Nathalia Guimarães Matias AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LARVÍCIDA DE EXTRATOS VEGETAIS FRENTE AO AEDES AEGYPTI Pindamonhangaba - SP 2015 Nathalia Guimarães Matias AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LARVÍCIDA DE EXTRATOS VEGETAIS FRENTE AO AEDES AEGYPTI Monografia apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Diploma de Graduação pelo Curso de Farmácia da Faculdade de Pindamonhangaba-SP Orientador: Matheus Diniz G. Coelho Co-Orientador: Gokithi Akisue Pindamonhangaba - SP 2015 Matias, Nathalia Guimarães Avaliação da atividade larvicida de extratos vegetais frente ao Aedes aegypti / Nathalia Guimarães Matias / Pindamonhangaba-SP : FAPI Faculdade de Pindamonhangaba; 2015 47 f. : il. Monografia (Graduação em Farmácia) FAPI-SP. Orientador: Orientador: Matheus Diniz G. Coelho Co-Orientador: Gokithi Akisue 1 Dengue. 2 Extratos vegetais . 3 Aedes aegypti. 4 Plantas medicinais. 5 Resistência a inseticidas. 6 Atividade larvicida. 7 Epidemia. I Avaliação da atividade larvicida de extratos vegetais frente ao Aedes aegypti II Nathalia Guimarães Matias Nathalia Guimarães Matias AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LARVÍCIDA DE EXTRATOS VEGETAIS FRENTE AO AEDES AEGYPTI Monografia apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Diploma de Graduação pelo Curso de Farmácia da Faculdade de Pindamonhangaba-SP Data:___________________ Resultado:_______________ BANCA EXAMINADORA Prof. _____________________________________ Faculdade de Pindamonhangaba Assinatura_________________________________ Prof. _____________________________________ Faculdade de Pindamonhangaba Assinatura_________________________________ Prof. _____________________________________ Assinatura_________________________________ Faculdade de Pindamonhangaba Dedico este trabalho a minha família, pelo carinho, amor, dedicação, compreensão e pelas orações, que a todos os momentos me fortalece neste novo caminho. AGRADECIMENTOS Primeiramente quero agradecer a Deus que sempre me ajudou, estando ao meu lado e segurando em minhas mãos em todas as horas, até mesmo nos momentos que nada parecia dar certo, ele esteve ali para me socorrer. Aos meus pais Carlos Alberto Matias e Maria Angélica Guimarães Matias, que são minha base, meus pilares, me ajudam em todos os momentos da minha vida, transformaram o meu sonho, minhas realizações, em seus sonhos e suas realizações, mesmo não sendo fácil esses anos, acordando muito cedo, muitas vezes atrasada e minha mãe sempre preocupada. Quantas noites mal dormidas para ficar estudando e a senhora sempre ao meu lado, sentando no sofá para me esperar ir dormir, fazendo café para eu conseguir ficar acordada mais tempo. Muitas noites em claro meu pai passa para poder realizar meu sonho, eu dou muito valor pelo esforço dele, poderia estar tranquilo agora, mas luta para me dar um futuro melhor, mesmo com seu jeito durão de militar, você tem um coração que se derrete por mim. Só tenho a agradecer aos dois e dizer que os amo muito. As minhas amigas e amigos, Katia, Fernanda, Lais, Isadora, Maycon e Nathalia, quantas vezes me ajudaram em todos os sentidos, não só na faculdade, mas também em meus sentimentos, me dando conselhos, me colocando para cima, passamos juntos por momentos difíceis sim, mas superamos e estamos aqui de pé, por um sonho compartilhado por todos. Agradeço a FAPI, instituição que academicamente nos proporcionou nossa formação e principalmente nos proporcionando um bom aprendizado através de nobres mestres e professores, que incansavelmente sempre estão prontos na arte do educar. Aos professores orientadores Matheus Diniz Gonçalves Coelho e Gokithi Akisue, pelo auxilio, disponibilidade de tempo, com paciência e dedicação, sempre disponível no fornecimento de material para pesquisa do tema. “Tu, ó Senhor Deus, és tudo o que tenho. O meu futuro está em tuas mãos. Tu diriges a minha vida”. (Salmos 16:5) LISTA DE FIGURAS Figura 1 Ciclo da vida do Aedes aegypti.............................................................................. 13 Figura 2 Citronela (Cymbopogon winterianus) .................................................................... 24 Figura 3 Azadirachta indica A. Juss (Neem) ........................................................................ 29 Figura 4 Lippia sidoides Cham. (Alecrim-pimenta) ............................................................. 31 Figura 5 Flores da Moringa oleifera .................................................................................... 34 SUMÁRIO INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 11 1 REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................................... 13 1.1 Controle de vetores....................................................................................................... 15 1.1.1 Resistência a Inseticidas ............................................................................................ 16 1.2 Inseticidas alternativos ................................................................................................. 17 1.3 Inseticidas botânicos com atividade larvicida ............................................................. 18 1.4 Extração dos extratos das plantas ............................................................................... 22 1.5 Plantas com atividade larvicida frente ao Aedes aegypti ............................................. 25 1.5.1 Cymbopogon winterianus J. (Citronela). ................................................................... 25 1.5.1.1 Extração dos óleos essenciais da Cymbopogon winterianus ................................... 26 1.5.2 Azadirachta indica A. Juss (Neem) ............................................................................ 27 1.5.2.1Obtenção do extrato da Azadirachta indica ............................................................ 28 1.5.3 Lippia sidoides Cham. (Alecrim-pimenta) ................................................................. 29 1.5.3.1 Extração do óleo da Lippia sidoides ....................................................................... 30 1.5.4 Moringa oleifera (Acácia-branca ou Lírio branco) .................................................. 32 1.5.4.1 Óleo essencial da Moringa oleifera ......................................................................... 34 2 MÉTODO ........................................................................................................................ 35 3 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 36 4 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 39 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 40 RESUMO O culicídeo Aedes aegypti é o transmissor da doença viral, a dengue se faz pela picada fêmea do mosquito, uma doença reemergente que vem preocupando as autoridades sanitárias mundiais dos cinco continentes, assumindo formas graves e letais. Nas ultimas décadas o numero de casos registrados e de vitimas tem aumentado muito devido a resistências aos inseticidas convencionais. Procurando um controle dos vetores causadores da doença, houve um estimulo para novas pesquisas e estudos de forma que não prejudiquem o ambiente e a resistência seja difícil de acontecer. Este trabalho é uma revisão bibliográfica por meio da compilação de dados referente ao crescente avanço nas pesquisas de espécies de plantas com larvicida e inseticida frente ao vetor da dengue o Aedes aegypti e suas quatro fases. O controle alternativo frente ao Aedes aegypti tem gerado pesquisas e estímulos no intuito de se descobrirem, novas substâncias inseticidas de origem vegetal, neste contexto os óleos essenciais têm se mostrado muito promissores. Visando uma futura alternativa de controle do vetor, verifica-se que mais estudos devem ser realizados a fim de galgar maiores conhecimentos sobre os compostos vegetais para que seu usufruto seja eficiente, proporcionando sucesso no controle do vetor e baixo risco à saúde humana e ao ambiente. Produtos naturais como a Cymbopogon winterianus, a Azadirachta indica A. Juss, a Lippia sidoides Cham. e a Moringa oleifera tem demonstrados como alternativas de controle ao vetor da dengue, em razão de sua baixa toxicidade para os o ser humano e da ausência de impacto ambiental. Palavra chave: Dengue. Extratos vegetais. Aedes aegypti. Plantas medicinais. Resistência a inseticidas. Atividade larvicida. Epidemia. ABSTRACT The culicídeo Aedes aegypti is the transmitter of the viral disease, transmitted by the bite of female mosquito, a reemerging disease that worrying health authorities worldwide comes from five continents, taking serious and lethal. In the last decades the number of recorded cases and fatalities has increased greatly due to resistance to conventional insecticides. Looking for a control of the disease-causing vectors, there was a stimulus for new research and studies in a way that does not harm the environment and the resistance is hard to come by. This paper is a literature review by compiling data on the growing advances in research of plant species with insecticidal and larvicidal front of the dengue vector Aedes aegypti and the four phases. The alternative front to control Aedes aegypti has generated research and stimuli in order to discover new substances, insecticides of vegetable origin, in this context the essential oils have been shown to be very promising, in flora. Seeking a future alternative vector control, more studies should be conducted in order to gain greater knowledge about plant compound so that your enjoyment is efficient, providing successful vector control and low risk to human health and environment. Natural products like Cymbopogon winterianus, Azadirachta indica a. Juss, Lippia sidoides Cham., Moringa oleifera and have demonstrated through research as alternatives to the dengue vector control, due to is low toxicity to humans and lack of environmental impact. Key word: Dengue. Plant extracts. Aedes aegypti. Medicinal plants. Resistance to insecticides. Larvicidal activity. Epidemic. 11 INTRODUÇÃO Atualmente a dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem, constituindo um grave problema pertinente a saúde pública no mundo. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que cerca de 2,5 bilhões de pessoas vivem em áreas de risco perto de criadouros da dengue.1 A dengue, uma infecção viral transmitida pelo mosquito do gênero Aedes, vem sendo considerada uma das maiores preocupações mundiais de Saúde Pública. Com uma ampla incidência nos países tropicais e subtropicais, estima-se que aproximadamente mais de 1 bilhão de pessoas estejam em risco de serem infectadas com o vírus.2 É uma doença febril severa causada por um vírus de evolução benigna, na maioria dos casos. O vírus causador da doença é um arbovírus do gênero flavivírus, pertencente à família Flaviviridae, sendo conhecidos quatro sorotipos: DEN 1, DEN 2, DEN 3 e DEN 4.3 A origem do mosquito é africana, chegou ao Brasil pelos navios negreiros, depois da viagem dos ovos nos depósitos de água das embarcações. Em 1685 ocorreu o primeiro caso de dengue foi registrado em Recife (PE). Posteriormente, foi registrada a primeira epidemia, que se deu em 1962 na cidade de Salvador (BA) provocando mais de duas mil mortes (Benseñor, 2007).4 Uma das estratégias atuais para combater a dengue é a eliminação do vetor através de produtos inseticidas, que tem como consequências do uso contínuo o surgimento de populações resistentes de Aedes aegypti. Além disso, efeitos indesejáveis desses inseticidas como a permanência por longos períodos de tempo no meio ambiente, afetando os ecossistemas, estimularam a pesquisa de produtos naturais. Neste sentido, alguns estudos apontam compostos de origem botânica com atividade larvicida e potencial para uso no controle vetorial.5 Plantas com fins medicinais são utilizadas há anos no mundo, tendo ampla utilização na agricultura como pesticidas.6 Com o decorrer dos anos, o mosquito da dengue desenvolveu resistência aos inseticidas convencionais utilizados, e, em decorrência deste advento, a busca por novas fórmulas coloca em evidencia as pesquisas em extratos vegetais e substâncias naturais que sejam eficazes no combate ao mosquito adulto e/ou à larva de Aedes aegypti e que sejam isentas de toxicidade para o meio ambiente. 7 12 Em decorrência desta resistência, os estudos sobre as plantas que produzem substâncias para sua própria defesa em resposta a um ataque patogênico, tem sido uma das buscas científicas, pois muitos vegetais sintetizam e emitem inúmeros compostos voláteis com a finalidade de defesa e atrair seus polinizadores. Alguns óleos essenciais obtidos de plantas são considerados fontes em potencial de substâncias biologicamente ativas.8 Os inseticidas naturais são obtidos de recursos renováveis e são rapidamente degradáveis, ou seja, não persistem no ambiente; o desenvolvimento da resistência dos insetos a essas substâncias, compostas da associação de vários princípios ativos, é um processo que ocorre muito lentamente. Provocando nos mosquitos de diversas formas repelência, inibição de oviposição e da alimentação, distúrbios no desenvolvimento, deformações, infertilidade e mortalidade.6 Estudos morfológicos que esclarecem os efeitos tóxicos de extratos de plantas sobre larvas de Aedes aegypti auxiliam na compreensão das diversas formas de ação desses produtos. A demonstração do local de atuação e da forma de ação tem grande importância para a potencialização de seus efeitos e para o desenvolvimento do produto inseticida. 9 No Brasil, ha uma grande diversidade de vegetais existente no Brasil, de um total estimado entre 350 e 550 mil espécies, e, neste sentido, estudos a partir de extratos vegetais surgem com a expectativa de se encontrarem substâncias com propriedades inseticidas e simultaneamente seletivas para serem usadas em futuras formulações de um produto comercial.10 Existem diversas formas de ação dos compostos botânicos, à saber: a) Ação toxica, repelente ou antialimentar, ou seja, matam o inseto por intoxicação, ou induzem ao afastamento do inseto evitando a oviposição e alimentação, ou inibem a alimentação do inseto; b) Ação em órgãos ou enzimas específicas, interferindo nos processos de desenvolvimento, no metabolismo respiratório e na síntese de proteínas, impedindo a síntese de diversas proteínas ou causando retardo e paralisia no desenvolvimento do inseto levando à morte ou à deformidades; c) Ação por contato ou ingestão, em que o produto é absorvido pelo tegumento do inseto impedindo a respiração e levando à morte ou o produto é ingerido pelo inseto provocando redução na alimentação e resultando na morte do inseto. 11 O presente trabalho teve como objetivo realizar uma pesquisa bibliográfica sobre as alternativas naturais, com foco nos extratos vegetais, úteis para a contenção e eliminação de larvas e mosquitos do Aedes aegypti, usando recursos naturais que no Brasil existe em grandes proporções, e principalmente que causem o menor impacto na saúde humana e ao meio ambiente. 13 1 REVISÃO DA LITERATURA Aedes aegypti (Díptera: Culicidae) é um inseto proveniente da África, onde existem populações selvagens e domésticas. Originalmente descrito no Egito, o que lhe conferiu seu nome específico (Aedes aegypti), ele tem acompanhado o homem em sua permanente migração.12 O mosquito Aedes aegypti exerce um papel de grande importância na transmissão da dengue e febre amarela, doenças vetoriais da etiologia viral que pode acometer grandes contingentes populacionais.13 Mundialmente se encontra a espécie, geralmente, entre as latitudes 35° Norte e 35° Sul, que correspondem à isoterma de inverno de 10°C. A distribuição desse mosquito também é restrita à baixas altitudes, no entanto têm-se registros de sua presença a 2.132 e 2.200 metros acima do nível do mar, na Índia e na Colômbia.12-14 O desenvolvimento do Aedes aegypti se dá por metamorfose completa e o ciclo de vida é holometabólico, compreendendo-se por quatro estágios biológicos (Fig.1) distintos o ovo, larva (1º a 4º instar), pupa e adulto (diformismo sexual). Os ovos são depositados nas paredes de depósitos artificiais de água limpa (criadouros), sendo super-resistentes. O estágio da larva passa por quatro instares ate a formação da pupa, fase aquática do mosquito, com condições favoráveis o período de eclosão do ovo e a pupação não excede cinco dias, sendo este o período considerado mais propicio para a erradicação devido à vulnerabilidade da metamorfose.13-15 Figura1 – Ciclo de vida Aedes aegypti Fonte: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/kitdengue2/epidemiologia/imagens.html 14 O crescimento e o desenvolvimento das larvas variam de acordo com a temperatura da água, disponibilidade de alimento e densidade populacional no criadouro. Já na fase adulta está intimamente associada às atividades do homem por suas características de alimentação e reprodução.13-15 A dengue é uma doença considerada reemergente, que conforme já mencionado anteriormente, é transmitida pela picada do mosquito A. aegypti, espécie originaria da África e dotada de uma grande capacidade de adaptação, e que, por volta do sec.XVII, dispersou-se pelo planeta. Período onde se documentou casos de dengue, todos os continentes, com exceção da Antártida, inclusive com episódios epidêmicos.16 A forma mais agressiva da doença é a hemorrágica com relatos desde o século XVIII. Por volta do século XIX há ocorrência de relatos de surtos de dengue, porém, a primeira epidemia registrada foi na década de 1980, na cidade de Boa Vista-RO, se alastrando nas Américas. Em 1986 na região sudeste, a doença ocorreu de maneira significativa no Estado do Rio de Janeiro, dando inicio a disseminação descontrolada para o resto do país.16 Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), há uma estimativa que atualmente mais de 2,5 bilhões de pessoas possam vir a ser infectados, podendo ainda haver 50 milhões de infecções de dengue a cada ano. Tal patologia é considerada um grave problema da saúde pública, já que o seu vetor é um inseto doméstico, antropofílico, com atividade hematofágica diurna e com extrema facilidade de adaptar a criadouros artificiais, dificultando o seu controle.1,13,16 Após o hospedeiro ser infectado, as primeiras manifestações clínicas, é febre alta com início abrupto, dor de cabeça, dores musculares e nas articulações, manchas cutâneas avermelhadas e eruptivas com presença ou não de prurido, perda de apetite e consequente perda de peso, náuseas, vômitos e diarreia, demoram de 4 a 10 dias para aparecerem. O quadro clínico pode evoluir para dengue hemorrágica, com manifestações hemorrágicas por todo o corpo, ao final do período febril, somada aos sinais anteriormente descritos.17 Um dos controles atuais, mais utilizados estrategicamente da dengue, ainda é o uso em larga escala de inseticidas sintéticos, como é o caso do organofosforado, mas o uso contínuo pode trazer problemas de intoxicação e contaminação ambiental, ocasionando riscos à biodiversidade local, bem como à saúde humana. Para a saúde ambiental, o uso contínuo desse inseticida pode apresentar efeitos indesejáveis, como a permanência por longos períodos de tempo no ambiente, à seleção de populações de vetores resistentes e o aparecimento de novas pragas, e além dessa população resistente de vetores, pode ocorrer a eliminação de espécies que contribuem para o equilíbrio ambiental.18 15 No que concerne à busca por melhores ações em prol do meio ambiente, o uso de produtos de origem orgânica no controle de pragas é considerado uma alternativa promissora, uma vez que tais substâncias apresentam elevada taxa de biodegradabilidade no ambiente e menor toxicidade sobre espécies não alvo. Várias pesquisas com extratos de plantas vêm sendo desenvolvidas, com atuação larvicida frente desenvolvimento embrionário, na fase larval, pupa e na fase adulta do A. aegypti.19 1.1 CONTROLE DE VETORES As práticas no controle de insetos são muito antigas, havendo registro na China há mais de 2.000 anos. Basicamente, eram práticas de controle biológico direcionadas ao enfrentamento das pragas agrícolas.12 No controle da população do Aedes aegypti a Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu várias estratégias, particularmente a utilização de produtos químicos e biológicos integrados a programas de manejo ambiental capazes de eliminar formas larvais e insetos adultos. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) o controle seletivo do vetor pode ser considerado uma operacionalização do controle integrado. Incluindo a seleção das metodologias mais efetivas a serem utilizadas, com base na realidade local, e compreende três fases: definição de local; levantamento das informações necessárias; decisão sobre o momento e a forma de sua implementação.12,20 O controle realizado pelo uso de inseticidas sintéticos ainda é predominante, porém apesar de resultados significativos, quando utilizados de forma não planejada e intermitente, são tóxicos para organismos não alvos e para o homem, bem como, favorecendo a resistências aos produtos.21 No Brasil, utilizam-se principalmente inseticidas químicos, onde se destacam os organofosforados, piretróides e mais recentemente os reguladores de crescimento, denominados de juvenóides. A toxicidade de uma substância química para insetos não a qualifica necessariamente como praguicida. Para tal, devem estar associadas várias propriedades a esta atividade, como: eficácia em pequenas concentrações, baixa toxicidade para mamíferos e animais superiores, ausência de fitotoxicidade e biodegradabilidade. Estas propriedades são consideradas as ideais para inseticidas, porém dificilmente será encontrado um produto que agregue todas estas propriedades.13,16,18 O controle do vetor encontra, ainda, uma nova barreira, referente á resistência crescente dos insetos aos inseticidas químicos atualmente utilizados nas atividades de controle 16 no país, fazendo necessário o monitoramento da resistência dos mosquitos aos compostos químicos, assim como pesquisas constantes para o desenvolvimento de novos produtos inseticidas, eficazes e ecologicamente seguros.17 1.1.1 Resistência a inseticidas Com a rapidez do avanço da urbanização o mosquito Aedes aegypti, encontrou no mundo moderno condições muito favoráveis para uma rápida expansão. Neste sentido, o crescimento desenfreado das cidades as deficiências de abastecimento de água e de limpeza urbana cooperam com a proliferação. Além disso, a intensa utilização de materiais não biodegradáveis, como recipientes descartáveis de plástico e vidro e as mudanças climáticas também favorecem a expansão de populações do mosquito. Com essas condições, a espécie espalhou-se por uma área onde vivem cerca de 3,5 bilhões de pessoas em todo o mundo.14,18 Com a intensidade do uso dos inseticidas químicos os primeiros estudos realizados para verificação da resistência de Aedes aegypti a inseticidas foi com populações de mosquito do estado de São Paulo e Rio de Janeiro, em meados da década de 1990. A rede MoReNAa (Rede Nacional de Monitoramento da Resistência de Aedes aegypti a Inseticidas), atualmente incorporada ao PNCD (Programa Nacional de Controle da Dengue), foi então instituída em 1999, com o objetivo de agregar laboratórios de referência para a realização de avaliações da suscetibilidade do vetor da dengue a inseticidas, através de bioensaios.12,17 Os inseticidas têm sido bastante usados, tanto na agricultura e agropecuária quanto na área da Saúde Pública. E a resistência tem sido detectada para todas as classes de inseticidas, afetando, direta e profundamente, a reemergência das doenças transmitidas por vetores, pois, apesar dos importantes avanços alcançados no desenvolvimento de métodos alternativos, os inseticidas químicos continuam sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle.12 A resistência a inseticidas químicos resulta de um processo de evolução acelerada que ocorre em populações que estão submetidas continuamente a pressão seletiva. Dessa forma, ocorre a seleção e sobrevivência de indivíduos portadores de mutações aleatórias que condicionam fatores de resistência. Os mecanismos que estão provavelmente envolvidos na resistência aos compostos sintéticos são: diminuição da taxa de penetração pela cutícula, diminuição da sensibilidade do sítio-alvo e detoxificação metabólica aumentada. Desse modo, populações de insetos, ácaros e outros artrópodes podem, naturalmente, apresentar uma proporção de indivíduos que tenham alelos que lhes confiram resistência a um determinado 17 produto químico. Cepas resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que matam indivíduos com alelos suscetíveis e não matam aqueles que possuam alelos resistentes.1,12 Assim, torna-se de grande importância a descoberta de novos agentes inseticidas que promovam mortalidade de larvas de populações resistentes sem afetar o meio ambiente. Compostos de origem vegetal com atividade inseticida têm sido investigados quanto aos seus efeitos sobre enzimas detoxificantes de insetos, visando identificar agentes com efeito inibitório que possam ser utilizados como sinergistas visando aumentar ou reestabelecer a susceptibilidade aos inseticidas rotineiramente usados.22 Neste sentido, uma das tendências atuais é a prospecção de produtos naturais de origem vegetal com propriedades larvicidas. 23 1.2 INSETICIDAS ALTERNATIVOS Com as novas formas de tipos resistentes do mosquito aos inseticidas convencionais utilizados, e através das pesquisas da busca de novos inseticidas as plantas têm sido consideradas como uma das alternativas para o controle de mosquitos, vetores de doenças, como a dengue, uma vez que produtos naturais de origem vegetal praticamente não apresentam toxicidade para animais e plantas, e pelo fato deles serem biodegradáveis, assim evitando a contaminação do meio ambiente. Em contraste, os inseticidas sintéticos, aos quais os insetos se tornam cada vez mais resistentes, são tóxicos e poluentes.23,24 Com a evolução das pesquisas as plantas, desenvolveram mecanismos contra a ação de insetos, sendo capazes de sintetizar, a partir de diferentes vias metabólicas, compostos de defesa como metabólitos secundários e proteínas que agem como toxinas inseticidas. Essas substâncias, de origem vegetal, vêm despertando interesse de vários pesquisadores na busca por estratégias alternativas para o controle químico do Aedes aegypti. Elas sintetizam diversos tipos de compostos que possuem potencial entomotóxico reconhecido.21 Com as dificuldades operacionais e econômicas geradas pela crescente resistência aos inseticidas sintéticos, os métodos alternativos ganharam novo impulso e passaram a merecer maior atenção.2,13 A prática de usar plantas com propriedades inseticidas é uma prática muito antiga. No entanto, com o surgimento dos inseticidas organossintéticos que se mostravam mais eficientes e baratos, os compostos de origem vegetal praticamente deixaram de ser utilizados. Por meio de pesquisas sabe-se que as plantas, como organismos que coevoluíram com insetos e outros 18 microrganismos, são fontes naturais de substâncias inseticidas e estas, por sua vez, são produzidas pelo vegetal em resposta a um ataque patogênico.6 É possível ressaltar vantagens da utilização de inseticidas botânicos quando comparadas ao emprego de produtos sintéticos, visto que são obtidos de recursos renováveis, rapidamente degradáveis e apresentam várias substâncias que atuam simultaneamente, fazendo com que o desenvolvimento de resistência dos insetos a essas substâncias ocorra de forma muito lenta. Além disso, não apresentam ação residual nos alimentos e, ainda, sua obtenção é de fácil acesso, o que representa um menor custo de produção para a população. No entanto, para que sejam comercialmente viáveis, além de apresentar uma eficaz atividade significativa, os produtos naturais precisam apresentar seletividade contra inimigos naturais, baixa toxicidade ambiental e em mamíferos, além da biodegradabilidade e ausência de fitotoxicidade.6,13 As plantas são fontes importantes de substâncias bioativas com estruturas químicas diferentes e com diversas atividades contra insetos. Com característica de seleção recíproca entre organismos interdependentes, as plantas produzem substâncias inseticidas e antimicrobianas como resultado dos mecanismos de defesa desenvolvidos contra insetos predadores. Alcaloides, terpenóides e derivados de fenilpropanóides são substâncias de baixo peso molecular, oriundos do metabolismo secundário das plantas e os principais constituintes envolvidos nas interações planta-inseto.16-17 Na década de 1940, os inseticidas de origem natural foram muito utilizados no combate às pragas agrícolas. Dentre os inseticidas orgânicos cujas substâncias ativas são provenientes de plantas destacam-se: o alcaloide nicotina, isolado de espécies de Nicotiana; os piretróides piretrina e aletrina, extraídos das flores de Chrisanthemum cinerariaefolium e o rotenoide rotenona, isolado de espécies dos gêneros Derris e Lonchocarpus, e, mais recentemente, o limonoide azadiractina, obtido de Azadirachta indica.16 1.3 INSETICIDAS BOTÂNICOS COM ATIVIDADE LARVICIDA A grande diversidade botânica existentes no Brasil colaborou com diversos estudos a partir de extratos vegetais, que são meios pelos quais se consegue extrair metabólitos provenientes do metabolismo secundário de plantas, e que surgem como alternativa de encontrar substâncias com propriedades inseticidas sobre A. aegypti.17 Os produtos derivados de plantas, particularmente alguns extratos e óleos essenciais, são amplamente utilizados por sua diversidade química e pela variada aplicação na indústria. 19 Os extratos vegetais são considerados uma rica fonte de bioativos químicos que podem ajudar no controle de pragas. O conhecimento popular sobre o uso e a eficácia das plantas contribui de forma relevante para a divulgação de suas propriedades, despertando o interesse de pesquisadores de diferentes áreas do conhecimento. 18 Ha diversas plantas que apresentam compostos inseticidas, com o poder de afetar os processos peculiares as peste-alvo, perturbando o comportamento de alimentação, alterando o processo de crescimento e o balanço endócrino, sendo particularmente uteis para desenvolvimento de compostos inseticidas seguros contra os vetores da dengue.25 O uso e a pesquisa sobre produtos naturais obtidos de plantas, com atividade larvicida contra Aedes aegypti é recente, com estudos a partir da década de 1980, com o intuito de isolar e caracterizar tais substâncias bioativas. A maior parte dos estudos é realizada com extratos brutos e óleos essenciais, sendo que, na maioria destes casos, não se conhece o composto responsável pela atividade apresentada. Muitos produtos à base de plantas apresentam compostos ativos, que agem sinergicamente, possuindo características que poderiam ser utilizadas como alternativas dirigidas para controle e monitoramento das populações de mosquitos, somado ao fato de que são obtidos de recursos renováveis, rapidamente degradáveis, com baixo potencial de resistência, fácil acesso e baixo custo de produção.6,13,16 Grande parte das plantas apresentam em sua composição química metabólitos primários e secundários. Os primeiros são encontrados em todas as células vegetais vitais para o desenvolvimento da planta, já os segundos são produzidos como forma de proteção aos microrganismos e insetos predadores, caracterizados por suas propriedades aromáticas, sendo candidatos naturais para o descobrimento de novas formulas que possam ser utilizados no controle de Aedes aegypti.26 Nos últimos anos, óleos essenciais obtidos de plantas têm sido considerados fontes em potencial de substâncias biologicamente ativas. Ênfase tem sido dada às propriedades antimicrobiana, antitumoral e inseticida de compostos voláteis, além de sua ação sobre o sistema nervoso central.27 Os óleos essenciais das plantas são misturas complexas de constituintes voláteis que conferem aromas e sabores característicos, e já ha relatos que eles se apresentam como uma fonte que pode atuar diretamente no controle do Aedes aegypti, acarretando como repelência, inibição de oviposição e da alimentação, distúrbios no desenvolvimento ocasionado por alterações no sistema hormonal, deformações, infertilidade e mortalidade nas diversas fases dos insetos.6 20 Nesta pesquisa objetivam se as propriedades das plantas com atividades larvicidas como a Cymbopogon winterianus J., Azadirachta indica A., Lippia sidoides Cham e a Moringa oleifera A Cymbopogon winterianus Jowitt é popularmente conhecida como Citronela no Brasil, seu cultivo tem um grande valor no mercado em virtude da procura de seu óleo essencial. Há poucas informações sobre Cymbopogon winterianus, apenas alguns relatos de suas atividades antifúngica e acaricida de seu óleo essencial.28 As pesquisas realizadas sobre a atividade larvicida do óleo de citronela contra larvas de Aedes aegypti tem apresentado bons resultados, atingindo alta porcentagem de mortalidade das larvas em apenas 24 horas de exposição, demonstrando que mais pesquisas devem ser realizadas visando estabelecer ação larvicida da citronela.29 O óleo essencial do Cymbopogon winterianus possui várias substâncias, sendo os com maior concentração o citronelal, geraniol e limoneno. 30 A Azadirachta indica A. afeta importantes processos relacionados à maturação reprodutiva tanto de machos como de fêmeas, retardando o início do acasalamento e do período de postura. O número de ovos por fêmea pode ser reduzido, em decorrência dos efeitos da azadiractina na síntese de vitelogenina e pela redução na retirada de proteínas do corpo gorduroso pelos oocistos, prejudicando seu desenvolvimento e maturação. 31 A espécie Lippia sidoides Cham. é popularmente conhecida como alecrim-pimenta, sendo uma planta bastante aromática que ocorre principalmente na vegetação nordestina.32 Na Lippia sidoides seus benefícios são devido à presença de metabólitos secundários presentes em suas folhas, que inclui os compostos fenólicos, também conhecidos como polifenóis, são considerados antioxidantes naturais e representam um importante grupo de compostos bioativos em alimentos. Estes compostos estão presentes em todos os alimentos vegetais, mas o seu tipo e os níveis variam enormemente dependendo da planta, fatores genéticos e condições ambientais. Ultimamente os trabalhos sobre a extração de compostos fenólicos de produtos naturais têm atraído um interesse especial.33 As sementes de Moringa oleifera contêm lectinas, proteínas com capacidade de ligação a carboidratos, denominadas WSMoL (water-soluble M. oleifera lectin), cMoL (coagulant M. oleifera lectin) e MoL (M. oleifera lectin), que apresentam diferenças quanto à especificidade, estrutura e atividades biológicas, cMoL possui atividade coagulante e foi capaz de remover partículas em suspensão na água turva, incluindo ácidos húmicos. A WSMoL matou larvas em estágio L4 de Aedes aegypti apresentando valores de CL50 (concentração necessária para matar 50% das larvas em 24 h) de 0,197 mg/mL, promovendo 21 ruptura do epitélio intestinal, aumento do volume do lúmen intestinal e hipertrofia dos segmentos, estimulação da atividade de enzimas digestivas (protease, tripsina e α-amilase) e inibição da atividade da enzima detoxificadora β-esterase. A lectina também prejudicou a eclosão de ovos de A. aegypti armazenados, matando os embriões dentro dos ovos, bem como apresentou efeito estimulante sobre a oviposição e impediu o desenvolvimento de embriões nos ovos depositados pelas fêmeas grávidas. Os efeitos deletérios de WSMoL sobre A. aegypti tornam esta lectina uma promissora candidata para uso como inseticida e um componente de alto valor das sementes de moringa. A recuperação de cMoL e WSMoL a partir da torta de sementes de M. oleifera constitui uma estratégia interessante para a utilização deste material com notável potencial biotecnológico.34 A atividade dos óleos essenciais como repelentes sobre o Aedes aegypti, atraentes e até mesmo tóxicos a insetos e microorganismos, apresentam em sua constituição uma mistura de aproximadamente 4 a 50 componentes voláteis, destacando-se os monoterpenos, sesquiterpenos ou fenilpropanóides como as principais classes químicas envolvidas. Os óleos essenciais são formados por metabólitos secundários de plantas, voláteis, lipofílicas, odoríferas e liquidas podem ser encontrados em estruturas especializadas, como os pelos glandulares, células parenquimáticas, estocados também nas flores, folhas, frutos, caules e raízes dentre outros, com uma textura oleosa em temperatura ambiente. Geralmente, encontradas como misturas de substâncias químicas de natureza terpênica, incluindo seus derivados alcoólicos e aldeídicos. Comercialmente, são usados na indústria farmacêutica, nas indústrias cosméticas e como inseticidas.13,16 O uso de plantas e de produtos manipulados a partir de seus constituintes, tais como extratos e óleos essenciais, contra culicídeos têm aumentado nos países industrializados, inclusive no Brasil, por ser um país com uma flora rica e diversa, destacando-se o uso de óleos essenciais, pois estes apresentam compostos biodegradáveis, não tóxicos e potencialmente adequados para utilização no controle de larvas de mosquito.26 Na literatura ha diversos estudos que investigam a atividade larvicida de óleos essenciais frente a larvas de Aedes aegypti, bem como de metabólitos secundários obtidos de várias espécies de plantas, havendo predominância de compostos oriundos da investigação de extratos de raízes. Os estudos registram a avaliação dos efeitos de extratos brutos, óleos essenciais, frações e metabólitos secundários isolados de vegetais contra A. aegypti, mencionam 20 famílias (Annonaceae, Apiaceae, Asteraceae, Caesalpinoideae, Cupressaceae, Erythroxylaceae, Lauraceae, Meliaceae, Monimiaceae, Moraceae, Phrymaceae, Simaroubaceae, Sterculiaceae, Targionaceae, Taxodiaceae, Zingiberaceae, Rutaceae, 22 Piperaceae, Fabaceae, Verbenace, Poaceae e Boraginaceae) como principais fontes de metabólitos larvicidas contra esse vetor. Dentre eles, destacam-se compostos pertencentes às classes: amidas, quinonas, terpenóides, fenólicos, rotenóides, flavonóides entre outros. 16,21 Há registros de diversos óleos de origem vegetal que apresentam atividade inseticida sobre o A. aegypti, como por exemplo, os óleos essenciais de Azadirachta Indica (Neem), Cymbopogon citratus (capim-limão), Lippia sidoides (alecrim pimenta), Cymbopogon winterianus Jowitt (citronela), Lippia sidoides (alecrim pimenta).13 Neste sentido, o uso de extratos vegetais no controle natural de vetores é menos impactante em termos ambientais, em relação aos inseticidas convencionais (sintéticos), pois apresentam uma degradação mais rápida, resultando em menor exposição ocupacional e poluição do meio ambiente.19 1.4 EXTRAÇÃO DOS EXTRATOS OLEOSOS DAS PLANTAS As plantas tendem a ser uma alternativa como agentes larvicidas.35 O metabolismo vegetal origina produtos denominados metabólitos primários e secundários, os primários são decorrentes de conjuntos de processos que desempenham um papel fundamental no vegetal, tais como o transporte de solutos, a fotossíntese e a respiração estando correlacionados com a produção de celulose, lignina, proteínas, lipídios, açucares e outras substâncias de função vital. O metabolismo secundário origina compostos que não possuem uma distribuição universal, pois não são necessários para todas as plantas, sendo derivados dos metabólitos primários e apresentando ação biológica que garante vantagens adaptativas. Tais metabolitos estão restritos a determinados grupos vegetais, sendo obtidos em quantidades pequenas devido ao baixo peso molecular dos mesmos. Destacam-se os alcaloides, terpenoides e derivados de fenilpropanóides. Os fenilpropanóides e, especialmente os terpenóides tem grande importância na interação planta-inseto.36-37 Os óleos essenciais têm como características naturais serem incolores ou amarelados, instáveis na presença de luz, ar, temperatura, umidade e metais, caracterizados por um forte odor sendo sintetizados por plantas aromáticas presentes nas flores, folhas, cascas, raízes, frutos e sementes das plantas, que na maioria das vezes apresentam aroma forte e agradável, sendo também chamados de essências.38-39 Apresentando propriedades químicas específicas os óleos essenciais são misturas complexas, com alta volatilidade e baixa solubilidade em água, sendo em sua grande maioria derivados de terpenoides. Os terpenos encontrados com maior frequência nos óleos essenciais 23 são os monoterpenos e sesquiterpenos, os quais conferem aroma característico às folhas e outras partes da planta. Os terpenoides ou isoprenoides são assim chamados devido à unidade precursora derivada de uma molécula de cinco carbonos isopentenil difosfato (IPP).36,38-39 Por sua complexibilidade química, os autores Simões et al. (2007), a esse respeito esclarecem que os constituintes dos óleos variam desde hidrocarbonetos terpênicos, alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, éteres, fenóis, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos contendo enxofre. Na mistura, tais compostos apresentam-se em diferentes concentrações e normalmente um deles é o majoritário, existindo outros em menores teores e alguns em baixíssimas quantidades (traços). 39 Os métodos de extração dos óleos essenciais variam de acordo com a região da planta em que tais componentes se encontra, bem como com a proposta de utilização dos mesmos. Os mais comuns são: enfloração (enfleurage), o arraste por vapor d’água, a extração com solventes orgânicos, e a prensagem e extração por CO2 supercrítico.40 Industrialmente o método mais empregado para extração é a destilação por vapor de água em consequência da simplicidade e economia, permitindo tratar de uma única vez quantidades enormes de matéria-prima. A destilação prolonga-se durante um tempo determinado, quer por circunstâncias de caráter técnico, quer de natureza econômica. Com efeito, uma destilação rápida pode conduzir a um produto contendo predominantemente constituintes mais voláteis, mas destituídos das melhores características, pelo contrário, uma extração prolongada encarece sempre o óleo essencial, mas também a pode sobrecarregar dos compostos de aromas menos estimados. Através de algumas experiências determinou se, para cada planta o momento em que deve cessar a operação, para obter um produto de qualidade e a preço mais baixo.40 Em pequena escala, os alambiques são simples com preços acessíveis, em particular os móveis menores não necessitam de mão de obra especializada, o que acaba barateando o processo. Como os óleos essenciais possuem tensão de vapor mais elevada do que água, eles são arrastados pelo vapor d'água, podendo ser empregado um aparelho de Clevenger, quando em pequena escala. O óleo essencial obtido, após separar-se da água, deve ser seco com Na2SO4 anidro. Esse procedimento, embora clássico, pode levar à formação de artefatos em função da alta temperatura empregada. Preferencialmente, esse método é utilizado para extrair óleos de plantas frescas.40 O uso do aparelho é preconizado pela Farmacopeia Brasileira, com modificações especificadas, como também cuidados a serem adotados como antes da utilização. O aparelho deve ser limpo por lavagens repetidas e sucessivas com acetona, água, mistura sulfocrômica e 24 novamente água. Depois de seco, deve ser montado em local protegido de correntes de ar. A escala graduada deve ser aferida e, se necessário, estabelecer fator de correção para cada aparelho. Quando terminada a operação, deixar esfriar por 10 minutos e ler o volume do óleo essencial recolhido no tubo.41 Determinar as condições de extração de óleos voláteis é uma etapa muito importante por ser um fator determinante na relação entre a composição química e a qualidade do óleo extraído, estas especificações estão diretamente relacionadas com a qualidade do óleo essencial. Uma destilação rápida pode tendenciar à condução de um produto contendo predominantemente constituintes mais voláteis mais destituídos das melhores características; ao contrário, uma extração prolongada encarece o produto e também o pode sobrecarregar de compostos de aroma menos estimados.40,42 As plantas são fontes naturais de substancias inseticidas e antimicrobianas, sintetizam vários compostos voláteis que atraem polinizadores e se defendem de herbívoros, sendo assim as substancia s extraídas da casca do caule, das folhas e dos frutos de diversas plantas tem demonstrado propriedades larvicidas no controle de diversos culídeos. Os óleos essenciais de algumas espécies de plantas podem sobre os insetos, causando redução de ovos, repelência, inibição da oviposição, do desenvolvimento e da alimentação.39,43-44 As toxinas botânicas entram em contato com os animais pela via respiratória, ingestão e contato que se da pela absorção na quitina e no exoesqueleto. Atuam sobre o sistema nervoso central, apresentando ação toxica e consequentemente a morte. Vários terpenos como α-pineno, β-pineno, 3-careno, limoneno, mirceno, α-terpineno e canfeno já mostraram toxicidade sobre vários insetos. A conservação dos óleos essenciais, em função da relativa instabilidade das moléculas que os constituem, torna-se difícil, uma vez que podem sofrer diferentes tipos de degradação: fotoisomerização, fotociclização (citrais), ruptura oxidativa de propenilfenois, peroxidação de hidrocarbonetos e decomposição de cetonas e alcoóis (limoneno), termoisomerização (citrais), dentre outras. Estas degradações podem modificar as propriedades e/ou pôr em dúvida a inocuidade do produto. Os procedimentos para realização do controle de qualidade de matérias primas vegetais ricas em óleos voláteis são descritos em farmacopeias.35,45 Atualmente os óleos essenciais vêm sendo muito utilizados na farmacologia por seus efeitos antimicrobiano, anti-inflamatório, analgésico e inseticida. Indústrias usam os óleos essenciais para aromatizar produtos de higiene, cosméticos, alimentos e medicamentos.46 25 1.5 PLANTAS COM ATIVIDADE LARVICIDA FRENTE AO AEDES AEGYPTI 1.5.1 Cymbopogon winterianus J. (Citronela) A citronela é uma planta do gênero Cymbopogon da família Poaceae, é uma espécie do sudeste, típica de regiões tropicais e temperadas, apresentando duas espécies conforme a região de procedência. Seus óleos essenciais tem aroma idênticos e possuem as mesmas indicações, ficando a diferença no teor de citronelal do óleo. Ambas originaram-se de uma espécie selvagem, a Cymbopogon confertiflorus. Uma é a citronela do Ceilão (Cymbopogon nardus) e a outra é a citronela de Java (Cymbopogon winterianus), esta segunda sendo muito cultivada pela sua alta concentração de óleo. É uma planta de ciclo perene, que possui uma grande resistência, podendo crescer em solos com características variadas, todavia prefere os que possuem boa drenagem e riqueza de nutrientes.13,47 A citronela apresenta folhas inteiras, estreitas e longas podendo chegar até 1 metro, suas folhas apresentam bordas ásperas e cortantes e cor mais escura e brilhante que o capimlimão (Fig.2). Desenvolve-se bem em clima tropical e, como a maioria das gramíneas, não suporta geada. Seu plantio é feito por meio de divisão de touceiras, e as mudas devem ter um espaçamento de aproximadamente um metro, entre os meses de março a setembro. Onde há possibilidade de geadas é recomendável evitar os meses de junho e julho.48 Com uma boa adaptação ao clima tropical do Brasil, vem sendo utilizada na medicina popular como repelente contra o Aedes aegypti. As folhas apresentam entre 0,6 a 1,0% de óleo essencial, ricos em geraniol e citronelal, que são muito utilizadas pelas indústrias de cosméticos, perfumarias e medicamentos, além de serem utilizados na produção de velas e incensos com efeitos repelentes a algumas espécies de mosquitos entre eles do A. aegypti.13 Atualmente entre os repelentes botânicos a citronela é umas das mais estudadas e pesquisadas. Após determinação da composição química do óleo essencial de citronela, alguns estudiosos identificaram as seguintes porcentagens relativas dos constituintes de maior expressividade: citronelal (45%), geraniol (20,7%) e citronelol (14,49%), e comprovaram a eficácia do óleo de citronela como inseticida natural, sendo uma fonte promissora no controle do vetor, pois as pesquisas relataram que o óleo essencial de citronela mostrou elevada atividade larvicida contra larvas do mesmo, atingindo alta porcentagem de mortalidade das larvas após exposição de apenas 24 horas.10,13,49 O seu óleo é uma das substâncias mais presentes em formulações repelentes de insetos, além disso, é crescente o número de velas e incensos que a utilizam como repelentes 26 ambientais.50 Com base no decreto 5813, de 22 de junho de 2006 (Ministério da Saúde), que aprova a política nacional de plantas medicinais e visa, entre outros: “Promover e reconhecer as práticas populares de uso de plantas medicinais e remédios caseiros”, as pesquisas e estudo propagam o conhecimento das propriedades desta planta como repelente natural e ecológico que repele o mosquito da dengue sem mata-lo, sem prejudicar a natureza uma vez que este inseto faz parte do ecossistema. Assim, tais componentes oportunizam as pessoas a utilização de métodos naturais, que não agridam o meio ambiente, contribuam para a manutenção e conservação do planeta, sendo ao mesmo tempo um recurso de baixo custo. 3 1.5.1.1 Extração dos óleos essências do Cymbopogon winterianus Remotamente os caboclos utilizavam os óleos de Citronela para afastar qualquer tipo de mosquito e inseto dos locais onde viviam, com o advento da tecnologia e a busca por fontes inovadores no controle de praguicidas, obteve-se os óleos concentrados, chamados óleos essenciais, retirados das mesmas plantas e com uma eficácia ainda maior.51 Sua propriedade repelente contra mosquitos e apresentou ln (CL50) de 4 mg/ ml e ln (CL90) de 4,5 mg/ml.10 Segundo estudos de Mendonça et al. o óleo essencial de C. winterianus apresentou atividade inseticida em larvas de 4° estadio de A. aegypti. A CL50 encontrada nos testes foi de 98 μg/L, após 48 h de exposição. Já Amer e Mehlhorn verificaram a ação larvicida da solução de 50 ppm do óleo de C. winterianus, sendo esta capaz de matar 60% das larvas de 3°estágio de A. aegypti, após 24 h de exposição.52 Figura 2: Citronela (Cymbopogon winterianus) Fonte: http://www.elnougarden.com/tienda/plantas/semillas/armoaticas-y-medicinales/citronella-cymbopogon 27 1.5.2 Azadirachta indica A. Juss (Neem) Azadirachta indica (Neem) é uma espécie da família Meliaceae (Fig.3), originária da Índia, que por muitos séculos foi utilizada no controle de insetos pragas, nematóides, alguns fungos, bactérias, na medicina humana e animal, na fabricação de cosméticos, reflorestamento e paisagismo. Das árvores da Neem atualmente, são extraídos e comercializados compostos químicos ativos sobre mais de 200 espécies de insetos, incluindo também alguns moluscos. Pesquisas comprovam a segurança em relação aos produtos de origem sintética, insistentemente utilizados no controle de insetos, e que podem atuar como veneno sobre o sistema nervoso central do homem.53-54 A azadiractina é um dos princípios ativos mais potentes que é retirado do extrato de neem, inibindo a alimentação dos insetos, afetam o desenvolvimento das larvas e atrasando seu crescimento, reduzindo a fecundidade e fertilidade dos insetos adultos, alterando o comportamento, causando diversas anomalias nas células e na fisiologia dos insetos e mortalidade de ovos, larvas e adultos.53 As espécies da família Meliaceae, quimicamente têm em comum a presença de triterpenos oxigenados, conhecidos como meliacinas. Inclui-se, dentre estes, o mais promissor agente antialimentar descoberto até agora, a azadiractina, que está presente nas folhas, frutos e sementes do neem. Outros compostos, como os triterpenóides, geduninas, nimbim, liminóides, dentre outras substâncias, agem juntamente aumentado à ação inseticida. Todas as partes da planta possuem esses compostos, porém a concentração varia de acordo com a região da planta. Tem ação de distúrbios fisiológicos nos insetos, possuem ação fagoinibidora, interferindo no funcionamento das glândulas endócrinas que controlam a metamorfose em insetos, impedindo assim o desenvolvimento na fase larval. Do óleo do neem foram isoladas seis substâncias: neemola (C15H3003S); margosina (C28H48O10), glicosídeo; ácido palmítico; ácido oléico, ácido totradecóico. Também se isolaram três princípios ativos: Nimbim (0,1%), Nimbinim (0,01%) e Nimbidim (1,1%).53 Já nas flores do neem, isolou-se Na, K, Ca, Fe, Cl, CO2, SO4 e SiO2, além de Nimbosterol (C20H34O) (0,03%), glicosídio Nimbosterim (0,005%), flavonoide Nimbicetim C15H6O2(OH)4 (0,05%) e sesquiterpenos (0,5%). Foi isolado das sementes do neem, componentes como: solanina, solanol, solanoacetato-3-dia-acetilsolanina, azadiradion, 14epoxia zaridion, gedunim, Nimbineur e diacetil Nimbinim. 53 Organizações internacionais como a GTZ, da Alemanha, apoiam a pesquisa, cultura e difusão do Neem, na tentativa de reduzir a utilização de inseticidas sintéticos. O Conselho 28 Nacional de Pesquisas (National Research Council) de Washington, EUA, denominou o Neem de “a árvore para resolver os problemas globais”. A FAO (Food and Agriculture Organization) chamou o Neem de “uma das maiores dádivas para a humanidade”.53 O neem foi introduzido no Brasil em 1993 na cidade de Goiânia- GO pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA. O extrato botânico de neem tem sido utilizado para o controle biológico de insetos, ácaros, bactérias e fungos agrícolas, parasitas Hematófagos.39,55 Tem demonstrado alta capacidade no controle do vetor do dengue, é uma árvore resistente a condições de altas temperaturas e baixa disponibilidade de água. No Brasil já existem plantações dessa árvore nas regiões, nordeste, centro-oeste e sul do país.55 Sua importância está relacionada ao uso como inseticida, carrapaticida e nematicida destacando-se sua alta eficiência e baixa toxicidade. Geralmente os extratos das folhas, sementes ou frutos são utilizados como inseticidas. Os principais métodos de obtenção do extrato são através de processos de extração em água e solventes orgânicos como hidrocarbonetos, alcoóis, cetonas ou éteres. 56-57 Os principais efeitos como larvicida frente ao Aedes aegypti são repelência, inibição alimentar, de crescimento, da biossíntese da quitina e de oviposição, interfere nos hormônios da ecdise e no hormônio juvenil, deformações em pupas e adultos, redução da fecundidade e da longevidade de adultos, inibição de oviposição e mortalidade, podendo afetar os insetos tanto por ingestão como por contato. A resistência do mosquito em relação aos extratos vegetais do neem é extremamente difícil, pelo fato de serem inúmeros os princípios ativos e da forma como os mesmos atuam afetando inúmeros mecanismos ao mesmo tempo.53,58 1.5.2.1 Obtenção de extrato de Azadirachta indica O óleo de Azadirachta indica segundo Oliveira et al. é retirado nas sementes, onde os princípios ativos são mais concentrados e seus derivados mais efetivos. Para os autores Balandrin et al. dentre os componentes com atividade inseticida presentes no Neem, 75% deles estão concentrados nas sementes. Produtos derivados de Neem têm vantagem de ser praticamente atóxicos ao ser humano, e rapidamente degradados no solo e nas plantas.59 Segundo Mordue et al. a Azadiractina, principal ativo do óleo de Neem, pode apresentar efeitos diretos causando inibição da divisão celular e na síntese de proteína acarretando paralisia dos músculos, necrose e falta de produção de enzimas no intestino médio. A azadiractina, que tem ação larvicida sobre A. aegypti e é reportada como causadora 29 de alterações fisiológicas irreversíveis. Ndione et al. pesquisaram a ação larvicida do óleo da A. indica, constataram mortalidade de 64,0% das larvas de quarto estádio na concentração de 8 mg/L (1,0%), e 82,0% das larvas quando a concentração foi reduzida para 3 mg/L (0,3%) em 24h de exposição.20,59 De acordo com Gomes através de testes, avaliou a ação do extrato bruto de neem sobre lavas do mosquito, após identificação da eclosão de ovos do mosquito nas bandejas e contagem da população das larvas por 100 ml de água coletada. Para averiguar a toxicidade, o óleo foi diluído em água destilada para o preparo de solução estoque de 0,01%, 5% e 10% do produto. A solução estoque de 0,01% foi utilizada para o preparo de soluções de 10-3 %, 10-4 %, e 10-5 %. A solução estoque de 10% foi utilizada para o preparo de soluções de e 1%, 101 % e 10-2 %, A solução estoque de 5% foi utilizada para preparar a solução de 5x10-2% do produto. Para a seleção das concentrações utilizadas levou em consideração a concentração de 1%, que é a recomendada pelo fabricante para uso no campo. As concentrações de 10-5%, 104%, 10-3% de Nim, resultaram em sobrevivência de 92,2%, 82,2% e 74,4%, respectivamente.59 Figura 3: Azadirachta indica A. Juss (Neem), da família Meliaceae. Fonte: http://herbaria.plants.ox.ac.uk/vfh/image/index. 1.5.3 Lippia Sidoides Cham. (Alecrim pimenta) Da família Verbenaceae a Lippia sidoides Cham. (Fig.4), popularmente conhecida como alecrim pimenta, é um arbusto densamente ramificado próprio da vegetação do Nordeste do Brasil, possui caule quebradiço e folhas aromáticas e picantes, de onde se extrai um óleo essencial que apresenta forte ação antimicrobiana contra fungos e bactérias, auxilia no tratamento de acnes, odores desagradáveis, pelo seu uso na medicina popular esta espécie é 30 cultivada em grande parte do território brasileiro, e já esta inclusa no programa de fitoterapia e na lista da Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (RENISUS).33,59 Fontenelle cita que o gênero Lippia está presente nas regiões tropicais subtropicais de todo o mundo, pertence à família botânica Verbenaceae, sendo na maioria aromática e ornamentais, segundo Mendonça no Brasil existe aproximadamente 120 espécies, com características de serem ervas eretas, procumbentes ou receptantes, subarbustos ou mesmos arbustos.60 Segundo Matos através de suas pesquisas comprova que as folhas e flores constituem a parte medicinal desta planta. Seu óleo essencial possui elevado valor comercial, pois contém timol ou uma mistura de timol e carvacrol, dois fenilpropanóides com fortíssimas propriedades antimicrobianas, antissépticas, antifúngica, antioxidante, anti-inflamatória e larvicida. Tendo relato de Fontenelle et al. e Sousa et al. 6% e como constituinte principal o timol, que é o principal responsável pelo poder antisséptico de suas folhas, tendo outros constituintes importantes como o E-cariofileno, ρ-cimeno , ρ-felandreno, mirceno e carvacrol. A utilização se dá em diversas atividades, como agricultura, veterinária, indústria de alimentos, farmacêutica, cosmética e perfumes. 59-58 O óleo essencial, extraído de suas folhas, é composto principalmente por mono e sesquiterpenos, destacando-se o timol como o constituinte majoritário. O potencial medicinal da espécie pode ser comprovado pela intensa atividade antimicrobiana do óleo essencial, que possui ainda atividade moluscicida e larvicida contra o estágio aquático do mosquito A. aegypti. Sendo o timol um principio ativo toxico contra as larvas do A. aegypti, com capacidade de induzir 100% de mortalidade em 90 min., na concentração 0,017%. 10,33 1.5.3.1 Extração do óleo Lippia sidoides Na extração dos óleos essenciais de Lippia sidoides é realizado comumente o método de hidrodestilação, utilizando-se de um aparelho de Clevenger modificado. Posteriormente, o óleo essencial é acondicionado em frasco de vidro âmbar a 4ºC e ao abrigo da luz. Paralelamente às extrações, realiza-se o teste de umidade, de acordo com o método oficial da “American Oil Chemists’ Society” (AOCS). O rendimento do óleo essencial foi calculado e expresso em peso de óleo por peso de folhas com base livre de umidade (BLU). Ehlert et al. em suas pesquisas utilizou o método de hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger, em balões de três litros com três repetições. A destilação era dada por encerrada quando o 31 incremento de tempo não alterava mais o volume de óleo essencial extraído. Observou-se o teor de óleo essencial (mL 100 g-1) e o tempo de extração (min.), o máximo teor de óleo essencial de Lippia sidoides foi obtido aos 160 min.61-62 Segundo pesquisas de Terblanché e Kornelius o óleo essencial, extraído das folhas do alecrim-pimenta, é composto principalmente por mono e sesquiterpenos, destacando-se o timol como o constituinte majoritário. O potencial medicinal da espécie pode ser comprovado pela intensa atividade antimicrobiana apresentada pelo óleo essencial, como bem demonstram os trabalhos de Lemos et al., Fontenelle, Oliveira et al. e Botelho et al.. Segundo estudos de Lorenzi e Matos este óleo essencial possui ainda atividade moluscicida contra o caramujo Biomphalaria glabrata, e larvicida contra o estágio aquático do mosquito da dengue, A. aegypti.63 O estudo químico de extratos de Lippia sidoides levou ao isolamento e caracterização de compostos fixos, incluindo dois dímeros naftoquinônicos (lapachenolisocatalponol e tectol), ésteres metílicos naturais dos ácidos graxos de C16 a C24, β-sitosterol, ácido vanílico, 2-metil-5-isopropilfenol e a 5-4-dihidroxi-6,7-dimetoxi-flavona. As pesquisas de Viana et al. e os estudos de Mendonça et al. demonstram que no ensaio toxicológico agudo pré-clínico foi possível notar a baixa toxicidade dos constituintes hidrossolúveis arrastados por vapor d'água durante a extração de óleo essencial das folhas de L. sidoides. Além disso, o teste de reação por contato, feito com a aplicação de óleo essencial a 1% na pele dos animais, não causou alergia.64 Figura4: Lippia sidoides Cham. (Alecrim Pimenta) Fonte: http://www.terradeismael.com.br/novaterra/index. php/plantas/196-lippia-sidoides-alecrim-pimenta 32 1.5.4 Moringa oleifera Lam. (Acácia-branca ou Lírio Branco) Uma planta nativa da Índia, a Moringa oleifera da família das Moringaceae (Fig.5), muito cultivada na Etiópia, Sudão e também nos trópicos desde que sobrevive por longo período em solos pobres e com baixo teor de umidades. É uma árvore perene de caule espesso e alto; folhas longo-pecioladas com comprimento até 3 cm; frutos secos e comestíveis com coloração marrom escuro; as sementes são castanhas escuras e oleaginosas, sobrevive por longos períodos em solos pobres e regiões pouco úmidas foram introduzidas no Brasil para ornamentação e arborização de ruas e praças, sendo conhecida popularmente como lírio, quiabo de quina ou simplesmente moringa. A moringa desperta grande interesse devido a sua propriedade medicinal e utilização como planta forrageira, bem como por ser uma fonte promissora de óleo e biogás.21-22,65 Sutherland et al. em seus estudos sobre a Moringa oleifera Lam., vem completar o parágrafo acima, é uma planta alógama, isto é, de fecundação cruzada, que cresce rapidamente de sementes e mudas, igualmente em solos marginais, demandando pouco ou nenhum cuidado e possui uma resistência que permite viver por prolongados tempos de estiagem.66 Segundo estudos de Souza e Lorenzi e Kiill et al. suas folhas são bipenadas com sete folíolos pequenos em cada pina, isto é, tem a lâmina foliar dividida em mais de três folíolos (1a divisão) e os folíolos divididos em foliólulos (2a divisão) dispostos ao longo da raque e raquíola, respectivamente, e suas flores são agrupadas em inflorescências terminais do tipo cimosa, de coloração amarelo-pálidas, perfumadas, muito procuradas por abelhas e pássaros, que são os agentes polinizadores de suas flores. 66 De acordo com as pesquisas de Ramos et. al. a Moringa oleifera Lam. apresenta um fruto seco do tipo cápsula loculicida, com três valvas de coloração castanho-médio. Os frutos apresentaram um comprimento relativamente pequeno (±28,50 cm de comprimento e ±2,21 cm de largura), com aproximadamente 12 sementes por fruto baixo. As sementes são globóides e aladas, de cor castanho-médio, com alas castanho-claros, bitegumentadas e exabuminosas, contendo em seu interior uma massa branca e oleosa. Possuem cerca de 1,04 cm de comprimento e 1,0 cm de espessura e peso de médio a leve (197g/1000 sementes).66 Atualmente tem sido chamada de “árvore multiuso”, pois têm aplicações para inúmeros fins: forragem animal (folhas e sementes), produção de biogás (folhas), agente de limpeza doméstica (folhas), fonte de corante azul (madeira), componente de fertilizantes (semente) e de adubo verde (folhas), complemento nutricional (suco das folhas), obtenção de 33 goma (do tronco), fabricação de cordas (casca), fonte de taninos para curtimento (casca), aplicação no tratamento da água (sementes) e para fins ornamentais. As folhas e sementes possuem excelente valor nutricional, pois são ricas em aminoácidos essenciais, proteínas e lipídios.22 Além disto, as pesquisas em diversas áreas da biotecnologia, atribuem diversas propriedades biológicas às diferentes partes da planta, como atividades coagulante, inseticida, antitumoral, antiepilética, anti-inflamatória, antimicrobiana, antidiabética, antioxidante, diurética e anti-hipertensiva.21 Os estudos feitos a partir das sementes foram isoladas duas lectinas, a lectina cMoL (do inglês, coagulant M. oleifera lectin) (1% p/p) apresentou atividade coagulante e inseticida promovendo a mortalidade das pupas Anagasta kuehniellae aumentou o tempo total de desenvolvimento e a WSMoL (do inglês, water-soluble M. oleifera lectin) foi ovicida (EC50 = 0.1 mg/mL) retardando o desenvolvimento larval da população de Aedes aegypti e larvicida (LC50 = 0.197mg/mL) contra o quarto estagio larval deste inseto.21-22 A lectina WSMoL interfere no desenvolvimento embrionário e na sobrevivência da larva ainda dentro do ovo do mosquito da dengue, bem como apresentou efeito estimulante sobre a oviposição em condições de laboratório e de campo simulado, é uma potencial candidata para uso no controle da população de A. aegypti em armadilhas de captura de ovos, uma vez que interfere na sobrevivência tanto dos ovos quando das larvas que vierem a eclodir.21-22 M. oleífera apresenta grande potencial com atividade larvicida. Segundo estudos de Santos et al. as lectinas isoladas da sementes deste vegetal promoveram a mortalidade de larvas de A.aegypti, podendo ser utilizado como inseticida natural, por ser capaz de interromper o ciclo biológico desses mosquitos. 67 1.5.4.1 Óleo essencial de Moringa oleifera Reda e Carneiro destacam em seus estudos que a M. oleifera Lam. é uma planta oleaginosa de ciclo perene, com potencialidade energética ainda não totalmente conhecida. Os óleos são substâncias insolúveis em água (hidrofóbicas) formadas predominantemente por ésteres de triacilgliceróis. Os óleos vegetais, representam um dos principais produtos extraídos de plantas da atualidade nos quais cerca de dois terços são usados em produtos alimentícios fazendo parte da dieta humana. 66 34 As análises de Barreto et al. nos óleos essenciais das folhas, flores e frutos de Moringa oleifera Lam., por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, identificaram os seguintes constituintes químicos: fitol (21,6%) e timol (9,6%) nas folhas, octadecano (27,4%) e ácido hexadecanóico (18,4%) nas flores e docosano (32,7%) e tetracosano (24,0%) nos frutos. Esses autores destacam que o estudo do óleo essencial das flores e frutos é recente, e relataram, pela primeira vez para o gênero Moringa, o isolamento da substância 4-hidroxifenil-acetonitrila, de poderosa capacidade antioxidante. 66 Ferreira et al. por meio de pesquisas avaliaram o potencial larvicida do extrato aquoso da semente frente ao mosquito A. aegypti A solução inicial possuía uma concentração de 26% m/m. Uma concentração de 5200 mg.L-1 foi responsável pela mortalidade de 99,2% das larvas no 3º estágio de desenvolvimento, sendo a mortalidade diretamente proporcional à concentração testada. Em termos de prevenção à eclosão, nenhuma das concentrações testadas mostrou-se eficaz. Entretanto, 100% das larvas recém eclodidas morreram antes de atingir o 2º estágio de desenvolvimento. A atividade larvicida extinguiu-se após o aquecimento do extrato a 80°C por 10 min, o que pode ser um indicativo de que os compostos tóxicos sejam proteínas.68 Figura 5: Flores da Moringa oleifera Fonte: http://www.prota4u.org/protav8.asp?p=Moringa+oleifera 35 2 MÉTODO Foram usados artigos científicos e monografias e dissertações de mestrado e doutorado por meio da palavra chave avaliação da atividade larvícida de extratos vegetais frente ao aedes aegypti, nas bases de dados da internet como Scielo, Google Acadêmico, Pub Med., e revistas nacionais e internacionais pertinentes ao tema. 36 3 DISCUSSÃO Há uma estimativa que por volta de 50 a 100 milhões de pessoas são infectadas com o vírus da dengue anualmente em mais de 100 países de todos os continentes, com exceção da Europa e da Antártida. Destes casos, cerca de 550 mil necessitam de hospitalização e pelo menos vinte mil evoluem ao óbito.16 Segundo estimativas do Ministério da Saúde (MS) a incidência da doença no Brasil tomou proporções de epidemia nos últimos anos, chegando a atingir por volta de 1.500 milhões de casos relatados, na busca por diminuir a quantidade de casos, o Ministério da Saúde em conjunto com os centros de saúdes locais tem feito campanhas praticamente quase que o ano inteiro, buscando a erradicação de focos de Aedes aegypti.69 No ano de 2012 foi registrado mais de 120.000 casos de dengue pelo Programa Regional da dengue da OPAS/OMS, com 1.855 casos graves e 40 óbitos, tendo sido verificada a manifestação dos quatro sorotipos de vírus. Advento que tornou a dengue em um problema contemporâneo e urgente para o sistema sanitário. Dentre todos os países da Américas o Brasil é o país mais afetado em número de casos de dengue, sendo responsável por, aproximadamente, 70% dos casos notificados. A circulação concomitante dos três sorotipos na maioria dos estados tem aumentado o número de casos graves e a taxa de hospitalização.13,16 Hoje a dengue é uma das senão mais preocupantes enfermidades, tendo sido endêmica em 112 países. A doença é incidente em países tropicais e subtropicais, onde latitudes e longitudes, assim como as condições do meio, tais como temperatura e umidade, favorecem o desenvolvimento e a proliferação do mosquito vetor.15 Segundo levantamento de Fradin e Day o aumento da incidência da dengue tem levado a busca por novos métodos de controle do mosquito vetor. Para Maciel et al. os mosquitos transmitem doenças para aproximadamente 700 milhões de pessoas anualmente.As estratégias de controle das doenças transmissíveis por vetores são complexas, principalmente quando associadas à existência de reservatórios domésticos e silvestres e aos aspectos ambientais. 59 A utilização em massa dos inseticidas sintéticos vem preocupando pela resistência dos insetos cada vez mais, em decorrência disso o uso de inseticidas botânicos vem são visto como vantajosa em relação aos outros, pois esses são provenientes de recursos renováveis e por ser uma mistura de vários compostos ativos agindo sinergicamente, a resistência pode 37 ocorrer mais lentamente. Além disso, esses fitoquímicos não colocam em risco outros organismos.26 Utilizar as plantas como repelentes de insetos são citada por mais de décadas, e desde o início do século XX, vários produtos naturais foram utilizados para esse fim, em sua maioria são utilizados na forma de óleos extraídos dos componentes da planta, destacando-se óleos extraídos de vegetais, os chamados óleos essenciais, produtos aromáticos de metabolismo secundário das plantas, que podendo ser encontrados em várias partes destas.39 Vários estudos evidenciaram que os óleos de Cymbopogon winterianus (citronela) resultaram em repelência expressiva, com índices médios de proteção acima de 98%. A partir de alguns estudos a atividade larvicida da citronela foi avaliada, e em 24 horas de exposição houve uma alta taxa de mortalidade das larvas do A. aegypti, abrindo assim margem para mais estudos sobre o uso larvicida deste óleo. 10,13 Por outro lado, muitas pesquisas feitas com o óleo essencial da Azadirachta indica (Neem), destacam a azadiractina como principal principio ativo e demonstraram que tem ação larvicida sobre A. aegypti. A azadiractina é reportada como indutora de alterações fisiológicas irreversíveis neste inseto, e uma mortalidade de 64,0%, induzindo um comprometimento no desenvolvimento de larvas de A. aegypti. A azadiractina bloqueia a síntese e liberação de ecdisona, impede a liberação da exúvia e deteriora a cutícula, além de bloquear os receptores proteicos do ecditeroide. Isso ocasiona a inibição do crescimento, má formação, esterilidade e morte das larvas.20 Segundo Naqvi et al. em experimentos realizados com Neem contra larvas de A.aegypti permitiram notar que muitas das larvas morreram e as que sobreviveram deram origem a pupas melanizadas. Houve contração geral do corpo larval e as pupas apresentaram o abdômen reduzido. Alguns adultos não foram capazes de emergir e os que foram capazes apresentaram anomalias nas pernas, abdômen e asas reduzidas. 59 Nas pesquisas de Martinez e Emden nas maiores concentrações, (102%, 5x10-2%, 101%, 1%) a sobrevivência das larvas diferiu estatisticamente do controle. Os autores reforçam a teoria de que a azadiractina afeta o sistema neurossecretor e é mais provável que mate o inseto por perturbar a regulação do hormônio da ecdise e não pela sua toxicidade. 59 Por sua vez, o óleo da Lippia sidoides possui propriedade larvicida e seu principal ativo o Timol é capaz de induzir 100% de mortalidade em 90 minutos de exposição das larvas na concentração de 0,017%.53 Já no extrato de semente de Moringa oleifera contendo a lectina WSMoL (watersoluble M. oleifera lectin), pesquisas demonstraram uma ação larvicida o que proporcionou o 38 retardo no desenvolvimento larval do A. aegypti. A ação larvicida de WSMoL sobre larvas do mosquito da dengue estimulou a avaliação do seu efeito sobre uma população resistente a inseticidas organofosforado, bem como do potencial larvicida de cMoL. 22 Pesquisas de extrato aquoso de sementes de moringa apresentaram atividades larvicida e ovicida contra A. aegypti. Outros tecidos da moringa também constituem potenciais fontes de inseticidas, tendo o extrato da casca apresentado ação larvicida e adulticida contra os mosquitos vetores da filariose (Culex gelidus e Culex quinquefasciatus), enquanto extrato aquoso de flores de moringa contendo inibidor de protease induziu a mortalidade de larvas de Aedes aegypti no primeiro (L1), segundo (L2), terceiro (L3) e quarto (L4) estágios, sendo capaz de inibir a atividade de tripsina de larvas L4 em 98,6% após 5 horas de exposição.67 39 4 CONCLUSÃO A dengue é uma doença associada principalmente a sociedades de baixo poder aquisitivo e que assola a população da maior parte do planeta. As epidemias se sucedem, sem que medidas efetivas sejam tomadas para evitá-las. O mosquito está tão adaptado aos ambientes doméstico e urbano que resiste a larvicidas e inseticidas e, no primeiro voo, já é capaz de copular e infectar. O desenvolvimento de estratégias inovadoras, inteligentes e de fácil aplicação é necessário no combate e na prevenção da dengue, pois até o momento não existe vacina nem tratamento específico para a doença. Os estudos sobre a ação de plantas como larvicidas e repelentes do mosquito têm sido divulgados nos grandes centros de pesquisas, uma ação que pode trazer controle já na fase ovicida do mosquito. Como foi demonstrado nesta revisão de literatura no uso da ação ovicida e larvicida das plantas como Cymbopogon winterianus (Citronela), a Azadirachta indica (Neem), A Lippia sidoides (Alecrim-pimenta) e a Moringa Oleifera (Acácia branca ou Lírio branco). Apesar dos avanços na área de controle de insetos vetores, ainda há muitos impedimentos quanto ao uso desses métodos em âmbito comercial e nas campanhas de saúde pública. Muitas vezes por conta da escassez de experimentos científicos que determinem a toxidade destes produtos ao homem e a real possibilidade de sua comercialização, considerando que as pesquisas desenvolvidas até hoje objetivaram apenas a verificação da atividade larvicida desses produtos. 40 REFERÊNCIAS 1 OMS, Organização Mundial da Saúde. Dengue/Degue Hemorrhagic Fever Prevention and Control. New Delhi, WHO Regional Office for South-East Asia,2002:1-33. 2 Who,World Health Organization. Dengue bulletin: Situation of dengue/dengue haemorrhagic fever in SEA countries.2004. 3 Brasil MS, Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Vigilância Epidemiológica. Guia de vigilância Epidemiológica. 6º ed. Série A. Normas e Manuais Técnicos. Brasília: Ministério da Saúde, 2006. 4 Benseñor I. How Stuff Works - Como funciona a dengue. [doc. Online] Publicado em 09/05/2007 (atualizado em 09/05/2008). Disponível em: http://saude.hsw.uol.com.br/dengue.htm. 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