Trabalho

FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO E
SOLUBILIZAÇÃO DE FOSFATO
INORGÂNICO POR BACTÉRIAS ASSOCIADAS
À CANA-DE-AÇÚCAR
Michelangelo de Oliveira Silva1, Fernando José Freire2, Júlia Kuklinsky-Sobral3, Mario de Andrade Lira
Júnior4, Maria das Dores da Silva5, Luana Lira Cadete6 & Andreza Raquel Barbosa de Farias6

Introdução
A exploração e o conhecimento dos mecanismos de
interação bactéria-planta poderão ser utilizados em
sistemas de manejo que busquem uma produção
sustentável de diversas culturas de interesse agrícola,
principalmente a cana-de-açúcar, que exerce grande
importância na economia atual. Neste contexto, há
estudos em que a contribuição da fixação biológica de
nitrogênio (FBN), devido à associação com essas
bactérias na cultura da cana-de-açúcar, pode chegar a
promover até 60% do nitrogênio total acumulado por
esta cultura [1]. A FBN reduz N2 atmosférico em uma
forma que é assimilada através das plantas por
intermédio da associação com determinados grupos
bacterianos. Isto pode significar que em solos com
baixos teores de nitrogênio disponível, a FBN pode ser
suficiente para satisfazer a exigência de N para a
produção da cana-de-açúcar que normalmente são
suplementadas pelo uso de fertilizantes industriais [1,
2].
Além da FBN, outra característica de interesse é a
solubilização de fosfato inorgânico pelas bactérias
associadas às plantas, pois apesar de diversas bactérias
solubilizadoras de fosfato ocorrerem no solo,
frequentemente seu número não é suficiente para
competir com outras bactérias estabelecidas na
rizosfera. Então, a quantidade de P liberada por elas,
geralmente, não é o suficiente para um aumento
substancial de crescimento vegetal. Portanto, o uso de
bactérias solubilizadoras de fosfato como inoculantes é
uma alternativa almejada para o aumento do
desenvolvimento e produção vegetal [3, 4, 5, 6, e 7].
Do ponto de vista biotecnológico, bactérias que
possuam mais de uma característica para a promoção
de crescimento vegetal, como, por exemplo, fixar N2 e
solubilizar fosfato ou produzir auxina e sideróforos,
entre outras, são almejadas e rastreadas para uma
possível aplicação no campo objetivando o aumento da
produção agrícola.
Neste contexto, o presente trabalho teve o objetivo
de selecionar bactérias associadas à cana-de-açúcar
com capacidade de fixar nitrogênio in vitro e de
solubilizar fosfato inorgânico.
Material e métodos
A. Linhagens Bacterianas
Foram analisadas 142 linhagens bacterianas
(endofíticas de folhas e raízes e do rizoplano)
associadas a três variedades (RB 867515, RB 863129,
RB 92579) de cana-de-açúcar cultivadas na Zona da
Mata Norte do Estado de Pernambuco, pertencentes à
coleção de culturas bacterianas do Laboratório de
Genética e Biotecnologia Microbiana (LGBM) da
Unidade Acadêmica de Garanhuns (UAG/UFRPE).
B. Seleção de Bactérias Fixadoras de Nitrogênio
A seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio foi
realizada segundo Dobereiner et al. [8]. Para tanto, as
bactérias foram inoculadas em meio semi-sólido NFb
[5g/l da ácido málico; 0,5g/l de K2HPO4; 0,2g/l de
MgSO4.7H2O; 0,1g/l de NaCl; 0,01g/l de CaCl2.2H2O;
4ml/l de Fe.EDTA (solução 1,64%); 2ml/l de azul de
bromotimol (0,5 %); 2ml/l de solução de
micronutrientes (0,2g/l de Na2MoO4.2H2O; 0,235g/l de
MnSO4.H2O; 0,28g/l de H3BO3; 0,008g/l de
CuSO4.5H2O); 1,75g/l da agar; pH 6,8], incubadas a
28°C por 8 dias. Os experimentos foram realizados em
triplicatas e o resultado positivo foi caracterizado pela
________________
1 Doutorando do PPG em Ciência do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE,
CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
2. Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manuel de Medeiros, Dois Irmãos,
Recife, PE, CEP 52171-900.
3. Professora Adjunta da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista,
Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
4. Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manuel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos,
Recife, PE, CEP 52171-900.
5. Aluna de Graduação em Zootecnia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa
Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
6. Alunos de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n,
Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e FACEPE.
presença de um halo de crescimento no interior do
meio de cultura.
C. Seleção de Bactérias Solubilizadoras de Fosfato
Inorgânico
A seleção de bactérias solubilizadoras de fosfato
inorgânico foi realizada segundo Rodriguez & Fraga
[3] e Verma et al. [5], com algumas modificações. As
bactérias foram inoculadas em meio de cultura sólido
contendo fosfato insolúvel (10g/l de glicose; 5g/l de
NH4Cl; 1g;l de NaCl; 1g/l de MgSO4.7H2O; 4g/l de
CaHPO4; 15g/l de agar; pH 7,2). As placas foram
inoculadas a 28°C por 72h e, em seguida, realizadas as
leituras. Os experimentos foram realizados em
triplicatas e a presença de um halo claro em torno da
colônia indicou a solubilização do fosfato.
Resultados e Discussão
Dos 142 isolados bacterianos, 70 isolados
endofíticos foram avaliados em relação ao potencial
para fixar N2, por meio de cultivo em meio seletivo
NFb. Foi possível observar que 36% dos isolados
foram capazes de crescer em meio NFb, apresentando
portanto, potencial para fixar N2. Além disso, foi
observado que as bactérias endofíticas capazes de fixar
N2, isoladas das variedades RB 867515 e RB 863129
foram, na sua maioria, oriundas das folhas, enquanto
que as bactérias isoladas da variedade RB 92579
foram, em maior parte, oriundas das raízes (Figura 1).
A fixação biológica de N2 tem sido um dos
mecanismos explorados na interação microrganismosplanta em diversos estudos [ 9, 10]. Em cana-de-açúcar
os estudos têm se concentrado em variedades de cana
cultivados na região Sudeste do país e encontrado
importantes grupos bacterianos que desempenham a
Fixação Biológica do Nitrogênio (FBN) [2]. Portanto,
os isolados encontrados neste trabalho, reforçam que
bactérias associadas à cana-de-açúcar representam uma
relação importante para o desenvolvimento da planta
hospedeira.
Contudo, tem-se buscado selecionar bactérias que
apresentem mais de uma característica envolvida com a
promoção de crescimento vegetal [5 e 7]. Portanto, os
142 isolados bacterianos foram avaliados em relação à
solubilização de fosfato inorgânico, apresentando 51
isolados positivos, ou seja, apresentaram o halo de
solubilização, desses 19 isolados também fixam
nitrogênio, correspondendo a 28,5% das fixadoras. Foi
possível observar que houve interação entre os tecidos
vegetais e as variedades de cana das quais as bactérias
foram isoladas (Figura 2). As variedades RB 863129 e
RB 92579 apresentaram uma proporção crescente de
bactérias solubilizadoras de fosfato isoladas das folhas,
raiz e rizoplano. A variedade RB 867515 apresentou
uma proporção maior de bactérias solubilizadoras de
fosfato oriundas das folhas, seguida do rizoplano e raiz.
A capacidade de bactérias em solubilizar fosfato
inorgânico também é um fator envolvido na interação
bactéria-planta, pois esta característica aumenta a
disponibilidade de fosfato viável para o vegetal, sendo
este um possível mecanismo de promoção de
crescimento vegetal em condições de campo. Neste
aspecto, a observação de maior frequência de bactérias
solubilizadoras de fosfato inorgânico na região da folha
e rizoplano sugerem que este grupo de bactérias
poderia ter um papel mais importante durante esta fase
do desenvolvimento da planta hospedeira dependendo
do genótipo da planta. Tendo em vista que bactérias
endofíticas colonizam o interior da planta hospedeira e
o fosfato inorgânico está no solo, é viável especular
que bactérias endofíticas, durante seu processo de
colonização da planta, possam solubilizar e aumentar a
disponibilidade de fosfato à planta hospedeira [6 e 11].
Conclusão
As variedades de cana-de-açúcar cultivadas no
Nordeste apresentam uma comunidade bacteriana
associada com potencial aplicação para a promoção de
crescimento vegetal, pois possuem a capacidade de
fixar nitrogênio e solubilizar fosfato inorgânico,
inclusive com linhagens apresentando ambas
características.
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Figura 1. A) Frequência relativa (%) da fixação de N2 dos isolados bacterianos endofíticos de três variedades de cana-de-açúcar: RB
92579, RB 867515 e RB 863129; B) Frequência relativa (%) da solubilização de fosfato inorgânico dos isolados bacterianos
endofíticos e do rizoplano de três variedades de cana-de-açúcar: RB 92579, RB 867515 e RB 863129.