Apostila micro 2010 FCF USP (1)

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS E
NUTRIÇÃO EXPERIMENTAL
ANÁLISE
MICROBIOLÓGICA
DE ALIMENTOS
Aulas Práticas
Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco
Profa. Dra. Maria Teresa Destro
Profa. Dra. Mariza Landgraf
Nome:
2010
SUMÁRIO
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS ........................................... 1
I.
NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA .. 3
II.
PREPARO DO MATERIAL PARA UMA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA .... 6
III. PREPARO DO ALIMENTO PARA ANÁLISE ......................................... 8
IV.
METODOLOGIAS .............................................................................. 9
1.
ENUMERAÇÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS,
PSICROTRÓFICAS E TERMÓFILAS ........................................................... 9
2.
ENUMERAÇÃO DE FUNGOS ............................................................. 12
3.
ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS, COLIFORMES A 45 ºC
(TERMOTOLERANTES) E DE ESCHERICHIA COLI ................................... 14
4.
PESQUISA DE SALMONELLA........................................................... 21
5.
ENUMERAÇÃO DE CLOSTRÍDIOS SULFITO-REDUTORES E DE
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ............................................................... 25
6.
ENUMERAÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ............................... 28
7.
ENUMERAÇÃO DE BACILLUS CEREUS ............................................. 31
8.
PESQUISA DE LISTERIA MONOCYTOGENES ................................... 35
9.
PESQUISA DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS ................................. 38
V.
MÉTODOS ALTERNATIVOS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE
ALIMENTOS ........................................................................................... 42
VI.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO ............................................................. 44
VII. MEIOS DE CULTURA ....................................................................... 45
VIII.
BIBLIOGRAFIA ......................................................................... 64
2
I.
NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
As normas de segurança nos laboratórios de Microbiologia foram elaboradas com o objetivo de
proteger a saúde do pessoal do laboratório e do público, assim como o meio ambiente, dos
riscos associados à exposição acidental a microrganismos e materiais biológicos experimentais.
Os acidentes em laboratório de Microbiologia, normalmente, ocorrem pela formação de
aerossóis, por respingos, pipetagens incorretas, injeções, trabalhos com grandes quantidades
e/ou concentrações elevadas de microrganismos, laboratórios superlotados de pessoal e
material, infestação por roedores e insetos, entrada de pessoas não autorizadas. Para evitar a
maior parte destes riscos, devem ser tomados cuidados especiais, desde a concepção geral e
instalação do laboratório.
As infecções por microrganismos em laboratório de Microbiologia podem ocorrer através da
pele, da via digestiva, da via respiratória e dos olhos e ouvidos.
As regras enumeradas a seguir constituem a base das práticas seguras de laboratório e devem
ser consideradas regulamento de trabalho.
Serão apresentadas aqui as regras mais
importantes, às quais podem ser acrescentadas outras, muitas delas específicas para cada
laboratório onde se trabalhe com agentes patológicos específicos.
1. Não se alimente, não beba ou fume, não guarde alimentos e não aplique cosméticos no
recinto de trabalho;
2. Não pipete com a boca qualquer tipo de material; proteja a ponta superior das pipetas com
algodão antes da esterilização;
3. O laboratório deve ser mantido limpo e em ordem, devendo ser dele retirados quaisquer
materiais que não tenham relação com o trabalho;
4. As superfícies de trabalho devem ser descontaminadas, pelo menos, uma vez por dia e
sempre que ocorrer caso de derramamento de substâncias potencialmente perigosas;
5. O pessoal de laboratório deve lavar as mãos antes de iniciar os experimentos, depois de
haver manipulado materiais e animais infectados, e também ao deixar o laboratório;
6. Conservar as mãos longe da boca, nariz, olhos e rosto;
7. Deve ser evitado o uso de barba e os cabelos compridos devem estar sempre presos;
8. Todos os procedimentos devem ser efetuados de maneira a se evitar, ao máximo, a
formação de aerossóis;
9. As superfícies das bancadas devem ser recobertas com papel absorvente, sempre que exista
a possibilidade de respingamentos de material perigoso;
10. As subculturas de microrganismos infecciosos devem ser feitas em capelas;
3
11. Todos os líquidos e sólidos contaminados devem ser descontaminados antes de eliminados
ou reutilizados. Os materiais esterilizados em autoclaves ou incinerados fora do laboratório
deverão ser acondicionados em recipientes fechados, impermeáveis e devidamente
indentificados;
12. Use sempre avental ou uniforme enquanto estiver no laboratório; estas roupas não devem
sair do recinto de trabalho e devem ser desinfetadas por procedimentos adequados;
13. Sempre que for necessário, proteja os olhos e o rosto de respingos ou impactos usando
óculos de segurança, escudos faciais, máscaras ou qualquer outro dispositivo de segurança;
14. As bancadas do laboratório devem ter a superfície muito lisa, de maneira a serem
facilmente limpas e desinfetadas;
15. Somente deverão ser autorizadas a entrar no laboratório pessoas que tenham sido
informadas sobre os possíveis riscos e satisfaçam os requisitos que se exigem para o acesso;
durante o trabalho, as portas devem ser mantidas fechadas; somente terão acesso ao local,
animais e pessoas autorizadas; não se deve permitir a entrada de crianças no laboratório;
16. Não se deve permitir a entrada no laboratório, de animais que não tenham relação com os
trabalhos que estão sendo efetuados;
17. Deve ser estabelecido um programa de luta contra os insetos e roedores;
18. As pipetas usadas devem ser imediatamente imersas em desinfetantes;
19. Em caso de respingos, cubra imediatamente a área com desinfetantes;
20. Nunca umedeça rótulos com a língua; use água ou rótulos auto-adesivos;
21. Use seringas e agulhas hipodérmicas somente para injeção parenteral, aspiração de
líquidos dos animais de laboratório e de vacinas contidas em frascos com tampas perfuráveis.
Não as use para manipular líquidos infecciosos; nestes casos, devem ser empregadas pipetas
automáticas;
22. Não empregue chumaços de algodão ao esvasiar uma seringa contendo ar ou excesso de
líquido. Use um pequeno frasco cheio de algodão embebido em desinfetante;
23. Antes e depois de injetar materiais infecciosos em animais, esfregue o local da infecção
com desinfetante;
24. Utilize seringas com acessório especial para evitar que a agulha se separe da seringa;
25. Em todos os trabalhos nos quais existem possibilidades de contato direto acidental com
sangue, material infeccioso ou animais infectados, devem ser usadas luvas. Estas luvas, antes
de descartadas, devem ser esterilizadas em autoclaves;
26. Todos os derramamentos, acidentes e exposições reais ou potenciais por material infectado
devem ser imediatamente notificados ao diretor do laboratório. Devem existir protocolos
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escritos destes episódios, onde são previstas avaliações, vigilância e tratamento médico
apropriados;
27. Amostras de soro sanguíneo de todo o pessoal do laboratório e demais pessoas expostas
aos riscos a ele inerentes, devem ser conservadas como referência;
28. As centrífugas usadas para material contaminado ou infeccioso devem ser protegidas por
anteparos;
29. Use para centrifugação somente tubos não danificados e tampados. Tenha a certeza de
que o líquido contido no tubo não transbordará durante a centrifugação;
30. Culturas líquidas de organismos altamente infecciosos requerem cuidados especiais, pois,
qualquer movimento que agite a superfície do líquido, produzirá aerossol; os liquidificadores
dão origem a pesados aerossóis.
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II.
PREPARO DO MATERIAL PARA UMA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
1 - Vidraria - Uso do Forno de Pasteur
Todo material de vidro, metal ou plástico que entrará em contato com o alimento deve ser
esterilizado. Normalmente emprega-se o forno de Pasteur para esterilizar vidraria e material
de metal e o óxido de etileno ou irradiação para esterilização de material plástico
(normalmente comercializados já esterilizados, podendo ser usados uma só vez).
O forno de Pasteur trata-se de uma cabine de metal, com paredes isoladas termicamente,
aquecido a eletricidade. Todo material de vidro ou metal a ser esterilizado deve ser mantido a
170-180 ºC, durante uma hora. Os frascos de vidro (erlenmeyers, tubos de ensaio, balões,
provetas, etc.) devem ter sua boca protegida por um chumaço de algodão hidrófobo recoberto
por papel. Placas de Petri devem ser embrulhadas em papel antes de colocadas no forno, o
mesmo acontecendo com pipetas (que devem ter um chumaço de algodão hidrófobo na
extremidade a ser colocada na boca), e demais utensílios (pinças, espátulas, etc.). Decorrido
o tempo de esterilização, deixar o forno esfriar por si só uma vez que sua abertura quando
ainda quente poderá danificar o material devido à brusca variação de temperatura. Aconselhase esterilizar o material necessário na véspera do seu emprego.
2 - Meios de cultura
Com raras exceções (determinada nas fórmulas de preparo), todos os meios de cultura
empregados numa análise microbiológica devem ser esterilizados.
Preparar os meios de cultura conforme instruções . Colocar um chumaço de algodão hidrófobo
na boca de cada frasco e cobrir com papel. Alguns meios de cultura especiais não podem ser
autoclavados, devendo ser esterilizados por simples fervura ou em vapor fluente (autoclave
aberta), ou ainda filtrados. Nunca se deve utilizar os meios de cultura na temperatura que
saem da autoclave. Se necessário abaixar a temperatura em água corrente e manter os meios
num banho-maria a 45-50 ºC até o instante do uso.
Uso da autoclave
Princípio de funcionamento: obtenção de altas temperaturas por aquecimento de água em
recipiente fechado, sob pressão.
Técnica: colocar água no fundo da autoclave, introduzir a cesta contendo o material a ser
autoclavado, adaptar a tampa e fechar os parafusos, deixando a válvula de escape de vapor
aberta. Ligar a autoclave no máximo de intensidade. A princípio, haverá expulsão do ar
contido na caldeira. Quando a água começar a ferver haverá saída de um jato intermitente de
ar misturado com vapor de água. Quando todo o ar for expulso, começará a sair, apenas, um
jato contínuo de vapor de água. Neste momento, fechar a válvula de escape de vapor e
observar o aumento de pressão acusado pelo manômetro. Ao atingir a temperatura desejada,
regular o aquecimento de modo que o ponteiro do manômetro fique estável, mantendo-se
neste nível pelo tempo desejado. Decorrido este tempo, desligar a autoclave e esperar que a
pressão desça a zero e, então, abrir a válvula de escape de vapor. Quando não há mais saída
de vapor, abrir a tampa e retirar o material.
3 - Outros reagentes
6
Outros reagentes como soluções tampões de diluição, água, solução de ácidos ou álcalis, etc.,
precisam estar estéreis se forem entrar em contacto com o alimento, podendo ser esterilizados
na autoclave junto com os demais meios de cultura, ou então filtrados em filtros de
esterilização.
Uso de filtros de esterilização
Ex: Filtros tipo Millipore ou Nuclepore (de celulose).
Colocar a membrana de esterilização no local adequado, e esterilizar todo o conjunto
(Kitassato, funil, membrana, copo) na autoclave a 121 ºC, durante 30 minutos.
Colocar o líquido a ser esterilizado no copo do filtro, ligar a extremidade do Kitassato à trompa
d'água (ou bomba de vácuo) e proceder a filtração, que não deve demorar muito. Filtrado todo
o líquido, transferí-lo assepticamente para um frasco previamente esterilizado.
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III. PREPARO DO ALIMENTO PARA ANÁLISE
1 - Alimentos sólidos
Pesar, assepticamente, 25 g do alimento e homogeneizar com 225 mL de tampão diluente ou
água peptonada. *A homogeneização pode ser feita em homogeneizador próprio para
alimentos ou em liquidificador com o copo "higienizado" pela lavagem, por 3 vezes, com álcool
70% e posteriormente com água destilada estéril. Usar velocidade baixa para não aquecer a
mistura. Transferir a diluição 10-1 assim obtida para um frasco estéril e proceder à diluição
seriada decimal (1 mL da diluição 10-1 adicionado à 9 mL de diluente, e assim por diante).
2 - Alimentos líquidos
Pipetar, assepticamente, 25 mL de alimento e transferir para um frasco contendo 225 mL de
diluente e homogeneizar. Proceder à diluição seriada como descrito acima.
*Preferencialmente, a homogeneização deve ser feita em aparelho do tipo “stomacher”.
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IV.
METODOLOGIAS
1. ENUMERAÇÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS, PSICROTRÓFICAS E
TERMÓFILAS
1.1. Material necessário
Meio de cultura:
Ágar Padrão para Contagem – PCA (14)
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas
Alças de Drigalski
Estufas a 35-37 ºC e a 55C
Incubadora BOD a 5-7 ºC
Banho-maria a 45-50 ºC
Contador de colônias
1.2. Metodologia
1.2.1. Preparar a quantidade necessária do ágar para contagem padrão (PCA), conforme
instruções no frasco, calculando 15 a 20 mL para cada placa de Petri.
1.2.2. Efetuar a pesagem, homogeneização e diluição seriada do alimento.
1.2.3. Procedimento
1.2.3.1. Bactérias aeróbias mesófilas e termófilas
a) De cada diluição do alimento transferir 1 mL para placas de Petri
esterilizadas.
b) Adicionar cerca de 20 mL de PCA, esfriado a 45 ºC, em cada placa semeada e
homogeneizar girando suavemente as placas em movimentos na forma de oito.
c) Uma vez solidificado o ágar, inverter as placas e incubá-las a 35-37 ºC
durante 48 horas, para as bactérias aeróbias mesófilas e a 55 ºC durante 48
horas, para as bactérias aeróbias termófilas.
1.2.3.2. Bactérias aeróbias psicrotróficas
9
a) De cada diluição do alimento semear 0,1 mL na superfície de placas contendo
PCA. Espalhar com a alça de Drigalski. Incubar a 5-7 ºC durante 7-10 dias.
1.2.4. Enumeração
a) Decorrido o tempo de incubação, selecionar as placas contendo 25 a 250 colônias e
contá-las com o auxílio de contador.
b) Calcular o número de unidades formadoras de colônias de bactérias aeróbias
mesófilas / psicrotróficas / termófilas por grama de amostra (UFC/g ou mL),
multiplicando o número de colônias encontradas pelo inverso do fator de diluição.
No caso de bactérias psicrotróficas, considerar ainda o volume semeado.
1.3. Resultados
Expressar os resultados em “Unidades Formadoras de Colônias” por grama ou mL de
alimento (UFC/g ou UFC/mL).
Em caso de se obter apenas placas com número inferior a 25 ou superior a 250
colônias, expressar os resultados como: Contagem estimada: UFC/g ou UFC/mL.
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1.4. Esquema
25g
amostra
25
g/25
mL da amostra
225 mL de diluente
10-1
9 mL de diluente
9 mL de diluente
1 mL
Homogeneização
1 mL
10-2
1 mL
0,1 mL
PCA
(Pour Plate)
1 mL
PCA
(Pour Plate)
1 mL
PCA
(Pour Plate)
PCA
(Superfície)
Termófilos
55ºC/48h
1 mL
PCA
(Pour Plate)
1 mL
Termófilos
55ºC/48h
1 mL
PCA
(Pour Plate)
PCA
(Superfície)
Mesófilos
35-37ºC/48h
Psicrotróficos
5-7ºC/7-10dias
0,1 mL
PCA
(Pour Plate)
PCA
(Superfície)
Mesófilos
35-37ºC/48h
Psicrotróficos
5-7ºC/7-10dias
0,1 mL
10-3
Termófilos
55ºC/48h
Mesófilos
35-37ºC/48h
Psicrotróficos
5-7ºC/7-10dias
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2. ENUMERAÇÃO DE FUNGOS
2.1. Material necessário
Meio de cultura:
Ágar Dicloran Rosa de Bengala com Suplemento Seletivo o antibiótico
Cloranfenicol– DRBC (3)
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas de 1 mL
Pipetas de 5 mL
Bastão de vidro
Alças de Drigalski
Papel indicador de pH
Banho-maria a 45 ºC
Contador de colônias
2.2.
Metodologia
2.2.1. Preparar a quantidade necessária de ágar Ágar Dicloran Rosa de Bengala
Cloranfenicol com Cloranfenicol Suplemento Seletivo (DRBC), conforme instruções
do frasco, e esterilizar em autoclave a 121 ºC durante 15 min. Distribuir o meio de
cultura em placas de Petri esterilizadas.
2.2.2. Efetuar a pesagem, homogeneização e a diluição seriada adequada da
amostra.
2.2.3. Procedimento
a) De cada diluição do alimento, transferir 0,1 mL para a superfície das placas de
ágar DRBC.
b) Espalhar com a alça de Drigalski.
c) Incubá-las a 25 ºC, sem inverter, durante 3-5 dias.
d) Decorrido o período de incubação, selecionar as placas contendo entre 15 e 150
colônias e contar as colônias.
e) Determinar o número de colônias de fungos por grama ou mL de alimento,
conforme o item 1.2.4.
2.3. Resultados
Expressar os resultados em “Unidades Formadoras de Colônias” por grama ou mL
de alimento (UFC/g ou UFC/mL).
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2.4. Esquema
25 g/ 25 mL amostra
225 mL de diluente
9mL de diluente
9mL de diluente
10-1
Homogeneização
1 mL
1 mL
10-2
0,1 mL
Ágar DRBC (superfície)
25ºC/3-5dias
Contagem total
10-3
0,1 mL
0,1 mL
Ágar DRBC (superfície)
Ágar DRBC (superfície)
25ºC/3-5dias
Contagem total
25ºC/3-5dias
Contagem total
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3. ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS,
(TERMOTOLERANTES) E DE Escherichia coli
3.1.
COLIFORMES
A
45
ºC
Método dos tubos múltiplos
3.1.1. Material necessário:
Meios de cultura:
Caldo Lauril Sulfato Triptose – LST (40)
Caldo Bile Verde Brilhante 2% – VB (33)
Caldo EC (34)
Ágar Eosina Azul de Metileno – Levine (8)
Caldo Indol (37)
Caldo MR-VP (41)
Ágar Citrato de Simmons (5)
Reagentes:
Reagente de Kovacs (56)
Reagente VM (58)
Reagente VP (59)
Banho-maria a 45 ± 0,2 ºC (alimento)
Banho-maria a 44,5 ± 0,2 ºC (água)
Estufa a 35 ºC
3.1.2. Metodologia
3.1.2.1. Preparo do alimento para análise
Efetuar a pesagem, homogeneização e a diluição seriada do alimento. Preparar, no
mínimo, 3 diluições decimais subsequentes.
3.1.2.2. Procedimento
Teste presuntivo para coliformes totais, coliformes termotolerantes e E. coli
a) De cada diluição do alimento, transferir alíquotas de 1 mL para 3 tubos contendo o
caldo Lauril Sulfato Triptose (LST). Homogeneizar através de agitação cuidadosa.
b) Incubar a 35 ºC durante 48 horas.
c) Decorrido o tempo de incubação, separar os tubos positivos, ou seja, os que
apresentarem turvação do meio e gás no interior do tubo de Durham; dispensar os
demais.
Teste confirmatório para coliformes totais
a) Transferir, com o auxílio de alça, um inóculo de cada tubo positivo de LST para
outro tubo contendo caldo Bile Verde Brilhante (VB).
b) Incubar a 35 ºC durante 48 horas.
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c) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gás no interior dos tubos de Durham)
e anotar os resultados.
d) Utilizar a Tabela NMP adequada para calcular o "Número Mais Provável" (NMP) de
coliformes totais por grama ou mL de alimento.
Teste confirmatório para coliformes termotolerantes e E. coli
Obs.: A legislação em vigor (Resolução RDC 12 de janeiro de 2001) estabelece
limites para “coliformes a 45 ºC”, sinônimo de coliformes fecais ou termotolerantes.
a) Transferir um inóculo com o auxílio de alça de cada tubo positivo de caldo LST
para outro tubo contendo caldo EC.
b) Incluir, para controle da temperatura do banho-maria, um tubo de caldo EC
inoculado com uma cultura de E. coli (controle positivo) e um tubo de caldo EC
inoculado com cultura de Enterobacter aerogenes (controle negativo).
c) Incubar a 45 ºC ± 0,2 (alimento) ou 44,5 ºC ± 0,2 (água) durante 24 horas.
d) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gás no interior dos tubos de Durham)
e anotar os resultados.
e) Utilizar a tabela NMP (item 3.1.4.) adequada para calcular o "Número Mais
Provável" de coliformes a 45 ºC por grama de alimento.
Teste confirmatório para E. coli
a) Semear, por estrias, os tubos positivos de caldo EC em ágar Levine, de modo a
obter colônias isoladas.
b) Incubar a 35 ºC durante 24 horas.
c) Observar o surgimento de colônias típicas de E. coli, isto é, de coloração negra,
com brilho metálico esverdeado (este brilho pode estar ausente ou pouco visível).
Fazer a confirmação bioquímica das colônias suspeitas, através da série IMViC (prova
do indol, do vermelho de metila, de Voges-Proskauer e do citrato):
Prova do Indol: Inocular com o auxílio de alça uma colônia suspeita no caldo indol.
Incubar a 35 ºC durante 24 horas. Adicionar 0,3 mL do reativo de Kovacs e observar
a coloração da fase alcoólica.
Prova +: fase alcoólica de cor púrpura
Prova -: fase alcoólica de cor amarela
Prova do VP: Inocular a colônia suspeita no caldo MR-VP, incubar a 35 ºC durante 48
horas. Adicionar a 1,0 mL de cultura 0,6 mL do reagente "A" (α-naftol) e 0,2 mL do
reagente "B" (KOH) e agitar vigorosamente o tubo. Se necessário, aquecer.
Prova +: coloração vermelha
Prova -: coloração amarela
Prova do VM: Inocular a colônia suspeita no caldo MR-VP e incubar a 35 ºC durante 4
dias. Adicionar algumas gotas do reagente VM, e observar a coloração do meio.
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Prova +: coloração vermelha
Prova -: coloração amarela
Prova do citrato: Inocular a colônia suspeita na superfície do ágar citrato e incubar a
35 ºC por até 4 dias. Observar a mudança da coloração do meio verde para azul.
Prova +: meio azul
Prova -: meio verde
d) Resultados positivos para as provas do indol e do VM e negativos para as provas
do VP e citrato confirmam a presença de E. coli.
e) Expressar os resultados em NMP de E. coli/g ou mL do alimento consultando a
tabela do NMP (item 3.1.4.).
3.1.3. Tabelas
Tabela 1: Número Mais Provável (NMP) e intervalo de confiança a nível de 95% de probalidade, para
diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 10 porções de 10 mL da
amostra por tubo (APHA, 1985)
Intervalo de confiança (95%)
(valores aproximados)
Nº de tubos
positivos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NMP/100
mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
Mínimo
Máximo
0
0,03
0,26
0,69
1,3
2,1
3,1
4,3
5,9
8,1
13,5
3,0
5,9
8,1
10,6
13,4
16,8
21,1
27,1
36,8
59,5
Infinito
Tabela 2: NMP por grama e intervalo de confiança (95%), para séries de 3 tubos com 0,1, 0,01 e
0,001 g/mL de inóculo.
Pos. tubes
NMP/g
Conf. lim.
Pos. tubes
MPN/g
Conf. lim.
16
0.10
0.01
0.001
Low
High
0.10
0.01
0.001
Low
High
0
0
0
<3.0
--
9.5
2
2
0
21
4.5
42
0
0
1
3.0
0.15
9.6
2
2
1
28
8.7
94
0
1
0
3.0
0.15
11
2
2
2
35
8.7
94
0
1
1
6.1
1.2
18
2
3
0
29
8.7
94
0
2
0
6.2
1.2
18
2
3
1
36
8.7
94
0
3
0
9.4
3.6
38
3
0
0
23
4.6
94
1
0
0
3.6
0.17
18
3
0
1
38
8.7
110
1
0
1
7.2
1.3
18
3
0
2
64
17
180
1
0
2
11
3.6
38
3
1
0
43
9
180
1
1
0
7.4
1.3
20
3
1
1
75
17
200
1
1
1
11
3.6
38
3
1
2
120
37
420
1
2
0
11
3.6
42
3
1
3
160
40
420
1
2
1
15
4.5
42
3
2
0
93
18
420
1
3
0
16
4.5
42
3
2
1
150
37
420
2
0
0
9.2
1.4
38
3
2
2
210
40
430
2
0
1
14
3.6
42
3
2
3
290
90
1,000
2
0
2
20
4.5
42
3
3
0
240
42
1,000
2
1
0
15
3.7
42
3
3
1
460
90
2,000
2
1
1
20
4.5
42
3
3
2
1100
180
4,100
2
1
2
27
8.7
94
3
3
3
>1100
420
--
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#tables
17
3.1.4. Esquema
25g amostra
225 mL de diluente
10-1
9 mL de diluente
9 mL de diluente
1 mL
1 mL
Homogeneização
10-2
10-3
1 mL
1 mL
1 mL
Caldo LST
(Teste
Presuntivo)
35-37ºC/48h
Multiplicação e produção de gás
(tubos positivos)
Caldo VB
(Teste confirmativo
para Coliformes
Totais)
1 alçada
Caldo EC
(Teste confirmativo
para Coliformes a
45ºC)
Multiplicação e
produção de gás
NMP coliformes a
45ºC
E. coli
E. aerogenes
35-37ºC/48h
Multiplicação e
produção de gás
NMP coliformes
totais
45º/24h
Citrato de
Simmons
35-37ºC/96h
Citrato (-)
1 alça
Ágar EMBA
(Teste confirmativo
para E. coli)
1 alça
35-37ºC/24h
Caldo
MR-VP
Caldo
Triptona
35-37ºC/48h (VP)
35-37ºC/96h (VM)
35-37ºC/24h
VP (-) e VM (+)
Indol (-) ou (+)
18
3.2. Enumeração de coliformes em água empregando o método da membrana
filtrante
3.2.1.
Material necessário
Meios de cultura:
Meio m-Endo (51)
Meio m-FC (52)
Reagentes:
Ácido rosólico 1% em NaOH 0,2N
NaOH 1N
HCl 1N
Bomba de vácuo
Porta filtro
Placas de Petri de 5 cm de diâmetro
Kitassato ou sistema manifold
Pinça de bordas chatas
Membranas filtrantes
Cartão absorvente
Mangueira de silicone flexível
Estufa incubadora a 35 ºC
Banho-maria a 44,5 ºC
3.2.2.
Metodologia
3.2.2.1. Preparo da amostra
Homogeneizar a amostra por inversão do frasco.
3.2.2.2. Procedimento para o preparo da unidade filtrante
a) Esterilizar o porta-filtro por autoclavação a 121 ºC por 15 minutos. Caso o portafiltro seja de aço-inox ou de vidro pode ser esterilizado por exposição à luz ultravioleta por 5 minutos (distância da fonte de UV de 15 cm).
b) Conectar o kitassato (na saída lateral) à bomba de vácuo com auxílio da
mangueira.
c) Acoplar o porta-filtro ao kitassato ou ao sistema manifold.
d) Retirar a membrana filtrante do envelope com auxílio da pinça previamente
flambada. Colocar a membrana com o quadriculado voltado para cima, sobre a base
do porta-filtro.
3.2.2.3. Procedimento de análise
a) Transferir 100 mL da amostra para o porta-filtro.
b) Ligar a bomba de vácuo e, assim que todo o líquido for filtrado, desligar.
19
g) Adicionar água estéril para lavar as paredes internas do porta-filtro (20 mL
aproximadamente). Agitar o porta-filtro e filtrar novamente.
h) Retirar, com a pinça previamente flambada, a membrana e colocar na placa sobre
o cartão absorvente embebido com 2 mL de meio de cultura colocando o
quadriculado voltado para cima. Para contagem de coliformes totais, usar o meio mEndo e para coliformes termotolerantes, o meio m-FC.
i) Fechar a placa e cuidar para não deixar ar retido entre a membrana e o meio de
cultura. Incubar a placa de Petri invertida.
j) Para coliformes totais, incubar em estufa a 35 ºC por 24  2 horas. Caso a estufa
seja muito grande, colocar um recipiente raso com água para umidificar o ambiente,
evitando, assim, o ressecamento do meio de cultura das placas.
Para coliformes termotolerantes, colocar as placas em um frasco de vidro com tampa
e incubar esse frasco em banho-maria a 44,5  0,2 ºC, por 24  4 horas.
3.3.
Resultados
- Coliformes totais: Contar todas as colônias com cor verde ou vermelha com brilho
metálico característico.
Expressar os resultados em UFC de coliformes totais/100 mL.
- Coliformes a 44,5 ºC: Contar todas as colônias com cor azul royal forte.
Expressar os resultados como UFC de coliformes termotolerantes/100 mL.
Pesquisa de E. coli
As colônias de coloração azul nas placas de m-Endo são suspeitas de E.coli. Para a
confirmação, utilizar os testes bioquímicos do item 3.1.2 do método dos tubos
múltiplos.
20
4. Pesquisa de Salmonella
4.1. Material necessário
Meios de cultura:
Caldo Lactosado (39)
Caldo Rappaport-Vassiliadis – RV (42)
Caldo Tetrationato – TT (43)
Ágar Bismuto Sulfito – BS (4)
Ágar Entérico de Hektoen – HE (7)
Ágar Rambach – RAM (18)
Meio EPM (49)
Meio MILi (53)
Ágar Citrato de Simmons (5)
Ágar Lisina Ferro – LIA (10)
Ágar Tríplice Açúcar Ferro – TSI (21)
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas de 1 mL
Estufa a 35 ºC
Contador de colônias
Filtro esterilizante
Soros polivalentes somático e flagelar
4.2. Metodologia
4.2.1. Pré-enriquecimento
Homogeneizar 25 g ou 25 mL do alimento com 225 mL de caldo Lactosado. Incubar a
35-37 ºC, por 18-24 horas.
4.2.2. Enriquecimento
Transferir 1 mL do homogeneizado para um tubo contendo 10 mL de caldo tetrationato
e 0,1 mL para um tubo contendo 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis. Incubar o
primeiro a 35 ºC e o segundo a 43 ºC em banho-maria por 24 horas. Obs: Para
amostras de carnes cruas ou rações, incubar ambos a 43 ºC.
4.2.3. Semeadura em ágar seletivo
Semear superficialmente por esgotamento os caldos de enriquecimento em placas de
ágar Bismuto Sulfito (BS), ágar Entérico de Hektoen (HE) e ágar Rambach (RAM), de
modo a obter colônias isoladas. Incubar a 35-37 ºC por 24 horas.
21
4.2.4. Identificação de colônias suspeitas
Ágar BS: as colônias podem ser de cor marrom, cinza ou preta; algumas vezes
apresentam-se com brilho metálico.
Ágar HE: colônias verde-azuladas a azuis com ou sem centro negro. Muitas culturas
de Salmonella spp. podem produzir colônias totalmente negras.
Ágar Rambach: colônias “pink”, arredondadas, brilhantes.
4.2.5. Identificação bioquímica
Semear uma colônia em tubo contendo ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI), inclinado, e
ágar Lisina Ferro (LIA). Incubar a 35-37 C/24h.
TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de
H2S (escurecimento do ágar). Reação atípica em TSI que não deve ser descartada se
as demais reações em LIA se apresentarem típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos),
com ou sem produção de H2S.
LIA: fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração da cor do meio), com ou sem
produção de H2S (escurecimento do meio). Reação atípica em LIA que não deve ser
descartada se as demais reações em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado
com rampa alcalina, com ou sem produção de H2S.
Colônias características de Salmonella: proceder à incubação no sistema Enterokit
B (Probac do Brasil Produtos Bacteriológicos Ltda.), que emprega os meios EPM, MILi e
Citrato de Simmons.
Tocar o centro da colônia suspeita com a agulha de níquel-cromo e semear: o meio
EPM em toda a superfície e por picada até o fundo do tubo; o meio MILi, por picada,
até o fundo e o meio de citrato em toda a superfície. Incubar os 3 tubos a 37 ºC
durante 24 horas.
O meio EPM permite observar:
1)
2)
3)
4)
produção
produção
produção
produção
de
de
de
de
gás: desenvolvimento de bolhas.
H2S: enegrecimento do meio.
urease: a base do meio fica azul.
L-triptofano desaminase: a superfície do meio fica verde escuro.
O meio MILi permite observar:
1) motilidade: o meio fica todo turvo.
2) produção de lisina descarboxilase: o meio fica todo roxo.
3) produção de indol: desenvolvimento de anel vermelho, após adição do reativo de
Kovacs.
O meio citrato de Simmons permite observar utilização de citrato por mudança de
cor do meio para azul.
22
Os resultados destes testes para Salmonella são:
EPM
MILi
Salmonella spp.
S. Typhi
S. paratyphi A
produção de gás
+
-
V
produção de H2S
+
+f
-
produção de urease
-
-
-
produção de LTD
-
-
-
motilidade
+
+
+
indol
-
-
-
lisina
+
+
-
+
-
-
Citrato
V = variável
+f = positivo fraco
4.2.6. Identificação sorológica
Deverá ser realizada após a identificação bioquímica, utilizando-se inicialmente o
soro polivalente somático (contém anticorpos contra os antigenos somáticos das
salmonelas dos grupos A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3, E4 e contra o antigeno Vi) e,
posteriormente, o soro polivalente anti-Salmonella flagelar (contém anticorpos contra
os antigenos flagelares a, b, c, d, i, 1, 2, 5) (Probac do Brasil Produtos
Bacteriológicos Ltda.). A metodologia para a identificação sorológica é a de
aglutinação em lâmina.
A presença de Salmonella deve ser confirmada por testes sorológicos. O gênero
Salmonella é caracterizado por componentes antigênicos específicos. Os antígenos
estão divididos em somático (O), flagelar (H) e capsular (K). Os antígenos somáticos
são compostos de lipopolissacarídeos complexos que são termoestáveis e resistentes
a etanol e ácido diluído. Os antígenos flagelares (H) são protéicos e termossensíveis,
enquanto que os antígenos de superfície (K) consistem de polissacarídeos
termossensíveis que estão presentes na cápsula ou na membrana externa da
bactéria. As Enterobacteriaceae possuem alguns antígenos somáticos semelhantes,
podendo causar testes falso-positivos. Este problema é diminuído com o uso de soros
mais específicos. Entretanto, a sorotipagem definitiva de uma cultura deve ser feita
por pessoal especialmente treinado, em laboratórios de referência.
4.3. Resultados
Expressar os resultados como “ausência” ou “presença” de Salmonella spp. em 25 g
ou 25 mL de alimento.
23
4.4. Esquema
25g amostra
225 mL de caldo de pré-enriquecimento
Homogeneização
Incubação 35-37ºC/18-24h
1 mL
Enriquecimento
seletivo
Ágar BS
0,1 mL
Caldo Tetrationato
(TT) 10 mL
Caldo RappaportVassiliadis (RV) 10 mL
35ºC/24h
43ºC/24h
Ágar RAM
Ágar BS
Ágar HE
Ágar RAM
Ágar HE
35-37ºC/24h
Identificação
Ágar
TSI
Ágar LIA
35-37ºC/24h
EPM
MILi
Citrato de Simmons
35-37ºC/24h
Série bioquímica positiva para Salmonella
Sorologia
24
5. ENUMERAÇÃO
DE
CLOSTRÍDIOS
Clostridium perfringens
SULFITO-REDUTORES
E
DE
5.1. Material necessário
Meios de cultura:
Ágar Triptose Sulfito Cicloserina – TSC (25)
Caldo Tioglicolato (45)
Ágar Nitrato-Motilidade (11)
Meio Lactose-Gelatina (50)
Reagentes para nitrato
Jarras para anaerobiose
Envelopes geradores de anaerobiose
Estufa a 46 ºC
Contador de colônias
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas
5.2. Metodologia
5.2.1. Preparo do alimento para análise
Proceder a homogeneização do alimento e a diluição seriada adequada.
5.2.2. Procedimento
a) De cada diluição do alimento, transferir 1 mL para placas de Petri esterilizadas.
b) A cada placa, adicionar cerca de 15 mL de ágar TSC, resfriado a 50 ºC,
homogeneizando suavemente.
c) Após solidificação do ágar, colocar nova camada de ágar TSC, de aproximadamente
5 mL, cobrindo toda a superfície do ágar ("over-ágar").
d) Após a solidificação da sobrecamada, incubar, sem inverter as placas, em
anaerobiose, durante 18-24 horas a 46 ºC.
e) Decorrido o tempo de incubação, contar as colônias negras.
f) Para a identificação de C. perfringens, selecionar colônias características e efetuar as
provas bioquímicas de confirmação.
25
5.2.3. Provas bioquímicas de confirmação
Todos os meios a serem utilizados devem ser desaerados e rapidamente resfriado em
banho de gelo no momento de uso.
Inocular as colônias suspeitas em caldo Tioglicolato e incubar a 35 ºC durante 18-24
horas. Fazer os seguintes testes:
a) Coloração de Gram: C. perfringens é bacilo Gram-positivo.
b) Teste de nitrato-motilidade: Inocular o meio de cultura com auxílio de agulha e
incubar a 37 ºC durante 24 horas. A motilidade é positiva quando há turvação de todo
o meio. A redução do nitrato a nitrito é observada pelo desenvolvimento de coloração
vermelha ou alaranjada após adição de 0,5 mL do reativo A e 4 gotas do reativo B.
Caso não haja o aparecimento de uma dessas cores, adicionar uma pitada de zinco em
pó. O aparecimento da cor vermelha, neste momento, indica que o teste é negativo
para esta prova. O não aparecimento da cor vermelha, após a adição do zinco, indica
que o teste é positivo para a redução do nitrato a nitrito. C. perfringens é negativo no
teste de motilidade e positivo na redução do nitrato.
c) Liquefação da gelatina e fermentação de lactose: Inocular, com auxílio de
agulha e incubar a 37 ºC durante 24-48 horas. A fermentação da lactose é indicada
pelo desenvolvimento de coloração amarela no meio e a formação de gás (bolhas).
Para leitura do teste de liquefação da gelatina, incubar o tubo por 1 hora em geladeira.
A prova é considerada positiva, quando não ocorrer a solidificação da gelatina. C.
perfringens é positivo para ambos os testes.
5.3. Resultados
Calcular o número de C. perfringens por grama de alimento, considerando somente as
contagens de colônias suspeitas confirmadas pelos testes bioquímicos. Expressar os
resultados em Unidades Formadas de Colônias por grama (UFC/g).
Para esse cálculo, considerar o número de colônias que foram positivas nos testes
bioquímicos e o número total de colônias características. Por exemplo: se o número de
colônias características foi igual a 25, e 5 colônias foram bioquimicamente testadas,
sendo que 3 foram positivas para C. perfringens, o número de C. perfringens será:
25 colônias características ------------------------------------ 5 testadas
X ----------------------------------- 3 confirmadas
X
= 15
Consequentemente, a população de C. perfringens será igual a 15 multiplicado pelo
inverso da diluição.
26
5.4. Esquema
25g amostra
225 mL de diluente
9 mL de diluente
10-1
Homogeneização
9 mL de diluente
1 mL
1 mL
10-2
1 mL
10-3
1 mL
1 mL
TSC com
sobrecamada
46ºC/18-24h anaerobiose
Colônias pretas típicas
Caldo tioglicolato
35ºC/18-24h
Coloração de
Gram (+)
Teste Nitratomotilidade
37ºC/24h
Nitrato (+)
Motilidade (-)
Liquefação da
gelatina e
fermentação da
glicose
37ºC/24-48h
Fermentação
Lactose (+) gás (+)
Hidrol. Gelatina (+)
27
6. ENUMERAÇÃO DE Staphylococcus aureus
6.1. Material necessário
Meio de cultura:
Ágar Baird-Parker – BP (2)
Caldo Infusão Cérebro Coração – BHI (38)
Ágar DNA Azul de Toluidina (6)
Plasma de coelho
Estufa a 35oC
Contador de colônias
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas de 2 mL
Alças de Drigalski
6.2. Metodologia
6.2.1. Preparo do alimento para análise
Efetuar a homogeneização e a diluição seriada do alimento.
6.2.2. Procedimento
a) Transferir 0,1 mL de cada diluição do alimento para a superfície do meio de BairdParker. Espalhar com a alça de Drigalski.
b) Após completa secagem da superfície do ágar, inverter as placas e incubá-las a
35 ºC durante 48 horas.
c) Decorrido o tempo de incubação, selecionar as colônias suspeitas, de coloração
negra com 2 halos circundantes e efetuar os testes bioquímicos de confirmação.
Obs.: existem Staphylococcus que não apresentam os dois halos, assim, quaisquer
colônias pretas devem ser testadas.
6.2.3. Identificação bioquímica
Reação da coagulase
a) Inocular as colônias suspeitas em caldo BHI e incubar a 35 ºC durante 24 horas.
b) Misturar 0,1 mL desta cultura com 0,3 mL de plasma de coelho.
c) Incubar a 35 ºC, observando a formação de coágulo. Após 6 horas, a ausência de
coágulo indica teste negativo.
A coagulase é uma exotoxina produzida pelo Staphylococcus coagulase positiva. A
coagulase é um fator semelhante a uma enzima que causa a coagulação da fibrina
28
formando um coágulo que pode ser visualizado. A produção de coagulase nesse
gênero de bactérias é normalmente associada à patogenicidade.
Reação da termonuclease
a) Pipetar, de modo a espalhar, 3 mL de ágar DNA Azul de Toluidina sobre uma lâmina
de microscopia.
b) Após solidificar, cortar o ágar usando um tubo capilar esterilizado, de modo a obter
orifícios de 2 mm de diâmetro. Remover o ágar dos orifícios por aspiração.
c) Utilizando pipetas Pasteur ou tubos capilares, adicionar a cada orifício,
aproximadamente, 10 L da cultura em caldo usada para o teste da coagulase,
previamente aquecida durante 15 minutos em banho-maria em ebulição.
d) Incubar a lâmina em câmara úmida por 4 horas a 35-37 ºC.
Esta reação permite observar a capacidade do microrganismo em degradar a molécula
de DNA (ácido desoxirribonucléico) utilizando a desoxirribonuclease (DNase). A DNase
é uma enzima extracelular que hidrolisa o DNA produzindo oligonucleotídeos, que são
cadeias de vários desoxirribonucleotídeos ou até mesmo mononucleotídeos.
Reação positiva: aparecimento de um halo cor de rosa brilhante, estendendo-se por,
pelo menos, 1 mm além das bordas do orifício.
6.3. Resultados
Calcular o número de UFC de S. aureus por grama de alimento de maneira análoga ao
realizado para C. perfringens (item 5.3.).
Expressar os resultados em “Unidades Formadoras de Colônia” por grama (UFC/g).
29
6.4. Esquema
25g amostra
225 mL de diluente
9 mL de diluente
9 mL de diluente
10-1
1 mL
1 mL
Homogeneização
10-1
10-2
10-3
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
Ágar BairdParker
35ºC/48h
Colônias típicas
Caldo BHI
35ºC/24h
0,1 mL
0,3 mL de
plasma de
coelho
35ºC/6h
Ágar DNA azul de toluidina
+
10 L da cultura em caldo BHI
(aquecido em banho por
15min)
35-37ºC/4h em
câmara úmida
Reação de
termonuclease
Reação de
coagulase
30
7. ENUMERAÇÃO DE Bacillus cereus
7.1. Material necessário
Meios de cultura:
Ágar Polimixina Piruvato Gema de Ovo Manitol Azul de Bromotimol –
PEMBA (16)
Meio Motilidade BC Semi-Sólido (54)
Ágar Nutriente (12)
Ágar Sangue (19)
Reagente:
Fucsina básica
Estufa a 30oC
Contador de colônias
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas de 2 mL
Alça de Drigalski
7.2. Metodologia
7.2.1. Preparo do alimento para análise
Efetuar a homogeneização do alimento e diluição seriada adequada da amostra.
7.2.2. Procedimento
a) De cada diluição do alimento, transferir 0,1 mL para placas de Petri contendo o
meio PEMBA. Espalhar com auxílio de alça de Drigalski.
b) Após a completa secagem da superfície do ágar, inverter as placas e incubá-las
a 35oC durante 24h.
c) Examinar as colônias típicas de Bacillus cereus.
d) Caso não haja colônias características, incubar por mais 24h à 25oC.
e) Decorrido o tempo de incubação, efetuar a contagem das colônias de cor
turquesa a azul pavão, rodeadas por um precipitado denso de mesma cor. Efetuar
os testes bioquímicos para confirmação das colônias suspeitas.
7.2.3. Testes bioquímicos de confirmação
a) Motilidade: inocular, com auxílio de alça de níquel-cromo, 1 tubo com meio
motilidade BC semi-sólido. Incubar por 18-24 horas a 30 ºC. Os
microrganismos móveis produzem crescimento difuso ao longo da picada.
Inocular os tubos por picada, no centro do meio até aproximadamene 1cm do
fundo do tubo e incubar. Observar se ocorreu migração das células para as
regiões fora da linha de inoculação (motilidade positiva) ou se o crescimento
restringiu-se à linha da picada (motilidade negativa). As cepas de B. cereus e
31
B. thuringiensis geralmente são ativamente móveis, enquanto as cepas de B.
anthracis e B. cereus var. mycoides são imóveis.
b) Crescimento rizóide: com auxílio de uma alça de níquel-cromo, inocular, sem
espalhar, o centro de uma placa de ágar nutriente, previamente seca. Incubar a
30 ºC por 48-72 horas. O crescimento rizóide é caracterizado pelo
aparecimento de colônias com morfologia semelhante a raízes de árvore podem
se estender vários centímetros do centro da inoculação. Colônias de B.cereus,
B. thurigiensis e B.anthracis não apresentam crescimento rizóide.
c) Atividade hemolítica: inocular, por picada, uma placa de ágar sangue.
Incubar a 35 ºC por 24 horas. Verificar a presença de atividade hemolítica.
As colônias de B. cereus são fortemente hemolíticas (β), produzindo halos de
hemólise grandes, claros e bem nítidos ao redor das colônias. A maioria das
cepas de B. thuringiensis e B. mycoides é também
β-hemolítica. Cepas de B.
anthracis são geralmente não hemolíticos após 24h de incubação.
d) Produção de cristal de toxina: incubar as placas de ágar nutriente usadas no
item “b”, por um período adicional de 3 dias à temperatura ambiente.
Após a coloração, o exame em microscópio com lente de imersão permite a
visualização da presença de esporos livres e de cristais de toxinas. Os cristais
são geralmente menores do que os esporos e abundantes em culturas de
B. thuringiensis com 3 a 4 dias, B. cereus e outros membros do grupo do B.
cereus não produzem cristais de toxinas.
Proceder como descrito a seguir:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
preparar um esfregaço da colônia em uma lâmina de microscopia
fixar pelo calor
recobrir com metanol. Aguardar 30 segundos
drenar o metanol e secar na chama
recobrir com solução de fucsina básica
aquecer na chama até começar a desprender fumaça. Aguardar 1-2 minutos
reaquecer. Aguardar 30 segundos
drenar o corante e lavar com água
secar
Examinar a lâmina em microscópio e verificar a presença de esporos livres e
cristais de toxina tetragonais ("diamond-shaped"). Os cristais são ligeiramente
menores que os esporos.
Os resultados destes testes são:
32
Teste
B.cereus
Reação gema de ovo
+
Ácido do manitol
Motilidade
V
Crescimento rizóide
Atividade hemolítica
+
Prod. cristal de toxina
V = variável
+ = 50-90% de linhagens positivas
B. thuringiensis
+
V
+
+
B.cereus
var. mycoides
+
+
+
-
B. anthracis
+
-
7.3. Resultados
Calcular o número de UFC de B. cereus por grama de alimento de maneira análoga
a descrita para C. perfringens (item 5.3.).
33
7.4. Esquema
25g amostra
225 mL de diluente
10-1
Homogeneização
9 mL de diluente
9 mL de diluente
1 mL
1 mL
10-3
10-2
0,1m
L
0,1m
L
0,1m
L
Ágar PEMBA
30ºC/24h
Colônias suspeitas
Meio
motilidade
BC
30ºC/18-24h
Ágar nutriente
Ágar sangue
30ºC/48-72h
35ºC/24h
Teste de crescimento
rizóide
Teste de motilidade
Teste de hemólise
25ºC/3dias
Produção de Cristal de toxina
34
8. PESQUISA DE Listeria monocytogenes
8.1. Material necessário
Meios de cultura:
Caldo de Enriquecimento para Listeria Tamponado – BLEB (36)
Ágar Palcam (15)
Ágar Oxford (13)
Ágar Tripticase Soja com Extrato de Levedura – TSA-YE (24)
Ágar Sangue de Cavalo (19)
Meio para Teste de Motilidade (55)
Ágar Púrpura de Bromocresol (17)
Estufas a 25 ºC, 30 ºC e 35 ºC
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas de 1 mL
Filtros esterilizantes
8.2. Metodologia
8.2.1. Enriquecimento
Homogeneizar 25 g ou 25 mL do alimento com 225 mL de caldo de enriquecimento
para listerias. Incubar a 30 ºC por 24 e 48 horas.
8.2.2. Semeadura em ágar seletivo
Após 24 e 48 horas, semear uma alçada da amostra enriquecida em placas de ágar
Palcam e ágar Oxford, de modo a obter colônias isoladas.
Incubar as placas de ágar Palcam e Oxford a 35 ºC por 24-48 horas.
Identificação das colônias suspeitas
Ágar Palcam: colônias cinza-esverdeadas com centro côncavo, negro; halo negro
sobre fundo vermelho.
Ágar Oxford: colônias negras com centro côncavo e halo negro.
8.2.3. Purificação das colônias
Tocar o centro da colônia suspeita com a agulha de níquel cromo e semear em
placa de ágar Soja Tripticase com Extrato de Levedura (TSA-YE). Incubar a 35 ºC
por 24 horas. Examinar sob luz transmitida buscando colônias verde-azuladas.
8.2.4. Identificação bioquímica
Tocar o centro da colônia suspeita com a agulha de platina e semear, por picada, o
ágar sangue de cavalo, o meio para teste de motilidade e um tubo de TSA-YE.
Incubar o teste de motilidade a 25 ºC por 7 dias e os demais a 35 ºC por 24 horas.
35
No ágar sangue, L. monocytogenes apresenta uma zona de hemólise pequena,
muitas vezes restrita às bordas da colônia.
No meio de motilidade, Listeria spp. apresenta crescimento típico em forma de
guarda-chuva.
A partir do tubo de TSA-YE, inocular em placas de ágar púrpura de bromocresol,
cada uma delas acrescida de um dos seguintes carboidratos: xilose, dextrose,
ramnose e manitol. Incubar a 35 ºC por 24-48 horas.
Fazer também o teste para produção de catalase.
A catalase é uma enzima que destrói o peróxido de hidrogênio, um produto tóxico
para a bactéria. Se a mistura do crescimento da bactéria com peróxido de
hidrogênio provoca o imediato aparecimento de bolhas (liberação de oxigênio), isso
é indicativo da presença de catalase.
catalase
2H2O2 
2H2O + O2
Os resultados para as diferentes espécies de Listeria são:
Espécie
L.
L.
L.
L.
L.
monocytogenes
innocua
seeligeri
ivanovii
welshimeri
DEX
+
+
+
+
+
Fermentação de
carboidratos
XIL
RAM
MAN
+
*
+
+
+
*
-
. Hémolise
Catalase
+
+
+
-
+
+
+
+
+
* variável
DEX = dextrose, XIL = xilose, RAM = ramnose, MAN = manitol
8.3. Resultados
Expressar os resultados como “ausência” ou “presença” de Listeria monocytogenes
em 25 g ou 25 mL.
36
8.4. Esquema
25g amostra
225 mL de caldo BLEB
Enriquecimento
Homogeneização
Incubação 30ºC/24 e 48h
Palcam
Oxford
35ºC/48h
Colônias típicas
Examinar sob luz
transmitida
TSA-YE
35ºC/24h
Colônias típicas
Teste da
catalase
Hemólise
Fermentação de carboidratos
Motilidade
25° C
37
9. PESQUISA DE Vibrio parahaemolyticus
9.1. Material necessário:
Meios de cultura:
Tampão Fosfato Salina pH 7,4 – PBS (62)
Água Peptonada Alcalina pH 8,5 ± 0,2 – APA (28)
Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose – TCBS (20)
Ágar Tripticase Soja + 2% NaCl – TSA (23)
Ágar Triplice Açúcar Ferro + 2% NaCl – TSI (22)
Ágar Arginina Glicose – AGS (1)
Meio Teste Motilidade + 2% NaCl (55)
Caldo Triptona sem e com 3%, 6%, 8% ou 10% NaCl – T1N (44)
Reagentes:
Reagente de oxidase
Estufa a 35 ºC
9.2. Metodologia:
9.2.1. Preparação da Amostra
Para amostras de moluscos: lavar a superfície externa dos animais (12 animais)
com o auxílio de uma escova e sob água corrente potável para a remoção de
resíduos aderidos às cascas. Abrir os animais com o auxílio de uma faca
esterilizada e retirar o músculo e o líquido interno de cada animal, colocando-os em
um saco plástico estéril. Em seguida, homogeneizar em Stomacher por 2 minutos
em alta velocidade. Misturar 25 g deste homogeneizado com 225 mL (10-1) de
Tampão Fosfato Salina pH 7,4 (PBS). Fazer diluições decimais com o mesmo
diluente.
9.2.2. Enriquecimento
Transferir três alíquotas de 1 mL de cada diluição para três, tubos, separados de
APA e incubar a 35-37 ºC por 16-18h.
9.2.3. Isolamento
Semear, superficialmente em meio TCBS, com o auxílio de alça de níquel-cromo,
um inóculo retirado da superfície de cada tubo de APA. A semeadura deve garantir
a obtenção de colônias isoladas. Incubar 35-37 ºC por 18-24h.
Identificação de colônias
Colônias suspeitas de Vibrio parahaemolyticus em ágar TCBS têm de 2-3 mm de
diâmetro e apresentam coloração verde ou azul esverdeada.
38
9.2.4. Identificação Bioquímica
Transferir as colônias suspeitas para ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) adicionado de
NaCl 2% e ágar Arginina Glicose (AGS) inoculando em profundidade e superfície.
Inocular também um tubo com TSA (2% NaCl). Incubar a 35-37 ºC por 18-24h.
Vibrio parahaemolyticus em ágar TSI 2% NaCl apresenta ápice alcalino (vermelho)
e base ácida (amarela), sem gás ou H2S. Em ágar Arginina Glicose apresenta
reação alcalina na superfície (púrpura) e base ácida (amarela), sem gás ou H2S.
Quando os 2 resultados forem característicos, a partir do crescimento em TSA,
realizar os seguintes testes bioquímicos:
Prova de oxidase
Colocar uma gota do reagente de oxidase, recém-preparado, em um pedaço de
papel de filtro e transferir, com um palito estéril, pequena quantidade da colônia a
ser testada. O desenvolvimento de coloração púrpura em poucos segundos indica
reação positiva.
A citocromo-oxidase é uma enzima oxidativa do grupo das ferro porfirinas, que faz
parte da cadeia respiratória. A oxidação do citocromo c é uma reação que leva à
prova positiva de oxidase:
Nesta reação, os elétrons do citocromo c reduzido são captados pela citocromooxidase que os transfere para a molécula de oxigênio.
Na prova de oxidase ocorre a seguinte reação:
A leitura deve ser feita dentro de 10 segundos, pois o reagente pode tornar-se
oxidade pela exposição ao ar.
Teste Motilidade
Inocular, com auxílio de agulha de níquel cromo, até, aproximadamente, 2/3 da
profundidade do meio. Incubar a 35-37 ºC por 18-24h e observar o crescimento ao
longo da linha de inoculação.
Teste de multiplicação em presença de diferentes concentrações de NaCl
39
Inocular a colônia suspeita presente no ágar TSA (2% NaCl) em uma série de tubos
contendo caldo T1N com as diferentes concentrações salinas (0, 3, 6, 8% e 10% de
NaCl). Incubar a 35-37 ºC por 18-24h e observar o crescimento bacteriano.
Os resultados para V. parahaemolyticus são:
Prova
Prova
Caldo
Caldo
Caldo
Caldo
Caldo
da oxidase - positiva
da motilidade - positiva
T1N sem NaCl - negativo
T1N com 3% NaCl - positivo
T1N com 6% NaCl - positivo
T1N com 8% NaCl - positivo
T1N com 10% NaCl – negativo
9.3. Resultado
Expressar os resultados como NMP de Vibrio parahaemolyticus por g ou mL de
alimento.
40
9.4. Esquema
12 Ostras
Homogeneizar
25g amostra
225 mL de PBS
(3% NaCl)
9 mL de PBS
(3% NaCl)
1 mL
9 mL de PBS
(3% NaCl)
1 mL
10-1
10-2
10-3
1 mL
1 mL
1 mL
APA
35-37ºC/16-18h
Tubos positivos (NMP)
Ágar TCBS
35-37ºC/18-24h
TSI (2%NaCl)
AGS (2%NaCl)
TSA (2%NaCl)
35-37ºC/18-24h
35-37ºC/18-24h
35-37ºC/12-24h
Oxidase
Caldo
T1N
Caldo
T1N3
Caldo
T1N6
Caldo
T1N8
Caldo
T1N10
Motilidade
35-37ºC/18-24h
41
V.
MÉTODOS ALTERNATIVOS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
DE ALIMENTOS
Os métodos convencionais de análise microbiológica de alimentos são trabalhosos,
demoram muito para dar o resultado da análise e estão sujeitos a falhas humanas. Para
contornar esses problemas, estão surgindo no mercado muitos métodos alternativos,
muito mais simples que os métodos convencionais, e que fornecem resultados mais
rápidos. Por serem prontos para uso, são padronizados e menos sujeitos a erros durante
a realização da análise e também na interpretação dos resultados.
Os métodos alternativos podem ser divididos em dois grandes grupos: aqueles utilizados
para contagem de microrganismos indicadores (bactérias aeróbias totais, coliformes
totais, coliformes fecais, Escherichia coli, fungos) e os empregados na pesquisa de
patógenos. Os métodos alternativos são considerados apenas métodos de triagem, ou
seja, todo resultado positivo deve ser confirmado através da metodologia convencional.
No curso prático da disciplina de Análise Microbiológica de Alimentos, serão utilizadas
duas técnicas alternativas, uma para contagem de indicadores (Petrifilm) e outra para
pesquisa de Listeria spp. (VIP), escolhidas ao acaso entre as inúmeras alternativas
possíveis.
PETRIFILM
TM
As placas Petrifilm, produzidas pela 3M Health Care, USA, são placas prontas para uso,
constituídas de um cartão (8x 10cm) revestido de nutrientes desidratados e géis
hidrossolúveis a frio. Cada placa Petrifilm tem um filme superior removível, revestido
internamente de géis e de um corante indicador. No momento do uso, suspende-se o
filme superior e adiciona-se ao cartão 1 ml do produto a ser testado adequadamente
diluído. Volta-se o filme superior para área de 20 cm2, e aguarda-se a solidificação do gel
(1 mL). Incuba-se as placas e faz-se a contagem das colônias, que tem coloração
vermelha devido ao indicador 2,3,5 cloreto de trifeniltetrazolio.
a) Contagem total
Após seguir procedimento acima relatado, selecionar as placas que apresentarem de 25
a 250 colônias vermelhas e fazer a contagem, usando contador. Quando houver
duplicatas para uma mesma diluição, calcular a média das colônias nas duas placas. Usar
o guia de interpretação da 3M. Reportar os resultados em Unidades Formadoras de
Colônias (UFC) por g ou ml de produto, multiplicando o resultado da contagem pelo
inverso da diluição decimal correspondente.
b) Enumeração de coliformes totais e Escherichia coli
Selecionar as placas PCC que apresentarem de 25 a 250 colônias vermelhas com bolhas
de gás (coliformes totais) e fazer contagem, usando contador. Nas placas PEC, contar as
colônias vermelhas com Gás (coliformes totais) e azuis com gás (E. coli). Quando houver
duplicatas pra a mesma diluição, calcular a média das colônias nas duas placas. Usar
guia de interpretação da 3M. Reportar os resultados em Unidades Formadoras de
Colônias (UFC) por g ou ml de coliformes totais ou E. coli, multiplicando o resultado da
contagem pelo inverso da diluição decimal correspondente. Se a placa utilizada foi PEC e
se o resultado que interessa é o de coliformes totais, somar o número de colônias
vermelhas e de azuis. Caso haja interesse em determinar coliformes fecais, as placas
PCC ou PEC devem ser incubadas a 45,5o C. A incubação pode ser feita em estufa dentro
de um recipiente fechado contendo algodão umedecido ou banho-maria, dentro de
42
embalagem original das placas Petrifilm, adequadamente vedada para impedir a entrada
de água.
VIP PARA Listeria
O Visual Immunoprecipitate Assay (VIP), da BioControl Systems, é um teste que utiliza
anticorpos altamente específicos para Listeria, estando parte deles ligada à superfície de
pequenas partículas móveis de látex, coradas de azul, e outra parte imobilizada.
Apresenta-se como um aparato de uso único com 3 janelas: uma, onde se coloca a
amostra enriquecida; outra, onde aparece o resultado do teste; a última é do controle. A
amostra enriquecida é adicionada na janela da amostra e, por capilaridade, migra até as
janelas de resultado e de controle. Na primeira, se Listeria estiver presente, o complexo
antígeno-anticorpo-partículas de látex formado liga-se a anticorpos imobilizados na
membrana. O excesso de látex carregando ou não o antígeno continuará a migrar até
encontrar uma linha de anticorpos policlonais, formando uma linha azul de controle. Se a
linha na janela de resultados não aparecer, a amostra é considerada negativa. O tempo
total para obtenção de resultado é de 52 horas.
43
VI.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
Coloração de Gram
1 - Preparar a extensão na lâmina
2 - Fixar pelo calor
3 - Corar um minuto com a solução de cristal violeta fenicada (ou com a solução
de oxalato de amôneo segundo Hucker)
4 - Escorrer o corante e cobrir durante 1 min com lugol
5 - Lavar com água corrente
6 - Diferenciar com álcool 95o
7 - Lavar com água corrente
8 - Corar o fundo rapidamente com fucsina
9 - Lavar e secar
Coloração de Esporos - Método de Wirtz
1 - Preparar a extensão na lâmina
2 - Fixar pelo calor
3 - Cobrir com verde malaquita e aquecer até o desprendimento de vapores
durante 1-2 minutos, sem deixar ferver
4 - Lavar com água corrente
5 - Corar rapidamente com a safranina
6 - Lavar e secar
44
VII. MEIOS DE CULTURA
1 – Ágar Arginina Glicose Inclinado (AGS)
Peptona
Extrato de levedura
Triptona
NaCl
Gicose
L-arginina
Citrato de amônia férrica
Tiossulfato de sódio
Bromocresol púrpura
Ágar
Água destilada
5g
3g
10 g
20 g
1g
5g
0,5 g
0,3 g
0,02 g
15 g
1000 mL
Suspender os ingredientes em água destilada e ferver para dissolver. Dispensar em
tubos e autoclavar de 10-12 min por 121 ºC. Antes de solidificar, inclinar os tubos.
2 – Ágar Baird-Parker (BP)
Preparar o meio conforme instruções no frasco. Esterilizar em autoclave a
121 oC durante 15 minutos. Esfriar a 50 oC e adicionar a cada 940 mL de meio as
seguintes soluções:
a) 10 mL de telurito de potássio a 1%
b) 50 mL de emulsão de gema de ovo (Extrair assepticamente as gemas,
colocando-as em uma proveta esterilizada. Medir seu volume e adicionar igual
volume de salina esterilizada. Homogeneizar bem, sem fazer espuma). Distribuir
em placas de Petri esterilizadas (15-20 mL por placa). Secar a superfície do meio
antes de usar as placas.
Esse meio contém cloreto de lítio e telurito de potássio como agentes seletivos. O
crescimento de S. aureus é favorecido pela adição de piruvato de sódio e glicina.
O telurito e os componentes da gema de ovo são os responsáveis pela
diferenciação dos estafilococos.
As colônias típica de S. aureus ficam pretas devido à redução do telurito (K2TeO3).
O halo opaco ao redor da colônia é formado por um precipitado contendo
gorduras, ácidos graxos livres e proteínas, devido à ação da lecitinase. O halo
transparente é devido a hidrólise dos lipídeos pela lipase.
Estafilococos coagulase negativos raramente crescem e são facilmente
diferenciáveis devido à sua aparência irregular e grandes halos opacos. Espécies
de Proteus e Bacillus também podem crescer, mas como colônias marrons.
3 – Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol com Cloranfenicol Suplemento
Seletivo (DRBC)
Preparar conforme instruções no frasco.
45
O meio DRBC é uma modificação do meio ágar Rosa de Bengala com o
suplemento Cloranfenicol com pH reduzido para 5,6, redução de Rosa de Bengala
para 50% e adição de Dicloran. O efeito cumulativo destas modificações
proporciona inibição de crescimento bacteriano, evita o “espalhamento” de
bolores como Rhizopus e Mucor, além de facilitar o crescimento de espécies que
não são isoladas com o ágar Rosa de Bengala Cloranfenicol e o ágar Batata
Dextrose Acidificado. A inibição no “espalhamento” de bolores e restrição no
tamanho das colônias faz com que a enumeração e detecção de bolores
produtores de micotoxinas e outras espécies de importância na deterioração de
alimentos seja efetiva.
4 - Ágar Bismuto Sulfito (BS)
Preparar conforme instruções no frasco.
Neste meio de cultura, sulfito de bismuto e verde brilhante inibem o crescimento
de gram positivos e coliformes, permitindo o vigoroso crescimento de Salmonella.
A produção de H2S ocorre devido à presença de compostos de sulfurados no meio
e o H2S gerado reage com o ferro contido no meio, formando um precipitado,
gerando colônias características marrons ou negras, com brilho metálico. A
redução dos íons bismuto a bismuto metálico é que confere brilho metálico às
colônias. As colônias de Salmonella podem ser de cor marrom, cinza ou preta;
algumas apresentam brilho metálico.
5 - Ágar Citrato de Simmons
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 2 mL por tubo de ensaio antes
de autoclavar.
É um ágar contendo citrato de sódio como única fonte de carbono e sais de
amônio (Dihidrogenio fosfato de amônia) como única fonte de nitrogênio e um
indicador de pH (azul de bromotimol – ácido = verde escuro, básico = azul
cobalto). A utilização do citrato leva à alcalinização do meio, provocando sua
mudança de cor de verde para azul.
Reações químicas envolvidas:
Utilização do Citrato
oxaloacetato + citrato  piruvato + CO2
CO2 + H2O + sódio  carbonato de sódio
6 - Ágar DNA Azul de Toluidina
Tris (hidroximetil) aminoetano
DNAse ágar
Sol.CaCl2 0,01M
NaCl
Ágar
Sol. de azul de toluidina 1%
0,61 g
0,63 g
0,1 mL
0,925 g
0,775 g
0,92 mL
Dissolver o Tris (hidroximetil) aminometano em 100 mL de água destilada e
ajustar o pH em 9,0. Adicionar os demais ingredientes, exceto o azul de toluidina.
Fundir em microondas. Resfriar a 50 oC e adicionar o azul de toluidina a essa
46
solução. O frasco de Erlenmeyer contendo o meio preparado deve ser tampado
com rolha de borracha e mantido em geladeira a 4 oC. Não é preciso esterilizar.
O ágar DNase com Azul de Toluidina (composto metacromático) forma um
complexo polimerizado que mantém o DNA do meio intacto. Quando algum
microrganismo produz a enzima DNAse ocorrerá a despolimerização do DNA e,
consequentemente, a quebra do complexo DNA-azul de toluidina. Esta quebra faz
com que os nucleotídeos reajam com o composto metacromático levando à
formação de zonas róseas ao redor do local de aplicação da amostra.
7 – Ágar Entérico de Hektoen (HE)
Preparar conforme instruções no frasco.
É um meio para Salmonella que possui sais biliares como agente seletivo e um
alto teor de peptona e carboidratos para contrabalancear o efeito inibitório dos
sais biliares sobre Shigella. As colônias lactose-positivas são diferenciadas das
lactose-negativas pela presença dos indicadores de pH azul de bromotimol e
fucsina ácida. Este meio permite ainda detectar a produção de sulfeto de
hidrogênio a partir de tiosulfato de sódio, o que torna as colônias negras, devido à
precipitação de sulfeto férrico. As colônias de Salmonella ficam verde azuladas
com ou sem centro negro, sendo que muitas culturas apresentam-se totalmente
negras.
8 - Ágar Eosina Azul de Metileno (EMBA) - Levine
Preparar conforme instruções no frasco.
Esse meio possui uma combinação de eosina e azul de metileno como
indicadores, permitindo uma nítida diferenciação de colônias fermentadoras e não
fermentadoras de lactose. Os microrganismos lactose positivos podem produzir
aldeídos que, combinados aos corantes, originam cor característica.
E. coli
aparece com centro escuro e característico brilho verde metálico e outros
coliformes produzem colônias róseas.
9 - Ágar Kligler Ferro (KIA)
Preparar conforme instruções no frasco.
O meio de cultura contém os seguintes agentes diferenciadores:
Dextrose - 1 g
Lactose - 10 g cada
tiossulfato de sódio – 0,3 g
sulfato ferroso – 0,2 g
vermelho de fenol-indicador de pH (ácido = amarelo, básico = vermelho) 0,024g
Permite a diferenciação de bacilos gram negativos com base na sua capacidade de
fermentar dextrose ou lactose e na capacidade de produção de sulfeto de
hidrogênio. Esse meio contém vermelho de fenol como indicador de pH e sulfato
ferroso como indicador da produção de H2S. Se a bactéria em teste fermenta a
glicose, a base fica amarela. Se a bactéria também utiliza lactose, a base e a
superfície ficarão amarelas. Os organismos lactose negativos deixam a superfície
47
vermelha, pois o pH fica alcalino devido à formação de subprodutos da utilização
aeróbia de aminoácidos e proteínas.
10 - Ágar Lisina Ferro (LIA)
Preparar conforme instruções do fabricante.
O meio de cultura contém, entre outros ingredientes, a seguinte composição:
Glicose  fonte primária de energia
L-lisina  aminoácido a ser descarboxilado
Citrato férrico amoniacal e tiossulfato de sódio  reveladores de H2S
Púrpura de bromocresol  indicador de pH
( ácido = amarelo, básico = púrpura)
A glicose, ao ser metabolizada, acidifica o meio tornando-o amarelo. Quando
depletada a glicose, se a bactéria produzir a enzima lisina-descarboxilase, a lisina
será degradada, dando origem a metabólitos alcalinos e a cor do meio voltará a
ser púrpura. Ainda nesse meio, pode-se observar a produção de H2S, que reage
com o ferro presente no meio, produzindo coloração negra. Também pode haver
produção de gás a partir da glicose.
11 – Ágar Nitrato-Motilidade
extrato de carne
peptona
nitrato de potássio
fosfato dissódico
galactose
glicerol
ágar
água
3,0 g
5,0 g
1,0 g
2,5 g
5,0 g
5,0 ml
3,0 g
1 litro
Dissolver os ingredientes, aquecendo. Acertar o pH para 7,4 e dividir em tubos (9
mL por tubo). Esterilizar em autoclave 121 oC durante 15 minutos. Esfriar
rapidamente em banho de gelo.
Clostridium perfringens não é móvel, e então o crescimento deve ocorrer apenas
ao longo da linha de inoculação. Pode-se observar também a reação de redução
do nitrato a nitrito.
nitrato redutase
NO3-

NO2-  NH3
O nitrito reage com ácido sulfanílico e -naftilamina, formando um azo-corante
vermelho. Assim, a cor vermelha após a adição dos dois reagentes é um teste
positivo para redução do nitrato. Se a cor vermelha não é observada, todo o
nitrato pode ter sido reduzido a nitrito e então completamente convertido a
amônia. Além disso, pode ter ocorrido desnitrificação, com completa conversão do
NO3 a N2. A outra possibilidade é que o nitrato não tenha sido reduzido.
Para determinar o que ocorreu, adiciona-se um pouco de zinco metálico, que
reduzirá nitrato a nitrito. Se for observada a formação de cor vermelha, então o
teste para redução do nitrato é negativo. A ausência de cor vermelha, após a
48
adição de zinco, indica que não havia mais nitrato no meio, indicando teste
positivo para redução de nitrato.
12 – Ágar Nutriente
Preparar conforme instruções no frasco.
É um meio de uso geral para manutenção de culturas de bactérias.
13 – Ágar Oxford
Preparar conforme instruções no frasco. Autoclavar. Adicionar, assepticamente, o
suplemento conforme recomendado pelo fabricante. Distribuir em placas estéreis.
Para o isolamento e diferenciação de Listeria spp., este meio utiliza como agentes
seletivos cloreto de lítio, acriflavina, sulfato de colistina, cefotetan, cicloheximida
e fosfomicina e, ainda, possui o sistema indicador esculina/íons ferro. Listeria spp.
hidrolisa esculina, produzindo zonas escuras ao redor das colônias.
C15H16O9
esculina
+
H2O
enzima

bacteriana
C6H12O6
glicose
+
C9H6O4
esculetina
+
citrato férrico

sal marrom escuro
14 – Ágar Padrão para Contagem (PCA)
Preparar conforme instruções no frasco.
É um meio rico (contém triptona, extrato de levedura e dextrose) que permite o
desenvolvimento de praticamente todas as bactérias presentes na amostra,
permitindo que se tenha uma medida quantitativa do número de bactérias. Este
número é importante porque dá idéia das condições de higiene e conservação do
produto. Se variarmos a temperatura de incubação podemos avaliar a população
de bactérias psicrotróficas (7 ºC / 10d), mesófila (37 ºC / 48h) ou termófilas (45
ºC / 48h).
15 – Ágar Palcam
Preparar conforme instruções no frasco. Autoclavar. Adicionar, assepticamente, o
suplemento (contem sulfato de polimixina B, ceftazidima e acriflavina) conforme
recomendado pelo fabricante. Distribuir em placas estéreis.
É altamente seletivo devido à presença de cloreto de lítio, ceftazidima, polimixina
B e acriflavina. Ele permite a fácil identificação de Listeria spp., utilizando um
sistema indicador duplo:
a) Esculina/ferro: Listeria spp. forma colônia com halo negro.
b) manitol/vermelho de fenol: Listeria spp. não fermenta manitol e pode ser
diferenciada de enterococos e estafilococos, que fermentam manitol e mudam a
cor do indicador de pH vermelho de fenol de vermelho para amarelo.
49
16 - Ágar polimixina piruvato gema de ovo manitol azul de bromotimol (PEMBA)
Preparar o meio conforme instruções no frasco. Esterilizar em autoclave a 120oC
durante 15 minutos. Esfriar a 45oC e adicionar 1 frasco de solução de polimixina
resuspendida com água destilada estéril conforme indicação do fornecedor
(Oxoid) e 10 mL de emulsão de gema ovo. Não reaquecer o meio após a adição
da gema de ovo. Distribuir em placas de Petri estéreis. Secar a superfície do meio
antes de usar as placas.
O B. cereus é manitol negativo e a presença de manitol no meio permite a
diferenciação da flora acompanhante manitol positiva, que provoca a viragem do
indicador azul de bromotimol. O uso do antibiótico polimixina na concentração
empregada pelo fornecedor do meio (Oxoid) é suficiente para inibir a flora
acompanhante. B. cereus é resistente a este antibiótico. A formação de um halo
precipitado ao redor das colônias de B. cereus deve-se à ação da lecitinase,
formando produtos insolúveis de degradação da lecitina da gema de ovo, que se
acumulam ao redor das colônias. As colônias de B. cereus apresentam-se azuis
com um precipitado denso ao redor.
17 – Ágar Púrpura de Bromocresol
Preparar 4 frascos de ágar, conforme instruções no frasco. Autoclavar.
Preparar soluções a 20% de cada um dos carboidratos (dextrose, xilose, ramnose
e manitol) e esterilizar por filtração.
Adicionar a cada um dos frascos de meio base um dos carboidratos, de modo a
obter a concentração final de 1%. Distribuir em placas esterilizadas.
Meio base para teste de fermentação de carboidratos. Os produtos ácidos da
fermentação do carboidrato mudam a cor do indicador de pH púrpura de
bromocresol de roxo para amarelo.
18 – Ágar Rambach (RAM)
Preparar conforme instruções no frasco.
Possui desoxicolato de sódio como agente seletivo, e o propileno glicol serve
como substrato para formação de ácido, originando precipitado vermelho nas
colônias de salmonela. Este meio ainda possui uma mistura cromogênica que
revela a presença de β-galactosidase, diferenciando Salmonella (que não tem
essa enzima), de Proteus e outras Enterobacteriaceae. Então, nesse meio as
colônias de Salmonella aparecem vermelhas, as de coliformes aparecem azul/azul
violeta, ao passo que as outras Enterobacteriaceae não possuem cor ou são
amareladas.
19 – Ágar Sangue de Cavalo
Preparar ágar tripticase soja, conforme instruções no frasco. Autoclavar. Esfriar a
45 oC e adicionar assepticamente, 7% de sangue desfibrinado de cavalo.
Distribuir em placas estéreis.
50
20 – Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS)
Preparar conforme instruções no frasco.
É utilizado para o isolamento de víbrios, inibindo o crescimento de
enterobactérias. Os sais biliares agem como agente seletivo e a fermentação da
sacarose serve como característica diferencial. O Vibrio parahaemolyticus
apresenta colônias azuis, e os víbrios que fermentam sacarose formam colônias
amarelas.
21 – Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)
Preparar de acordo com as instruções do fabricante.
O meio de cultura contém, entre outros ingredientes, a seguinte composição:
Glicose  1 g
Lactose e Sacarose  10 g cada
Citrato férrico amoniacal e tiossulfato de sódio  reveladores de H2S
Vermelho de fenol  indicador de pH ( ácido = amarelo, básico = vermelho)
Este meio permite avaliar a capacidade de utilização de lactose e sacarose com
produção de gás (constatada pela presença de bolhas no meio de cultura), e
ainda a produção de gás sulfeto (visualizada pela presença de um precipitado
negro). Esse meio contém uma pequena quantidade de glicose e dez vezes mais
de lactose. As Enterobacteriaceae e outros fermentadores de glicose metabolizam
primeiramente a glicose, aeróbia e anaerobiamente (tanto na superfície do ágar
como na base), causando a acidificação do meio e consequente mudança de
vermelho para amarelo (devido à presença de indicador de pH vermelho de
fenol), dentro de 6 h. Depois da utilização da glicose, organismos fermentadores
de sacarose ou lactose começarão a utilizar esses açúcares. Como a lactose está
presente em alta concentração, o organismo continuará produzindo ácidos e o
meio permanecerá amarelo, após 24 h de incubação (reação é Ácido/Ácido, A/A).
Se o organismo que está sendo testado não é capaz de utilizar a lactose e/ou
sacarose do meio, ele deve produzir energia, metabolizando as proteínas e
aminoácidos presentes no meio. O metabolismo protéico ocorre principalmente na
superfície do meio, onde o oxigênio é abundante. Os subprodutos da quebra da
peptona (como por exemplo, amônia) são alcalinos e fazem com que a superfície
do meio se torne vermelha. A base permanece ácida devido à prévia fermentação
da glicose. Essa reação é chamada Alcalina/Ácida (K/A) Os organismos não
fermentadores da glicose podem também produzir compostos alcalinos a partir de
peptona, verificado na superfície do meio.
22 - Ágar Tríplice Açúcar Ferro + 2% NaCl (TSI)
Preparar de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 2% de NaCl.
23 - Ágar Tripticase Soja + 2% NaCl (TSA)
Preparar conforme instruções no frasco. Adicionar 2% de NaCl.
24 - Ágar Tripticase Soja com Extrato de Levedura (TSA-YE)
51
Pesar o ágar tripticase soja conforme instruções no frasco. Adicionar 0,6% de
extrato de levedura. Hidratar, homogeneizar e autoclavar. Distribuir em placas e
tubos estéreis.
É um meio para
L. monocytogenes.
cultivo
de
bactérias,
utilizado
na
manutenção
de
25 - Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC)
A base desse meio é comercializada pela Difco (SFP Ágar Base) ou pela Oxoid
(Perfringens Ágar Base). Após preparar e esterilizar a base, de acordo com as
instruções do fabricante, resfriar o meio a 45 °C e adicionar 10 mL da solução de
D-cicloserina a 4%, esterilizada por filtração, para cada 1000 mL de base. Quando
preparar ágar TSC com gema de ovo, reidratar a base em 910 mL de água
destilada e, após esterilização, adicionar 10 mL de solução de D-cicloserina e 80
mL de emulsão de ovo-salina.
É uma base com alto valor nutritivo, que permite o desenvolvimento de
clostrídeos. O sulfito e o ferro provocam o enegrecimento de colônias produtoras
de H2S. Nesse ágar, a cicloserina inibe a flora acompanhante.
26 - Ágar T1N1
tripticase
NaCl
ágar
água
10 g
10 g
15 g
1000 mL
Dissolver os ingredientes, distribuir em tubos de ensaio e autoclavar a 121 oC por
15 min. Deixar solidificar em posição inclinada. pH final deve ser 7,2 ± 0,2.
27 - Água Peptonada a 0,1%
peptona
água destilada
1g
1 litro
Dissolver a peptona na água destilada. Ajustar o pH a 7,0 ± 0,2. Autoclavar a
121 oC durante 15 minutos.
Diluente para homogeneização e diluição de amostras para a análise.
28 - Água Peptonada Alcalina pH 8,5 + 0,2 (APA)
peptona
NaCl
água destilada
10 g
10 g
1000 mL
Misturar os ingredientes, ajustar o pH para 8,5 ± 0,2, distribuir em frascos e
autoclavar a 121 oC por 10 min.
Esse meio serve para diluição de amostras que serão usadas na enumeração de
víbrios, pois essas bactérias, como muitas outras gram negativas, crescem bem
em condições alcalinas. Os víbrios são anaeróbios facultativos e crescem na
52
porção mais aeróbia do tubo. Por isso, a alíquota para plaqueamento a partir do
APA para meios seletivos deve ser retirada da superfície do meio, sem que este
seja agitado. Devem ser semeados todos os tubos que apresentarem turvação.
29 - Água Peptonada Tamponada (APT)
NaCl
Na2HPO4.7H2O
KH2PO4
Peptona
Água destilada
5g
6.6 g
1.5 g
10.0 g
1000 mL
Misturar os ingredientes, ajustar o pH para 7.5 ±0,1.
Autoclavar a 121 oC por 15 min.
Aumenta a recuperação de células de Salmonella que possam estar injuriadas
devido a exposição a técnicas de conservação de alimentos, como aquecimento,
desidratação, conservantes, alta pressão osmótica e mudança de pH. Esse meio
tamponado em pH 7,2 assegura manutenção desse pH por um período de 24 h de
incubação, levando à recuperação das células que poderiam ser especialmente
prejudicadas por baixos pHs. Isto é particularmente importante para alimentos de
origem vegetal, que possuem uma baixa capacidade tamponante.
30 - Água com Triptona a 1%
triptona (ou tripticase)
água
10 g
1000 mL
Dissolver os ingredientes e autoclavar a 121oC por 15 min. O pH final deve ser
6,9 ± 0,2.
31 - Água com Triptona a 1% com 3% NaCl
Preparar o meio 30 adicionando 3% de NaCl.
32 - Água com Triptona a 1% com 7% NaCl
Preparar o meio 30 adicionando 7% de NaCl.
33 – Caldo Bile Verde Brilhante 2% (VB)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo, introduzindo
um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
Serve como agente inibitório de microrganismos gram positivos e dos não
fermentativos. Contém sais biliares e o corante verde brilhante, sendo mais
seletivo que o LST e, permitindo a confirmação da presença de coliformes totais.
Novamente neste caldo é observada a produção de gás a partir de lactose, dentro
de 48 h a 35 ºC.
34 - Caldo EC
53
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo, introduzindo
um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
Consiste de um caldo lactosado tamponado, contendo 0,15% de sais biliares.
Nesse meio é inibido o crescimento de organimos formadores de esporos e de
estreptococos fecais, enquanto que o crescimento de Escherichia coli é favorecido.
A temperatura de incubação (44,5 ºC/24h) também favorece o desenvolvimento
de E. coli. A turvação do meio com produção de gás (devido à fermentação da
lactose), indica prova positiva para a presença de coliformes fecais.
35 – Caldo de Hugh-Leifson com glicose
Preparar conforme instruções do fabricante.
36 – Caldo de Enriquecimento para Listeria Tamponado (BLEB)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 225 mL em frascos erlenmeyer.
Autoclavar. Esfriar rapidamente a 45 oC e manter em geladeira até o momento do
uso. Imediatamente antes do uso adicionar o suplemento para BLEB, que contém
acriflavina, ácido nalidíxico e cicloheximida.
É um meio tamponado (pH 7,4) que contém os nutrientes necessário para o
desenvolvimento de listerias. Como agentes seletivos possui ácido nalidíxico,
acriflavina e cicloheximida, aos quais esses microrganimos são resistentes.
37 - Caldo Indol
triptona
NaCl
água destilada
10 g
5g
1 litro
Dissolver os ingredientes e acertar o pH para 7,0. Dividir 5 mL por tubo de
ensaio. Autoclavar a 121 oC durante 15 minutos.
A produção de indol a partir de triptofano é revelada pela adição ao meio de
cultura, de algumas gotas do reagente de Kovacs (que contém
ρ-dimetilaminobenzaldeído). O indol reage com o aldeído formando o corante
rosindol, que leva à formação de um halo vermelho na superfície do meio, devido
à hidrofobicidade do reagente de Kovacs. Na prova negativa, observa-se apenas
um halo de coloração amarelada.
38 – Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 1 mL por tubo.
Meio de enriquecimento e manutenção geral.
39 – Caldo Lactosado
Extrato de carne
3,0 g
54
Peptona
Lactose
Água Destilada
5,0 g
5,0 g
1000 mL
Misturar os ingredientes, ajustar o pH para 6,9 ± 0,2. Autoclavar a 121 ºC por
15min.
40 – Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo, introduzindo
um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
O LST possui alguma seletividade para organismos coliformes devido à presença
do surfactante lauril sulfato, mas ainda permite a recuperação de bactérias que
possam estar injuriadas (expostas a condições adversas como a presença de
cloro, por exemplo). Para análise de água utiliza-se 10 tubos com 10 mL de LST
dupla concentração, contendo um tubo invertido (tubo de Durham), que
aprisionará o gás que poderá ser produzido a partir da fermentação da lactose
presente no meio de cultura. Os tubos inoculados são incubados a 35 ºC/48 h e
são observados para a produção de gás.
41 – Caldo MR-VP
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 5 mL por tubo antes de
autoclavar.
Na prova de vermelho de metila e Voges-Proskauer, obtêm-se informações a
respeito do metabolismo fermentativo do organismo em questão. Estas provas
são realizadas em caldo MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer). De cada placa com
colônia típica de E. coli, inocula-se um tubo com caldo MRVP, que é então
incubado a 35 oC.
Teste de VP: esta prova detecta a presença de acetoína, que é formada durante
o metabolismo da glicose, via fermentação butilenoglicólica. Para sua detecção,
após 48 h de incubação, retira-se uma alíquota de 1 mL do caldo MR-VP e a ela
são adicionados 0,6 mL de solução de -naftol (catalisador) e 0,2 mL de solução
de KOH (oxidante). Após agitação vigorosa, para uma prova positiva, observa-se
coloração rósea, decorrente da formação de um complexo. Se negativa, coloração
amarelada.
fermentação
glicose
 acetoína -------------> butilenoglicol
KOH  O2
diacetil
+
núcleos guanidina (provenientes da peptona e da arginina)
 condensação
complexo rosa-avermelhado
Observação:
guanidina.
pode-se adicionar creatina
como fonte adicional
de núcleos
55
Teste de VM: neste teste observamos a habilidade de um organismo produzir e
manter produtos finais ácidos. Alguns microrganismos produzem ácidos após 48
h de incubação, mas com a incubação subseqüente, esses produtos são
degradados e o pH eleva-se para 6-7. Após cinco dias de incubação adiciona-se o
reagente de VM, ao caldo MR-VP inoculado. Este reagente contém vermelho de
metila, um indicador de pH de cor vermelha entre os pHs 4 e 5. A coloração
vermelha indica a ocorrência de fermentação ácida mista, resultado positivo para
VM. O negativo é indicado pela coloração amarela, pH entre 6 e 7.
42 – Caldo Rappaport-Vassiliadis (RV)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo
Contém verde malaquita, cloreto de magnésio e um baixo pH (5,1) como agentes
inibidores, permitindo a seleção de membros do gênero Salmonella. Esse meio
explora a capacidade de Salmonella sobreviver a pressões osmóticas
relativamente altas e apresentar capacidade de multiplicação em baixos pHs,
maior resistência ao verde malaquita, e menores requerimentos nutricionais. É
importante que o tamanho do inóculo seja pequeno o suficiente para não
interferir na seletividade (1:100).
43 – Caldo Tetrationato (TT)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo de ensaio. Não
autoclavar. No instante do uso, adicionar 0,1 mL de uma solução de verde
brilhante 1:1000 e 0,2 mL da seguinte solução de lugol:
iodo
iodeto de potássio
água destilada
6g
5g
20 mL
O meio de cultura contém a seguinte composição: proteose peptona, sais biliares,
tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, verde malaquita e iodo-iodeto de
potássio.
A efetividade do meio na inibição de coliformes é decorrente da presença de íons
tetrationato (S4O6--) originários do tiossulfato presente na formulação deste meio.
Organismos que possuem a enzima tetrationato redutase crescem nesse meio,
por exemplo, Salmonella e Proteus. Os sais biliares inibem os organismos que não
vivem no intestino e o carbonato de cálcio netraliza os produtos ácidos da
decomposição do tetrationato. Atuam ainda, como agentes seletivos o verde
malaquita e o iodo-iodeto de potássio.
Dos caldos de enriquecimento secundário (TT e RV), com auxílio de uma alça de
níquel cromo, são estriadas placas de ágar Rambach (RAM), ágar Hektoen Enteric
(HE) e ágar sulfito de bismuto (BSA).
44 – Caldo T1N sem NaCl e com 3%, 6%, 8% e 10% de NaCl
Triptona (ou tripticase)
NaCl
Água
10 g
0, 30, 60, 80 ou 100 g
1000 mL
56
Preparar frascos do caldo com as diferentes concentrações de NaCl necessária.
Autoclavar a 121 oC por 15 min. O pH final deve ser ajustado para 7,2 ± 0,2.
45 – Caldo Tioglicolato
Preparar o meio conforme instruções no frasco.
Contém tioglicolato e cisteína que são substâncias redutoras e criam um potencial
de redução suficientemente baixo para o desenvolvimento de anaeróbios. Devido
à presença de grupos sulfidrila, nesse meio são inativados compostos de arsênio,
mercúrio e outros metais pesados. A alta viscosidade, devido à adição de 0,075%
de ágar, impede a rápida penetração de oxigênio e o eventual aumento da tensão
de oxigênio será indicado pela viragem da resazurina sódica (indicador redox) do
incolor para rosa. (Obs.: esse caldo deve ser fervido antes do uso para eliminar o
oxigênio dissolvido e após a inoculação deve-se adicionar uma camada de
vaselina líquida para evitar a sua re-incorporação).
46 - Corantes para Coloração de Esporos
a) Verde malaquita
verde malaquita
água destilada
5g
100 mL
b) Safranina
safranina
água destilada
1g
100 mL
47 - Corantes para Coloração de Gram
a) Cristal violeta fenicada
cristal violeta
álcool 95
fenol fundido
água destilada
1g
10 mL
2g
100 mL
Dissolver o corante no álcool, juntar o fenol misturando sempre, e em seguida
juntar a água, aos poucos. Filtrar após 24 horas de repouso.
b) Cristal violeta
Preparo Solução A
Cristal violeta (90-95% de pureza) 2 g
Etanol 95%
Filtrar em papel de filtro.
Preparo Solução B
Oxalato de amônio
Água destilada
20 mL
0,2 g
80 mL
57
Misturar as soluções colocando-se a solução B sobre a A. Deixar em repouso por
24 horas, filtrando em seguida. Estocar em frasco âmbar.
c) Lugol
iodo
iodeto de potássio
água destilada
1g
2g
300 mL
Triturar o iodo com o iodeto de potássio em um graal adicionando água aos
poucos.
d) Fucsina
Fucsina básica
álcool 95
fenol fundido
água destilada
1g
10 mL
30 mL
100 mL
48 - Fucsina Básica para B. cereus
Dissolver 0,5 g de fucsina básica em 20 mL de etanol 95%. Diluir para 100 mL
com água destilada.
49 - Meio EPM
a) Solução A
triptona
extrato de carne
cloreto de sódio
fosfato de sódio dibásico anidro
L-triptofano
ágar
água destilada
10 g
2g
5g
1,22 g
1g
11 g
1 litro
Dissolver os ingredientes, exceto o ágar, acertar o pH para 7,0. Adicionar o ágar e
autoclavar a 121 oC durante 15 minutos.
b) Solução B
citrato de ferro amoniacal
tiossulfato de sódio
glicose
uréia
água destilada
2g
2g
10 g
40 g
85 mL
Dissolver os ingredientes e aquecer em banho-maria a 65
constante, durante 1 hora.
o
C com agitação
c) Solução C
58
azul de bromotimol
hidróxido de sódio 0.05N
etanol
água destilada
1.5 g
48 mL
50 mL
2 mL
Estocar protegido da luz.
d) Preparo final do meio
solução A
solução B
solução C
100 mL
1,75 mL
0,20 mL
Após resfriar a solução A a 65 oC adicionar a solução B e a solução C. Distribuir
5 mL em tubos de ensaio 12 x 120mm, previamente esterilizados e deixar
solidificar em posição inclinada.
O meio de cultura contém os seguintes agentes diferenciadores:
L-Triptofano  substrato para enzima triptofano-desaminase
Glicose  substrato para produção de gás e energia
Uréia  substrato para a enzima urease
Citrato férrico amoniacal e Tiossulfato de sódio  reveladores de H2S
Azul de bromotimol  indicador de pH
(ácido= verde garrafa, básico = azul da prússia)
Informa quanto aos testes de produção de gás a partir da glicose, H2S, urease e
triptofano desaminase. Na base do meio observam-se os resultados para as
provas de gás, H2S e urease, enquanto que na superfície observa-se a prova de Ltriptofano desaminase (LTD). No teste positivo para gás a partir da glicose,
verifica-se a presença de bolhas. A degradação da uréia pela urease, leva à
formação de amônia e conseqüente alcalinização do meio, mudando sua cor para
azul ou amarelo esverdeado. A presença de H2S leva ao escurecimento da base e
a atividade da LTD provoca a alcalinização do meio, tornando a superfície do meio
verde escuro (verde garrafa).
Reações químicas envolvidas:
Triptofano Desaminase
RCHNH2COOH + 1/2 O2  RCOCOOH + NH3 + H2O
Urease
O=C
NH2
+ 2 H2O  2 NH3 + CO2 +H2O
NH2
uréia, pH 6,8
amônia, pH 8,1
59
50 – Meio Lactose-Gelatina
triptose
extrato de levedura
lactose
fosfato dissódico
vermelho fenol
gelatina
água destilada
15 g
10 g
10 g
5g
0,05 g
120 g
1 litro
Dissolver os ingredientes, aquecendo levemente. Acertar pH para 7,5 e dividir em
tubos (10 mL p/ tubo). Autoclavar 121 oC durante 15 minutos. Antes de usado, o
meio deve ser aquecido para a exaustão do ar.
Nesse meio a fermentação da lactose é indicada pela presença de bolhas de gás e
pela mudança de cor do indicador vermelho de fenol do vermelho para o amarelo.
Observa-se também a liquefação da gelatina, que é uma proteína derivada do
colágeno que quando hidrolisada em seus aminoácidos constituintes, perde a
capacidade de geleificação mesmo em temperaturas de refrigeração.
51 - Meio m-Endo
Medir 100 mL de água destilada, a mais pura possível, com uma proveta. Colocar
50 mL aproximadamente de água em um erlenmeyer. Pipetar 2 mL de álcool
etílico para o erlenmeyer. Adicionar, quantitativamente, 4,8 g do meio para o
erlenmeyer. Agitar vigorosamente. Adicionar os 50 mL restantes para o
erlenmeyer. Agitar. Tampar o erlenmeyer e colocar em banho-maria. Aquecer até
a ebulição agitando de tempos em tempos. O meio pode ser aquecido também no
forno de micro-ondas mantendo-o sob observação até que atinja a fervura. Esfriar
o meio a 45 oC e acertar o pH para 7,2 com solução de NaOH 1N ou com HCl 1N.
Manter o meio de cultura em geladeira (4 oC a 10 oC) por até 96 horas. Não
utilizar o meio após o prazo. Adicionar 2 mL de meio de cultura por placa onde ja
foi previamente colocado, de maneira asseptica, o cartão absorvente.
52 - Meio m-FC
Medir 100 mL de água destilada, a mais pura possível, com uma proveta. Colocar
50 mL de água em um erlenmeyer. Adicionar, quantitativamente, 3,7 g do meio
para o erlenmeyer. Adicionar 1 mL de solução de Ácido Rosólico 1% em NaOH
0,2N. Ajustar, se necessário, o pH para 7,4 com solução de HCl 1N.
Tampar e aquecer o meio até a ebulição.
Deixar o meio esfriar até temperatura ambiente e adicionar 2 mL por placa de
Petri, onde já foi previamente colocado o cartão absorvente.
OBS: Preparar tantas placas quanto forem necessárias, para aquele dia, uma vez
que o meio de cultura, já distribuído, não pode ser estocado.
53 - Meio MILi
extrato de levedura
peptona
triptona
3g
10 g
10 g
60
L-lisina
glicose
ágar
solução de purpura de bromocresol 0.2%
água destilada
10 g
1g
2g
25 mL
1 litro
Dissolver os ingredientes, exceto ágar. Ajustar o pH para 6.5, adicionar o ágar e
aquecer para dissolução completa. Distribuir 4 mL em tubos 12 X 120mm e
autoclavar a 121 oC durante 15 minutos. Deixar solidificar na posição vertical.
Solução de púrpura bromocresol a
púrpura de bromocresol
NaOH 0,05N
etanol
água destilada
0,2%
0,2 g
74,0 mL
13 mL
13 mL
Estocar protegido da luz.
Obs.: Os meios EPM e MILi podem ser adquiridos prontos no comércio (Probac do
Brasil Produtos Bacteriológicos Ltda).
O meio de cultura contém os seguintes agentes diferenciadores:
Triptona  fonte de triptofano para produção de indol
L-lisina  substrato para enzima lisina-descarboxilase
Púrpura de bromocresol  indicador de pH
( ácido = amarelo, básico = púrpura)
É um meio semi-sólido, preparado em tubos, semeado por picada, que informa
quanto aos testes de motilidade, produção de indol e lisina descarboxilase. A
motilidade é positiva se ocorre turvação total do meio ou observação do
crescimento além da linha de inoculação e negativa se o crescimento se restringe
à linha de inoculação, com o restante do meio límpido. Devido à presença de
indicador de pH, a fermentação da glicose pode ser observada quando a base do
meio fica amarela e a descarboxilação da lisina leva à reversão da cor do meio
para roxo ou roxo acinzentado. A produção de indol a partir de triptofano é
revelada pela adição ao meio de cultura, de algumas gotas do reagente de
Kovac’s (que contém p-dimetilaminobenzaldeído). O indol reage com o aldeído
formando o corante rosindol, que leva à formação de um halo vermelho na
superfície do meio. Na prova negativa, observa-se apenas um halo de coloração
amarelada
Reações químicas envolvidas:
Lisina Descarboxilase
H2N-(CH2)4- CHNH2-COOH
Lisina

H2N-(CH2)4-CH2NH2 + CO2
Lisina descarboxilase
Produção de Indol
triptofano
triptofanase

indol + ácido pirúvico + amônia
61
indol + ρ-dimetilaminobenzaldeído  rosindol (corante vermelho)
reagente Kovacs
54 - Meio Motilidade BC Semi-Sólido
Tripticase
Extrato de levedura
Dextrose
Na2HPO4
Ágar
Água destilada
10 g
2,5 g
5g
2,5 g
3g
1 litro
Dissolver os ingredientes, aquecendo levemente. Acertar o pH para 7,4 e dividir
em tubos (2 mL/tubo). Autoclavar 121 oC durante 15 minutos.
55 - Meio para Teste de Motilidade
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 3 mL por tubo de ensaio
pequeno. Autoclavar.
Nesse meio Listeria spp. apresenta crescimento típico em forma de guarda-chuva,
devido a sua natureza microaerófila.
Obs.: No caso de Vibrio spp. adicionar NaCl até concentração final de 2%.
56 - Reagente de Kovacs
p. dimetil amino benzaldeido
álcool amílico
HCl concentrado
5g
75 mL
25 mL
Dissolver o aldeido no álcool e adicionar o ácido.
57 - Reagente Nitrato
Reagente A
Ácido sulfanílico
Ácido acético 5N
5g
1000 mL
Reagente B
Alfa-naftol
Ácido acético 5N
5g
1000 mL
58 - Reagente VM
vermelho de metila
álcool etílico
água
0,1 g
300 mL
200 mL
62
Dissolver o corante no álcool e adicionar a água.
59 - Reagente VP
a) alfa naftol
álcool absoluto
5g
100 mL
b) solução de KOH a 40%
60 - Tampão Diluente
a) solução estoque
fosfato monopotássico
água destilada
34 g
1000 mL
Dissolver o fosfato em 500 mL de água destilada e ajustar o pH a 7,2 ± 0,2 com
NaOH 1N (cerca de 170 mL). Completar o volume para 1 litro de água destilada.
Esterilizar em autoclave a 121 oC durante 15 minutos. Conservar em geladeira.
b) Solução de uso
Dissolver 1,25 mL da solução estoque em 1 litro de água destilada. Dividir em
frascos de diluição do alimento e esterilizar em autoclave a 121 oC durante
15 minutos.
61 - Tampão Diluente
NaCl
Na2HPO4
KH2PO4
Água destilada
7,650 g
0,724 g
0,210 g
1000 mL
Dissolva os ingredientes em água destilada. Ajuste o pH para 7,7 (com NaOH 1N).
Autoclavar 15 min a 121 ºC.
62 - Tampão Fosfato Salina (PBS)
NaCl
7,650 g
Na2HPO4
0,724 g
KH2PO4
0,210 g
Água destilada
1000 mL
Dissolva os ingredientes em água destilada. Ajuste o pH para 7,4 (com NaOH 1N).
Autoclavar 15min a 121 ºC.
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