MSPA/MSR
5,00
0,78
50 g/L
0,7
0,68
2,00
0,66
1,00
0,64
0,62
0,00
Concentração de Sacarose (g/L)
Concentração de Sacarose (g/L)
FIGURA 2 Relação entre as características estudadas e as diferentes concentrações de sacarose no meio de cultivo,
independente da luz. (A) Massa seca parte aérea (MSPA) (B) Massa seca raiz (MSR) (C) Razão massa seca da parte
aérea/raízes (MSPA/MSR) (D) Massa foliar específica (MFE) (E) Teor estimado de clorofilas totais (valores de MPC)
(F) Rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm) em plantas de cana-de-açúcar cultivadas in vitro aos 28 dias. Cada
símbolo representa a média de seis repetições em MSPA, MSR, MSPA / MSR e MFE e oito repetições em Valores de
MPC e da relação Fv/Fm. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%).
aérea. Essa relação é de fundamental importância para a
organização dos processos fisiológicos e desenvolvimento
das plantas (TAIZ & ZEIGER, 2002). Essas partes estão
relacionadas entre si, e essa relação é devida à dependência
nutricional e fitohormonal da parte aérea com a raiz
(SALISBURY & ROSS, 1992) (Figura 2c).
As diferentes concentrações de sacarose
influenciaram a massa foliar específica (MFE), a qual
representa a quantidade de massa seca por unidade de
área da folha, estimando a proporção relativa da superfície
assimilatória e os tecidos de sustentação e condutores da
folha, além de poder ser correlacionada positivamente com
a taxa fotossintética (CRUZ et al., 2004). A menor
concentração de sacarose apresentou o menor valor (14,8
g m-2), o que indica que a ausência de sacarose pode
comprometer a espessura foliar, bem como a capacidade
da maquinaria fotossintética (Figura 2d).
O teor de clorofila foi estimado por meio do medidor
portatil de clorofila (MPC). Os valores encontrados da
intensidade do verde foram oriundos da média de cinco
repetições em cada folha. As diferentes concentrações de
sacarose no meio de cultivo influenciaram a intensidade
de verde (Figura 2e), em que a maior concentração de
sacarose apresentou o maior valor do MPC (33,6),
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 84-91, 2008
Eficiência fotoquímica e características de crescimento...
diferenciando significativamente dos demais tratamentos.
Esses valores estão relacionados com uma maior
quantidade de clorofilas totais em maiores teores de
sacarose. Nesse caso, em plantas de cana-de-açúcar, a
elevação no teor de sacarose contribui para o incremento
do teor de clorofilas, a partir de 30 g L-1 desse composto no
meio de cultivo.
Com relação à atividade do PSII, avaliada por meio
da emissão da fluorescência da clorofila a, as plantas de
cana-de-açúcar apresentaram alterações com relação aos
tratamentos utilizados. Estatisticamente, os valores
menores da eficiência fotoquímica máxima do PSII (Fv/Fm)
foram verificados na concentração de 20 g L-1 de sacarose
(Figura 2f). Com exceção das plantas crescidas nessa
concentração de sacarose, as demais plantas cultivadas
em meios com maiores concentrações de sacarose, não
apresentaram diferenças significativas para a característica
22
A
Fv/Fm. Por meio dos resultados relacionados aos efeitos
da concentração de sacarose no meio de cultivo sobre as
características de crescimento, a produção de biomassa
estaria mais relacionada à oferta de carbono no meio de
cultivo do que a eficiência na maquinaria fotoquímica das
plantas.
A qualidade do fluxo de fótons fotossintético (FFF)
teve influência relevante nas características MSPA, MSR,
MFE e valores do MPC. A luz considerada vermelha emitida
pelas lâmpadas GroLux proporcionou maiores valores das
características supracitadas. Tais resultados poderiam estar
relacionados a um maior ganho de carbono por meio de um
aumento da taxa fotossintética líquida e/ou indiretamente
causado por alterações fitormonais causadas pela
modificação no espectro luminoso (CAMPELL &
BONNER, 1986). Ainda, na presença da luz vermelha, houve
favorecimento para a produção de biomassa, tanto na parte
0,05
B
Luz branca
Luz vermelha
0,04
MSR (g)
MFE (g/m2)
20
18
16
Luz branca
Luz vermelha
0,03
0,02
0,01
0
14
LUZ
MSPA (g)
0,12
LUZ
D
Luz branca
30
Luz vermelha
28
Valores de MPC
0,14
C
89
0,1
0,08
0,06
Luz branca
Luz vermelha
26
24
22
0,04
0,02
20
LUZ
LUZ
FIGURA 3 Relação entre as características estudadas e os diferentes tipos de luz (Branca e Vermelha), (A) Massa
seca parte aérea (MSPA), (B) Massa foliar especifico (MFE) (C) Massa seca raiz (MSR), e (D) Teor estimado de
clorofilas totais (Valores de MPC), Cada símbolo representa a média sendo 15 repetições em MSPA, MSR e valores de
MPC e 20 repetições em MFE em plantas de cana-de-açúcar cultivadas in vitro aos 28 dias. Médias seguidas pela
mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 84-91, 2008
90
MOTHÉ, G. P. B. et al.
aérea como no sistema radicular. A luz branca apresenta
uma composição espectral que pode variar, e causar
respostas diferenciadas na cultura in vitro. A
predominância na emissão de fótons na região do vermelho
até o azul pode estimular a indução de calos, quebrar a
molécula de AIA e ainda estimular a indução de brotos
(BARRUETO CID, 2001; CHAMOVITZ & DENG, 1996).
As plantas cultivadas em maiores concentrações
(40 e 50 g/L-1) de sacarose e aclimatadas em luz vermelha
tiveram melhores resultados do que nos outros tratamentos
(Figura 2 e 3).
CONCLUSÕES
CAMPELL, R. R.; BONNER, B. A. Evidence for
phytochrome regulation of gibberelin A20 3b-hydroxylation
in shoots of dwarf (lele) Pisum sativum L. Plant Physiology,
Washington, v. 82, p. 909-915, 1986.
CHAMOVITZ, D. A.; DENG, X. W. Light signaling in plants.
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Em cana-de-açúcar cultivada em condições in vitro
e em frascos fechados, a elevação na concentração de
sacarose no meio de cultivo promoveu aumentos na
GEORGE, E. F.; SHERRINGTON, P. D. (Eds.). Plant
propagation by tissue culture. Eversley: Exegetics, 1984.
709 p.
matéria seca da parte aérea e da raiz, na massa foliar
específica e na intensidade de cor verde das folhas
estudadas. Não houve alteração na eficiência fotoquímica
máxima do PSII. A luz vermelha associada à concentrações
GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A.
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plantas. Brasilia, DF: Embrapa, 1990. p. 99-169.
de sacarose de 40 e 50g/L-1 parece ter uma resposta
somatória, tanto na produção de parte aérea e raiz, quanto
na massa foliar específica e no teor de clorofila.
GROUT, B. W. W.; DONKIN, M. E. Photosynthetic activity of
cauliflower meristem cultures in vitro and a transplanting into
soil. Acta Horticulturae, Amsterdam, v. 212, p. 323-327, 1987.
A justificativa para o não-comprometimento da
sacarose no meio sobre as características relacionadas à
fotossíntese, estudadas neste trabalho, como exemplo o
teor de clorofilas (avaliada pelos valores do MPC) e o
rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm), pode estar
relacionada com a alta capacidade dessa espécie em
armazenar sacarose nos tecidos.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 84-91, 2008
92
EFFECTS OF AUXINSVICTÓRIO,
AND CYTOKININS
ON IN VITRO
C. P. et al.
DEVELOPMENT OF Alpinia purpurata K. SCHUM AND
PHENOLIC COMPOUNDS PRODUCTION
EFEITO DE AUXINAS E CITOCININAS NO DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE
Alpinia purpurata K. SCHUM E PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS FENÓLICAS
CRISTIANE PIMENTEL VICTÓRIO1, IACINETE PAMPLONA DA CRUZ2, ALICE SATO3,
RICARDO MACHADO KUSTER4, CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE5
1
Doutora em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/Lab. Fisiologia Vegetal Universidade Federal
do Rio de Janeiro/UFRJ Av. Carlos Chagas Filho, s/n, CCS, Bloco G, sala G2-050 21952-590 Rio de Janeiro, RJ [email protected]
2
Estudante de Farmácia, bolsista PIBIC/UFRJ.
3
Doutora em Biotecnologia Vegetal, Prof. Dep. Botânica Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro Av. Pasteur 458
22290-040 Rio de Janeiro, RJ [email protected]
4
Doutor, Prof., Laboratório de Fitoquímica Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais (NPPN) Universidade Federal do Rio de
Janeiro/UFRJ Av. Carlos Chagas Filho, s/n, CCS, Bloco H 21941-902 Rio de Janeiro, RJ [email protected]
5
Doutor, Prof. IBCCFo Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ Av. Carlos Chagas Filho, s/n, CCS, Bloco G, sala G2-050
21952-590 Rio de Janeiro, RJ [email protected]
ABSTRACT
Alpinia purpurata K. Schum is largely used in
ornamentation and scarcely present itself in folk medicine. Studies
using plant tissue culture technique under standardized condition
permit to evaluate plant physiological, morphological and
phytochemical responses to exogenous plant growth regulator.
This work consisted in the establishment of in vitro A. purpurata
plants using different concentrations of auxin and cytokinins in
mg L-1: IAA 2, TDZ 2 and 4, IAA 2 + TDZ 2, IAA 2 + BAP 2.
Additionally, it was determined the content of phenolic
compounds in the leaves of field and in vitro plants using FolinCiocalteau method. Buds from inflorescence A. purpurata were
disinfested and introduced in solid MS medium to initiate cultures.
The direct organogenesis process was fast and satisfactory
producing elongated plants with a developed radicular system.
The rooting percentage reached 100% for all treatments after 2
months. Cytokinins and auxins were important for the increasing
of the leaves quantity (4.2 to 5.1) and shoot elongation (4.0 cm).
Liquid MS0 presented the favorable results for fast
micropropagation and higher production of shoots, providing
plants ready to be acclimatized. In vitro plants cultivated under
MS0 produced 93% of phenolic compounds in comparison with
field plants (100%). Through High Performance Liquid
Chromatographic, it was verified similar chromatographic profiles
between field and in vitro plant extracts.
Index terms: Folin-Ciocalteau, HPLC, micropropagation, tissue
culture, Zingiberaceae, Alpinia purpurata.
RESUMO
Alpinia purpurata K. Schum é uma espécie muito
utilizada como ornamental e possui escassas indicações de uso
na medicina popular. Estudos utilizando técnicas de cultura de
tecidos vegetais permitem, a partir de condições padronizadas,
avaliar as respostas fisiológicas, morfológicas e fitoquímicas dos
vegetais aos fitorreguladores exógenos. Este trabalho consistiu
no estabelecimento de plantas de A. purpurata in vitro utilizandose diferentes concentrações de auxina e citocininas (mg L-1): AIA
2, TDZ 2 e 4, AIA 2 + TDZ 2, AIA 2 + BAP 2. Verificou-se
também o conteúdo de substâncias fenólicas nas folhas de plantas
de campo e in vitro, através do método de Folin-Ciocalteau.
Brotos oriundos da inflorescência de A. purpurata foram
desinfestados e introduzidos em meio MS sólido para iniciar as
culturas. O processo de organogênese direta foi rápido e
satisfatório, produzindo plantas alongadas e com sistema radicular
desenvolvido. A porcentagem de enraizamento atingiu 100% para
todos os tratamentos ao final de 2 meses. As citocininas e auxinas
foram importantes para incrementar o número de folhas (4,2 a
5,1) e alongamento dos brotos (4,0 cm), em comparação com o
meio controle. O MS0 líquido foi o mais favorável para rápida
propagação in vitro e maior produção de brotos, com suprimento
de plantas aptas a serem aclimatizadas. Plantas in vitro cultivadas
em meio MS0 produziram 93% de fenóis totais, em relação às
plantas de campo (100%). Através da Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência foi verificada semelhança entre os perfis
cromatográficos dos extratos de plantas de campo e in vitro.
Termos para indexação: Folin-Ciocalteau, CLAE,
micropropagação, cultura de tecidos vegetais, Zingiberaceae,
Alpinia purpurata.
INTRODUCTION
Alpinia purpurata K. Schum is widely used as
ornamental plant in several tropical and subtropical areas,
with high international market demand (KRESS et al., 2002;
SANGWANANGKUL et al., 2008). In folk medicine, it is
(Recebido em 20 de junho de 2008 e aprovado em 16 de outubro de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 92-98, 2008
Effects of auxins and cytokinins on in vitro...
used for cough in Venezuela and presents antibacterial
activity (BERMÚDEZ & VELÁSQUEZ, 2002; ZOGHBI et
al., 1999). Recent studies have showed the phytochemical
potential of this species (VICTÓRIO et al., 2007, 2008).
The vegetative propagation through rhizome is the
main way of reproduction of this species. According to
Morón (1987), for the propagation of A. purpurata in
greenhouse the time is twice more than in in vitro systems.
Plant tissue culture techniques have been employed, in
Brazil, since 1950, and the main advantages include the
continuous and fast production of aseptic and selected
plants. These techniques permit a commercial-scale
production of plants (ROUT et al., 2006) and some studies
have showed them as an alternative for optimizing
secondary metabolites production (RAO &
RAVISHANKAR, 2002). The micropropagation of A.
purpurata supplies may be a source for ornamental and
medicinal raw material (MULABAGAL & TSAY, 2004;
POMPELLI et al., 2007).
Addition of auxins and cytokinins in the culture
media are essential to improve and regulate growth and
morphogenesis of the cultures (CHITRA & PADMAJA,
2005; KYOZUKA, 2007). Besides, several studies have
reported the effects of plant growth regulators in in vitro
phenolic production (SANTOS-GOMES et al., 2002;
THIEM, 2003). We intended to develop a protocol for in
vitro production of A. purpurata plants and to evaluate
the effects of auxins and cytokinins on plant development
and compounds phenolic production.
MATERIALAND METHODS
Plant Material
Buds from inflorescence of donor plants of Alpinia
purpurata, red inflorescence, were used as source of plant
material to initiate in vitro cultures. Voucher specimen was
deposited at the Herbarium of Rio de Janeiro Botanical
Garden, under accession number RB 433484. Buds were
collected and washed with running water using nylon
brush for removing residues. The sterilization process was
concluded in four steps in sterile ambient, after dissection
93
of leaves: 20% of commercial bleach solution for 40 min,
followed by immersion in distilled water plus commercial
detergent solution for 15 min, dipped in 70% ethanol,
washed for 10 min in 30% of commercial bleach solution
and rinsed with sterile distilled water three after each step.
Establishment of in vitro cultures
Explants were subcultured into glasses (16 x 8 cm)
containing 50 ml of culture medium Murashige & Skoog
(1962) supplemented with 3% of sucrose, 1.48 ìM thiamineHCl, 2.43 ìM pyridoxine, 4.1 ìM nicotinic acid, 0.6 mM myoinositol. The media pH was adjusted to 5.8 before
autoclaving at 121oC for 15 min. The media was solidified
with 0.78% of agar-agar. In order to obtain at the least of
shoots for initiating the treatments, plantlets were
subcultured in solid MS0 until enough shoots were
available. MS basal media was supplemented with growth
regulators BAP (6-benzylaminopurine), TDZ (thidiazuron),
IAA (indole-3-acetic) either singly or in combination as
follows: solid MS (control 1); liquid MS (control 2); IAA 2
(2 mg L-1); TDZ 2 and TDZ 4 (2 and 4 mg L-1, respectively);
BAP 2 (2 mg L-1); IAA 2 + TDZ 2 (2 mg L-1) and IAA 2 +
BAP 2 (2 mg L-1). Liquid MS was used for all treatments
with growth regulators. Cultures were maintained at 25 ±
2oC, photoperiod of 16 h under fluorescent tubes (Duramax
Universal, General Electric®) at light intensity of 30
µmoles.m-2.s-1. The morphogenetic response was recorded
after 3 months of incubation: percentage of shoot per
explant, number of leaves, shoot height (cm) and percentage
of rooting. Figure 1 shows a summarized scheme of in
vitro protocol of A. purpurata plant production. Threemonth-old in vitro plants were used in the phytochemistry
analysis.
Total phenolic content through Folin-Ciocalteau
Total phenolics compounds were determined using
the Folin-Ciocalteau method. The hydroalcoholic extracts
of leaves of A. purpurata from field and in vitro system
were dissolved in ethanol (70%) at 1mg mL-1. An aliquot of
0.5 ml of diluted extract and 2 ml Folin-Ciocalteau reagent
(10%) were added, after 3 min, along with 2 ml of 7.5%
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 92-98, 2008
94
VICTÓRIO, C. P. et al.
FIGURE 1 Scheme of in vitro establishment of Alpinia purpurata.
sodium carbonate, and the contents were mixed. The mixture
was homogenized and incubated at 50oC for 30 min. The
absorbance was measured at 740 nm in a
spectrophotometer using gallic acid as standard. It was
used two controls: (1) Folin-Ciocalteau + sodium carbonate
and (2) crude extract solution. The quantification of
phenolic compounds in crude extracts was determined from
regression equation of calibration curves and expressed
as mg gallic acid equivalents (GAE) per 1 g of dried leaves,
after converted in percentage considering field samples as
100%. All determinations were carried out in triplicates.
Qualitative analysis of crude extract by HPLC
Leaves of A. purpurata from field and in vitro
systems were dried and macerated in 70% ethanol for 45
min using ultrasonic bath according to Victório (2008).
Crude extracts were filtered and dried by evaporation at
60ºC in rotary evaporator and by lyophilization. Crude
extracts were dissolved in methanol (70%) at 20 mg mL-1
(field leaves) and 50 mg mL-1 (in vitro leaves), filtered in
vacuum and HPLC-UV analyses were performed on an
apparatus Shimadzu equipped with SPD-M10A diode array
detector, LC-10AD pump and CBM-10 interface, UV-vis
detector and fitted with a reversed phase column
(Lichrosorb RP-18, 25 cm x 5 mm), ambient temperature.
Separation was done in the following mobile phase: MilliQ
water + 0.1% phosphoric acid (A) and methanol (B): 1-10
min (30% B); 20 min (40% B); 60 min (100% B). The flow
rate was kept constant at 1 ml min-1 and the peaks were
detected at 360 nm. All chemical used in analysis as
methanol and phosphoric acid were of HPLC grades and
were purchased from Merck. MilliQ water was utilized to
HPLC mobile phase and sample preparation. The injections
were repeated in triplicates.
Statistical analysis
Each treatment was replicated a minimum of 30 times,
using a completely randomized design. Data were submitted
to analysis of variance (ANOVA) and statistical averages
comparisons were made through Tukey s test at 5%
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 92-98, 2008
Effects of auxins and cytokinins on in vitro...
significance level. For percentages, it was taken difference
between two percentages (p1 and p2) test, considering p<
0.05 level using t-test.
95
subcultures or acclimatization can be made, since its shoots
Comparing growth regulators treatments, no
advantage was obtained in number of shoots. In previous
studies, Morón (1987) verified that BAP increased the
proliferation rate of A. purpurata. Illg & Faria (1995)
obtained the best number of shoots when combined BAP
with auxin. In the present study, the addition of isolated
TDZ or BAP improved the number of leaves when
compared with control. For the first time it was evaluated
the addition of TDZ in in vitro cultures of any Alpinia
species. The increasing in TDZ concentration did not result
in better proliferative responses of in vitro plants.
Despite auxins are associated with the initiation of
rooting, IAA did not influence rooting in A. purpurata.
These plantlets developed new roots from the first month,
reaching 100% in the second month, when cultured in
medium without growth regulators. However, auxin IAA
induced an increasing in shooting height and in the number
of leaves in comparison with control after 3 months.
reached 100% rooting and are properly elongated (Figure
Considering the report on micropropagation of the
2A). The ideal interval of time for subcultures was 2 to 3
same species using IAA and BAP (ILLG & FARIA, 1995;
months for all treatments. High proliferation rate was
MORÓN, 1987), the different results suggest that plant
achieved using liquid MS0. Within 1 year, it was verified
material characteristics as origin, collecting period, age of
the greatest quantity of 30 shoots per year (100%) in MS0,
plant are decisive for establishing in vitro cultures and
followed by TDZ 2 (84%). By comparison with solid MS0,
obtaining a good development.
RESULTS AND DISCUSSION
The sterilization method was efficient. The use of
buds from inflorescence represented an advantage instead
of rhizome buds that are more difficult to be sterilized and
may present dormancy period (BURCH et al., 1987). The in
vitro development responses of A. purpurata are grouped
in Table 1 and Figure 2.
Alpinia species posses the advantage of
reproducing through vegetative propagation that increases
the chances in micropropagation. Cultures establishment
was fast and the growth is continuous as shootings occur
till 5 or 6 months. For three months, different stages of
shooting were observed, however after 2 months plants
the liquid medium increased the number of shoots in 161%
The production of phenolic compounds in plantlets
and for this reason it was chosen for conducting growth
has been reported and may be associated with in vitro
regulators experiments.
stress conditions (SANTOS-GOMES et al., 2002). The
TABLE 1 In vitro development of Alpinia purpurata plants under different plant growth regulators.
Growth
Regulators (mg L-1)
Leaves per shoot
1 month
2 months
4.0±0.2
a
82.5
100
100
ac
100
100
100
b
100
100
100
3.5±0.2
a
100
100
100
4.2±0.2
c
100
100
100
90
96.7
100
100
100
100
2.2±0.1
a
2.1±0.1
a
BAP 2
2.8±0.1
a
IAA 2 + TDZ 2
2.0±0.1a
4.2±0.2a
5.0±0.2b
IAA 2 + BAP 2
a
a
b
2.5±0.1
3.3±0.2
a
3 months
2.3±0.1
TDZ 4
3.3±0.2
a
2 months
a
TDZ 2
3.4±0.2
a
1 month
a
2.3±0.3
IAA 2
3.4±0.3
3 months
a
Liquid MS0
a
Rooting (%)
4.2±1.0
3.4±0.1
4.1±0.2
5.1±0.1
5.1±0.2
Different letters indicate significant differences at p< 0.05 level, Tukey s test, n e 30.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 92-98, 2008
96
VICTÓRIO, C. P. et al.
FIGURE 2 In vitro development of Alpinia purpurata plants in MS medium under different plant growth regulators
(mg.l-1): (A) Sequence of development: 1 month (I), 2 months (II) and 3 months (III); (B) shoot height after 2 months; (C)
shoot height and (D) percentage of shoots, after 3 months. Different letters indicate significant differences at p< 0.05
level, Tukey s test, n e 30. *100% correspond to 30 shoots per explant, within 1 year.
advantage of in vitro production of secondary metabolites
is the possibility to control environment and nutritional
factors. Data show high level of phenolics in in vitro
cultures of A. purpurata (93%) compared with field plants
(100%) (Figure 3A). Through reversed-phase HPLC was
found similarity between field and in vitro plants profiles
(Figure 3B-C). The peaks 1, 2 and 3 presented
characteristics of phenolic compounds verified through
UV spectra obtained by HPLC. A. purpurata is not currently
used in folk medicine and these results may indicate the
presence of therapeutic resource in its phytochemistry.
The preliminary investigation of phenolic in
organogenic cultures of A. purpurata using FolinCiocalteau reagent and HPLC analysis brings perspectives
about the production of antioxidant compounds by this
species. In addition, the establishment of tissue culture of
A. purpurata may be a good alternative to produce aseptic
plants and its bioactive metabolites.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 92-98, 2008
Effects of auxins and cytokinins on in vitro...
97
FIGURE 3 (A) Total phenolic of crude extract of field and in vitro Alpinia purpurata leaves, n= 3. (B) Chromatographic
profiles of hydroalcoholic extract of field A. purpurata plants (360 nm) and (C) in vitro plants (liquid MS0) obtained by
HPLC.
ACKNOWLEDGEMENTS
C. P. Victório acknowledges the fellowship from
CAPES and PROEX financial support.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 92-98, 2008
CURVA DE CRESCIMENTO,
ATIVIDADE
DA
FENILALANINA AMÔNIACurva de crescimento,
atividade da
fenilalanina...
99
LIASE E TEORES DE FENÓIS E TANINOS TOTAIS EM CALOS DE
Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (FABACEAE-MIMOSOIDEAE)
GROWTH CURVE, PHENYLALANINE AMMONIA-LYASE ACTIVITY AND TOTAL
PHENOL LEVELS IN CALLUS OF Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville
(FABACEAE-MIMOSOIDEAE)
ANA HORTÊNCIA FONSÊCA CASTRO1, MILLER MARANI LIMA2, RENATO PAIVA3,
AMAURI ALVES DE ALVARENGA4, MIRELLE OLIVEIRA SÓTER5
1
Doutora, Centro Universitário de Lavras/UNILAVRAS 37200-000 Lavras, MG.
Bolsista IC/FAPEMIG, Centro Universitário de Lavras/UNILAVRAS 37200-000 Lavras, MG.
3
PhD, Universidade Federal de Lavras/UFLA 37200-000 Lavras, MG.
4
Doutor, Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG [email protected]
5
Acadêmica, Centro Universitário de Lavras/UNILAVRAS 37200-000 Lavras, MG.
2
RESUMO
Objetivou-se estabelecer a curva de crescimento e avaliar
a atividade da fenilalanina amônia-liase e os teores de fenóis e
taninos totais em calos de barbatimão, explantes foliares foram
inoculados em meio MS suplementado com 30 g L-1 sacarose e
acrescidos de 9,05 M de 2,4-D. O crescimento, a atividade da
fenilalanina amônia-liase e os teores de fenóis e taninos totais
foram avaliados a cada 10 dias, durante 110 dias. A curva de
crescimento dos calos apresentou um padrão sigmoidal, com cinco
fases distintas. Os teores médios de fenóis totais acompanharam
as variações observadas para a atividade enzimática. Alta atividade
e maiores teores de fenóis totais foram observados no explante
inicial, com reduções progressivas até a fase linear. Na fase
estacionária, observaram-se incrementos importantes naatividade
da fenilalanina amônia-liase e nos teores de fenóis totais. Não foi
detectada a presença de taninos totais nos calos.
INTRODUÇÃO
Atualmente, um considerável esforço tem sido feito
com o intuito de se produzir fitoterápicos com maiores
concentrações de substâncias ativas vegetais, através de
culturas de células ou tecidos. Segundo Taniguchi et al.
(2002), dentre as diferentes técnicas de cultivo in vitro, a
cultura de calos tem apresentado grande importância para
a propagação e produção in vitro de espécies de interesse
medicinal. A desdiferenciação e indução de regeneração
das plantas a partir de calos são, muitas vezes, processos
difíceis de serem obtidos e podem demandar algum tempo.
Termos para indexação: Barbatimão, cultivo in vitro, planta
medicinal, Stryphnodendron adstringens.
As auxinas têm sido amplamente utilizadas nos meios de
ABSTRACT
In order to establish growth curve, phenylalanine ammonialyase (PAL) activity and total phenol and tannin levels in
Stryphnodendron adstringens, leaf explants were inoculated in
MS medium, supplemented with 30 g L-1 sucrose and 9.05 M
2,4-D. The growth, PAL activity and total phenol and tannin
levels were evaluated at 10 days intervals, during 110 days. Callus
growth curve presented a sigmoid shape with five different phases.
Average levels of total phenol followed the changes observed for
enzymatic activity. High activity and higher levels of total phenol
were observed in initial explants, with progressive reductions until
the linear phase. Increases in phenylalanine ammonia-lyase activity
and total phenols levels were observed in stationary phase. No
tannins were observed on callus.
da concentração, causam elongação celular e expansão ou
Index terms: Stryphnodendron adstringens, In vitro Culture,
Medicinal Plant.
cultivo para a indução de calos e geralmente, dependendo
divisão celular. Em geral, com o uso de baixas
concentrações de auxinas, predomina a formação de raízes
adventícias, enquanto que altas concentrações induzem a
formação de calos. A interação entre auxinas e citocininas
também é muito utilizada para a indução de calogênese
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Durante a calogênese é importante estabelecer-se
a curva de crescimento de calos, o que propicia a
identificação das fases distintas de crescimento da espécie.
A partir deste estudo, pôde-se determinar o momento exato
de repicagem dos calos para um meio fresco ou a
(Recebido em 23 de janeiro de 2008 e aprovado em 7 de outubro de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 99-104, 2008
100
CASTRO, A. H. F. et al.
possibilidade de sua utilização em suspensões celulares,
visando a otimização da produção de metabólitos
secundários em espécies medicinais (GEORGE, 1996). O
crescimento in vitro de calos geralmente apresenta um
padrão sigmoidal, com cinco fases distintas. Segundo Smith
(1992), a fase lag se caracteriza como fase de maior produção
de energia, correspondendo ao período em que as células
se preparam para a divisão, visando sua expansão. Ocorre o
início da mobilização de metabólitos primários, sem qualquer
divisão celular, síntese de proteínas e de compostos
específicos. Essa fase resulta em um pequeno crescimento
dos calos. A fase exponencial é biossintética. Observa-se o
maior crescimento dos calos, devido à máxima taxa de divisão
celular, característica desse período. O número de células
aumenta. Na fase linear há diminuição da divisão celular,
mas aumento de volume celular e a fase de desaceleração é
o momento em que as culturas devem ser transferidas para
outro meio, devido à redução de nutrientes, produção de
produtos tóxicos, secagem do ágar e redução do oxigênio
no interior das células. Na fase estacionária ocorre maior
acúmulo de metabólitos secundários.
O barbatimão [Stryphnodendron adstringens
(Mart.) Coville Fabaceae-Mimosoideae) é uma importante
espécie medicinal do cerrado, com altos teores de
compostos polifenólicos, em especial os taninos. Possui
grande distribuição e importância econômica para o estado
de Minas Gerais, sendo empregado como adstringente e
cicatrizante, no combate de amidalite, faringite,
hemorróidas, leucorréias, erupções cutâneas, diarréias e
como agentes antiinflamatórios (LIMA et al., 1998).
A fenilalanina amônia-liase (E.C. 4.3.1.5) é uma
enzima-chave e regulatória da rota biossintética dos
fenilpropanóides e de seus derivados e catalisa a
desaminação do aminoácido L-fenilalanina, em ácido transcinâmico, sendo esse o primeiro passo para a biossíntese
dos fenólicos vegetais (ASSIS et al., 2001). De acordo com
Rivero et al. (2001), os níveis dessa enzima podem flutuar
significativamente em intervalos relativamente curtos, em
resposta a uma ampla variedade de estímulos como o
fotoperíodo, fitocromo, mudanças de temperatura, radiação
UV, deficiência de nutrientes, reguladores de crescimento,
injúrias mecânicas, íons metálicos, infecções fúngicas,
virais e ataque de insetos, bem como o estádio de
desenvolvimento vegetal e o grau de diferenciação de
células e tecidos (SOLECKA & KACPERSKA, 1995).
Devido à exploração irracional pelas indústrias de
curtimento do couro, o barbatimão encontra-se ameaçado
de extinção. Assim, devem-se melhorar as técnicas de
propagação, encorajar seu cultivo e criar vias alternativas
para a produção de tanino, em larga escala, a partir de
fontes naturais.
Objetivou-se estabelecer a curva de crescimento e
avaliar a atividade da fenilalananina amônia-liase e os teores
de fenóis e taninos totais em calos de barbatimão.
MATERIAL E MÉTODOS
As etapas experimentais foram realizadas entre
fevereiro de 2007 e janeiro de 2008, no Centro Universitário
de Lavras (UNILAVRAS) e na Universidade Federal de
Lavras (UFLA).
Curva de crescimento de calos
A curva de crescimento foi obtida a partir da
inoculação de segmentos foliares de 0,25 cm2 de área,
empregados como explantes em meio MS (MURASHIGE
& SKOOG, 1962), suplementado com 30 g L-1 sacarose e
acrescidos de 9,05 M de 2,4-D. Os meios foram
solidificados com ágar, na proporção de 7 g L-1 e o pH
ajustado para 5,7 ± 0,1, antes da autoclavagem, por 20 min.
Após inoculação, os explantes foram transferidos para sala
de crescimento, onde foram incubados na presença de luz,
à temperatura de 27 ± 1 oC , fotoperíodo de 16 horas e
DFFFA= 25 mol m-2 s-1.
Foram feitas pesagens do material inoculado fresco,
a partir do dia da inoculação (tempo 0), até ser atingida a
fase de desaceleração, em intervalos de 10 dias. O
porcentual de crescimento dos calos foi determinado pela
equação proposta por Lameira (1997):
% crescimento = Pf Pi
Pf
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 99-104, 2008
Curva de crescimento, atividade da fenilalanina...
101
onde:
Pf = Matéria seca final
Pi = Matéria seca inicial
agitação contínua, medida pela variação da absorbância a
290 nm. A atividade específica da enzima foi definida em
nmol de ácido cinâmico/h/mg de proteína.
O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado, sendo cada pesagem composta
por duas repetições e cada repetição pela média de 10
tubos, cada tubo contendo um explante. Os dados obtidos
foram submetidos à análise de variância e analisados
estatisticamente utilizando-se o Sistema de Análise de
Variância para Dados Balanceados (FERREIRA, 2000).
Fenóis totais
Determinações da atividade da fenilalanina amônia-liase
e teores de fenóis e taninos totais
Calos obtidos na curva de crescimento foram
imersos em nitrogênio líquido e posteriormente
armazenados em Freezer Forma Scientific, a -86 oC, até o
momento de serem utilizados na determinação da atividade
enzimática. Outros calos, assim como aqueles obtidos no
experimento com a sacarose foram liofilizados para
determinação dos teores de fenóis e taninos totais.
Atividade da fenilalanina amônia-liase
O procedimento descrito por Cheng & Breen (1991),
com algumas modificações, foi utilizado para extração e
determinação da atividade enzimática.
Calos congelados (5 g) foram triturados,
homogeneizadas com acetona 80% e congelados por 15
minutos. O homogenato foi filtrado e o pelet foi seco através
de vácuo.
O extrato protéico foi obtido homogeneizando-se
0,5 g do pelet seco, em 5 mL de tampão borato de sódio 0,1
M, pH= 8,8, contendo 5 mM de -mercaptoetanol, 2 mM
de EDTA e 4% (p/v) de PVP a 4oC. Depois de 1h, o
homogenato foi centrifugado a 27.000 g por 30 minutos, a
4 oC. A mistura de reação foi constituída por 0,5 mL de Lfenilalanina 30 M, 30 mM de tampão borato de sódio pH=
8,8 e 1 mL de extrato cru, num volume total de 3 mL. O
substrato foi adicionado após 10 minutos de pré-incubação
e a reação foi interrompida com 0,1 mL de HCl 6 N. A
atividade da fenilalanina amônia-liase foi determinada pela
produção de cinamato, após 90 minutos, à 30 oC, sob
Amostras de calos liofilizados foram trituradas em
micromoinho e armazenadas em frascos fechados,
protegidos da luz.
Aproximadamente 500 mg de calos liofilizados e
triturados foram extraídos cinco vezes com 5 mL de uma
mistura de metanol:água (1:1), sob refluxo. O volume final
do extrato foi completado para 25 mL.
Uma alíquota de 100 L do extrato foi utilizada para
a determinação dos teores de fenóis totais, através do
método de Folin-Dennis, segundo as normas da AOAC
(1970). As determinações foram feitas em triplicata e o
resultado foi expresso em porcentagem de ácido tânico,
por grama de calo seco.
Taninos Totais
A determinação dos teores de taninos totais foi
realizada através do Método de Difusão Radial , de acordo
com Hagerman (1987).
Um volume de 5 mL do extrato foi concentrado a 37
o
C e posteriormente retomado com 0,5 mL de uma mistura
de metanol:água (1:1). Uma alíquota de 15 mL foi utilizada
para a determinação. Todas as determinações foram feitas
em triplicata. O resultado foi expresso em percentagem de
tanino, por grama de calo seco.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Curva de crescimento de calos
A curva de crescimento dos calos seguiu o padrão
sigmoidal, apresentando cinco fases distintas: lag,
exponencial, linear, desaceleração e estacionária (Figura
1). A fase lag onde as células do explante se preparam para
a divisão celular e produção de energia ocorreu até o 30o
dia após a inoculação, com calos apresentando um
crescimento de aproximadamente 73%. A segunda fase,
exponencial, estendeu-se do 31o ao 50o dia de cultivo,
com 70% de crescimento, período esse caracterizado pela
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 99-104, 2008
102
CASTRO, A. H. F. et al.
máxima divisão celular. A fase linear ocorreu entre o 51o ao
70o dia e não se verificou crescimento dos calos nesse
período. Entre o 71o e 100o dia observou-se a fase de
desaceleração, com 28% de crescimento e a partir do 101o
dia, a cultura entrou na fase estacionária. Segundo Smith
(1992), na fase de desaceleração, os calos devem ser
transferidos para um novo meio de cultura, devido à
redução de nutrientes, secagem do ágar e acúmulo de
substâncias tóxicas.
0,16
Matéria seca (g)
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100 110 120
Dias
FIGURA 1
Curva de crescimento de calos de
Stryphnodendron adstringens obtidos a partir de segmentos
foliares inoculados em meio MS, contendo 9,05 M de 2,4D e 30 g L-1 de sacarose.
De maneira semelhante, essa mesma curva de
crescimento pode ser dividida em três fases: fase de
crescimento lento (do dia da inoculação até o 30o dia), fase
de crescimento ativo (do 31 o ao 70 o dia) e fase de
estabilização (71 o dia em diante), sendo indicada a
repicagem entre o 71o ao 100o dia.
A curva de crescimento para calos de
barbatimão apresentou um padrão semelhante ao de outras
espécies medicinais de cerrado como Byrsonima
intermédia A. Juss. (NOGUEIRA et al., 2008), Croton
urucurana Baill.(LIMA, 2004), Rudgea viburnoides Benth.
(BONILLA, 2002) e Derris sp. (CONCEIÇÃO, 2000).
Atividade da fenilalanina amônia-liase e teores de fenóis
e taninos totais
Na figura 2, encontram-se representados os
resultados da atividade da enzima fenilalanina amônia-liase
e dos teores de fenóis totais verificados durante o período
experimental. O explante inicial apresentou um teor médio
de 0,65% de taninos totais, não se detectando, entretanto,
a presença de taninos nos demais calos formados.
Conforme pode-se observar, a atividade da
fenilalanina amônia-liase situou-se entre 0,16 e 1,96 mol
de ácido cinâmico h-1 g-1 de matéria fresca (p<0,05) (figura
2A). A atividade apresentou-se máxima no explante inicial
(dia 0) e reduziu progressivamente até o 70o dia, período
esse correspondente às fases lag, exponencial e linear.
Entre o 71o ao 100o dia, ou seja, na fase de desaceleração, a
atividade enzimática indicou uma tendência em se manter
constante e a partir do 101o dia (fase estacionária), verificouse um pequeno incremento nessa atividade, da ordem de
26%. De maneira semelhante, os teores médios de fenóis
totais acompanharam as variações observadas para a
atividade enzimática e situaram-se em uma faixa de 0,29 a
3,99%, sendo o teor médio máximo observado no explante
inicial (figura 2B). Os teores de fenóis totais reduziram
significativamente até o 60o dia (fase lag e exponencial) e a
partir do 61o ao 90o dia permaneceram praticamente
constantes, com os menores níveis observados durante o
período experimental, em torno de 0,37%, em média. A partir
da fase estacionária (100o dia), verificou-se um aumento de
65% nos teores médios de fenóis totais.
Estes resultados mostraram-se muito interessantes
do ponto de vista fisiológico e fitoquímico e corroboram
com relatos de Conceição (2000) e Lameira (1997), os quais
citam que a fase estacionária corresponde ao período em
que ocorre maior acúmulo de metabólitos secundários.
Apesar de esses teores serem baixos, é importante ressaltar
que o meio de cultura pode ser otimizado para produção
em larga escala de fenóis totais e taninos, uma vez que
foram obtidos in vitro, a partir de segmentos foliares e de
forma convencional são extraídos da casca da planta adulta,
cultivada in vivo.
A presença de baixos teores de fenóis e a ausência
de taninos pode estar associada à alta atividade metabólica
relacionada ao crescimento dos calos (mitose), o que
demanda elevada quantidade de substrato necessário à
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 99-104, 2008
2,5
103
4,5
A
B
4
2
3,5
Fenóis Totais (%)
Atividade da Fenilalanina Amônia-Liase (mmol de
ác. cinâmico h -1 g-1 MF)
Curva de crescimento, atividade da fenilalanina...
1,5
1
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0,5
0
0
0
10
20 30 40
50 60 70
80 90 100 110 120
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120
Dias
Dias
FIGURA 2 Valores médios de atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (A) e teores de fenóis totais (B) em
Stryphnodendron adstringens, durante o período experimental.
produção de energia. Segundo Botta et al. (2001), a
diferenciação celular, assim como a desaceleração da
atividade mitótica, progressivamente, permite o acúmulo de
compostos derivados do metabolismo secundário. Para
Lavola et al. (2000) e Peñuelas et al. (1997), variações nos
teores de metabólitos secundários não podem ser explicadas
somente pelas diferenças na disponibilidade de carboidratos,
devendo-se considerar também a disponibilidade de
precursores para a sua síntese e as mudanças nos padrões
de síntese e catabolismo desses compostos.
CONCLUSÕES
A curva de crescimento para calos de barbatimão
apresentou um padrão sigmoidal, com cinco fases distintas,
sendo indicada a repicagem entre o 71o ao 100o dia.
Alta atividade e maiores teores de fenóis totais
foram observados no explante inicial, com reduções
progressivas até a fase linear. Na fase estacionária,
observaram-se incrementos importantes na atividade da
fenilalanina amônia-liase e nos teores de fenóis totais.
Não se detectou a presença de taninos totais nos
calos durante a determinação da curva de crescimento, na
presença de 9,04 M de 2,4-D.
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AGRADECIMENTOS
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EMBRIOGÊNESEEmbriogênese
SOMÁTICA
DIRETA
DE Coffea arabica L.:
somática direta
de Coffea arabica...
CONCENTRAÇÕES DE NH4NO3 E DE KNO3 NO
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES1
105
DIRECT SOMATIC EMBRYOGENESIS OF Coffea arabica L.: CONCENTRATIONS OF
NH4NO3 AND KNO3 ON THE DEVELOPMENT OF EMBRYOS
JULIANA COSTA DE REZENDE2, MOACIR PASQUAL3, SAMUEL PEREIRA DE CARVALHO3,
ESTER ALICE FERREIRA4, FLAVIA CARVALHO SANTOS5
1
Artigo extraído da dissertação de mestrado da primeira autora apresentada a Universidade Federal de Lavras/UFLA.
Pesquisadora MSc Epamig Campus da UFLA Cx. P. 176 372000-000 Lavras, MG [email protected]
3
Professor Dr. Titular do Departamento de Agricultura/DAG Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P 3037 372000-000
Lavras, MG [email protected], [email protected]
4
Pesquisadora Dra. Epamig Cx. P. 351 Uberaba, MG [email protected]
5
Doutoranda em Fitotecnia Bolsista Capes [email protected]
2
RESUMO
O melhoramento genético do cafeeiro tem incorporado
através de cruzamentos, ganhos genéticos para produtividade e
outras características de interesse agronômico. A introdução de
métodos biotecnológicos para auxiliar os programas de
melhoramento genético tem-se mostrado bastante útil,
principalmente em culturas perenes, como é o caso do cafeeiro.
Um importante método de propagação in vitro de plantas de
Coffea é a embriogênese somática direta. Objetivou-se, com este
trabalho, avaliar os efeitos de diferentes concentrações de
NH4NO3 e KNO3 no desenvolvimento de embriões somáticos
diretos de C. arabica L. cv. Rubi. Os tratamentos foram
constituídos de cinco concentrações de NH4NO3 (0; 412,5; 825;
1237,5 e 1650 mg L-¹) e cinco concentrações de KNO3 (0; 475;
950; 1425 e 1900 mg L-¹) adicionados ao meio MS. O experimento
foi mantido por 150 dias em sala de crescimento com irradiância
em torno de 32 ìM m-2 s-1 e fotoperíodo de 16 horas, com
temperatura de 25 ± 1oC. As variáveis avaliadas foram número de
folhas, comprimento da parte aérea e massa fresca da parte aérea.
Os resultados indicaram que a utilização de 950 mg L-¹ de KNO3
combinada com 115,5 a 247,5 mg L-¹ de NH4NO3 como a mais
indicada para o desenvolvimento de embriões somáticos de C.
arabica L. Os resultados apontam ainda que a ausência de
nitrogênio promove o maior peso das plântulas.
of NH4NO3 (0; 412.5; 825; 1237.5 and 1650 mg L-¹) of MS
formulation x KNO3 (0; 475; 950; 1425 and 1900 mg L-¹) MS
formulation were tested for the development of somatic embryos.
The experiments were maintained in a growth room under light
intensity of 32 µMol m-2 s-1, photoperiods of 16 hours and
temperature of 25 ± 1o C. The characteristics evaluated were: leaf
number, shoot length and shoot fresh matter. The results indicated
that the use of 950 mgL-¹ KNO3 combined with 115.5 to 247.5
mg L-¹ NH4NO3 is the most indicated for the development of
somatic embryos of C. arabica L. The absence of nitrogen
promotes the largest weight of plantlets.
Termos para indexação: Nitrogênio, café cv. Rubi, Coffea
arabica.
O nitrogênio difere dos demais macronutrientes por
ABSTRACT
Coffee breeding programs have incorporated, using
artificial crossings, genetic benefits for productivity and other
characteristics of agronomic interest. The introduction of
biotechnology methods to improve genetic breeding programs
has demonstrated to be useful, mainly in perennial cultures, as
coffee species. An important method of in vitro propagation of
Coffea plants is somatic embryogenesis. Therefore, the objective
of this work was to obtain the most adequate combinations of
culture medium components, for plantlets growth. The influence
Index Terms: Nitrogen, Coffee cv. Rubi, Coffea arabica.
INTRODUÇÃO
O nitrogênio é um dos elementos necessários e
ativos para diversos processos metabólicos da planta, pois
é constituinte de várias biomoléculas essenciais, tais como
aminoácidos, ácidos nucléicos, enzimas e proteínas e,
juntamente com a sacarose, é o principal componente em
quantidade no meio de cultura.
apresentar-se na forma de cátion (amônio) e ânion (nitrito
e nitrato) contribuindo de forma efetiva tanto no
metabolismo celular como na regulação do seu potencial
osmótico. Atua como agente tamponante e favorece a
absorção de outros íons presentes no meio (NAGAO et
al., 1994). A vantagem dos tecidos vegetais receberem pelo
menos parte do nitrogênio sob uma forma prontamente
reduzida é que haveria uma diminuição no gasto de energia
(Recebido em 14 de fevereiro de 2007 e aprovado em 16 de outubro de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 105-110, 2008
106
REZENDE, J. C. de et al.
que ocorre na conversão enzimática de nitrato a amônio
(GEORGE et al., 1987). O efeito dessas diferentes formas
inorgânicas, separadamente, pode promover ou não o
crescimento e desenvolvimento de determinadas espécies
de plantas, enquanto a combinação das duas estimula o
crescimento de muitas espécies in vitro (CALDAS et al.,
1998).
De acordo com George & Sherrington (1984), o
desenvolvimento e morfogênese em cultura de tecidos são
acentuadamente influenciados pela disponibilidade de
nitrogênio e pela forma como o mesmo é fornecido. Alta
concentração de sais do meio MS, comparada a outros
meios, especificamente dos níveis de amônio (-NH4) e
nitrato (-NO3), pode ser crítica no processo de morfogênese
e crescimento (SAKUTA & KOMAMINE, 1987), estando
pois, a demanda energética fornecida pelo metabolismo de
carboidratos e a assimilação destes íons diretamente
relacionada com o sucesso da cultura in vitro.
Sato (1994) estudou o efeito de diferentes
concentrações de nitrogênio sobre a propagação de três
diferentes clones de gérbera de vaso (Gerbera jamesonii
Adlam.), e concluiu que a concentração de nitrogênio do
MS completo inibe a regeneração de brotos, enquanto a
utilização de concentrações diluídas favorece a indução
dos brotos. Bespalhok et al. (1992), estudaram a
concentração de nitrato de amônia na indução de brotos
em estevia (Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni) e
constataram que a concentração de nitrato de amônia do
MS é tóxica. Obteve maior indução de brotações usando
¼ de nitrato de amônia no meio MS. Por outro lado, Tadesse
et al. (2000), verificaram que a ação de diferentes
concentrações de nitrogênio promoveu um incremento
inicial da área foliar das plântulas formadas, mas ocasionou
efeitos relativamente negativos no aumento da área foliar
das plântulas durante a aclimatização.
O nitrato, como única fonte de nitrogênio, sustenta
boa taxa de crescimento em algumas culturas, como roseira
(Rosa gallica L.) (NASH & DAVIES, 1972) e trigo (Triticum
ssp) (BAYLEY et al., 1972; GAMBORG et al., 1968;
GAMBORG & SHYLUK, 1970). Entretanto, há espécies
que não crescem bem com o nitrato no meio como, por
exemplo, o arroz (Oriza sativa L.) (SARGENT & KING, 1974;
YATAZAWA & FURUHASHI, 1968).
Grewal et al. (1980), citados por Grattapaglia &
Machado (1990), verificaram em culturas de eucalipto
(Eucaliptus citriodora Hook.) que, ao se reduzir pela
metade as concentrações de nitrato de amônio e de
potássio do meio MS, a taxa de multiplicação dobrava.
Essa mesma concentração proporcionou o melhor
comprimento da parte aérea em embriões zigóticos de C.
arabica L. (RIBEIRO, 2001).
A maioria das plantas prioriza a absorção de NH4+ a
NO3-, porém é necessário encontrar o balanço ideal de
NH4+/NO3- para o ótimo crescimento in vitro (SATO, 1994).
Objetivou-se, com este trabalho, estudar os efeitos de
diferentes concentrações de NH4NO3 e KNO3 do meio MS
no desenvolvimento de embriões somáticos diretos de C.
arabica L. cv. Rubi.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório
de Cultura de Tecidos Vegetais do Departamento de
Agricultura da Universidade Federal de Lavras, MG. Foram
utilizados como explantes, embriões de C. arabica cv.
Rubi provenientes da embriogênese somática direta. Os
embriões somáticos foram induzidos em meio MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962) com 50% dos sais,
acrescido de 20 mg L-1 de GA3, 6 mg L-1 de cinetina, 8 mg
L-1 de ANA, 100mg L-1 de caseína hidrolisada e 400mg L1
de extrato de malte. Os tubos de ensaio foram mantidos
durante 150 dias sob condições de obscuridade, com
temperatura de 25 ± 1oC. Os embriões somáticos induzidos
nesse processo foram individualizados em tubos de
ensaio e mantidos, durante 30 dias, em meio MS,
objetivando a homogeneização do material para a
realização deste experimento.
No preparo do meio foram utilizadas soluçõesestoque armazenadas em frascos de vidro escuro, a
temperaturas em torno de 5°C. Os tratamentos foram
constituídos de cinco concentrações de NH4NO3 (0; 475;
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 105-110, 2008
Embriogênese somática direta de Coffea arabica...
950; 1425 e 1900 mg L-¹) e cinco concentrações de KNO3
-
(0; 475; 950; 1425 e 1900 mg L ¹) adicionados ao meio MS.
O meio foi solidificado com 5g L -1 de ágar e o pH
ajustado para 5,8 ± 0,1, utilizando NaOH 0,5 e 0,1 N ou HCl
0,5 N e 0,1 N e distribuído em tubos de ensaio, cada um
recebendo 15 mL do mesmo. Os tubos foram vedados com
tampas plásticas translúcidas antes do processo de
autoclavagem a 121°C e 1 atm, por 20 minutos. Após o
resfriamento, o meio foi levado à câmara de fluxo laminar
desinfestada com álcool 70% (etanol), onde foi feita a
inoculação dos explantes.
Os tubos foram vedados com parafilme e mantidos
em sala de crescimento com irradiância em torno de 32 ìM
m-2 s-1 e fotoperíodo de 16 horas, com temperatura de 25 ±
1oC. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente
casualizado, com quatro repetições e três tubos por
parcela, cada tubo contendo um explante.
Aos 150 dias após a instalação, foram avaliadas as
variáveis número de folhas, comprimento da parte aérea e
peso da matéria fresca das plântulas. Os valores observados
foram submetidos à análise de variância para dados
desbalanceados. Utilizou-se o procedimento GLM,
disponível no aplicativo computacional SAS ® (SAS
INSTITUTE, 1990).
Em situações em que a análise de variância não
confirmou a normalidade dos resíduos, para o comprimento
da parte aérea e peso da matéria fresca os dados sofreram
107
uma transformação para garantir que essa pressuposição
fosse atendida. As transformações utilizadas foram x e
5
x 1 0, 2 , respectivamente. A variável número de folhas
atendeu às pressuposições de normalidade. A análise de
variância do peso da matéria fresca foi realizada por meio
do método dos quadrados mínimos ponderados pelo
inverso das variâncias de cada tratamento, uma vez que
esses apresentaram heterogeneidade de variâncias.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Houve efeito significativo das concentrações de
NH4NO3 e KNO3 para o número de folhas e peso da matéria
fresca das plântulas (Tabela 1). Observa-se que a interação
entre os fatores mostrou-se significativa em relação a todas
as características avaliadas a 5% de probabilidade, pelo
teste F.
Número de folhas
Analisando-se as curvas de regressão, observase, na Figura 1, que houve formação de maior número
de folhas quando foram adicionados ao meio de cultura
1900 mg L-¹ de KNO3 combinado com 129,85 mg L-¹ de
NH4NO3 (média de 11,63 folhas). Com a utilização de 950
mg L-¹ de KNO3 combinada com 878,79 mg L-¹ de NH4NO3,
pôde-se observar a formação média de 10,01 folhas.
Dessa forma, como a diferença é mínima, justifica-se a
utilização de 950 mg L-¹ de KNO3, com o objetivo de
redução dos custos.
TABELA 1 Análise de variância dos dados relativos ao número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA) e
peso da matéria fresca (PMF), das plântulas de Coffea arabica cv. Rubi cultivadas em diferentes concentrações de
NH4NO3 e KNO3.
Fonte de variação
GL
QM
NF
CPA (cm)
PMF (g)
NH4NO3
4
45,8337*
0,1152
1,7450*
KNO3
4
23,0014*
0,0837
2,2117
NH4NO3 x KNO3
16
20,447*
0,1215*
1,5139*
Erro
135
9,1386
0,0584
0,5871
51,62
23,57
9,12
CV (%)
* Significativo a 5%, pelo teste F.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 105-110, 2008
108
REZENDE, J. C. de et al.
Número de folhas (unid.) .
12
10
8
6
4
2
0
0
412,5
825
1237,5
1650
NH4NO3 (mg L-1)
Y KNO3 475, Y KNO3 1425 = ns
Y KNO3 0 = 4,35743 - 0,02046X - 0,0003936X2 + 0,91484LN(X+1) R2 = 0,7819
Y KNO3 950 = 2,38286 + 0,28657X - 0,00269X2 R2 = 0,9544
Y KNO3 1900 = 4,67671 - 0,70436X + 0,00471X2 + 5,59020LN(X+1) R2 = 0,9811
FIGURA 1 Número folhas de plântulas de Coffea arabica
cv. Rubi cultivadas em diferentes concentrações de
NH4NO3 combinadas com 0,950 e 1900 mg L-¹ de KNO3.
Esses autores conseguiram diminuir o efeito tóxico do
amônio apenas diminuindo a concentração de nitrato de
amônio no meio MS.
O número de folhas obtidas na ausência de KNO3
foi inferior, quando comparado aos demais tratamentos (a
maior média observada foi 6,58 folhas na concentração de
376,26 mg L-¹ de NH 4NO 3), evidenciando, assim, a
importância desse sal para o desenvolvimento de folhas
em plântulas de C. arabica cv. Rubi. Os resultados obtidos
confirmam citações (MAGALHÃES & WILCOX, 1987;
SAKUTA & KOMAMINE, 1987), de que o nitrogênio é um
dos elementos essenciais e ativos para diversos processos
metabólicos da planta, pois, é constituinte de várias
biomoléculas essenciais, como aminoácidos, ácidos
nucléicos, proteínas, enzimas e outros.
Comprimento da parte aérea
1,4
1,3
Comprimento da parte aérea (cm) . .
Contudo, concentrações acima de 878,79 mg L-¹ de
NH4NO3 combinadas com 950 mg L-¹ de NH4NO3 ou na
ausência desse, provocaram redução no número de folhas,
possivelmente por toxidez causada pelo amônio, devido à
sua concentração mais elevada em relação ao nitrato no
meio de cultura. Quando o nitrogênio é fornecido somente
na forma de sais inorgânicos de amônio as células in vitro
apresentam sintomas de toxidez (GAMBORG & SHYLUK,
1970; YATAZAWA & FURUHASHI, 1968), demonstrando
assim a necessidade de combinação dessas duas fontes
no meio de cultura.
Segundo Raab & Terry (1994), em virtude do grande
requerimento de energia fotoquímica para a redução
bioquímica do nitrato, era de se esperar que as plantas
crescessem melhor em meios com amônia do que em meios
com nitrato como única fonte de nitrogênio, no entanto,
observou-se o inverso. Esses mesmos autores apontam
como causa desse paradoxo, o efluxo de íons H+ que ocorre
devido à absorção do íon amônio, provocando acidificação
do meio impedindo a absorção de nutrientes. Segundo
Hashimoto et al. (1992), a presença de amônio in vitro
poderia acidificar o meio favorecendo a síntese de
carbamatos e também a atividade de anidrase carbônica.
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0
412,5
825
1237,5
1650
NH4NO3 (mg L-1)
KNO3 0, Y KNO3 475,
Y KNO3 1900 = ns
Y KNO3 950 0,90002 - 0,01368X + 0,00004223X2 + 0,20762LN(X+1) R2 = 0,9793
Y KNO3 1425 = 0,99217 - 0,01854X + 0,00054029X2 - 0,00000342X3 R2 = 0,6948
FIGURA 2 Comprimento da parte aérea de plântulas de
C. arabica cv. Rubi cultivadas em diferentes
concentrações de NH4NO3 combinadas com 950 e 1425
mg L-¹ de KNO3.
Analisando-se o efeito das concentrações de KNO3
e NH4NO3 no gráfico da Figura 2, observa-se que a utilização
de 950 mg L-¹ de KNO3, associada a 280,86 mg L-¹ de
NH4NO3, promoveu o maior desenvolvimento da parte
aérea (1,28 cm, dados transformados). Os resultados
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.2, p. 105-110, 2008
Embriogênese somática direta de Coffea arabica...
concordam, em parte, com os obtidos por Ribeiro (2001),
trabalhando com embriões zigóticos de C. arabica, que
recomenda a adição de 950 mg L-¹ de NH4NO3 e KNO3 no
meio de cultura para comprimento da parte aérea.
Observa-se, ainda que, utilizando-se a concentração
de 1425 mg L-¹ de KNO3 há redução no comprimento da
parte aérea das plântulas até a concentração de 420,91 mg
L-¹ de NH4NO3, havendo, a partir desse ponto, incremento
no desenvolvimento da variável até a concentração de
1491,31 mg L-¹ de KNO3 (1,32 cm, dados transformados).
Esses resultados demonstram que as respostas de
interação entre fontes de nitrogênio variam em função das
concentrações utilizadas.
Na ausência de NH 4 NO 3 , em ambas as
concentrações estudadas, o comprimento da parte aérea
foi inferior (0,9 e 0,97 cm, respectivamente, nas
concentrações de 950 e 1425 mg L-¹ de KNO3) evidenciando,
mais uma vez, a importância desse sal no desenvolvimento
de embriões em C. arabica cv. Rubi.
mg L-¹ de NH4NO3 (Figura 3), observando-se aumento do
peso da matéria fresca a partir deste ponto. Para a
concentração de 950 mg L-¹ de KNO3 ocorreu aumento do
peso da matéria fresca até a concentração de 1002,21 mg L¹ de NH4NO3. Porém, o maior valor foi registrado na
ausência de ambos os sais estudados (9,76 g).
Da mesma forma, Grossi (2000) trabalhando com
bromélia, observou que a menor concentração de
nitrogênio promoveu maior produção de massa fresca.
Kanashiro et al. (2007), observou decréscimo linear na
massa fresca de folhas de bromélia à medida que se
aumentou a concentração de nitrogênio (entre 7,5 e 120
mM), sendo que para cada mM de nitrogênio acrescido ao
meio, houve um decréscimo de 0,0018 g na massa fresca.
Provavelmente, o cultivo em concentrações maiores de
nitrogênio tenderia a diminuir a produção de massa fresca,
como foi observado no presente experimento.
CONCLUSÕES
Com base no crescimento da parte aérea e na
formação do maior número de folhas, a utilização de 950
Peso da matéria fresca
10,5
mg L-¹ de KNO3 combinada com 115,5 a 247,5 mg L-¹ de
NH4NO3 é mais indicada para o desenvolvimento de
embriões somáticos de Coffea arabica L. Os resultados
indicam ainda que a ausência de nitrogênio promove o
maior peso das plântulas.
10
Peso da matéria fresca (g) .
109
9,5
9
8,5
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7,5
7
6,5
6
0
412,5
825
NH4NO3 (mg L-1)
1237,5
1650
Y KNO3 475; Y KNO3 1425; Y KNO3 1900 = ns
Y KNO3 0 = 9,68811 - 0,06491X + 0,00061019X2 R2 = 0,9017
Y KNO3 950 = 8,00708 + 0,02278X 0,00022883X2 R2 =0,9053
FIGURA 3 Peso da matéria fresca de plântulas de C.
arabica cv. Rubi cultivadas em diferentes concentrações
de NH4NO3 combinadas com 0,950 mg L-¹ de KNO3.
Na ausência de KNO3 houve decréscimo do peso
da matéria fresca associado ao incremento das
concentrações de NH4NO3 até a concentração de 917,75
BAYLEY, J. M.; KING, J.; GAMBORG, O. L. The effect of
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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS E COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation
é editada semestralmente pela Editora da Universidade
Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos
científicos e comunicações científicas da área de cultura
de tecidos de plantas, elaborados por membros da
comunidade científica nacional e internacional. Não é
cobrada taxa para publicação de trabalhos, desde que um
dos autores seja sócio e esteja em dia com a ABCTP
(Associação de Cultura de Cultura de Tecidos de Plantas).
É condição fundamental que os artigos/comunicações
submetidos à apreciação da revista Plant Cell Culture &
Micropropagation não foram e nem serão publicados
simultaneamente em outro lugar. Com a aceitação do artigo
para publicação, os editores adquirem amplos e exclusivos
direitos sobre o artigo para todas as línguas e países. A
publicação de artigos/comunicações dependerá da
observância das Normas Editoriais, dos pareceres do Corpo
Editorial e da Comissão ad hoc. Todos os pareceres têm
caráter sigiloso e imparcial, e tanto os autores quanto os
membros do Corpo Editorial e/ou Comissão ad hoc não
obtêm informações identificadoras entre si.
Os conceitos e afirmações contidos nos artigos e
comunicações serão de inteira responsabilidade do(s)
autor(es).
1. SUBMISSÃO:
Cada trabalho deverá ter no máximo 14 páginas e
junto do mesmo deverá ser encaminhado ofício dirigido ao
Editor Chefe da revista, solicitando a publicação do artigo.
Esse ofício deverá conter o pedido de apreciação
na revista ao editor chefe, a declaração de ser um trabalho
original e não ter sido submetido a nenhuma outra revista,
ser assinado por todos os autores, constar o endereço
completo, telefone e e-mail de todos. Qualquer inclusão,
exclusão ou alteração na ordem dos autores, deverá ser
notificada mediante ofício assinado por todos os autores
(inclusive do autor excluído).
Originais: quatro vias impressas e uma via em CDR, com
texto e ilustrações e gráficos. Das 4 vias impressas apenas
1 deve conter os nomes completos dos autores e rodapé
na primeira página.
Processador de texto: Word for Windows (version 98, 2000,
XP ou 2003)
Redigido em português, inglês ou espanhol
Espaçamento do texto: Duplo. Margens: esquerda (3cm),
direita (2cm), inferior e superiores (2,5cm). Cabeçalho e
Rodapé (2,5cm).
Papel: formato A4
Fonte: Times New Roman, tamanho 12
Número de páginas: até 14 páginas, numeradas
consecutivamente, incluindo as ilustrações
Tabelas: devem fazer parte do corpo do artigo e ser
apresentadas no módulo tabela do Word. O título deve
ficar acima.
Gráficos, Figuras e Fotografias: devem ser apresentados
em preto e branco, nítidos e com contraste, escaneados,
inseridos no texto após a citação dos mesmos e também
em um arquivo à parte, salvos em extensão tif ou jpg ,
com resolução de 300 dpi. Os gráficos devem vir também
em excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem
negrito, sem caixa de textos e agrupados, em arquivo à
parte.
Símbolos e Fórmulas Químicas: deverão ser feitos em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker, sem perda de suas formas originais.
2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
2.1. O artigo científico deve ser apresentado na seguinte
seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfulas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação instituição a que o autor
está filiado endereço da instituição CEP cidade, estado
endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista Plant Cell Culture & Micropropagation para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
INTRODUÇÃO
Deve apresentar uma visão concisa do estado atual
do conhecimento sobre o assunto, que o manuscrito
aborda e enfatizar a relevância do estudo, sem constituirse em extensa revisão e, na parte final, os objetivos da
pesquisa. Deve incluir a revisão de literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta seção pode ser dividida em subtítulos,
indicados em negrito.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Podem ser divididas em subseções, com subtítulos
concisos e descritivos, e conter tabelas e figuras.
CONCLUSÕES
Finalizar com os resultados de acordo com os
objetivos do trabalho
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Devem seguir as normas para citação no texto e na
seção própria.
2.2. A comunicação científica deve ser apresentada na
seguinte seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfluas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação instituição a que o autor
está filiado endereço da instituição CEP cidade, estado
endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista Plant Cell Culture & Micropropagation para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
Texto: sem subdivisão, porém com introdução, material e
métodos, resultados e discussão (podendo conter tabelas
e gráficos e conclusão subentendidas.
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção
própria.
3. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS,
ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
3.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão TIFF ou JPEG com resolução de 300 dpi.
3.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão TIFF ou JPEG com resolução de 300 dpi.
As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New
Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e
agrupadas.
3.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos
mesmos, dentro do próprio texto, elaborado
preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman,
tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas
formas originais.
OBS: A formatação correta é parte imprescindível para que
o trabalho seja devidamente protocolado. Caso este não
esteja nas normas, o mesmo será recusado.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências
bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002
da ABNT.
A exatidão das referências constantes da listagem e a
correta citação no texto são de responsabilidade do(s)
autor(es) do artigo.
4.1. Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento
científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não
deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de
publicação (cidade), a ser descrito no lugar adequado para
cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
4.2. Exemplificação (tipos mais comuns):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de
ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas
Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 7480, jan./mar. 2000.
LIVRO:
a) livro no todo:
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and
procedures of statistics. New York: McGraw-Hill Book,
l960. 481 p.
b) Parte de livro com autoria específica:
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos
da automação sobre a organização da produção de trabalho.
In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/
IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em
confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de
corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica
de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha
dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera
controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado
em Ciência dos Alimentos) Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: A folha é composta de duas páginas: anverso e
verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são
impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.
(ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de
madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia
brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6.,
1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/
SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme
normas específicas para cada tipo de documento
(monografia no todo e em parte, trabalho apresentado em
evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.),
acrescidas de informações sobre o endereço eletrônico
apresentado entre braquetes (< >), precedido da expressão
Disponível em: e da data de acesso ao documento,
precedida da expressão Acesso em: .
Nota: Não se recomenda referenciar material eletrônico de
curta duração nas redes (ABNT, NBR6023/2000, p. 4).
Segundo padrões internacionais, a divisão de endereço
eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
a) livro no todo
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//
www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível
em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de
institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de
projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de
institutos de pesquisa tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000.
Disponível em: <http://www.abipti.org.br>. Acesso em:
01 dez. 2000.
d) Tese
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira
de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação (Mestrado
em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua) - Pontifícia
Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997.
Disponível em: <http://www.terra.com.br/virtualbooks/
freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em: 28 nov. 2000.
O INFORMARÁ SOBRE SUA PUBLICAÇÃO. OS
ARTIGOS QUE NECESSITAREM DE MODIFICAÇÕES
SERÃO DEVOLVIDOS AO AUTOR PARA A DEVIDA
REVISÃO.
Artigo de periódico (acesso online):
7. OS ARTIGOS SERÃO PUBLICADOS EM ORDEM
DE APROVAÇÃO.
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um
conceito contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife,
v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em: <http://
www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov.
2000.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTORDATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE,
1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al.,
1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma
obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
5. O EDITOR CHEFE NOTIFICARÁ O AUTOR DO
RECEBIMENTO DO ORIGINAL E, POSTERIORMENTE,
6. OS ARTIGOS NÃO APROVADOS SERÃO
DEVOLVIDOS.
8. O NÃO-CUMPRIMENTO DESSAS NORMAS
IMPLICARÁ NA DEVOLUÇÃO DO ARTIGO AO
AUTOR.
9. OS CASOS OMISSOS SERÃO RESOLVIDOS PELA
COMISSÃO EDITORIAL.
10. O ARTIGO DEVERÁ SER ENVIADO PARA:
ABCTP
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
CEP 37200-000
Lavras MG
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Plant Cell Culture & Micropropagation , a
semestral journal edited by Editora UFLA of the
Universidade Federal de Lavras, publishes scientific
articles and communications in the area of plant tissue
culture, elaborated by researchers of the national and
international scientific community. One of the authors must
be associated and have paid all charges required by the
ABCTP (Plant Tissue Culture Association) in order to be
tax free for publication in Plant Cell Culture &
Micropropagation. Submission of a manuscript implies that
it is neither under consideration for publication elsewhere
nor has appeared previously in part or in whole. On
acceptance for publication, authors assign to the Editors
full copyright of the manuscript in all languages and
countries. Publications will depend on editorial rules and
on the review of experts and ad hoc commission. Reviewer
and editorial opinions will be anonymously communicated
to authors.
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communications are of the entire responsibility of the
authors.
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The manuscript must present a maximum of 14
pages. At the time of submission, a cover letter must be
sent with the manuscript copies to the Editor requesting
publication of the article. This cover letter must be signed
by all authors and also contain the full address,
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inclusion, exclusion or alteration in the authors order must
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Spacing of the text: Double. Margin on the left hand side
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lower margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for the
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Paper: A4 format
Source: Times New Roman, size 12
Number of pages: up to 14 pages, including the illustrations
Tables: Tables should be part of the body of the paper and
they must be presented in Word or Excel. The title should
be above and be presented in the language in which the
article was written and in English. The vertical lines
separating the columns should not appear.
Graphs/Figures/Photographs: must be presented in black
and white, clear and with contrast, scanned, inserted in
the text after citation and also in a separate file (on the
same diskette as the article) saved in extension tif or
jpg , with resolution of 300 dpi. The title should be below
and presented in the language in which the article was
written and in English.
Symbols and Chemical Formula: must be presented using
a word processor that permits a format Page Maker.
2. STRUCTURE AND ORGANIZATION
2.1. The article should be presented in the following
sequence:
TITLE
In English language, containing no more than 15 words in
capital letters and bold.
AUTHORS
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies. :
Footnote: titulation name of the institution to which the
authors belong address of institution ZIP CODE city,
state mail address.
ABSTRACT
should be informative and condensed and should
explain the objectives, material and methods, results and
conclusion of the work in a maximum of 250 words all written
in one paragraph.
For articles written in English the abstract should also be
presented in Portuguese.
Key words: minimum of three and maximum of five. They
should not repeat words that are already in the title. These
may include phrases as well as individual words and should
be separate by commas.
For articles written in English the key-words should also
be presented in Portuguese.
INTRODUCTION
Should present a concise vision of the current level of
knowledge that has been achieved within the subject area
that the paper will discuss. It should neither give an
extensive review nor should it include details about the
results and discussion. It should clearly indicate the
objectives of the research that was carried out.
MATERIALAND METHODS
This section can contain subdivisions, with subtitles in
bold print.
RESULTS AND DISCUSSION
This section can have subsection which begins with
concise, descriptive titles in bold print.
CONCLUSIONS
Finishing agree of objectives of work
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
2.2 The Communication should be presented in the
following sequence
TITLE
Sufficiently clear, conspicuous and complete, without
superfluous words. It is recommended to initiate with the
term that represent the most important aspect, with other
terms in decreasing of importance
TITLE IN PORTUGUESE;
FULL NAME(S) OF THE AUTHOR(S)
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies.
Footnote: titulation name of the institution to which the
authors belong address of institution ZIP CODE city,
state mail address.
ABSTRACT
Written continuously without paragraph. It must
not exceed 250 words. Index terms must be enclosed after
the abstract using terms different from those used in the
title and separated by comma.
Index terms: (3 to 5) must be described in capital and small
letters, and express the content of the article
ABSTRACT AND INDEX TERMS IN PORTUGUESE
Text: with no division but must include introduction,
material and methods, results and discussion and
conclusion (it may include tables and figures)
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
3. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS
OR FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULD
OBEY THE FOLLOWING RULES:
3.1. Photographs must be presented in black and white,
clear and with contrast, inserted in the text after their citation
and also in a separate file (on the same diskette as the
article) saved in extension TIFF or JPEG with
resolution of 300 dpi.
3.2. Figures must be presented in black and white, clear
and with contrast, inserted in the text after their citation and
also in a separate file (on the same diskette as the article)
saved in extension TIFF or JPEG with resolution of
300 dpi. They must be elaborated using Times New Roman
font, size 10, without bold, without text box and arranged.
3.3. Graphs must be inserted in the text after their citation,
elaborated preferentially in Excel, using Times New Roman
font, size 10, without bold.
3.4. Symbols and Chemical Formula must be presented
using a word processor that permits a format for Page Maker
(ex: MathType, Equation) without loss of its original form.
4. REFERENCES: references must be cited according to
NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct
citation in the text are of the entire responsibility of the
author(s).
5. THE BRAZILIAN ASSOCIATION OF PLANT TISSUE
CULTURE (ABCTP) WILL INFORM THE AUTHOR THE
RECEIPT OF THE ORIGINAL MANUSCRIPT AND
EVENTUALLY IT WILLALSO SEND INFORMATION
REGARDING ITS PUBLICATION. MANUSCRIPTS
THAT REQUIRE MODIFICATIONS WILL BE
RETURNED TO THE AUTHOR FOR THE RESPECTIVE
REVISION ANDCORRECTIONS.
6. MANUSCRIPTS NOT APPROVED WON T BE
RETURNED TO THE AUTHOR.
7. ARTICLES WILL BE PUBLISHED ACCORDING TO
THE ORDER OF RECEIPTAND APPROVAL.
8. IFANY OFTHESE RULES ARE NOTATTENDED THE
MANUSCRIPTWILL BE RETURNED TO THE AUTHOR.
9. THE NEGLECTFUL CASES WILL BE SOLVED BY
THE EDITORIAL COMMITTEE.
10. MANUSCRIPTS SHOULD BE SENT TO THE
FOLLOWINGADDRESS:
ABCTP
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
37200-000 Lavras MG BRAZIL