doenças bacterianas em tilápias do nilo
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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde Departamento de Medicina Veterinária Curso de Medicina Veterinária em Betim Lorena Costa Mourão DOENÇAS BACTERIANAS EM TILÁPIAS DO NILO (Oreochromis niloticus) CULTIVADAS EM SISTEMA INTENSIVO Betim 2013 Lorena Costa Mourão DOENÇAS BACTERIANAS EM TILÁPIAS DO NILO (Oreochromis niloticus) CULTIVADAS EM SISTEMA INTENSIVO Monografia apresentada ao Curso de Medicina Veterinária em Betim da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Medicina Veterinária. Orientador: Marco Túlio Diniz Peixoto Betim 2013 Lorena Costa Mourão DOENÇAS BACTERIANAS EM TILÁPIAS DO NILO (Oreochromis niloticus) CULTIVADAS EM SISTEMA INTENSIVO Monografia apresentada ao Curso de Medicina Veterinária em Betim da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Medicina Veterinária. ____________________________________________ Marco Túlio Diniz Peixoto (Orientador) – PUC Minas ____________________________________________ Isabella Bias Fortes – PUC Minas ____________________________________________ Guilherme Campos Tavares – UFMG Betim, 21 de julho de 2013 AGRADECIMENTOS A todos que contribuíram para a realização deste trabalho, fica expressa aqui a minha gratidão, especialmente: Ao professor Marco Túlio, pela orientação, aprendizado e por tornar possível a realização deste trabalho. Ao Guilherme Tavares pelo auxílio nas dúvidas e ajuda em todos os momentos necessários. A Andréia pela paciência e ajuda na realização desse trabalho. A professora Isabel pela cooperação. Aos meus pais, irmã e amigos pelo carinho, incentivo e pelo apoio constantes. A todos que, de alguma forma, contribuíram para esta construção. RESUMO O Brasil reúne condições extremamente favoráveis para a aquicultura, principalmente devido ao seu grande potencial hídrico. Dentre as espécies de peixes cultivadas no Brasil, a que possui maior produção e importância na aquicultura nacional é a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). O aumento significativo das atividades relacionadas à aquicultura levou a uma maior intensificação do manuseio, altas taxas de estocagem, problemas na qualidade da água e maior estresse aos peixes. Isso favorece a ocorrência de infecções por organismos patogênicos, trazendo como consequência grandes perdas e prejuízos econômicos na produção. Treze peixes provenientes de quatro pisciculturas distintas foram submetidos ao exame de diagnostico bacteriológico de fragmentos do fígado, rins, cérebro, baço, intestino, pele e ovário. Foi identificado Aeromonas sp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. e Clostridium sp. O isolado de Aeromonas sp. apresentou sensibilidades a todos os antibióticos testados, os isolados S. agalactiae apresentaram resistência frente aos antibióticos cloranfenicol, sulfametoxazol + trimetoprim e sulfonamida em uma propriedade e em outra apresentou resistência a oxacilina e sulfametoxazol + trimetoprim. As bactérias isoladas nesse estudo são ambientais, mas de grande importância para a aquicultura nacional, pois podem representar risco para a saúde das tilápias e do próprio consumidor. Palavras chave: Tilápias do Nilo, piscicultura, bacterioses, sanidade. ABSTRACT Brazil has extremely favorable conditions for aquaculture, mainly due to its large hydro potential. Among the fish species cultivated in Brazil, has the highest production and national importance in aquaculture is the tilapia (Oreochromis niloticus). The significant increase in the activities related to aquaculture led to further intensification of handling, high stocking rates, problems in water quality and increased stress on fish. This favors the occurrence of infections by pathogenic organisms, as a result bringing huge losses and economic losses in production. Thirteen fish from four different fish farms underwent diagnostic bacteriological examination fragments of liver, kidney, brain, spleen, bowel, skin, and ovary. Was identified Aeromonas sp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. and Clostridium sp.. The isolate of Aeromonas spp. showed sensitivity to all tested antibiotics, isolates S. agalactiae were resistant against antibiotics chloramphenicol, sulfamethoxazole and trimethoprim sulfonamide in a property and another showed resistance to oxacillin and trimethoprim-sulfamethoxazole. The bacteria isolated in this study are environmental, but of great importance to the national aquaculture, as they may pose a risk to the health of tilapia and consumers themselves. Keywords: Nile tilapia, pisciculture, bacterial diseases, sanity. LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - Produção de pescado (t) nacional da aquicultura (marinha e continental) de 1980 a 2010..................................................................... 14 FIGURA 2- Produção da aquicultura e distribuição das principais espécies por região do Brasil........................................................................................ 14 FIGURA 3 - Distribuição percentual e o volume de produção das principais espécies da piscicultura no Brasil........................................................................... 15 FIGURA 4- Tilapia rendalli......................................................................................... 16 FIGURA 5- Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).................................................. 16 FIGURA 6 - Evolução da produção de tilápia cultivada no Brasil............................... 17 FIGURA 7 - Estruturas básicas que compõem um tanque- 19 rede.................................... FIGURA 8 - Trato digestivo de duas tilápias do mesmo tamanho................................ FIGURA 9 - Mortalidade de tilápias em tanque rede.................................................... 23 FIGURA 10 - Olho da tilápia apresentando a córnea ulcerada e hemorrágica............... 24 FIGURA 11 - Nadadeira peitoral normal e com lesão.................................................... 24 FIGURA 12 - Sintomas nervosos - natação errática e perda de equilíbrio na água........ 27 FIGURA 13 - Escurecimento do corpo – peixe sadio (de cima) x peixe doente (de baixo)........................................................................................................ 27 FIGURA 14 - Tilápia à direita com distensão abdominal (ascite).................................. 28 FIGURA 15 - Exoftalmia causada por estreptocose....................................................... 28 FIGURA 16 - Mancha despigmentada na pele (perda de escama) que pode evoluir para Úlcera............................................................................................... 31 FIGURA 17 - Lesão ulcerativa em tilápia: infecção por Aeromonas.............................. 31 FIGURA 18 - Hemorragias difusas: infecção por Aeromonas........................................ FIGURA 19 - Tilápia apresentando fígado aumentado e vesícula biliar repleta de Bílis........................................................................................................... 31 FIGURA 20 - Tilápia apresentando opacidade da córnea............................................... 33 FIGURA 21 - Tilápia com septicemia provocada por Edwardsiella tarda..................... 33 FIGURA 22 - Manchas descoloridas e localizadas na pele............................................. 37 FIGURA 23 - Podridão das nadadeiras em tilápia causada por Flavobacterium columnare................................................................................................. 37 Tilápia com o rim e baço aumentado e presença de numerosos nódulos brancos em ambos os órgãos.................................................................... 38 FIGURA 24 - 23 31 FIGURA 25 - Corte histológico do baço com granulomas (A) e tecidos normais do baço (B).................................................................................................... 39 FIGURA 26 – Tilápia do Nilo........................................................................................ 54 FIGURA 27 - Necropsia do peixe.................................................................................. 55 FIGURA 28 - Coleta de material para semeadura em meios de cultura......................... 55 FIGURA 29 - Colônias de bactérias em amostras do baço............................................. 57 FIGURA 30 - Resultado do PCR das amostras testadas para S. agalactiae, dos peixes 2 e 3 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG................................................................................................ FIGURA 31 - 58 Resultado do PCR da amostra testada para S. agalactiae, do peixe da piscicultura B, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG............................................................................................................ 61 LISTA DE QUADROS QUADRO 1 - Principais bactérias patogênicas na tilapicultura...................................... 22 QUADRO 2 - Resultado da cultura bacteriológica dos peixes 1, 2 e 3 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG......................... QUADRO 3 - Resultado da cultura bacteriológica do peixe da piscicultura B, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG............................. QUADRO 4 - 60 Resultado cultura bacteriológica do peixe 1 e 2 da piscicultura C, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG............................. QUADRO 5 - 57 62 Resultado cultura bacteriológica dos alevinos, fêmea e reprodutor da piscicultura D, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG.................................................................................................... 63 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Produção de pescados (t) da aquicultura continental por espécie............ TABELA 2 - Resultado do antibiograma do peixe 1 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG................................................... TABELA 3 - 59 Resultado do antibiograma do peixe 3 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG................................................... TABELA 5 - 59 Resultado do antibiograma do peixe 2 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG................................................... TABELA 4 - 15 59 Resultado do antibiograma da amostra de Aeromonas sp. isolada do peixe da piscicultura B, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG.......................................................................................... TABELA 6 - 61 Resultado do antibiograma da amostra de Streptococcus agalactiae isolada do peixe da piscicultura B, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG................................................................................. 62 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BHI Brain heart infusion b.i Banho de imersão DGGE Eletroforese em gel com gradiente desnaturante DNA Ácido desoxirribonucleico DNOCS Departamento Nacional de Obras Contra as Secas FAO Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura FRLP Polimorfismo no comprimento de fragmento de restrição g Grama GIFT Genetically Improved Farmed Tilapia ha Hectare hab Habitante i.p Injeção intraperitoneal Kcal Quilocaloria Kg Quilograma Km Quilômetro m3 Metro cúbico MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento mg Miligramas ml Mililitro MPA Ministério da Pesca e Aquicultura OMS Organização Mundial da Saúde PCR Reação em Cadeia da Polimerase PFGE Eletroforese em campo pulsado pH Potencial hidrogeniônico pv Peso vivo RAPD Amplificação aleatória de DNA polimórfico RNAr Ácido ribonucleico ribossômico t Toneladas TGGE Eletroforese em gel com gradiente de temperatura TSA Tryptic Soy Agar v.o Via oral µm Micrometro SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................................. 12 2 REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................... 2.1 Aquicultura nacional................................................................................................. 2.2 O cultivo de tilápias................................................................................................... 2.2.1 Sistemas de criação.................................................................................................. 2.3 Enfermidades em tilapicultura................................................................................. 2.3.1 Doenças bacterianas................................................................................................ 2.3.1.1 Estreptococoses ................................................................................................... 2.3.1.2 Septicemia móvel causada por Aeromonas........................................................ 2.3.1.3 Edwardsiellose…………………………………………………………….......... 2.3.1.4 Escherichia coli e Klebsiella sp……………………………………………….... 2.3.1.5 Columnariose....................................................................................................... 2.3.1.6 Francisella sp....................................................................................................... 2.3.1.7 Clostridiose........................................................................................................... 2.3.2 Tratamento das principais enfermidades bacterianas em tilápias......................... 2.3.3 Controle das enfermidades bacterianas.................................................................. 2.3.4 Certificação sanitária na aquicultura..................................................................... 13 13 16 18 20 21 25 29 32 33 35 37 39 45 48 52 3 CASUÍSTICA................................................................................................................ 3.1 Material e métodos..................................................................................................... 3.2 Resultados................................................................................................................... 3.2.1 Piscicultura A........................................................................................................... 3.2.2 Piscicultura B........................................................................................................... 3.2.3 Piscicultura C........................................................................................................... 3.2.4 Piscicultura D........................................................................................................... 53 53 56 56 60 62 63 4 DISCUSSÃO.................................................................................................................. 63 5 CONCLUSÃO............................................................................................................... 66 REFERÊNCIAS............................................................................................................... 67 12 1 INTRODUÇÃO Nos últimos anos, a aquicultura vem se firmando como atividade pecuária e é apontada como o segmento responsável pelo aumento da oferta mundial de pescado, sendo este, a primeira fonte de proteína de origem animal no mundo. A elevada taxa de crescimento da aquicultura, e mais especificamente da piscicultura pode ser explicada simultaneamente pela tendência de aumento da demanda por carnes brancas associadas à redução dos estoques mundiais de pescados disponíveis em ambiente natural. Dentre as espécies de peixes cultivadas no Brasil, a que possui maior produção e importância na aquicultura nacional é a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Esta espécie, proveniente da África, foi introduzida em nosso país devido ao seu excelente desempenho em ganho de peso, crescimento, grande adaptação a diferentes tipos de ambientes e sistema de produção, resistência a enfermidades, reproduzirem facilmente, além de ser uma carne de excelente qualidade nutricional e possuir boa aceitação por parte dos consumidores (JÚNIOR; JÚNIO, 2008; TAVARES; PALHARES, 2011). O mais antigo e tradicional sistema de produção de tilápias praticado no Brasil é em viveiros escavados, mas, o sistema de cultivo normalmente utilizado é o intensivo em tanques rede, caracterizado por alta taxa de estocagem de peixes e, consequentemente, arraçoamento intensivo, o que pode resultar em diminuição da qualidade da água e aumentar o estresse entre os animais, tornando-os susceptíveis às enfermidades infecciosas (LONGHI et al, 2012). A intensificação dos cultivos traz como consequência elevação da matéria orgânica, que por sua vez, favorece a multiplicação de microrganismos. Dentre eles, destacam-se as bactérias, por se proliferarem rapidamente em ambiente aquáticos e persistirem em hospedeiros, sem provocar a doença, até que ocorram alterações capazes de causar danos ao sistema imune do animal (MEIRELLES, 2010). Os fatores que influenciam a susceptibilidade das tilápias às doenças são: espécie ou linhagem envolvida, condições de qualidade da agua e carga orgânica nas unidades de produção, estado nutricional dos peixes e condições de temperatura da agua, já que este fator influencia diretamente a resposta imunológica das tilápias. As principias espécies de bactérias patogênicas para tilápias são: Aeromonas sp., Flavobacterium columnare, Edwardsiella tarda e Streptococcus sp. (KUBITZA, 2008). O surgimento de enfermidades nos diferentes sistemas de cultivo de tilápias representa um importante fator de impacto na sanidade afetando, sobretudo no rendimento da produção e na qualidade do produto que chega a mesa do consumidor (MEIRELLES, 2010). 13 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Aquicultura Nacional Formado por 8.400 km de costa marítima e 5.500.000 hectares em reservatórios de águas doces, o Brasil comporta aproximadamente 12 % da água doce disponível no planeta e apresenta um grande potencial para o desenvolvimento da aquicultura (CREPALDI et al, 2006). O Brasil é um dos líderes mundiais na produção e exportação de frango, carne suína e bovina. Mesmo possuindo uma grande superfície de água disponível para a criação de peixes, o pescado nunca ocupou um papel de destaque na produção de proteína animal no país, e isso pode ser justificado devido ao baixo consumo anual de peixes pela população brasileira, que é de 9,75 kg/hab./ano, comparado com o consumo per capita mundial de 18 kg/hab./ano, sendo que o consumo recomendado pela OMS é de 12 kg/hab./ano (PROCHMANN; MICHELS, 2003; FAO, 2010). No entanto, nas últimas quatro décadas, o consumo de peixes no Brasil e no mundo vem aumentando, pois a população vem buscando, cada vez mais, produtos com perfil nutricional adequado e, o pescado ganha destaque por possuir carne muito nutritiva, com baixo teor de gordura, rica em proteínas, aminoácidos, vitaminas e minerais, além de possuir elevados teores de ômega-3, trazendo benefícios à saúde humana (CREPALDI et al, 2006). De acordo com a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO), a produção aquícola brasileira teve início em 1968, quando foram reportadas menos de 0,5 t. Desde então, a aquicultura nacional tem mostrado um crescimento gradual, atingindo o pico de produção em 2003, com 273.268 t (Figura 1). Após uma pequena queda nos anos de 2004 e 2005, a produção retomou o crescimento, registrando os maiores valores em 2008, 2009 e 2010, com 365.367 t, 415.649 t e 479.398 t, respectivamente (MPA, 2010). Nos últimos 10 anos a aquicultura nacional cresceu a uma taxa média de 10% ao ano, contra um crescimento mundial de 6% ao ano no mesmo período (KUBITZA et al, 2012). Figura 1: Produção de pescado (t) nacional da aquicultura (marinha e continental) de 1980 a 2010. 14 Fonte: MPA, 2010. As regiões sul e nordeste são as principais regiões produtoras, respondendo juntas por 61% da produção aquícola nacional (Figura 2). As regiões sudeste e centro-oeste são responsáveis por 30% da produção e a região norte tem a menor participação na produção nacional, com 9% (KUBITZA et al, 2012). Figura 2: Produção da aquicultura e distribuição das principais espécies por região do Brasil Fonte: KUBITZA et al, 2012 15 O perfil da aquicultura brasileira em termos da representatividade das espécies cultivadas, de acordo com os dados do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA) entre o ano de 2008 e 2010, está discriminado na Tabela 1. Tabela 1: Produção de pescados em (t) da aquicultura continental por espécie. Espécie Carpa Tilápia Tambaqui Pacu Pirapitinga Pintado Tambacu Piau Traíra Truta Outros 2008 67.624,2 111.145,3 38.833,0 15.190,0 560,2 1.777,8 15.459,0 5.227,0 190,4 3.662,6 8.122,0 Produção (t) 2009 80.895,5 132.958,3 46.454,1 18.171,0 670,2 2.126,7 18.492,8 6.252,0 227,7 4.381,4 9.715,9 2010 94.579,0 155.450,8 54.313,1 21.245,1 783,6 2.486,5 21.621,4 7.227,6 266,3 5.122,7 11.359,6 Fonte: MPA, 2010 A tilápia, espécie pouco valorizada até meados da década de 90, é hoje a principal espécie cultivada no Brasil com 155.450 toneladas em 2010 (KUBITZA et al, 2012). Os peixes redondos, grupo que reúne o tambaqui, o pacu, a pirapitinga e os diferentes híbridos entre essas espécies, somaram 102.880 toneladas em 2010 (figura 3) (KUBITZA et al, 2012). Figura 3: Distribuição percentual e o volume de produção das principais espécies da piscicultura no Brasil. Fonte: KUBITZA et al, 2012. 16 2.2 O cultivo de tilápias A tilápia é uma das espécies de peixes mais produzidas em todo o mundo, e no Brasil é o peixe mais cultivado (BRISTOT, 2008). Apesar de sua introdução em caráter experimental no Brasil, ainda na metade do século passado, somente em 1971, através do Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), foi implementado um programa oficial de produção de alevinos de tilápia do Nilo, com origem na Costa do Marfim, para povoamento dos reservatórios públicos da região Nordeste (JÚNIOR; JÚNIO, 2008). No entanto, apenas no início da década de 90 a tilapicultura começou a ganhar importância nos estados do Sul e Sudeste do país, particularmente após os produtores adotarem a tecnologia de reversão sexual (masculinização) dos alevinos. Os Estados de São Paulo e Minas Gerais, através de suas companhias hidrelétricas, também produziram neste período significativa quantidade de alevinos para povoamento de seus reservatórios, venda e distribuição a produtores rurais (JÚNIOR; JÚNIO, 2008; KUBITZA, 2011). Existem várias espécies de tilápia, cada uma com características próprias de adaptação e reprodução, o que leva os produtores a estabelecerem preferências de acordo com a região e as condições do ambiente de cultivo. No Brasil introduziu-se inicialmente a Tilapia rendalli (figura 4) em açudes do Nordeste, no qual, devido ao baixo desempenho em termos de crescimento, foi substituída gradativamente pela tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), (figura 5) sendo esta última espécie a mais utilizada nos criatórios do país devido ao seu excelente desempenho em ganho de peso, crescimento e por possuir boa aceitação por parte dos consumidores (JÚNIOR; JÚNIO, 2008). Figura 4: Tilápia rendalli Figura 5: Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) Fonte: OLIVER, 1997. Fonte: KUBITZA et al, 2012. 17 A tilápia do Nilo (O. niloticus) pertencente à família dos ciclídeos, é originária da bacia do rio Nilo, no Leste da África, encontrando-se amplamente disseminada nas regiões tropicais e subtropicais, como em Israel, no Sudeste Asiático (Indonésia, Filipinas e Formosa) e no Continente Americano (USA, México, Panamá e toda a América do Sul). É uma espécie tropical cuja temperatura ideal para seu desenvolvimento varia entre 25 e 30°C, seu crescimento é afetado em temperaturas abaixo de 15°C e não resiste a temperaturas por volta de 9°C (AYROZA, 2009). A tilápia do Nilo destaca-se por sua resistência a doenças, tolerância ao cultivo em altas densidades e em ambientes hostis e estressantes, desovas durante todo o ano, possuem carne saborosa, com baixo teor de gordura (0,9%) e calorias (172 Kcal/100 g de carne), não possuem espinhos em forma de “Y” e apresentam rendimento de filés que variam entre 30 e 40%, o que as tornam bastantes atrativas para a industrialização (TEIXEIRA, 2006; NOGUEIRA; RODRIGUES, 2007). As estatísticas oficiais brasileiras mostram que a tilapicultura cresceu de 12.000 para 155.450 toneladas de 1995 a 2010. Nos últimos 10 anos a produção de tilápia aumentou a uma taxa média de 17% ao ano e representa cerca de 40% da produção da piscicultura brasileira (Figura 6) (KUBITZA, 2011). Figura 6: Evolução da produção de tilápia cultivada no Brasil. Fonte: KUBITZA, 2011 Os principais fatores que contribuíram com o desenvolvimento da tilapicultura no Brasil foram: melhoria na qualidade dos alevinos, através da reversão sexual e do uso de linhagens melhoradas, como a tailandesa e, mais recentemente, a GIFT – (Genetically Improved Farmed Tilapia); a adoção da tecnologia de criação em tanques-rede, que 18 possibilitou uma rápida expansão da criação em diversos estados, aproveitando os reservatórios disponíveis; a resposta rápida da indústria de ração na elaboração de linhas completas para tilápias; o grande mercado interno no país, que rapidamente enxergou a qualidade dos produtos de tilápia ofertados pelos frigoríficos e produtores (KUBITZA, 2011). 2.2.1 Sistemas de criação No Brasil a tilápia é produzida basicamente em tanques de terra (viveiros) e em tanques-rede de pequeno volume. O peso comercial de 600 g a 1 kg é atingido em 6 a 10 meses, a partir de alevinos de 0,5 g (KUBITZA, 2011). A criação em viveiros escavados é o mais antigo e tradicional sistema de produção de tilápias praticado no Brasil. Mesmo demandando maior investimento na implantação das fazendas de produção, traz importantes vantagens competitivas sobre a criação em tanquesrede, como menor incidência de doenças, impondo menor risco ao desenvolvimento da atividade; contribuição do alimento natural no crescimento da biomassa, fixando carbono e aumentando os níveis de ômega-3 nos produtos; conversões alimentares mais eficientes, reduzindo o uso de ração e o custo da alimentação por quilo de tilápia produzida; melhor aproveitamento de alevinos e maior sobrevivência durante a recria e engorda (KUBITZA, 2009). Os desafios da criação de tilápias em tanques escavados são: dificuldade de despesca e problemas com “off-flavor” ou mau sabor nos peixes (estes podem apresentar gosto de terra, particularmente quando há uma proliferação muito intensa de fitoplâncton). Tais desafios podem ser superados com criatividade, equipamentos, instalações adequadas e estratégia de produção (KUBITZA, 2009). A criação de peixes em tanques-rede teve início na década de 1980. É uma forma intensiva de criação, que utiliza o meio ambiente com alta produtividade de forma sustentável, com elevadas taxas de estocagem, em que os organismos são mantidos num volume limitado, possibilitando a livre e constante circulação de água (Figura 7). Esse sistema é hoje, um dos mais utilizados e, também, o mais produtivo por unidade de cultivo (MORI, 2012). Figura 7: Estruturas básicas que compõem um tanque-rede: 19 Fonte: CODEVASF, 2010 Dentre as vantagens do sistema de tanques-rede, pode-se destacar menor custo de implantação em comparação aos sistemas de cultivo intensivo em viveiros escavados e Raceway; maior facilidade e rapidez na montagem da infraestrutura de produção; maior facilidade e rapidez para expansão da capacidade de produção; maior facilidade de controle e monitoramento do processo de cultivo; maior facilidade e controle no processo de despesca; maior proteção contra predadores naturais e o aproveitamento de ambientes de grandes lagos e barragens, dispensando desmatamento de áreas e movimentações de terras, evitando processos de erosão e assoreamento de rios e lagos, podendo ser implantado em diferentes escalas de produção atendendo desta forma a pequenos, médios e grandes produtores (TEIXEIRA, 2006; CODEVASF, 2010; MORI, 2012). Como desvantagens observam-se a necessidade de fluxo constante de água através das redes; dependência total do sistema ao arraçoamento; risco de encrustamento e rompimento da tela da gaiola com perda da produção; possibilidade de introdução de doenças e/ou peixes no ambiente prejudicando a população natural e acúmulo de fezes e metabólitos embaixo dos tanques-rede promovendo impacto ambiental (TEIXEIRA, 2006; CODEVASF, 2010). A produtividade em tanques de terra varia de 8 a 10 toneladas/ha/ciclo (sob condições de baixa renovação de água) a até, 60 a 80 toneladas/ha/ciclo (em tanques com até 20 a 30% de renovação de água). O custo de produção em viveiros varia entre R$ 1,70 a 2,40/kg (KUBITZA, 2009; 2011). Em tanques-rede de pequeno volume a produtividade varia entre 80 e 250 kg/m3 por ciclo. Devido à ausência de alimento natural, ao maior custo da ração e mortalidade durante o 20 cultivo, o custo de produção em tanques-rede é mais elevado (R$ 2,70 a 3,40/kg) do que em viveiros. Até o momento os tanques-rede de pequeno volume têm sido mais usados, aproveitando áreas mais abrigadas dos reservatórios. No entanto, com o aumento no volume de produção dos empreendimentos haverá uma tendência de aumento no tamanho/volume dos tanques-rede e a expansão dos projetos para áreas mais expostas dos reservatórios (KUBITZA, 2009; 2011) 2.3 Enfermidades em tilapicultura As tilápias sempre foram reconhecidas por sua grande rusticidade, capacidade de tolerar o manuseio e condições adversas de qualidade de água. Dificilmente eram registradas doenças ou deficiências nutricionais nos cultivos, que em sua maioria eram conduzidos em tanques escavados com a presença de plâncton. No entanto, nas últimas décadas os cultivos de tilápia se intensificaram impulsionados tanto pela consolidação da tilápia como um peixe de aceitação global e pelo desenvolvimento de sólidos mercados locais (KUBITZA, 2005). O aumento na pressão de produção, a maior dependência do uso de alimentos formulados, a intensificação do manuseio e a maior ocorrência de problemas de qualidade de água nestes cultivos intensivos, trouxe como consequência a elevação da matéria orgânica, que por sua vez, favorece a multiplicação de microrganismos (KUBITZA, 2005; MEIRELLES, 2010). As tilápias, apesar de sua natureza resistente, começaram a apresentar problemas nutricionais e mortalidade atribuída a organismos patogênicos. Desta forma, nos sistemas de produção intensiva de peixes, a sanidade passou a ser um dos aspectos mais relevantes para a criação comercial de qualquer espécie (ZAGO, 2012). No tanque de piscicultura deve haver equilíbrio entre a saúde do hospedeiro, a proliferação de agentes patógenos e as condições do ambiente aquático (ZANOLO; YAMAMURA, 2006). Se houver algum desequilíbrio ou estresse, como a deterioração da qualidade da água, a redução de oxigênio dissolvido, elevação do dióxido de carbono, alterações bruscas de temperatura, alta densidade de peixes, manejo inadequado, nutrição desequilibrada e infestação por parasitos, a ocorrência de doenças bacterianas, fúngicas e virais são favorecidas (ZANOLO; YAMAMURA, 2006; BARAÚNA, 2008; KUBITZA et al, 2013). Pelo fato de serem encontradas na superfície ou no intestino dos animais, possuírem fácil disseminação e por apresentarem caráter oportunista, as bactérias são importantes 21 patógenos na piscicultura intensiva, uma vez que podem ocasionar impacto econômico considerável devido às doenças que provocam nos peixes (BARAÚNA, 2008; ZAGO, 2012). Especial atenção também deve ser dada as doenças parasitárias, que consistem em uma das maiores causas de perdas na piscicultura industrial e esportiva e servem como “porta de entrada” para agentes bacterianos e fúngicos, comprometendo o desempenho zootécnico e a reprodução dos peixes, além de disseminar agentes patogênicos para o ambiente, que geram prejuízos ao produtor e riscos à saúde pública (MORI, 2012; ZAGO, 2012) Os danos causados ao hospedeiro por doenças parasitárias dependem de vários fatores, como: o grupo do parasita em questão, a sua localização e o modo particular como atuam sobre o hospedeiro. Dentro deste contexto, as lesões branquiais são particularmente importantes, uma vez que esse órgão reage fortemente à presença de parasitas, provocando uma acentuada proliferação celular e implicando na diminuição ou perda da respectiva atividade respiratória que, nos casos mais graves, pode provocar a morte do hospedeiro por asfixia (ZANOLO, 2006; KUBITZA, 2008). Diversas espécies de peixes são acometidas por doenças virais, alguma delas de notificação obrigatória em diversos países. Com a tilápia isso ainda não ocorreu. Geralmente há uma carência de profissionais treinados ou de laboratórios equipados para a identificação de viroses em peixes em diversos países tropicais onde se cultiva a tilápia (KUBITZA, 2008). Isso faz com que episódios de mortandade que possam ter sido primariamente desencadeados por infecções virais passem sem diagnóstico, ou seja, atribuídos exclusivamente a outros agentes infecciosos (bactérias, por exemplo) isolados dos peixes doentes (KUBITZA, 2005; 2008). 2.3.1 Doenças bacterianas A água é um ambiente extremamente favorável para a proliferação de determinados patógenos, com rapidez e eficiência. Em condições normais de criação, as bactérias encontram-se na água sem causar qualquer dano à saúde do peixe. Porém, fatores ambientais, nutricionais, genéticos e sanitários interferem no ambiente de cultivo, tornando as tilápias mais susceptíveis a doenças, e fazendo com que estas mesmas bactérias, que coexistiam sem causar qualquer dano, provocassem um impacto direto na saúde do peixe, passando a agir como agente oportunista (TAVARES; PALHARES, 2011; ROBERTS, 2012). Os fatores que favorecem a ocorrência de doenças bacterianas em peixes são: deterioração da qualidade da água; excessivo acúmulo de matéria orgânica; nutrição 22 deficiente; excessiva alimentação dos peixes; temperatura da água muito elevada; estresse físico e fisiológico no manuseio e transporte; excessiva estocagem nos tanques de cultivo e infestações por parasitos, potenciais vetores de doença (KUBTIZA, 2008; MEIRELLES, 2010). Diversas bacterioses em tilápia que, há alguns anos eram de pouca expressão ou sequer haviam sido diagnosticadas no Brasil, hoje, impõem consideráveis prejuízos econômicos ao setor (Quadro 1). A globalização da tilapicultura, com transferência de póslarvas, alevinos e matrizes entre diversos países, tem favorecido a rápida disseminação de agentes patogênicos juntos aos principais centros de cultivo. O estudo das doenças bacterianas de peixes torna-se difícil com a atual falta de compreensão adequada das interações que ocorrem entre as bactérias, seus hospedeiros e do ecossistema aquático em geral (KUBITZA, 2008). Quadro 1: Principais bactérias patogênicas na tilapicultura Bactéria Nome da doença Flavobacterium Columnariose; columnare podridão Aeromonas espécies (diversas isoladas Sinais clínicos típicos da doença ou Podridão da nadadeira caudal e das brânquias; lesões das esbranquiçadas ou com aspecto de tufo de algodão sobre o nadadeiras; ou boca de corpo e boca (semelhante a infecção por fungos); lesões algodão; ou podridão profundas na cabeça com exposição da musculatura e de brânquias. ossos. Septicemia móvel. Lesões ulcerativas sobre o corpo; hemorragia na base das nadadeiras e aspecto de ulcera sobre o corpo; abdômen em distendido; escamas eriçadas, olhos hemorrágicos. tilápias) Streptococcus iniae Estreptococose (doença Peixes com natação espiralada; corpo escurecido e de S. agalactiae da natação espiralada) aspecto curvado em forma de “s”; olhos opacos e às vezes saltados. S. dysgalactiae Edwardsiella tarda Edwardsiellose Lesões com exposição da musculatura; abcessos na musculatura com presença de gás e mau odor. Francisella sp. Granuloma visceral das Órgãos internos (baço, rim e coração) e brânquias tilápias apresentando numerosos nódulos brancos (granulomas). Fonte: KUBITZA, 2008 Os principais sinais clínicos de bacterioses nos peixes são: perda de apetite (Figura 8) e letargia; ocorrência de mortalidade crônica (todos os dias aparecem peixes mortos nos tanques) (Figura 9); natação errática e com movimentos espiralados; hemorragia nas nadadeiras e no corpo; hemorragias nos olhos (figura 10) e no ânus; podridão (necrose) das nadadeiras (figura 11); lesões na pele (manchas brancas, lesões com aspecto inflamado ou 23 ainda lesões na forma de úlceras ou furúnculos); abdômen distendido (ascite) geralmente devido ao acúmulo de fluido na cavidade abdominal; escamas eriçadas, em função da excessiva distensão do abdômen; hemorragia nas vísceras e órgãos internos; baço aumentado e de coloração escura; nódulos brancos no baço, fígado e rins; intestino com fluido sanguinolento (KUBITZA, 2000; 2008; SILVA, 2010). Figura 8: Trato digestivo de duas tilápias do mesmo tamanho *Legenda: Lado esquerdo – trato digestivo de um peixe doente que deixou de se alimentar. Apresenta estômago e intestino vazios e a vesícula biliar repleta com bile de cor verde escuro. Lado direito – peixe sadio com estomago e intestino repleto e vesícula não muito cheia com bile de cor verde claro. Fonte: KUBITZA, 2000 Figura 9: Mortalidade de tilápias em tanque rede Fonte: KUBITZA, 2000 Figura 10: Olho da tilápia apresentando a córnea ulcerada e hemorrágica 24 Fonte: KUBITZA, 2000 Figura 11: Nadadeira peitoral normal e com lesão . *Legenda: Em cima - peixe apresentando podridão e hemorragia da nadadeira peitoral. Em baixo: Peixe sadio – aspecto normal da nadadeira Fonte: KUBITZA, 2000 O diagnóstico das bacterioses é realizado através da associação dos sinais clínicos, isolamento das bactérias, técnicas bioquímicas e moleculares (por exemplo, o PCR). O diagnóstico definitivo das bacterioses é dado através da cultura bacteriana a partir de lesões da pele e/ou órgãos internos, uma vez que os sinais clínicos são raramente patognomônicos. As amostras devem ser submetidas a um laboratório que esteja familiarizado com a cultura de espécies bacterianas aquáticas, já que muitos desses patógenos têm necessidades especiais. Estas devem ser incubadas na temperatura ambiente (25 – 28 0C) e não a 37 0C como é feito habitualmente nos laboratórios comerciais de microbiologia, pois alguns patógenos podem não crescer ou crescem pouco a 37 0C (NOGA, 2010). As lesões cutâneas são particularmente um desafio no diagnóstico, pois podem apresentar vários patógenos e frequentemente torna-se difícil determinar o agente que desencadeou a enfermidade, isto é, o principal patógeno. Na cultura de órgãos internos várias espécies bacterianas também podem estar presentes. O rim é o melhor tecido para isolamento de rotina de patógenos sistêmicos, no entanto, outros tecidos podem ser preferíveis para certos 25 patógenos ou para identificar portadores assintomáticos. As infecções múltiplas são comuns, e determinar todos os agentes patogénicos envolvidos é importante (NOGA, 2010). Técnicas de biologia molecular na piscicultura vêm se desenvolvendo amplamente, tornando-se possível o estudo mais detalhado de genes, para pesquisas de diversas finalidades, como a melhoria de aspectos produtivos, sanitários e ambientais, seja de peixes cultivados ou nativos (FIGUEIREDO et al, 2010). Como a maioria das bactérias estão amplamente disseminadas em ambientes aquáticos ou possuem variantes incapazes de causar doença, ao realizar o diagnóstico, este deve ser capaz de distinguir se a bactéria identificada é realmente um patógeno ou se faz parte da microbiota normal dos peixes. Dessa forma, os fatores de virulência (capacidade de um microrganismo causar uma enfermidade) devem ser analisados, para poder diferenciar bactérias patogênicas das não patogênicas. O diagnóstico correto tem forte impacto nos procedimentos a serem adotados tanto na prevenção de surtos (como a recomendação do uso de vacinas), quanto para o controle desses surtos (como o uso de antibióticos) (FIGUEIREDO et al, 2010). 2.3.1.1 Estreptococose A estreptococose em peixes é uma doença comum em várias partes do mundo podendo infectar diversas espécies de peixes de água doce e marinhos. O primeiro relato de estreptococos causando doença em peixes foi no Japão, no ano de 1958. As principais espécies dessa bactéria que causam infecção em peixes são o Streptococcus iniae, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. ictaluri. No Brasil os isolamentos até agora obtidos são de S. agalactiae, S. iniae e S. dysgalactiae (FIGUEIREDO et al, 2007b; TAVARES; PALHARES, 2011). As bactérias do gênero Streptococcus são cocos Gram-positivos, com aproximadamente um (1) µm de diâmetro, formam cadeias, são catalase-negativas, anaeróbias facultativas e imóveis. Crescem muito bem em meios de cultura ágar sangue e ágar BHI (brain heart infusion) (QUINN et al., 2005; ROBERTS, 2012). Streptococcus agalactiae (Grupo B Lancefield, GBS), é um importante patógeno emergente que tem sido ligado à morbidade e mortalidade nas pisciculturas de todo o mundo. É frequentemente associado com meningoencefalite em peixes, mastite em vacas e meningite neonatal em humanos (FIGUEIREDO; LEAL, 2008d; PEREIRA et al, 2010). 26 O primeiro relato de infecção por Streptococcus iniae, foi descrita em uma espécie de golfinho de água doce, o Inia geoffrensis. Atualmente essa bactéria é um dos patógenos de maior relevância para a produção de peixes na América do Norte (Canadá, Caribe e EUA), Ásia-pacífico (Austrália, China, Japão, Singapura e Taiwan) e Oriente Médio (Bahrein e Israel). No Brasil, o primeiro relato da doença foi em 2008, em uma tilapicultura do Paraná, onde os animais eram cultivados em tanques rede e submetidos a altas densidades de estocagem (FIGUEIREDO et al, 2009b; 2012). Streptococcus dysgalactiae é caracterizado como responsável por casos de faringite (“dor de garganta”) em seres humanos e mamite em bovinos. Nos anos 90, essa bactéria foi responsável por causar surtos de mortalidades em fazendas de peixes marinhos, principalmente do gênero Seriola, e não tinha ocorrência aparente em peixes de água doce. No ano de 2007, foi realizado o primeiro relato de surto dessa bactéria em uma fazenda de tilápias localizada no Nordeste do Brasil, estado do Ceará (NETTO et al, 2011). A transmissão da estreptococose ocorre de forma horizontal por contato direto entre peixes infectados com peixes sadios, e por contato indireto, pela bactéria presente na água, permitindo que a doença se manifeste gradativamente em diferentes tanques-rede de uma mesma propriedade e/ou por meio de fômites, que pode ser qualquer objeto inanimado ou substância capaz de absorver, reter e transportar organismos infecciosos de um local para outro, como baldes, puçás, classificadores, etc. (SALVADOR 2008; MIAN et al, 2009). Esta doença apresenta mortalidade elevada, principalmente em peixes cultivados em tanques-rede, quando há manejo inadequado, ocasionando estresse físico e fisiológico, deterioração da qualidade da água, nutrição deficiente, infestação por parasitas e excessivas estocagens. A temperatura elevada da água de cultivo durante o verão pode ser também um fator que aumenta a frequência da doença (FIGUEIREDO et al., 2007c; KUBITZA, 2008). Em condições naturais a doença pode ser observada em peixes com peso variando entre 50 gramas até matrizes com peso acima de um (1) quilo, mas predomina na fase de engorda, sendo os peixes entre 400 e 600 gramas, os mais acometidos (FIGUEIREDO et al, 2007b). Os alevinos e juvenis parecem não manifestar a doença, mas isso não descarta a possibilidade dos peixes jovens serem portadores assintomáticos e a principal fonte de infecção para as fases de crescimento e engorda (FIGUEIREDO et al, 2007b; PÁDUA et al, 2012). Os peixes infectados por estreptococos desenvolvem uma doença septicêmica, ou seja, a bactéria passa a se multiplicar na corrente sanguínea do peixe e em diversos órgãos, como fígado, baço e rim, contudo, o cérebro parece ser o principal alvo da bactéria. Além da 27 septicemia temos uma encefalite instalada e como consequência os peixes podem apresentar natação alterada, com rodopios e perda de equilíbrio na água (Figura 12) (FIGUEIREDO et al, 2007b; MIAN et al, 2009). Outros sinais clínicos perceptíveis são: lesões de pele e músculo semelhantes à abcessos, pontos avermelhados na superfície corporal, principalmente ao redor da boca, opérculo e nadadeiras, anorexia, escurecimento do corpo (Figura 13), distensão abdominal (Figura 14), olhos opacos ou de coloração esbranquiçadas e exoftalmia unilateral ou bilateral (figura 15) (KUBITZA, 2000; LEMOS et al, 2006; PRETTO-GIORDANO et al, 2010) Figura 12: Sintomas nervosos - natação errática e perda de equilíbrio na água. . Figura 13: Escurecimento do corpo – peixe sadio (de cima) x peixe doente (2 de baixo) . Fonte: KUBITZA, 2005 Figura 14: Tilápia à direita com distensão abdominal (ascite). . Fonte: KUBITZA, 2000. Figura 15: Exoftalmia causada por estreptococose . 28 Fonte: KUBITZA, 2005 Fonte: TAVARES, 2011 Internamente podem ser observado acúmulo de líquido hemorrágico na cavidade abdominal, esplenomegalia, fluido intestinal sanguinolento e fígado pálido. No crânio verifica--se congestão difusa cerebral com líquido cefalorraquidiano hemorrágico. Histologicamente ocorre severa inflamação granulomatosa, panoftalmite (inflamação generalizada do olho), meningoencefalite, necrose e vacuolização de hepatócitos e congestão e necrose esplênica (FIGUEIREDO et al, 2006; SALVADOR, 2008; PRETTO-GIORDANO et al, 2010) Nos casos de infecção por Streptococcus dysgalactiae os peixes podem apresentar, além dos sinais clássicos de infecção por estreptococos, um aumento de volume na região caudal (Abcesso). Essa formação de abcesso pode estar relacionada a processo de infecção crônica, onde os peixes infectados não morrem e desenvolvem as lesões somente com o passar do tempo, pois em infecções experimentais com S. dysgalactiae, os peixes infectados adoeceram e a mortalidade foi elevada, contudo, diferentemente do observado no campo, os peixes não apresentaram abcessos na região caudal (NETTO et al, 2011). O diagnóstico da estreptococose é realizado através da associação dos sinais clínicos e achado laboratorial. São coletados fragmentos de rim e cérebro de peixes doentes para isolamento da bactéria em meios de cultivo seletivos como o ágar sangue, BHI e TSA. Após o isolamento de colônias de bactérias, essas serão identificadas por meio de provas bioquímicas padronizadas (kits API 20 STREP), pela determinação do chamado “grupo de Lancefield” (que é um método sorológico de classificação com base na substância C grupo-específica polissacarídeo da parede celular) e por técnicas de biologia molecular (PCR) (QUINN et al, 2005; FIGUEIREDO et al, 2007b). Para diagnostico do S. iniae, é realizado PCR específico, já que, as colônias suspeitas não podem ser identificadas com o uso de testes bioquímicos como o kit API 20 STREP (FIGUEIREDO et al, 2009b). Como em condições de campo a coleta de amostras torna-se difícil devido à contaminação com bactérias ambientais, pode ser enviado para o laboratório o peixe inteiro vivo ou resfriado em caixa térmica com gelo (MIAN et al, 2009). 29 Os problemas com estreptococos podem ser minimizados assegurando boas práticas de manejo como: adequada qualidade da água, correta nutrição, evitar manipulação excessiva nas operações rotineiras e nas transferências dos mesmos, remoção imediata de peixes moribundos e mortos, evitar excesso de estocagem e acúmulo excessivo de matéria orgânica nos tanques (LEMOS et al, 2006). 2.3.1.2 Septicemia móvel causado por Aeromonas Septicemia por Aeromonas móveis é a denominação conferida à doença causada por bactérias desse gênero em peixes. As infecções por essas bactérias são de ocorrência mundial e provavelmente é a doença bacteriana mais comum em peixes de água doce. Atualmente 17 espécies bacterianas são classificadas como membro do gênero Aeromonas. Dentre elas, as principais espécies patogênicas para peixes são a Aeromonas hydrophila, A. caviae e A. sobria. (FIGUEIREDO et al, 2008a). Aeromonas são bactérias gram-negativas, bastonete curto, anaeróbica facultativa, móvel por flagelo polar, catalase positivo, oxidase positivos, reduz nitrato em nitrito, mesofílica, podem ou não produzir gás e é adaptada ao crescimento em temperaturas que variam de 5 0C a 37 0C, com crescimento ideal na temperatura de 28 0C (QUINN et al., 2005). São encontradas em diversos habitats, tanto em ambiente aquático e terrestres, e fazem parte da flora intestinal normal dos peixes (ROBERTS, 2012). A transmissão do agente se dá de modo horizontal, estando o mesmo presente na água ou no sedimento, sendo transmitidos por descarga do trato intestinal dos peixes ou lesões na pele. São considerados patógenos facultativos, ou oportunistas, que só irão causar a doença quando os peixes forem submetidos a fatores estressantes (PAVANELLI et al, 2002; COSTA, 2003; TAVARES; PALHARES, 2011). A septicemia por Aeromonas em tilápias ocorrem com maior frequência em períodos de temperaturas baixas ou amenas, quando a resposta imunológica dos peixes é mais reduzida. Porém o aumento da temperatura acima de 30 0C, pode também predispor a ocorrência de surtos. Nestas condições a mortalidade e os prejuízos podem ser consideráveis (KUBITZA, 2000; FIGUEIREDO et al, 2008a). Algumas espécies de Aeromonas têm sido associadas a doenças em seres humanos, sendo classificadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como patógenos de interesse emergente à saúde pública, veiculados pela água, por alimentos contaminados (leite e derivados, carcaças de frangos, vegetais e pescado) ou por via cutânea (manipuladores de 30 alimentos, trabalhadores de piscicultura, aquaristas, etc.) (HIRSCH et al, 2006). As infecções em seres humanos são caracterizadas por quadros de gastroenterite, septicemia, síndrome urêmica hemolítica, peritonite, infecção respiratória, feridas e pústulas cutâneas (FIGUEIREDO et al, 2008a). Nos peixes a enfermidade ocasionada por esses agentes provoca quadros septicêmicos, agudos e crônicos. Pode ainda apresentar na forma de doença ulcerativa, caracterizada pelo aparecimento de lesões cutâneas (úlceras) localizadas. Os principais órgãos acometidos são rins, fígado, baço, pâncreas, brânquias, musculatura esquelética e cérebro (COSTA, 2003; FIGUEIREDO et al, 2008a). Os sinais mais comuns da doença são: falta de apetite (anorexia), letargia (natação vagarosa) com peixes se posicionando nas áreas mais rasas dos tanques, escurecimento corporal, perda de equilíbrio, palidez de brânquias e mucosas (indicativo de anemia), perda de escamas, erosão ou destruição das nadadeiras, lesões sobre o corpo evoluindo para ulcerações (Figuras 16 e 17), hemorragia difusa, observadas também na base das nadadeiras peitorais, pélvica e caudal (Figura 18), exoftalmia, olhos opacos e hemorrágicos, ascite com líquido abdominal opaco a sanguinolento, conteúdo intestinal amarelado a sanguinolento, hemorragia petequial visceral, hepatomegalia (figura 19), esplenomegalia, rins hiperplásicos e friáveis e pontos hemorrágicos na parede interna da cavidade abdominal (KUBTIZA, 2000; PAVANELLI et al, 2002; FIGUEIREDO et al, 2008a; ROBERTS, 2012). Figura 16: Mancha despigmentada na pele (perda de escama) que pode evoluir para úlcera Figura 17: Lesão ulcerativa em tilápia: infecção por Aeromonas 31 Fonte: KUBITZA, 2005 Figura 18: Hemorragias difusas: infecção por Aeromonas Fonte: KUBITZA, 2000 Fonte: KUBITZA, 2005 Figura 19: Tilápia apresentando fígado aumentado e vesícula biliar repleta de bílis Fonte: KUBITZA, 2000 Como a sintomatologia nervosa e a septicemia podem ser confundidas com os sintomas ocasionados pelas estreptococoses e realmente são semelhantes, torna-se necessário o diagnostico laboratorial, pois só ele conseguirá determinar qual o agente causador da doença (FIGUEIREDO et al, 2008a). Sendo assim, para diagnóstico laboratorial é realizado o isolamento da bactéria através de amostras de órgãos ou sangue, em meios de cultura específicos (Rimler-Shotts, águar sangue e TSA) e técnicas bioquímicas. Para a detecção do fator de virulência e confirmação de que o isolado seja realmente de A. hydrophila, é necessário o uso de técnicas moleculares (PCR), pois a identificação bioquímica não é suficiente para essa confirmação. Devem ser coletados peixes com sintomatologia clinica da 32 doença e enviados vivos ou refrigerada ao laboratório imediatamente (KUBTIZA, 2000, FIGUEIREDO et al, 2008a). O controle da infecção causada por Aeromonas esta ligado ao controle de fatores que facilitam a invasão dos hospedeiros. 2.3.1.3 Edwardsiellose Edwardsiella tarda é uma bactéria Gram-negativa, membro da família Enterobacteriaceae, anaeróbica facultativa, móveis com flagelo periféricos, catalase positivo, fermentadora de glicose, reduzem nitrato a nitrito e oxidase negativo (QUINN et al, 2005; BARAÚNA, 2008; ROBERTS, 2012). Edwardsiella tarda é frequentemente isolada do trato digestório de carpas, bagres, tilápias e outros peixes de criação, em fezes humanas e também em cobras, rãs, tartarugas e aves. Além disso, ocorre na água e no sedimento dos tanques de criação. Ela se manifesta especialmente no verão, quando a temperatura da água esta em média 30 0C, há grande quantidade de matéria orgânica na água e os hospedeiros estão em situação de estresse (ALBINATI et al, 2006). Essa bactéria tem caráter zoonótico, pois pode ser transmitida ao homem pela ingestão da carne de peixes contaminados, causando meningite, abscessos hepáticos, infecções de feridas pelo manuseio de material contaminado e mais comumente gastroenterites (ALEXANDRINO et al, 1999; BARAÚNA, 2008; LIMA et al, 2008). O mecanismo de transmissão dessa bactéria durante surtos não está completamente esclarecido, no entanto, a infecção é conhecida por permanecer latente nos tecidos de peixes (NOGA, 2010). Em cultivo intensivo a transmissão é facilitada, devido ao maior aporte de fezes e acúmulo de matéria orgânica nos tanques, bem como pelas altas densidades de estocagem, que facilitam o contato entre os peixes (ALEXANDRINO et al, 1999; ALBINATI et al., 2006; BARAÚNA, 2008). Os sinais clínicos manifestados em casos de edwardsiellose são pequenas lesões na cabeça, musculatura e cauda, que podem originar abcessos de maiores dimensões nos músculos laterais e na cauda, despigmentação cutânea, nódulos nas brânquias, necrose de linha lateral, opacidade de córnea (Figura 20) e lesões hemorrágicas cutâneas que podem evoluir para abcessos com tecido necrótico e odor desagradável (Figura 21). As lesões cutâneas também podem se estender à musculatura interna, causando peritonite fibrinosa de evolução rápida e necrose do tecido hepático e renal. Podem ser encontrados bolhas gasosas 33 de odor fétido na musculatura e no rim e um exsudato fibrinoso que cobre o fígado, tornandoo friável (ALBINATI et al, 2006; BARAÚNA, 2008; ROBERTS, 2012). Figura 20: Tilápia apresentando opacidade da córnea Fonte: KUBITZA, 2008 Figura 21: Tilápia com septicemia provocada por Edwardsiella tarda Fonte: KUBITZA, 2000 Em casos septicêmicos, observa-se ascite, distensão da cavidade visceral, exoftalmia, prolapso anal e nódulos brancos no fígado, rins e baço. Apresenta mortalidade entre 5% e 30% e morbidade entre 5 e 70% (MURATORI et al, 2001; BARAÚNA, 2008). O diagnóstico é feito através da sintomatologia e a confirmação é obtida através do isolamento bacteriano pela semeadura em placas de ágar sangue, ágar MacConkey ou caldo triptose, incubados a 28 0C por 24-48 horas (PAVANELLI et al, 2002; ALBINATI et al, 2006; LIMA et al, 2008). O melhor método profilático consiste em evitar o estresse dos peixes de cultivo, mantendo-os em baixas densidades populacionais e evitar um grande acúmulo de matéria orgânica na água (PAVANELLI et al, 2002; BARAÚNA, 2008). 2.3.1.4 Escherichia coli e Klebsiella sp. Escherichia coli é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae. São geralmente móveis, com flagelos peritríquios, fermentadores de lactose, oxidase negativo, catalase positivo, anaeróbios facultativos, crescem em meios não enriquecidos e produzem colônias de cor rosa em ágar MacConkey. Essas bactérias tem distribuição mundial e habitam o trato intestinal de animais e de humanos e contaminam a vegetação, o solo e a água (QUINN et al., 2005). 34 Em geral as estirpes de E. coli que colonizam o trato gastrointestinal são comensais inofensivas ou desempenham um papel importante na manutenção da fisiologia intestinal (HUSS, 1997). Muitas linhagens de E. coli são de baixa virulência, mas podem causar infecções oportunistas em localização extra intestinal, como glândula mamária e trato urinário. Linhagens patogênicas da E. coli possuem fatores de virulência que permitem a colonização das superfícies mucosas e a subsequente produção de doença (QUINN et al., 2005). E. coli causadoras de gastrenterites podem ser divididas de acordo com os sintomas clínicos e mecanismos da patogenicidade nos seguintes grupos: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli verotoxigênica (VTEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EaggEC) e E. coli enteroinvasiva (EIEC) (QUINN et al., 2005; VALLANDRO, 2010). Infecções por E. coli em animais jovens (como bezerros, leitões, cães) podem estar limitadas aos intestinos (colibacilose entérica, diarréia neonatal), ou podem manifestar-se como septicemia (colissepticemia, colibacilose sistêmica) ou toxemia (toxemia colibacilar). Em animais adultos, infecções não entéricas localizadas, muitas ocasionadas por invasão oportunista, podem envolver o trato urinário (cistite principalmente em cadela), as glândulas mamárias (mastite em vacas e porcas) e o útero (piometra em cadela e cervídeos) (QUINN et al., 2005). Patógenos ou indicadores de poluição fecal são raramente encontrados nos pescados recém-capturados. A maior parte das infecções parece estar relacionada com a contaminação da água ou com o manuseio do produto alimentar de forma inadequada já que, após a captura, a microbiota inicial é alterada e a incidência de microrganismos nos pescados é dependente das condições de transporte, manipulação, contato com o gelo, superfície e equipamentos, estocagem e comercialização. Aliado e esses fatores existem a falta de medidas que priorizem a qualidade do pescado por parte de pescadores e produtores, que negligenciam o aspecto higiênico de produção e comercialização, tornando o pescado uma fonte de infecção de E. coli para humanos e outros animais (MURATORI et al, 1994; LIBRELATO; SHIKIDA, 2005). A E. coli pode, sem dúvida, ser isolada de ambientes poluídos por material fecal ou esgotos e o organismo pode multiplicar e sobreviver durante um longo período neste ambiente. No entanto, foi demonstrado, recentemente, que a E. coli pode ser igualmente encontrada em águas tropicais quentes não poluídas, onde pode sobreviver indefinidamente (HUSS, 1997). Os estudos epidemiológicos para distinguir os vários tipos de E. coli recorrem de técnicas de isolamento em ágar sangue ou ágar MacConkey, métodos imunológicos, 35 técnicas moleculares como o PCR e detecção de genes que codificam toxinas (QUINN et al., 2005). Klebsiella sp. é também uma bactéria pertencente a família Enterobacteriaceae e fazem parte do grupo dos patógenos oportunistas, ou seja, raramente causam infecção entérica em animais domésticos, estando algumas vezes envolvidos em infecções oportunistas com diferentes localizações anatômicas (QUINN et al., 2005). A contaminação fecal do meio ambiente explica a ampla distribuição dos microrganismos e contribui para a ocorrência de infecções oportunistas. Fatores predisponentes incluem infecções intercorrentes, desvitalização tecidual e vulnerabilidade inerente de certos órgãos (HUSS, 1997). Klebsiella sp. é comumente encontrado em mastite por coliformes em vacas, endometrite em égua, pneumonia em bezerros e potros e infecção do trato urinário em cães. Podem ser encontradas em peixes contaminados através da manipulação em condições inadequadas de higiene e nos que vivem em ambientes aquáticos contaminados (QUINN et al., 2005). O diagnóstico é realizado através do isolamento da bactéria em ágar sangue ou ágar MacConkey, e identificação através de testes bioquímicos. O tratamento é realizado com terapia antibiótica, de acordo com o teste de sensibilidade a antimicrobianos e as causas predisponentes e fontes de infecção devem ser identificadas e, se possível, eliminadas (QUINN et al., 2005). 2.3.1.5 Columnariose Flavobacterium columnare é o agente etiológico de uma doença conhecida como “columnariose” ou “doença da boca de algodão ou podridão das nadadeiras”. É uma bactéria Gram-negativa, na forma de bacilos alongados (bastonetes) e móveis, mensurado cerca de cinco (5) µm de comprimento e um (1) µm de largura. Suas colônias são amareladas, rizóides, planas e dispostas em forma de colunas, daí a denominação “Columnare” e não cresce em meios convencionais de microbiologia (TAVARES; PALHARES, 2011; ZAGO, 2012). F. columnare habita os sistemas aquáticos e convive em pleno equilíbrio com os peixes. Para que ocorra a enfermidade é necessário que haja algum distúrbio ambiental (mudança rápida na temperatura da água, piora na qualidade da água com elevação de nitrito e queda do teor de oxigênio dissolvido), pressão de manejo (excessiva densidade de estocagem e inadequado manuseio, provocando feridas nos peixes) e queda na resistência dos peixes (KUBITZA, 2000; 2012). 36 A maior incidência ocorre no verão, onde a temperatura da água varia entre 28 e 30 0C e pode causar mortalidade acima de 80% ainda na primeira semana após a estocagem dos alevinos (KUBITZA et al, 2013; ZAGO, 2012). Essa mortalidade ocorre em uma etapa do cultivo onde os peixes ainda são pequenos e o custo direto associado a esses alevinos ainda é relativamente baixo. Isso faz com que muitos produtores subestimem a importância dessas perdas nos resultados econômicos do cultivo, mas em longo prazo, essas perdas prejudicam a formação de estoque de juvenis, consequentemente os tanques de engorda acabam vazios ou sub estocados, diminuindo a produção anual da piscicultura (KUBITZA et al, 2013). Apesar de a columnariose ser observada em animais adultos, as pós-larvas e alevinos são as faixas etárias de maior susceptibilidade, uma vez que seus mecanismos específicos de defesa não estão completamente desenvolvidos, não respondendo rapidamente às infecções (FIGUEIREDO, 2007a; SEBASTIÃO et al, 2010; KUBITZA et al, 2013). Os sinais clínicos observados são perda de apetite e natação vagarosa, asfixia (devido à infecção da bactéria nas brânquias), manchas descoloridas e localizadas na pele (Figura 22), lesões nas margens das nadadeiras (principalmente na caudal) com aspecto de apodrecimento (Figura 23), lesões esbranquiçadas a amareladas ao redor da boca, apresentando crescimento bacteriano com aspecto de tufos de algodão, áreas necróticas amareladas nas brânquias (colônias de bactérias), indicando a destruição do epitélio branquial, o que dificulta a respiração e causa a morte dos peixes por asfixia (KUBITZA, 2000; ROBERTS, 2012; ZAGO, 2012). Figura 22: Manchas descoloridas e localizadas na pele Figura 23: Podridão das nadadeiras em tilápia causada por Flavobacterium columnare G-PLOUGH, 2007 37 Fonte: KUBITZA, 2005 Em alevinos, pode ser observada a lesão em “sela”, que são lesões esbranquiçadas ao longo da nadadeira dorsal, nas laterais do animal e cabeça, que podem ser vista em alguns alevinos no inicio do surto, mas que, infelizmente não são sinais exclusivos da columnariose (FIGUEIREDO, 2007a). Mesmo não havendo lesões típicas é importante saber que as brânquias são locais comuns de infecção pela bactéria, e que muitas vezes essas serão as portas de entrada para que o F. columnare atinja órgãos internos do peixe, como o rim e o fígado (FIGUEIREDO, 2007a). O diagnóstico tem por base os sinais clínicos característicos da doença e a confirmação é feita através da microscopia direta, isolamento bacteriano em meios de cultura específicos e técnicas de biologia molecular (PCR) (TAVARES; PALHARES, 2011). A prevenção e o controle da columnariose devem ser feitos por uma associação de medidas que visam sempre a diminuição da carga infectante do F. columnare no ambiente, ou seja, que permita convivência com o agente no ambiente da piscicultura, mas sem a ocorrência de casos clínicos significativos (FIGUEIREDO, 2007a). 2.3.1.6 Francisella sp. As bactérias do gênero Francisella sp. são responsáveis por causar a doença conhecida como granuloma visceral das tilápias É uma bactéria gram-positiva, aeróbio obrigatório, imóvel, oxidase negativa e catalase positivo fraco. São microrganismos fastidiosos que requerem a adição de cisteína ao ágar sangue para crescimento e não crescem em ágar MacConkey. É adaptada ao crescimento em temperaturas que variam 6 a 28 0C, com crescimento ideal na temperatura de 17 a 220C (QUINN et al, 2005; SOTO, 2010; ROBERTS, 2012) Essa bactéria é extremamente virulenta para diversas espécies de peixes marinhos e de água doce, causando também, doença em mamíferos (incluindo humanos) (BOWEN et al, 2008; KUBITZA, 2008). 38 A maior incidência da doença ocorre no inverno e a transmissão ocorre por contato direto com animais infectados, através da água ou alimentos contaminados ou por vetores, tais como insetos. A infecção por Francisella sp. caracteriza-se como uma síndrome aguda (com poucos sinais clínicos e alta mortalidade) subaguda ou crônica (com sinais clínicos inespecíficos com variados graus de mortalidade) (SOTO et al, 2010; COLQUHOUN; DUODU, 2011). Os sinais clínicos não específicos dessa bacteriose incluem perda do apetite, comportamento letárgico, natação errática e exoftalmia. Internamente é observado sinais mais específicos da doença, que é a presença de um grande número de nódulos brancos nas brânquias, baço, rim e gônodas, e, ocasionalmente, no fígado e coração (Figura 24) (BOWEN et al, 2008; KUBITZA, 2008; JEFFERY et al, 2010; COLQUHOUN; DUODU, 2011). Histologicamente pode ser observada extensa inflamação granulomatosa, com núcleo necrótico e infiltração de células mononucleares (Figura 25). Figura 24: Tilápia com o rim e baço aumentado e presença de numerosos nódulos brancos em ambos os órgãos Fonte: BOWEN et al, 2008 Figura 25: Corte histológico do baço com granulomas (A) e tecidos normais do baço (B) 39 Fonte: BOWEN et al, 2008 O diagnostico é realizado através dos sinais clínicos e a confirmação do agente é obtida através da cultura bacteriana em meios específicos, associado com a histopatologia e técnicas de biologia moleculares (PCR) (JEFFERY et al, 2010; COLQUHOUN; DUODU, 2011). A Francisella é de difícil tratamento, mas estudos experimentais têm demonstrado que o uso do florfenicol administrado na ração na dosagem de 15mg/kg/pv durante 10 dias ou a oxitetraciclina na dosagem de 30-50 mg/kg/pv durante 10 – 14 dias, pode ser eficaz (BOWEN et al, 2008; JEFFERY et al, 2010). 2.3.1.7 Clostrídiose Os Clostrídios são bactérias Gram positivas, grandes, anaeróbios, fermentativas, que requerem meios enriquecidos para crescer, são bacilos retos ou levemente curvos, catalase negativo, oxidase negativa e a maioria possui motilidade pela presença de flagelos peritríquios (QUINN et al, 2005). Embora mais de 100 espécies de clostrídios sejam reconhecidas, menos de 20 são patogênicas, sendo agrupadas em quatro categorias: três baseadas na atividade tóxica (neurotóxicos, histotóxicos e enterotóxicos) e tecidos afetados e a quarta contendo patógenos de menor importância, que causam doença esporádica, geralmente afetando animais de modo individual. Os clostrídios neurotóxicos, como Clostridium tetani e C. botulinum, afetam a 40 função neuromuscular sem indução observável de lesão tecidual. Em contraste, os clostrídios histotóxicos como os C. perfringens (tipo A), C. chauvoei, C. septicum, C. haemolyticum e C. novyi (Tipo A-B), produzem lesões relativamente localizadas em tecidos (como nos músculos e no fígado) e podem subsequentemente causar toxemia. Já os C. perfringens (tipo A-E), são enterotóxicos e produzem lesões inflamatórias no trato gastrintestinal juntamente com enterotoxemia (QUINN et al, 2005). Os clostrídios são saprófitos encontrados no solo, na água fresca ou em sedimentos marinhos. As espécies de Clostridium produzem endósporos que são corpos dormentes altamente resistentes que garantem a sobrevivência durante condições ambientais adversas. A diferenciação das espécies pode ser realizada através do tamanho, forma e localização dos endósporos (ROBERTS, 2012). Clostridium perfringens são classificados em cinco genótipos (A a E) que produzem várias exotoxinas potentes e imunologicamente distintas, que causam efeitos locais e sistêmicos encontrados nas enterotoxemia. C. perfringens tipo B, C, D e E são particularmente significativos em animais domésticos e podem sobreviver no solo por vários meses como esporos. C. perfringens tipo A, que constituem parte da flora intestinal normal, estão amplamente distribuídos no solo (QUINN et al, 2005). Em revisão da literatura, observou-se que a investigação sobre o envolvimento de C. perfringens em peixes de água doce é limitada. Contudo, a carne crua ou processada e armazenada em condições inadequadas, constituem em uma importante fonte de contaminação por C. perfringens para humanos ou outros animais que venha a consumir esta (DAS; JAIN, 2012). Clostridium difficile causa doença em seres humanos e animais que vão desde a colonização assintomática a diarreia e colite (GOULD; LIMGABO, 2010). Em pesquisa realizada por RAMIREZ e DIXON (2003), foi demonstrada a associação de C. difficile com uma doença conhecida como ''Malawi bloat'' (no qual o peixe infectado apresenta o abdômen distendido) em ciclídeos africanos, mas não ficou comprovado que esta seja o principal patógeno desencadeante dessa doença. Botulismo é uma intoxicação grave, potencialmente fatal para o homem e animais, adquirida pela ingestão de toxina produzida pela bactéria Clostridium botulinum (EKLUND, et al, 1982; HANNETT et al, 2011). Oito tipos de C. botulinum são reconhecidos com base na especificidade sorológica das toxinas que produzem (A, B, C α, C β D, E, F, G) (EKLUND, et al, 1982; 1984; QUINN et al, 2005; YULE et al, 2006). Os tipos C e D causam a maioria dos surtos de botulismo em animais domésticos, que ocorrem mais comumente em aves aquáticas, 41 bovinos, equinos, ovinos, martas, aves domésticas e peixes cultivados (QUINN et al, 2005). O tipo E é o mais prevalente em ambientes marinho e de água doce do hemisfério norte (EKLUND, et al, 1982; 1984). Os esporos do Clostridium botulinum são as formas mais resistentes que se têm encontrado entre os agentes bacterianos, podendo sobreviver por mais de 30 anos em meio líquido e, provavelmente, mais tempo ainda em estado seco, tolerando temperaturas de 100ºC por horas. Para destruir os esporos, os alimentos contaminados devem ser aquecidos a 121ºC por 30 minutos. Além disso, os esporos do C. botulinum tipo E são capazes de germinar em temperaturas inferiores a 3ºC e frequentemente estão associados com frutos do mar refrigerados (CERESER et al, 2008). C. botulinum é encontrado no solo, fezes, decomposição matéria orgânica e sedimentos aquáticos. São comuns também no trato intestinal de peixes e podem ser isolados a partir de sedimentos de tanques de terra em algumas áreas (YULE et al, 2006; AUSTIN; AUSTIN, 2007; HANNETT et al, 2011; ROBERTS, 2012). Em humanos a toxina causa quatro tipos reconhecidos de enfermidades, incluindo botulismo alimentar, botulismo por feridas, colonização intestinal em adultos e botulismo infantil. O botulismo alimentar ocorre pela ingestão da toxina pré-formada, enquanto que, nos outros três tipos, a enfermidade ocorre pela infecção, multiplicação e produção de toxinas por microrganismos clostridiais em feridas ou no trato gastrintestinal (EKLUND et al, 1982; CERESER et al, 2008) Um grama de toxina botulínica é suficiente para matar 30 milhões de camundongos. A dose letal da toxina botulínica para o ser humano não é conhecida, mas pode ser estimada extrapolando-se os resultados encontrados para primatas. Tem-se, por exemplo, uma dose letal para toxina tipo A em um homem de 70kg igual a 0,09-0,15μg, por via intravenosa ou intramuscular, de 0,70-0,90μg por inalação, ou ainda de 70μg por via oral (CERESER et al, 2008). As toxinas botulínicas são as mais potentes toxinas biológicas conhecidas. Estas não atingem o sistema nervoso central devido à barreira hematoencefálica, não ocorrendo, portanto, perturbações de ordem central, permanecendo o infectado, comumente, consciente durante a evolução do quadro. As toxinas atuam nas junções neuromusculares, provocando paralisia funcional motora sem a interferência com a função sensorial. Os efeitos farmacológicos das toxinas acometem principalmente os nervos periféricos, os quais têm a acetilcolina como mediador. As toxinas ligam-se na membrana nervosa bloqueando a liberação da acetilcolina, causando a paralisia flácida que evolui para a morte, devido à 42 paralisia dos músculos respiratórios, sem o desenvolvimento de lesões histológicas (QUINN et al, 2005; CERESER et al, 2008). O primeiro relato de ocorrência de botulismo como uma doença em peixes ocorreu em 1974, em um cultivo de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss) na Dinamarca. Através desse relato foi demonstrado que o botulismo é uma doença crônica, que teve como agente causal reconhecido o C. botulinum tipo E, e foi chamada pelos piscicultores de "Doença da falência” em resposta a significativa mortalidade e grande perda econômica que ocasionou (EKLUND et al, 1982; YULE et al, 2006; AUSTIN; AUSTIN, 2007). Posteriormente surtos semelhantes foram relatados nos Estados Unidos em 1979 e em trutas na Grã-Bretanha em 1982. Vários outros surtos de botulismos em viveiros de peixes, tem sido documentadas, principalmente em países do hemisfério norte, mas poucas pesquisas sobre a toxicologia da neurotoxina botulínica em peixes têm sido conduzidas (EKLUND et al, 1984; AUSTIN; AUSTIN, 2007; ROBERTS, 2012). Botulismo por C. botulinum tipo E em humanos é associado com o consumo de peixe e de mamíferos aquáticos contaminados (HANNETT et al, 2011). Os peixes são suspeitos de abrigar as bactérias no seu trato gastrointestinal, onde a toxina é subsequentemente formada, possivelmente quando submetidos a certas condições de estresse. NOL et al. (2004) suspeita que a tilápia (Oreochromis mossambicus) quando esta sujeita a uma variedade de infecções bacterianas, pode ter experimentado um aumento da susceptibilidade à formação de toxina ou presença da toxina dentro de seu trato gastrointestinal devido o seu estado geral estar comprometido. Nos Grandes Lagos da América do Norte, a grande mortalidade de aves provocada pela ingestão de peixes contaminados por Clostridium botulinum toxina tipo E levou a estudos sobre a distribuição da toxina no intestinos dos peixes e de sua toxicidade para eles (ROBERTS, 2012). A fonte de infecção para os peixes não esta completamente esclarecida, mas em estudos realizados para verificar a presença de botulismos em peixes, foi demonstrado que os peixes mortos e em deterioração na água favorecem a germinação e proliferação de bactérias e subsequente produção de neurotoxinas (os numerosos esporos produzidos podem permanecer latentes nos sedimentos por muitos anos), sendo uma das principais fontes de infecção, uma vez que peixes como o salmão coho e truta, alimentam de tecidos moles de peixes mortos (canibalismo), onde muitas vezes esta concentrada as toxinas (EKLUND et al, 1982; 1984; YULE et al, 2006). A utilização de restos de peixes mortos como alimentos para os outros animais, assim como ração e/ou outros alimentos armazenados inadequadamente, 43 podem constituir em outra importante fonte de infecção para os peixes (AUSTIN; AUSTIN, 2007). Os invertebrados também podem ser vetores da toxina E, já que foi demonstrada a presença dessa toxina em caracóis, minhocas e pequenos nematoides (EKLUND et al, 1984; YULE et al, 2006). EKLUND et al. (1984) relataram que os surtos de botulismo ocorreram geralmente durante o verão ou outono, quando a temperatura da água é maior. Em temperaturas elevadas, maiores que 15 a 20 0C, os esporos podem germinar, crescer e produzir milhões de células adicionais do tipo E no peixe morto e os peixes vivos pode começar a exibir os sintomas de botulismo quando a temperatura aumenta a 23 0C ou mais. Quando a temperatura da água caiu abaixo dos 10 0C, os sustos assim como a taxa de crescimento das bactérias diminuíram. Os peixes afetados geralmente apresentam cor escura (hiperpigmentação), corpo ligeiramente inchado, flutua apaticamente na superfície e em seguida afundam e nadam erraticamente à superfície. Os sinais patológicos incluem palidez das brânquias, ligeiro edema abdominal, e, em geral, apresentam trato digestivo vazio. Não apresentam alterações histopatológicas óbvias, a menos que ocorra uma infecção bacteriana concomitante (AUSTIN; AUSTIN, 2007; ROBERTS, 2012). Em um estudo experimental, no qual foi testada a toxicidade da neurotoxina botulínica do tipo E para peixes dos grandes lagos na América do norte, YULE et al. (2006) verificaram que as características predominantes dos peixes afetados foram mudanças comportamentais (perda da função motora, apresentando perda de equilíbrio, natação errática e decúbito dorsal) e alteração na pigmentação. Em outro estudo realizado no qual foi pesquisado botulismo tipo E em salmonídeos, EKLUND et al. (1984) observaram que pouco antes do desenvolvimento dos sinais de botulismo, os peixes tornaram-se hipersensíveis e nervosos e, com a progressão da doença, os músculos peitoral, pélvico, anal e das nadadeiras dorsais foram paralisados devido à ação da neurotoxina tipo E do C. botulinum. Isso começou com a nadadeira peitoral e a paralisia continuou progressiva em direção caudal. A nadadeira caudal, no entanto, permaneceu ativa, o que permitiu o peixe se movimentar, mas a sua incapacidade para controlar as outras nadadeiras resultou em perda de equilíbrio e direção. Após a morte, foi observado que na porção final do trato intestinal dos peixes continha muito material fecal viscoso, sugerindo um estado de constipação, uma condição frequentemente associada com o botulismo em outros animais e em humanos, assim como o característico sinal da progressão dos sintomas de forma cranial-caudal. 44 Para diagnóstico de botulismo é realizado o isolamento da bactéria, bioensaio em camundongos para avaliar a presença de fatores tóxicos e técnicas de biologia molecular. O isolamento da bactéria pode ser conseguido através da utilização de técnicas anaeróbicas, já que o C. botulinum é anaeróbico estrito. Amostras do conteúdo intestinal, o que, provavelmente, suportam uma microflora residente anaeróbia e órgãos internos devem ser homogeneizadas em tampão de fosfato a 1% de peptona, a pH 7, e diluída cinco vezes. Estas amostras diluídas devem ser inoculadas em 100 ml ou 200 ml alíquotas de caldo de carne de Robertson, com a subsequente incubação anaeróbica a 30 ° C por até 6 dias (AUSTIN; AUSTIN, 2007). A presença de C. botulinum e a sua toxicidade pode ser avaliada através da inoculação de filtrados de cultura estéreis em ratos e / ou o peixe e a toxina especifica é identificada por testes de neutralização com anti-soros monovalentes (ROBERTS, 2012). Recentemente existem vários estudos sobre a análise de bactérias intestinais de peixes que combinam métodos moleculares com os métodos tradicionais bacteriológicos. Consequentemente, as técnicas moleculares têm sido desenvolvidas e são utilizadas com mais frequência para estudar e obter informações mais detalhadas sobre a microflora intestinal dos peixes. Essas técnicas incluem métodos de impressão digital baseados na utilização do gene RNAr 16S, reação em cadeia polimerase (PCR), eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE), eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE), polimorfismo no comprimento de fragmento de restrições (FRLP), amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD) e eletroforese em campo pulsado (PFGE) são as ferramentas que têm sido utilizado para determinar a relação genética entre Cepas de C. botulinum tipo E (SUGITA et al, 1996; HANNETT et al, 2011). Botulismo é uma condição de muito baixa incidência em fazendas de criação que se limita a peixes cultivados em tanques de terra ou tanques rede. Geralmente, ela está associada com condições de estresse provocada aos peixes como altas densidades nos tanques, nutrição deficiente e principalmente a não retirada dos peixes mortos e moribundos diariamente. Sendo assim, cabe a todos os piscicultores o dever de manter os padrões de criação adequados, que impedem o seu desenvolvimento e a propagação da doença a outros animais e aos seres humanos (EKLUND et al, 1982; 1984; ROBERTS, 2012). Os funcionários devem ser informados de que C. botulinum e sua toxina são potencialmente perigosos para si e suas famílias. Se os clostrídios são trazidos para dentro de casa, especialmente em grandes números, através da roupa suja ou mãos impropriamente lavadas, podem ser introduzida em carnes cozidas ou cruas, peixes e legumes. Portanto, é 45 essencial que os funcionários usem roupas de proteção e luvas sempre que trabalhar com o peixe doente e que seja realizada uma boa higiene após o contato com esses peixes (EKLUND et al, 1982). Peixes mortos, como citado acima, são sujeitos à decomposição e proliferação das bactérias tornando uma das principais fontes infecção para os outros peixes, portanto, não deve ser permitido acumular nos fundos dos viveiros ou tanques. Os peixes mortos devem ser incinerados ou colocados em trincheiras longe do abastecimento doméstico de água e enterrados sob uma camada de solo e cal. Caso contrário, surto de botulismo em peixes poderia ser estendido a outras populações de animais e ao próprio homem (EKLUND et al, 1982; 1984). Nos viveiros onde ocorreram surtos de botulismo, os sedimentos não devem ser usados como fertilizantes ou para outros fins, já que podem conter uma grande população de organismos de C. botulinum. Em vez disso os sedimentos devem ser enterrados na mesma maneira como recomendado para peixes mortos (EKLUND et al, 1982; 1984). Não há tratamento eficaz para estoque em sistemas contaminados (daí o nome "doença da falência”). Pode ser utilizadas medidas de controle como a correta eliminação dos peixes moribundos e mortos e aplicação de boas praticas de manejo, evitando, por exemplo, altas taxas de densidades nos tanques e viveiros de criação (ROBERTS, 2012). 2.3.2 Tratamentos das principais enfermidades bacterianas em tilápias O tratamento das enfermidades bacterianas na aquicultura é realizado através da administração de antibióticos aos peixes. Atualmente temos poucas opções de farmoquímicos autorizados oficialmente disponíveis para conduzir uma intervenção terapêutica em situações de surtos em pisciculturas. O florfenicol, a oxitetraciclina e a neomicina (este ultimo é destinado a peixes ornamentais) são as opções de antibióticos liberados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e abastecimento (MAPA) para uso na aquicultura. No entanto, na prática são empregadas muitas outras moléculas de forma indiscriminada e sem conhecimento dos potenciais riscos à saúde humana, dos peixes e de toda a biota aquática (PÁDUA et al, 2012). Os antibióticos podem ser administrados via injeção, misturados à ração ou através do banho de imersão. A injeção é a maneira mais eficiente de garantir que a dose de antibiótico desejada chegue até a corrente sanguínea, porém, esse processo é trabalhoso e impraticável para tratamento de peixes na fase de recria e engorda, sendo utilizado, em alguns casos, em 46 peixes reprodutores. O banho de imersão possui a desvantagem de precisar de maiores doses de antibiótico para alcançar o efeito desejado. Na pratica é utilizado em poucas situações, como por exemplo, no transporte de alevinos em sacos plásticos ou nas caixas de caminhões especializadas ou em sistemas fechados como laboratórios ou larviculturas, onde o volume de água é menor e o fluxo pode ser controlado. A via mais utilizada é a incorporação dos antibióticos à ração. Essa incorporação pode ser feita na fabrica de ração ou na propriedade (FIGUEIREDO et al, 2008b). O florfenicol (FFC) (D-(threo)-1-(methylsulfonylphenyl)2-dichloroacetamide-3- fluoro-1-propanol) é caracterizado por ter alta disponibilidade em peixes, boa penetração nos tecidos e rápida eliminação (CARRASCHI, 2010). Ele apresenta amplo espectro, que atua sobre bactérias gram negativas e gram positivas, inibindo o metabolismo bacteriano através da interferência no processo da síntese de proteína. Possui a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica (o que não ocorre com a tetraciclina), sendo indicado para o tratamento de doenças bacterianas que acometem o cérebro (FIGUEIREDO et al, 2007b). A oxitetraciclina é um antibiótico do grupo das tetraciclinas e vem sendo utilizado por décadas no tratamento de bacterioses, principalmente por ser eficaz, de baixo custo, de amplo espectro de ação e possuir a capacidade de difusão em fluidos e tecidos corpóreos (CARRASCHI, 2010). O tratamento da estreptococose é realizado administrando antibiótico a base de florfenicol, na dose de 10mg/kg/pv combinado com sulfa-trimetoprim na dose de 25 mg/kg/pv por um período recomendado de 10 dias (TAVARES; PALHARES, 2011; FIGUEIREDO et al, 2012). De acordo com a literatura, Edwardsiella tarda é sensível a uma ampla variedade de agentes antimicrobianos e, portanto, o tratamento ainda é efetuado através do uso de antibióticos (LIMA et al, 2008). O uso de oxitetraciclina, 55mg/kg de peixe/dia, durante 10 dias, ou 60 mg/kg de peixe/dia, durante quatro (4) a cinco (5) dias, tem-se revelado um tratamento muito eficaz (PAVANELLI et al, 2002). Flavobacterium columnare é uma bactéria que apresenta boa sensibilidade aos antibióticos e ao NaCl. Por isso a utilização de oxitetraciclina na ração em quantidade suficiente para consumo ao redor de 50 a 75 mg/kg/pv, durante 10 dias costuma ser eficaz. Outra opção de tratamento é o banho com permanganato de potássio por 30 minutos à uma hora na concentração de 5-10 mg/litro (KUBITZA, 2000). Os antibióticos podem ser utilizados como tratamento profilático das enfermidades geralmente um tempo e por um período após manejo como durante o transporte de animais, 47 repicagem, entre outros. Apesar de essa prática parecer vantajosa, ela pode trazer prejuízos para o sistema de médio a longo prazo, pois o uso indevido e indiscriminado desses antibióticos pode selecionar microrganismos resistentes aos medicamentos usados, e, em casos de surtos, esses não serão mais eficientes (PÁDUA et al, 2012; FIGUEIREDO et al, 2008b). Além do impacto direto na produção, o uso inadequado de antibióticos pode ser altamente nocivo para o meio ambiente, principalmente em culturas realizadas em tanques rede onde estão localizadas em grandes bolsões de água como represas, lagos e rios, pois parte do antibiótico incorporado à ração se dissolvem na água e podem depositar no sedimento ou serem ingeridas por outros animais ali presentes, alterando o perfil de microrganismos e induzindo a seleção daqueles que são resistentes à droga (CARRASCHI, 2010; FIGUEIREDO et al, 2008b). Sendo assim, a forma mais coerente para a utilização dos antibióticos é quando ocorre um surto no local. De preferência esses devem ser usados no inicio do caso, quando os primeiros sinais começam a aparecer e sempre realizar um antibiograma para determinar qual o melhor antibiótico. Como um dos primeiros sinais clínicos é a falta de apetite, é importante ter a consciência de que o tratamento com uso de ração medicada com antibióticos, só será efetiva para os animais que ainda estiverem saudáveis ou em fases bem iniciais da infecção. As mortalidades não cessarão imediatamente, pois a parcela de peixes que já estiver doente provavelmente morrerá (FIGUEIREDO et al, 2008b). 2.3.3 Controle das enfermidades bacterianas O sucesso dos empreendimentos aquícolas depende de vários fatores, sendo que um dos mais importantes é a condição sanitária dos animais que estão sendo cultivados. Dessa forma, o monitoramento do estado de saúde dos peixes é essencial para garantir a produção de animais saudáveis e evitar perdas na atividade. Ademais, o conhecimento da distribuição sazonal dos organismos causadores de enfermidades, assim como, da complexa relação entre fatores ambientais, hospedeiros e patógenos são importantes para que se possa intervir no sistema, com técnicas profiláticas adequadas, através de programas preventivos de controle destas enfermidades (ROBERTS, 2012). 48 O controle das enfermidades bacterianas deve ser feito através de uma associação de medidas que visam à diminuição da carga infectante do patógeno no ambiente. As boas praticas de manejo devem ser implementadas como preventivo para a introdução de doenças na piscicultura, as principais medidas a serem adotadas são: Contínuo monitoramento e correção da qualidade da água; Assegurar uma correta nutrição através do uso de rações de qualidade adequada às condições do cultivo, evitando o uso de resíduos animais na alimentação dos peixes, pois podem favorecer a ocorrência de doenças; Prover adequado manejo alimentar, evitando alimentar o peixe de maneira excessiva; Manter adequada condições de estocagem; Tomar cuidado na introdução de alevinos, juvenis e reprodutores, dar preferência para a aquisição desses animais com fornecedores idôneos e atentos ao manejo sanitário dos seus estoques (alevinos são as principais fontes de infecção para as fases de crescimento e engorda); Realizar quarentena antes da introdução de novos exemplares; Realizar isolamento das unidades de produção, manter o setor de berçário isolados dos outros setores; Ficar atento a qualquer alteração no comportamento dos peixes e dos sinais indicativos de anormalidades e doenças; Remover diariamente peixes mortos e moribundos dos tanques de cultivo e disponibilizar local adequado para a disposição dos mesmos; Realizar inspeção sanitária de rotina mesmo em lotes de peixes aparentemente sadio (inspeção externa e interna, exames parasitológicos e microbiológicos); Realizar desinfecção de equipamentos e utensílios de uso rotineiro; Manter sob controle a população de outros animais na piscicultura, pois estes podem servir de vetores de doenças ou zoonoses e ainda atuar como hospedeiro intermediário de alguns parasitos; Evitar o uso indiscriminado de terapêuticos, pois podem causar resistência dos patógenos a determinados tratamentos; Ter apoio de profissional especializado para o estabelecimento de diagnóstico e devidas ações para controle das doenças (KUBITZA et al, 2008; 2013; PÁDUA et al, 2012). 49 O uso de antibióticos incorporados às rações como medicamento preventivo (profilático) é prejudicial, pois pode levar à seleção de microrganismos resistentes, provocar impacto ambiental, gerar resíduos e aumentar o custo de produção (FIGUEIREDO et al, 2009a). Uma das alternativas que o meio técnico e científico vem buscando na perspectiva diminuir o uso de antibióticos na aquicultura diz respeito à substituição desses produtos por probióticos e prebióticos em rações para peixes, tendo-se a expectativa de se prevenir doenças (MOURIÑO et al, 2010). Os probióticos podem ser definidos como microrganismos vivos que ao serem ministrados a tanques de cultivo, atuam beneficamente no organismo aquático de interesse, seja melhorando o consumo ou absorção da ração, o sistema imunológico, balanço de bactérias benéficas e patogênicas no trato intestinal, ou o ambiente de cultivo (MEURER et al, 2008; MOURIÑO et al, 2010). O uso de probióticos em rações para peixes tem mostrado resultados promissores quando os animais são submetidos a algum tipo de estresse. No entanto, um sistema aquícola que apresente as condições necessárias para bom desempenho dos peixes (manejo nutricional e sanitário) não se faz necessária a utilização de probióticos, já que o contato com microrganismos patogênicos é mínimo (FERREIRA et al, 2012). Já os prebióticos são substâncias não digeríveis que beneficiam o balanço das bactérias no trato intestinal, promovendo o crescimento específico das cepas probióticas, ou seja, ele beneficia seletivamente a composição da microbiota, fornecendo aos probióticos e/ou bactérias benéficas, vantagens competitivas sobre outras bactérias existentes no trato intestinal (MOURIÑO et al, 2011). Ambos têm uma atividade complementar, mas apesar dos seus efeitos benéficos para a saúde dos peixes, alguns resultados observados em estudos são contraditórios, fato que exige dos meios técnico e científico mais estudos que possam contribuir com a viabilização desses produtos na alimentação de peixes (MEURER et al, 2008; MOURIÑO et al, 2010; FERREIRA et al, 2012). O sal marinho, composto basicamente por cloreto de sódio (NaCl), é amplamente disponível, de baixo custo, seguro para os peixes e para quem o manipula e pode ser usado em diversas situações nas pisciculturas: na prevenção e controle de doenças; como alívio do estresse relacionado às despescas, biometrias, classificações por tamanho, transferências dos peixes e confinamento durante a depuração; no alívio do estresse do transporte de curta e longa duração; e como amenizador de condições ambientais adversas (toxidez por nitrito, inflamação das brânquias, entre outros) (KUBITZA, 2007). Durante a depuração dos peixes para o transporte (pós-larvas, alevinos e reprodutores), o uso do sal, na concentração de 0,3 a 0,6% (3 a 6g/litro ou 3 a 6kg/1.000litros), previne o 50 aparecimento de lesões (manchas brancas) e a infecção por fungos e bactérias externas (como a Flavobacterium columnare - que causa podridão das nadadeiras nos peixes). É fundamental a adição do sal à água de transporte também, em concentrações entre 0,5 e 0,8% (5 a 8g/litro ou 5 a 8kg/1.000litros) para evitar significativa mortalidade e supressão do sistema imunológico causado pelo estresse (KUBITZA, 2007). Para controle da columnariose, podem ser aplicados banhos preventivos com sal no recebimento dos alevinos e após as operações de manejo. Nesse caso devem ser dados banhos de sal na concentração de 5% (50 g/litro ou 50 kg/1.000 litros) por 30 segundos a 2 minutos; ou banhos em água com 2 a 3% de sal (20 a 30 g/ litro = 20 a 30 kg/1.000 litros) por 2 a 20 minutos; ou banhos prolongados, entre 4 a 12 horas, com sal na concentração de 1,0 a 1,2% (10 a 12 g/litro ou 10 a 12 kg/1.000 litros). Essas concentrações e tempos de exposição ao sal nos banhos podem ser usados também como controle de doenças parasitárias e fúngicas (FIGUEIREDO, 2007a; KUBITZA, 2007; PÁDUA et al, 2012). Em todo mundo o uso de vacinas como método imunoprofilático na aquicultura tem aumentado significativamente, seguindo a tendência de expansão da atividade (FIGUEIREDO; LEAL, 2008d). As primeiras vacinas para peixes foram comercializadas no mercado mundial no final da década de 1970, e foram concebidas para prevenção contra infecção por Vibrio anguillarum, Vibrio ordalli e Yersinia ruckeri. Atualmente, existem diversas vacinas comerciais para diversas espécies de peixes e contra grande parte dos patógenos de importância para atividade (FIGUEIREDO et al, 2009a). Vacinas vivas, inativadas e de DNA (menor frequência) são os principais tipos utilizados. Devido aos benefícios econômicos, as vacinas produzidas a partir de células inativadas dos microrganismos, são os tipos mais comuns e as principais vacinas utilizadas para prevenção e controle de doenças bacterianas na aquicultura (LONGHI et al, 2012). Os peixes podem ser imunizados por via injetável, preferencialmente por injeção intraperitoneal (i.p.); por banhos de imersão (b.i), onde os animais são imersos em solução aquosa contendo os antígenos vacinais; ou pela administração oral (v.o.) das vacinas. Esses métodos apresentam diferentes vantagens e desvantagens quanto à eficiência da imunização, praticidade, efeitos colaterais e custo – benefício (FIGUEIREDO; LEAL, 2008d; LONGHI et al, 2012). A via injetável é o método mais laborioso e demorado, uma vez que exige a administração do produto em cada um dos peixes, sendo que estes devem ser sedados e é necessário um número elevado para a realização do procedimento. Porém, são as que induzem 51 melhores respostas imunes, sendo essas mais intensas e duradouras (FIGUEIREDO et al, 2009a). O banho de imersão é vantajoso para a escala de produção, uma vez que o produtor pode vacinar um grande número de peixes de uma vez, com menor manipulação dos peixes em relação à vacinação intraperitoneal, mas, esse tipo de via promove menor resposta imune e por tempo mais curto que a via injetável (FIGUEIREDO et al, 2009a). A vacinação oral é boa alternativa para a vacinação, pois não há manipulação dos peixes, reduzindo o estresse e de fácil administração (as vacinas são misturadas à ração), sendo apropriada para a imunização de grandes quantidades de peixe. Entretanto, há poucas vacinas orais comercializadas, devido à grande quantidade de antígeno requerido para estimular a resposta imune e a falta de duração adequada da proteção ao longo do cultivo, além disso, não se tem controle da dosagem individual de cada peixe (SILVA, 2008). No Brasil, em 2011, foi aprovada a primeira vacina de Streptococcus agalactiae inativada para tilápias, a Aquavac® STREP Sa, de aplicação i.p. (LONGHI et al, 2012). Os estudos epidemiológicos patrocinados pela MSD Saúde Animal em todo o mundo demonstraram a presença de dois grupos ou biótipos diferentes de S. agalactiae (ou seja, I e II). Os isolados de tilápia de diferentes regiões no mundo mostram que 26% dos estreptococos foram identificados como S. agalactiae Biótipo I, enquanto 56% eram S. agalactiae Biótipo II, o mais prevalente no mundo, encontrado principalmente na China, Indonésia, Vietnã, Filipinas e América Latina. No Brasil, os estudos sorológicos mostram 100% de sorologia positiva para o S. agalactiae Biótipo II (SALVADOR et al, 2011). A vacina Aquavac® STREP SA, contem bactérias inativadas de S. agalactiae biótipo II (sorotipo Ib). Ela deve ser administrada na dose de 0,05mL por peixe, através da via intraperitoneal a uma distância de meia nadadeira na frente das nadadeiras pélvicas de tilápias pesando pelo menos 15 gramas. Estudos laboratoriais demonstraram que a proteção tem início em aproximadamente 28 dias e dura até 7 (sete) meses após a vacinação (ZANOLO et al, 2011). A avaliação da vacina AquaVac® Strep Sa em condições experimentais induziu a proteção efetiva na tilápia do Nilo e mostrou uma redução significativa do índice de mortalidade nos peixes vacinados, demonstrando ser valiosa e altamente eficaz. Uma dose única da vacina pode constituir em uma ferramenta indispensável para melhorar a produtividade, o desempenho, a viabilidade econômica e servir de prevenção e controle da estreptococose na produção de tilápias no Brasil (SALVADOR et al, 2011; ZANOLO et al, 2011). 52 2.3.4 Certificação Sanitária Atualmente, peixes e outros produtos aquícolas são as principais fontes de proteína de origem animal no mundo, e a maior parte dessa demanda é suprida pela aquicultura comercial. Para manter velhos clientes e conquistar novos mercados é necessária uma produção eficiente e economicamente viável, visando um produto de qualidade a um preço competitivo. Para isso, o controle sanitário é importante, uma vez que tem como finalidade a obtenção de animais ou produtos atestadamente livres de doença importantes e o animal estando saudável, o desempenho produtivo será melhor, a um custo baixo, originando produtos com boas características e sem risco à saúde do consumidor (FIGUEIREDO; LEAL, 2008c). Para que isso funcione, deve ser instalado um programa sanitário especifico (devido a grande diversidade de sistemas de cultivos), que envolve diversos procedimentos e práticas, aplicadas de acordo com a realidade observada na propriedade ou empresa (KUBITZA et al, 2013). O primeiro passo para a certificação sanitária é a identificação dos principais problemas vigentes na propriedade, realizando levantamento de informações sobre a produção, índices produtivos, manejo, etc., bem como coleta de material e realização de exames laboratoriais para o diagnóstico de doenças. A partir disso, inicia-se o controle e erradicação das doenças, que envolve o descarte de animais e tratamentos terapêuticos com antibióticos e substâncias desinfetantes (FIGUEIREDO; LEAL, 2008c). Logo após essas etapas partimos para a implantação das práticas de biossegurança, que tem como objetivo impedir a recorrência das doenças e evitar a entrada de novos patógenos e parasitas na propriedade. Estas incluem o monitoramento contínuo da qualidade da água, uso de ração de alta qualidade, adequado manejo dos peixes, etc. Entre as medidas a serem tomadas, umas das principais é a realização do treinamento de funcionários, para eles sejam capazes de identificar o menor sinal de problema e realizar os procedimentos básicos para controlar ou conter as possíveis eventualidades até a chegada do profissional responsável (FIGUEIREDO; LEAL, 2008c, KUBITZA et al, 2013). Para o sucesso do programa sanitário, deve ser realizada constantemente a avaliação deste quanto ao seu funcionamento, eficiência e resultados obtidos, detectando as falhas que estão ocorrendo ou podem vir a ocorrer, comprometendo todo o trabalho realizado (FIGUEIREDO; LEAL, 2008c). 53 A adoção de práticas de biossegurança não implica em grandes investimentos e aumento demasiado nos custos operacionais do empreendimento. A elevação do custo de produção decorrente de problemas sanitários nas pisciculturas e a redução nos lucros dos empreendimentos que esses problemas provocam, supera em muito o valor de implantação a aplicação de práticas de biossegurança e de manejo da produção, no entanto, a decisão final cabe ao produtor (KUBITZA et al, 2013). 3 CASUÍSTICA 3.1 Material e métodos Na cidade de Morada Nova de Minas, localizada na região central de Minas Gerais, as margens do lago da represa de Três Marias, foi realizado o diagnóstico bacteriológico de quatro pisciculturas com cultivo de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) (Figura 26). As propriedades foram nomeadas em A, B, C e D. As pisciculturas A, B e C apresentam sistema de criação intensiva em tanques rede, com animais na fase recria e engorda utilizando o corpo hídrico do reservatório de três Marias, enquanto que a piscicultura D caracteriza-se pela produção de alevinos de tilápia do Nilo. Figura 26: Tilápia do Nilo Fonte: Fotos da autora Na piscicultura A foram coletados três peixes. O peixe 1 era o menor entre os coletados e apresentava lesão superficial, hemorrágica e edema. Os peixes 2 e 3 apresentavam sinais de letargia, perda da capacidade natatória e exoftalmia. Na piscicultura B foi coletado um peixe na fase de engorda com peso de 400 g e com sinal de lesão na pele. Na piscicultura 54 C, dois peixes sem lesões na pele, mas com suspeita de enterotoxemia foram encaminhados ao laboratório, e, na piscicultura D foram enviados dois peixes adultos (uma fêmea e um reprodutor macho) e cinco alevinos para exame laboratorial de rotina já que estes não apresentaram lesões ou outros sinais clínicos evidentes. Os peixes foram coletados no verão e foram transportados inteiros e resfriados para o Centro de Diagnóstico e Monitoramento Animal (CDMA), localizado em Belo Horizonte, onde foram examinados. No laboratório, os peixes foram examinados quanto ao aspecto físico e morfológico, e, posteriormente realizado a necropsia destes. Quanto ao aspecto morfológico foram observados os olhos (posicionamento, retração ou protusão do globo), a pele (muco, injúrias, hemorragias, abscessos, úlceras, edemas, cicatrizes, descoloração e formação de nódulos), nadadeiras (malformações, injúrias, necrose, inflamações, cicatrizes, perda de fios), linha lateral (bifurcações e deformidades). A musculatura foi observada quanto à consistência e forma. Cabeça e boca foram examinadas quanto à presença de perfurações, cicatrizes, formações calosas, saliências, depressões ou malformações e as brânquias observando se há aumento de secreção do muco, edemas, sangramentos, descolorações, necrose, descamação, cicatrizes, malformações. A necropsia consistiu na abertura da cavidade visceral através de uma incisão ventral, começando na região do ânus, prolongando-a até a região anterior e rebatendo logo em seguida as paredes laterais da cavidade visceral para expor os órgãos internos (Figura 27). Durante a necropsia foi observada a presença de qualquer alteração nos órgãos internos quanto à coloração, tamanho, aspecto, presença de aderências e de líquidos. As possíveis alterações macroscópicas foram anotadas e procedidas às coletas do material para exames bacteriológicos do fígado, rins, cérebro, baço, intestino, pele (áreas de lesão, superfície e debaixo da escama) e ovário. Figura 27: Necropsia do peixe 55 Fonte: Fotos da autora O material foi semeado em meios de cultura ágar sangue, ágar MacConkey e incubados a 280C durante 24 a 48 horas (figura 28). Após o período de incubação, procedeuse a caracterização das estirpes isoladas através da morfologia das colônias, hemólise, teste de Gram, oxidase e catalase. Figura 28: Coleta de material para semeadura em meios de cultura Fonte: Fotos da autora Foram realizados, em todos os peixes, exames de bacteriologia com métodos de cultura bacteriológica, identificação bacteriana com testes bioquímicos e PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) de acordo com o descrito por MATA et al, 2004. Na piscicultura A também foi realizado a bacterioscopia das amostras e histopatologia do fígado. Nas pisciculturas A e B os isolados foram submetidos ao teste de sensibilidade a antimicrobianos. Na piscicultura A foi utilizado os seguintes antibióticos: ciprofloxacin, florfenicol, enrofloxacin, eritromicina, oxacilina, sulfametoxazol + trimetoprim e tetraciclina e a piscicultura B os antibióticos: cloranfenicol, enrofloxacin, eritromicina, florfenicol, sulfametoxazol + trimetoprim e tetraciclina. Ambos foram determinadas utilizando o método de Kirby-Bauer que consiste na colocação de discos de papel filtro contendo quantidades apropriadas do agente antibacteriano em ágar uniformemente semeados com a bactéria a ser testada. Logo após o diâmetro das zonas de inibição são medidos em milímetros e os resultados são comparados a tabelas padrão para determinar a sensibilidade ou resistência do isolado, sendo classificados em resistente, intermediário ou sensível. 56 3.2 Resultados 3.2.1 Piscicultura A Na bacterioscopia realizada na piscicultura A, foram observados no cérebro numerosos cocos gram positivos, sugerindo Streptococcus spp.. Na cultura bacteriológica do peixe 1, no fígado, rins e cérebro foram negativo para o crescimento bacteriano, já no baço, superfície da pele e debaixo da escama houve crescimento bacteriano de Streptococcus spp.. No peixe 2 houve crescimento de Escherichia coli alfa hemolítica no fígado e Streptococcus agalactiae (cultura pura e abundante) em amostras dos rins, cérebro e baço. No peixe 3 nas amostras dos rins, baço e lesão da pele houve crescimento de Streptococcus agalactiae (cultura pura e abundante), no fígado crescimento de Escherichia coli alfa hemolítica e no intestino de Klebsiella spp. (Quadro 2). Quadro 2: Resultado da cultura bacteriológica dos peixes 1, 2 e 3 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG. Cultura bacteriológica Peixe 1 Fígado Rins Cérebro Baço Superfície Debaixo escamas Peixe 2 Fígado Rins Cérebro Baço Peixe 3 Fígado Rins Cérebro Baço Intestino Lesão pele Fonte: CDMA Resultados Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Streptococcus spp. Streptococcus spp. Streptococcus spp. Escherichia coli alfa hemolítica Streptococcus agalactiae (cultura pura e abundante) Streptococcus agalactiae (cultura pura e abundante) Streptococcus agalactiae (cultura pura e abundante) Escherichia coli alfa hemolítica Streptococcus agalactiae (cultura pura e abundante) Ausência de crescimento bacteriano Streptococcus agalactiae (cultura pura e abundante) Klebsiella spp. Streptococcus agalactiae (cultura pura e abundante) 57 Na identificação bacteriana foram observadas colônias puras (Figura 29), caracterizados como cocos gram positivos, catalase negativos e oxidase negativos, das amostras de peixe 2 e 3, foram submetidas a testes primários de caracterização e o grupo de Lancefield foi determinado com o uso do kit comercial SLIDEX Strepto Plus (BioMerieux, França). Figura 29: Colônias de bactérias em amostras do baço Fonte: Fotos da autora Os isolados bacterianos foram caracterizados por PCR espécie-específica para Streptococcus agalactiae e esta representada na figura 30. Figura 30: Resultado do PCR das amostras testadas para S. agalactiae, dos peixes 2 e 3 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG. 58 *Legenda do gel fotodocumentado: Canaleta 1 – Marcador (100 Kb) Canaleta 4 e 5 – Peixe 3 Canaleta 8 e 9 – Controle negativo Fonte: CDMA Canaleta 2 e 3 – Controle positivo Canaleta 6 e 7 – Peixe 2 Canaleta 10 – Marcador (100 Kb) Na histopatologia do fígado, foi observado que a maioria das células hepáticas eram morfologicamente normal, com citoplasma esponjoso (rico em glicogênio), contendo núcleos arredondados de cromatina frouxa e nucléolos proeminentes. Entretanto, algumas células hepáticas mostraram vacúolos no citoplasma (degeneração hidrópica ou gordurosa). Foram observados ainda, focos de células pancreáticas normais e junto a estas alguns macrófagos com pigmentos escuros no citoplasma (melanina) e moderado infiltrado linfohistiocitário ao redor de condutos biliares. No antibiograma realizado na propriedade o peixe pequeno (1) com diagnóstico de Streptococcus spp apresentou sensibilidade a todos os antibióticos testados (tabela 2), já as amostras de S. agalactiae dos peixes 2 e 3 apresentaram resistentes aos antibióticos oxacilina e sulfametoxazol + trimetoprim e foram sensíveis ao florfenicol, enrofloxacin e eritromicina (tabela 3 e 4). Tabela 2: Resultado do antibiograma do peixe 1 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG Fonte: CDMA Tabela 3: Resultado do antibiograma do peixe 2 da piscicultura A, localizada na cidade 59 de Morada Nova de Minas, MG Fonte: CDMA Tabela 4: Resultado do antibiograma do peixe 3 da piscicultura A, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG *Legenda: S (Sensível), R (Resistente), I (Intermediário). Fonte: CDMA 3.2.2 Piscicultura B Na bacteriologia da piscicultura B realizada em uma amostra de peixe com lesão na pele, foi diagnosticado crescimento de colônias de bactérias do gênero Aeromonas sp. em amostras do fígado e cérebro. Nos rins houve crescimento de bactérias do gênero Streptococcus agalactiae e ausência de crescimento bacteriano em amostras do baço e pele (quadro 3). Quadro 3: Resultado da cultura bacteriológica do peixe da piscicultura B, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG Peixe 400gr Fígado Rins Cérebro Baço Pele Cultura bacteriológica Resultados Aeromonas sp. Streptococcus agalactiae Aeromonas sp. Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Fonte: CDMA Na identificação bacteriana foram observadas colônias puras, caracterizadas como cocos gram positivos, catalase negativo e oxidase negativa, da amostra dos rins do peixe, 60 foram submetidas também a testes primários de caracterização e o grupo de Lancefield determinado com o uso do kit comercial SLIDEX Strepto Plus (BioMerieux, França). Os isolados foram caracterizados por PCR espécie-especifica para Streptococcus agalactiae de acordo com a figura 31. Figura 31: Resultado do PCR da amostra testada para S. agalactiae, do peixe da piscicultura B, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG Fonte: CDMA Na propriedade B foi testada a sensibilidade das bactérias Aeromonas sp. e S. agalactiae, isoladas de um único peixe. A amostra de Aeromonas sp. apresentou sensibilidade a quase todos os antibióticos testados e foi intermediário a eritromicina (tabela 5), já o S. 61 agalactiae apresentou resistência ao cloranfenicol, sulfametoxazol + trimetoprim a e sulfonamida e foi sensível a eritromicina e o florfenicol (tabela 6) Tabela 5: Resultado do antibiograma da amostra de Aeromonas sp. isolada do peixe da piscicultura B, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG Fonte: CDMA Tabela 6: Resultado do antibiograma da amostra de Streptococcus agalactiae isolada do peixe da piscicultura B, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG *Legenda: S (Sensível), R (Resistente), I (Intermediário). Fonte: CDMA 3.2.3 Piscicultura C Na piscicultura C, a cultura bacteriológica realizada em dois peixes com suspeita de enterotoxemia obteve resultado positivo para o crescimento de colônias de Clostridium sp. em amostras do intestino e ausência de crescimento bacteriano no fígado, rins, cérebro e baço (quadro 4). Os resultados de identificação bacteriana e PCR ainda estão em andamento. 62 Quadro 4: Resultado cultura bacteriológica do peixe 1 e 2 da piscicultura C, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG Peixe 1 Fígado Rins Cérebro Baço Intestino Peixe 2 Fígado Rins Cérebro Baço Intestino Cultura bacteriológica Resultados Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Clostridium sp. Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Ausência de crescimento bacteriano Clostridium sp. Fonte: CDMA 3.2.4 Piscicultura D Na piscicultura D o resultado obtido da cultura bacteriológica com pesquisa de aeróbios e anaeróbios foi ausência de crescimento bacteriano em todas as amostras dos peixes (alevinos, fêmea e reprodutor) (quadro 5). Quadro 5: Resultado cultura bacteriológica dos alevinos, fêmea e reprodutor da piscicultura D, localizada na cidade de Morada Nova de Minas, MG Alevinos (1 a 5) Fígado Rins Cérebro Baço Intestino Fêmea Fígado Rins Cérebro Baço Intestino Ovário Reprodutor Fígado Rins Cérebro Baço Intestino Cultura bacteriológica Aeróbios Anaeróbios Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo - Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 63 Fonte: CDMA 4 DISCUSSÃO Na aquicultura mundial o Streptococcus agalactiae é um patógeno importante que tem sido associada com morbidade e mortalidade em pisciculturas em todo o mundo (PEREIRA et al., 2010). Segundo ZAGO (2012), diversos fatores predispõem os peixes a infecções bacterianas, tais como: má nutrição, acúmulo de resíduos orgânicos nos tanques ou viveiros, estresse causado pelo manejo ou transporte, qualidade inadequada da água e mudança abrupta da temperatura. Nesse relato, foi diagnosticado em duas pisciculturas, A e B, a presença de S. agalactiae em peixes que estavam na fase de engorda. De acordo com FIGUEIREDO et al. (2007), em condições naturais a doença pode ser observada em peixes com peso variando entre 50 gramas até matrizes com peso acima de um (1) quilo, mas predomina na fase de engorda, sendo os peixes entre 400 e 600 gramas, os mais acometidos. Os peixes dessas pisciculturas apresentavam como sinais clínicos lesão superficial hemorrágica com edema, perda da capacidade natatória, letargia e exoftalmia que são característicos e suspeitos de infecções causadas por bacterioses descritas por KUBITZA (2008) e SILVA (2010). As amostras desses peixes foram colhidas na época de verão, onde são observadas temperaturas mais elevadas, e isso pode ter contribuído para uma maior ocorrência do diagnóstico de Streptococcus nessas duas propriedades (A e B), pois segundo FIGUEIREDO et al. (2007) e KUBITZA (2008), a temperatura elevada da água de cultivo durante o verão pode ser também um fator que aumenta a frequência da doença. Além do diagnóstico de S. agalactiae, na propriedade A também foi diagnosticado a presença de Escherichia coli alfa hemolítica (peixe 2 e 3) e Klebsiella spp. (peixe 3). Essas bactérias, pertencentes à família Enterobacteriaceae, apresentam distribuição mundial e habitam o trato intestinal de animais e de humanos e contaminam a vegetação, o solo e a água (QUINN et al., 2005). De acordo com LIBRELATO e SHIKIDA (2005), a maior parte da infecção de peixes por essas bactérias, é proveniente de ambientes aquáticos contaminados ou manuseio em condições higiênicas inadequadas. Não foi encontrado relatos dessas bactérias causando sinais clínicos em peixes, mas o seu diagnóstico é fundamental, pois podem causar enfermidades em seres humanos ou outros animais através de pescados contaminados. 64 As bactérias dos gêneros Aeromonas podem ser frequentemente isoladas de peixes saudáveis, uma vez que são de ocorrência comum no solo e na água. ZAGO (2012) descreve que infecções por estas bactérias geralmente são causadas quando há algum distúrbio ambiental ou pressão de manejo, podendo levar a um quadro de infecção generalizada (septicemia hemorrágica) em peixes. No presente estudo, apenas a propriedade B apresentou um exemplar infectado por Aeromonas sp.. Os antibióticos liberados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e abastecimento (MAPA) para uso na aquicultura são o florfenicol, a oxitetraciclina e a neomicina (este ultimo é destinado a peixes ornamentais), no entanto, na prática são utilizadas muitas outras moléculas (PÁDUA et al, 2012). De acordo com TAVARES e PALHARES (2011) e FIGUEIREDO et al. (2012), o tratamento da estreptococose é realizado administrando antibiótico a base de florfenicol, na dose de 10mg/kg/pv combinado com sulfa-trimetoprim na dose de 25 mg/kg/pv por um período recomendado de 10 dias. O florfenicol é indicado para o tratamento de doenças bacterianas que acometem o cérebro por possui a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica (o que não ocorre com a tetraciclina) (FIGUEIREDO et al., 2007). Todas as amostras de S. agalactiae foram sensíveis ao florfenicol, mas apresentaram resistência sulfametoxazol + trimetoprim. A tetraciclina, outro medicamento liberado pelo MAPA, apresentou eficaz para o tratamento de Aeromonas sp. (piscicultura B) e Streptococcus spp. (piscicultura A), e foi intermediário para tratamento de S. agalactiae das propriedades A e B. Segundo FIGUEIREDO et al. (2008) e ZAGO (2012), o ambiente aquícola consiste em um importante meio para a seleção de espécies bacterianas resistentes a vários antibióticos, devido à utilização, muitas vezes de forma indiscriminada de tais substâncias no tratamento e profilaxia de determinadas doenças e em casos de surtos, esses não serão mais eficientes. De acordo com PÁDUA et al. (2012), os alevinos constituem-se como uma das principais fontes de infecção para as fases de crescimento e engorda, sendo assim, é de extrema importância à adoção de manejo sanitário nas propriedades produtoras de alevinos para evitar a propagação de doenças e perdas na produção. Na propriedade D, todas as amostras, tanto os alevinos como os dois peixes adultos (Fêmea e o reprodutor) apresentaram resultado negativo para a pesquisa de bactérias aeróbias e anaeróbias. Por ser tratar de uma empresa produtora de alevinos, o resultado negativo pode ser atribuída a adoção de práticas de manejo sanitário nessa propriedade, dada a importância dessa prática como citado acima. 65 Na propriedade C, a bacteriologia de dois peixes apresentou resultado positivo para Clostridium sp.. YULE et al. (2006), AUSTIN e AUSTIN (2007), HANNETT et al. (2011) e ROBERTS (2012) relataram que o Clostridium sp. pode ser encontrado no solo, fezes, decomposição de matéria orgânica e sedimentos aquáticos, sendo comuns também no trato intestinal de peixes e podem ser isolados a partir de sedimentos de tanques de terra em algumas áreas. Segundo AUSTIN e AUSTIN (2007) e ROBERTS (2012) os peixes afetados geralmente apresentam cor escura (hiperpigmentação), corpo ligeiramente inchado, flutua apaticamente na superfície e em seguida afundam e nadam erraticamente à superfície, sinais que podem ser confundidos com outras bacterioses. Os peixes analisados não apresentavam sinais clínicos evidentes, apenas uma suspeita de enterotoxemia. Os exames de identificação bacteriana e PCR foram encaminhados ao Laboratório de Doenças de Animais Aquáticos (Aquavet), para uma análise detalhada das colônias isoladas. Se for confirmado que essas colônias são de bactérias patogênicas para os peixes, esse será o primeiro relato de infecção por Clostridium sp. em tilápias no Brasil. 5 CONCLUSÃO Doenças bacterianas afetam pisciculturas de todo mundo provocando grandes perdas na produção e prejuízos econômicos. Nos ambientes de criação deve haver equilíbrio entre a saúde do hospedeiro, a proliferação de agentes patogênicos e as condições do ambiente aquático. Desse modo, fatores que promovem estresse físico e fisiológico aos peixes devem ser evitados, pois favorecem a ocorrência de doenças. A associação de medidas como boas práticas de manejo, controle eficaz, certificação sanitária e exame diagnóstico de rotina são fundamentais para evitar a introdução e propagação de doenças nas pisciculturas brasileiras. Torna-se fundamental também o aprofundamento de pesquisas relacionadas com outros agentes infecciosos, como os vírus, pois, muitas vezes, produções de todo o país não conseguem chegar a um diagnóstico definitivo ou mortalidades crônicas são atribuídas somente às bactérias, quando na verdade muitos outros agentes podem estar envolvidos. 66 REFERÊNCIAS ALBINATI, A. C. L.; ALBINATI, R. C. B.; OLIVEIRA, E. M. D.; et al. Edwardsielose em Tilápias do Nilo (Oreochromis Niloticus). Rev. Bras. Saúde e Produção Animal, v.7, n. 2, p. 164-168, 2006. ALEXANDRINO, A. C.; OKUMURA, M. P. M; BALDASSI, L.; et al. Ocorrência de infecção por Edwardsiella tarda em truta arco-iris (Oncorhynchus mykiss) em cultivo intensivo. 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