AÇÃO ANTIOXIDANTE DO RESVERATROL E ÁCIDO α

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AÇÃO ANTIOXIDANTE DO RESVERATROL E ÁCIDO α-LIPÓICO
NO PROCESSO OXIDATIVO INDUZIDO PELO METABÓLITO
DAPSONA-HIDROXILAMINA EM ERITRÓCITOS DE INDIVÍDUOS
SAUDÁVEIS in vitro
Rosyana de Fátima Vieira de Albuquerque
BELÉM-PA
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AÇÃO ANTIOXIDANTE DO RESVERATROL E ÁCIDO α-LIPÓICO NO
PROCESSO OXIDATIVO INDUZIDO PELO METABÓLITO DAPSONAHIDROXILAMINA EM ERITRÓCITOS DE INDIVÍDUOS SAUDÁVEIS in
vitro
Autor: Rosyana de Fátima Vieira de Albuquerque
Orientadora: Profa. Dra. Marta Chagas Monteiro
Co-orientadora: PhD. Lilian Lund Amado
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, área de
concentração Fármacos e Medicamentos, do Instituto de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará, como
requisito para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
BELÉM-PA
2013
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Biblioteca do Instituto de Ciências da Saúde – UFPA
Albuquerque, Rosyana de Fátima Vieira de.
Ação antioxidante do resveratrol e ácido α-lipóico no processo oxidativo induzido pelo
metabólito dds-noh em eritrócitos de indivíduos saudáveis in vitro / Rosyana de Fátima
Vieira de Albuquerque ; orientadora, Marta Chagas Monteiro, co- orientadora, Lilian Lund
Amado. — 2013
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da Saúde,
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Belém, 2013.
1.
1. Dapsona. 2. Hidroxilamina. 3. Hanseníase. 4. Resveratrol. 5. Ácido α-lipóico. 6.Estresse
Oxidativo. 7. Antioxidantes. I. Título.
.
CDD: 22. ed.: 541.39
ROSYANA DE FÁTIMA VIEIRA DE ALBUQUERQUE
AÇÃO ANTIOXIDANTE DO RESVERATROL E ÁCIDO α-LIPÓICO NO
PROCESSO OXIDATIVO INDUZIDO PELO METABÓLITO DAPSONAHIDROXILAMINA EM ERITRÓCITOS DE INDIVÍDUOS SAUDÁVEIS in
vitro
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, área de
concentração Fármacos e Medicamentos, do Instituto de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará, como
requisito para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Aprovado em:______/______/______
Banca Examinadora
____________________________________________________________
Prof. Dra. Marta Chagas Monteiro PPGCF/UFPA (Orientadora)
____________________________________________________________
Prof. Livre-Docente Sandro Percário PPGBAIP/UFPA
____________________________________________________________
Prof. Msc. Osmarina Pereira da Paixão e Silva FF/UFPA
AGRADECIMENTO
À Deus que se faz presentes em todos os momentos da minha vida
iluminando e me guiando sempre no caminho do bem.
À minha família, por acreditar em mim, e principalmente aos meus pais,
por incentivar as minhas escolhas, pela força para enfrentar os desafios, por
acreditar na minha capacidade e pelo amor em todos os momentos.
À profa. Marta pela orientação acadêmica, por ter acreditado em mim, por
todos os conhecimentos transmitidos, pelo incentivo e ajuda para desenvolver
este estudo.
A todas do laboratório de Microbiologia, em especial, Diane (exintegrante), Dani, Nivia, Mari, Carla, Kely, Fábio Chada e Fábio Oliveira por
sempre poder contar com vocês tanto para os assuntos do laboratório, das
técnicas, mas também pelas conversas e pelo apoio.
Ao prof. Eduardo, Carlos Barros, Jóse Luiz e as Profa. Osmarina e Lilian,
obrigada pela prestatividade e auxílio que possibilitou a realização dos
experimentos.
Àqueles amigos sempre dispostos a ouvir e ajudar, e que ao longo desta
convivência se tornaram amigos e confidentes: João e Dani
Aos meus queridos amigos farmacêuticos Tamyris, Jefferson, Flávia, e
Gregório pela ajuda em muitos momentos importantes e pela amizade construída
ao longo destes anos.
Ao meu amor, pelo carinho, paciência e compreensão nesta etapa
decisiva.
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e
ver a vida passar. É melhor tentar, ainda em
vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu
prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes
em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora
louco, que em conformidade viver.”
Martin Luther King
RESUMO
A dapsona (DDS), rifampicina e clofazimina constituem a poliquimioterapia para a
Hanseníase, a qual pode ser classificada para fins operacionais em: paucibacilar ou
multibacilar. Na clínica, as reações adversas ao medicamento, como metemoglobinemia e
anemia hemolítica frenquentemente observadas em pacientes hansenianos estão relacionadas
com o uso da DDS, sendo que a formação dos metabólitos N-hidroxilamina da DDS, como o
dapsona-hidroxilamina (DDS-NOH) são considerados os responsáveis por esta
hematotoxidade. Neste sentido, a fim de prevenir e atenuar a toxidade induzida pelo
metabólito DDS-NOH foi avaliada a ação protetora dos antioxidantes; Resveratrol (RSV) e
Ácido α-lipóico (ALA) em suspensões de eritrócitos humanos sadios expostos ao DDS-NOH
in vitro. O RSV é uma fitoalexina sintetizada na casca de uvas que apresenta propriedades
antioxidantes, cardioprotetoras e anti-inflamatórias. Enquanto, o ALA é um composto
sulfidrílico presente em células eucariotas que atua como cofator em diferentes
multicomplexos enzimáticos. Assim, a ação antioxidante destes compostos foram analisadas,
a partir da avaliação do percentual de formação de metemoglobina (MetHb) induzido em
eritrócitos após a exposição ao DDS-NOH em diferentes concentrações, os quais
primeiramente foram pré-tratados com RSV e /ou ALA em diferentes concentrações. Em
virtude, do efeito oxidativo do DDS-NOH avaliou-se a indução de espécies reativas de
oxigênio no meio intracelular através da técnica de citometria de fluxo utilizando a sonda 2’,
7’- diacetato de diclorodihidrofluoresceína e a atividade das enzimas catalase (CAT) e
superóxido dismutase (SOD). Mediante, a exposição das suspensões de eritrócitos humanos
ao DDS-NOH constatou-se que este efeito hematotóxico induzido foi dose-dependente, e ao
analisar o potencial redutor dos antioxidantes estudados, o pré-tratamento com RSV e ALA
(10 a 1000µM) foi capaz de atenuar o %MetHb induzido por DDS-NOH (2,5 a 7,5µg/mL), no
entanto, ao comparar o efeito redutor dos antioxidantes com o do azul de metileno, o único
antioxidante que foi tão eficaz quanto este composto foi o ALA (1000µM). O DDS-NOH (2,5
e 7,5µg/mL) induziu grande quantidade de espécies reativas de oxigênio em meio intracelular,
todavia estes radicais livres foram reduzidos quando na presença de RSV e ALA (100 e
1000µM), porém, dentre eles apenas o RSV (1000µM) foi eficiente na redução de radicais
livres induzidos por DDS-NOH na concentração 7,5µg/mL. As suspensões de eritrócitos
expostas ao DDS-NOH (2,5µg/mL) apresentaram redução na atividade da enzima CAT,
porém estas células quando pré-tratadas com o ALA (100µM) não apresentaram
comprometimento da atividade da enzima. Por outro lado, a atividade da SOD não foi alterada
mediante a exposição ao metabólito hidroxilamina. Mediante a obtenção destes dados pode-se
concluir que DDS-NOH está associado com surgimento de metemoglobinemia em pacientes
em uso da DDS, bem como apresenta efeito oxidativo sobre os eritrócitos e enzimas
eritrocitárias. Tais dados também demonstraram o potencial dos antioxidantes em relação à
prevenção e tratamento de efeitos hematotóxico induzido por este metabólito, enfatizando-se
o potencial antioxidande do ALA na MetHb e na depleção da CAT induzida por DDS-NOH,
bem como o potencial do RSV em atenuar a quantidade de radicais livres no meio
intracelular.
Palavras Chaves: Dapsona-Hidroxilamina; Hanseníase; Metemoglobina; Estresse
oxidativo; Resveratrol; Ácido α-lipóico; Antioxidantes
ABSTRACT
The dapsone (DDS), rifampicin and clofazimine are multidrug therapy for leprosy, which can
be classified to operational aims as: paucibacillary or multibacillary. At the clinic, the adverse
reactions to the medicine, as metheomoglobin and hemolitic anemia frequently observed in
leprosy patients are related with the use of DDS, and that the formation of metabolites Nhydroxylamine DDS, dapsone as hydroxylamine (DDS-NOH) are considered the responsible
for this blood toxicity. In this regard, in order to prevent and reduce the induced toxicity by
the metabolite DDS-NOH it was evaluated the protecting action of the antioxidants;
Resveratrol (RSV) and α-lipoic acid (ALA) in suspensions of erythrocytes exposed to healthy
human in vitro DDS-NOH. RSV is a phytoalexin synthesized in the skin of grapes which has
antioxidant, anti-inflammatory and cardioprotective. While the ALA is a sulfhydryl
compound present in eukaryotic cells that acts as a cofactor in various enzymatic
multicomplexes. Thus, the antioxidant action of these compounds were assessed from the
evaluation of the percentage of formation of methemoglobin (MetHb) induced in red blood
cells after exposure to the DDS-NOH different concentrations, which were first pretreated
with RSV and / or ALA in different concentrations.Under the effect of oxidative DDS-NOH,
it was evaluated the induction of reactive oxygen species intracellularly using the technique of
flow cytometry using the probe 2 ', 7'-diacetate diclorodihidrofluorescein and the activity of
catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD). Upon the display of human erythrocyte
suspensions to DDS-NOH, it was found that this induced blood toxic effect was dosedependent, and by analyzing the reducing potential of the antioxidants studied, pretreatment
with RSV and ALA (10 to 1000μM) was capable of alleviating the % MetHb DDS-induced
NOH (2.5 to 7.5 mg/ml). However, when comparing the reduction effect of antioxidants with
methylene blue, the only antioxidant which was as effective as this compound was ALA
(1000μM). The DDS-NOH (2.5 and 7.5 mg/ml) induced large amounts of reactive oxygen
species in the intracellular environment, however these free radicals were reduced in the
presence of RSV and ALA (100 and 1000μM), but among them only RSV (1000μM) was
effective in reducing free radicals induced by DDS-NOH concentration 7.5mg/ml. The
suspensions of erythrocytes exposed to DDS-NOH (2.5mg/ml) showed a reduction in the
activity of catalase, but these cells when pre-treated with ALA (100μM) had no impairment of
enzyme activity. On the other hand, the SOD activity was not altered by exposure to
hydroxylamine metabolite. By obtaining these data it can be concluded that DDS-NOH is
associated with the emergence of methemoglobinemia in patients using the DDS and presents
oxidative effect on erythrocytes and erythrocyte enzyme. These data also demonstrated the
potential relationship of antioxidants in the prevention and treatment of effects induced by this
blood toxic metabolite, emphasizing the potential of ALA in antioxidant MetHb and in the
depletion of DDS-induced CAT NOH, as well as the RSV potential in attenuating the amount
of free radicals in the intracellular environment.
KeyWords: Dapsone-Hydroxylamine; Leprosy; Methemoglobin; Oxidative stress;
Resveratrol; α-lipoic acid; Antioxidants
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Coeficiente de detecção de casos novos de hanseníase por 100.00 habitantes no
mundo, em janeiro de 2011. ..................................................................................................... 27
Figura 2: Fórmula estrutural da Dapsona esse fármaco possui grupo sulfonil (SO2) e grupo
arilamina (AR-NH2). ................................................................................................................ 29
Figura 3: Mecanismo de ação bacteriostático da Dapsona. ...................................................... 30
Figura 4:Estrutura da dapsona (DDS) e metabólitos DDS-NOH e MADDS-NOH (dapsonahidroxilamina e monoacetildapsona-hidroxilamina) ................................................................ 32
Figura 5: As vias de biotransformação da DDS: glicuronidação, N-acetilação e N-hidroxilação
e os seus metabólitos ................................................................................................................ 33
Figura 6: Atividade da G6PD na primeira fase da via das pentoses-fosfato ............................ 34
Figura 7: A hemoglobina consiste em um grupo prostético, heme, e o protéico ..................... 36
Figura 8: Representações da estrutura tetrapirrólica do grupo prostético heme....................... 36
Figura 9: Arranjo eletrônico que ocorre entre o Ferro do grupo heme e moléculas de oxigênio
.................................................................................................................................................. 37
Figura 10: Processo de oxidação do Fe2+ pela ligação ao O2, formando o Fe3+. ...................... 38
Figura 11: Representação esquemática do ciclo de formação da metemoglobina nos eritrócitos
a partir da indução DDS-NOH (dapsona hidroxilamina) ......................................................... 40
Figura 12: A via de Embden-Meyerhof e das pentoses-fosfato, responsáveis pela produção de
NADH e NADPH, respectivamente ......................................................................................... 41
Figura 13: Redução da metemoglobina para hemoglobina ocorre pelo processo de NADHcitocromo b5 redutase .............................................................................................................. 41
Figura 14: As prováveis vias de redução da metemoglobina, sendo que a principal via
fisiológica é a do citocromo b5 redutase. ................................................................................. 42
Figura 15: Representação da membrana eritrocitária ............................................................... 44
Figura 16: Mecanismo de proteção do sistema antioxidante dos eritrócitos ............................ 47
Figura 17: Estruturas da glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) .................................. 48
Figura 18: Modelo celular do eritrócito .................................................................................... 50
Figura 19: Fórmula estrutural do trans-resveratrol .................................................................. 51
Figura 20: Síntese do Resveratrol em cascas de uva ................................................................ 52
Figura 21: A estrutura química do trans-resveratrol e cis-resveratrol...................................... 52
Figura 22: Sítio de ligação da Hb e RSV ................................................................................. 54
Figura 23: Estrutura química do Ácido α-lipóico e a estrutura química da sua forma reduzida
(DHLA) .................................................................................................................................... 55
Figura 24: Esquema do experimento de incubação da suspensão de eritrócitos ...................... 60
Figura 25: Esquema do experimento de pré-incubação da suspensão de eritrócitos................ 61
Figura 26: Esquema da técnica de metemoglobina .................................................................. 63
Figura 27: Esquema da avaliação da produção de espécies reativas pela oxidação química de
DCFH. ...................................................................................................................................... 65
Figura 28: Percentual de metemoglobina em suspensão de eritrócitos normais expostos ao
DDS-NOH ................................................................................................................................ 67
Figura 29: Percentual de metemoglobina induzida por diferentes concentrações de dapsonahidroxilamina ............................................................................................................................ 69
Figura 30: Percentual de metemoglobina induzida por diferentes concentrações de dapsonahidroxilamina (2,5; 5,0 e 7,5 µg/mL) em suspensão de eritrócitos normais que foram prétratados com ácido α-lipóico (10; 100; 200 e 1000 µM) por 60 min a 37°C in vitro............... 70
Figura 31: Percentual de metemoglobina induzida por dapsona-hidroxilamina (2,5 µg/mL) em
suspensão de eritrócitos normais que foram pré-tratados com resveratrol (100µM) por
diferentes tempos (30, 60, 90 e 120 min). ................................................................................ 71
Figura 32: Percentual de metemoglobina induzida por diferentes concentrações de dapsonahidroxilamina (2,5; 5,0 e 7,5 µg/mL) em suspensão de eritrócitos normais que foram prétratados com azul de metileno (15ng/mL) por 30 min a 37°C in vitro..................................... 72
Figura 33: Comparação das médias do percentual de metemoglobina obtidas em suspensão de
eritrócitos normais pré-incubados com azul de metileno (15ng/mL) ou com resveratrol
(100µM)/ ácido α-lipóico (1000µM) in vitro. .......................................................................... 74
Figura 34: O efeito dapsona-hidroxilamina (2,5 e 7,5 µg/mL) na produção de ERO em
suspensão de eritrócitos. ........................................................................................................... 76
Figura 35: O efeito do dapsona-hidroxilamina (2,5 µg/mL) sobre a atividade da catalase em
suspensão de eritrócitos pré-incubados com resveratrol e ácido α-lipóico.. ............................ 78
Figura 36: O efeito do dapsona-hidroxilamina (2,5µg/mL) sobre a atividade da superóxido
dismutase em suspensão de eritrócitos pré-incubados com resveratrol e ácido α-lipóico. ...... 80
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Esquema da poliquimioterapia para hanseníase preconizada pela OMS para o
tratamento de pacientes adultos. ............................................................................................... 28
LISTA DE ABREVIATURAS
2,3-DPG-2,3- Difosfoglicerato
ALA- Ácido α-lipóico
ARE-Elemento de resposta ao antioxidante
Ar-NH2- grupo arilamina ou amina aromática
Asp- aminoácido Ácido aspártico
ATP- trifosfato de adenosina
Ca2+- íon de cálcio
CAT- enzima catalase
CFZ- Clofazimina
Cl-- íons cloro
CO2- Gás carbônico
CYP2C9- Citocromo P450 2C9
DCFH-DA- 2’,7’-diclorofluoresceína diacetato
DDS- Dapsona
DDS-NO- Dapsona nitrosobenzeno
DDS-NOH: Dapsona-hidroxilamina
DHLA- ácido diidrolipóico
DNPH- 2,4 dinitrofenilhidrazina
DTNB- ácido 5,5’- ditio-bis (2-nitrobenzóico)
Emáx- efeito máximo
ERN- Espécie reativa de nitrogênio
ERO- Espécies reativas de oxigênio
FAD- Flavina adenina dinucleotídeo
FADH- Flavina adenina dinucleotídeo( Forma reduzida)
Fe2+- íons ferroso
Fe3+- íons férrico
G6P- 6-fosfogluconolactona
G6PD-glicose 6-fosfato desidrogenase
GPx- glutationa peroxidase
GR- Glutationa redutase
GSH- Glutationa reduzida
GSSG- Glutationa oxidada
H2NOH- grupo funcional hidroxilamina
H2O- água
H2O2- Peróxido de hidrogênio
Hb- hemoglobina
HClO- ácido hipocloroso
HCO3- íon bicarbonato
HIV- Vírus de imunodeficiência humana
HNO2- Ácido nitroso
Ig A- Imunoglobulina A
K+- íon potássio
KCl-Cloreto de potássio
MADDS-OH- Monoacetil dapsona-hidroxilamina
MB-Multibacilar
MetHb- metemoglobina
N2O3- óxido nitroso
Na+- íon de sódio
NaCl- cloreto de sódio
NADH- Nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida do NAD+)
NADP- Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NADPH- Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (Forma reduzida NADP)
NO- óxido nítrico
Nrf2: Fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2
NO2-Nitritos
NO3-Nitratos
O2- Oxigênio molecular
O2-●- ânion radical superóxido
OH- grupo Hidroxila
OH-●- radical hidroxila
OMS- Organização Mundial de Saúde
ONOO- Ânion peroxinitrito
PABA- ácido Para-aminobenzóico
PB- Paucibacilar
PBS- Tampão fostato salina
PC- proteínas carboniladas
pH- potencial hidrogeniônico
PMRS- sistema redox situado na face externa da membrana plasmática
PQT- Poliquimioterapia
Pro- aminoácido Prolina
PS-Fosfatidilserina
R- estado conformacional da hemoglobina com elevada afinidade pelo oxigênio
RAM- Reação adversa ao medicamento
RMP- Rifampicina
RO●- Radical alcoxila
ROO●- Radical peroxila
rpm- rotações por minuto
RSV- Resveratrol
SO2-Grupo funcional sulfonil
SOD- enzima superóxido dismutase
SDS-PAGE- Poliacrilamina-dodecil sulfato de sódio
SH- grupo sulfidrila
T- estado conformacional da hemoglobina com baixa afinidade pelo oxigênio
T-BHP- terc- butil-hidroperóxido
Thr- aminoácido Treonina
°C- graus Celsius
h-hora
λ- comprimento de onda
M-mol
µM- micromol
µL- microlitro
µg/mL- micrograma por mililitro Min- minuto
mg- miligrama
mg/Kg- miligrama por quilograma
mg/L- miligrama por litro
mM- milimolar
ng/mL- nanograma por mililitro
nm- nanomêtro
%MetHb- percentual de metemoglobina
Π- pi
Seg- segundo
σ- sigma
U/mg- unidade por miligrama
UI/mL- Unidades internacionais por mililitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................................................................................... 23
2 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................................................................................................. 26
2.1 Hanseníase e Poliquimioterapia ......................................................................................................................................... 26
2.2 Dapsona e Dapsona-hidroxilamina (DDS-NOH) .......................................................................................................... 29
2.3 Hemoglobina (HB) e Metemoglobina (MetHb) ............................................................................................................ 35
2.4 Eritrócitos humanos ................................................................................................................................................................. 43
2.4.1 MEMBRANA ERITROCITÁRIA ..................................................................................................................................... 43
2.4.2 METABOLISMO ERITROCITÁRIO .............................................................................................................................. 45
2.4.3 SISTEMA ANTIOXIDANTE DO ERITRÓCITO ......................................................................................................... 46
2.4.4 O ERITRÓCITO COMO MODELO EXPERIMENTAL ............................................................................................. 49
2.5 Antioxidantes .............................................................................................................................................................................. 50
2.5.1 RESVERATROL (RSV) ..................................................................................................................................................... 51
2.5.2 ÁCIDO Α-LIPÓICO (ALA) ................................................................................................................................................ 54
3 OBJETIVOS ............................................................................................................................................................................................ 57
3.1 Objetivo Geral.............................................................................................................................................................................. 57
3.2 Objetivos Específicos ............................................................................................................................................................... 57
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................................................................................. 58
4.1 Material .......................................................................................................................................................................................... 58
4.1.1 AMOSTRA BIOLÓGICA .................................................................................................................................................... 58
4.1.2 REAGENTES E SOLVENTES .......................................................................................................................................... 58
4.2 Métodos ......................................................................................................................................................................................... 58
4.2.1 COLETA DE AMOSTRAS SANGUÍNEAS .................................................................................................................... 58
4.2.2 ISOLAMENTO DE ERITRÓCITOS ................................................................................................................................ 59
4.2.3 TRATAMENTO DOS ERITRÓCITOS ........................................................................................................................... 59
4.2.4 DETERMINAÇÃO DE METEMOGLOBINA ............................................................................................................... 61
4.2.5 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS EM ERITRÓCITOS .............................................. 64
4.2.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA CATALASE ............................................................................................... 65
4.2.7 PROTEÍNAS TOTAIS ........................................................................................................................................................ 66
4.2.8 DETERMINAÇÃO DA SUPERÓXIDO DISMUTASE ............................................................................................... 66
4.2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................................................................. 66
5 RESULTADOS ....................................................................................................................................................................................... 67
5.1 Curva dose-resposta do DDS-NOH em eritrócitos in vitro ...................................................................................... 67
5.2 Efeito do Resveratrol e do Ácido α-Lipóico na metemoglobina induzida pelo DDS-NOH em eritrócitos
normais in vitro .................................................................................................................................................................................. 68
5.3 Curva temporal da pré-incubação do Resveratrol em eritrócitos expostos a DDS-NOH in vitro........... 71
5.4 Efeitos do azul de metileno na metemoglobina induzida pelo DDS-NOH em eritrócitos normais in
vitro ......................................................................................................................................................................................................... 72
5.5 Detecção de ERO intracelulares em suspensões de eritrócitos pré-incubados com RSV/ALA e
incubados com DDS-NOH in vitro .............................................................................................................................................. 75
5.6 Atividade da Catalase (CAT) em suspensões de eritrócitos pré-incubados com RSV/ALA e incubados
com DDS-NOH in vitro ..................................................................................................................................................................... 77
5.7 Atividade da SOD em suspensões de eritrócitos pré-incubados com RSV/ALA e incubados com DDSNOH in vitro ......................................................................................................................................................................................... 79
6 DISCUSSÃO ............................................................................................................................................................................................ 81
7 CONCLUSÕES ....................................................................................................................................................................................... 91
23
1 INTRODUÇÃO
A dapsona (4,4’-diaminodifenil-sulfona) ou DDS é o fármaco utilizado na
poliquimioterapia da hanseníase (VADHER e LALLJEE, 1992), no tratamento de malária,
(SHANKS et al. 1992) nos casos de resistência a cloroquina (WOZEL, 1989) e na malária
complicada ocasionada por Plasmodium falciparum (AMUKOYE et al.1997).
Esta sulfona bacteriostática é utilizada como fármaco de segunda escolha para
pneumonia ocasionada por Pneumocystis carinii (SANGIOLO et al. 2005) e
para
quimioterapia da encefalite toxoplásmica (LEE et al. 1989; TORRES et al. 1993) ambos em
pacientes HIV – positivo. É também em casos de dermatite herpetiforme, dermatose por IgA e
em diversas doenças de pele (ZHU e STILLER, 2001) atuando como um agente
antiinflamatório ao inibir, principalmente a aderência dos neutrófilos (BOOTH et al. 1992;
BOZEMAN et al. 1992; THUONG-NGUYEN et al. 1993). Por outro lado, o mecanismo de
ação bacteriostático baseia-se na inibição da síntese bacteriana que ocorre pela diminuição da
produção do ácido fólico, uma vez que há antagonismo competitivo entre a DDS e o ácido
para-aminobenzóico (PABA) pelo sítio ativo de dihidropteroato sintetase (COLEMAN, 1993;
KWADIJK e TORAÑO, 2002; ANNIGERI et al. 2007).
A partir da década de 50, a DDS foi considerada o fármaco de primeira escolha para o
tratamento da hanseníase, no entanto a monoterapia desta doença infectocontagiosa se
apresentava como a principal causa de resistência do Micobacterium leprae ao medicamento
(DHARMENDRA, 1994). Assim, a partir da década de 80, a Organização Mundial de Saúde
(OMS) padronizou a poliquimioterapia para Hanseníase, composta por rifampicina (RMP),
DDS e clofazimina (CFZ; NOORDEEN, 2000), que são utilizados no tratamento padrão das
formas multibacilares e paucibacilares da hanseníase, sendo que para cada forma há um
esquema terapêutico (BRASIL, 2010).
Na clínica a DDS, mesmo em baixas doses diárias de 100mg é o principal fármaco
responsável por reações adversas (RAM) presentes em pacientes hansenianos (COLEMAN e
TINGLE, 1992), visto que, a maior parte dos pacientes apresenta alterações hematológicas,
devido a isto, o uso da DDS torna-se limitado nestes pacientes (DEGOWIN et al. 1966;
COLEMAN, 1995).
De acordo com Lee e Nashed (2003), as principais RAM dose dependente provocadas
pela DDS são a anemia e metemoglobinemia. Sendo que, as reações idiossincrásicas mais
citadas são: agranulocitose, anemia aplásica, algumas reações cutâneas e a síndrome da
sulfona (febre, mal-estar, dermatite, disfunção hepática, linfademopatia e outros). Blum et al.
24
(1992) mostraram também que pacientes em tratamento com a DDS apresentaram um quadro
anêmico significativo que culminou na redução do hematócrito. Vyas et al. (2005) citam a
hipótese que as RAM estão diretamente relacionadas com a presença do grupo funcional
hidroxilamina (NHOH) na molécula do metabólito da DDS, o dapsona-hidroxilamina (DDSNOH).
Estudos farmacocinéticos realizados por Winter et al. (2000) mostraram que a DDS é
metabolizada no homem especialmente, pelas vias de biotransformação; N-acetilação e Nhidroxilação através da isoforma do citocromo P450, a CYP2C9. Entretanto, a N-hidroxilação
forma o metabólito dapsona-hidroxilamina (DDS-NOH ou DDS-NHOH) que é considerado o
responsável por induzir metemoglobinemia em pacientes utilizando DDS (ISRAILI et al.
1973; SCHIFF et al. 2006) além de induzir a remoção de eritrócitos em ratos (GROSSMAN
et al., 1995; McMILLAN et al. 1995) e alteração morfológica nos eritrócitos humanos
(McMILLAN et al. 1995).
Conforme Bradshaw et al. (1997), o DDS-NOH quando em contato com os eritrócitos
realizam um ciclo de oxidação-redução com a oxihemoglobina e com moléculas de oxigênio
(O2), formando metemoglobina (MetHb) e ERO, respectivamente. A MetHb é formada
naturalmente quando íons ferroso (Fe2+) são oxidados para íons férrico (Fe3+), podendo ser
induzida por fármacos como DDS, rifampicina, clofazimina, primaquina, benzocaína e
sulfonamidas (REHMAN, 2001). A formação de MetHb ocasiona a deficiência do transporte
O2 aos tecidos, visto que este gás não consegue se ligar aos íons férrico comprometendo desta
maneira o transporte dele pelos glóbulos vermelhos.
Estudos de Bordin et al. (2010) indicam que o DDS-NOH induz alterações
progressivas nos eritrócitos, inicialmente pelo domínio citosólico das proteínas de membrana
dos eritrócitos, a banda 3, sendo observada formação de MetHb e o comprometimento da
atividade das proteínas tirosina quinase e das fosfatases. Além disso, a DDS-NOH também
induz a formação de agregados da banda 3 na membrana eritrocitária.
Desta forma, pesquisas com compostos antioxidantes que propiciem redução dos
efeitos tóxicos associados ao uso da DDS, ou do seu metabólito DDS-NOH são de certa
forma promissores para uma adesão segura ao tratamento. Portanto, objetivando a melhora da
adesão ao uso da DDS é que várias terapias vêm sendo estudadas, tais como o oxigênio
hiperbárico e o ácido ascórbico (O'DONOHUE et al. 1980; BORAN et al. 2008; ELHUSSEINI e AZAROV, 2010). Bergamaschi et al. (2011) mostraram que o uso de
curcumina, um polifenol com propriedades anti-inflamatória e antioxidante, nas doses
25
0,02mg/kg e 0,1mg/kg diminuiu significativamente a MetHb induzida por DDS em ratos
(TAYYEM et al. 2006).
Nos últimos anos têm-se estudado muitos compostos antioxidantes, tais como, o ácido
α-lipóico (ALA) e Resveratrol (RSV). O ácido α-lipóico (ácido 1,2-ditiolano-3-pentanóico ALA) é um composto sulfidrílico, naturalmente encontrado em praticamente todas as espécies
vegetais e animais, em células procariontes e eucariontes (TEICHERT et al. 2005). Por outro
lado, o RSV (3,4’,5-Trihidroestilbeno) é um polifenol comumente encontrado em bagas, casca
de uvas e amendoim apresentando ação antifúngica nestes alimentos ( JANG et al. 2001;
SIGNORELLI e GHIDONI, 2005). Além de apresentar atividades biológicas como, antiinflamatório e antitumoral (VIDAVALUR et al. 2006). Entretanto, também existem estudos
que relataram interação do RSV com a hemoglobina (Hb) através da ligação das três
hidroxilas desse estilbeno com as cadeias α dos aminoácidos Pro95, Thr134 e Asp126 da Hb
formando pontes de hidrogênio, o que favorece a proteção da cavidade central da Hb contra a
ação de agentes oxidantes (ZHONG et al. 2007).
Galtieri et al. (2010) demonstraram que o RSV também foi capaz de diminuir a
oxidação da Hb mostrando um potente efeito redutor, uma vez que este composto interage
com a Hb deslocando o estado conformacional da mesma de T para R, sendo o estado R, o de
maior afinidade ao O2 sugerindo que o RSV apresenta papel estabilizante na Hb, protegendoa de elevados níveis de oxidação. Com relação à ação do ALA sobre efeitos oxidativos da
DDS, Coleman e Walker (2000) mostraram que este composto reduz a metemoglobinemia
induzida pelo metabólito monoacetil dapsona-hidroxilamina (MADDS-NOH).
Portanto, estudos subsequentes com o RSV e com ALA podem demonstrar possíveis
alternativas terapêuticas em casos de metemoglobina e danos em eritrócitos, podendo ser
utilizados como prováveis e seguros inibidores da toxidade induzida em eritrócitos
observados em pacientes com hanseníase em uso da poliquimioterapia (PQT). Sugerindo-se, a
importância de avaliar o efeito destes potentes antioxidante na MetHb e nos danos oxidativos
em eritrócitos induzida pela DDS-NOH em modelo in vitro.
26
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Hanseníase e Poliquimioterapia
A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa e crônica, causada pelo bacilo álcoolácido resistente denominado Mycobacterium leprae. A transmissão ocorre a partir da
exposição prolongada a secreções nasais ou orais de pacientes doentes e sem tratamento,
contudo há outras formas menos relevantes como: o contato com a pele lesionada por meio
das soluções de continuidade, transmissão congênita (DUNCAN et al. 1983) e inoculação
cutânea com objetos contaminados (PORRIT e OLSEN, 1947).
O agente etiológico
responsável por esta patologia apresenta alta infectividade e baixa patogenicidade, e em
virtude disso o processo de evolução da doença varia normalmente 2 a 3 anos (REA e
MODLIN, 2008) comprometendo mais comumente a pele e nervos periféricos (SUZUKI et
al. 2012), no entanto as manifestações clínicas dependem principalmente da imunidade celular
do hospedeiro.
De acordo com a resposta imunológica específica ao bacilo, a infecção evolui de
diversas maneiras, portanto OMS (1982) propôs uma classificação operacional para fins de
tratamento, em que os pacientes com hanseníase são classificados em paucibacilares (PB) e
multibacilares (MB). Os PB apresentam até cinco lesões de pele, que podem estar distribuídas
assimetricamente pelo corpo, apenas um tronco nervoso comprometido e baixa carga de
bacilos, o que explica o exame baciloscópico negativo, por outro lado, os multibacilares (MB)
apresentam mais de cinco lesões de pele distribuídas de forma simétrica pelo corpo, mais de
um tronco nervoso acometido e a alta carga de bacilos, o que justifica a baciloscopia positiva
(SOUZA, 1997).
Essa doença é de notificação compulsória e de investigação obrigatória em todo
território nacional (BRASIL, 2005). Segundo OMS (2010), a hanseníase continua a ser um
importante problema de saúde em todo o mundo, dentre 1 em cada 20 pessoas (5%) exposta a
M. leprae é capaz de desenvolver a doença (WOROBEC, 2012), a figura 1 mostra que o
coeficiente de detecção de casos novos hanseníase são mais acentuados na Índia, Brasil,
Nepal e Butão.
27
Figura 1: Coeficiente de detecção de casos novos de hanseníase por 100.00 habitantes no mundo, em
janeiro de 2011. Fonte: OMS (2011)
No Brasil, os coeficientes de detecção de casos novos registrados nos estados
brasileiros evidenciam a sua importância na região Norte, a qual apresentou nos sete anos um
coeficiente médio de 69,40/100.000 habitantes, com valores situados entre 54,25/100.000, o
mais baixo, registrado em 2007, e 78,01/100.000, o mais alto, correspondente ao ano de 2003
(OMS, 2010). Dados do Sistema de Informação de Agravos de notificação do Ministério da
Saúde (Sinan/SVS/MS, 2009) mostram que o Pará é líder de notificações de hanseníase no
país, visto que no ano de 2008 foram registrados 4.595 casos da doença e em 2009, registrouse 4.057 notificações (Sinan/SVS/MS, 2010). Em 2010, o Estado do Pará ocupou o segundo
lugar com 3.138 casos novos, perdendo apenas para o Estado do Maranhão (Sinan/SVS/MS,
2010).
No entanto, a partir de 1991, o número de notificações foi reduzindo no Brasil, devido
à poliquimioterapia (PQT) ser implantada em massa em todo o país, entre 2001 e 2007 houve
uma redução na taxa de prevalência que variou de 26,61 para 21,08 pacientes em cada
100.000 habitantes, respectivamente (BRASIL, 2008). Entretanto, apesar do desenvolvimento
econômico, a expansão da saúde pública e os esforços do programa de controle da hanseníase
nos últimos anos, esta doença não foi eliminada e novos casos ainda estão sendo detectados
28
(PENNA et al, 2009). Um dos fatores essenciais na eliminação e no controle desta doença
como problema de saúde pública é o tratamento com PQT (BRASIL, 2005).
Até o início da década de 80, a Dapsona era o único fármaco de escolha para o
tratamento da hanseníase, porém, o emprego da monoterapia foi a principal causa do
desenvolvimento de resistência ao medicamento. Em virtude deste fato, a OMS passou a
recomendar a PQT, como esquema terapêutico apropriado para o controle e cura da doença
(CAMBAU et al. 1997).
Na Hanseníase, a PQT é administrada de acordo com a classificação operacional do
doente em paucibacilar ou multibacilar. O esquema-padrão consiste na combinação de três
princípios ativos: a Rifampicina (única bactericida do esquema padrão), Dapsona
(quimioterápico bacteriostático) e Clofazimina (corante fenazínico, bacteriostático contra o
bacilo de hansen) (BRASIL, 2002).
O esquema terapêutico da hanseníase preconizado para adultos pela Organização
Mundial da saúde está representado no quadro abaixo:
MEDICAMENTO
FORMAS CLÍNICAS
PAUCIBACILAR
(PB)
DAPSONA (DDS)
100mg DOSE
SUPERVISIONADA
+
100mg/DIA
AUTOADMINISTRADA
RIFAMPICINA (RFM)
600mg, UMA VEZ POR
MÊS, SUPERVISIONADA
(MB)
SUPERVISIONADA
+
100mg/DIA AUTOADMINISTRADA
(CFZ)
-
DURAÇÃO DO
TRATAMENTO
6 DOSES MENSAIS
DE RIFAMPICINA
SUPERVISIONADA
300 mg, UMA VEZ POR
100mg DOSE
MULTIBACILAR
CLOFAZIMINA
MÊS,
600mg, UMA VEZ POR
MÊS, SUPERVISIONADA
SUPERVISIONADA
+
12 DOSES
MENSAIS DE
RIFAMPICINA
SUPERVISIONADA
50mg/DIA, AUTOADMINISTRADA
Fonte: Adaptado de BRASIL (2009).
Quadro 1: Esquema da poliquimioterapia para hanseníase preconizada pela OMS para o tratamento de pacientes adultos.
A utilização desta associação medicamentosa permitiu um controle mais efetivo na
transmissão e evolução da doença (MORAES et al. 2006), apesar da eficácia da PQT, existem
algumas limitações durante sua utilização, uma vez que os pacientes podem apresentar
algumas RAM, dentre elas: anemia hemolítica, metemoglobinemia, agranulocitose,
29
trombocitopenia,
icterícia,
problemas
gastrointestinais,
fotossensibilidade,
hepatite,
(TALHARI e NEVES, 1997), bem como a duração prolongada do tratamento pode ocasionar
a não aderência e até abandono do tratamento (CELLONA et al. 2003; MOREL 2004;
PENNA et al. 2011).
Dentre os fármacos empregados na PQT da hanseníase, a dapsona é a principal
responsável por ocasionar anemia hemolítica, efeito adverso mais frequente nos pacientes
(GONÇALVES et al, 2012). Estudo publicado por Goulart et al, (2002) constatou que a causa
da maioria das reações adversas que mais acometiam pacientes com hanseníase em tratamento
com poliquimioterápico no Centro de Saúde da Universidade Federal de Uberlândia no
período de 1995 à 2000, relacionava-se ao uso da Dapsona (80% dos casos), onde as maiores
intercorrências atribuídas a este fármaco consistiam principalmente de casos de anemia
hemolítica, gastrite e metemoglobinemia.
2.2 Dapsona e Dapsona-hidroxilamina (DDS-NOH)
A DDS é utilizada no tratamento de Hanseníase (Figura 2) (DHOPLE, 1999), bem
como em outras doenças que acometem a pele como: dermatite herpetiforme, acne conglobata
e psoríase pustulosa (THUONG-NGUYEN et al, 1993), e em casos de infecções oportunistas,
causadas por P.carinii e Toxoplasma gondii, em pacientes imunodeprimidos (ZHU e
STILLER, 2001).
Figura 2: Fórmula estrutural da Dapsona, esse fármaco possui grupo sulfonil (SO 2 ) e grupo
arilamina (AR-NH2). Fonte: Monteiro et al, 2012
O mecanismo de ação bacteriostático da DDS consiste na inibição da síntese do
ácido fólico pelas bactérias e protozoários, devido à competição com o ácido para-
30
aminobenzóico pelo sítio ativo da enzima dihidropteroato sintetase (Figura 3),
comprometendo consequentemente a síntese de purinas e a formação de RNA e DNA
(WOLVERTON, 1992; COLEMAN, 1993; FARHI et al. 2005). Cerca de 80 a 85% do
fármaco é absorvido no trato gastrintestinal apresentando distribuição uniforme em todos os
tecidos do organismo, contudo, tende a se depositar na pele, músculos e especialmente no
fígado e rins. Esse fármaco atravessa a barreira hematoencefálica e a placenta, sendo parte
excretada no leite materno (PETERS et al. 1975; EDSTEIN et al. 1986; GATTI et al. 1997;
WOLF et al. 2000; PANIKER e LEVINE, 2001). Aproximadamente, 70% DDS encontra-se
ligada as proteínas plasmáticas, com concentração plasmática variando entre 0,4 a 1,2 mg/L,
após 24 h da ingestão de 100 mg do fármaco (ELLARD, 1966; SHEPARD, 1976; ZUIDEMA
et al. 1986).
Figura 3: Mecanismo de ação bacteriostático da Dapsona. Fonte: Adaptado de Farhi et al. 2005
Conforme, Tingle et al. (1997) após a absorção a DDS é transportada pela circulação
portal para o fígado, local onde é metabolizada pelas vias de N-hidroxilação, N-acetilação ou
glicuronidação, grande parte da DDS e seus metabólitos são conjugados com ácido
glicurônico (UDP), através da ação da enzima UDP-glicuronosiltransferase (UGTs), sendo
esses conjugados glicuronídeos excretados através da urina e bílis. Estudo de Zimmerman
(1999) mostraram que a frequência de doenças no fígado associadas com DDS é de cerca de
5%, quando administrado isoladamente, mas a incidência de lesão hepática por DDS
31
aumentou até 40% quando a droga era co-administrada com Trimetoprim para pacientes com
AIDS.
A N-acetilação é a principal via de biotransformação de fármacos contendo arilamina
ou amina aromática (Ar-NH2; HANNA, 1997) essa reação é catalisada pelas enzimas
designadas de N-acetiltransferases citosólicas (NAT). Os seres humanos expressam duas
NAT: a NAT1 e NAT2, essas enzimas detoxificam aminas aromáticas transformando-as em
amidas que são metabólitos menos tóxicos isso pode ser observado a partir da formação
monoacetildapsona (MADDS) formada pela acetilação do grupo amino (NH2; GROSSMAN e
JOLLOW, 1988). Coleman e Tingle (1992), afirmaram que MADDS não é a principal
responsável pela toxicidade da DDS, a menos que seu outro grupo amino seja N-hidroxilado.
Portanto, a N-hidroxilação que ocorre principalmente pela ação da isoforma do
citocromo P450, a CYP2C9, forma os metabólitos: monoacetildapsona-hidroxilamina
(MADDS-NOH) e dapsona-hidroxilamina (DDS-NOH), sendo eles os responsáveis pela
hematotoxidade observada em pacientes (Figura 4; ISRAILI et al. 1973; SCHIFF et al. 2006).
32
Figura 4:Estrutura da dapsona (DDS) e metabólitos DDS-NOH e MADDS-NOH (dapsonahidroxilamina e monoacetildapsona-hidroxilamina) formados a partir do processo de
biotransformação, N-hidroxilação da DDS e MADDS (monoacetildapsona), respectivamente. Fonte:
Grossman e JOLLOW (1988)
Conforme Hjelm e DeVerdier (1965); Glader e Conrad (1973) a anemia hemolítica e
metemoglobinemia que ocorre durante o tratamento com a DDS é mediada por seus
metabólitos hidroxilados e não pelo fármaco ativo. Em virtude disso, Scott e Rasbridge
(1973) avaliaram o efeito desses dois metabólitos e compararam a capacidade de ambos em
formar MetHb em eritrócitos de indivíduos sadios e com deficiência em glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PD), assim observou-se que MADDS-NOH foi muito mais tóxico para
essas células que o DDS-NOH. Por outro lado, Israili et al. (1973) revelaram que esses
metabólitos apresentam o mesmo efeito hematotóxico em eritrócitos humanos, resultados
semelhantes a este foram demonstrados por Vage et al. (1994); Coleman (1995) utilizando
sangue de humano e de rato.
33
Reilly et al. (2000) avaliaram o efeito tóxico do DDS-NOH mediante a exposição de
queratinócitos que em meio a esse metabólito apresentou diminuição acentuada na
concentração da glutationa reduzida (GSH), a qual é o principal componente celular com
atividade antioxidante, logo com a depleção desse componente celular ocorreu o acúmulo de
espécies reativas de oxigênios (ERO) que facilitou a auto-oxidação da hemoglobina, bem
como dos metabólitos arilhidroxilamina (DDS-NOH e MADDS-NOH) transformando-os em
compostos arilnitosos (Ar-N=O), sendo esses compostos bastante eletrofílicos com
capacidade de agir rapidamente com os tióis nucleofílicos, presente nas proteínas e com a
GSH
(GRANTHAM;
WEISBURGER
e
WEISBURGER,
1965;
KAZANIS
e
MCCLELLAND, 1992). Durante a auto-oxidação, o oxigênio molecular (O2) reduz a
superóxido (O2-•), que é subsequentemente reduzido a peróxido de hidrogênio (H2O2) pela
ativação da superóxido dismutase (SOD), frequentemente maior parte H2O2 encontra-se
envolvido na reação de Fenton, que é o processo responsável pela formação dos radicais
hidroxila que são altamente citotóxicos (Figura 5; CRIBB et al. 1991; BRADSHAW et al.
1997).
Figura 5: As vias de biotransformação da DDS: glicuronidação, N -acetilação e N-hidroxilação e os
seus metabólitos, conjugado glicuronídeos, MADDS e DDS -NOH, respectivamente. o DDS-NOH
pode se auto-oxidar principalmente a partir da depleção de GSH (glutationa reduzida) e de enzimas
antioxidantes (SOD e CAT), havendo quantidades elevadas de ero que são capazes de reagir com
DDS-NOH, facilitando a formação do metabólito DDS -NO (grupamento nitroso, N=O). Fo nte:
adaptado Vyas et al. (2005); Coleman (1995); Svensson (2003); Grossman e Jollow (1988).
34
O processo de formação de anemia hemolítica induzida pela DDS-NOH foi
correlacionado com a inibição da G6PD em eritrócitos humanos in vitro. No estudo a DDSNOH foi capaz diminuir o tempo de meia-vida dos eritrócitos deficientes em G6PD induzindo
um processo anêmico duas vezes maior quando comparado com eritrócitos normais expostos
a esse metabólito (GROSSMAN, BUDINSKY e JOLLOW, 1995). Portanto, as células
deficientes em G6PD apresentam maior susceptibilidade ao dano oxidativo, uma vez que se
tornam incapazes de reduzir NADP+ para NADPH. A G6PD catalisa a reação de oxidação da
glicose-6-fosfato (G6P) a 6-fosfogliconolactona em uma reação que usa especificamente
NADP+ como coenzima, que após a redução transforma-se em NADPH.
O NADPH é uma molécula altamente redutora e extremamente importante para os
eritrócitos pelo fato de manter a forma reduzida da glutationa (GSH), uma vez que é o
suprimento necessário para atividade da glutationa-redutase que transforma glutationa
oxidada (GSSG) em GSH (MEHTA et al. 2000). Como os eritrócitos não possuem
mitocôndria ou organelas, a única fonte de suprimento de NADPH é pela ação catalítica da
G6PD através da via das pentoses-fosfato, o que favorece a capacidade de defesa antioxidante
dos eritrócitos pela ação da GSH que é capaz de detoxificar o H2O2, bem como manter
resíduos de cisteína da hemoglobina e de outras proteínas de glóbulos vermelhos no estado
reduzido (Figura 6; URSINI et al. 1997; SALVEMINI et al. 1999).
Figura 6: Atividade da G6PD na primeira fase da via das pentoses -fosfato, enzima responsável pela
formação de NADPH. o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) formado a partir da redução do O 2 induz a
oxidação da glutationa reduzida (GSH) transformando -a em glutationa oxidada (GSSG), a partir da
ação da glutationa-peroxidase (GP), por outro lado, glutationa -redutase (GR) atua na conversão da
GSSG em GSH, no entanto esse processo só ocorre usando como fo nte o NADPH formado pela ação
da G6PD. Fonte: adaptado Mehta et al. (2000)
Conforme Wertheim et al. (2006) o maior problema clínico associado ao uso de DDS
é a diminuição do tempo de vida dos eritrócitos humanos, uma vez que esse efeito pode
provocar um quadro de anemia, causando assim um aumento de índices de morbidade e
35
mortalidade, como descrito no estudo de Gonazales et al. (2000), em áreas onde a DDS é
usada para o tratamento de Malária.
De acordo, com Goulart et al. (2002) os distúrbios hematológicos, como a
metemoglobinemia e anemia são as reações adversas ao medicamento (RAM) mais
frequentes durante o tratamento com DDS, principalmente nas doses usadas para tratamento
de hanseníase (100mg/dia; HALIM e OGBEIDE, 2002). Tais efeitos estão relacionados com a
formação do metabólito hidroxilamina, uma vez que Evelo et al. (1998) comprovam que o
principal efeito tóxico no homem dos compostos hidroxilamina (H2NOH) ocorre nos glóbulos
vermelhos, envolvendo principalmente produção de elevados índices de metemoglobinemia in
vitro e diminuição do tempo de vida dos eritrócitos. Reilly et al. (1999) mostraram que o
potencial de induzir MetHb nos eritrócitos in vitro está intimamente relacionado com o ciclo
de oxidação-redução com a oxihemoglobina e com moléculas de oxigênio (O2), produzindo
MetHb e ERO, respectivamente. Neste mesmo estudo mostrou que efeito hematotóxico DDSNOH não ocorre somente em casos de deficiência de G6PD ou situações de depleção da
concentração de GSH, propondo que a principal causa da formação de MetHb pela DDSNOH está na reatividade do metabólito com a hemoglobina.
Por outro lado, Coleman (1993) associa a anemia e a metemoglobinemia causadas
pelo uso de DDS a uma desnaturação oxidativa na membrana dos eritrócitos, acelerando os
processos de hemólise celular, bem como Bordin et al. (2010) mostraram que o DDS-NOH
induz alterações progressivas nos eritrócitos, inicialmente pelo domínio citosólico das
proteínas de membrana dos eritrócitos, a banda 3, sendo observado a formação de MetHb e a
fosforilação da tirosina de banda 3 no domínio citosólico que é responsável pelas trocas
aniônicas (BAGGIO et al. 1993 a,b), incluindo a regulação de glicólise (LOW et al. 1993),
alterações na morfologia (BORDIN et al. 1995), volume (MUSCH et al. 1999) e senescência
dos eritrócitos (BORDIN et al. 2009; PANTALEO et al. 2009).
2.3 Hemoglobina (HB) e Metemoglobina (MetHb)
Segundo Baldwin e Chothia (1979) a hemoglobina (Hb) é uma hemeproteína
tetramérica globular presente no interior dos eritrócitos dos mamíferos com função primordial
de transportar o O2 para os tecidos e eliminar CO2 dos mesmos. Esta hemeproteína apresenta
um grupo protéico constituído por dois pares de cadeias de polipeptídeos, chamadas de
globinas α e β (Figura 7), sendo cada globina composta por uma sequência de aminoácidos,
possuindo as cadeias α 141 aminoácidos e as cadeias β, 146 (GALIZA NETO e
36
PITOMBEIRA, 2002). Por outro lado, o grupo prostético presente nas cadeias de globina é
representado pelo heme, anel porfirínico tetrapirrólico, cujo núcleo contém ferro sob a forma
de Fe2+ (ferroso), o qual se liga covalentemente aos quatro anéis pirrólicos unidos em anel
planar por quatro pontes de meteno (=CH-), sendo o átomo de Fe2+ responsável pela ligação
com o O2 (Figura 8), visto que cada molécula de Hb possui quatro grupos heme, logo é capaz
de se combinar com quatro moléculas de O2 (GALIZA NETO e PITOMBEIRA, 2002).
Figura 7: A hemoglobina consiste em um grupo prostético, heme, e o protéico, representado pelas cadeias de
globina α e β. Fonte: Mader (1997)
Figura 8: Representações da estrutura tetrapirrólica do grupo prostético heme, ligando-se aos quatro anéis
pirrólicos e a moléculas de oxigênio. Fonte: Peñuela (2005)
Portanto, a estrutura tetramérica da Hb é essencial para o transporte de O2, bem como
a ligação cooperativa que ocorre entre esse gás e a Hb, o qual quando ligado a um ponto no
tetrâmero da Hb influencia a ligação de mais O2 nos demais pontos da Hb, e vice-versa, ou
seja, a saída de O2 de um heme facilita a saída desse gás presente nos outros. O processo de
oxigenação ocorre a partir da avidez das duas cadeias β pelo O2 que se movimentam juntas
para facilitar a combinação entre eles, contudo para que ocorra a liberação desse gás nos
37
tecidos é necessária a atuação do 2,3-Difosfoglicerato (2,3-DPG) que proporciona a redução
da afinidade da Hb pelo O2 proporcionando a liberação deste para os tecidos (LORENZI,
2011).
Conforme Shikama (1998), a conversão da Hb a sua forma oxigenada está associada a
um arranjo eletrônico, uma vez que ocorre transferência de carga (doação π) do Fe2+ para O2,
e uma coordenação (doação σ) do O2 para o Fe2+, ocasionando assim uma forte ligação
covalente entre o ferro e o oxigênio (Figura 9). Logo, após esta oxidação o íon Fe2+ do grupo
heme não pode mais combinar-se com O2, pois esta molécula não apresenta nenhuma
afinidade pelo íon férrico (Fe3+), sendo assim observada a formação da MetHb. De acordo
com Carrell et al. (1975), este é o processo de auto-oxidação da hemoglobina (alta afinidade
ao O2 ou estado R) que ocorre geralmente em taxa de 0,5 a 3% ao dia.
Figura 9: Arranjo eletrônico que ocorre entre o Ferro do grupo heme e moléculas de oxigênio a partir da
transferência de cargas que ocorre entre eles. Fonte: Shikama (1998)
No entanto, Harris (1991) descreve que o grupo heme está protegido da auto-oxidação
por uma região hidrofóbica, que quando perturbada, uma ligeira modificação estrutural pode
permitir a entrada de pequenos ânions ou água, e o grupo heme perde um elétron, oxidando-se
a seu estado de maior spin, MetHb, e liberando o radical O2•- (Figura 10).
38
Figura 10: Processo de oxidação do Fe2+ pela ligação ao O2, formando o Fe3+, caracterizando o processo natural
de metemoglobina nos eritrócitos.
A MetHb é um processo natural que ocorre diariamente sem causar nenhum dano aos
tecidos, sendo principalmente regulada pela enzima NADPH-metemoglobina redutase
(nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida), no entanto pode ser induzida por fármacos
com ação oxidante, tais como DDS, sulfonamidas, anestésicos locais e azul de metileno em
altas doses, ocasionando significativa carência do suprimento de O2 nos tecidos provocando
importantes manifestações clínicas, como: dispnéia, náuseas e taquicardia quando há níveis de
até 30% de MetHb; letargia, estupor e perda de consciência resultam de níveis de
aproximadamente 50%; taxa 50 a 70% de MetHb pode ocasionar arritmias cardíacas, falência
circulatória e depressão neurológica, e níveis acima de 70% geralmente levam à morte
(COLEMAN, 1995). Além disso, é possível observar que no processo de MetHb pode ocorrer
a formação de produtos da agressão oxidativa no interior dos eritrócitos, provocando a
desnaturação da hemoglobina e precipitando-a sob forma de agregados polipeptídios
insolúveis, denominados corpúsculos de Heinz (WINTERBOURN, 1990).
Com relação à DDS muitos estudos têm investigado o potencial metemoglobinizante
deste fármaco. Dentre estes, Queiroz et al. (1997) afirmam que o tratamento a longo prazo
com DDS (100mg/dia) pode resultar em formação de MetHb e hemólise significativa
sugerindo que este fármaco é o principal responsável por estes achados hematológicos e que o
uso da rifampicina e clofazimina não aumentam a incidência de MetHb durante o tratamento.
Estudo conduzido por Dalpino (1997) também mostrou que o percentual de MetHb de
pacientes hansênicos que se encontravam sob tratamento de DDS (100mg/dia), estavam
aumentados de forma significativa quando comparados ao grupo controle. Além disso, dois
relatos de caso de intoxicação por DDS descritos por Hansen et al. (1994) mostraram que os
pacientes intoxicados por este fármaco apresentavam MetHb sintomática, com concentrações
de MetHb de 35% e 37%. Em crianças apresentando quadros de intoxicação aguda por esse
fármaco foram encontradas taxas de MetHb que variavam de 23,5 a 49,7%, sendo observadas
39
manifestações
clínicas
como
cianose,
taquicardia,
vômitos,
dispnéia
e
agitação
(BUCARETCHI et al. 2000).
Estudos in vitro têm demonstrado que a DDS-NOH apresenta potencial citotóxico
mais potente que outros metabólitos hidroxilados da DDS e que a capacidade de formar
MetHb da DDS-NOH é dose–dependente (REILLY et al. 1998; REILLY et al. 1999). Além
disso, Vage et al. (1994) relataram que tanto a DDS-NOH quanto a MDDS-NOH são capazes
de induzir a formação de MetHb in vitro em eritrócitos humanos.
Ciccoli et al. (1999) demonstraram que glóbulos vermelhos tratados com DDS-NOH
apresentaram aumento significativo na formação de MetHb quando comparados ao controle
sugerindo desta forma que a presença deste metabólito hidroxilado é essencial para os efeitos
hematotóxicos observados durante tratamento com DDS.
O provável mecanismos que explica o processo de formação de MetHb por parte
DDS-NOH é que a Hb sofreria oxidação por parte deste composto levando a formação de
MetHb e um composto derivado da DDS, denominado de nitrosobenzeno que é reduzido pela
enzima NADH-metemoglobina redutase e pela GSH novamente à DDS, dando continuidade
ao processo de oxidação da Hb. Estima-se que este processo se repita até que os níveis de
GSH estejam esgotados (KRAMER et al. 1972; COLEMAN e JACOBUS, 1993) assim como
a G6PD (Figura 11), que a partir de sua oxidação fornece os elétrons para a NADHmetemoglobina
redutase
convertendo
diminuindo a MetHb (HALL et al. 1986).
a
hemoglobina-Fe3+
para
hemoglobina-Fe2+,
40
Figura 11: Representação esquemática do ciclo de formação da metemoglobina nos eritrócitos a partir da
indução DDS-NOH (dapsona hidroxilamina), demonstrando o possível ciclo redox que recupera o composto
nitrosobenzeno até o precursor hidroxilamina. Nota: DDS: dapsona, DDS-NO: dapsona nitrosobenzeno, P450:
citocromo P450. Fonte: Adaptado de Coleman e Jacobus (1993)
De acordo com Kinoshita et al. (2007), a redução da metemoglobina ocorre por dois
principais mecanismos; pela via do sistema NADPH-dependente (nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato reduzida) e NADH-dependente (nicotinamida adenina dinucleotídeo
reduzida), representadas pela NADPH-metemoglobina redutase e NADH-citocromo b5
redutase (chamada também como NADH-metemoglobina redutase), respectivamente.
NADPH-metemoglobina redutase é capaz de reduzir a MetHb formada sob condições
normais, já sob condições de elevada oxidação da Hb a responsável pela redução e NADHcitocromo b5 redutase (WRIGHT et al. 1999). A fonte de NADH necessária para a redução da
MetHb provém da glicólise anaeróbia de Ebdem-Meyerhof, a partir da reação da oxidação da
glicose que gera ATP e NADH, por outro lado o substrato NADPH é proveniente da via das
pentoses a partir da ativação da G6PD (Figura 12).
41
Figura 12: A via de Embden-Meyerhof e das pentoses-fosfato, responsáveis pela produção de NADH e NADPH,
respectivamente. Substratos importantes no processo de redução da Metemoglobina. Fonte: Percy e Lappin
(2008)
A via redutora de maior utilidade e importância para os eritrócitos é a NADHcitocromo b5 redutase, sendo esta influenciada pela disponibilidade de NADH e de citocromo
b5. O citocromo b5 é uma hemeproteína que está presente no citoplasma dos eritrócitos que
tem como função primordial a redução da MetHb (JAFFÉ, 1981), este processo ocorre pelo
transporte de elétrons do seu íon Fe3+ que reduz para íon Fe2+, e isso só ocorre na presença do
substrato NADH (Figura 13) (PERCY e LAPPIN, 2008).
Figura 13: Redução da metemoglobina para hemoglobina ocorre pelo processo de NADH-citocromo b5 redutase
que reduz o citocromo b5 (Cb5) oxidado para Cb5 reduzido, e essa redução é acompanhada pela oxidação do
NADH para NAD+, bem como pela redução da metemoglobina a hemoglobina. Fonte: Percy e Lappin (2008)
No entanto, em casos de formação de MetHb, com taxa superior 40%, induzida
principalmente por fármacos oxidantes e alguns compostos tóxicos, a via NADH-citocromo
42
b5 redutase fica comprometida, e o paciente cianótico e com apnéia e tratado com azul de
metileno, sendo este o tratamento de primeira escolha, a dose eficaz é 1 a 2mg/kg em solução
de 1%, pela via intravenosa. O azul de metileno apresenta efeito rápido na redução da MetHb
tanto in vivo, como também in vitro (GIBSON, 2002). Portanto, o seu mecanismo redutor de
MetHb ocorre devido a capacidade da enzima NADPH-metemoglobina redutase transferir
elétrons para ele, o que faz com que ele seja capaz de reduzir o íon férrico para íon ferroso
(Figura 14). No entanto, como essa via depende de NADPH, pacientes com deficiência de
G6PD a utilização do azul de metileno é ineficaz e ainda pode induzir hemólise (WARD e
McCARTHY, 1998), bem como sintomas como dispnéia, dor precordial, cianose persistente
(SILLS e ZINKHAM, 1994).
Figura 14: As prováveis vias de redução da metemoglobina, sendo que a principal via fisiológica é a do
citocromo b5 redutase. No entanto, essa redução também pode ser feita pela via exógena com o uso de azul de
metileno. Fonte: Walker et al. (2009).
43
2.4 Eritrócitos humanos
2.4.1 MEMBRANA ERITROCITÁRIA
Os eritrócitos humanos são células anucleadas produzidas pelo sistema hematopoiético
localizado na medula óssea que após chegar à circulação sanguínea possuem naturalmente em
torno de 120 dias de vida, sendo a responsável pelo transporte de O2 dos pulmões para os
tecidos, mediante a interação da Hb com o gás (DACIE e LEWIS, 1995). Estas células são
constituídas basicamente por uma membrana plasmática e citoplasma, este contêm apenas
água, eletrólitos, enzimas e Hb (HOKAMA et al. 2002), portanto como não há organelas
citoplasmáticas a energia necessária para a sobrevivência deles provém da glicólise
anaeróbica na forma de adenosina trifosfato (ATP), e de coenzimas como NADH e NADPH,
sendo importantes na manutenção e circulação da célula por meses em seu estado funcional
frente a exposições repetidas a lesões mecânicas e/ou metabólicas, mantendo assim
principalmente sua integridade ao atravessar os capilares do organismo que apresentam 2 a 3
µm de diâmetro (HOKAMA et al. 2002).
A membrana dos eritrócitos é composta de uma bicamada lipídica, contendo
compostos de fosfolipídeos, colesterol não esterificado e glicolipídeos, ancorada em um
citoesqueleto. É responsável pela manutenção da forma, do volume, da deformabilidade, da
estabilidade mecânica, além da homeostase do cálcio e das trocas iônicas do eritrócito
(HOKAMA et al. 2002). No entanto, por ser rica em ácidos graxos poliinsaturados é
considerado um alvo primário para reações envolvendo os radicais livres permitindo assim
que os eritrócitos fiquem vulneráveis a danos oxidativos (MAY et al. 1998).
Os fosfolipídeos presentes na membrana eritrocitária são: fosfatidilcolina (30%),
fosfatidiletanolamina (28%), fosfatidilserina (14%), esfingomielina (25%). O restante, 3%,
inclui fosfatidilinositol, ácido fosfatídico e cardiolipina. Na porção externa da bicamada
lipídica, predominam os fosfolipídeos: fosfatidilcolina e esfingomielina, enquanto que na
porção interna, junto ao citoplasma, estão os aminofosfolipídeos: fosfatidilserina,
fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, além dos demais fosfolipídios. O colesterol está
distribuído igualmente entre as duas camadas (LORENZI et al. 2003).
A estrutura do citoesqueleto é constituída por proteínas integrais e periféricas (Figura
15), e é responsável pela forma bicôncava dos eritrócitos, pois estas proteínas formam uma
espécie de concha para o material intracelular (MURADOR e DEFFUNE, 2007).
44
Figura 15: Representação da membrana eritrocitária, composta por fosfolipídios, colesterol, glicoforinas,
proteínas integrais e periféricas. Fonte: Red Cell Biology (2011)
As proteínas integrais atuam principalmente como proteínas de transporte, proteínas
de adesão ou como receptores de sinais, como é o caso das glicoforinas (A, B, C, D, E)
relacionadas aos antígenos eritrocitários e a banda ou proteína 3 que atua como canal
transportador de ânions e água para o eritrócito (MOHANDAS e GALLAGHER, 2008), no
entanto, através de seu domínio citoplasmático, a banda 3 se destaca como um grande centro
organizacional que interage com algumas proteínas periféricas: tais como, anquirina,
considerada a maior ponte para o citoesqueleto espectrina-actina, proteína 4.1 e proteína 4.2,
além da ligação com fosfofrutoquinase, desoxihemoglobina, tirosinaquinase e hemicromos,
que regulam a interação do citoesqueleto com enzimas glicolíticas (MURADOR e
DEFFUNE, 2007). Por outro lado, as proteínas periféricas são representadas pelas espectrinas,
anquirinas, bandas 4.1; 4.2; 4.9; 5; aducina, bandas 6 e 7, sendo a interação destas proteínas
com a bicamada lipídica e com as proteínas integrais responsável pela flexibilidade e
deformabilidade do eritrócito (HANDIN et al,1995).
A partir de estudos McMillan et al. (1995) conseguiram demonstrar que anemia
hemolítica causada pela DDS-NOH em eritrócitos de ratos estava relacionada com severas
alterações nas proteínas de membrana do citoesqueleto dessas células, já que os eritrócitos
45
apresentaram acentuadas irregularidades nas suas bordas, caracterizando-as como em forma
de equinócitos ou hemácias espiculadas.
2.4.2 METABOLISMO ERITROCITÁRIO
A função inerente dos eritrócitos de transportar O2 dos pulmões para os tecidos e de
CO2, dos capilares teciduais para os pulmões é possível não somente pela presença da Hb,
mas também pela participação ativa do metabolismo eritrocitário (LORENZI et al. 2003).
A geração de energia ocorre pelo catabolismo de glicose que adentra a célula por
difusão facilitada. Assim cada molécula de glicose é metabolizada em duas moléculas de
lactato e gerada duas moléculas de ATP, este processo é chamado de Via de EmbdenMeyerhof. Neste processo, a energia gerada é suficiente para manter a forma e a flexibilidade
da membrana, preservando os lipídios e mantendo o gradiente interno dos íons pelo
funcionamento das bombas de Na+, K+ e Ca2+. Por outro lado, existem outras vias
metabólicas, que direta ou indiretamente estão relacionadas às funções eritrocitárias, sendo a
via das Pentoses-fosfato uma delas (LORENZI et al. 2003).
Percy et al. (2005) mostraram que via glicolítica de Embden-Meyerhof forma três
importantes produtos: NADH, um co-fator na reação da metahemoglobina redutase; ATP, o
principal nucleotídeo fosfato de alta energia; e 2,3-DPG, um regulador da função da Hb. O
NADH é essencial para manter o ferro do complexo heme no estado reduzido (Fe2+), um
processo enzimático que é mediado pela NADH-metahemoglobina-redutase. Assim como,
pela via de Luebering-Rapaport também são sintetizadas as moléculas de 2,3-DPG,
importante modulador da afinidade do O2 à molécula de Hb (GREER; FOERSTER;
LUKENS, 2003).
Na via das Pentoses-fosfato, três moléculas de glicose-6-fosfato (G6P) produzem três
moléculas de CO2 e três açúcares de cinco carbonos (MURRAY et al. 2006), sendo o NADPH
reduzido produto mais importante formado nesta via, devido esse produto ser utilizado pelo
eritrócito como cofator da glutationa redutase que efetua a redução da molécula de GSSG
para GSH (GREER; FOERSTER; LUKENS, 2003), assim como molécula essencial para
ativação do potencial redutor do azul de metileno, cisteína, ascorbato (BEUTLER et al. 1995;
LEE et al. 1999).
46
2.4.3 SISTEMA ANTIOXIDANTE DO ERITRÓCITO
No eritrócito, assim como em outros locais do organismo há formação de radicais
livres, cujo elétron desemparelhado está centrado num átomo de oxigênio ou de nitrogênio,
sendo denominados respectivamente de ERO e de Espécie Reativa de Nitrogênio (ERN).
Estas espécies são produzidas em processos fisiológicos, tais como: produção de energia,
fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de importantes
substâncias biológicas, no entanto, quando produzidas em excesso podem ser danosas.
As principais ERO distribuem-se em dois grupos, as radicalares: hidroxila (OH•-),
superóxido (O2-•), peroxila (ROO•) e alcoxila (RO•); e as não-radicalares: O2, H2O2 e ácido
hipocloroso (HClO). Dentre as ERN incluem-se o óxido nítrico (NO•), óxido nitroso (N2O3),
ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2), nitratos (NO3) e peroxinitritos (ONOO-; BARREIROS
et al. 2006). Portanto, o eritrócito é um local de relativa abundância de geração de radicais
livres por diversos fatores, entre os quais o fato de possuir: constante suplemento de O2; e alta
concentração de hemoglobina que pode reagir com fármacos oxidativos e ERO/ERN
(ASLAN; THORNLEY-BROWN; FREEMAN, 2000).
Portanto, a molécula de Hb, em especial a região não polar que contém o grupo heme
necessita manter sempre o Fe no estado ferroso, uma vez que qualquer modificação na
estrutura pode permitir o acesso de pequenos ânions ou moléculas de água e,
consequentemente, dar origem à formação de radicais livres, desencadeando o processo de
oxidação da Hb (NAOUM, 1996).
Em virtude da sua susceptibilidade ao dano oxidativo, os eritrócitos, assim como
outras células do organismo, apresentam várias formas de defesa antioxidante, as quais podem
ser classificadas: defesa antioxidante pela ação de sistemas enzimáticos e não enzimáticos.
Dentre as enzimas que catalisam reações antioxidantes estão a superóxido dismutase
(SOD) e catalase (CAT). A SOD é específica na remoção do radical O2•-, já que catalisa a
dismutação do radical O2•- a H2O2, e este por sua vez é degradado em moléculas de H2O e O2
pela ação da enzima CAT, a qual apresenta quatro subunidades, cada uma contendo um
grupamento Fe3+, ligado ao seu sítio ativo (WIEACKER et al. 1980) localiza-se
principalmente nos peroxissomas da célula, sendo responsável pela detoxificação específica
do H2O2 (Figura16).
47
Figura 16: Mecanismo de proteção do sistema antioxidante dos eritrócitos a partir da produção de espécies
reativas de oxigênio e produção de metemoglobina. Fonte: Harris (1991)
Dentre os antioxidantes não enzimáticos incluem GSH, NADPH, NADH e algumas
vitaminas derivadas exclusivamente de dietas, como as vitaminas C e E, entre outros. O
sistema antioxidante tem a função de manter o estado reduzido da célula, protegendo assim a
integridade estrutural e funcional de macromoléculas biologicamente fundamentais como
proteínas, fosfolipídios, entre outras (FREI, 1999; TAVAZZI et al. 2000).
A GSH é um tripeptídeo tiólico presente na maioria das células, o qual possui
atividade antioxidante estando envolvido principalmente na defesa celular do eritrócito, por
agir como um tampão redox nessa célula (STRYER,1995; LEHNINGER et al. 2002). O
tripeptídeo é formado por resíduos de glicina, glutamato e cisteína, sendo esse último
aminoácido portador do grupo sulfidrila (SH), grupo empregado nas reações de oxido-redução
nas quais a molécula participa, sendo assim capaz de manter componentes diversos da célula
em estado reduzido, especialmente proteínas e íons Fe2+ dos grupos heme das cadeias.
48
Um dos mecanismos de remoção de H2O2, além da atividade da CAT, envolve a
oxidação da GSH gerando o dímero denominado glutationa oxidada (GSSG; STRYER,1995;
LEHNINGER et al. 2002). No entanto, para que ocorra a regeneração GSH, a forma oxidada
GSSG sofre a ação da glutationa redutase que atua em conjunto com NADPH promovendo
assim a manutenção das concentrações ideais do tripeptídeo no seu estado reduzido (Figura
17; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2001; PASTORE et al. 2003).
Figura
17:
Estruturas
da
glutationa
reduzida
(GSH)
e
oxidada
(GSSG).
<http://commons.wikipedia.org/wiki/image:glutathione-skeletal.png>Acesso em março de 2013
Fonte:
A G6PD embora não possua uma atuação direta na remoção de ERO/ERN ela é
considerada de suma importância para sistema antioxidante do eritrocitário, além da sua
função primordial que é fornecer energia a partir da glicose nessas células. A G6PD catalisa a
primeira reação da via das Pentoses-fosfato na qual a G6P é oxidada a 6-fosfogluconolactona
com a redução concomitante de NADP+ a NADPH. Portanto, é essencial na proteção do
eritrócito contra a ação de oxidantes por manter a glutationa no estado reduzido (BEUTLER,
1994).
A metahemoglobina redutase, NADH dependente, também chamada de citocromo b5
metahemoglobina redutase, é uma enzima (flavoproteína) constituída de uma cadeia peptídica
e um grupo prostético, esta enzima é a responsável por converter aproximadamente 67% da
metemoglobina a deoxihemoglobina, através do uso de dois carreadores de elétrons, o
citocromo b5 e o NADH. A deficiência genética dessa enzima ou de citocromo b5 pode
causar metemoglobinemia congênita em humanos (PERCY et al. 2005). Além disso, há a
metahemoglobina redutase, NADPH dependente, sendo o NADPH o principal cofator
envolvido na redução da MetHb em desoxihemoglobina. A deficiência dessa enzima não está
associada a casos de metemoglobinemia porque a mesma reduz apenas 5% da metemoglobina
formada, no entanto o tratamento com azul de metileno em casos de intoxicação por DDS ou
49
de metemoglobinemia severa causadas por esse fármaco só é eficaz se haver o suprimento
necessário de NADPH (PERCY et al. 2005).
2.4.4 O ERITRÓCITO COMO MODELO EXPERIMENTAL
O estresse oxidativo está envolvido em muitos fenômenos fisiológicos e patológicos
que ocorre nas células, e principalmente nos eritrócitos, mesmo eles possuindo um sistema
antioxidante ativo (ASHA et al. 2005). A exposição de eritrócitos a radicais livres e a
compostos oxidantes podem ocasionar diversos danos oxidativos, dentre eles, mudanças nas
proteínas de membrana, como peroxidação lipídica e adutos de proteínas; oxidação da GSH
alterando a sua atividade antioxidante (ROHN et al. 1993; EL-MISSIRY e ABOU-SEIF,
2000), assim como mudanças na morfologia celular (PRASANTHI e RAJINI, 2005)
tornando-os mais suscetíveis à hemólise (ZAVODNIK, 2002), e consequentemente sendo
retirados precocemente da circulação reduzindo o seu tempo médio de vida (Figura 18).
A facilidade de obtenção, custo e preservação dos eritrócitos humanos, bem como a
sua capacidade de reagir com ERO e ERN exógenos (TANG e LIU, 2007) é o que faz ser
comumente utilizado como modelo experimental para investigar potencial antioxidante de
compostos (FUJINO et al. 2000; OKAMOTO et al. 2004), considerando que ela é a principal
célula transportadora de O2 sendo constantemente exposta ao dano oxidativo e o processo de
oxido-redução que ocorre na Hb faz com os eritrócitos sejam altamente susceptíveis ao ataque
de ERO. Assim a suspensão de eritrócitos é um sistema eficaz para a investigação do efeito
protetor de substâncias antioxidantes, em virtude do efeito de radicais livres e compostos
oxidantes induzidos nessas células, prejudicando principalmente os constituintes da
membrana lipídica e a Hb (SHIVA et al. 2007). No entanto, é limitante por não reproduzir
exatamente as condições do organismo, pois se perdem as funções sistêmicas como a
endócrina e a nervosa, contudo ainda é um modelo celular útil e muito valioso na ciência
biomédica e farmacêutica (CASADEVALL, 2009).
50
Figura 18: Modelo celular do eritrócito, com seus principais constituintes, hemoglobina e sistema de defesa
antioxidante, bem como a bicamada lipídica que mantém a forma bicôncava do eritrócito. Fonte: Casadevall
(2009).
2.5 Antioxidantes
De acordo com Halliwell e Gutteridge (1990), antioxidante pode ser definido como
uma substância que presente em baixas concentrações em relação ao substrato oxidável, pode
retardar ou prevenir significativamente a oxidação deste substrato de maneira eficaz. Por
outro lado, Krinsky (1992) definiu que a ação antioxidante está relacionada com o potencial
de proteção dos sistemas biológicos contra os efeitos prejudiciais de processos ou reações que
causam a oxidação extensiva.
Consideram-se estas duas definições como complementares, uma vez que o processo
como eles suprimem os danos ocasionados pelos agentes pró-oxidantes são diversos. Logo,
para caracterizar a ação antioxidante de um composto, deve-se analisar como este exerce sua
atividade, se atua diretamente, através do sequestro de ERO ou inibindo sua geração, ou se
está atuando de forma indireta, como cofator de enzimas, na up-regulation de genes
envolvidos na defesa contra os danos causados por xenobióticos ou ERO, na expressão de
enzimas envolvidas no reparo de DNA etc.
Ensaios realizados com eritrócitos in vitro podem caracterizar a ação do antioxidante e
sua eficácia em certos parâmetros, tais como: da hemólise; da oxidação da hemoglobina a
metemoglobina; do conteúdo de GSH celular; morfologia do eritrócito que pode apresentar
rigidez e alteração da forma da membrana celular sob a ação do agente oxidante; nível
antioxidante dos eritrócitos, através da determinação da atividade enzimática da SOD e CAT;
51
análise das proteínas de membrana em eletroforese em gel desnaturalizante (SDS-PAGE), que
analisa se os antioxidantes evitam a degradação das proteínas de membrana pelo agente
oxidante; avaliação da fluidez da membrana, localizando os compostos estudados nas
membranas e seus efeitos na dinâmica dos lipídios nas diferentes regiões da bicamada
lipídica, através do uso de sondas fluorescentes e determinação de glicoproteínas e grupos
carbonila de proteínas (CASADEVALL, 2009).
2.5.1 RESVERATROL (RSV)
O resveratrol (trans-3,4’,5-Trihidroxiestilbeno) é um polifenol, classificado como uma
fitoalexina (SOLEA et al. 1997) sendo comumente encontrada na casca de uvas (Vitis vinifera
e Vitis labrusca) e no vinho tinto (Figura 19) que juntamente com as uvas podem ser
considerados as principais fontes alimentares de RSV (IGNATOWICZ e BAERDUBOWSKA, 2001).
Figura 19: Fórmula estrutural do trans-resveratrol ( trans-3,4’,5-Trihidroestilbeno) que consiste em dois anéis
fenólicos ligados por uma dupla ponte estireno(isopropileno). Fonte: Fan et al. (2009)
A síntese de resveratrol ocorre na casca das uvas, como resposta ao estresse causado
por ataque fúngico (Botrytis cinerea e Plasmopora vitcula), dano mecânico ou por irradiação
de luz ultravioleta. King et al. (2006) mostraram que a síntese do RSV tanto pela exposição à
luz solar como pelo ataque fúngico ocorre nas cascas de uvas a partir da condensação entre as
moléculas, malonil-CoA e a 4-coumaroil-CoA através da enzima resveratrol sintase (Figura
20).
O RSV é um estilbeno encontrado em duas formas isômeras com atividade biológica:
trans-resveratrol e cis-resveratrol, sendo convertido o trans-resveratrol em cis-resveratrol
(Figura 21) quando há presença de luz visível (SAUTTER et al. 2005). Waterhouse (2002)
relata que é a isoforma trans, a principal responsável pela atividade biológica, uma vez que
52
esta isoforma é a mais estável e facilmente encontrada nas cascas de uvas e vinho tinto,
portanto é a única forma disponível no mercado (SOLEAS et al.1997).
Figura 20: Síntese do Resveratrol em cascas de uva. Fonte: King et al. (2006).
Figura 21: A estrutura química do trans-resveratrol e cis-resveratrol (3,4’,5 Trihidroestilbeno). Fonte:
Mukherjee et al. (2010)
Diversos estudos demonstram que o RSV possui efeito anti-plaquetária, antiinflamatório e efeitos antitumorais, bem como contra doenças cardíacas (OLAS e
HOLMSEN, 2012). Walle et al. (2004), descreveram que o RSV apesar de apresentar efeito
53
benéfico em diversas doenças e ser considerado seguro, devido apresentar baixa toxidade, ele
possui baixa biodisponibilidade, quando utilizado via oral, tanto em humanos quanto em
animais, além de ser eliminado rapidamente do organismo apresentando uma meia-vida
plasmática de 8-14 minutos.
De acordo com Vidavalur et al. (2006), este polifenol é encontrado aproximadamente
em 72 espécies de plantas que apresentam atividade biológica como propriedades
antioxidante, anti-inflamatória e antitumoral. Zhang et al. (2013) demonstraram que o
potencial antioxidante do RSV atenuou o estresse oxidativo induzido por As2O3 (trióxido de
arsênio) pelo fato desse antioxidante preservar os níveis de SOD e CAT no soro, reduzindo os
índices de dano nas células.
Morales et al. (2002), relataram que houve melhora na função renal de ratos expostos a
gentamicina, fármaco fortemente nefrotóxico, após uso de RSV, com redução nos sintomas
da síndrome nefrótica, caracterizada por proteinúria, hipoalbuminemia e hiperlipidemia.
Outro efeito amplamente pesquisado do RSV é a proteção do sistema cardiovascular.
Estudos de Soleas et al. (1997) e Wang et al. (2002) mostraram que o RSV inibe a agregação
plaquetária tanto in vivo quanto in vitro, podendo ser um dos mecanismos pelo qual o vinho
tinto exerce um efeito cardioprotetor.
Zhong et al. (2007) relataram que ocorre um interação do resveratrol com a Hb
através da ligação das três hidroxilas (5-OH, 4’-OH e 3-OH) desse estilbeno com as cadeias α
dos aminoácidos Pro95 (prolina), Thr134 (treonina) e Asp126 (ácido aspártico) da Hb
formando pontes de hidrogênio, com isso o resveratrol ocupa a cavidade central da Hb, região
esta na qual alguns fármacos interagem (Figura 22). Estudos de Galtieri et al. (2010)
mostraram que o RSV possui uma ação nos glóbulos vermelhos, em particular nas proteínas
integrais da membrana dessas células, a Banda 3 ou proteína de troca de íons (anion
exchanger 1- AE1), que realiza as trocas de Cl-/HCO3, aumentando então a capacidade
sanguínea de transporte de CO2 garantindo a homeostase e o equilíbrio ácido-básico
(MURADOR e DEFFUNE, 2007). O resveratrol também foi capaz de diminuir a oxidação da
Hb, indicando um efeito redutor. Experimentos demonstraram que o resveratrol interage com
a Hb deslocando o estado conformacional da mesma de T para R, no qual o O2 tem afinidade
para se ligar a hemoglobina (GALTIERI et al. 2010).
54
Figura 22: Sítio de ligação da Hb e RSV, mostrado através do modelo molecular (programa Autodock) , sendo
a linha azul o RSV (resveratrol) e as demais são átomos presente na Hb (Carbono-cinza; oxigênio-vermelho;
nitrogênio-azul; hidrogênio- azul claro). Fonte: Zhong et al. (2007).
2.5.2 ÁCIDO Α-LIPÓICO (ALA)
O ácido α-lipóico (ácido 1,2-ditiolano-3-pentanóico- ALA) é um composto tiol
derivado do ácido octanóico (ácido caprílico), apresenta em sua estrutura química dois grupos
tiol (-SH), o qual quando sofre redução gera o composto ácido diidrolipóico (DHLA ou
ADHL) com a participação do NADPH (Figura 23; SMITH et al. 2004).
O ALA é coenzima de complexos enzimáticos do ciclo do ácido cítrico (ciclo de
Krebs), como piruvato desidrogenase e α-cetoglutarato desidrogenase, catalisando
descarboxilação oxidativa do piruvato e α-cetoglutarato e cadeias ramificadas de α-cetoácidos
formados durante a transaminação da leucina, isoleucina e valina, sendo essencial para o
complexo mitocondrial de proteínas participantes da síntese de ciclina e sua degradação
(sistema de clivagem de ciclina; PACKER et al. 2001; BILSKS e WLODEK, 2005).
55
Figura 23: Estrutura química do Ácido α-lipóico e a estrutura química da sua forma reduzida (DHLA). Fonte:
Smith et al. (2004)
O ALA é sintetizado nas mitocôndrias de mamíferos pela atividade da enzima ácido
lipóico sintetase, mas pode também ser absorvido pela dieta alimentar (MORIKAWA et al.
2001) sendo utilizado como suplemento dietético (SABHARWAL e MAY, 2008).
O ALA proveniente da alimentação é facilmente absorvido e eliminado, no entanto
acumula-se principalmente nos tecidos e mitocôndrias (PRASAD e GANAPATHY, 2000).
Conforme Haramaki et al. (1997) dentro da mitocôndria o ALA é reduzido a DHLA pela ação
da lipoamida desidrogenase ou pelo sistema da tioredoxina redutase, este processo
dependente de NADPH. O par redox ALA/DHLA apresenta potencial redutor elevado, uma
vez que é capaz de quelar metais de transição, como mercúrio e cádmio e reagir com ERO/
ERN, além disso, o DHLA é capaz de reduzir as formas oxidadas do antioxidante α-tocoferol
de forma direta interagindo com o radical tocoferoxil, ou indireta que é pela redução da
dehidroascorbato que reduz a α-tocoferol, bem como reduzir a GSSH a GSH. Portanto, a ação
antioxidante do ALA/DHLA reduz o estresse oxidativo nas mitocôndrias presenvando sua
função e prevenindo-a da morte celular (SMITH et al. 2004).
Magalhães (2000) demonstra que o ALA possui características hidrossolúveis e
lipossolúveis, influenciando o metabolismo celular na eliminação de resíduos tóxicos, além de
auxiliar na recuperação de lesões, principalmente por inibir a ativação do fator NFк-B
(Nuclear factor Kappa Beta) consequentemente inibindo a resposta inflamatória. Além do
mais, tanto o ALA quanto a sua forma reduzida, o DHLA, são considerados potentes agentes
56
antioxidantes, uma vez que podem capturar diversos ERO, incluindo radicais superóxido, OH•,
ácido hipocloroso (HClO) e radicais peroxila (WOLLIN e JONES, 2003).
Estudos in vitro mostram que o ALA diminui a susceptibilidade plasmática à oxidação
(MARANGON et al. 1999), protegendo os eritrócitos humanos contra hemólise induzida por
radicais peroxila (CONSTANTINESCU et al. 1994), e aumenta a síntese de GSH em
eritrócitos humanos isolados (HAN et al. 1997). Conforme Perez e Castaneda (2006) a
capacidade antioxidante do ALA está relacionada à presença de um grupamento tiol que é
capaz de reagir diretamente com espécies reativas, portanto ele é considerado um excelente
antioxidante com valor terapêutico nas doenças relacionadas a produção acentuada de ERO.
Assim como, estudos de Lexis et al. (2006) mostraram o potencial antioxidante do ALA
juntamente com α- tocoferol em relação ao estimulação da defesa antioxidante dos eritrócitos.
Coleman e Walker (2000) mostraram que o ALA quando incubado com eritrócitos de
humanos diabéticos e não diabéticos in vitro, induzidos a formação de metemoglobinemia
pelo metabólito MADDS-OH, provocou redução acentuada da metemoglobinemia.
Atualmente Georgakouli et al. (2013) propôs que a suplementação com ALA (600mg/dia)
trouxe benefícios para pacientes com deficiência em G6PD, uma vez que esse antioxidante
aumentou os índices de GSH e CAT após a segunda semana de tratamento reduzindo o
conteúdo de proteínas carbonilada, portanto indica que a suplementação com ALA pode
modular o estado redox no sangue de humanos com deficiência em G6PD diminuindo os
índices de estresse oxidativo.
Embora estudos demonstrem o potencial antioxidante do ALA em vários processos
patológicos ocasionados pelo estresse oxidativo, como diabetes mellitus, ateroesclerose
doenças cardíacas e outras, o número de estudos que demonstram o potencial do ALA em
casos de anemias hereditárias ou ocasionadas por fármacos é escaço. Georgakouli et al.
(2013) relatou isto mostrando que o único estudo que associou o efeito do ALA em casos de
anemia foi o de Martins et al. (2009). Portanto é de suma importância analisar o efeito do
ALA, e outros antioxidantes, como o RSV em casos de anemias induzidas por fármacos e
outras alterações nos eritrócitos, efeitos comumente observados em pacientes em uso como a
DDS. Assim o estudo poderá descobrir possíveis alternativas de tratamento para atenuar ou
prevenir os efeitos hematotóxicos da DDS, os quais comprometem a adesão do paciente ao
tratamento, e põe em questão a relação risco e benefício deste fármaco.
57
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito do Resveratrol (RSV) e do ácido α-lipóico (ALA) na metemoglobinemia
e no estresse oxidativo induzido pelo metabólito dapsona-hidroxilamina (DDS-NOH) em
modelos in vitro, correlacionando alterações do equilíbrio redox.
3.2 Objetivos Específicos
 Padronizar o modelo de metemoglobina induzida pelo metabólito dapsonahidroxilamina (DDS-NOH) em eritrócitos de voluntários sadios in vitro;
 Avaliar o efeito do Resveratrol e ácido α-lipóico na metemoglobina induzida pelo
metabólito DDS-NOH in vitro;
 Quantificar a liberação de ERO intracelulares em eritrócitos expostos ao metabólito
dapsona-hidroxilamina (DDS-NHOH) e ao DDS-NOH/RSV- DDS-NOH/ALA in
vitro;
 Avaliar os efeitos sobre a atividade antioxidante dos eritrócitos após exposição ao
DDS-NOH e ao RSV/DDS-NOH - ALA/DDS-NOH in vitro pela determinação da
atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT;
58
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 AMOSTRA BIOLÓGICA
Os eritrócitos foram obtidos a partir de amostras de sangue venoso de voluntários
sadios, mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
(ANEXO A). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres
Humanos do Setor de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará (CEP), sob parecer
n°165/11 CEP-ICS/UFPA e CAAE 0154.0.073.000-11 (ANEXO B).
4.1.2 REAGENTES E SOLVENTES
Nos experimentos in vitro foram utilizados a DDS-NOH (Santa Cruz Biotechnology),
Metanol P.A (Merck), Resveratrol (Sigma-Aldrich), ácido α-lipóico (Sigma-Aldrich), Azul de
metileno P.A (Synth), Fosfato de sódio monobásico/ bibásico P.A (Synth), Ferrocianeto de
potássio (Synth), Cianeto de sódio (Qeel), Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 2’,7’- diacetato de
diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA; Sigma-Aldrich), Peróxido de hidrogênio (H2O2;
Vetec), Citocromo c (Sigma-Aldrich), Hipoxantina (Sigma-Aldrich), Xantina oxidase (SigmaAldrich), terc-butilhidroperóxido(t-BHP; Sigma-Aldrich). O anticoagulante utilizado foi
Heparina sódica 5000UI/mL e para a lavagem de eritrócitos e manutenção do pellet dos
eritrócitos foi utilizado cloreto de sódio a 0,9%. (NaCl). O solvente utilizado para solubilizar
o DDS-NOH foi metanol P. A (Vetec).
4.2 Métodos
4.2.1 COLETA DE AMOSTRAS SANGUÍNEAS
As amostras de sangue foram obtidas de doze voluntários adultos saudáveis do sexo
masculino e feminino com idade de 20 a 25 anos, sendo 6 homens e 6 mulheres que não
estavam fazendo tratamento medicamentoso, bem como uso de suplementos alimentares com
antioxidantes, considerou-se também como critérios de inclusão, não fumantes e não portador
de patologias crônicas. O sangue total foi armazenado em tubos de ensaio contendo o
anticoagulante Heparina sódica 5000UI/mL por no máximo 4horas a 37°C.
59
4.2.2 ISOLAMENTO DE ERITRÓCITOS
4.2.2.1 Lavagem e preparação de eritrócitos
Inicialmente, centrifugaram-se as amostras coletadas com heparina sódica 5000UI/mL
em 3000 rpm por 10 min, para posteriormente ser retirado a camada de leucócitos (buffy-coat)
e o plasma. Em seguida, foram feitas quatro lavagens na suspensão de eritrócitos com NaCl
0,9% até a obtenção de uma suspensão límpida e um pellet glóbulos vermelhos.
Após a lavagem, o pellet de glóbulos vermelhos foi isolado e diluído em NaCl 0,9%
para resultar em uma suspensão com hematócrito de aproximadamente 40%, uma vez que este
valor é aproximadamente igual aos hematócritos de adultos saudáveis.
4.2.3 TRATAMENTO DOS ERITRÓCITOS
4.2.3.1 Incubação de eritrócitos com DDS-NOH
A suspensão de eritrócitos com hematócrito de aproximadamente 40% obtido
conforme o item 4.2.2.1 foi distribuído em alíquotas de 2000µL em tubos de ensaio de vidro.
Em seguida, alíquotas de 400µL das diferentes concentrações de DDS-NOH (2,5; 5,0; 7,5; 10
µg/mL) foram adicionadas a estas alíquotas de eritrócitos, este protocolo foi adaptado de
Mcmillan et al. (1995). O período de incubação foi 60 minutos a 37°C e posteriormente,
500µL foram retirados para a dosagem de metemoglobina (MetHb) e construída uma curva
dose versus resposta (Figura 24). O grupo controle foi formado pelos eritrócitos incubados
com ou sem metanol. O teste foi feito em triplicata em cada concentração.
60
Figura 24: Esquema do experimento de incubação da suspensão de eritrócitos, hematócrito de aproximadamente
40 %, com DDS-NOH em diferentes concentrações (2,5; 5,0; 7,5; 10 µg/mL). Experimento foi realizado em
triplicata.
4.2.3.2 Pré-incubação de eritrócitos com RSV e/ou ALA e incubação com
DDS-NOH
A avaliação da ação antioxidante do RSV foi feita a partir da adição de alíquotas
400µL de soluções de RSV (diluídas em tampão fosfato a 0,5M) nas concentrações de 10;
100; 200; 1000µM em 2000µL de suspensão de eritrócitos, sendo que o período de tratamento
destas células foi de 60 min a 37 °C (PANDEY e RIZVI, 2010). Após este tratamento foram
adicionadas alíquotas de 400 µL de soluções de DDS-NOH nas concentrações de 2,5; 5,0; 7,5
µg/mL com período de incubação de 60 min a 37°C. E finalmente para a determinação de
metemoglobina, foram retirados 500µL de suspensão de eritrócitos expostos ao RSV/DDSNOH e os grupos controle (Figura 25). No entanto, para a concentração o RSV 100µM foi
feita uma pré- incubação também nos períodos de 30, 90 e 120 min.
O experimento in vitro para avaliar a ação antioxidante do ALA seguiu o mesmo
esquema de pré-incubação e incubação utilizado para o RSV, no entanto adaptado de
Coleman e Taylor (2003).
61
Figura 25: Esquema do experimento de pré-incubação da suspensão de eritrócitos, hematócrito de
aproximadamente 40 %, com diferentes concentrações do RSV-ALA (10; 100; 200; 100µM), nos períodos de
30; 60; 90 e 120 minutos. E em seguida a incubação com DDS-NOH nas concentrações (2,5; 5,0; 7,5µg/mL) por
um período de 1h. Os experimentos com RSV foram realizados em triplicata.
4.2.3.3 Pré-incubação de eritrócitos com Azul de metileno (15ng/ml) e
DDS-NOH
O azul de metileno foi utilizado no estudo como o controle positivo na reversão da
metemoglobinemia pela DDS-NOH em eritrócitos in vitro, uma vez que clinicamente este
agente redutor é considerado o único tratamento para a MetHb induzida por DDS. A préincubação foi feita de acordo como descrito no item 4.2.3.2 para o RSV, no entanto o período
de pré-incubação do azul de metileno (15ng/mL) foi de 30 min a 37°C (REILLY et al. 1999).
4.2.4 DETERMINAÇÃO DE METEMOGLOBINA
A determinação de metemoglobina por espectrofotometria descrita por Evelyn e
Malloy (1938) foi feita a partir da retirada de 500µL das suspensões de eritrócitos, descritas
nos itens 4.2.3.1, 4.2.3.2 e 4.2.3.3, posteriormente essas células foram hemolisadas pela
adição de 2500µL de água destilada.
Em tubos de ensaio, foram agitadas por inversão três vezes e mantidas em repouso por
3 min. Adicionou-se 1 mL de tampão fosfato 0,5 M e 100µL do reagente Triton X-100, levouse ao agitador vórtex por 30 s. A seguir, retirou-se para tubo identificado como A1 uma
62
alíquota de 2,4 mL e para outro tubo identificado como A2, uma alíquota de 0,2 mL, sendo
acrescentado a esse último 2,2 mL de solução de ferrocianeto de potássio 5%. Procedeu-se a
leitura das amostras em λ=632 nm em espectrofotômetro, para obtenção de valores de A1 e
A2. Acrescentou-se 100 μL da solução neutralizada de cianeto de sódio 10% nos tubos A1 e
A2, agitou-se em vórtex por 30 s e novamente procedeu-se a leitura λ=632 nm em
espectrofotômetro, para obtenção de valores de A3 e A4 (Figura 26).
63
Figura 26: Esquema da técnica de metemoglobina, descrita por Evelyn e Malloy (1938). Fonte: Hegesh et al
(1970)
Após a leitura das absorvâncias, calculou-se a taxa de metemoglobina pela
seguinte equação.
64
4.2.5 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS EM
ERITRÓCITOS
A produção de ERO foi avaliada através da utilização do DCFH-DA, que é
considerada uma excelente ferramenta para verificar a liberação de ERO em células, tais
como radical hidroxila, peroxila, radical alcoxila, peroxinitrito, bem como H2O2 (WANG e
JOSEPH, 1999). Suspensões de eritrócitos com hematócrito a 5% foram pré-incubadas com
RSV/ALA nas concentrações de 100 e 1000µM por 60 minutos, mediante isso foram
adicionadas juntamente alíquotas de 200µL de soluções de DDS-NOH nas concentrações de
2,5 e 7,5µg/mL e 10µL DCFH-DA (10mM), sendo o tempo de incubação de 30 minutos a
37°C. O mesmo procedimento foi feito para os grupos controles (Figura 27) de DDS-NOH
(2,5 e 7,5µg/mL) e RSV/ALA (100 e 1000µM), além destes grupos controles foi utilizado o tBHP a 200µM como grupo positivo, pois este composto é capaz de induzir grandes
quantidades de ERO no meio intracelular (LISOVSKAYA et al. 2009).
O método consiste na capacidade do DCFH-DA atravessar a membrana celular, sendo
que quando presente no citoplasma sofre hidrólise por esterases celulares formando o
composto DCFH, o qual é facilmente oxidado pela ação de ERO presentes no meio
intracelular e o resultado desta reação geram o composto fluorescente, diclorofluoresceína
(DCF). A fluorescência foi medida nos eritrócitos pela técnica de citometria de fluxo FACS
Calibur (Becton-Dickinson) com excitação de λ=488nm (laser azul) e com um filtro de
emissão de λ=530 nm (RICHARD et al. 2002; GRASSO et al. 2003). Os resultados foram
analisados em dot density plot do programa WinMDI 2.9.
65
Figura 27: Esquema da avaliação da produção de espécies reativas pela oxidação química de DCFH em
suspensão de eritrócitos a 5%. O controle positivo foi o Terc-butilhidroperóxido (T-BHP) a 200µM.
4.2.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA CATALASE
A atividade da catalase foi determinada conforme o método descrito por Aebi (1984),
as suspensões de eritrócitos foram hemolisadas em água gelada (1:3) para em seguida serem
diluídas em tampão TRIS base (Tampão Tris 1M/EDTA 5mM ; pH8,0). No entanto, para
realizar a leitura, ou seja, verificar o decaimento do H2O2, alíquotas das amostras diluídas
foram adicionados a 900µL de solução de reação (Tampão TRIS base, peróxido de hidrogênio
30% e água ultrapura) pH 8, sendo que cada amostra continha seis réplicas (BUKOWSKA e
KOWALSKA, 2004). A diminuição da concentração de H2O2 foi verificada em
espectrofotômetro (Shimadzu UV-visível 1800) a λ=240 nm a 37°C durante 60 segundos. A
atividade de catalase foi definida como a atividade necessária para degradar um 1 mol H2O2
em 60 seg, em pH 8 a 25°C , sendo expressa como U / mg proteina (BUKOWSKA e
KOWALSKA, 2004). O coeficiente de extinção molar do H2O2 utilizado para o cálculo foi de
39,4 cm2/mol.
66
4.2.7 PROTEÍNAS TOTAIS
Os dados de atividade enzimática obtida no ensaio da CAT foram normalizados pelas
respectivas concentrações protéicas totais, usando-se o Kit comercial Doles.
4.2.8 DETERMINAÇÃO DA SUPERÓXIDO DISMUTASE
A determinação da atividade da SOD foi realizada segundo a técnica preconizada por
McCord e Fridowich (1969) adaptada. Esta metodologia é de detecção indireta da atividade
da SOD, pois a presença desta enzima na amostra promove a conversão do O2.- em H2O2, o
qual é gerado pela reação que ocorre entre a xantina oxidase e a hipoxantina presente no meio
de reação impedindo desta maneira a redução do citocromo C que também encontra-se no
meio. A atividade da SOD foi avaliada pela técnica de espectrofotometria com λ=550nm
(Shimadzu UV-visível 1800) e expressa em nmol/ mL do hemolisado dos grupos, tratamento:
RSV/ALA (100 e 1000µM) e DDS-NOH (2,5 µg/mL) e controle. Neste ensaio, uma unidade
de atividade é definida como a quantidade de enzima que promove 50% de inibição da
redução do citocromo C à 25ºC em pH 7,8.
4.2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi feita usando GraphPad Prism 5.1 (2007), para análise de
variância uma via, seguida do teste de Tukey nos pares de médias da curva dose resposta
DDS-NOH e para os demais experimentos, os resultados são expressos em média ± desvio
padrão e considerados estatisticamente significativos para p ≤ 0,05 . Por outro lado, foi
utilizado o teste de Mann-Whitney usando o programa BioEstat 5.0 (2007) para realização das
comparações do %MetHb dos dois grupos independentes do estudo, grupo exposto ao DDSNOH e tratado com RSV; grupo exposto ao DDS-NOH e não tratado. O resultado apresenta
uma significância quando (P-valor) < 0, 05.
67
5 RESULTADOS
5.1 Curva dose-resposta do DDS-NOH em eritrócitos in vitro
A fim de verificar in vitro o percentual de metemoglobina (%MetHb) nas suspensões
de eritrócitos expostas ao DDS-NOH nas diferentes concentrações de 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0
µg/mL, incubou-se essas células por 60 min a 37°C, bem como descrito no item 4.2.3.1.
Logo, a partir desse experimento foi possível se obter uma curva dose resposta do DDS-NOH
em eritrócitos de voluntários sadios.
A figura 28 mostra que o DDS-NOH em todas as concentrações testadas foi capaz de
induzir significativamente o aumento do %MetHb ( *p ≤ 0,05), em relação as células expostas
ao metanol. Além disso, observou-se que o efeito metemoglobinizante do DDS-NOH foi dose
dependente.
Figura 28: Percentual de metemoglobina em suspensão de eritrócitos normais expostos ao DDS-NOH, nas
concentrações 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0 µg/mL, in vitro. No grupo controle, os eritrócitos foram expostos ao metanol
(solvente). A determinação de metemoglobina foi realizada por espectrofotometria em λ=632nm. Os %MetHb
dos grupos foram comparados pelo teste de Mann-Whitney, sendo os resultados realizados em triplicatas.
*comparado ao grupo metanol.
68
5.2 Efeito do Resveratrol e do Ácido α-Lipóico na metemoglobina
induzida pelo DDS-NOH em eritrócitos normais in vitro
Com o intuito de verificar o efeito do RSV e do ALA na metemoglobina induzida em
suspensão de eritrócitos pelo DDS-NOH (2,5; 5,0 e 7,5 µg/mL) foram feitas pré-incubação
com RSV e ALA (10; 100; 200 e 1000 µM) por 60 min, como descrito no item 4.2.3.2.
A figura 29 (A, B, C, D) mostra que o RSV nas concentrações de 10µM (A), 100µM
(B), 200µM (C), 1000 µM (D) foi capaz de inibir significativamente o % MetHb induzido
pelas diferentes concentrações ( 2,5; 5,0 e 7,5 µg/mL) de DDS-NOH. Observa-se que o RSV
apresenta um efeito anti-metemoglobinizante não dose-dependente, uma vez que todas as
concentrações de RSV foram eficientes na redução da MetHb induzida por diferentes
concentrações de DDS-NOH. No entanto, ao analisar o efeito das diferentes concentrações de
RSV na redução MetHb induzida por DDS-NOH em eritrócitos in vitro, observou-se que o
RSV nas concentrações de 100 e 1000µM se mostraram mais eficazes em inibir o %MetHb in
vitro.
69
Figura 29: Percentual de metemoglobina induzida por diferentes concentrações de dapsona-hidroxilamina (2,5;
5,0 e 7,5 µg/mL) em suspensão de eritrócitos normais que foram pré-tratados com resveratrol (10; 100; 200 e
1000 µM) por 60 min a 37°C in vitro. O grupo controle foi representado pelos eritrócitos incubados apenas com
metanol P.A. A determinação de metemoglobina foi feita por espectrofotometria em λ=632nm. . Os %MetHb
dos grupos foram comparados pelo teste de Mann-Whitney, sendo os resultados realizados em triplicatas. #
comparado ao grupo de células que foram incubados apenas com dapsona-hidroxilamina.
Bem como a pré-incubação com ALA 10µM (A), 100µM (B), 200µM (C), 1000 µM
(D) por 60 min e 37°C in vitro (Figura 30) foi capaz de reduzir significativamente a
metemoglobina induzida pelo DDS-NOH em diferentes concentrações. De acordo com o
%MetHb, observou-se que nas concentrações de 100 e 1000 μM, este composto apresentou
maior eficácia na proteção e/ou reversão do efeito metemoglobinizante induzido do
metabólito DDS-NOH in vitro.
70
Figura 30: Percentual de metemoglobina induzida por diferentes concentrações de dapsona-hidroxilamina (2,5;
5,0 e 7,5 µg/mL) em suspensão de eritrócitos normais que foram pré-tratados com ácido α-lipóico (10; 100; 200
e 1000 µM) por 60 min a 37°C in vitro. O grupo controle foi representado pelos eritrócitos incubados apenas
com metanol P.A. A determinação de metemoglobina foi feita por espectrofotometria em λ=632nm. O %MetHb
dos grupos foram comparados pelo teste de Mann-Whitney, sendo os resultados realizados em triplicatas. #
comparado ao grupo de células que foram incubados apenas com dapsona-hidroxilamina.
71
5.3 Curva temporal da pré-incubação do Resveratrol em eritrócitos
expostos a DDS-NOH in vitro
A fim de verificar se o efeito do RSV na metemoglobina induzida em suspensão de
eritrócitos pelo DDS-NOH é dependente do tempo de pré-incubação com o RSV, os
eritrócitos foram pré-tratados com 100µM de RSV por diferentes tempos 30-120 min, em
seguida, os eritrócitos foram expostos à DDS-NOH (2,5µg/mL).
Conforme a figura 31, observa-se que os valores da média do % MetHb de eritrócito
incubados somente com DDS-NOH (2,5µg/mL) foi de 19,24. A pré-incubação de eritrócitos
com RSV (100µM) nos tempos de 60 e 90 min foi mais eficaz em proteger as células do
efeito metemoglobinizante induzido pelo DDS-NOH, cujas médias do % MetHb foram 7,19 e
8,64, respectivamente. No entanto, não se observou diferença entre os valores do% MetHb
nos diferentes tempos de incubação (60 e 90 min) com RSV. Por outro lado, o tempo de préincubação de 30 e 120 min não foram eficazes na proteção dos eritrócitos.
Figura 31: Percentual de metemoglobina induzida por dapsona-hidroxilamina (2,5 µg/mL) em suspensão de
eritrócitos normais que foram pré-tratados com resveratrol (100µM) por diferentes tempos (30, 60, 90 e 120
min). Como grupos controles, utilizaram-se células incubadas somente com resveratrol (100µM). A
determinação de metemoglobina foi feita por espectrofotometria em λ=632nm. O %MetHb dos grupos foram
comparados pelo teste de Mann-Whitney, sendo os resultados realizados em triplicatas. # comparado ao grupo de
células que foram incubados apenas com dapsona-hidroxilamina.
72
5.4 Efeitos do azul de metileno na metemoglobina induzida pelo
DDS-NOH em eritrócitos normais in vitro
Clinicamente, o azul de metileno é considerado o principal fármaco utilizado no
tratamento para a metemoglobinemia induzida por DDS em pacientes. Portanto, esse agente
redutor foi utilizado como controle positivo a fim de comparar a eficácia do efeito antimetemoglobina do RSV e do ALA in vitro.
As suspensões de eritrócitos foram pré-incubadas com azul de metileno (15ng/mL) por
30 min a 37°C e posteriormente essas células foram incubadas com DDS-NOH (2,5; 5,0 e 7,5
µg/mL) por 60 min. Pode-se observar na figura 32 que o azul de metileno foi capaz de reduzir
significativamente a metemoglobina induzida por diferentes concentrações de DDS-NOH.
Figura 32: Percentual de metemoglobina induzida por diferentes concentrações de dapsona-hidroxilamina (2,5;
5,0 e 7,5 µg/mL) em suspensão de eritrócitos normais que foram pré-tratados com azul de metileno (15ng/mL)
por 30 min a 37°C in vitro. Como grupos controles, utilizaram-se células incubadas somente com metanol. A
determinação de metemoglobina foi feita por espectrofotometria em λ=632nm. O %MetHb dos grupos foram
comparados pelo teste de Mann-Whitney, sendo os resultados realizados em triplicatas. # comparado ao grupo de
células que foram incubados apenas com dapsona-hidroxilamina.
O efeito redutor do azul de metileno (15ng/mL) foi comparado ao do RSV (100µM) e
ALA (1000µM), sendo a análise estatística realizada através do Teste não-paramétrico MannWhitney. De acordo com a figura 33 (A), observa-se que a pré-incubação com RSV (100 µM)
73
somente apresentou a mesma eficiência que o azul de metileno em inibir a MetHb quando a
concentração de DDS-NOH foi de 2,5µg/mL. Nas demais concentrações de DDS-NOH,
observou-se diferença estatística entre os valores de MetHb dos grupos pré-tratados com Azul
de metileno e com RSV.
No entanto, observa-se na figura 33 (B) que o pré-tratamento com ALA (1000μM)
conseguiu reduzir o percentual de metemoglobina induzida pelo DDS-NOH em todas as
concentrações do metabólito testadas, 2,5; 5,0 e 7,5 μg/mL, sobretudo quando comparado
com o Azul de metileno o ALA apresentou-se mais eficaz na inibição de MetHb induzida por
DDS-NOH na concentração de 5,0 e 7,5 μg/mL. Nota-se, então, que o ALA (1000µM)
possuiu um maior efeito redutor de MetHb que o Azul de metileno, o qual é considerado o
agente redutor padrão para tratamento de metemoglobinemia.
74
Figura 33: Comparação das médias do percentual de metemoglobina obtidas em suspensão de eritrócitos
normais pré-incubados com azul de metileno (15ng/mL) ou com resveratrol (100µM)/ ácido α-lipóico (1000µM)
in vitro. Os grupos controles foram células incubadas somente com metanol. A determinação de metemoglobina
foi feita por espectrofotometria em λ=632nm.O %MetHb dos grupos foram comparados pelo teste de MannWhitney, sendo os resultados realizados em triplicatas. # comparado ao grupo de células que foram incubados
apenas com dapsona-hidroxilamina; **comparado ao grupo tratado com resveratrol; °° comparado ao grupo
tratado com ácido α-lipóico.
75
5.5 Detecção de ERO intracelulares em suspensões de eritrócitos
pré-incubados com RSV/ALA e incubados com DDS-NOH in vitro
A concentração de ERO foi mensurada no meio intracelular a partir do percentual de
células que emitiam fluorescência. Portanto, para avaliar a produção de ERO em suspensões
de eritrócitos (hematócrito a 5%) expostos ao DDS-NOH (2,5 e 7,5µg/mL), estas células
foram pré-incubadas com DDS-NOH por 30 minutos e ao mesmo tempo incubadas com
DCFH-DA (10mM). Para comparar o efeito oxidativo do DDS-NOH (2,5 e 7,5µg/mL),
utilizou-se o T-BHP (200µM), um agente oxidante que é capaz induzir elevados níveis de
ERO em eritrócitos. Além disso, foi avaliado o potencial antioxidante de RSV e ALA (100 e
1000µM), a partir da pré-incubação de suspensões de eritrócitos a 5% com estes antioxidantes
em diferentes concentrações.
A figura 34 (A e B) mostra que suspensões de eritrócitos incubadas com DDS-NOH
(2,5 e 7,5µg/mL) apresentaram níveis significativos na produção de ERO quando comparado
ao grupo controle negativo (eritrócitos). A pré-incubação com RSV e ALA (100 e 1000µM)
reduziu significativamente a produção de ERO induzida por DDS-NOH (2,5 µg/mL) quando
comparada aos eritrócitos incubados com DDS-NOH (2,5 µg/mL) e sem pré-tratamento
(Figura 34-A e B). Observa-se também que o DDS-NOH (7,5µg/mL) apresentou efeito
semelhante ao do controle positivo T-BHP (200µM) na elevação da produção de ERO
mostrando que a produção de ERO por DDS-NOH foi dose-dependente. No entanto, o RSV
(100 µM) e ALA (100 e 1000µM) não alteraram os níveis de ERO nos eritrócitos expostos ao
DDS-NOH (7,5µg/mL). Contudo, o pré-tratamento com RSV (1000µM) foi capaz de inibir
significativamente a produção de ERO induzido pelo DDS-NOH na concentração de
7,5µg/mL (Figura 34A e 34B).
76
Figura 34: O efeito dapsona-hidroxilamina (2,5 e 7,5 µg/mL) na produção de ERO em suspensão de eritrócitos
(Hematócrito a 5%). Os valores são representados pelo percentual de células fluorescentes, as quais indicam a
presença de ERO no meio intracelular. (A) As suspensões de eritrócitos normais foram pré-incubados com RSV
(100 e 1000µM) durante 60 minutos e incubadas com DDS-NOH (2,5 e 7,5µg/mL) e DCFH-DA (10mM) por 30
minutos. (B) ALA (100 e 1000µM) durante 60 minutos e incubadas com DDS-NOH (2,5 e 7,5µg/mL) e DCFHDA (10mM) por 30 minutos. O grupo controle positivo foi T-BHP (200µM) e o grupo negatico foi eritrócitos.
Os dados foram expressos em % células fluorescentes, sendo os resultados realizados em seis réplicas diferentes.
*comparado ao grupo eritrócitos; #comparado ao grupo tratado apenas com dapsona-hidroxilamina (2,5 µg/mL);
#comparado ao grupo tratado apenas com dapsona-hidroxilamina (7,5 µg/mL).
77
5.6 Atividade da Catalase (CAT) em suspensões de eritrócitos préincubados com RSV/ALA e incubados com DDS-NOH in vitro
O efeito do DDS-NOH (2,5 µg/mL) sobre a atividade da CAT eritrocitária foi
demonstrado em suspensões de eritrócitos pré-incubadas ou não com RSV e ALA (100 e
1000µM), como mostra a figura 35 (A e B).
Nos dados mostrados na figura 35A é possível observar que a incubação com DDSNOH (2,5µg/mL) levou a diminuição da atividade de CAT e o pré-tratamento dessas células
com RSV (100 e 1000µM) não reverteu à inibição da atividade dessa enzima induzida pelo
DDS-NOH. Em relação aos dados com ALA, a figura 35B mostra que a incubação com DDSNOH (2,5µg/mL) inibiu a atividade de CAT, e o pré-tratamento com ALA (100 µM) foi
capaz de reveter significativamente a diminuição da atividade dessa enzima, retornando a
níveis do controle.
78
Figura 35: O efeito do dapsona-hidroxilamina (2,5 µg/mL) sobre a atividade da catalase em suspensão de
eritrócitos pré-incubados com resveratrol e ácido α-lipóico. A determinação da atividade da catalase foi feita por
espectrofotometria em λ=240nm. Os dados foram expressos em média ± desvio padrão, sendo os resultados
realizados em seis réplicas diferentes. * comparado ao grupo metanol e # comparado ao grupo dapsonahidroxilamina. (A) As suspensões de eritrócitos normais foram pré-incubadas com resveratrol (100 e 1000µM)
durante 60 minutos e incubadas com dapsona-hidroxilamina (2,5 µg/mL) por 60 minutos. (B) ácido α-lipóico
(100 e 1000µM) durante 60 minutos e incubadas com dapsona-hidroxilamina (2,5 µg/mL) por 60 minutos.
79
5.7 Atividade da SOD em suspensões de eritrócitos pré -incubados
com RSV/ALA e incubados com DDS-NOH in vitro
O efeito do DDS-NOH (2,5µg/mL) sobre a atividade da SOD eritrocitária foi
demonstrado em suspensões de eritrócitos pré-incubadas ou não com RSV e ALA (100 e
1000µM), como mostra a figura 36(A e B).
A figura 36 (A e B) mostra que suspensões de eritrócitos incubadas com DDS-NOH
(2,5 µg/mL) não apresentaram alteração na atividade de SOD. Além disso, o pré-tratamento
com RSV e ALA nas diferentes concentrações não interferiu na atividade de SOD em
eritrócitos incubados com DDS-NOH (2,5µg/mL). Em contrapartida, o tratamento com TBHP (200µM) foi capaz de reduzir significativamente a atividade dessa enzima quando
comparada ao grupo controle.
80
Figura 36: O efeito do dapsona-hidroxilamina (2,5µg/mL) sobre a atividade da superóxido dismutase em
suspensão de eritrócitos pré-incubados com resveratrol e ácido α-lipóico. A determinação da atividade da
superóxido dismutase foi feita por espectrofotometria em λ=550nm. Os dados foram expressos em média ±
desvio padrão, sendo os resultados realizados em seis réplicas diferentes. *comparado ao grupo metanol. (A) As
suspensões de eritrócitos normais foram pré-incubadas com resveratrol (100 e 1000µM) durante 60 minutos e
incubadas com dapsona-hidroxilamina (2,5µg/mL) por 60 minutos. (B) ácido α-lipóico (100 e 1000µM) durante
60 minutos e incubadas com dapsona-hidroxilamina (2,5µg/mL) por 60 minutos. O grupo controle positivo foi
T-BHP (200µM) período de incubação de 30 minutos.
81
6 DISCUSSÃO
Conforme Wozel (1989) a DDS é o principal fármaco da PQT, devido ser o único
dentres os demais a ser administrado diariamente por 6 meses por pacientes com a forma
paucibacilar e pacientes com a forma multibacilar a administração diária é feita associada com
a clofazimina por 12 meses (OMS, 1982). A sua eficácia é bem descrita também no
tratamento de dermatite herpetiforme e de outras condições dermatológicas de caráter
inflamatório. No entanto, o uso terapêutico deste fármaco está sendo cada vez mais limitado e
o motivo para tal restrição está relacionado ao seu efeito hematotóxico (DEGOWIN et al.
1966).
Assim, com o intuito de verificar hemotoxidade deste fármaco, o nosso estudo
analisou in vitro o efeito hematotóxico de um dos metabólitos hidroxilamina da dapsona, o
DDS-NOH, uma vez que estudos in vitro de Grossman e Jollow (1988) mostraram que DDS
quando incubada com eritrócitos não induziu nenhum efeito hemotóxico sugerindo que a
toxidade ocasionada em pacientes é mediada pelos seus metabólitos.
Logo, os nossos resultados demonstraram que o metabólito DDS-NOH nas
concentrações de 2,5 a 10 µg/mL foi capaz de induzir a formação de elevados níveis de
metemoglobina (19 a 40%). Dados semelhantes a este foram observados no trabalho de Vage
et al. (1994), os quais mostraram que diferentes concentrações de DDS-NOH (10 a
100.000µM) ocasionaram também a formação de metemoglobina, cuja curva dose-resposta
apresentou efeito máximo(Emáx) de 81% de MetHb, assim como Reilly et al. (1999) que
utilizaram eritrócitos humanos e obtiveram Emáx de 83%, por outro lado, Emáx encontrado no
nosso estudo foi de 40%, este valor foi inferior ao dos demais estudos, devido utilizarmos
concentrações de DDS-NOH que se aproximavam das concentrações plasmáticas média da
dapona, sendo estes valores mostrados no trabalho de Vieira et al. (2010), os quais
constataram que 90% dos pacientes com hanseníase em uso de PQT apresentaram níveis
terapêuticos de dapsona no plasma com intervalo de 0,5 a 5 μg/mL.
A metemoglobinemia e anemia hemolítica são consideradas as reações adversas mais
frequentes observadas em pacientes hansenianos. Coleman (1993) demonstrou que esta
toxidade é ocasionada principalmente pelo metabólito N-hidroxilado da DDS, o DDS-NOH.
McMillan et al. (1998) ao averiguar o efeito hemolítico da DDS-NOH, a partir da
determinação da sobrevida dos eritrócitos de ratos marcados com 51Cr in vitro concluem que a
exposição destas células marcadas ao DDS-NOH (180µM) in vitro durante 2h resultou em
82
uma acentuada remoção destas células da circulação dos ratos, sendo encontrado tempo de
meia vida (T50%) de apenas 2h, os autores destacaram que este efeito hemolítico foi dosedependente, assim como este trabalho a hemotoxidade induzida por DDS-NOH no nosso
trabalho também foi dose-dependente. Assim, pode-se inferir que o uso prolongado da
dapsona com a dose diária de 100mg são fatores que devem ser revisto, além da possibilidade
de reduzir o tempo de tratamento que atualmente é de 6 a 12 meses, o que gera em alguns
casos desistência por parte dos doentes ou negligência ao tratamento devido às reações
adversas presentes ao longo do tratamento.
Deps et al. (2007) a fim de verificar o impacto das RAM no seguimento correto do
esquema medicamentoso reportaram a frequência de RAM em pacientes MB e PB durante os
30-90 dias de tratamento com a PQT. As RAM foram verificadas através de exames
laboratoriais, dentre eles: hemograma e testes de função hepática, a partir disso os autores
mostraram que maior parte das RAM encontradas nestes pacientes, com um total de 194
pacientes avaliados 85 pacientes apresentaram RAM devido ao uso da DDS, dentre elas:
anemia hemolítica, manifestações gastrointestinais, alterações hepáticas, tonturas, dores de
cabeça, metemoglobinemia e fraqueza. Em virtude disso, os autores mostraram que houve
uma interrupção do uso da DDS em 46 (54%) pacientes dos 85.
Estudos recentes como de Deps et al. (2012) e Gonçalves et al. (2012) mostraram que
o efeito hemolítico da DDS, bem como a incidência de outras RAM ocasionadas pelo uso da
DDS associado a rifampicina e clofazimina são problemas comuns enfrentados pelos
pacientes hansenianos. O estudo de Gonçalves et al. (2012) ao buscar possíveis voluntários
doentes para avaliar a eficiência de um novo modelo de PQT verificou que todos os pacientes
analisados para o estudo apresentaram um quadro significativo de anemia. No mais, eles
concluiram que tais achados devem-se à DDS e não a rifampicina, indicando uma possível
influência da clofazimina na gênese do aumento da incidência da anemia hemolítica atribuída
a esta sulfona.
Conforme Prasad et al. (2008) a metemoglobinemia e hemólise são os dois tipos de
consequências clínicas agudas ocasionadas por DDS, e que atualmente o único tratamento
farmacológico de escolha para a metemoglobina é o azul de metileno a 1%, e a uma dose de
1-2mg/Kg, sendo essa dose repetida a cada 4-6h, no entanto alguns pacientes não respondem
ao tratamento por serem portadores da deficiência de G6PD, bem como pelo efeito paradoxal
ocasionado por este antagonista, o qual em altas doses pode exacerbar o efeito de
metemoglobina, devido as suas propriedades oxidativas (ROSEN et al. 1971; HARVEY e
KEITT, 1983).
83
Com isso, várias terapias alternativas vêm sendo propostas para o tratamento dos
efeitos hematotóxico da DDS, tais como o de Coleman et al. (1990) que analisaram o efeito
da co-administração da cimetidina por voluntários em uso com DDS (100mg/dia). Sendo
concluído que este tratamento foi capaz de reduzir o processo de N-hidroxilação da DDS in
vivo, uma vez que a quantidade de DDS-NOH encontrada na urina dos voluntários foi
significativamente reduzida, e consequentemente foi demonstrado que o percentual de
formação de MetHb foi totalmente reduzido. Por outro lado, os autores observaram que houve
uma formação acentuada do metabólito monoacetil dapsona na presença da cimetidina, o qual
pode sofrer a reação de N-hidroxilação, formando assim o MADDS-NOH, que é também
considerado hematotóxico, assim como, o DDS-NOH (VAGE et al. 1994).
Jo et al. (2008) analisaram o efeito do antioxidante piruvato de etila na
metemoglobinemia induzida por DDS em ratos. O potencial antioxidante deste composto em
relação ao percentual de MetHb foi mensurado em diferentes tempos após a administração da
DDS (90, 180 e 360 min). E mostrou-se eficaz apenas na redução da MetHb formada nos
períodos de 90 e 180min.
Neste sentido, o presente estudo avaliou a ação protetora dos compostos antioxidantes;
resveratrol e ácido α-lipóico na metemoglobinemia induzida por DDS-NOH in vitro e alguns
parâmetros de estresse oxidativo, com o intuito de mostrar que estes compostos podem
apresentar ação efetiva contra esta reação adversa comumente presente em pacientes em uso
de doses terapêuticas da DDS, bem como reduzir a quantidade de espécies reativas geradas
pelo metabólito e o possível comprometimento das atividades das enzimas antioxidantes.
Mediante a avaliação do potencial redutor dos antioxidantes sobre os eritrócitos
expostos ao metabólito, os dados expostos neste estudo mostraram que o pré-tratamento com
diferentes concentrações de RSV e ALA reduziu significativamente a formação de
metemoglobina induzida pelo metabólito da DDS em diferentes concentrações. A atividade de
compostos antioxidantes também foi demonstrada por Tedesco et al. (2000), os quais
avaliaram o efeito protetor de polifenóis, como resveratrol e a quercetina, e estes quando
incubados com eritrócitos foram capazes de reduzir significativamente a formação de
metemoglobina ocasionada pelo t-BHP (terc-butil-hidroperóxido), bem como a hemólise por
H2O2.
Assim como no presente estudo, o potencial protetor do ácido α-lipóico também foi
demonstrado por Coleman e Taylor (2003) que compararam a capacidade do ALA e da sua
forma reduzida, o DHLA, com a do azul de metileno na redução da formação de MetHb
induzida por DDS-NOH in vitro. E após avaliar a eficácia destes dois antioxidantes no pré-
84
tratamento e tratamento dos eritrócitos expostos ao DDS-NOH, constataram-se que apenas o
DHLA foi capaz de inibir a formação de MetHb in vitro atuando semelhantemente como o
azul de metileno. Todavia, mesmo com este resultado, os autores sugerem que o ALA poderia
ser incluído como suplemento na prevenção da toxidade induzida pela DDS, já que o ALA
pode ser reduzido a sua forma DHLA tanto in vitro como in vivo (COLEMAN et al, 2001).
De certa forma este resultado mostrou que o tratamento com ALA pode ser favorável na
redução da toxidade da dapsona, o que pode ser confirmado com os nossos resultados, pois o
efeito redutor do ALA se destacou em relação ao do azul de metileno quando comparado a
capacidade de ambos na redução da MetHb induzida pelas concentrações de 5,0 e 7,5µg/mL
de DDS-NOH.
Caylak et al. (2008) demonstraram o efeito do ALA na anemia induzida por acetato de
chumbo em eritrócitos de ratos in vivo, sendo este efeito apresentado através das análises das
médias do nível de hemoglobina dos animais expostos a 2000 ppm de acetato chumbo e
daqueles que foram expostos e tratados com 25mg/kg/dia de ALA. Assim, mediante a este
tratamento, os autores concluiram que o ALA foi capaz de atenuar o efeito hemotóxico
causado pelo acetato de chumbo, uma vez que a média do grupo exposto foi de 12,71 g/dl, e
do grupo exposto e tratado com ALA foi de 16,51 g/dl, sendo este valor próximo ao do grupo
controle que foi de 16,52 g/dl. Leggett (1993) afirma que a intoxicação por chumbo promove
sérios danos oxidativos em eritrócitos, dentre eles, alterações na membrana de eritrócitos,
auto-oxidação da hemoglobina através da indução da produção de ERO, como O2-•e OH•,
bem como a inibição da síntese do grupo heme e da hemoglobina.
Portanto, a proteção do ALA demonstrada contra o efeito hemotóxico de xenobióticos
também foi observada nos nossos resultados, pois ele foi eficaz na redução do dano oxidativo
induzido na hemoglobina de eritrócitos expostos ao DDS-NOH. A razão para este efeito pode
está relacionado com a facilidade do ALA e DHLA em atravessar a membrana dos eritrócitos,
e agir na redução da GSSG, aumentando consequentemente a quantidade GSH no meio
intracelular, a qual age reduzindo a quantidade de ERO geradas por xenobióticos, além de
contribuir para a regeneração de vitamina E a partir da sua forma oxidada, e do ácido
ascórbico (MAY et al. 2007; ROCHETTE et al. 2013).
Todavia, mesmo existindo inúmeros estudos demonstrando o efeito antioxidante do
ALA em eritrócitos humanos ou de ratos, bem como em indivíduos saudáveis ou doentes, o
uso terapêutico em casos de danos oxidativos induzidos por xenobióticos ou por doenças
crônicas ainda é incerto, já que estudo de Martins et al. (2009) demonstraram que o
tratamento com o ALA em casos de anemia hemólitica crônica, isto é, anemia falciforme, não
85
foi capaz de reverter os baixos índices de eritrócito, hemoglobina, hematócrito e transferrina,
o que provavelmente explica este resultado é que pacientes falciforme estão sujeitos a um
estado de anemia crônica causado por frequentes crises hemolíticas. No mais, a ausência do
efeito protetor neste caso pode está relacionado também com a capacidade do ALA em
aumentar a atividade do [Ca2+] citosólico e ativar os canais de Ca2+ sensíveis ao K+ levando a
hiperpolarização da membrana com subsequente perda de KCl, o que favorece o
encolhimento do eritrócito (BHAVSAR et al. 2010). Além disso, a entrada de Ca+2 nos
eritrócitos provoca um desarranjo de fosfolipídio na membrana (ZHOU et al. 2002), levando
assim a perda da assimetria da fosfatidilserina (PS), mecanismo que é caracterizado pela
translocação da PS da face interna da membrana plasmática para a face externa, sendo assim a
partir dessa exposição da PS na superfície dos eritrócitos, a célula é reconhecida pelos
macrófagos, que possuem receptores específicos para PS. Com isso, os macrófagos
rapidamente engolfam e degradam estes eritrócitos do sangue periférico, sendo esses um dos
principais mecanismos que induzem a morte suicida de eritrócitos, também denominada,
eriptose (CLOSSE et al. 1999).
O presente estudo não realizou a avalição de danos oxidativos em membranas de
eritrócitos, portanto não pode-se afirmar que o pré-tratamento com ALA altera hematócrito
das amostras tratadas e expostas ao DDS-NOH, contudo, pode-se afirmar que o prétratamento com ALA, na faixa de concentração de 10 a 1000µM, confere aos eritrócitos a
capacidade de proteção contra o efeito metemoglobinizante do DDS-NOH, sendo o percentual
de formação de MetHb bem menor nas amostras de eritrócitos pré-tratados. Além do ALA,
este trabalhou avaliou também o efeito protetor do RSV no estresse oxidativo induzido por
DDS-NOH, o qual conferiu tanto quanto o ALA a proteção contra a formação de MetHb,
embora esta redução foi tempo dependente, pois apenas os tempos de pré- incubação de 60 e
90 minutos foram eficazes em proporcionar um efeito protetor aos eritrócitos. Fato que
também foi comprovado por Pandey e Rizvi (2010), visto que somente após o período de 30
min é que o RSV foi capaz de proteger significativamente os eritrócitos expostos ao t-BHP in
vitro, e este efeito protetor foi reduzido quando o período de incubação foi superior a 120
min.
Outro estudo de Pandey e Rizvi (2009) utilizaram as concentrações de 10 e 100µM
RSV semelhantemente a este trabalho, e demonstraram que nessas concentrações o RSV foi
capaz de proteger os eritrócitos humanos submetidos ao estresse in vitro evitando a formação
de grupos de proteína carbonilada na membrana assim como a peroxidação lipídica. Além da
manutenção da integridade lipídica e da proteção contra dano oxidativo induzido em
86
proteínas, estudos demonstram que o RSV também pode inibir a morte suicida de eritrócitos
(eriptose) através da redução da exposição de fosfatidilserina (PS) na superfície de eritrócitos,
bem como na diminuição de [Ca+2] citosólico, e outros processos diretamente relacionados
com a eriptose (QADRI et al. 2009).
A ação antioxidante da maior parte dos polifenóis, como RSV, está associada a 3
processos: 1) aumento do nível intracelular de GSH; 2) bloqueio de influxo de Ca2+; 3)
remoção de ERO ou inativação destes radicais livres através da doação de átomos de
hidrogênio a estas moléculas interrompendo desta forma a reação em cadeia (RICE-EVANS
et al. 1996; GITIKA et al. 2006).
Galtieri et al. (2010) avaliaram que RSV tem a capacidade de diminuir a oxidação da
Hb, visto que esse composto interage com a Hb deslocando o estado conformacional da
mesma de T para R, estado de maior afinidade ao O2. Com isso, esses dados sugerem que o
RSV apresenta um papel estabilizante na molécula de Hb, protegendo-a de elevados níveis de
oxidação. O efeito protetor do RSV na oxidação da hemoglobina pode está associado também
a inibição do estresse oxidativo por meio da redução de ERO e atenuação de H2O2 e O2 (LIU
et al. 2003; CHEN et al. 2004). Bem como, pelo potencial de aumentar a expressão do heme
oxigenase 1, o qual cliva a molécula de heme e libera biliverdina, monóxido de carbono e
ferro. A biliverdina é subsequentemente convertida em bilirubina pela ação da biliverdina
redutase e o ferro livre é prontamente seqüestrado pela ferritina, e isto consequentemente
reduz os níveis de ERO (JUAN et al. 2005).
Logo, a importância deste trabalho está relacionada ao possível mecanismo de
proteção da hemoglobina pelos dois antioxidantes analisados, já que a hemoglobina está
altamente concentrada dentro dos eritrócitos e consequentemente envolvida em uma série de
reações de redução-oxidação que são responsáveis pela formação de estresse oxidativo nos
eritrócitos, pelo fato de favorecer a auto-oxidação da hemoglobina produzindo a
metemoglobina e radical ânion superóxido (RIFKIND e RAMASAMY et al. 2004). Assim ao
garantirmos a proteção desta proteína pela suplementação com ácido α-lipóico e/ou
resveratrol, a manutenção da integridade funcional e morfológica dos eritrócitos podem ser
aspectos relevantes na adesão ao tratamento da PQT.
Dessa forma, de acordo com os resultados apresentados, o RSV e o ALA foram
eficientes em todas as concentrações analisadas (10, 100, 200, 1000µM), sendo este efeito
redutor não dose-dependente, uma vez que foi capaz de atenuar o %MetHb induzida por
diferentes concentrações de DDS-NOH. Contudo, quando o efeito redutor do RSV foi
comparado ao azul de metileno, o RSV(100µM) só apresentou a mesma eficiência que o azul
87
de metileno em inibir a MetHb quando a concentração de DDS-NOH utilizada como estímulo
foi de 2,5µg/mL.
Baseando-se nos estudos de Walker et al. (2009) a formação de metemoglobina
induzida por 100mg/dia DDS pode chegar até 16% de MetHb em alguns pacientes, e que
estes podem apresentar sintomas, como: taquicardia, dispnéia e dor nas costas, além de
anemia, e mais gravimente hipóxia tecidual, a qual é decorrente do mau funcionamento do
transporte de O2 para os tecidos, devido a incapacidade de ligação do O2 proveniente dos
pulmões a Hb (MANSOURI e LURIE, 1993; UMBREIT, 2007).
A toxidade do DDS-NOH é bastante explorada, no que concerne, o seu efeito
hemotóxico, no entanto, alguns estudos, como o Veggi et al. (2008) e Reilly et al. (1999)
investigaram a relação deste efeito com a indução de estresse oxidativo através do
comprometimento de enzimas antioxidantes como, CAT e SOD, uma vez que, baseando-se no
processo de auto-oxidação da Hb, que além de resultar na formação de MetHb é considerado
o principal mecanismo de produção de O2-•. A SOD catalisa a reação de dismutação deste
radical à H2O2 que, em seguida, é degradado pela CAT e pela glutationa peroxidase formando
moléculas de H2O e O2 (BANERJEE e KUYPERS, 2004), no entanto, em condições de
estresse oxidativo, a ação antioxidante destas enzimas passa a ser ineficiente quanto à redução
de ERO que se encontram em grande quantidade, o que desta forma aumenta a suscetibilidade
dos eritrócitos a produção de MetHb e danos oxidativos.
No estudo, ao avaliar o efeito do DDS-NOH (2,5 e 7,5µg/mL) e do potencial
antioxidante do ALA e RSV (100 e 1000µM), considerando o potencial oxidante do
metabólito, observou-se que esse composto induziu uma produção acentuada de ERO nos
eritrócitos, e isto, foi verificado a partir da técnica de citometria de fluxo que é altamente
sensível a detecção de ERO em meio intracelular (AMER et al. 2003). Estes dados
corroboram aos de Vyas et al. (2005) que demonstraram a elevada produção de ERO em
cultura de células, a partir da incubação com os metabólitos DDS-NOH e MADDS-NOH,
bem como o efeito redutor do ácido ascórbico na neutralização de ERO induzidos por estes
metabólitos. Mediante, a avaliação do efeito antioxidante do RSV e do ALA, observou-se que
o RSV (1000µM) foi um potente antioxidante, devido à capacidade de reduzir quantidades
acentuadas de ERO geradas pelo DDS-NOH (2,5 e 7,5µg/mL). Por sua vez o ALA (100 e
1000µM) só apresentou eficácia na neutralização de ERO geradas pelo DDS-NOH
(2,5µg/mL).
A provável resposta para este efeito do resveratrol na atenuação de ERO no meio
intracelular pode ser justificado pela presença e posição dos grupos funcionais hidroxila, uma
88
vez que estudos sobre estrutura e atividade do resveratrol e de seus análogos indicam que os
determinantes estruturais necessários para a atividade antioxidante do resveratrol está na
presença da hidroxila na posição 4’, bem como a configuração trans do grupo funcional de
etileno na estrutura química deste estilbeno (STIVALA et al. 2001). Por outro lado, como
citado acima o efeito antioxidante do ALA na remoção de ERO foi parcialmente favorável,
porém não podemos descartar a sua eficiência, pois o ALA apresenta o grupo sulfidrílico na
sua estrutura química, o qual confere a este composto uma potente atividade antioxidante,
pois ele é capaz de reagir com radicais livres retirando-os do meio intracelular, bem como
capaz de reverter antioxidantes endógenos como a glutationa, vitamina E e vitamina C
(PACKER et al. 1995).
Neste contexto, além de verificar o efeito redutor dos antioxidantes, em relação à
produção de ERO, houve a necessidade de verificar o efeito destes antioxidantes sobre a
atividade das enzimas CAT e SOD, que possivelmente poderiam ser afetadas pelo estresse
oxidativo induzido pelo metabólito da DDS ou pela presença em excesso de radicais livres.
Logo, quanto à atividade da enzima SOD, os resultados não mostraram diferença de atividade
nos grupos estudados, principalmente no grupo de eritrócitos expostos ao metabólito na
concentração de 2,5µg/mL. Pode-se justificar este resultado através dos percentuais de
metemoglobina (média de 19%) observados nos eritrócitos expostos ao que relativamente
podem ter gerado quantidades de ERO que foram reduzidos eficientemente pelo sistema
antioxidante dos eritrócitos sem comprometer atividade da SOD. Dados semelhantes a este
comportamento da SOD foi observado em pacientes com anemia falciforme que faziam a
suplementação ou não com ALA (200mg/dia; MARTINS et al, 2009).
Por outro lado, os resultados da atividade da enzima CAT evidenciaram uma
significativa diminuição no grupo exposto ao DDS-NOH (2,5µg/mL). E o efeito do prétratamento com os antioxidantes estudados foi favorável apenas quando estas células foram
primeiramente tratadas com ALA (100µM) mostrando-se eficiente na reversão dos níveis
basais de CAT destas células. O fato de o ALA ter apresentado esta ação pode ser explicado
da seguinte maneira: reduziu acentuadamente a oxidação do DCFH, ou seja, atenuou
significativamente a quandidade de ERO presente no meio intracelular, bem como foi capaz
de reverter potencialmente a formação de MetHb induzida pelo metabólito diminuindo a
formação de íons superóxido e consequentemente de peróxido de hidrogênio proporcionando
desta maneira o equilíbrio da atividade da enzima catalase.
89
A falta de atividade do RSV, em relação reversão da diminuição da atividade da CAT
demonstrada neste trabalho, nos permite inferir que há a necessidade de desenvolver técnicas
mais sensíveis para analisar os sistemas de defesa antioxidantes que estão presentes em
diversos tipos celulares, tais como, as técnicas utilizadas por He et al, (2012), que constataram
que o pré-tratamento com RSV conferiu uma redução no estresse oxidativo induzido pelo
Paraquat (PQ), que é um herbicida considerado altamente tóxico para humanos, provocando
edema pulmonar e destruição do epitélio bronquial (BUS e GIBSON, 1984). Vale ressaltar
também que a atividade antioxidante de um composto depende da concentração que ele se
encontra e também do tipo de célula que esta atividade é avaliada (GUTTERIDGE e
HALLIWELL, 2010).
A partir dos dados, em conjunto, constatou-se que dentre os tratamentos estudados
com antioxidantes em eritrócitos expostos ao DDS-NOH in vitro, o ALA mostrou melhor
eficácia na redução de um dos principais efeitos adversos da DDS, que é a formação de
MetHb. Fato que pode ser ocorrido por um mecanismo dependente da ação da enzima CAT
sobre a produção acentuada de ERO induzida pelo DDS-NOH (2,5µg/mL), proporcionando
assim a proteção da Hb contra a oxidação induzida pelo H2O2 e de outros ERO.
É importante salientar que um recente estudo sugeriu que a excessiva oxidação da Hb
pode ser reconhecida pelo sistema imune inato como algo prejudicial ao organismo, o que
pode induzir a expressão de genes de citocinas pró-inflamatórias em células endotelias in
vitro, bem como o recrutamento de polimorfonucleares in vivo, e em condições de hemólise
pode ocorrer o remodelamento da parede vascular (MARTIN-VENTURA et al. 2012).
Por este motivo, foi de suma importância o desenvolvimento deste trabalho, já que foi
avaliada a ação de antioxidantes contra a metemoglobinemia, reação adversa comumente
presente em pacientes hansenianos em uso com a DDS, os quais embora obtenham sucesso no
seu tratamento contra a hanseníase, podem estar susceptíveis ao surgimento de doenças
secundárias, principalmente doenças vasculares, tais como, aterosclerose e trombose, devido a
exposição prologada de ERO e níveis elevados de formação de MetHb.
Contudo, mesmo que haja dados favoráveis do ALA contra a hemotoxidade induzida
por DDS-NOH, não podemos elucidar o efeito real do ALA nesta RAM, uma vez que o ALA
em determinadas concentrações podem agir diminuindo o fibrinogênio, fator VII e fator de
Von Willbrand, fatores procoagulantes que atuam no processo de hemostasia, o qual garante
integridade do endotélio vascular e da fluidez do sangue (FORD et al. 2001).
Assim, para que a suplementação diária com antioxidantes como o ALA possa a vir
ser inserida ao tratamento da hanseníase juntamente com a PQT, é de suma importância
90
garantir a segurança desta suplementação, porém, este trabalho inicialmente pôde demonstrar
que este antioxidante garantiu aos eritrócitos uma possível proteção contra os danos
oxidativos induzido pelo metabólito da DDS.
91
7 CONCLUSÕES
No estudo sobre o processo oxidativo em suspensões de eritrócitos humanos induzidos
por DDS-NOH, observou-se que:
 O metabólito DDS-NOH foi capaz de induzir metemoglobina in vitro.
 A pré-incubação com RSV e ALA em diferentes concentrações reveteram a
formação de metemoglobina induzida pelo DDS-NOH, sendo que o ALA foi
mais eficaz do que o do azul de metileno e RSV na reversão desse efeito.
 O RSV e o ALA mostraram ser eficiente na remoção de ERO do meio
intracelular induzido por DDS-NOH (2,5µg/mL), mas somente RSV foi capaz
de inibir a produção de ERO induzido pela maior concentração de DDS-NOH
(7,5 µg/mL).
 O ALA (100µM) reverteu a redução da atividade da CAT induzido pelo DDSNOH (2,5µg/mL);
 A exposição ao DDS-NOH e pré-tratamento com RSV e ALA não alteraram a
atividade de SOD;
Portanto, conclui-se que os compostos antioxidantes avaliados, o ALA e o RSV
mostram possuir potencial terapêutico na prevenção da metemoglobina induzida por DDSNOH, no entanto, o ALA se mostrou mais eficaz na reversão desse efeito hematotóxico
quando comparado ao RSV e o azul de metileno. Com isso, outros estudos precisam ser
realizados para garantir a segurança desta suplementação, bem como sua eficácia, considerase importante a realização de um estudo in vivo nesta mesma temática já que nesta condição
outros parâmetros poderam ser analisados de maneira mais precisa.
92
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AEBI, H. Catalase in vitro. In: Packer L. Methods in Enzymology, Vol. 105. Academic Press, Orlando, pp.
121–126. 1984
AMER, J.; GOLDFARB, A.; FIBACH, E. Flow cytometric measurement of reactive oxygen species production
by normal and thalassaemic red blood cells. Eur J Haematol., v. 70, p. 84–90, 2003.
AMUKOYE, V.; WINSTANLEY, P.; WATKINS, W.; SNOW, R.; HATCHER, J.; MOSOBO,M. et al.
Chlorproguanil-Dapsone: Effective Treatment for Uncomplicated Falciparum Malaria. Antimic. agents and
chemotherapy., p. 2261-2264, 1997.
ANNIGERI, S. R.; METGUD, S. C.; PATIL, J. R. Lepromatous leprosy of histoid type. Indian J. Med.
Microbiol., v. 25, p.70–71, 2007.
ASHA, D. S.; SUBRAMANYAM, M. V. V.; VANI, R.; JEEVARATNAM, K. Adaptations of the antioxidant
system in erythrocytes of trained adult rats: Impact of intermittent hypobaric-hypoxia at two altitudes.
Comparative Biochemistry and Physiology., v. 140, p. 59–67, 2005.
ASLAN, M.; THORNLEY-BROWN, D. e FREEMAN, B. A. Reactive species in sickle cell disease. Annals
New York Academy of Sciences., v.899, p.375-391, 2000.
BAGGIO, B.; BORDIN, L.; GAMBARO, G.; PICCOLI, A.; MARZARO, G. e CLARI, G. Evidence of a link
between band 3 phosphorylation and anion transport in patients with ‘idiopathic’ calcium oxalate nephrolithiasis.
Miner. Electrolyte Metab., v. 19, p.17–20, 1993b.
BALDWIN, J. e CHOTHIA, C. Hemoglobin: the structural changes related to ligand binding and its allosteric
mechanism. J. Mol. Biol., v. 129, p. 175–220, 1979.
BANERJEE, T. e KUYPERS, F. Reactive oxygen species and phosphatidylserine externalization in murine
sickle red cells. British Journal of Haematology., v. 124, p. 391–402, 2004.
BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. M. e DAVID, J. P. Oxidative stress: Relations between the formation of
reactive species and the organisms’ defense. Química Nova, v.29, n. 1, p. 113-123, 2006.
BERGAMASCHI, M.M.; STEINHORST, G. K.; VALÉRIO, D. A.; QUEIROZ, R. H. Curcumin could prevent
methemoglobinemia induced by dapsone in rats. Food and Chemical toxicology., v. 49, p. 1638-1641, 2011.
BERTELLI, A. A.; GIOVANNINI, L.; STRADI, R.; URIEN, S.; TILLEMENT, J. P. e BERTELLI, A. Kinetics
of trans- and cis-resveratrol (3,4′,5- trihydroxystilbene) after red wine oral administration in rats. Int. J. Clin.
Pharmacol. Res., v.16, p.77–81, 1996.
BEUTLER, E.; LICHTMAN, M. A.; COLLER, B. S. e KIPPS, T. J. K. Hematology. 5. ed., New York: Mc
Graw-Hill, 1995, p.L51.
BEUTLER, E. G6PD Deficiency. Blood., v. 84, n. 11, p. 3613-3636, 1994.
BILSKA, A.; WLODEK, L. Lipoic acid- the drug of the future?. Pharmacological Reports., v. 57, p. 570-577,
2005.
BOOTH, S. A.; MOODY, C. E.; DAHL, M. V.; HERRON, M. J. e NELSON, R. D. Dapsone suppresses
integrin-mediated neutrophil adherence function. J. Invest. Dermatol., v. 98, p. 135–140, 1992.
BOZEMAN, P. M.; LEARN, D. B. e THOMAS, E. L. Inhibition of the human leukocyte enzymes
myeloperoxidase and eosinophil peroxidase by dapsone. Biochem. Pharmacol., v. 44, p. 553-563, 1992.
BORAN, P.; TOKUC, G.; YEGIN, Z. Methemoglobinemia due to application of prilocaine during circumcision
and the effect of ascorbic acid. J. Pediatr. Urol., v.4, p. 475–476, 2008.
93
BORDIN, L.; CLARI, G.; MORO, I.; DALLA VECCHIA, F. e MORET, V. Functional link between
phosphorylation state of membrane proteins and morphological changes of human erythrocytes. Biochem.
Biophys. Res. Commun., v. 213, p. 249–257, 1995.
BORDIN, L.; FIORE, C.; BRAGADIN, M.; BRUNATI, A. M. e CLARI, G. Regulation of membrane band 3
Tyr-Pby proteolysis of p72syk and possible involvement in senescence process. Acta. Biochim. Biophys. Sin.,
v. 41, p. 846–851, 2009.
BORDIN, L; FIORE, C.; ZEN, F.; COLEMAN, M. D.; RAGAZZI, E. e CLARI, G. Dapsone hydroxylamine
induces premature removal of human erythrocytes by membrane reorganization and antibody binding. British
Journal of Pharmacology., v. 161, p.1186–1199, 2010.
BUCARETCHI, F.; MIGLIOLI, L.; BARACAT, E. C. E.; MADUREIRA, P. R.; DE CAPITANI, E. M. e
VIEIRA, R. J. Exposição aguda à dapsona e metemoglobinemia em crianças: tratamento com doses múltiplas de
carvão ativado associado ou não ao azul de metileno. Jornal de Pediatria., v.76, n.4, p.290-4, 2000.
BUKOWSKA, B. E KOWALSKA, S. Phenol and catechol induce prehemolytic and hemolytic changes in
human erythrocytes. Toxicology Letters., v.152, p.73–84, 2004
BUS, J. S. e GIBSON, J. E. Paraquat: model for oxidant-initiated toxicity. Environ. Health Perspect., v. 55, p.
37–46, 1984.
BHAVSAR, S. K.; BOBBALA, D.; XUAN, N. T.; FÖLLER, M.; LANG, F. Stimulation of Suicidal
Erythrocyte Death by α-Lipoic Acid. Cell Physiol Biochem., v. 26, p. 859-868, 2010.
BLUM, R. N.; MILLAR, L. A.; GAGGINI, L. C e COHN, D. L. Comparative trial of dapsone versus
trimethoprim-sulfamethoxazole for primary prophylaxis of Pneumocystis carinii pneumonia. J. Ac. Im.
Defi. Syndrom., v. 5, p. 341-347, 1992.
BRADSHAW, T. P.; MCMILLAN, D. C.; CROUCH, R. K. e JOLLOW, D. J. Formation of free radicals and
protein mixed disulfides in rat red cells exposed to dapsona hydroxylamine. Free Radic Biol Med., v. 22,
p.1183–1193, 1997.
BRASIL. Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Ministério da Saúde.
Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. 2008. Acesso em 14/06/2011.
BRASIL, Portaria Nº 3.125, de 7 de outubro de 2010 . Aprova as Diretrizes para Vigilância Atenção e
Controle da hanseníase. Brasília: Ministério da Saúde., 2010.
BRASIL. Guia para o Controle da hanseníase. Brasília: Ministério da Saúde. Secretaria de Políticas de Saúde.
Departamento de Atenção Básica., 2002.
BRASIL. Doenças infecciosas e parasitárias: guia de bolso / Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância
em Saúde. Brasília : Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância
Epidemiológica. – 6. ed. rev. –Ministério da Saúde, 2005. 320 p. – (Série B. Textos Básicos de Saúde).
CAMBAU, E.; PERANI, E.; GUILLEMIN, I.; JAMET, P.; JI, B. Multidrug-resistance to dapsone, rifampicin,
and ofloxacin in Mycobacterium leprae. The Lancet., v.349, n. 9045 p.103-4, Jan. 1997.
CARRELL, R. W.; WINTERBOURN, C. C. e RACHMILEWITZ, E. A. Activated oxygen and haemolysis. Br.
J. Haematol., v. 30, p. 259–264, 1975.
CASADEVALL, V.U. Caracterización de derivados polifenólicos obtenidos de fuentes naturales.
Citotoxicidad y capacidad antioxidante frente a estrés oxidativo em modelos celulares. Barcelona, 2009.
Facultat de Farmàcia – Departament de Fisiologia - Universitat de Barcelona.
CAYLAK, E.; AYTEKIN, M.; HALIFEOGLU, I. Antioxidant effects of methionine, a-lipoic acid, Nacetylcysteine and homocysteine on lead-induced oxidative stress to erythrocytes in rats. Experimental and
Toxicologic Pathology., v. 60, p. 289–294, 2008.
CELLONA, R. V.; BALAGON, M. V. F.; DELA-CRUZ, E. C.; BURGOS, J. A.; ABALOS, R. M.; WALSH, G.
P.; TOPOLSKI, R.; GELBER, R. H.; WALSH, D. S. Long-term efficacy of 2 year WHO multiple-drug
94
therapy (MDT) multibacillary (MB) leprosy patients. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis., v. 71, p. 308-319,
2003.
CICCOLI, L.; FERRALI, M.; ROSSI, V.; SIGNORINI, C.; ALESSANDRINI, C.; COMPORTI, M. Hemolytic
drugs aniline and dapsone induce iron release in erythrocytes and increase the free iron pool in spleen and liver.
Toxicology Letters., v.29; v.110, n.1-2, p.57-66, 1999.
COLEMAN, M. D.; SCOTT, A. K.; BRECKENRIDGE, A. M. e PARK, B. K. The use of cimetidine as a
selective inhibitor of dapsone N-hydroxylation in man. Br. J. clin. Pharmac., v. 30, p.761-767, 1990.
COLEMAN, M. D. e TINGLE, M. D. Use of a metabolic inhibitor to reduce dapsone-dependent haematological
toxicity. Drug Dev. Res., v. 25, p.1-16, 1992.
COLEMAN, M. D. Dapsone: Modes of action, toxicity and possible strategies for increasing patient tolerance.
Br. J. Dermatol., v. 129, p. 507–513, 1993.
COLEMAN, M.D.; JACOBUS, D.P. Reduction of dapsone hydroxylamine to dapsona during methaemoglobin
formation in human erythrocytes in vitro. Biochemical Pharmacology, v.45, n.5, p.1027-33, 1993.
COLEMAN, M. D. Dapsone toxicity: some current perspectives. Gen. Pharmacol., v. 26, p. 1461,1995.
COLEMAN, M.D e WALKER, C.L. Effects of oxidized αlipoic acid and α-tocopherol on xenobiotic-mediated
methaemoglobin formation in diabetic and non-diabetic human erythrocytes in vitro. Environ. Toxicol and
Pharmaco., v. 8, p. 127-132, 2000.
COLEMAN, M.D.; EASON, R. C.; BAILEY, C. J. The therapeutic use of lipoic acid in diabetes: a current
perspective. Environm. Toxic. and Pharma., v. 10, p. 167–172, 2001.
COLEMAN, M. D. e TAYLOR, C. T. Effects of dihydrolipoic acid (DHLA), a-lipoic acid. N-acetyl cysteine
and ascorbate on xenobiotic-mediated methaemoglobin formation in human erythrocytes in vitro.
Environmental Toxicology and Pharmacology., v. 14, p. 121-127, 2003.
CONSTANTINESCU, A.; TRITSCHLER, H.; PACKER, L. Alpha-lipoic acid protects against hemolysis of
human erythrocytes induced by peroxyl radicals. Biochemistry & Molecular Biology International., v.33, p.
669-679, 1994.
CHEN, Z.H.; HURH, Y.J.; NA, H.K.; KIM, J.H.; CHUN, Y.J.; KIM, D.H. et al. Resveratrol inhibits TCDD
induced expression of CYP1A1 and CYP1B1 and catechol estrogen-mediated oxidative DNA damage in
cultured human mammary epithelial cells. Carcinogenesis., v. 25, p. 2005–2013, 2004.
CLOSSE, C.; DACHARY-PRIGENT, J et al. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to
vascular endothelium. Br. J. Haematol., v. 107, n. 2, p. 300-302, 1999.
CRIBB, A. E.; MILLER, M.; LEEDER, J. S.; HILL, J.; SPIELBERG, S. P. Reactions of the nitroso and
hydroxylamine metabolites of sulfamethoxazole with reduced glutathione. Implications for idiosyncratic
toxicity. Drug Metab Dispos., v. 19, 900–906, 1991.
DACIE, J. V. e LEWIS, S. M. Practical Haematology. 8.ed. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1995.
DALPINO, D. Atividade da NADH-redutase de metemoglobina em hemolisado e membranas eritrocitárias
de pacientes hansenianos sob tratamento sulfônico. 85f. Tese de doutorado, (doutorado em Medicina),
Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 1997.
DEGOWIN, R. L.; EPPES, R.B.; POWELL, R. D. e CARSON, P. E. The haemolytic effects of
diaphenylsulphone (DDS) in normal subjects and those with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.
Bull. W.H.O., v. 35, p.165. 1966.
DEPS, P et al. Hemolytic anemia in patients receiving daily dapsone for the treatment of leprosy. Lepr Rev., v.
83, p. 305–307, 2012.
DEPS, P. D.; NASSER, S.; GUERRA, P.; SIMON, M.; BIRSHNER, R. C.; RODRIGUES, L. C. Adverse effects
from multi-drug therapy in leprosy: a Brazilian study. Lepr Rev., v. 78, n. 3, p. 216–222, 2007.
95
DUNCAN, M. E.; MELSOM, R.; PEARSON, J. M.; MENZEL, S.; BAMETSON, R. S. A.; Clinical and
immunological study of four babies of mothers with lepromatous leprosy, two of whom developed leprosy in
infancy. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis., v.51, n.1, p.7–17, 1983.
DHARMENDRA. Classifications of leprosy. In: HASTINGS, R.C. Leprosy. 2.ed. New York: Churchill
Livingstone, 1994. p.179 - 90.
DHOPLE, A. M. In vitro activity of epiroprim, a dihydrofolate reductase inhibitor, singly and in combination
with brodimoprim and dapsone, against Mycobacterium leprae. Int J Antimicrob Agents., v. 12, p. 319–323,
1999.
EDSTEIN, M .D.; VEENENDAAL, J. R.; NEWMAN, K. e HYSLOP, R. Excretion of chloroquine, dapsone
and pyrimethamine in human milk. British Journal of Clinical Pharmacology., v.22, n.6, p.733-5, 1986.
EL-HUSSEINI, A.; AZAROV, N. Is threshold for treatment of methemoglobinemia the same for all? A case
report and literature review. Am. J. Emerg. Med., v.28, p.748e5–748e10, 2010.
ELLARD, G.A. Absorption, metabolism and excretion of di(rhoaminophenyl) sulphone (dapsone) and di(rhoaminophenyl) sulphoxide in man. British Journal of Pharmacology., v.26, n.1, p.212-7, 1966.
EL-MISSIRY, M.A.; ABOU-SEIF, M. Photosensitization induced reactive oxygen species and oxidative
damage in human erythrocytes. Cancer Lett., v. 158, p. 155–163, 2000.
EVELO, C.; SPOOREN, A.; BISSCHOPS, B.; BAARS, L.; NEIS, J. Two Mechanisms for Toxic Effects of
Hydroxylamines in Human Erythrocytes: Involvement of Free Radicals and Risk of Potentiation. Blood Cells,
Molecules, and Diseases, v.24, n.13, p.280–295, 1998.
EVELYN, K. A. e MALLOY, H. T. Microdetermination of oxyhemoglobin methemoglobin and sulfhemoglobin
in a single sample of blood. J. Biol. Chem., v.126, p. 655-662, 1938.
FARHI, D.; BÉGON, E.; WOLKENSTEIN, P. e CHOSIDOW, O.
Dermatologie Cosmétologie., v.2, n.2, p.103–117, 2005.
Dapsone in dermatology. EMC-
FUJINO, T.; WATANABE, K.; BEPPU, M.; KIKUGAWA, K.; YASUDA, H. Identification of oxidized protein
hydrolase of human erythrocytes as acylpeptide hydrolase. Biochimica Biophysica Acta., v. 1478, p. 102–112,
2000.
FORD, I.; COTTER, M. A.; CAMERON, N. E et al. The effects of treatment with alpha-lipoic acid or evening
primrose oil on vascular hemostatic and lipid risk factors, blood flow, and peripheral nerve conduction in the
streptozotocin-diabetic rat. Metabolism., v. 50, p. 868, 2001.
FREI, B. Molecular and biological mechanism of antioxidant action. Fed. Am. Soc. for Ex. Bio. J., v. 13, p.
963-964, 1999.
GALIZA NETO, G. C. e PITOMBEIRA, M. S. Aspectos Moleculares da Anemia Falciforme. Jornal Brasileiro
de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 39, n. 1, p. 51-56, 2002.
GALTIERI, A.; TELLONE, E.; FICARRA, S.; RUSSO, A. M.; BELLOCCO, E.; BARRECA, D et al.
Resveratrol treatment induces redox stress in red blood cells: a possible role of caspase 3 in metabolism and
anion transport. Biol. Chem., v. 391, p. 1057–1065, 2010.
GATTI, G.; HOSSEIN, J.; MALENA, M.; CRUCIANI, M.; BASSETTI, M. Penetration of dapsone into
cerebrospinal fluid of patients with AIDS. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy., v.40, n.1,
p.113-5, 1997.
GEORGAKOULI, K. et al. a-Lipoic acid supplementation up-regulates antioxidant capacity in adults with G6PD
deficiency. Food Chem. Toxicol. 2013.
GIBSON, Q. Introduction: congenital methemoglobinemia revisited. Blood., v. 100, p. 3445–3446, 2002.
GITIKA, B.; SAI, R. M.; SHARMA, S. K.; ILAVAZHAGAN, G.; BANERJEE, P. K. Quercetin protects C6
glial cells from oxidative stress induced by tertiary-butylhydroperoxide. Free Radic. Res., v. 40, p. 95–102,
2006.
96
GONAZALES, M. A.; MENENDEZ, C.; FONT, F.; KAHIGWA, E.; KIMARIO, J.; MSHNDA, H. et al. Costeffectiveness of iron supplementation and malaria chemoprophylaxis in the prevention of anaemia and malaria
among Tanzanian infants. Bull. W.H.O., v. 78, p. 97–107, 2000.
GONÇALVES, H. S. et al. Brazilian clinical trial of uniform multidrug therapy for leprosy patients - the
correlation between clinical disease types and adverse effects. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., v. 107, p. 74-78,
2012.
GOULART, I. M.; ARBEX, G. L.; CARNEIRO, M. H.; RODRIGUES, M. S.; GADIA, R. Efeitos adversos da
poliquimioterapia em pacientes com hanseníase: um levantamento de cinco anos em um Centro de Saúde da
Universidade Federal de Uberlândia. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical., v. 35, n.5, p.
453-460, 2002.
GUTTERIDGE, J. M.; HALLIWELL, B. Antioxidants: molecules, medicines, and myths. Biochemical and
Biophysical Research Communications., v. 393, p. 561–564, 2010.
GLADER, B. E. e CONRAD, M. E. Hemolysis by diphenylsulfones: Comparative effects ofDDS and
hydroxylamine-DDS. J. Lab. Clin. Med., v. 81, p. 267-272, 1973.
GRANTHAM, P. H.; WEISBURGER, E. K.; WEISBURGER, J. H. Dehydroxylation and deacetylation of Nhydroxy-N-2-fluorenylaceta- mide by rat liver and brain homogenates. Biochim. Biophys. Acta., v. 107, p. 414–
424, 1965.
GRASSO, S.; SCIFO, C.; CARDILE, V.; GULINO, R. e RENIS, M. Adaptative responses to the stress induced
by hyperthermia or hydrogen peroxide in human fibroblasts. Experimental Biology and Medicine., v. 228,
p.491–498, 2003
GREER, J. P.; FOERSTER, J.; LUKENS, J. N. Wintrobe’s Clinical Hematology, 11.ed. Lippincott Williams
& Wilkins Publishers, 2003.
GROSSMAN, S. J. e JOLLOW, D. J. Role of dapsone hydroxylamine in dapsone-induced hemolytic anemia. J.
Pharmacol. Exp. Ther., v. 244, p. 118–125, 1988.
GROSSMAN, S.; BUDINSKY, R. e JOLLOW, D. Dapsone-induced hemolytic anemia: role of glucose-6phosphate dehydrogenase in the hemolytic response of rat erythrocytes to N-hydroxydapsone. J. Pharmacol.
Exp. Ther., v. 273, p. 870–877, 1995.
HARAMAKI, N.; HAN, D.; HANDELMAN, G. J.; TRITSCHLER, H. J.; PACKER, L. Free Radic Biol Med.,
v. 22, p. 535-542, 1997.
HALL, A. H.; KULIG, K. W.; RUMACK, B. H. Drug- and chemical-induced methaemoglobinaemia. Clinical
features and management. Med. Toxicol., v. 1, p. 253–260, 1986.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Free Rad. Biol. Med.,3. ed. Oxford: Oxford University Press, 2001.
HALLIWELL, B. e GUTTERIDGE, J. M. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an
overview. Methods Enzymol., v. 186, p. 1–85, 1990.
HAN, D.; HANDELMAN, G.; MARCOCCI, L.; SEN, C. K.; ROY, S.; KOBUCHI, H.; TRITSCHLER, H.J.;
FLOHE, L.; PACKER, L. Lipoic acid increases de novo synthesis of cellular glutathione by improving cystine
utilization. BioFactors., v.6, p.321-338, 1997.
HANNA, P. E. Metabolic activation and detoxification of arylamines. Curr. Med. Chem., V. 3, p. 195–210,
1997.
HANDIN, R. I.; LUX, S. E. e STOSSEL, T. P. Blood: Principles and practice of hematology. Philadelphia: J.
B. Lippincott Company, p. 76-174, 1995.
HANSEN, D. G.; CHALLONER, K. R. e SMITH, D. E. Dapsone intoxication: two case reports. The Journal of
Emergency Medicine., v.12, n.3, p.347-51, 1994.
HALIM, N. K. e OGBEIDE, E. Haematological alterations in leprosy patients treated with dapsone. East
African Medical Journal., v.7, n.2, p.100-2, 2002.
97
HARRIS, J. R. Blood cell biochemistry. London: Plenum Press,. v. 3: Erythroid Cells. Cap. 7. 1991
HARVEY, J. W. e KEITT, A. S. Studies of the efficacy and potential hazards of methylene blue therapy in
aniline-induced methaemoglobinaemia. Br. J. Haematol., v. 54, p. 29–41, 1983.
HE, X.; WANG, L.; SZKLARZ, G.; BI, Y.; MA, Q. Resveratrol Inhibits Paraquat-Induced Oxidative Stress and
Fibrogenic Response by Activating the Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Pathway. J. Pharmacol.
and exp. thera., v. 342, n. 1, p. 81–90, 2012.
HOKAMA, N. K.; HOKAMA, P. O. N.; MACHADO, P. E. A. e MATSUBARA, L. S. Interferência da
malária na fisiologia e na fisiopatologia do eritrócito. Parte I- Eritrócito normal e vetor. J. Bras. Med.,
v. 83, n.1, p. 77-86, 2002.
HJELM, M. e DEVERDIER, C. H. Biological effects of aromatic amines. I. Methemoglobinemia, hemolysis and
Heinz-body formation induced by 4,4’- diaminodiphenylsulfone. Biochem. Pharmacol., v. 14, p. 1119-1128,
1965.
IGNATOWICZ, E.; BAUER-DUBOWSKA,W. Resveratrol, a natural chemopreventive agent against
degenerative diseases. Pol. J. Pharmacol., v.53, p. 557-569, 2001.
ISRAILI, Z. H.; CUCINELL, S. A.; VAUGHT, J.; DAVIS, B.; ZESSER, J. M. e DAYTON, P. G. Studies of the
metabolism of DDS in man and experimental animals. Formation of N-hydroxy metabolites. J. Pharmacol.
Exp. Ther., v. 187, p. 138–151, 1973.
JANG, J. H.; SURH, Y. J. Protective effect of resveratrol on beta-amyloid-induced oxidative PC 12 cell death.
Free Radic. Biol. Med., v. 34, p.181-190, 2001.
JO, Y. H.; KWON, W. Y.; LEE, J. H et al. The effect of ethyl pyruvate on dapsone-induced methemoglobinemia
in rats. Clin. Tox., v. 46, p.811-814, 2008.
JAFFE, E.R. (1981A) Methaemoglobin Pathophysiology. In: LISS, A. R. The Function of Red Cells:
Erythrocyte Pathobiology. New York, 1981. p. 133.
JUAN, S.H.; CHENG, T.H.; LIN, H.C.; CHU, Y.L.; LEE, W.S. Mechanism of concentration-dependent
induction of heme oxygenase-1 by resveratrol in human aortic smooth muscle cells. Biochem. Pharmacol., v.
69, n.1, p. 41–48, 2005.
KAZANIS, S. e MCCLELLAND, R. A. Electrophilic intermediate in the reaction of glutathione and
nitrosoarenes. J. Am. Chem. Soc., v. 114, p. 3052–3059, 1992.
KING, R. E.; BOMSER, J. A. e MIN, D. B. Bioactivity of resveratrol. Comprehensive Reviews in Food
Science and Food Safety., v. 5, p.65-69, 2006.
KINOSHITA, A.; NAKAYAMA, Y.; KITAYAMA, T.; TOMITA, M. Simulation study of methemoglobin
reduction in erythrocytes. Differential contributions of two pathways to tolerance to oxidative stress. FEBS
Journal., v. 274, p. 1449–1458, 2007.
KRAMER, P. A.; GLADER, B. E. e LI, T. K. Mechanism of methemoglobin formation by diphenylsulfones.
Effect of 4-amino-4'-hydroxyaminodiphenylsulfone and other p-substituted derivatives. Biochemical
Pharmacology., v. 21, n. 9, p. 1265-74, 1972.
KRINSKY, N. I. Mechanism of action of biological antioxidants. Exp. Biol. Med., v. 200, n.2, p. 248-254,
1992.
KWADIJK, S. e TORAÑO, J. S. High-performance liquid chromatographic methodwith ultraviolet detection for
the determination of dapsone and its hydroxylated metabolite in human plasma. Biomed. Chromatogr., v. 16, p.
203–208, 2002.
LEE, B.; MEDINA, I.; BENOWITZ, N.; JACOB, P.; WOFSY, C. e MILLS, J. Dapsone trimethoprim, and
sulfamethoxazole plasma levels during treatment of Pneumocystis pneumonia in patients with the acquired
immunodeficiency syndrome (AIDS). Evidence of drug interactions. Ann. Intern. Med., v. 110, p. 606-611,
1989.
98
LEE, K. B. e NASHED, T. B. Dapsone-induced sulfone syndrome. Ann Pharmacother., v. 37, p. 1044-1046,
2003.
LEE, R.; FOERSTER, J.; LUKENS, J.; PARASKEVAS, F.; GREER, J. e RODGERS, G. Wintrobe’s Clinical
Hematology. 10 ed. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins,1999. p. 196-217.
LEGGETT, R. W. An age-specific kinetic model of lead metabolism in humans. Environ Health Perspect.,
v.101, p. 598–616,1993.
LEHNINGER, A. L. Lehninger princípios de bioquímica. 3. ed. São Paulo, 2002. 975p.
LEXIS, L. A.; FASSETT, R. G.; COOMBES, J. S. a-Tocopherol and a-Lipoic Acid Enhance the Erythrocyte
Antioxidant Defence in Cyclosporine A-Treated Rats. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology., v. 98, p.
68–73, 2006.
LORENZI TF. Fisiologia das células do sangue e hemostasia. In: LORENZI TF, D’AMICO E, DANIEL MM,
SILVEIRA PAA, BUCCHERI.V. Manual de Hematologia Propedêutica e Clínica. 3ª Ed. Rio de Janeiro:
Atheneu; 2003.p.45-192.
LORENZI, T. F. Manual de hematologia propedêutica e clínica. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro., 4 ed. p.
44-83, 2011.
LOW, P. S.; RATHINAVELU, P. e HARRISON, M. L. Regulation of glycolysis via reversible enzyme binding
to the membrane protein band 3. J. Biol. Chem., v. 268, p.14627–14631, 1993.
LISOVSKAYA et al. Clotrimazole enhances lysis of human erythrocytes induced by t-BHP. ChemicoBiological Interactions., v. 180, p. 433–439, 2009.
LIU, J.C., CHEN, J.J., CHAN, P., CHENG, C.F., CHENG, T.H. Inhibition of cyclic strain-induced endothelin-1
gene expression by resveratrol. Hypertension., v. 42, p. 1198–1205, 2003.
MAGALHÃES, J. O uso de cosmeticos atraves dos tempos, envalhecimento cutâneo. In: Cosmetologia: com
questões de avaliação. Rio de Janeiro, p.33-42, 2000.
MANSOURI, A. e LURIE, A. A. Concise review: methemoglobinemia. Am. J. Hematol., v.42, p.7–12, 1993.
MARAGON, K.; DEVARAJ, S.; TIROSH, O.; PACKER, L. e JIALAL, I. Comparison of the effect of alphalipoic acid and alpha-tocopherol supplementation on measures of oxidative stress. Free Radical Biology and
Medicine., v.27, p. 1114-1121, 1999.
MARTIN-VENTURA, J.L.; MADRIGAL-MATUTE, J.; MARTINEZ-PINNA, R.; RAMOS-MOZO, R.;
BLANCO-COLIO, L et al. Erythrocytes, leukocytes and platelets as a source of oxidative stress in chronic
vascular diseases: Detoxifying mechanisms and potential therapeutic options. Thrombosis and Haemostasis.
108, 435-442.,2012.
MARTINS, V. D.; MANFREDINI, V.; PERALBA, M. C. R.; BANFATO, M. S. Alpha-lipoic acid modifies
oxidative stress parameters in sickle cell trait subjects and sickle cell patients. Clin. Nut., v. 28, p. 192–197,
2009.
MAY, J. M.; QU, Z. C.; NELSON, D. J. Uptake and reduction of alpha-lipoic acid by human erythrocytes. Clin.
Biochem., v. 40, p. 1135–1142, 2007.
MAY, J. M.; QU, Z. C. e MENDIRATTA, S. Protection and recycling of alfa-tocopherol in human erythrocytes
by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Bioph., v. 349, p. 281–289, 1998.
MEHTA, A.; MASON, P. J.; VULLIAMY, T. J. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Bailliere’s
Clinical Haematology., v. 13, n. 1, p. 1521–38, 2000.
MOHANDAS, N. e GALLAGHER, P. G. Red cell membrane: past, present, and future. Blood., v. 112, p. 39393948, 2008.
99
MORAES, M. O.; CARDOSO, C. C.; VANDERBORGHT, P. R.; PACHECO, A. G. Genetics of host response
in leprosy. Lepr. Rev., v. 77,p. 189-202, 2006.
MORALES, A. I.; BUITRAGO, J. M.; SANTIAGO, J. M.; FERNANDEZ-TAGARRO, M.; LOPEZ-NOVOA,
J. M.; PEREZ-RARRIOCANAL, F. Protective effect of trans-resveratrol on gentamicin-induced nephrotoxicity.
Antioxid. Redox Signal., v.4, n.6, p. 893-898, 2002.
MOREL, C. M. Multidrug therapy against leprosy. Development and implementation over the past 25 years, In:
World Health Organization, Geneva, 2004. p. VII-VIII.
MORIKAWA, T.; YASUNO, R.; WADA, H. FEBS LETT., v. 498, p. 16-21, 2001
MURADOR, P. e DEFFUNE, E. Aspectos estruturais da membrana eritrocitária. Revista Brasileira de
Hematologia e Hematologia, v.29, n.2, p.168-178, 2007.
MURRAY, R. K.; GRANER, D. K.; MAYES, P.A.; RODWELL, U. W. Harper. Bioquímica. 7.ed. São Paulo:
Atheneu, 2006.
MUSCH, M. W.; HUBERT, E. M. e GOLDSTEIN, L. Volume expansion stimulates p72syk and p56lyn in skate
erythrocytes. J. Biol. Chem. v. 274, p.7923–7928, 1999.
MCCORD, J and FRIDOVICH, I. Superoxide dismutase an enzymic function
(hemocuprein). The Journal of Biological Chemistry, v.244, n.2, p.6049-6055, 1969.
for erythrocuprein
MCMILLAN, D. C.; SIMSON, J.V.; BUDINSKY, R. A. e JOLLOW, D. J. Dapsone-induced hemolytic anemia:
effect of dapsone hydroxylamine on sulfhydryl status, membrane skeletal proteins and morphology of human
and rat erythrocytes. J. Pharmacol. Exp. Ther., v. 274, p.540–547, 1995.
MCMILLAN, D. C.; JENSEN, C.B.; BUDINSK. e JOLLOW, D. J. Role of lipid peroxidation in Dapsoneinduced hemolytic anemia. J. Pharmacol. Exp. Ther., v. 287, p.868–876, 1998.
NAOUM, P. C. Radicais livres em eritrócitos falcêmicos e talassêmicos. Boletim da Sociedade Brasileira de
Hematologia e Hemoterapia., v. 18, n. 173, p. 75-81, 1996.
NOORDEEN, S. K. Leprosy research and elimination. Lepr. Rev., v. 71, p. S12, 2000.
O’DONOHUE JR., W. J.; MOSS, L. M.; ANGELILLO, V. A. Acute methemoglobinemia induced by topical
benzocaine and lidocaine. Arch. Intern. Med., v. 140, p. 1508–1509, 1980.
OKAMOTO, K.; MARUYAMA, T.; kAJI, Y.; HARADA, M.; MAWATARI, S.; FUJINO, T.; UYESAKA, N.
Verapamil prevents impairment in filterability of human erythrocytes exposed to oxidative stress. Japanese
Journal of Physiology., v. 54, p. 39–46, 2004.
OLAS, B. e HOLMSEN, H. Interaction of resveratrol with membrane glycerophospholipids in model system in
vitro. Food and Chemical Toxicology., v. 50, p. 4028–4034, 2012.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE. Chemotherapy of leprosy for control programmes. WHO, Geneva,
Technical Report Series, Nº 675, 1982.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Weekly epidemiological Record. v.85, n.35, p. 337–48, Aug.
2010. Disponível em: < http://www.who.int/wer/2010/wer8535/en/index.html>.
PACKER, L.; KRAEMER, K.; RIMBACH, G. Molecular aspects of lipoic acid in the prevention of diabetes
complications. Nutrition., v. 17, p.888-895, 2001.
PACKER, L.; WITT, E. H. e TRITSCHLER, H. J. Alpha-lipoic acid as a biological antioxidant. Free Radic.
Biol. Med., v.19, p.227-250, 1995.
PANDEY, K. B. e RIZVI, S. I. Protective Effect of Resveratrol on Markers of Oxidative Stress in Human
Erythrocytes Subjected to In Vitro Oxidative Insult. Phytother. Res., v. 24, p. S11–S14, 2010.
100
PANDEY, K. B. e RIZVI, S. I. Protective effect of resveratrol on formation of membrane protein carbonyls and
lipid peroxidation in erythrocytes subjected to oxidative stress. Appl. Physiol. Nutr. Metab., v.34, p.1093–
1097, 2009.
PANIKER, U. e LEVINE, N. Dapsone and sulfapyridine. Dermatologic Clinics., v. 19, n. 1, p.79-85, 2001.
PANTALEO, A.; FERRU, E.; GIRIBALDI, G.; MANNU, F.; CARTA, F. e MATTE, A. et al. Oxidized and
poorly glycosylated band 3 is selectively phosphorylated by Syk kinase to form large membrane clusters in
normal and G6PD-deficient red blood cells. Biochem. J., v.418, p. 359–367, 2009.
PASTORE, A. et al. Analysis of glutathione: implication in redox and detoxification. Clin. Chim. Acta,, v. 333,
p.19–39, 2003.
PENNA, M. L.; DE OLIVEIRA, M. L.; PENNA, G. O. The epidemiological behaviour of leprosy in Brazil.,
Leprosy Review., v. 80,n.3, p.332-44, 2009.
PENNA, G. O. Leprosy: the need to employ evidence-based medicine in control policies around the world.
Lepr. Rev., v. 82, p. 210-212, 2011.
PERCY, M. J.; McFERRAN, N. V.; LAPPIN, T. R. J. Disorders of oxidised haemoglobin. Blood Reviews.,
v.19, p. 61-68, 2005.
PERCY, M. J. e LAPPIN, T. R. Recessive congenital methaemoglobinaemia: cytochrome b5 reductase
deficiency. British Journal of Haematology., v. 141, p. 298–308, 2008.
PEREZ, O. G.; CASTANEDA, R. E. G. Therapeutic perspectives on the combination of alpha-lipoic acid and
vitamin E. Nutrition Research., v. 26, p. 1-5, 2006.
PETERS, J. H.; GORDON, G. R.; KARAT, A. B. Polymorphic acetylation of theantibacterials
sulfamethazine and dapsone in South Indian subjects.The American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene., v. 24, n.4, p.641-8, 1975.
PORRIT, R. J. e OLSEN, R. E. Two simultaneous cases of leprosy developing in tattoos. Am. J. Pathol., v.
23, p. 805-817, 1947.
PRASAD, P.D.; GANAPATHY, V. Structure and function of mammalian sodium-dependent multivitamin
transporter. Curr.Opin. Clin. Nutr. Metab. Care., v. 3, p. 263–266, 2000.
PRASAD, R.; SINGH, R.; MISHRA, O. P. e PANDEY, M. Dapsone Induced Methemoglobinemia : Intermittent
vs Continuous Intravenous Methylene Blue Therapy. Indian Journal of Pediatrics, v. 75, p. 245-247, 2008.
PRASANTHI, K..; RAJINI, P. S. Morphological and biochemical perturbations in rat erythrocytes
following in vitro exposure to Fenvalerate and its metabolite. Toxicol. In Vitro., v. 19, p. 449-456, 2005.
QADRI, S. M.; FOLLER, M.; LANG, F. Inhibition of suicidal erythrocyte death by resveratrol. Life Sciences.,
v. 85, p. 33–38, 2009.
QUEIROZ, R. H. C.; MELCHIOR, E. J.; SOUZA, A. M.; GOUVEIA, E.; BARBOSA, J. C. e CARVALHO, D.
Haematological and biochemical alterations in leprosy patients already treated with dapsone and MDT. Pharm.
Acta Helv. Zürich, 1997, p.209-213.
REA, T. H.; MODLIN, R. L. Leprosy. In: WOLFF K.. et al. Fitzpatrick’s Dermatology in General Medicine
editors. New York 7th ed.: McGraw-Hill; 2008:1786–1796.
RED
CELL
BIOLOGY:
Erythropoiesis,
Apoptosis,
and
Metabolism.
Disponível
<http://faculty.washington.edu/calvoc/DocumentsLabM321/Lectures/3RBC.ppt>. Acesso em 10/03/2012.
em:
REHMAN, H. U. Methemoglobinemia. Ewjm., 2001. v. 175, p. 193-196.
REILLY, T. P.; WOSTER, P. M. e SVENSSON, C. K. Methemoglobin formation by hidroxylamine metabolites
of sulfamethoxazole and dapsona: Implications for differences in adverse drug reactions. The journal of
pharmacology and experimental therapeutics., v. 288, p. 951–959, 1999.
101
REILLY, T. P.; BELLEVUE, F. H.; WOSTER, P. M. e SVENSSON, C. K. Comparison of the in vitro
cytotoxicity of hydroxylamine metabolites of sulfamethoxazole and dapsone. Biochemical Pharmacology,
v.55, n.6, p.803-10, 1998.
REILLY, T. P.; LASH, L. H.; WOSTER, P. M.; SVENSSON, C. K. A role for bioactivation and covalent
binding within epidermal keratinocytes in sulfonamide-induced cutaneous drug reactions. J Invest Dermatol., v.
114, p. 1164–1173, 2000.
RICE-EVANS, C. A.; MILLER, N. J.; PAGANGA, G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids
and phenolic acids. Free Radic. Biol. Med., v. 20, p. 933–956, 1996.
RICHARD, D.; HOLLENDER, P. e CHÉNAIS, B. Involvement of reactive oxygen species in aclarubicininduced differentiation and invasiveness of HL-60 leukemia cells. International Journal of Oncology., v. 21, p.
393–399, 2002.
RIFKIND, J. M. e RAMASAMY, S. Redox reactions of hemoglobin. Antioxid Redox Signal., v. 6, n. 3, p.
657-666, 2004.
ROCHETTE, L.; GHIBU, S.; RICHARD, C.; ZELLER, M.; COTTIN, Y.; VERGELY, C. Direct and indirect
antioxidant properties of -lipoic acid and therapeutic potential. Mol. Nutr. Food Res., v. 57, p. 114–125, 2013.
ROHN T.T.; HINDS, T.R.; VINCENZI, F. F. Inhibition of the Ca21 pump of intact red blood cells by t-butyl
hydroperoxide:important of glutathione peroxidase. Biochim. Biophys. Acta, v. 1153, p. 67–76, 1993.
ROSEN, P. J.; JOHNSON, C.; MCGEHEE, W. G. e BEUTLER, E. Failure of methylene blue treatment in toxic
methemoglobinemia. Ann. Intern. Med., v. 75, p. 83–86, 1971.
SABHARWAL, A. K. e MAY, J. M. Alpha-Lipoic acid and ascorbate prevent LDL oxidation and oxidant
stress in endothelial cells. Molecular and Cellular Biochemistry., v. 309, p. 125–132, 2008.
SALVEMINI, F.; FRANZE, A.; LERVOLINO, A. Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by
increased glucose-6-phosphate dehydrogenase expression. Journal of Biological Chemistry., v. 274, p. 2750–
2757, 1999.
SANGIOLO, D.; STORER, B.; NASH, R.; COREY, L.; DAVIS, C. Toxicity and efficacy of daily dapsone as
Pneumocystis jiroveci prophylaxis after hematopoietic stem cell transplantation: a case-control study. Biol.
Blood Marrow Transplant.,v.11, p. 521-529, 2005.
SAUTTER, C. K.; DENARDIM, S.; ALVES, A. O.; MALMANN, C. A.; PENNA, N. G. e HECKTHEUER, L.
H. Determinação de resveratrol em sucos de uva no Brasil. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v.
25, n.3, p. 437-442, 2005.
SINAN/SVS/MS. Hanseníase - Casos confirmados notificados no Sistema de Informação de Agravos de
Notificação - Sinan Net, Ano 2009. Disponível em <http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/index. php>. Acesso
em 16 de maio de 2011.
SINAN/SVS/MS. Hanseníase - Casos confirmados notificados no Sistema de Informação de Agravos de
Notificação - Sinan Net, Ano 2010. Disponível em <http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/index. php>.
Acesso em 16 de maio de 2011.
SIGNORELLI, P.; GHIDONI, R. Resveratrol in an anticancer nutrient: molecular basis, open questions and
promises. J. Nutr. Biochem., v. 16, p. 449–466, 2005.
SILLS, M.R. e ZINKHAM, W.H. Methylene blue-induced Heinz body hemolytic anemia. Arch. Pediatr.
Adolesc. Med., v.148, p. 306-10, 1994.
STIVALA, L. A.; SAVIO, M.; CARAFOLI, F.; PERUCCA, P.; BIANCHI, L.; MAGA, G.; FORTI, L.;
PAGNONI, U. M.; ALBINI, A.; PROSPERI, E.; VANNINI, V. Specific structural determinantsare responsible
for the antioxidant activity and the cell cycle effects of resveratrol. J. Biol. Chem., v. 276, p. 22586–22594.
2001
SOUZA, C. S. Hanseníase: formas clínicas e diagnóstico diferencial. In: SIMPÓSIO: HANSENÍASE, 30., n.
325-34, 1997, Ribeirão Preto.
102
SOLEAS, G. J.; DIAMANDIS, E. P.; GOLDBERG, D. M. Resveratrol: a molecule whose time has come? And
gone?. Clin. Biochem., v. 30, p. 91-113, 1997.
SUZUKI, K.; AKAMA, T.; KAWASHIMA, A.; YOSHIHARA, A.; YOTSU, R.; ISHII, N. Current status of
leprosy: Epidemiology, basic science and clinical perspectives. J. of Dermat., v. 39, p. 121-129, 2012.
SCOTT, G. e RASBRIDGE, M. The in vitro action of dapsone and its derivatives on normal and G6PD-deficient
red cells. Br. J. Haematol., v. 24, p. 307, 1973.
SCHIFF, D. E.; ROBERTS, W. D. e SUE, Y. J. Methaemoglobinemia associated with dapsone therapy in a
child with pneumonia and chronic immune thrombocytopenic purpura. J. Pediatr. Hematol. Oncol., v. 28, p.
395–398, 2006.
SHANKS, G. D.; EDSTEIN, M. D.; SURIYAMONGKOL, V.; TIMSAAD, S. e WEBSTER, H. K. Malaria
chemoprophylaxis using proguanil/dapsone combinations on the Thai-Cambodian border. Am. J. Trop. Med.
Hyg., v.46, p.643-648, 1992.
SHEPARD, C. C. Combinations involving dapsone, rifampin, clofazimine, and ethionamide in the
treatment of M. leprae infections in mice. International Journal of Leprosy and Other Mycobacterial
Diseases., v.44, n. 1-2, p.135-9, 1976.
SHIKAMA, K. The moleculas mechanism of autoxidation for myoglobin and hemoglobin: Venerable Puzzle.
Chem. Rev., v.98, p.1357-1373,1998.
SHIVA, S.; HUANG, Z.; GRUBINA, R.; SUN, J.; RINGWOOD, L. A.; MACARTHUR, P. H.; XU, X.;
MURPHY, E.; DARLEY-USMAR, V. M. e GLADWIN, M. T. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that
generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circ. Res., v.100, p.654-661, 2007.
SMITH, A. R.; SHENVI, S. V.; WIDLANSKY, M.; SUH, J. H.; HAGEN, T. M. Lipoic acid as a potential
therapy for chronic diseases associated with oxidative stress. Curr. Med. Chem., v. 11, p. 1135–1146, 2004.
STRYER, L. Biochem.. 4. ed. New York: W. H. Freeman and Company, 1995. p. 131-135.
TALHARI, S. e NEVES, R. G. Dermatologia Tropical. In: Hansenologia., 3 ed, 1997.
TANG, Y. Z. e LIU, Z. Q. Free-radical-scavenging effect of carbazolo derivatives on AAPH-induced hemolysis
of human erythrocytes. Bioorganic & Medicinal Chemistry., v. 15, n. 5, p. 1903–1913, 2007.
TAVAZZI, B.; DI PIERRO, D.; AMORINI, A.M.; FAZZINA, G.; TOTTOBENE, M.; GIARDINA,B. e
LAZZARINO, G. Energy metabolism and lipid peroxidation of human erythrocytes as a function of increased
oxidative stress. European Journal Biochemistry., v. 267, p. 684-689, 2000.
TAYYEM, R. F.; HEATH, D. D.; AL-DELAIMY, W. K.; ROCK, C. L. Curcumin content of turmeric and curry
powders. Nutr. Cancer., v. 55, p. 126–131, 2006.
TEDESCO, I.; RUSSO, M.; RUSSO, P.; IACOMINO, G.; RUSSO, G. L.; CARRATURO, A.; FARUOLO,
C.; MOIO, L. e PALUMBO, R. Antioxidant effect of red wine polyphenols on red blood cells. J. Nutr.
Biochem., v. 11, p. 114-9, 2000.
TEICHERT, J.; TUEMMERS, T.; ACHENBACH, H.; PREISSE, C.; HERMANN, R.; RUUS, P.; PREISSE, R.
Pharmacokinetics of alfa-lipoic acid in subjects with kidney damage and end-stage renal disease. J.Clin.
Pharmacol., v.35, p.313-328, 2005.
TINGLE, M. D.; MAHMUD, R.; MAGGS, J. L.; PIRMOHAMED, M.; PARK, B. K. Comparison of the
metabolism and toxicity of dapsone in rat, mouse and man. The J. of Pharmacol. and Exper.Therap., v. 283,
n. 2, p. 817–823, 1997.
TORRES, R.; BARR, M.; THORN, M.; GREGORY, G.; KIELY, S.; CHANIN, E.; CARLO, C.; MARTIN, M. e
THORNTON, J. Randomized trial of dapsone and aerosolized pentamidine for the prophylaxis of Pneumocystis
carinii pneumonia and toxoplasmic encephalitis. Am. J. Med., v. 95, p. 573-583, 1993.
103
THUONG-NGUYEN, V.; KADUNCE, D. P.; HENDRIX, J. D.; GAMMON, W. R. e ZONE, J. J. Inhibition of
neutrophil adherence to antibody by dapsone: A possible therapeutic mechanism in the treatment of IgA
dermatoses. J. Invest. Dermatol., v. 100, p.349–355, 1993.
UMBREIT, J. Methemoglobin-it’s not just blue: a concise review. Am. J. Hematol., v.82, p. 134–144, 2007.
URSINI, M. V.; PARRELLA, A.; ROSA, G. Enhanced expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase in
human cells sustaining oxidative stress. Biochemical Journal., v. 323, p. 801–806, 1997.
VADHER, A.; AND LALLJEE, M. Patient treatment compliance in leprosy. A critical review. Int. J. Lepr.,
v.60, p.587-607, 1992.
VAGE, C.; SAAB, N.; WOSTER, P. M.; SVENSSON, C. K. Dapsone-induced hematologic toxicity:
comparison of the methemoglobin-forming ability of hydroxylamine metabolites of dapsone in rat and
human blood. Toxicology and Applied Pharmacology., v.129, n.2, p.309-16, 1994.
VEGGI, L. M.; PRETTO, L.; OCHOA, H. J.; CATANIA, C. A. et al. Dapsone induces oxidative stress and
impairs antioxidant defenses in rat liver. Life Sciences., v. 83, p. 155–163, 2008.
VIDAVALUR, R.; OTANI, H.; SINGAL, P. K.; MAULIK, N. Significance of wine and resveratrol in
cardiovascular disease: French paradox revisited. Exp. Clin Cardiol., v. 11, p. 217-225, 2006.
VIEIRA, J. L.; RIVEIRA, J. G.; MARTINS, A. D.; SILVA, J. P.; SALGADO, C. G. Methemoglobinemia and
dapsone levels in patients with leprosy. The Brazilian Journal of Infectious Diseases., v.14, n.3, p.319-21,
2010.
VYAS, P.; ROYCHOWDHURY, S.; WOSTER, P. e SVENSSON, C. Reactive oxygen species generation and
its role in the differential cytotoxicity of the arylhydroxylamine metabolites of sulfamethoxazole and dapsone in
normal human epidermal keratinocytes. Bio. Pharmacol., v. 70, p. 275–286, 2005.
WALKER, J. G.; KADIA, T.; BROWN, L.; JUNEJA, H. S.; DE GROOT, J. F. Dapsone induced
methemoglobinemia in a patient with glioblastoma. J. Neurooncol., v. 94, p.149–152, 2009.
WALLE, T.; HSIEH, F.; DeLEGGE, M. H.; OATIS, J. E. e WALLE, U. K. High absorption but very low
bioavailability of oral resveratrol in humans. Drug. Metab. Dispos., v. 32, p. 1377-1382, 2004.
WALTERHOUSE, A.L. Wine phenolics. Ann. Of New York A. Scien., v. 957, p. 21-36, 2002.
WANG, H.; JOSEPH, J. A. Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate
reader. Free Radic. Biol. Med., v. 27, p. 612–616, 1999.
WANG, Z.; HUANG, Y.; ZOU, J.; CAO, K.; XU, Y.; WU, J. M. Effects of red wine and wine polyphenol
resveratrol on platelet aggregation in vivo and in vitro. Int. J.Mol. Med., v.9, p. 77-79, 2002.
WARD, K. E. e MCCARTHY, M. W. Dapsone-induced methemoglobinemia. Ann. Pharmacother., v. 32, p.
549–553, 1998.
WERTHEIM, M. S.; MALES, J. J.; COOK, S. D. e TOLE, M. D. Dapsone induced haemolytic anaemia in
patients treated for ocular cicatricial pemphigoid. Br J Ophtalmol., v. 90, p. 516, 2006.
WIEACKER, P. et al. Assignment of the gene coding for human catalase to the short arm of chromosome 11.
Ann. Génét., v. 23, p. 73-77, 1980.
WINTERBOURN, C.C. Oxidative denaturation in congenital hemolytic anemias: the unstable hemoglobins.
Seminars in Hematology., v.27, n.1, p.41-50, 1990.
WOLF, R.; TÜZÜN, B. e TÜZÜN, Y. DAPSONE: Unapproved Uses or Indications. Clinic in Dermatology.,
v.18, n.1, p.37-53, 2000.
WOLVERTON, S. E. Monitoring for adverse effects from systemic drugs used in dermatology. Journal of the
American Academy of Dermatology., v. 26, p. 661-79, 1992.
104
WOZEL, G. The story of sulfones in tropical medicine and dermatology. Int J Dermatol., v. 28, n. 1, p. 17–
21, 1989.
WOROBEC, S. M. Current approaches and future directions in the treatment of leprosy. Research And Reports
In Tropical Medicine., v. 3, p. 79-91, 2012.
WINTER, H. R.; WANG, Y. e UNADKAT, J. D. CYP2C8/9 mediate dapsone N-hydroxylation at clinical
concentrations of dapsone. Drug Metab. Dispos., v. 28, p.865–868, 2000.
WOLLIN, S. D. e JONES, P. J. H. Alpha-lipoic acid and cardiovascular disease. Journal of Nutrition., v. 133,
p. 3327-3330, 2003.
WRIGHT, R. O.; LEWANDER, W. J.; WOOLF, A. D. Methemoglobinemia: Etiology, Pharmacology, and
Clinical Management. Annals Of Emergency Medicine., v. 34, n. 5, p. 646-656, 1999.
ZAVODNIK, L. B. et al. Hypochlorous acid-induced membrane pore formation in red blood cells.
Bioelectrochem., v. 58, p. 157– 161, 2002.
ZIMMERMAN, H. J. Hepatotoxicity. In: _______. Hepatotoxicity. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins,1999. p. 30.
ZUIDEMA, J.; HILBERS-MODDERMAN, E. e MERKUS, F.
Clinical Pharmacokinetics., v.11, n.4, p.299-315, 1986.
Clinical pharmacokinetics
of
dapsone.
ZHANG, W.; XUE, J.; GE, M.; YU, M.; LIU, L.; ZHANG, Z. Resveratrol attenuates hepatotoxicity of rats
exposed to arsenic trioxide. Food and Chemical Toxicology., v. 51,p. 87–92, 2013.
ZHONG, L.; YUYING, Z.; HUI, L.; JIANGLAN, Y.; ZHONGLIANG, Z. e GUOLIN, Z. Transport of a cancer
chemopreventive polyphenol, resveratrol: interaction with serum albumin and hemoglobin. J. Fluoresc., v.17, p.
580–587, 2007.
ZHOU, Q., J. ZHAO et al. Normal hemostasis but defective hematopoietic response to growth factors in mice
deficient in phospholipid scramblase 1. Blood., v.99, p. 4030-4038, 2002.
ZHU, Y. e STILLER, M. Dapsone and sulfones in dermatology: overview and update. J. of the Am. Ac. of
Dermatol., v. 45, n. 3, p. 420-434, 2001.
105
ANEXO
106
ANEXO A: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
(Baseado na resolução n° 196 de 10/10/1996 do Conselho Nacional de Saúde)
Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário, em uma pesquisa. Após ser esclarecido (a) sobre as
informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Sendo
uma delas sua, e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de recusa você não será penalizado (a) de forma alguma. Em
caso de dúvida você pode procurar o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Pará (endereço Av.
Perimetral, s.n., bairro Guamá CEP 66075-650).
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA:
Esta pesquisa será realizada pela pesquisadora e aluna de Mestrado em Fármaco e Medicamentos (PPGCF-UFPA)
Rosyana de Fátima Vieira de Albuquerque, sob a orientação da Professora Doutora Marta Chagas Monteiro, da Faculdade de
Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas-UFPa. E tem como objetivo avaliar o efeito do resveratrol
na metemoglobina induzida pela dapsona e seu metabólito DDS-NHOH em modelo in vitro, correlacionando ao
desenvolvimento do estresse oxidativo. Os voluntários serão alunos e professores da Faculdade de Farmácia- UFPA, sendo
que a obtenção do sangue venoso para a preparação do modelo in vitro, será em local apropriado e por um profissional
habilitado. Os critérios de exclusão serão o uso recente de algum medicamento, doenças crônicas, menor de 20 anos e
maiores de 45 anos e uso de tabaco. Todo material coletado nesta pesquisa ficará sob a guarda da pesquisadora responsável
durante o período de preparação do modelo in vitro e após será destruído.
Em nenhuma hipótese serão divulgados dados que permitam a sua identificação, guardando assim o absoluto sigilo
das informações cedidas a pesquisadora. A sua participação é de livre-arbítrio, não havendo pagamento pela mesma, podendo
se recusar a responder quaisquer perguntas das entrevistas. Após a conclusão da coleta do material biológico os eritrócitos
serão isolados para obtenção do modelo in vitro.
____________________________________
Marta Chagas Monteiro (Orientadora)
CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO:
Declaro que li as informações acima sobre a pesquisa e que me sinto perfeitamente esclarecido sobre o conteúdo da mesma,
assim como seus riscos e benefícios. Declaro ainda que por minha livre vontade, aceito participar da pesquisa cooperando
com as informações necessárias.
NOME:___________________________________________________ Belém,____/____/____
Assinatura do entrevistado__________________________________ RG:__________________
107
ANEXO B:
CARTA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA EM SERES
HUMANOS DO INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO
PARÁ