TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

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TECNOLOGIA DO DNA
RECOMBINANTE
Profª Roseli de Aquino Ferreira
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TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
• Durante milhares de anos os seres humano,
instintivamente, têm realizado experimentos com
DNA (cruzamentos seletivos de plantas cultivadas e
animais domésticos).
• Década de 70 – isolamento de um pedaço
específico de DNA, criação de novas moléculas em
tubo de ensaio e reintrodução das moléculas
criadas em laboratório em organismos vivos.
• Intervenção humana – manipulação de genes.
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TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
• Nomenclaturas:
DNArecombinante; splicing de
genes,
engenharia
genética.
• As
novas técnicas
permitiram
manipular
genes.
• Na
natureza,
estas
mudanças poderiam levar
milhares de anos para
ocorrer ao acaso.
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• Hoje é possível cortar uma região de DNA contendo um
gene específico de um genoma para produzir um
número ilimitado de cópias exatas de DNA e determinar
a seqüência de nucleotídeos numa velocidade de
milhares de nucleotídeos por dia.
• Variações da técnica permitem isolar e alterar
(redesenhar) o gene transferindo de volta para cultura
de células a fim de elucidar suas funções na célula viva.
• Com técnicas mais sofisticadas, os genes redesenhados
poder ser inseridos em animais e plantas, tornando-se
parte funcional e herdável do genoma do organismo.
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• Impacto dramático em todos os aspectos da biologia
celular.
• Conhecimento atual da organização e história
evolucionária de genomas complexos de eucariotos.
• Descoberta de classes inteiras de genes e proteínas.
• Descoberta de funções, domínios e relações entre as
proteínas.
• Revelação de mecanismos de expressão e regulação
gênica.
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• Influência profunda em muitos aspectos da vida humana
fora da vida científica.
• Detecção de mutações de DNA responsáveis por
doenças herdáveis.
• Medicina forense para identificar ou absolver possíveis
suspeitos de crime.
• Produção de um crescente número de produtos
farmacêuticos (insulina, proteínas de coagulação do
sangue, etc).
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Técnicas básicas da análise de DNA:
• Isolamento das seqüências de DNA;
• Produção de grande quantidade de DNA;
• Clonagem de DNA;
• Reação em cadeia da polimerase (PCR).
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Como as moléculas de DNA são analisadas?
• Descoberta de uma classe de enzimas
bacterianas conhecidas como nucleases
de restrição.
Enzimas de restrição
Sma I
Fita antiparalela de DNA
EcoR I
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Bases nitrogenadas: purinas(A e G)
e pirimidinas (C, T e U)
Tabela 1. Algumas endonuclease de restrição: origem e sítios de clivagem. A seta indica
o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.
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• A capacidade de cortar o DNA em seqüências
específicas
torna
as
nucleases
de restrição
fundamentais para todos os aspectos da moderna
tecnologia do DNA.
• Podem ser usadas para analisar DNA de qualquer
origem.
• Uma determinada nuclease de restrição sempre cortará
uma determinada molécula de DNA nos mesmos sítios.
• Por exemplo: para uma amostra de DNA de tecido
humano, o tratamento com uma determinada nuclease
de restrição sempre produzirá o mesmo conjunto de
fragmentos de DNA.
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• Depois que uma grande molécula de DNA é clivada em
pequenos pedaços usando as nucleases de restrição,
fragmentos de DNA precisam ser separados uns dos
outros.
• Utilização de eletroforese em gel: separa os fragmentos
em função dos seus comprimentos.
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Eletroforese em gel
• Técnica de separação de moléculas que
envolve a migração de partículas em um
determinado gel.
•
Aplicação de uma diferença de potencial.
•
As moléculas são separadas de acordo com o
seu tamanho, pois as de menor massa irão
migrar mais rapidamente que as de maior
massa.
•
Em alguns casos, o formato da moléculas
também influi, pois algumas terão maior
facilidade para migrar pelo gel.
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Separação dos fragmentos de DNA
Em Gel de agarose
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Eletroforese em gel
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• Diversos esquemas para seqüenciamento de DNA têm sido
desenvolvidos.
• Os mais usados empregam a REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION)
• Geração de cópias parciais dos fragmentos de DNA para serem
seqüenciados.
• Estas reações de replicação de DNA são conduzidas in vitro sob
condições que asseguram que as novas fitas de DNA sejam
idênticas ao molde fornecido.
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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION)
Conjunto de oito tubos de PCR,
cada um contendo 100μL
Aparelho de PCR (termociclador)
Preparação das soluções para PCR
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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION)
Aparelho de PCR (termociclador)
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Uma vez que um gene tenha sido isolado a partir de um
genoma completo como um pedaço de DNA surgem
vários questionamentos:
• De qual cromossomo o gene é originado?
• Onde está localizado no cromossomo?
• Em quais células do organismo o gene é transcrito?
• Outros organismos possuem genes similares?
• Ocorrência de mutações do gene?
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Clonagem de DNA
• Produção de diversas cópias idênticas de uma molécula
de DNA
• Descrever o isolamento de um determinado segmento
de DNA (um gene específico) do resto do DNA de uma
célula.
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Clonagem de DNA
• Inserção de um fragmento de DNA a ser
clonado em uma molécula capaz de replicação
(plasmídio, fagos, cosmídeos, vírus).
• Molécula de DNA-recombinante é introduzida
em uma célula hospedeira (bactéria) para que
ocorra a divisão celular.
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CLONAGEM
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• Hibridização é um processo que permite
localizar seqüências de ácidos nucléicos nas
células e nos cromossomos.
• O exame de um único gene no genoma humano
exige a procura pelo genoma total de mais de
três bilhões de nucleotídeos.
• A inacreditável especificidade das hibridizações
de DNA torna isto possível.
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EXEMPLO: DOENÇA GENÉTICA RECESSIVA ANEMIA
FALCIFORME
• Alteração específica de nucleotídeo no gene mutante é conhecida.
• A seqüência GAG é trocada para GTG em uma determinada
posição da fita de DNA que codifica a cadeia de β-globina da
hemoglobina.
• Ocorre uma alteração do aminoácido codificado de ácido glutâmico
para valina.
• Esta pequena alteração é suficiente para alterar as propriedades
das moléculas de hemoglobina resultantes para produzir a doença.
• O diagnóstico pré-natal da anemia falciforme é possível pela análise
do DNA das células fetais.
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• Hibridização in situ pode ser aplicada para detectar
seqüências de DNA em cromossomos e seqüências de
RNA nas células.
• Sondas de ácidos nucléicos marcadas são usadas na
busca do gene de interesse.
• Mais de 3000 doenças genéticas humanas distintas são
causadas por mutações em genes únicos.
• A hibridização in situ pode revelar a distribuição de um
determinado RNA nas células dos diversos tecidos,
tornando visível as alterações nos padrões de
expressão gênica que ocorrem nas células do embrião.
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SOUTHERN: DNA
NORTHERN: RNA
WESTERN: proteína
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BLOTTING
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Northern Blot "RNA"
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MARCAÇÃO DA SONDA
Forno de hibridação
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Biblioteca genômica
• Uma coleção de fragmentos clonados de DNA
cromossomal
representando
o
genoma
completo de um organismo é conhecida como
uma biblioteca genômica.
• A biblioteca é freqüentemente mantida como
clones de bactérias, cada clone carregando um
fragmento distinto de DNA.
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SEQÜENCIAMENTO DE DNA
Sequenciamento de nucleotídeos pelo método
do término do crescimento da cadeia.
Sequenciamento automático de DNA.
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SEQÜENCIAMENTO DE DNA
Método de Sanger
Os fragmentos migram de
acordo
com
os
seus
tamanhos e são detectados
ao passarem pelo detector a
laser no final do gel.
Cada tipo de nucleotídeo
emite uma luz com imagens
coloridas
na
forma de
bandas.
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SEQÜENCIAMENTO DE DNA
Clones de DNA podem ser
seqüenciados pelo método
de Sanger, usando ddNTPs
marcados
com
fluorescência.
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O uso da bioinformática é imprescindível para atender aos desafios científicos
oriundos do gigantesco volume de dados produzidos pelos atuais projetos na
área biológica.
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DNA MISTÉRIO OU SOLUÇÃO??!!