YVETTE MAY COULSON

Resultados
Figura 25. Células CHO transfectadas com o vetor pEGFP-condroitinase AC
secretam a enzima com baixa atividade. A atividade enzimática da condroitinase AC foi
medida pela quantificação do condroitim sulfato secretado para o meio condicionado por
células CHO-K1 transfectadas com o plasmídeo pEGFP-N1 (CHO/pEGFP) ou a construção
pEGFP-condroitinase AC (CHO/pEGFP-cAC). A atividade enzimática foi determinada 1
dia após transfecção. Os glicosaminoglicanos foram metabolicamente marcados com [35S]sulfato de sódio (5,55MBq, por 6 horas), e analisados por eletroforese em gel de agarose e
o condroitim sulfato presente no meio foi quantificado (*p=0,056). CHO: células ovarianas
de hamster chinês; CS: condroitim sulfato. O ensaio foi realizado uma vez, em duplicata.
Posteriormente, passamos a verificar se a condroitinase AC poderia se rastreada,
pois, em teoria, estaria sendo secretada em forma de quimera com a proteína GFP. Células
CHO-K1 foram transfectadas com o plasmídeo pEGFP-N1 ou a construção pEGFPcondroitinase AC, e analisadas ao microscópio invertido de varredura Confocal a laser 1
dia, 2 dias e 1 semana após a transfecção (Figura 26). Na Figura 26, podemos observar que
1 dia após a transfecção, cerca de 20% das células transfectadas com o plasmídeo vazio
expressam GFP. Uma semana após a transfecção, as células transfectadas com pEGFP-N1
continuam expressando GFP, enquanto as poucas células transfectadas com a construção
pEGFP-condroitinase AC que eram GFP+, deixam de ser. Ou seja, infelizmente, com a
inserção do gene da condroitinase AC no plasmídeo pEGFP-N1, ocorre uma diminuição de
sua expressão. Devido a isso, decidimos utilizar somente o vetor pcDNA3.1(+)condroitinase AC nos experimentos in vivo.
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Figura 26. A expressão da quimera condroitinase AC-GFP diminui com o tempo.
Células CHO-K1 foram transfectadas com os vetores pEGFP-N1 (pEGFP) ou pEGFPcondroitinase AC (pEGFP-cAC) (1,5µg de DNA) e a expressão das proteínas fluorescentes
(GFP e condroitinase AC-GFP) foi analisada por microscopia de fluorescência em células
vivas 1 dia, 2 dias e 1 semana após transfecção. Barra de escala: 20μm em pEGFP 1 dia e
10μm nas demais condições.
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4.7 Secreção de condroitinase AC ativa em lesão no SNC murino
Após a verificação, in vitro, de que células de mamífero transfectadas com o vetor
pcDNA3.1(+)-condroitinase AC expressam e secretam a enzima recombinante ativa
partimos para o transplante dessas células em lesões no córtex motor de camundongos. Nos
ensaios in vivo, as células mononucleadas foram obtidas da medula óssea de camundongos
GFP+, pois todas as células destes animais expressam GFP e, portanto, podem ser
localizados posteriormente em cortes do tecido. Investigamos se células mononucleadas
transfectadas com a construção pcDNA3.1(+)-condroitinase AC secretam condroitinase AC
ativa em modelos de lesão aguda e crônica, conforme descrito em Material e Métodos (item
3.17). No modelo de lesão aguda, células mononucleadas derivadas da medula óssea
transfectadas com pcDNA3.1(+) ou com a construção pcDNA3.1(+)-condroitinase AC
foram transplantadas imediatamente após a cirurgia estereotáxica para realização da lesão,
no mesmo local onde esta foi realizada. Em ensaios de imunofluorescência, condroitim
sulfato degradado foi localizado na matriz extracelular circundando células mononucleadas
derivadas da medula óssea que foram transfectadas com o plasmídeo recombinante
pcDNA3.1(+)-condroitinase AC, mas não próximo a células da medula óssea não
transfectadas ou transfectadas com o vetor vazio (Figura 27).
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Figura 27. Células mononucleadas derivadas da medula óssea expressam
condroitinase AC ativa quando transfectadas com o vetor pcDNA3.1(+)-condroitinase
AC. Células mononucleadas derivadas da medula óssea de camundongos GFP+ nãotransfectadas (MO), transfectadas com pcDNA3.1(+) (MO/pcDNA) ou com pcDNA3.1(+)condroitinase AC (MO/pcDNA-cAC) foram injetadas em uma lesão no córtex motor
murino. Condroitim sulfato degradado foi localizado pelo anticorpo anti-Δ-Di6S (verde) e
células GFP+ foram localizadas pelo anticorpo anti-GFP (vermelho). Os núcleos foram
corados com DAPI (azul). Barra de escala: 20μm.
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A seguir, foi analisada a secreção de condroitinase AC ativa in vivo em um modelo
de lesão crônica. Células derivadas da medula óssea de camundongos GFP+ foram
transfectadas com pcDNA3.1(+) ou pcDNA3.1(+)-condroitinase AC e transplantadas 4
semanas após a realização dos procedimentos para causar a lesão ao córtex motor,
utilizando as mesmas coordenadas estereotáxicas utilizadas para a realização da lesão. Os
animais foram sacrificados uma ou duas semanas depois de transplantar as células.
Imunofluorescência foi realizado em cortes dos cérebros para observar a localização das
células e expressão da condroitinase AC.
Observamos que as células transplantadas migram em massa para longe da lesão,
em direção a regiões mais internas, independentemente da transfecção realizada (Figura
28). As células transplantadas apresentaram migração por distâncias mais longas nos
animais que foram sacrificados após duas semanas em comparação com os sacrificados
após uma semana, indicando que as células transplantadas não se fixam no local do
transplante. Nestes cortes, houve migração das células derivadas da medula óssea para
regiões adjacentes à lesão e também para regiões mais internas em direção ao ventrículo
lateral no hemisfério ipsilateral. Algumas células GFP+ foram encontradas em locais bem
distantes do local de transplante, como exemplifica a Figura 29 que mostra células GFP+ na
substância branca do cerebelo. Um resultado interessante é que, embora tenhamos
encontrado algumas poucas células no cerebelo, a grande maioria migra em conjunto, como
pode ser observado nas Figuras 28 e 30.
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Figura 28. Células mononucleadas derivadas da medula óssea transplantadas no local
da lesão migram para regiões internas do córtex cerebral. Células mononucleadas
derivadas da medula óssea de camundongos GFP+ (vermelho) transfectadas com a
construção pcDNA3.1(+)-condroitinase AC foram transplantadas em uma lesão no córtex
motor murino, 4 semanas após a realização da lesão. Animais foram sacrificados uma ou
duas semanas depois e cortes sagitais do cérebro foram obtidos (A e B, respectivamente) e
marcados para condroitim sulfato degradado (verde). Barra de escala: 100μm.
Figura 29. Células mononucleadas derivadas da medula óssea podem migrar para
longe do local de transplante. O corte mostra a presença de duas células GFP+ (vermelho,
setas) na substância branca do cerebelo. DAPI (azul), GFAP (verde). Barra de escala 20μm.
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4.8 Efeitos da secreção de condroitinase AC sobre a distribuição de glia reativa na
região próxima à lesão
Uma vez que observamos que células mononucleadas derivadas da medula óssea
transfectadas com pcDNA3.1(+)-condroitinase AC secretam a enzima recombinante ativa e
que migram da lesão para outras regiões do cérebro, passamos a investigar se o transplante
poderia, eventualmente, ter algum efeito sobre a distribuição de glia reativa na região
próxima à lesão. Como foi apresentado na Introdução, células da glia ao redor de ou
atraídas para uma lesão do SNC, sofrem hipertrofia tornando-se glia reativa, que passa a
constituir a cicatriz glial. Utilizando um marcador para glia reativa, GFAP (glial fibrillary
acidic protein), a distribuição de glia reativa na região da lesão foi analisada. Nas Figuras
30 e 31, podemos observar uma quantidade maior de células da glia circundando as células
mononucleadas derivadas da medula óssea que expressam condroitinase AC quando
comparamos com células transfectadas com o vetor vazio. Mesmo quatro semanas após o
transplante das células, continuamos a observar uma quantidade maior de células da glia
circundando as células mononucleadas derivadas da medula óssea transfectadas com o gene
da condroitinase AC (Figura 32). Esse resultado provavelmente é devido à expressão de
uma enzima bacteriana, que estaria exacerbando a reação glial.
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Figura 30. Células mononucleadas derivadas da medula óssea expressando
condroitinase AC promovem aumento da glia reativa em torno da lesão. Células
mononucleadas derivadas da medula óssea transfectadas com pcDNA3.1(+) (A) ou a
construção pcDNA3.1(+)-condroitinase AC (B) foram transplantadas em uma lesão no
córtex motor murino, 4 semanas após a realização da lesão. Animais foram sacrificados 1
semana depois. Cortes sagitais do cérebro foram submetidos à imunoistoquímica para
localização de glia reativa utilizando o anticorpo anti-GFAP (verde). Barra de escala:
100μm. Os insertos em A e B mostram áreas delimitadas pelos quadrados em maior
aumento. Os núcleos foram corados com DAPI (azul) e as células transplantadas foram
localizadas por anti-GFP (vermelho). Barra de escala: 50μm.
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Figura 31. A resposta inflamatória a células derivadas da medula óssea expressando
condroitinase AC persiste duas semanas após transplante. Células mononucleadas
derivadas da medula óssea transfectadas com pcDNA3.1(+) (A) ou a construção
pcDNA3.1(+)-condroitinase AC (B) foram transplantadas em uma lesão no córtex motor
murino, 4 semanas após a realização da lesão. Animais foram sacrificados 2 semanas
depois. Cortes sagitais do cérebro foram submetidos à imunoistoquímica para localização
de glia reativa utilizando o anticorpo anti-GFAP (verde) e de células transplantadas
utilizando o anticorpo anti-GFP (vermelho). Barra de escala: 100μm.
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Figura 32. Células mononucleadas derivadas da medula óssea expressando
condroitinase AC mantêm o aumento da glia reativa em torno da lesão após 4
semanas. Células mononucleadas derivadas da medula óssea transfectadas com plasmídeo
vazio (B) ou plasmídeo contendo o gene da condroitinase AC (C) foram transplantadas em
uma lesão no córtex motor murino, 4 semanas após a realização da lesão. Como controle,
um grupo de animais recebeu uma injeção de veículo (A). Animais foram sacrificados 4
semanas pós-transplante e cortes coronais do cérebro foram submetidos à
imunoistoquímica para localização de glia reativa utilizando o anticorpo anti-GFAP (verde)
e as células transplantadas foram localizadas por anti-GFP (vermelho). Barra de escala:
100μm.
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