Tese_ICS_Luciana Santos Cardoso

Universidade Federal da Bahia
PPGIm
Instituto de Ciências da Saúde
Programa de Pós-graduação em Imunologia
TESE DE DOUTORADO
LUCIANA SANTOS CARDOSO
Modulação da resposta imune alérgica por antígenos de
Schistosoma mansoni
Salvador – BA
2009
Luciana Santos Cardoso
Modulação da resposta imune alérgica por antígenos de
Schistosoma mansoni
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Imunologia, Instituto de
Ciências da Saúde, Universidade Federal
da Bahia, como pré-requisito obrigatório
para obtenção do grau de Doutor em
Imunologia.
Orientadora:
Prof.
Dra.
Andrade Santos Araujo
Salvador – Bahia
2009
Maria
Ilma
Ficha Catalográfica elaborada pela
BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DA UFBA
C268 Cardoso, Luciana Santos
Modulação da resposta imune alérgica por antígenos de
Schistosoma mansoni / Luciana Santos Cardoso. - Salvador, 2009.
112 f. ; il.
Tese (doutorado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de
Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Imunologia,
2009.
Orientadora: Prof. Dra. Maria Ilma Andrade Santos Araújo
1. Alergia e Imunologia. 2. Alergia. 3. Asma. 4. Antígenos de
Schistosoma mansoni. I. Araújo, Maria Ilma Andrade Santos. II.
Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde. III.
Título.
CDU: 616.995.122:616.248
Dedico este trabalho aos meus pais
Renildo e Helena
pelo amor incondicional
que eles têm por mim
AGRADECIMENTOS
A Deus,
À Profa. Maria Ilma Araujo, orientadora do meu trabalho e exemplo de pesquisadora
e de professora, cujo trabalho é baseado na competência, dedicação e sobretudo na
ética. Desta admiração e encantamento que tenho pela forma como ela se se dedica
com afinco e amor à sua profissão de pesquisadora e professora, surgiu a minha
vocação.
Ao Dr. Sérgio Costa Oliveira pela contribuição tão importante neste trabalho;
Ao Dr. Edgar M Carvalho pelos sábios conselhos;
A todos os participantes do nosso Grupo de Helmintíases e Alergia, Profa. Leda,
Cecília, Régis, Aline, Luciane, Joanemille, Rafael, Giuseppe e Gil, pessoas tão
competentes e dedicadas;
Aos meus amigos e companheiros nesta jornada Thiago, Ricardo e Robson, que
tanto me apoiam e incentivam;
Ao Grupo do Serviço de Imunologia, especialmente Glória, Silvane, Olívia, Márcia,
Andréa, Thaís, Anselmo, Rajen, Eliane, Léa, Elbe, Lúcia, Orlando, Cristiano e
Dorival;
Ao Grupo da UFMG, Lucila, Fábio, Michele (in memorian) e Sandra, por terem me
recebido tão bem e me ajudado bastante e especialmente ao Dr. Alfredo Góes, pela
colaboração tão importante;
A minha família, pela constante participação em todos os momentos e, em especial
ao meu irmão Fábio e minha prima Lília Kátia, pessoas essenciais em minha vida;
Às amigas Thaís Almeida e Carol, pelo apoio e conselhos tão importantes.
A Divaldo pela companhia sempre tão presente.
A todos os professores, funcionários e colegas do Programa de Pós-graduação em
Imunologia.
Aos Indivíduos participantes das pesquisas.
“...Nessa mesma noite, Deus apareceu ao rei e disse: Pede o que desejas, que eu te
dou. Salomão respondeu a Deus:
Dignai-vos, portanto a conceder-me
a sabedoria e a inteligência...
Disse Deus a Salomão: Pois bem, a sabedoria e
a inteligência ser-te-ão concedidas,
mas também riquezas, tesouros e glória...”
II Crônicas 1, vs. 7 a12
RESUMO
A prevalência das doenças alérgicas vem aumentando nas últimas três décadas,
representando um grande problema de saúde pública. A infecção pelo Schistosoma
mansoni tem sido associada com a proteção contra alergias. Os mecanismos
envolvidos nesta associação incluem a produção de células e citocinas regulatórias.
Objetivo: Avaliar a resposta imune induzida pelos antígenos do S. mansoni Sm22.6,
PIII e Sm29 in vitro em células de indivíduos asmáticos e em modelo experimental
de asma induzida por OVA. Métodos: Células mononucleares de sangue periférico
(CMSP) de indivíduos asmáticos não infectados foram estimuladas in vitro com
Sm22.6, PIII e Sm29 para caracterizar o perfil de citocinas induzido por estes
antígenos. A frequência de células produtoras de IL-10 e a habilidade destes
antígenos em modularem a resposta do tipo Th2 alérgeno-específica foram também
avaliadas. As citocinas foram mensuradas em sobrenadantes pela técnica de ELISA
e os fenótipos das células produtoras de IL-10 foram determinados usando
citometria de fluxo. Para o estudo experimental, foi utilizado o modelo de asma
induzido por ovalbumina (OVA). Os camundongos receberam três doses dos
diferentes antígenos do S. mansoni. A histopatologia e a atividade da peroxidase
eosinofílica do pulmão foram avaliadas, assim como a celularidade no lavado
brônquio-alveolar (BAL) e os níveis séricos de IgE e de citocinas no BAL.
Adicionalmente, foi avaliada a frequência de células TCD4+ expressando Foxp3+ e
IL-10+ em culturas estimuladas com OVA. Resultados: Foi observado uma alta
produção de IL-10 por células de indivíduos asmáticos não infectados em resposta
aos antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 (451 ± 350 pg/mL, 364 ± 289 pg/mL e 712 ± 368
pg/mL, respectivamente), comparados às culturas não estimuladas. Não houve
diferença significativa nos níveis de IFN-γ, IL-5 e IL-13 após estímulo com os
diferentes antígenos. As células CD4+CD25+ e CD14+ foram as principais fontes de
IL-10 nas culturas estimuladas com os antígenos do S. mansoni. Além disso, a
adição destes antígenos às culturas estimuladas com Der p1 levou a um aumento
significativo nos níveis de IL-10 (p<0,0001 para todos os antígenos) e redução nos
níveis de IL-5 (p<0,05 para culturas estimuladas com Der p1 e Sm22.6 ou Sm29,
comparadas com Der p1 apenas). No modelo murino de asma a imunização com
Sm22.6, PIII e Sm29 levou a uma redução no número de células totais e eosinófilos
no BAL e nos níveis de IgE específica para OVA, comparados aos camundongos
não imunizados. Adicionalmente, os níveis de IL-4 e IL-5 no BAL dos camundongos
imunizados com PIII e Sm22.6 foram diminuídos, enquanto que os níveis de IL-10
foram maiores em camundongos imunizados com Sm22.6. A frequência de células
TCD4+Foxp3+ foi maior no grupo de camundongos que receberam Sm22.6, Sm29 e
PIII, sendo a freqüência de células TCD4+IL-10+ elevada apenas em camundongos
imunizados com Sm22.6. Conclusão: Os antígenos do S. mansoni Sm22.6, PIII e
Sm29 possuem a habilidade para modular os mediadores inflamatórios alérgicos in
vitro por CMSP de indivíduos asmáticos e em modelo murino de asma. Estes
antígenos podem representar futuras estratégias para prevenir doenças alérgicas.
Palavras-chave: alergia, asma, antígenos de S. mansoni
ABSTRACT
The prevalence of allergic diseases has been increasing over the last three decades,
representing a major health problem. Schistosoma mansoni infection has been
associated with protection against allergies. The mechanisms underlying this
association may include the production of regulatory cells and cytokines. Objective:
To evaluate the immune response induced by the S. mansoni antigens Sm22.6, PIII
and Sm29 in vitro in cells of asthmatic individuals and in an experimental model of
OVA-induced asthma. Methods: Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of
uninfected asthmatic individuals were stimulated in vitro with the Sm22.6, PIII and
Sm29 to characterize the profile of cytokine induced by these antigens. The
frequency of cells producing IL-10 and the ability of these antigens in downmodulating the allergen-specific Th2 response IL-10 were also evaluated. Cytokines
were measured in the supernatants by ELISA and the phenotype of cells producing
IL-10 was assessed using flow cytometry. For the exprerimental study, a model of
ovalbumin (OVA)-induced asthma in mice was used. Mice were given three doses of
the different S. mansoni antigens. Histopathology and eosinophil peroxidase activity
in lung were evaluated, as well as the cellularity of bronchoalveolar lavage (BAL), IgE
levels in serum and cytokines in BAL. Additionally, the frequency of TCD4 cells
expressing Foxp3 and IL-10 in cultures stimulated with OVA was also evaluated.
Results: It was observed a high production of IL-10 by cells of uninfected asthmatic
individuals in response to the Sm22.6, PIII and Sm29 antigens (451 ± 350 pg/mL,
364 ± 289 pg/mL, 712 ± 368 pg/mL, respectively), compared to non-stimulated
cultures. There was no significant diference in the levels of IFN-γ, IL-5 and IL-13 after
stimulation of the cells with the different antigens. The CD4+CD25+ and CD14+ cells
were the main source of IL-10 in the cultures stimulated with S. mansoni antigens.
Moreover, the addition of the different S. mansoni antigens to the cultures stimulated
with Der p1 resulted in an increased levels of IL-10 (p<0.0001 to all antigens) and
reduced levels of IL-5 (p<0.05 to cultures stimulated with Der p1 plus Sm22.6 and
Sm29, compared with Der p1 alone). In murine model of asthma the immunization
with Sm22.6, PIII and Sm29 lead to a reduction in the number of total cells and
eosinophils in BAL and the levels of OVA-specific IgE, compared to non-immunized
mice. Aditionaly, the levels of IL-4 and IL-5 in the BAL of mice immunized with PIII
and Sm22.6 were decreased, while the levels of IL-10 were higher in mice
immunized with Sm22.6. The frequency of CD4+Foxp3+T cells was higher in the
groups of mice receiving Sm22.6, Sm29 and PIII, being the frequency of CD4+IL10+T cells only higher in mice immunized with Sm22.6. Conclusion: The S. mansoni
antigens Sm22.6, PIII and Sm29 are able to down-modulate the allergic inflammatory
mediators in vitro by PBMC of asthmatic individuals and in murine model of asthma.
These antigens could represent futures strategies to prevent allergic diseases.
Key words: allergy, asthma, S. mansoni antigens
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estratégias viáveis para regulação da resposta imune alérgica. Adaptado
de Araujo e cols, 2009, Inflammation and Allergy – Drug Targets (Submetido). 22
Figura 2. Imagem densitométrica de fluorescência não específica por tamanho (FSC)
e granulosidade (SSC) celular, identificando as populações de linfócitos, região
1 (G1) e monócitos, região 2 (G2)......................................................................50
Figura
3.
Imagem
densitométrica
de
fluorescência
específica
de
células
mononucleares do sangue periférico, selecionada na janela de linfócitos, após
marcação com isotipos controles. O diagrama é representativo de um
experimento. ......................................................................................................50
Figura 4. Indução da inflamação das vias aéreas e imunização com antígenos de S.
mansoni..............................................................................................................53
Figura 5. Imagem densitométrica de fluorescência não específica, mostrando a
região de seleção da população de linfócitos, G1 (A) e de fluorescência
específica, selecionada na janela de linfócitos, após marcação com anticorpos
fluorescentes específicos para Foxp3 (B) e para IL-10 (C). O diagrama é
representativo de um experimento.....................................................................58
Figura 6. Níveis de IL-10 (A), IL-5 (B) e IL-13 (C) e IFN-γ (D) produzidos por células
mononucleares de sangue periférico de indivíduos cronicamente infectados pelo
S. mansoni estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni.....................63
Figura 7. Níveis de IL-10 (A), IL-5 (B) e IL-13 (C) e IFN-γ (D) produzidos por células
mononucleares de sangue periférico de asmáticos não infectados pelo S.
mansoni, estimuladas in vitro com os antígenos do parasita. ............................65
Figura 8. Níveis de IL-10 em culturas de CMSP de asmáticos não infectados
estimuladas com Der p1 na presença ou ausência dos antígenos Sm22.6 (A),
PIII (B) e Sm29 (C).............................................................................................67
Figura 9. Níveis de IL-5 em culturas de CMSP de asmáticos não infectados
estimuladas com Der p1 na presença ou ausência dos antígenos Sm22.6 (A),
PIII (B) e Sm29 (C), respectivamente. ...............................................................68
Figura 10. Figura representativa de corte histológico de pulmão mostrando o
processo inflamatório das vias aéreas induzido por OVA nos camundongos
BALB/c imunizados ou não com os antígenos do S. mansoni. ..........................72
Figura 11. Níveis de IgE específica para OVA no soro (A) e de peroxidase
eosinofílica (EPO) no pulmão (B) dos camundongos não imunizados e
imunizados
com
os
antígenos
Sm22.6,
PIII,
Sm29,
IPSE
e
PBS,
respectivamente.................................................................................................76
Figura 12. Efeito da imunização com antígenos de S. mansoni sobre a produção de
citocinas no BAL. Níveis de IL-4, IL-5, IL-10 e IFN-γ nos diferentes grupos de
camundongos (Figuras A, B, C e D, respectivamente). .....................................78
Figura 13. Frequência de células TCD4+Foxp3+ (A) e TCD4+IL-10+ (B) em células do
pulmão de camundongos asmáticos imunizados ou não com os antígenos de S.
mansoni..............................................................................................................80
LISTA DE TABELAS
Tabela I. Mecanismos induzidos pela infecção por helmintos ou seus produtos na
modulação das doenças de base imunológica...................................................37
Tabela II. Características demográficas e intensidade de infecção dos indivíduos
infectados com S. mansoni e asmáticos não infectados. ...................................60
Tabela III. Freqüência de células mononucleares de sangue periférico expressando
IL-10 intracelular em culturas não estimuladas e estimuladas com os antígenos
Sm22.6, PIII e Sm29 de indivíduos asmáticos não infectados pelo Schistosoma
mansoni..............................................................................................................69
Tabela IV. Número de células totais e contagem diferencial (x 105) no BAL dos
camundongos asmáticos não imunizados e imunizados com os diferentes
antígenos do S. mansoni....................................................................................74
LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
BAL
Lavado brônquio alveolar
BSA
Fração V de albumina bovina
CD
Do inglês “clusters of differentiation”
CMSP
Células mononucleares do sangue periférico
CTLA-4
Do inglês “Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4”
Der p 1
Alérgeno 1 do Dermatophagoides pteronyssinus
DO
Densidade ótica
DP
Desvio padrão
ELISA
Do inglês “Enzyme Like Immunosorbent Assay”
EPO
Peroxidase eosinofílica
FPLC
Do inglês “Fast Protein Liquid Chromatography”
IFN-γ
Interferon-gamma
H2O2
Peróxido de Hidrogênio
H2SO4
Ácido Sulfúrico
HTAB
Do inglês “Hexadecyltrimethylammonium bromide”
Ig
Imunoglobulina
IL
Interleucina
IPSE
Do inglês “IL-4-inducing principle of S. mansoni eggs”
IPTG
Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo
KDa
Kilodálton
LPS
Lipopolissacarídeos
LB
Lúria-Bertani
NO
Óxido Nítrico
OPD
Orto-fenilenodiamina
OVA
Ovalbumina
PBS
Tampão fosfato-salina
PHA
Fitohemaglutinina
PMB
Polimixina B
SEA
Antígeno Solúvel do Ovo do S. mansoni
SWAP
Antígeno Solúvel do Verme Adulto do S. mansoni
Th
Do inglês: “T helper”
TLR
Do inglês “Toll-like receptor”
TNF
Fator de Necrose Tumoral
VLA-4
Do inglês “Very Late Antigen-4”
SUMÁRIO
1. Introdução ............................................................................................................ 19
1.1 Resposta imune na infecção pelo Schistosoma mansoni ................................24
1.2 Resposta imune nas alergias e na asma .........................................................28
1.3 Regulação da resposta imune alérgica por helmintos em humanos................32
1.4 Regulação da resposta imune alérgica por helmintos em modelo experimental
...............................................................................................................................36
2. Hipótese ............................................................................................................... 39
3. Objetivos .............................................................................................................. 39
3.1 Objetivo Geral..................................................................................................39
3.2 Objetivos Específicos.......................................................................................39
4. Materiais e Métodos ............................................................................................. 40
4.1 Metodologia aplicada aos objetivos específicos 1, 2 e 3 .................................40
4.1.1 Desenho do estudo e cálculo amostral .....................................................40
4.1.2 Critérios de inclusão..................................................................................41
4.1.3 Critérios de exclusão.................................................................................42
4.1.4 Obtenção dos antígenos de S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29 .................43
4.1.5 Avaliação laboratorial dos indivíduos recrutados nos dois grupos ............45
4.1.6 Avaliação da resposta imune celular.........................................................47
4.1.7 Análise da fonte produtora de IL-10 ..........................................................48
4.1.8 Análise dos dados .....................................................................................51
4.1.9 Considerações éticas ................................................................................51
4.2 Metodologia aplicada aos objetivos específicos 4 e 5 .....................................52
4.2.1 Obtenção do modelo experimental de asma e imunização dos
camundongos com os antígenos Sm22.6, PIII, Sm29 e IPSE ...........................52
4.2.2 Obtenção do lavado brônquio-alveolar e determinação de citocinas ........54
4.2.3 Avaliação de IgE específico para OVA......................................................54
4.2.4 Avaliação da inflamação nos pulmões ......................................................55
4.2.5 Ensaio para detecção de peroxidase eosinofílica (EPO) ..........................56
4.2.6 Avaliação da freqüência de células TCD4+Foxp3+ e TCD4+IL-10+ em
células de pulmão dos camundongos asmáticos imunizados ou não com os
antígenos do S. mansoni....................................................................................56
4.2.7 Análise dos dados .....................................................................................59
4.2.7 Considerações éticas ................................................................................59
5. Resultados ........................................................................................................... 60
5.1 Resultados referentes aos objetivos específicos 1, 2 e 3 ...............................60
5.1.1 Características demográficas dos indivíduos avaliados no estudo ...........60
5.1.2 Produção de citocinas por CMSP de indivíduos cronicamente infectados
pelo S. mansoni .................................................................................................61
5.1.3 Produção de citocinas por CMSP de asmáticos não infectados pelo
S. mansoni .........................................................................................................64
5.1.4 Efeito da adição de antígenos do S. mansoni sobre a produção de IL-10 e
IL-5 induzida pelo alérgeno 1 do Dermatophagoides pteronyssinus (Der p1)....66
5.1.5 Frequência de CMSP produtoras de IL-10 após estimulação in vitro com
os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29.....................................................................69
5.2 Resultados referentes aos objetivos específicos 4 e 5 ....................................71
5.2.1 Modulação da inflamação das vias aéreas em modelo murino de asma
induzido por OVA pela imunização com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 .....71
5.2.2 Efeito da imunização com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 sobre a
celularidade do lavado brônquio-alveolar (BAL) dos camundongos dos
diferentes grupos ...............................................................................................73
5.2.3 Mediadores inflamatórios em camundongos imunizados e não imunizados
com os antígenos do S. mansoni .......................................................................75
5.2.5 Frequência (%) de células CD4+ no pulmão dos diferentes grupos de
camundongos, expressando a molécula Foxp3 e a citocina IL-10.....................79
6. Discussão............................................................................................................. 81
7. Resumo dos resultados........................................................................................ 88
8. Conclusões........................................................................................................... 89
9. Referências .......................................................................................................... 90
10. Anexos................................................................................................................102
19
1. INTRODUÇÃO
Nas últimas três décadas vem sendo observado um aumento na prevalência de
doenças alérgicas em países industrializados em relação aos países em
desenvolvimento (WHO/NHLBI; Romagnani 1997; Sears 1997; Umetsu e cols.
2002). O desencadeamento destas doenças envolve a predisposição genética e
fatores ambientais, entretanto, evidências vêm se acumulando de que a resposta
imune participa diretamente para o desenvolvimento das mesmas (Carrada Bravo
2002). Foi demonstrado que pacientes leucêmicos sem história prévia de doenças
alérgicas desenvolvem essas doenças após transplante de medula óssea de
doadores alérgicos (Saarinen 1984; Agosti e cols. 1988).
Dentre as doenças alérgicas a asma é uma das mais prevalentes e graves, afetando
aproximadamente 300 milhões de pessoas no mundo (Braman 2006). É uma doença
complexa e multifatorial, entretanto é bem conhecido o papel fundamental das
células TCD4+ do tipo Th2 na imunopatogenia da mesma (Wills-Karp 1999). Estas
células secretam IL-4 e IL-13 que induzem e mantêm a produção de IgE por células
B, e IL-5, que induz o recrutamento, diferenciação e infiltração de eosinófilos na
mucosa brônquica (Foster e cols. 1996). Além das ações acima referidas, a IL-4, que
é também produzida por mastócitos ativados, é um fator de diferenciação para
células Th2, perpetuando o processo inflamatório (Yssel e cols. 1993). Como
conseqüência da ativação desses diversos tipos celulares, ocorre a produção de
muco e hiperreatividade brônquica, o que leva aos sintomas da doença. Além das
células Th2, subpopulações de células Th1 ativadas que produzem IFN-γ e TNF-α
contribuem para a reação inflamatória associada ao dano tecidual na asma (Smart e
Kemp 2002; Cho e cols. 2005), e recentemente vêm surgindo algumas evidências de
que a inflamação pulmonar alérgica é agravada pela presença das citocinas IL-25,
IL-33 e IL-17 (Cheung e cols. 2006; Ballantyne e cols. 2007; Nakajima e Takatsu
2007).
A população de linfócitos T do cordão umbilical de recém-nascidos tem fenótipo Th2,
semelhante ao observado em adultos atópicos. Por esse perfil de células T supõe-se
que haveria uma predisposição natural para o desenvolvimento de doenças
alérgicas no homem. Entretanto, nos primeiros meses de vida há uma mudança para
20
o fenótipo Th1, semelhante ao de adultos não atópicos (Prescott e cols. 1998; Holt e
cols. 1999). Estudos mostram que infecções pelo vírus A da hepatite, pelo
Toxoplasma gondii e pelo Helicobacter pylori reduzem em 60% o risco de atopia,
como revisado por Matricardi e colaboradores (Matricardi e cols. 2000), sugerindo
que estímulos ambientais como infecções virais e bacterianas seriam responsáveis
pelo equilíbrio imunológico, desviando o tipo de resposta para o pólo Th1 e
prevenindo as doenças atópicas. Esta é a chamada “Hipótese da Higiene”, que
sugere que o aumento da incidência de asma em países em desenvolvimento teria
como causa a melhora das condições de saneamento, a redução das parasitoses, a
diminuição da exposição a agentes infecciosos, as campanhas de vacinação em
massa e ao uso abusivo de antibióticos. Ainda segundo esta hipótese, a falta de
regulação da resposta imune pela ausência de contato com antígenos que induzam
uma resposta do tipo Th1, a exemplo de infecções bacterianas e virais, manteria a
resposta Th2 da criança recém nata predispondo-a as doenças alérgicas (Strachan
1989; Strachan 2000; Yazdanbakhsh e cols. 2002).
Baseando-se no princípio de que a ausência de estímulo antigênico para o padrão
de resposta Th1 resultaria na polarização da resposta para o tipo Th2 e conseqüente
aumento na prevalência das doenças alérgicas, seria esperado que em países
desenvolvidos onde é elevada a prevalência de alergia, houvesse uma baixa
prevalência de doenças auto-imunes mediadas pela resposta do tipo Th1.
Entretanto, estudos mostram que tem havido nestes países aumento na prevalência
não apenas de doenças alérgicas, mas de doenças auto-imunes, a exemplo da
esclerose múltipla (Poser e cols. 1989; Cabre e cols. 2005), Diabetes melitus tipo I
(Onkamo e cols. 1999) e doença de Crohn (Elliott e cols. 2000). Estes dados de que
doenças do “tipo Th1” podem ocorrer concomitantemente com as do “tipo Th2” vão
de encontro à hipótese de que uma contra-regulação da resposta imune, dirigindo-a
para um dos pólos Th1 ou Th2, seja responsável pelo aumento da freqüência destas
doenças.
Uma vez que respostas polarizadas do tipo Th1 e Th2 relacionam-se com a
patogênese de doenças de base imunológica, a prevenção destas doenças poderia
advir de mecanismos regulatórios da resposta imune que promovessem o equilíbrio
entre estas respostas (Yazdanbakhsh e cols. 2002). Estes mecanismos incluem a
21
geração de células e moléculas regulatórias, cuja modulação se processa via
produção de citocinas como a IL-10, TGF-β, ou por contato célula-célula, via
CD80/CD86:CD28/CTLA4 (Padrid e cols. 1998; Francis e cols. 2003; Oliveira e cols.
2009).
A exposição crônica a antígenos parasitários, particularmente do Schistosoma sp,
pode levar ao desenvolvimento de mecanismos regulatórios e prevenção de
doenças alérgicas (van den Biggelaar e cols. 2000; Araujo e cols. 2004);
(Yazdanbakhsh e cols. 2001) e auto-imunes (Fiorentino e cols. 1989; Del Prete e
cols. 1993; Cooke e cols. 1999; La Flamme e cols. 2003).
Desta forma, a nossa hipótese é de que mecanismos reguladores, desenvolvidos
durante a infecção crônica pelo S. mansoni, a exemplo da produção da IL-10, sejam
capazes de modular a resposta a aeroalérgenos, prevenindo a reação de
hipersensibilidade imediata e melhorando o curso clínico da asma (Figura 1).
22
Estratégias viáveis
para regulação da
resposta imune alérgica
Desvio imune para o pólo
Th1
Produtos bacterianos
e virais
IFN-γ ou IL-12
exógenos
• Controle da resposta alérgica Th2
• Aumento da susceptibilidade a doenças
mediadas pela resposta Th1 (?)
Indução de mecanismos regulatórios
(Células T reg, CTLA-4, IL-10, TGF-β)
Imunoterapia
específica
Antígenos de
hemintos
Controle da resposta
inflamatória alérgica exacerbada
Figura 1. Estratégias viáveis para regulação da resposta imune alérgica. Adaptado
de Araujo e cols, 2009, Inflammation and Allergy – Drug Targets (Submetido).
O papel modulador da IL-10 é predominantemente enfatizado na resposta Th1, mas
hoje se sabe que esta citocina possui também a capacidade de modular a resposta
do tipo Th2 (Fiorentino e cols. 1989; Del Prete e cols. 1993; Oh e cols. 2002; Araujo
e cols. 2004) podendo, portanto, representar um dos mecanismos de modulação da
resposta inflamatória nas doenças alérgicas.
Neste trabalho avaliamos as proteínas recombinantes do S. mansoni, Sm22.6 e
Sm29 e o PIII, purificado do antígeno do verme adulto, quanto à capacidade de
modularem a resposta alérgica inflamatória in vitro por células mononucleares de
23
sangue periférico (CMSP) de indivíduos asmáticos e em modelo experimental de
asma induzido por ovalbumina (OVA).
A identificação de antígenos de S. mansoni com capacidade para modular a
resposta
imune
inflamatória
observada
nas
alergias
poderá
resultar
desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas para estas doenças.
no
24
1.1 RESPOSTA IMUNE NA INFECÇÃO PELO SCHISTOSOMA MANSONI
A infecção pelo Schistosoma mansoni ocorre pela penetração das cercárias na pele.
As cercárias então perdem a cauda neste processo, transformam-se em
esquistossômulos e estes ganham a circulação, realizando o ciclo pulmonar. Em
seguida, migram para o sistema porta, transformando-se neste trajeto em vermes
adultos, machos e fêmeas. Os vermes adultos vivem no sistema porto-mesentérico,
põem os ovos nos capilares intestinais e estes aparecem nas fezes após passar
pelos tecidos da mucosa intestinal, principalmente na região colônica. Estes ovos
podem ainda ganhar a circulação porto-hepática e alcançarem os espaços porta,
levando à formação de um granuloma, que é caracterizado pela reação inflamatória
a antígenos do ovo, seguida da produção de colágeno, podendo evoluir para um
quadro de fibrose hepática. A depender do grau da fibrose pode haver hipertensão
portal, varizes esofagianas e sangramento intestinal, quadro observado na forma
hepato-esplênica da doença (Wynn e Cheever 1995).
Seis a oito semanas após a primeira exposição inicia-se a fase aguda da doença,
conhecida como síndrome toxêmica (Lambertucci 1993; Rabello e cols. 1997; de
Jesus e cols. 2002). Esta fase é caracterizada principalmente por febre, astenia,
acentuada perda de peso, associadas a elevação dos níveis de citocinas pró
inflamatórias (TNF, IL-1, IL-6 e IFN-γ). Dor abdominal e diarréia são freqüentes nesta
fase e coincidem com o início da postura dos ovos, causando destruições focais na
mucosa e sub-mucosa intestinais. Adicionalmente pode surgir dispnéia e dor
torácicas em decorrência da pneumonite e pericardite, relacionadas com níveis
elevados de complexos imunes circulantes e reação de hipersensibilidade tipo III têm
sido descritas (Galvao-Castro e cols. 1981; de Jesus e cols. 2002). Esta fase aguda
sintomática é raramente encontrada em pessoas residentes em áreas endêmicas,
sendo mais comum em indivíduos expostos pela primeira vez à infecção. Este
achado sugere que a modulação da resposta imune que ocorre pela exposição
crônica ao parasita previne o aparecimento destas manifestações nos indivíduos
previamente infectados (Lambertucci 1993; Rabello 1995; Wynn e cols. 1998).
25
Na fase crônica da esquistossomose ocorre uma mudança do perfil da resposta
imune com desvio para o tipo Th2, caracterizada pela produção de IL-4, IL-5 e IL-13,
com baixos níveis de IFN-γ (Gazzinelli e Colley 1992; Williams e cols. 1994; Araujo e
cols. 1996; Finkelman e cols. 1997; Mwatha e cols. 1998). Esta mudança no padrão
de resposta tem sido relacionada à produção de IL-4 e IL-10 induzida por antígenos
do ovo, desde que coincide com a oviposição (Sher e cols. 1991; Brunet e cols.
1997; Montenegro e cols. 1999; Van der Kleij e cols. 2002; Silveira e cols. 2004).
Células regulatórias e macrófagos têm sido implicados como as fontes produtoras de
IL-10 neste processo (Hesse e cols. 2004; McKee e Pearce 2004).
A resposta imune polarizada para o tipo Th2 é também modulada na fase crônica da
esquistossomose e esse achado coincide com a produção de IL-10 (Pearce e
MacDonald 2002). Este fato parece ter grande importância fisiológica, desde que a
IL-10 modula a produção das citocinas do tipo Th2, podendo prevenir o
desenvolvimento da fibrose hepática (Hoffmann e cols. 2000; Booth e cols. 2004).
Estudos têm sido realizados para elucidar a resposta imune envolvida na formação
do granuloma e da fibrose hepática, tanto em modelo experimental, como em
modelo de modulação do granuloma in vitro e com biópsias de tecido (Wynn e
Cheever 1995; Falcao e cols. 1998; Gustavson e cols. 2002). Estes estudos vêm
demonstrando o envolvimento da IL-4, IL-5 e principalmente da IL-13 na formação
do granuloma e evolução para fibrose hepática (Chiaramonte e cols. 1999; De Jesus
e cols. 2000; Chiaramonte e cols. 2001; De Jesus e cols. 2004).
A resposta do tipo Th2, ao tempo em que está envolvida na patogenia da
esquistossomose tem sido também relacionada com proteção. Tem sido descrito
níveis elevados de IgE correlacionados à proteção contra a re-infecção (Jarrett e
Miller 1982; Rihet e cols. 1991; Dunne e cols. 1992; Hussain e cols. 1992). Em
modelo experimental, a resposta do tipo Th1 com produção de IFN-γ também tem
sido associada a proteção contra a infecção, sendo uma resposta equilibrada do tipo
Th1 e Th2 sugerida como protetora (Correa-Oliveira e cols. 1998; Brito e cols. 2000;
Pacifico e cols. 2006).
26
Em virtude de antígenos de S. mansoni serem capazes de induzir a produção de IL10 (Correa-Oliveira e cols. 1998; Velupillai e cols. 2000; Zouain e cols. 2000; Van der
Kleij e cols. 2002; Pacifico e cols. 2006), grande interesse têm surgido em avaliar a
capacidade da infecção por esse trematoda em atenuar as doenças auto-imunes,
doenças inflamatórias crônicas e doenças alérgicas.
Vários antígenos de S. mansoni têm sido identificados e testados em modelo
experimental quanto à capacidade de prevenir a infecção por este parasita e
também a patogenia induzida pelo mesmo. As proteínas recombinantes Sm22.6 e
Sm29 e o antígeno purificado PIII, por exemplo, têm sido avaliadas quanto ao
potencial protetor na infecção pelo S. mansoni e na redução da patologia associada
a infecção por este parasita, a exemplo da modulação do granuloma (Gustavson e
cols. 2002; Zouain e cols. 2004; Pacifico e cols. 2006; Pacifico e cols. 2006).
Estas proteínas estão presentes no tegumento do verme adulto do Schistosoma sp e
possivelmente estão envolvidas na supressão do sistema imune pelo parasita,
favorecendo a sobrevivência do mesmo no hospedeiro. Têm sido descritos vários
mecanismos envolvidos na modulação da resposta imune pelo S. mansoni. A
indução da produção de citocinas com potencial regulatório das respostas Th1 e
Th2, a exemplo da IL-10, é um dos mecanismos propostos para esta regulação.
A proteína do S. mansoni, Sm22.6 é uma proteína solúvel do tegumento, presente
em todos os estágios do ciclo do S. mansoni, exceto o ovo (Jeffs e cols. 1991).
Estudos com esta proteína mostram uma considerável homologia entre os antígenos
de 22.6 kDa do S. mansoni, S. haematobium e S. japonicum (Fitzsimmons e cols.
2004). Em modelo experimental a imunização com a proteína Sm22.6 induziu um
padrão de resposta mista, com produção tanto de IFN-γ como IL-4, além de IL-10
(Pacifico e cols. 2006).
O antígeno PIII do verme adulto do S. mansoni está associado com a modulação da
formação do granuloma em modelo experimental através da indução de IL-10
(Zouain e cols. 2000). Avaliando-se a produção de citocinas e outras moléculas in
vitro por células mononucleares de sangue periférico de indivíduos com
esquistossomose crônica, observou-se a produção de IL-10 e NO em culturas
27
estimuladas pelo PIII (Oliveira e cols. 1999). Os mecanismos envolvidos na
modulação do granuloma esquistossomótico por este antígeno foram: diminuição da
proliferação celular in vitro, estimulação da produção de IL-10, diminuição da
percentagem de células CD4+ expressando CD28 e aumento de células com o
fenótipo CD8+ expressando CTLA-4 (Zouain e cols. 2004).
A proteína Sm29 do S. mansoni foi identificada e caracterizada por pesquisadores
do Projeto Rede Genoma de Minas Gerais. A forma nativa é uma glicoproteína de
membrana do S. mansoni, presente no esquitossômulo e no verme adulto (Cardoso,
F. C. e cols. 2006). Os estudos sobre a resposta imune induzida por esta proteína
estão relacionados ao papel protetor na infecção pelo S. mansoni (Cardoso e cols.
2008).
Desde que antígenos do S. mansoni induzem a produção de IL-10 por células de
indivíduos cronicamente infectados e, uma vez que a IL-10 é capaz de promover
diminuição da liberação de histamina e de outros mediadores pelos mastócitos
(Royer e cols. 2001) e de inibir a produção de citocinas Th2, envolvidas na
patogênese da asma (Araujo e cols. 2004), é possível que antígenos deste parasita
sejam capazes de modular a resposta inflamatória nas alergias e na asma.
28
1.2 RESPOSTA IMUNE NAS ALERGIAS E NA ASMA
Alergia, um conceito criado em 1906 por Von Pirquet, é uma alteração da resposta
imune do organismo, que causa uma reação exagerada a substâncias normalmente
toleradas por indivíduos não alérgicos, como revisado por Jones e colaboradores
(Jones 2008). Atopia é o termo utilizado para descrever uma condição hereditária
que predispõe o indivíduo a doenças alérgicas, a exemplo da asma, rinite e
dermatite atópica (Sears 1997; Strachan 2000).
A asma é definida como uma doença inflamatória crônica caracterizada por
hiperresponsividade (HR) brônquica e por limitação variável do fluxo aéreo,
reversível espontaneamente ou com tratamento, manifestando-se clinicamente por
episódios recorrentes de sibilância, dispnéia, aperto no peito e tosse (Kay, 2000;
Carrada Bravo 2002; Jarjour e Kelly 2002). Dentre as doenças atópicas a asma é a
que causa maior morbi-mortalidade (Pearce e cols. 2000; Masoli e cols. 2004).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO) 255 mil pessoas morreram de
asma em 2005. Estima-se que aproximadamente 300 milhões de pessoas no mundo
sofram de asma, e os custos com esta doença para governos, sistemas de saúde,
famílias e pacientes vêm aumentando em todo o mundo, sendo uma das doenças
que mais consome recursos em países desenvolvidos. Essa patologia é a maior
causa de ausência de trabalho em muitos países, incluindo Austrália, Suécia,
Inglaterra e Estados Unidos (Masoli e cols. 2004).
Segundo o DATASUS do Ministério da Saúde do Brasil, em média, anualmente
ocorrem 350.000 internações por asma, constituindo-se na terceira ou quarta causa
de hospitalizações pelo Sistema Único de Saúde (2,3% do total). Porto Alegre,
Recife e Salvador são as cidades com maior registro de pacientes com asma, sendo
25% dos casos entre adolescentes (Telles-Filho 2007; Sole e cols. 2007).
O aumento na incidência da asma tem sido atribuído a diversos fatores relacionados
a melhora nas condições de vida. Em Salvador, esta doença é mais prevalente em
populações de maior nível sócio econômico (Baqueiro e cols. 2007).
29
Além dos fatores genéticos a asma sofre influências ambientais, a exemplo do
contato com antígenos da poeira domiciliar, poluentes, mudanças climáticas, fumo,
exercícios físicos, estresse emocional e exposição a patógenos (Bousquet e Burney
1993; Borish 1999; Busse e Lemanske 2001). Nos países industrializados, a
prevalência aumenta 50% a cada dez anos. Na Nova Zelândia e Austrália, mais de
um adolescente em cada grupo de cinco é acometido por esta doença. A influência
do ambiente fica evidente na “urbanização” das crianças africanas. Quando estas
migram do campo para a periferia da Cidade do Cabo, na África do Sul, a
prevalência aumenta de 0,15 para 3,2%. A taxa de asma aumenta quando as
comunidades passam a adotar um estilo de vida ocidentalizado e se tornam
urbanizadas. Com o aumento projetado da proporção da população mundial urbana
de 45-59% em 2025, ocorrerá aumento substancial do número de pacientes com
asma no mundo nas próximas duas décadas. Estima-se que haverá um incremento
em mais de 100 milhões em 2025 (Telles-Filho 2007).
A imunopatologia das doenças atópicas, incluindo a asma, está ligada a uma
exacerbação da resposta do tipo Th2, com produção principamente de IL-4, IL-5 e
IL-13. A IL-4 promove a diferenciação de células T para o subtipo Th2. A IL-4 e a IL13 induzem e mantêm a troca de classe de imunoglobulina no linfócito B para o
isotipo IgE. A IL-4 promove a expressão do receptor de alta afinidade para IgE
(FcεRI), na superfície dos mastócitos e basófilos, e de baixa afinidade (FcεRIIb) na
superfície das células B ativadas, monócitos e macrófagos (Yssel e cols. 1993). A IL4 induz ainda a expressão de moléculas de adesão vascular nos eosinófilos e
basófilos, além da produção de quimiocinas. Isto facilita a migração de células
inflamatórias da circulação para a lâmina própria, o epitélio e lúmen das vias aéreas
(Zhu e cols. 1999). A IL-5, junto a IL-3 e ao GM-CSF, promovem a diferenciação de
eosinófilos, a partir de precussores mielóides, além de atuar na ativação desta
célula. O eosinófilo ativado expressa moléculas na superfície, como a E-selectina e o
VLA-4, que estimulam a quimiotaxia destas células pela ligação a receptores no
endotélio vascular. (Foster e cols. 1996; Holt e cols. 1999; 2000). A IL-4, que é
também produzida por mastócitos ativados, é um fator de diferenciação para células
Th2, perpetuando o processo inflamatório (Yssel e cols. 1993).
30
Em indivíduos atópicos ao primeiro contato com o alérgeno a resposta imune é
desviada para o tipo Th2, com produção de IgE específica. Esta imunoglobulina ligase a receptores de alta afinidade nos mastócitos. Contatos posteriores com o
alérgeno resultam em interação do mesmo com as moléculas de IgE ligadas aos
mastócitos, ocorrendo degranulação destas células e liberação dos mediadores
inflamatórios como a histamina, prostaglandinas e leucotrienos, além de citocinas do
tipo Th2 (Platts-Mills e Wheatley 1996). Esta fase se caracteriza pela ativação de
terminações nervosas vagais com produção de neurotransmissores (acetilcolina,
substância P, neurocinina A) que vão resultar em broncoconstricção, vasodilatação,
aumento da permeabilidade vascular, com exsudação de plasma, hipersecreção de
muco e inflamação. Há uma produção de citocinas do tipo Th2 também por
mastócitos, eosinófilos e basófilos, e de quimiocinas como a eotaxina, que irão
recrutar mais células, perpetuando o processo inflamatório. Estes eventos iniciais da
fase aguda da asma iniciam-se aproximadamente 10 minutos após o contato com o
alérgeno e duram cerca de 2 horas. A fase tardia desta resposta se inicia 2 a 4 horas
após o contato com o alérgeno e tem uma duração média de 24 horas. Esta fase se
caracteriza pela quimiotaxia de neutrófilos, monócitos e linfócitos e pelo aumento da
liberação de mediadores inflamatórios, como o TNF (Ferreira 2004). Segue-se a
degeneração celular, com ruptura do epitélio ciliado, descamação para o lúmem,
juntamente com o muco, seguido de remodelamento brônquico e fibrose subepitelial,
com depósito intersticial de colágeno na lâmina reticular por células endoteliais e
miofibroblastos. Com o tempo este processo pode levar a um aumento do trabalho
respiratório e limitação do fluxo aéreo, causando a fadiga e a falência respiratória
progressiva podendo levar ao óbito por asfixia (Lemanske e Busse 2003).
O tratamento das doenças alérgicas de um modo geral baseia-se no uso de
broncodilatadores e corticosteróides. Alternativas baseadas no bloqueio de alguns
mediadores da inflamação, a exemplo do anti-IgE vêm sendo utilizado (Noga e cols.
2003; Chung 2004), mas o custo benefício tem limitado o uso desses agentes.
Diante das evidências de que a resposta imune alérgica pode ser modulada por
células e citocinas regulatórias, ou por antígenos que possam induzir essa resposta,
abriu-se novas perspectivas para o tratamento destas doenças. Outra opção para o
tratamento das alergias inclui a imunoterapia. Sabe-se hoje que o mecanismo de
31
ação da imunoterapia envolve células e citocinas regulatórias (Akdis e Blaser 2001;
Akdis e Blaser 2001; Till e cols. 2004), contudo, essa estratégia terapêutica ainda
não é largamente utilizada, seja porque nem todo paciente se beneficia com o uso
da mesma, seja pela possibilidade de efeitos colaterais.
Mesmo a patogênese da asma sendo relacionada ao aumento da resposta do tipo
Th2, citocinas do tipo Th1 também podem estar envolvidas, resultando em
agravamento do quadro (Smart e Kemp 2002; Cho e cols. 2005). Em modelo murino
de asma alérgica, a administração de células Th1 produtoras de IFN-γ causa uma
intensa inflamação neutrofílica das vias aéreas, reforçando a idéia de que a
regulação do sistema imune nas doenças inflamatórias não resulta de um simples
desequilíbrio entre as subpopulações de células Th1 e Th2 (Hansen e cols. 1999;
Randolph e cols. 1999).
Como a patogenia da asma está principalmente associada a uma falta de regulação
da resposta imune, a indução de mecanismos modulatórios da resposta exacerbada
poderão conter ou minimizar a patogenicidade associada a esta doença.
A necessidade de desenvolver vacinas com potencial imunomodulatório capazes de
conter a exacerbação do processo inflamatório envolvido na patogênese da asma e
que não interferissem na co-morbidade de outras patologias, justificaria pesquisas
que visassem à identificação e caracterização de antígenos com propriedades
regulatórias da resposta imune.
32
1.3 REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ALÉRGICA POR HELMINTOS EM
HUMANOS
Existem na literatura dados que sugerem que a baixa exposição de crianças a
patógenos indutores da resposta do tipo Th1, a exemplo de infecções virais e
bacterianas, previniria o desenvolvimento de doenças alérgicas, subsidiando a
“hipótese da higiene” (Strachan 1989; Yazdanbakhsh e cols. 2002).
Uma outra hipótese para explicar a baixa prevalência de atopia em países em
desenvolvimento seria a alta freqüência de infecções parasitárias nestas regiões. Em
um estudo realizado na Venezuela, foi demonstrado uma baixa positividade aos
testes cutâneos de alergia na população exposta à infecção por Ascaris lumbricoides
(Hagel e cols. 1993), havendo um aumento da reatividade aos testes após o
tratamento com anti-helmíntico (Lynch e cols. 1993). Cooper e colaboradores (2003),
avaliando 2865 crianças em idade escolar residentes em uma área endêmica em
geohelmintos no Equador, demonstraram baixa positividade ao teste cutâneo de
hipersensibilidade imediata para aeroalérgenos (Cooper e cols. 2003).
Esses dados falam a favor do papel protetor das infecções por helmintos sobre a
alergia. Entretanto, existem na literatura alguns dados controversos sobre o assunto,
a exemplo de estudos que encontraram uma associação positiva entre infecção por
helmintos e atopia (Dold e cols. 1998; Palmer e cols. 2002), e redução dos sintomas
da asma após tratamento para A. lubricoides (Lynch e cols. 1997). Uma possível
explicação para esses dados conflitantes seria o tipo de helminto avaliado nos
estudos, a carga parasitária e o tempo de infecção ou exposição ao parasita.
Fatores como infecções crônicas, altas cargas parasitárias e helmintos que vivem na
luz de vasos sanguíneos parecem ser importantes para que haja modulação da
resposta imune. Foi observado, por exemplo, que em indivíduos de zona urbana
infectados pelo A. lubricoides não ocorreu inibição da resposta ao teste cutâneo de
alergia (Ponte e cols. 2006). Adicionalmente foi demonstrado que apenas infecção
crônica pelo S. mansoni, e com altas cargas parasitárias, é capaz de suprimir a
inflamação alérgica das vias aéreas em modelo experimental (Smits e cols. 2007).
33
Poucos estudos na literatura têm avaliado o papel da infecção pelo Schistosoma sp
sobre as manifestações de atopia e asma em humanos (Araujo e cols. 2000; van
den Biggelaar e cols. 2000; Araujo e cols. 2004). Em um destes estudos foi
demonstrado que, em indivíduos infectados com alta carga parasitária de
Schsistosoma mansoni, residentes na área endêmica de Caatinga do Moura na
Bahia, havia um menor prevalência de positividade aos testes cutâneos de alergia
quando comparados com indivíduos não infectados ou infectados com baixa carga
residentes na mesma área (Araujo e cols. 2000). A gravidade da asma em indivíduos
residentes nesta região foi também avaliada em um estudo prospectivo com duração
de um ano e foi observada menor gravidade da asma em indivíduos residentes na
área endêmica, comparando-se com asmáticos não infectados residentes em uma
área rural e uma área urbana com as mesmas condições sócio-econômicas
(Medeiros e cols. 2003).
Vários fatores podem explicar a menor freqüência de positividade aos testes
cutâneos de hipersensibilidade imediata a aeroalérgenos em indivíduos infectados
por helmintos, tais como: a grande produção de IgE policlonal, altas concentrações
de IgG4 antígeno-específica, redução de IgE específica para o alérgeno e aumento
na produção de células e moléculas regulatórias da resposta imune (Hussain e cols.
1992; Araujo e cols. 1996; Malaquias e cols. 1997; Lynch e cols. 1998; Weiss 2000).
A avaliação prospectiva de indivíduos asmáticos residentes em três diferentes áreas
no Estado da Bahia, uma delas endêmica em S. mansoni, não mostrou diferenças
estatisticamente significantes nos níveis de IgE total e específica para aeroalérgenos
(Medeiros e cols. 2003). A possibilidade de que uma grande produção de IgE devido
à ativação policlonal bloqueasse os receptores de IgE presentes em mastócitos não
encontrou suporte em estudos que mostraram que basófilos de pacientes asmáticos
infectados pelo S. mansoni degranulam quando estimulados in vitro com o antígeno
1 do ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Der p1) (Medeiros e cols. 2003).
Além disso, em estudo realizado por Araujo e colaboradores, não foi observado
diferença significativa nos níveis de IgE total e específica para o antígeno Der p1
entre indivíduos infectados pelo S. mansoni com baixa ou alta carga parasitária,
sendo que nesse último grupo de indivíduos houve uma menor positividade aos
testes cutâneos (Araujo e cols. 2000). O aumento da produção de IgG4 vem sendo
34
apontado como um possível mecanismo envolvido na melhora clínica de pacientes
atópicos durante imunoterapia específica com alérgenos (Ebner e cols. 1997; PlattsMills e cols. 2001). Entretanto, em estudo realizado no Gabão, a ausência de
reatividade cutânea para alérgenos em indivíduos parasitados por helmintos não foi
associada com a elevação nos níveis de IgG4 (van den Biggelaar e cols. 2000).
Diante desses dados, a hipótese mais aceita recentemente é a indução de
mecanismos modulatórios da resposta imune envolvendo células regulatórias, a
exemplo das células Tr1 e células CD4+CD25+Foxp3+, e citocinas produzidas por
estas células, a exemplo da IL-10 (Yazdanbakhsh e Rodrigues 2001).
Inicialmente classificada como uma citocina do tipo Th2, a Interleucina-10 foi descrita
por Fiorentino e colaboradores (Fiorentino e cols. 1989), sendo posteriormente
considerada a principal citocina regulatória da resposta inflamatória (Akdis e Blaser
2001). A IL-10 é produzida por uma variedade de células da resposta imune como
macrófagos, linfócitos TCD4+, TCD8+, TCD4+CD25+, linfócitos B, células dendríticas
e células NK. As principais funções promovidas por esta citocina estão relacionadas
a sua atividade inibitória sobre a ativação da célula T, a produção de IgE, o
recrutamento de eosinófilos e a ativação de macrófagos. Agindo nos macrófagos, a
IL-10 modula sua atividade antimicrobiana, inibe a atividade co-estimulatória e a
produção de citocinas pró-inflamatórias. A IL-10 também inibe a diferenciação de
células dendríticas e suprime a produção de quimiocinas inflamatórias e citocinas do
tipo Th1 e Th2 em alguns modelos (Sher e cols. 1991; Del Prete e cols. 1993). Além
da IL-10, o papel das moléculas co-estimulatórias na modulação da resposta imune
vem sendo estudado. Trabalhos recentes conduzidos pelo Serviço de Imunologia do
HUPES, UFBA, comparando a expressão de moléculas co-estimulatórias em
linfócitos e monócitos de asmáticos infectados ou não infectados pelo S. mansoni,
demonstraram que a expressão de CTLA-4 foi significativamente maior em linfócitos
dos asmáticos infectados. Nesse estudo foi demonstrado ainda que as células
TCD4+CD25+ representavam as principais fontes produtoras de IL-10 nos asmáticos
infectados, e que macrófagos desses asmáticos são alternativamente ativados, ou
seja, apesar de expressam altos níveis de MHC classe II, essas células expressam
também elevados níveis de receptor para IL-10 e sintetizam essa citocina (Oliveira e
cols. 2009).
35
Estudos mostraram ainda que a infecção pelo S. mansoni pode interferir na resposta
imune para outros antígenos não relacionados, como visto no trabalho de SABIN e
colaboradores (1996), onde indivíduos infectados pelo S. mansoni produzem níveis
elevados de IL-4 e baixos de IFN-γ em resposta a vacinação pelo toxóide tetânico,
ao passo que nos indivíduos não infectados, há produção principalmente de IFN-γ
em resposta à vacinação (Sabin e cols. 1996).
Os mecanismos responsáveis por esse fenômeno ainda não estão bem elucidados,
contudo sabe-se que este efeito modulador não depende do parasita vivo, haja vista
que antígenos oriundos desses patógenos possuem também propriedades
modulatórias. Até o momento, porém, apenas extratos antigênicos foram descritos
com essa característica, tornando-se imperativo a identificação das moléculas
destes extratos que possuam a capacidade de modular a resposta inflamatória
(Deehan e cols. 1997; Faquim-Mauro e Macedo 1998).
A resposta imune nas alergias assemelha-se àquela envolvida na patogênese das
helmintíases, sendo também do tipo Th2. Entretanto, nas infecções por helmintos,
particularmente pelo S. mansoni, a expressão de células e moléculas regulatórias da
resposta imune é maior que na asma (Araujo e cols. 1996; Oliveira e cols. 2009).
Existem dados mostrando que na asma há uma deficiência na produção de IL-10
(Borish e cols. 1996; Lim e cols. 2004) e que o sucesso da imunoterapia está
associado a um aumento nos níveis desta citocina (Akdis e cols. 1998). Células
mononucleares de sangue periférico de asmáticos produzem mais baixos níveis de
IL-10 em resposta a endotoxina quando comparadas a controles normais (Borish e
cols. 1996). Adicionalmente, têm sido encontrados polimorfismos na região do
promotor de IL-10 em indivíduos asmáticos, sendo que o haplótipo GCC, associado
com baixa produção de IL-10, é encontrado em pacientes com asma grave (Lim e
cols. 1998).
Uma vez que a IL-10 é capaz de inibir a produção de citocinas Th2 envolvidas na
patogênese da asma (Araujo e cols. 2004), a produção de IgE (Royer e cols. 2001),
o recrutamento de eosinófilos (Zuany-Amorim e cols. 1996) e a liberação de
histamina pelos mastócitos (Royer e cols. 2001) e considerando que a resposta
imune a antígenos de S. mansoni leva a produção de IL-10 (Araujo e cols. 1996;
36
Cardoso, L. S. e cols. 2006), além de outros mecanismos regulatórios, a exemplo da
expressão de CTLA-4, é possível que antígenos de S. mansoni sejam capazes de
modular a resposta inflamatória nas alergias.
1.4 REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ALÉRGICA POR HELMINTOS EM
MODELO EXPERIMENTAL
Muitos estudos têm utilizado modelos experimentais para investigar os mecanismos
envolvidos nas doenças de base imunológica, possibilitando a avaliação do efeito da
administração in vivo de agentes terapêuticos, a exemplo das drogas, vacinas e
outros imunomoduladores. O entendimento da resposta aos potenciais agentes
terapêuticos nos permite desenvolver estratégias cada vez mais eficientes no
combate a essas doenças.
Têm sido demonstrado que a infecção por helmintos, administração de ovos ou o
uso de extratos oriundos destes parasitas possuem habilidade em modular doenças
inflamatórias mediadas por mecanismos imunológicos, a exemplo da doença de
Crohn (Elliott e cols. 2000; Elliott e cols. 2003), asma (Wohlleben e cols. 2004; Itami
e cols. 2005; Mangan e cols. 2006; Yang e cols. 2007; Pacifico e cols. 2009),
esclerose múltipla (La Flamme e cols. 2003; Sewell e cols. 2003; Zheng e cols.
2008) e diabetes tipo 1 (Cooke e cols. 1999; Zaccone e cols. 2003). Os mecanismos
imunológicos envolvidos nesta modulação estão mostrados na tabela I, como
revisado por Elliott e colaboradores (Elliott e cols. 2007).
37
Tabela I. Mecanismos induzidos pela infecção por helmintos ou seus produtos na
modulação das doenças de base imunológica.
Modelo
Animal
Colite induzida
por TNBS
Doença
Humana
Doença de
Crohn
Característica imune
associada ao modelo
↑IFN-γ, ↑IL-12, ↑TNF,
↓IL-4, ↓IL-10
Helminto estudado
Mudança imune
associada ao helminto
Schsitosoma mansoni
↓IFN-γ, ↓IL-12, ↑IL-4,
↑IL-10
Heligmosomoides
polygyrus
↓IFN-γ, ↓IL-12, ↑IL-4,
↑IL-10, TGF-β
Trichinella spiralis
↓IFN-γ, ↓IL-12, ↑IL-4, ↑IL-10
Hymenolepis diminuta
↓IFN-γ, ↓IL-12, ↑IL-4, ↑IL-10
H. Polygyrus
↓IFN-γ, ↓IL-12, ↑IL-4
S. mansoni
↓IFN-γ, ↓IL-12, ↑IL-13
Colite em IL-10
-/-
Doença de
Crohn
↑IFN-γ, ↑IL-12, NO,
IL-10
Encefalite auto
imune (EAE)
Esclerose
Múltipla
↑IFN-γ, ↑IL-12, ↑IL-6,
↑IL-17
S. mansoni
↓IFN-γ, ↓IL-12, ↓TNF,
↑IL-10, ↑IL-4, ↑TGF-β
Camundongos
NOD
Diabetes tipo 1
↑IFN-γ, ↑IL-12
S. mansoni
T. spiralis
H. poliygyrus
↑IL-4, ↑IL-10
Reatividade das
vias aéreas
Asma
↑IL-4, ↑IL-5, ↑IL-13
S. mansoni
H. Poliygyrus
↓IL-5, ↑IL-10
↓IL-5, ↑IL-10, ↑TGF-β
Adaptado de Elliott e cols (2007), Int J Parasitology.
Os modelos experimentais de asma baseiam-se na sensibilização e no desafio com
ovalbumina (Kitagaki e cols. 2006; Siddiqui e cols. 2008; Pacifico e cols. 2009),
proteínas de ácaros (Takeda e cols. 2004), proteínas de helmintos (Itami e cols.
2005) e até uso de ovos do S. mansoni (Padrid e cols. 1998; Mathur e cols. 1999).
Estes modelos de indução de asma alérgica parecem não diferir no fenótipo da
doença, uma vez que a imunopatogênese induzida é semelhante em todos eles.
No presente estudo utilizou-se o modelo de indução de asma alérgica pela
administração de ovalbumina (OVA). Estudos prévios com a infecção por helmintos
na asma experimental têm caracterizado a resposta imune modulatória induzida por
estes parasitas. A infecção pelo S. mansoni ou pelo Heligosomoides polygyrus
protege camundongos asmáticos contra os processos inflamatórios envolvidos nesta
doença, via produção de IL-10 induzida pelo parasita (Mangan e cols. 2004; Kitagaki
e cols. 2006). Kitagaki e cols mostraram ainda que, além da IL-10, células
CD4+CD25+Foxp3+ presentes nos linfonodos estariam envolvidas nesta modulação
(Kitagaki e cols. 2006). Outro estudo mostrou que administração de ovos de S.
38
japonicum modulou a inflamação das vias aéreas em modelo murino de asma
através do aumenento na freqüência de células TCD4+CD25+ (Yang e cols. 2007).
Em estudo recente realizado pelo nosso grupo foi observado que em camundongos
asmáticos infectados pelo S. mansoni as células CD4+CD25+Foxp3+ estão
envolvidas na regulação do processo inflamatório, porém por uma via independente
de IL-10. A maioria dos estudos indica que a IL-10 exerce papel central na
modulação do processo inflamatório envolvido na asma. Entretanto, outros estudos
sugerem que este não é o único mecanismo envolvido na modulação da asma pelos
helmintos. Trujillo-Vargas e cols (2007), por exemplo, mostraram que extratos de
Nipostrogilus braziliensis modulou a resposta inflamatória na asma por uma via
independente de IL-10 (Trujillo-Vargas e cols. 2007).
Modelos de infecção, de administração de ovos ou de extratos antigênicos, apesar
de bastante esclarecedores, envolvem às vezes múltiplas vias de ativação,
desencadeadas por numerosos epítopos imunogênicos presentes nestes antígenos.
Apesar da importância destes estudos na compreensão do entendimento da relação
helmintos-asma, é necessário a identificação de antígenos com potencial
modulatório da resposta inflamatória na asma a fim de que possam ser reproduzidos
em larga escala para uso clínico.
39
2. HIPÓTESE
Os antígenos do S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29 possuem a capacidade de
modular a resposta inflamatória na asma.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a capacidade dos antígenos do S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29 em modular
a resposta imune do tipo Th2 in vitro em indivíduos asmáticos e a resposta
inflamatória alérgica em modelo experimental de asma induzida por OVA.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Caracterizar a resposta imunológica específica para os antígenos de S. mansoni
Sm22.6, PIII e Sm29 in vitro por células mononucleares de sangue periférico de
indivíduos asmáticos, através da avaliação da produção de citocinas do tipo Th1
(IFN-γ), Th2 (IL-5 e IL-13) e anti-inflamatória (IL-10).
2. Avaliar a capacidade dos antígenos de S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29 em
modular a produção de IL-5 específica para aeroalérgeno em indivíduos asmáticos
não infectados pelo S. mansoni;
3. Identificar os fenótipos das células produtoras de IL-10 em culturas estimuladas
com os antígenos de S. mansoni nos asmáticos não infectados pelo parasita;
40
4. Avaliar a capacidade dos antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 em modular o processo
inflamatório pulmonar, a produção de peroxidase eosinofílica e de IgE específica
para OVA em modelo experimental de asma
5. Avaliar o perfil de citocinas no lavado brônquio-alveolar (BAL) e a freqüência de
células CD4+ expressando Foxp3 e IL-10 no pulmão dos camundongos asmáticos
imunizados com os referidos antígenos.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 METODOLOGIA APLICADA AOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1, 2 E 3
4.1.1 Desenho do estudo e cálculo amostral
Participaram do estudo asmáticos atendidos no ambulatório de alergia do Hospital
Universitário Professor Edgard Santos que possuem forma leve da asma, de
acordo com a avaliação clínica e prova de função pulmonar realizada pelos
profissionais que atendem no referido ambulatório. Estes indivíduos apresentaram
resultados do exame parasitológico de fezes negativo para ovos de helmintos e/ou
cistos de protozoários. A partir desta seleção, ressalvados os critérios de exclusão
referidos abaixo, 20 destes indivíduos asmáticos não infectados pelo S. mansoni,
foram admitidos no estudo, por ordem de atendimento ao recrutamento (GRUPO I).
Adicionalmente, foi selecionado um grupo controle (GRUPO II), constituído por 20
indivíduos não asmáticos infectados pelo S. mansoni, residentes em área
endêmica em esquistossomose.
O cálculo do tamanho amostral foi realizado tomando-se por base resultados prévios
que demonstraram que em indivíduos infectados pelo S. mansoni a produção da
citocina do tipo Th2, IL-5, em resposta a alérgeno foi em média 53 ± 110 pg/mL,
enquanto que em asmáticos não infectados foi 558 ± 674 pg/mL, sendo a diferença
41
média entre os grupos de aproximadamente 90% (Araujo e cols. 2004). Baseado
nestes dados, com 20 indivíduos o poder de estudo será de 80% com alfa de 0,05.
Desenho do Estudo - Fluxograma
GRUPO I
Infectados pelo
S. mansoni (n=22)
GRUPO II
Asmáticos não
infectados pelo
S. mansoni (n=20)
Parasitológico de fezes (Kato-Katz e Sedimentação espontânea)
e determinações séricas de IgE e IgG4 específicas para SWAP
Cultura de CMSP, 37oC, 5%
CO2 , 72h
Sm22.6, PIII, Sm29, SWAP
e SEA
Determinação das citocinas IL-5, IL-10,
IL-13 e IFN-γ em sobrenadante
(ELISA sanduíche)
Análise da fonte
produtora de IL-10
(FACS)
Cultura de CMSP
(37oC,5% CO2, 72h)
estimulada com Der p1 na
presença
ou
ausência
dos
antígenos do S. mansoni
Determinação das citocinas
IL-5 e IL-10 em sobrenadante
(ELISA sanduíche)
42
4.1.2 Critérios de inclusão
- Indivíduos com idade entre 6 a 40 anos;
- Ambos os gêneros;
- Diagnóstico de asma leve;
- Não infectados pelo S. mansoni, para compor o Grupo I;
- Infectados pelo S. mansoni, não asmáticos para compor o Grupo II.
Crianças menores de seis anos não foram incluídas no estudo pela dificuldade no
diagnóstico de asma brônquica e da realização da espirometria, e adultos acima de
40 anos não participaram devido ao risco aumentado de apresentarem doença
pulmonar obstrutiva crônica de outras etiologias que não fossem alérgicas.
4.1.3 Critérios de exclusão
Não foram admitidos no estudo:
- Mulheres grávidas;
- Indivíduos com asma grave;
- Indivíduos com a forma hepato-esplênica da esquistossomose;
-Indivíduos portadores de doenças crônicas ou que não possam colaborar com o
estudo;
- Indivíduos que estejam em uso de uma das seguintes drogas: anti-histamínicos,
anti-asmáticos e corticosteróides.
43
4.1.4 Obtenção dos antígenos de S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29
a) Produção do antígeno purificado PIII a partir do SWAP
O antígeno PIII é uma fração do antígeno solúvel do verme adulto (SWAP) obtido
por FPLC (“Fast Protein Liquid Chromatography”) (Pharmacia, Uppsala, Suécia)
através de cromatografia de troca aniônica utilizando uma resina de Q-Sefarose (5
mm x 90 mm; Pharmacia, Suécia) como descrito anteriormente por Hirsch e Góes
(Hirsch e Goes 1996).
b) Expressão e Produção da proteína recombinante Sm22.6
A proteína recombinante Sm22.6 foi produzida com previamente descrito por
Pacífico e colaboradores (Pacífico e Cols. 2006).
Resumidamente, o gene que codifica a proteína rSm22.6, foi encontrado na
biblioteca de cDNA de esquistossômulo de fase pulmonar de S. mansoni. Esse
gene já se encontra subclonado no vetor de expressão em bactérias, pMAL-c2. A
expressão utilizando o pMAL-c2 tem sido realizada segundo o manual do fabricante
(New England Biolabs, Beverly, Mass.). Com o objetivo de determinarmos a
cinética da expressão da proteína de fusão, foi realizado primeiramente um
experimento piloto com apenas 10 mL de cultura para determinar o melhor tempo
de indução, que foi de 3 horas.
O pré-inóculo saturado de clones contendo o gene Sm22.6 foram preparados em
meio LB suplementado com ampicilina, os quais foram incubados durante 16 horas
a 37°C ou por uma noite, sob agitação constante (200 rpm). Após o crescimento da
cultura, 1L de meio LB contendo 100 µg/mL de ampicilina e glicose a 0,1% foram
inoculados com 10 mL do pré-inóculo saturado de células, contendo o plasmídeo
recombinante. As células foram incubadas a 37°C sob agitação constante de 200
rpm até DO600 ~ 0,6. Em seguida foi adicionado IPTG, para uma concentração final
de 0,6 mM. Após 3 horas de indução as células foram centrifugadas a 7.000 rpm
por 40 min. O sedimento contendo as células foram então ressuspendidas em 100
mL de PBS 0,15 M pH 8,4 contendo 25 mg de lisozima. As bactérias foram lisadas
através de três ciclos de congelamento (-70ºC) e descongelamento (banho-maria à
44
42°C) e depois sonicadas três vezes com pulsos de 30 segundos, potência de 30
% em sonicador (Fisher Scientific), intercalados por 30 segundos no gelo, para
liberação total das proteínas. As frações de proteínas solúveis e insolúveis do
lisado foram separadas após centrifugação a 7.000 rpm por 40min a 4°C, no
sobrenadante e no sedimento, respectivamente e ambos foram submetidos a
eletroforese em gel de poliacrilamida 12 % para confirmar a presença da proteína
recombinante Sm22.6-MBP no sobrenadante. A proteína foi purificada por
cromatografia de afinidade com resina de amilose, que se liga à maltose do MBP e
foi eluída por competição com maltose livre.
c) Expressão e purificação da proteína recombinante Sm29
A proteína recombinante Sm29 foi produzida com previamente descrito por
Cardoso e colaboradores (Cardoso e Cols. 2006).
Resumidamente, o gene que codifica a proteína Sm29 do S. mansoni foi subclonado
no vetor de expressão pET21 em cepas de E. coli BL21 (DE3).
A expressão
utilizando o pET21a foi realizada segundo o manual do fabricante (Novagen,
Madison, WI). Foi realizado um experimento piloto com apenas 100 mL de cultura,
para determinar a cinética da proteína de fusão, que foi de 5 horas. O pré-inóculo
saturado de clones contendo os genes Sm29 foram preparados em meio LB
suplementado com ampicilina, os quais foram incubados durante 16 horas a 37ºC ou
por uma noite, sob agitação constante (200 rpm). Após o crescimento da cultura, 100
mL de meio LB contendo 0,2% de glicose e 100 µg/mL de ampicilina foram
inoculados com 1 mL do pré-inóculo saturado de células, contendo o plasmídeo
recombinante. As células foram incubadas a 37ºC sob agitação constante de 200
rpm até atingirem, aproximadamente 2x108 células/mL (DO600 de aproximadamente
0,5). Neste momento, uma alíquota de 5 mL de cultura foi coletada e em seguida
adicionado IPTG para uma concentração final de 1 mM. Após incubação adicional
de 5 horas, as células foram recuperadas por centrifugação a 10.000 rpm por 20
min. O sedimento contendo as células foi então ressuspendido em 1 mL de PBS
0,15 M pH 8,4 contendo 25 mg de lisozima. As bactérias foram lisadas através de
três ciclos de congelamento (gelo seco-metanol) e descongelamento (banho-maria à
37ºC) e depois sonicadas três vezes com pulsos de 30 segundos, potência de 30 %
45
em sonicador (Fisher Scientific), intercalados por 30 segundos no gelo, para
liberação total das proteínas. As frações de proteínas solúveis e insolúveis do lisado
foram separadas após centrifugação a 7.000 rpm por 20 min a 4ºC, no sobrenadante
e no sedimento, respectivamente e ambos foram submetidos a eletroforese em gel
de poliacrilamida 10 % para confirmar a presença da proteína recombinante Sm296xHis. A proteína foi purificada por cromatografia de afinidade com resina de níquel
(Amersham, Biosciences, São Paulo), que se liga aos resíduos de histidina e foi
eluída por competição com o ácido imidoacético.
d) Obtenção do Antígeno Solúvel do Verme Adulto (SWAP) e do Antígeno Solúvel
do Ovo (SEA)
Preparações antigências foram obtidas do ovo (SEA) e do verme adulto (SWAP)
preparadas como sobrenadante solúvel em tampão salina, de acordo com
medotologia descrita por Hirsch e colaboradores (1996) (Hirsch e Goes 1996; Hirsch
e cols. 1997).
Os antígenos SEA e SWAP foram utilizados como controles da resposta imune nos
grupos estudados. Estes antígenos, além do PIII foram gentilmente cedidos para o
estudo pelo Dr. Alfredo Góes, enquanto que os antígenos recombinantes Sm22.6 e
Sm29 foram cedidos pelo Dr. Sérgio Oliveira, ambos do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.
4.1.5 Avaliação laboratorial dos indivíduos recrutados nos dois grupos
a) Exame parasitológico de fezes
Os indivíduos selecionados para o estudo tiveram examinadas amostras de fezes
(3 amostras), através da técnica de sedimentação espontânea de Hoffmann-PonsJaner para a determinação da infestação parasitária e pela técnica de Kato-Katz
para avaliação da carga parasitária (Katz e cols. 1970).
b) Dosagem de IgE e IgG4 específicas para SWAP
46
Níveis de IgE e IgG4 específicos para SWAP foram determinados como descritos
previamente (Souza-Atta e cols. 1999; Ribeiro de Jesus e cols. 2000).
A dosagem de IgE específica para SWAP foi realizada pela técnica de ELISA
modificada. Resumidamente, uma placa de 96 foi sensibilizada com 10 µg/mL de
SWAP em TCB, pH 9,6 (100 µL/poço) e deixadas por uma noite a 40C. No mesmo
dia os soros foram diluídos em PBS-tween 0,05% (1:30) e adicionados ao RF (RF
Absorbent, Dade behring). As amostras foram também incubadas por uma noite a
40C. No dia seguinte os soros foram centrifugados a 2000 rpm a 40C por 5 minutos e
então coletados para serem adicionados na placa. Esta por sua vez foi lavada 3
vezes com PBS-tween 0,05% e bloqueada com 100 µL/poço de PBS-tween 0,05% +
5% BSA (250 µL/poço). Incubou-se por 1 hora a temperatura ambiente, lavou-se 3
vezes com PBS-tween 0,05% e adicionou-se os soros (100 µL/poço). Após
incubação por 2 horas a 37°C as placas foram lavadas e foi adicionado o anticorpo
anti-IgE conjugado a peroxidase (SIGMA) na diluição de 1:3000 e incubadas mais 1
hora a temperatura ambiente. Lavou-se 5 vezes com PBS + 0,05% de tween e
adicionou-se TMB (100 µL/poço). Após incubadas por 15 minutos as reações foram
paradas com adição de uma solução de H2SO4 2N (50 µL/poço). A reação foi em
seguida lida a 450 nm.
A dosagem de IgG4 foi realizada utilizando-se a técnica de ELISA sanduíche
modificada (Ribeiro de Jesus e cols. 2000). Resumidamente, as placas de 96 poços
foram sensibilizadas com o 10 µg/mL de SWAP e deixadas a 40C por uma noite. As
placas foram então bloqueadas com PBS + 3% de BSA (100 µl/poço) e em seguida
incubadas por uma noite a 40C. Em seguida foi adicionado anti-IgG4 humano ligado
a peroxidase (1:1000) e as placas foram incubadas por 1h a 370C. Após seis
lavagens com PBS + 0,05% de tween a reação foi revelada pela adição do substrato
TMB (ICN Biomedicals Inc.) e interrompida pela adição de H2SO4. As placas foram
lidas em espectofotômetro a 450 nm e os resultados expressos em densidade ótica.
Soros de indivíduos controles parasitados por outros helmintos e sem alergia
respiratória foram utilizados para o cálculo do cut-off (média mais dois desviospadrões das DO dos controles).
47
4.1.6 Avaliação da resposta imune celular
a) Obtenção de células mononucleares de sangue periférico
Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) foram obtidas através do
gradiente de Ficoll-Hypaque e ajustadas para concentração de 3 x 106 células/ml
em RPMI 1640, contendo 10% de soro AB+ humano normal inativado, penicilina
100U/ml, estreptomicina 100 µl/ml, L-glutamina 2mM, 30mM HEPES (Life
technologies GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). As células foram estimuladas com
10 µg/mL dos antígenos de S. mansoni ou com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA)
na diluição final de 1:100. As células serão cultivadas em placas de 24 poços, por
24, 48 e 72 horas à 37oC e 5% de CO2. Às culturas estimuladas com os antígenos
recombinante Sm22.6 e Sm29 foram adicionadas 30µg/mL de Polimixina B para
bloquear a produção de IL-10 induzida pela endotoxina, conforme descrito por
Cardoso e colaboradores (Cardoso e cols. 2007). Após a incubação, os
sobrenadantes das culturas foram coletados e mantidos a –20°C para posterior
dosagem de citocinas.
b) Adição de Sulfato de Polimixina B às culturas para bloqueio da produção de
citocinas pelo LPS.
As CMSP dos indivíduos foram pré-incubadas com 10 µg/mL de Sulfato de
Polimixina B (PMB) (CALBIOCHEM, Alemanha) por 30 minutos a 370C, 5% CO2,
distribuídas em placas de culturas na concentração de 3x106 células/mL, conforme
metodologia descrita por Cardoso e colaboradores (Cardoso e cols. 2007). Em
seguida adicionaram-se as proteínas recombinantes nos poços contendo PMB e as
proteínas não recombinantes nos demais poços, segundo esquema de placas préestabelecido. Polimixina B (10 µg/mL) foi adicionada novamente no tempos de 12 e
24 horas de cultura. A concentração final de 30 µg/mL de PMB foi suficiente para
bloquear até 50 ng/mL de LPS (Vabulas e cols. 2001).
c) Avaliação da produção de citocinas
Os níveis de IL-5, IL-10, IL-13, IFN-γ e TNF em sobrenadantes de culturas de
CMSP foram determinados pela técnica de ELISA sanduíche utilizando-se
48
reagentes comercialmente disponíveis (R&D Systems). Uma curva padrão foi
utilizada para expressar os resultados em pg/mL.
4.1.7 Análise da fonte produtora de IL-10
A expressão de IL-10 intracelular entre os diferentes tipos celulares foi analisada
como descrito por Sornasse e colaboradores (1996) (Sornasse e cols. 1996). Em
resumo, suspensões com 3 x 105 células foram incubadas em placas de 96 poços
por 16 horas a 37ºC, 5% de CO2 na presença ou ausência dos antígenos de S.
mansoni (concentração 10µg/mL). Após a incubação, foram adicionados 20µL/poço
de brefeldina diluída 10X e realizada nova incubação sob as mesmas condições
por 4 horas. As células foram então marcadas com os anticorpos monoclonais antiCD4, CD8, CD14, CD25, CD19, CTLA-4 e GITR conjugados com isotiocianato de
fluoresceína (FITC) ou “cycrhome” (CY) e mantidas a 4ºC, protegidas da luz até o
dia seguinte. Após a marcação das moléculas de superfície, as placas foram
lavadas com PBS azida sódica, fixadas com 200 µl de formaldeído a 4% em PBS e
mantidas a 4°C até o dia seguinte. Após esta etapa, as placas foram centrifugadas
e incubadas com 150µl/poço do tampão de permeabilização, por 10 minutos em
temperatura ambiente. Após a incubação, foi feita marcação intracelular, utilizandose anticorpo monoclonal anti-IL-10, conjugado com PE (ficoeritrina), seguido de
incubação por 20 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. Em seguida
foram feitas sucessivas lavagens utilizando-se o tampão de permeabilização,
seguida de ressuspensão das células em 200 µL de solução de lavagem e
transferência para tubos de leitura do FACS. A aquisição foi realizada utilizando-se
o aparelho FACSCALIBUR (Becton Dickinson). Para avaliação de células que
expressarem a citocina IL-10 foram adquiridos 100.000 eventos.
As células mononucleares foram analisadas de acordo com a frequência da
expressão dos marcadores de superfície celular usando o pograma “Cell Quest”.
As populações celulares foram definidas por fluorescência inespecífica a partir da
dispersão frontal (FSC) e lateral (SSC) como parâmetros de tamanho e
granulosidade celular, respectivamente. De acordo com as características
celulares, procedeu-se a seleção das populações de linfócitos e monócitos por
49
janelas nestas respectivas populações. Foram delimitadas duas regiões específicas
no gráfico: região 1 (G1), correspondente a janela na área de linfócitos e região 2
(G2), na área de monócitos (Figura 2). Portanto, para a análise das características
fenotípicas e expressão de IL-10 intracelular em linfócitos foi utilizada a região G1,
enquanto que para monócitos, a região G2.
As delimitações dos quadrantes foram realizadas de acordo com os isotipos
controles e as populações negativas de cada marcação (Figura 3).
50
Figura 2. Imagem densitométrica de fluorescência não específica por tamanho (FSC)
e granulosidade (SSC) celular, identificando as populações de linfócitos, região 1
(G1) e monócitos, região 2 (G2).
M1
Figura
3.
Imagem
densitométrica
de
fluorescência
específica
de
células
mononucleares do sangue periférico, selecionada na janela de linfócitos, após
marcação com isotipos controles. O diagrama é representativo de um experimento.
51
4.1.8 Análise dos dados
Os dados foram analisados através do software GraphPad Prism (GraphPad
software, San Diego, CA). Os dados referentes à amostra da população estudada
foram apresentados através de médias aritméticas e seus respectivos desvios
padrões. A Representação gráfica foi realizada utilizando-se o programa
“GraphPad Prism”, versão 3.03, (GraphPad software, San Diego, CA).
Foram utilizados o teste ANOVA para avaliar as diferenças nos níveis de citocinas e
foram considerados os resultados significantes entre os valores das culturas de
CMSP não estimuladas e estimuladas com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29. Foi
utilizado o teste pareado de Wilcoxon para comparar os níveis de IL-10 e IL-5 em
cultura de CMSP estimuladas com Der p1 ou com Der p1 na presença dos antígenos
do S. mansoni.
Todos os testes estatísticos de hipóteses foram bi-caudais, sendo considerados
estatisticamente significantes valores de p inferiores ao nível de significância préestabelecidos em 5%.
4.1.9 Considerações éticas
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da Maternidade
Climério de Oliveira, sob Parecer/Resolução número 52/2007 (ANEXO I), e os seus
participantes foram todos voluntários que, após esclarecimentos sobre o objetivo
desta pesquisa, assinaram termo de consentimento informado (ANEXO II). No caso
de menores, o consentimento foi assinado por um dos responsáveis (ANEXO III).
Os voluntários que participaram deste estudo doaram 20 mL de sangue para
avaliação imunológica e colheram amostras de fezes para realização de exames
parasitológicos.
A coleta de sangue foi realizada por profissionais da área de saúde habilitados para
tal. Os materiais utilizados na coleta de sangue foram descartáveis. A coleta de
52
sangue não oferece riscos, a não ser a possibilidade de sangramento e formação de
hematoma, o que é raro e pode ser contornado com compressão do local. Todos os
indivíduos portadores de parasitoses intestinais foram tratados gratuitamente. Os
indivíduos asmáticos são pacientes atendidos no ambulatório de alergia do Hospital
Universitário Professor Edgard Santos.
4.2 METODOLOGIA APLICADA AOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS 4 E 5
4.2.1 Obtenção do modelo experimental de asma e imunização dos
camundongos com os antígenos Sm22.6, PIII, Sm29 e IPSE
Para a obtenção do modelo experimental de asma induzida por OVA cinco
camundongos BALB/c por grupo foram sensibilizados pela injeção de uma solução
de OVA (Albumin chicken egg White, Grade V, Sigma) e hidróxido de alumínio
(alumem) via sub-cutânea nos dias 0 e 15. Cada animal recebeu 200µl de solução
que corresponde a 10ug OVA + 1mg alumen por animal. Entre os dias 22 a 25 os
camundongos foram desafiados com OVA aerosol (1%) por 30 minutos (Figura 4A).
Além dos antígenos a serem Sm22.6, PIII e Sm29, neste estudo foi utilizado o
antígeno do ovo IPSE (IL-4-inducing principle of S. mansoni eggs) como controle
positivo, ma vez que esta proteína é indutora de IL-4 na esquistossomose (Schramm
e cols. 2003; Schramm e cols. 2007).
Dois dias antes do início do protocolo de indução de asma os camundongos foram
imunizados via sub-cutânea com os diferentes antígenos de S. mansoni. O grupo
OVA não recebeu nenhuma imunização e o grupo PBS recebeu PBS e alumem. Os
camundongos foram divididos em grupos denominados de acordo com o antígeno
utilizado na imunização (Figura 4B). Cinco camundongos foram incluídos em cada
grupo e dois experimentos isolados foram realizados.
53
A
Dia:
-2
0
1a imuniz
s.c.
OVA
s.c.
8
2a imuniz
s.c.
15
OVA
s.c.
18
3a imuniz
s.c.
22
27
OVA aerosol
desafio
Eutanásia
B
Grupo
Sensibilização
Desafio
Imunização
OVA
OVA/alumem
OVA
--
Sm22.6
OVA/alumem
OVA
Sm22.6/alumem
PIII
OVA/alumem
OVA
PIII/alumem
Sm29
OVA/alumem
OVA
Sm29/alumem
IPSE
OVA/alumem
OVA
IPSE/alumem
PBS
PBS/alumem
PBS
PBS/alumem
Figura 4. Indução da inflamação das vias aéreas e imunização com antígenos de S.
mansoni. Camundongos BALB/c foram sensibilizados com injeções sub-cutâneas de
OVA/alumem e então desafiados com OVA aerosol entre os dias 22 a 27. Os
animais foram sacrificados no dia 28 para realização dos experimentos (A).
Diferentes grupos de camundongos foram imunizados com os antígenos Sm22.6,
PIII, Sm29 e IPSE, sendo que o controle negativo recebeu PBS/alumen e o grupo
OVA não recebeu nenhuma imunização (B).
54
4.2.2 Obtenção do lavado brônquio-alveolar e determinação de citocinas
A realização do lavado brônquio alveolar foi realizada como descrito por Pacífico e
colaboradores (Pacifico e cols. 2009). Resumidamente, para avaliação da
inflamação das vias aéreas foi realizada uma lavagem bronquioalveolar (BAL) e
avaliação
das
populações
celulares
existentes.
Os
camundongos
foram
sacrificados com dose letal de anestésico 0,4 mL (rompum ou ketamina) em
seguida a traquéia foi exposta, e com o auxílio de uma cânula acoplada a uma
seringa injetou-se 1mL de PBS nos brônquios, fazendo massagem no pulmão para
ajudar a voltar o lavado para a seringa. (Este processo foi repetido três vezes). O
material obtido na última lavagem foi utilizado para os experimentos, sendo
centrifugado a 1200 rpm por 5 minutos a 4ºC para obtenção das células. O
sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 100 µL de solução de
albumina 3% (BSA). Foi realizada a contagem de células totais existentes no BAL,
sendo que as lâminas foram feitas no citospin com aproximadamente 50.000
células, centrifugando 450 rpm por 3 minutos. Em seguida as lâminas foram
coradas por May-Grumald-Giemsa. Foi realizada a contagem diferencial de células
mononuclares, neutrófilos e eosinófilos (por proporção em relação ao número total
de células obtido no BAL).
As determinações das citocinas IL-4, IL-5, IFN-γ e IL-10 foram realizadas através de
ELISA sanduíche, utilizando anticorpos disponíveis comercialmente e seguindo
instruções dos fabricantes (BD e R&D Systems). As densidades óticas foram lidas a
450 nm e os resultados foram expressos em pg/mL, comparados a uma curva
padrão.
4.2.3 Avaliação de IgE específico para OVA
Os níveis de IgE específica para OVA foram determinados no soro dos animais,
como descrito por Fallon e colaboradores e Pacífico e colaboradores (Fallon e
Dunne 1999; Pacifico e cols. 2009). Resumidamente, amostras de soro dos animais
obtidas pela centrifugação do sangue total obtido a partir do plexo retro-orbital foi
55
utilizada para realização da determinação de IgE anti-OVA pela técnica de ELISA.
Placas de 96 wells de fundo chato (Nunc; Denmark) foram sensibilizadas com
anticorpo IgE de rato anti-camundongo (1:250; Southern Biotechnology) diluído em
TCB pH 9.6, 50 µL por poço e incubadas por 16 horas a 4ºC. Em seguida, as placas
foram lavadas 3 vezes com PBS Tween-20 0,05% pH 7.2 (PBST) e então
bloqueadas por 1 hora em temperatura ambiente com 200µL PBS-caseína. Após o
bloqueio, as placas foram novamente lavadas 3 vezes com PBST. Foi adicionado 50
µL de soro por poço e incubado por duas horas à temperatura ambiente. Em
seguida, OVA-Biotina (1:50) foi adicionada à placa e incubada por 1 hora à
temperatura
ambiente.
estreptavidina-HRP
Anticorpos
(1:10,000;
ligados
Southern
à
placa
foram
Biotechnology)
por
incubadas
45
com
minutos
à
temperatura ambiente. A reação de coloração se desenvolveu por adição de 100 µL
por poço de Solução de OPD (Sigma) diluído em 50 mL Tampão Citrato-Fosfato,
pH5 e H2O2 0,05%). As placas foram então incubadas a temperatura ambiente por
10 minutos e a reação foi interrompida pela adição de 50 µL por poço de H2SO4 5%.
A absorbância foi medida a 492 nm utilizando um leitor de placas de ELISA (BioRad,
Hercules, CA).
4.2.4 Avaliação da inflamação nos pulmões
Seguindo a lavagem brônquio-alveolar os pulmões foram coletados e fixados em
10% de formalina tamponada. Os cortes histológicos e a avaliação das lâminas
foram realizados no laboratório de Patologia Comparada sob supervisão do
professor Geovanni Cassali, departamento de Patologia Geral, UFMG. Para tal, os
fragmentos foram então desidratados, clarificados e embebidos em parafina. Várias
secções sagitais de todo o tecido foram feitas (3-4 µm de espessura). Elas foram
então coradas com Hematoxilina e Eosina e examinadas para avaliação de infiltrado
celular (aumento de 200x). Pelo menos 10 campos foram aleatoriamente
examinados e selecionados. A gravidade do processo inflamatório na região peribronqueal foi avaliada por dois patologistas que não conheciam a distribuição dos
grupos. A presença de células inflamatórias na região peri-bronqueal foi classificada
em uma escala que variou de 0 a 5, sendo: 0= ausência de inflamação, 1=
56
inflamação mínima, 2= pouca inflamação, 3= média, 4= moderada e 5= presença de
numerosas células inflamatórias. Esta classificação baseou-se nos critérios
apresentados por Siddiqui e colaboradores e por Mo e colaboradores (Mo e cols.
2008; Siddiqui e cols. 2008).
4.2.5 Ensaio para detecção de peroxidase eosinofílica (EPO)
O ensaio de EPO foram realizados como previamente descrito por Strath e
colaboradores (Strath e cols. 1985). Resumidamente, 100 mg de cada pulmão foi
homogenizado em 1mL de PBS contendo anti-proteases (0.1mM PMSF, 0.1 mM
cloreto de benzetônio, 10 mM EDTA and 20 KI aprotinin A) e 0.05% Tween 20. As
amostras foram então centrifugadas por 15 minutos a 4°C a 7000rpm e
sobrenadante foi descartado e ao pellet foi adicionado 1,5 mL de NaCl 0,2% e
ressuspendido. Após 15 segundos foi adicionado 1,5 mL de solução NaCl 1,6%
glicose 5% e então homogeneizado. As amostras então foram centrifugadas 15 min
4°C a 7000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pellet foi ressuspendido em 1,9
mL de PBS com HTAB (0,5%), quando então sofreu o processo de congelamento e
descongelamento em nitrogênio líquido 3 vezes. Para a detecção de EPO, 75µL das
amostras foram colocadas em placas de 96 poços e em seguida foi adicionado 75
µL de solução reveladora (OPD 1,5mM; Sigma) em tampão Tris-HCL 0,075mM pH=8
acrescido de H2O2 6,6mM). As placas foram então incubadas a temperatura
ambiente por 10 minutos para o aparecimento da coloração desejada e a reação foi
interrompida pela adição de 50 µL por poço de H2SO4 5%. A absorbância foi medida
a 492 nm utilizando um leitor de placas de ELISA (BioRad, Hercules, CA).
4.2.6 Avaliação da freqüência de células TCD4+Foxp3+ e TCD4+IL-10+ em
células de pulmão dos camundongos asmáticos imunizados ou não com os
antígenos do S. mansoni
A marcação dos anticorpos de superfície e intra-celulares foi realizada segundo
protocolo descrito por Pacífico e colaboradores (Pacifico e cols. 2009). Os pulmões
57
dos camundongos foram removidos, e tratados com 100 U/mL de colagenase de
Clostridium histolyticum (Sigma) por 30 minutos a 37°C. Em seguida foi filtrado em
membrana com poro de 70 µm e as hemácias foram lisadas pela adição do tampão
ACK. As células foram lavadas duas vezes com RPMI (SIGMA) e ajustadas para 2 x
106 células por poço. As células foram cultivadas por 16 horas com OVA (25µg/mL)
a 37°C e 5% de CO2. Após esse período adicionou-se 1mg/mL de brefeldina A por
poço e a cultura foi novamente incubada por mais 4 horas. Antes da marcação com
os anticorpos as células foram bloqueadas com CD16/CD32 (Fc block, e-bioscience)
e então adicionados o anticorpo de superfície anti-mouse CD4-FITC (e-bioscience) e
os isotipos controles anti-mouse IgG1-FITC e IgG2a-PECy5 (BD-Biosciences) e
incubadas por 30 minutos a 4°C. Para marcação intra-celular, após incubação as
células foram lavadas com PBS e adicionado tampão de permeabilização (ebioscience) e então incubadas novamente por 30 minutos a 4°C. Em seguida, foram
adicionados os anticorpos para marcação intra-celular anti mouse Foxp3-biotinilado
e anti-mouse IL-10-PE (ambos e-biosciences). Incubou-se por 30 minutos a 4°C e,
após lavagem com PBS, adicionou-se a streptavidina ligada ao PECy5 para a
revelação do Foxp3-biotinilado. Após incubação por 30 minutos a 4°C e lavagem,
finalmente as células foram lavadas duas vezes com PBS, e ressuspendidas em
paraformaldeído a 2% para posterior aquisição no citômetro. A aquisição foi
realizada usando o FACSCan (Becton Dickinson, San Jose, CA). As análises foram
realizadas utilizando-se o programa de interface FlowJO.
Os linfócitos foram definidos por fluorescência inespecífica a partir da dispersão
frontal (FSC) e lateral (SSC) como parâmetros de tamanho e granulosidade celular,
respectivamente. De acordo com as características celulares, procedeu-se a
seleção da população de linfócitos, delimitando-se na região específica no gráfico:
região 1 (G1), correspondente a janela na área de linfócitos (Figura 5A). Portanto,
para a análise das características fenotípicas e expressão de Foxp3 e IL-10
intracelulares em linfócitos foi utilizada a região G1. As delimitações dos
quadrantes foram realizadas de acordo com os isotipos controles. As populações
duplo-positivas foram utilizadas para avaliação da frequência destas moléculas
(Figuras 5B e C).
58
(B)
(A)
(C
G1
Figura 5. Imagem densitométrica de fluorescência não específica, mostrando a
região de seleção da população de linfócitos, G1 (A) e de fluorescência específica,
selecionada na janela de linfócitos, após marcação com anticorpos fluorescentes
específicos para Foxp3 (B) e para IL-10 (C). O diagrama é representativo de um
experimento.
59
4.2.7 Análise dos dados
Os dados foram analisados através do software “GraphPad Prism” (GraphPad
software, San Diego, CA). Os dados referentes a celularidade no pulmão, níveis de
citocinas, IgE e EPO foram apresentados através de médias aritméticas e seus
respectivos desvios padrões. A Representação gráfica foi realizada utilizando-se o
programa “GraphPad Prism”, versão 3.03.
Testes não paramétricos foram utilizados para avaliar as diferenças nos níveis de
citocinas. Foi usado o teste de Kruskal-Wallis com pós-teste “Dunn’s Multiple
Comparasion” e foram considerados os resultados significantes entre o grupo
asmático não imunizado em relação aos demais grupos que receberam imunização
com os antígenos Sm22.6, PIII, Sm29 e IPSE ou em relação ao grupo PBS.
Todos os testes estatísticos de hipóteses foram bi-caudais, sendo considerados
estatisticamente significantes valores de p inferiores ao nível de significância préestabelecidos em 5%.
4.2.7 Considerações éticas
O estudo experimental foi desenvolvido na Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG), Este estudo teve a aprovação pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal (CETEA) da referida Universidade.
60
5. RESULTADOS
5.1 RESULTADOS REFERENTES AOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1, 2 E 3
5.1.1 Características demográficas dos indivíduos avaliados no estudo
A tabela II mostra as características demográficas e intensidade de infecção dos
indivíduos incluídos no estudo. Não houve diferença significativa em relação à idade
e gênero entre os grupos avaliados.
Tabela II. Características demográficas e intensidade de infecção dos indivíduos
infectados com S. mansoni e asmáticos não infectados.
Indivíduos
Idade, anosa
média ± DP
Gênero, % masculinob
IgG4 específico para SWAP
(DO)a
Media ± DP
IgE específica para SWAP (DO)a
média ± DP
Carga parasitária, ovos de S.
mansoni /g de fezesa
média ± DP
a
Grupo 1
(n=20)
Grupo 2
(n=22)
Valor de p
21 ± 8
19 ± 10
> 0,05
63,6
40,0
> 0,05
0,08 ± 0,10
0,40 ± 0,20
< 0,01
0,003 ± 0,01
0,11 ± 0,07
< 0,01
0
330 ± 298
< 0,001
Teste de Mann-Whitney; b Teste exato de Fisher
Grupo 1: Asmáticos sem infecções helmínticas vivendo fora da área endêmica
Grupo 2: Indivíduos infectados pelo S. mansoni vivendo na área endêmica
“Cut-off” (DO): IgG4: 0,18, IgE: 0,05
61
5.1.2 Produção de citocinas por CMSP de indivíduos cronicamente infectados
pelo S. mansoni
Inicialmente foi avaliada a produção de citocinas em culturas de CMSP de indivíduos
infectados pelo S. mansoni estimuladas com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29.
Como controles, as células foram também estimuladas com os antígenos solúveis do
verme adulto (SWAP) e do ovo (SEA) (Figura 6).
A figura 6A mostra os níveis de IL-10 produzidos por CMSP de indivíduos
cronicamente infectados pelo S. mansoni, estimuladas in vitro com os antígenos
Sm22.6, PIII e Sm29, além do SWAP e do SEA.
Foi observado que todos os antígenos avaliados neste trabalho induziram a
produção de IL-10. Em relação às culturas não estimuladas, nas culturas
estimuladas com SWAP, SEA, Sm22.6, PIII e Sm29 os níveis de IL-10 foram
significativamente maiores (389 ± 420 pg/mL, 340 ± 370 pg/mL, 387 ± 271 pg/mL,
853 ± 347 pg/mL e 499 ± 326 pg/mL, respectivamente) (Figura 6A).
A produção de IL-5 é mostrada na Figura 6B. Foi observado que nas culturas
estimuladas com o antígeno PIII os níveis de IL-5 foram significativamente maiores
que naquelas não estimuladas (865 ± 1286 pg/mL e 34 ± 14 pg/mL,
respectivamente; p<0,001). Não houve diferença significativa na produção de IL-5
nas culturas estimuladas com os antígenos Sm22.6 e Sm29 (61 ± 88 pg/mL e 34 ±
15,6 pg/mL, respectivamente), em relação às culturas não estimuladas (34 ± 14
pg/mL). Os níveis de IL-5 em culturas estimuladas com SWAP e com o SEA foram
respectivamente 1048 ± 1594 pg/mL e 608 ± 1171 pg/mL, sendo significativamente
maiores
em
relação
as
culturas
não
estimuladas
(p<0,001
e
p<0,05,
respectivamente).
A produção de IL-13 por CMSP estimuladas com os antígenos avaliados é mostrada
na figura 6C. Os níveis desta citocina diferiram significativamente nas culturas
estimuladas com os antígenos SWAP, SEA e PIII (655 ± 751 pg/mL, 351 ± 461
pg/mL e 665 ± 879 pg/mL, respectivamente), comparados às culturas sem estímulo
(134 ± 38 pg/mL).
62
A Figura 6D mostra a produção de IFN-γ por CMSP estimuladas com os antígenos
de S. mansoni. Nas culturas estimuladas com os antígenos Sm22.6 e Sm29 foram
observados níveis mais elevados desta citocina (1708 ± 1478 pg/mL e 870 ± 1242
pg/mL, respectivamente) quando comparados às culturas não estimuladas (97 ± 192
pg/mL; p<0,001 e p<0,05, respectivamente). Não houve diferença estatisticamente
significante quanto a produção de IFN-γ nas culturas estimuladas com o SWAP, SEA
e PIII em relação às culturas não estimuladas.
Como controle positivo, foram dosadas as citocinas IL-10, IL-5, IL-13 e IFN-γ em
CMSP estimuladas com PHA, sendo os valores de 731 ± 396 pg/mL, 2272 ± 1264
pg/mL, 6277 ± 627 pg/mL e 2268 ± 966 pg/mL, respectivamente.
63
(A)
(B)
1500
4000
1000
##
##
##
##
500
IL-5 (pg/mL)
IL-10 (pg/mL)
***
3000
##
2000
*
1000
0
0
(C)
(D)
2000
4000
***
1500
IFN-γ (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
##
1000
500
3000
2000
**
Sem estímulo
SWAP
SEA
Sm22.6
PIII
Sm29
1000
0
0
Figura 6. Níveis de IL-10 (A), IL-5 (B) e IL-13 (C) e IFN-γ (D) produzidos por células
mononucleares de sangue periférico de indivíduos cronicamente infectados pelo S.
mansoni estimuladas in vitro com os antígenos de S. mansoni. As concentrações
são expressas em pg/mL e os resultados em médias ± DP. *p<0,05, **p<0,01,
##
p<0,001 e ***p<0,0001 comparados com as culturas não estimuladas. Análise
estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste (Dunn’s Multiple
Comparasion Test).
64
5.1.3 Produção de citocinas por CMSP de asmáticos não infectados pelo
S. mansoni
As figuras 7A, 7B, 7C e 7D mostram os níveis de IL-10, IL-5, IL-13 e IFN-γ,
respectivamente produzidos por células mononucleares de sangue periférico de
indivíduos asmáticos não infectados pelo S. mansoni, estimulados in vitro pelos
antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 do S. mansoni, além do SWAP e do SEA. Os
antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 induziram níveis significativamente mais elevados de
IL-10 (451 ± 350 pg/mL, 364 ± 289 pg/mL e 712 ± 368 pg/mL, respectivamente),
quando comparados às culturas não estimuladas (16 ± 2 pg/mL; p<0,001 para todos
os três antígenos). A produção de IL-10 induzida pelo SWAP e SEA foram baixas,
sendo as médias 55 ± 67 pg/mL e 35 ± 46 pg/mL, respectivamente.
Os níveis de IL-5, IL-13 e IFN-γ não diferiram significativamente nas culturas
estimuladas com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29, quando comparadas àquelas
não estimuladas. Apenas nas culturas estimuladas com SEA os níveis de IL-5 foram
maiores que nas culturas não estimuladas (média= 63 ± 102 pg/mL e 15,6 ± 0,1
pg/mL, respectivamente; p<0,05).
Quando as células foram estimuladas com fitohemaglutinina (PHA) houve sempre
produção de citocinas, sendo as concentrações de 960 ± 297 pg/mL, 795 ± 22
pg/mL, 1843 ± 1180 pg/mL e 1549 ± 342 pg/mL para IL-10, IL-5, IL-13 e IFN-γ,
respectivamente.
65
(A)
(B)
250
1500
1000
***
##
500
IL-5 (pg/mL)
IL-10 (pg/mL)
200
***
150
*
100
50
0
0
(C)
(D)
250
250
Sem estímulo
SWAP
SEA
Sm22.6
PIII
Sm29
150
100
IFN-γ (pg/mL)
IL-13 (pg/mL)
200
200
150
100
50
50
0
0
Figura 7. Níveis de IL-10 (A), IL-5 (B) e IL-13 (C) e IFN-γ (D) produzidos por células
mononucleares de sangue periférico de asmáticos não infectados pelo S. mansoni,
estimuladas in vitro com os antígenos do parasita. As concentrações são expressas
em pg/mL e os resultados em médias ± DP. *p<0,05,
##
p<0,001 e ***p<0,0001
comparados com as culturas não estimuladas. Análise estatística realizada pelo
teste de Kruskal-Wallis com pós-teste (Dunn’s Multiple Comparasion Test).
66
5.1.4 Efeito da adição de antígenos do S. mansoni sobre a produção de IL-10 e
IL-5 induzida pelo alérgeno 1 do Dermatophagoides pteronyssinus (Der p1)
Desde que a citocina IL-10 tem sido associada a uma modulação da resposta
inflamatória na asma (Akdis e cols. 1998; Adachi e cols. 1999) foi avaliado o efeito
da adição dos antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 às culturas de CMSP de indivíduos
asmáticos estimuladas com o Der p1 sobre a produção de IL-10.
As Figuras 8A, 8B e 8C mostram o efeito da adição dos antígenos Sm22.6, PIII e
Sm29 na produção de IL-10 por CMSP de asmáticos não infectados estimuladas
com o Der p1.
Foi observado que a adição destes antígenos resultou no aumento significativo da
produção de IL-10 por estas células (p<0,0001 para todos os antígenos).
Adicionalmente, foi avaliado se estes antígenos teriam a habilidade de modular a
produção de IL-5 em culturas estimuladas pelo Der p1. Foi observado que a adição
dos antígenos Sm22.6 (Figura 9A) e Sm29 (Figura 9B) resultou em diminuição nos
níveis de IL-5 por células de asmáticos não infectados (p<0,05 em ambos). Nas
culturas adicionadas de PIII não houve diferença estatisticamente significante
quando comparadas àquelas estimuladas apenas com Der p1 (Figura 9C; p>0,05,
teste de Wilcoxon pareado).
67
(A)
(B)
2000
IL-10 (pg/mL)
IL-10 (pg/mL)
2000
1000
0
Der p1
Der p1+Sm22.6
1000
0
Der p1
Der p1+PIII
(C)
IL-10 (pg/mL)
2000
1000
0
Der p1
Der p1+Sm29
Figura 8. Níveis de IL-10 em culturas de CMSP de asmáticos não infectados
estimuladas com Der p1 na presença ou ausência dos antígenos Sm22.6 (A), PIII (B)
e Sm29 (C). Os níveis de IL-10 foram significativamente mais elevados na presença
dos antígenos de S. mansoni quando comparados às culturas estimuladas apenas
com Der p1 (p<0,0001 para todos os antígenos; teste de Wilcoxon pareado).
68
(A)
(B)
1000
IL-5 (pg/mL)
IL-5 (pg/mL)
1000
500
500
0
0
Der p1
Der p1
Der p1+Sm22.6
Der p1+PIII
(C)
IL-5 (pg/mL)
1000
500
0
Der p1
Der p1+Sm29
Figura 9. Níveis de IL-5 em culturas de CMSP de asmáticos não infectados
estimuladas com Der p1 na presença ou ausência dos antígenos Sm22.6 (A), PIII (B)
e Sm29 (C), respectivamente. Os níveis de IL-5 foram significativamente mais baixos
nas culturas estimuladas com os antígenos Sm22.6 e Sm29 quando comparados às
culturas estimuladas apenas com Der p1 (p<0,05 em ambos; teste de Wilcoxon
pareado).
69
5.1.5 Frequência de CMSP produtoras de IL-10 após estimulação in vitro com
os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29
Desde que os antígenos do S. mansoni avaliados neste estudo induziram a
produção da citocina modulatória IL-10 por células de indivíduos asmáticos não
infectados, investigamos a fonte celular produtora desta citocina (Tabela III).
Tabela III. Freqüência de células mononucleares de sangue periférico expressando
IL-10 intracelular em culturas não estimuladas e estimuladas com os antígenos
Sm22.6, PIII e Sm29 de indivíduos asmáticos não infectados pelo Schistosoma
mansoni.
Sm22.6
PIII
Sm29
CD3 CD4
IL-10 em CD3+CD4+
Sem
estímulo
27,1±5,7
0,20±0,06
30,8±10,1
0,37±0,21
29,7±7,5
0,25±0,15
29,5±7,8
*
0,47±0,2
CD3+CD8+
IL-10 em CD3+CD8+
14,7±6,3
0,54±0,26
17,4±6,5
0,52±0,39
13,9±6,3
0,40±0,21
12,9±6,0
0,68±0,45
CD14+
IL-10 em CD14+
16,7±6,0
0,64±0,56
7,3±3,6
*
3,09±1,87
13,6±4,4
0,89±0,76
10,7±2,9
0,94±0,27
CD19+
IL-10 em CD19+
2,8±1,6
0,92±0,82
2,9±1,2
1,95±1,70
2,0±0,9
0,85±0,99
2,0±0,8
2,25±1,90
CD4+CD25+
IL-10 em CD4+CD25+
4,5±1,0
2,75±0,81
4,6±1,5
*
4,68±1,85
3,4±1,2
1,26±0,63
3,1±1,0
3,57±1,26
CD4+GITR+
IL-10 em CD4+GITR+
0,71±0,31
3,27±2,88
0,83±0,54
7,38±4,90
0,55±0,42
4,30±4,17
0,69±0,37
*
14,7±10,4
CD4+CTLA-4+
IL-10 em CD4+CTLA-4+
2,4±0,59
1,22±0,58
2,4±0,8
3,85±3,55
2,4±1,3
1,56±0,87
2,6±1,0
*
3,42±2,43
+
+
*
*p<0,05 comparados com culturas não estimuladas, Teste de Kruskal-Wallis com pós-teste.
Os resultados são expressos em média do percental ± DP.
70
Nas culturas estimuladas com Sm22.6 observou-se maior freqüência de células
CD4+CD25+ expressando IL-10 em relação às culturas não estimuladas (p<0,05).
Embora tenha havido uma menor freqüência de células CD14+, a freqüência destas
células expressando IL-10 foi significativamente maior em relação às culturas não
estimuladas (p<0,05). Nas culturas estimuladas com PIII não houve diferença
significativa na freqüência de células expressando IL-10 em relação às culturas não
estimuladas.
Por outro lado, embora não tenha sido observada diferença significativa na
freqüência de células CD4+, CD4+GITR+ e CD4+CTLA4+ em culturas estimuladas
com Sm29 em relação às células não estimuladas, houve maior freqüência destas
células expressando IL-10 nas culturas estimuladas com este antígeno (p<0,05 para
todas as células).
71
5.2 RESULTADOS REFERENTES AOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS 4 E 5
5.2.1 Modulação da inflamação das vias aéreas em modelo murino de asma
induzido por OVA pela imunização com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29
O infiltrado celular nos pulmões dos camundongos asmáticos imunizados com os
antígenos Sm22.6, PIII, Sm29 e IPSE foi avaliado e os resultados mostrados na
figura 10. Foi observado um intenso infiltrado de células inflamatórias distribuídos
por toda a região peri-bronqueal dos camundongos asmáticos não imunizados, aqui
denominados OVA (Figura 10A). Comparativamente, nos grupos de camundongos
imunizados com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29, além do grupo tratado com PBS,
a migração de células inflamatórias para o pulmão foi significativamente menor que
no grupo não imunizado (Figuras 10B, C, D e F, respectivamente; p<0,01 para os
grupos Sm22.6 e Sm29 e p<0,001 para os grupos PIII e PBS, comparados ao grupo
OVA). Como esperado, o grupo imunizado com a proteína IPSE apresentou um
escore de inflamação que não diferiu significativamente do grupo OVA (Figura 10G).
72
Figura 10. Figura representativa de corte histológico de pulmão mostrando o
processo inflamatório das vias aéreas induzido por OVA nos camundongos BALB/c
imunizados ou não com os antígenos do S. mansoni. Intensa infiltração de células
inflamatórias pode ser vista no grupo de camundongos não imunizados (A). As
figuras B, C, D, E e F indicam cortes de pulmão representativos dos grupos
imunizados com Sm22.6, PIII, Sm29, IPSE e PBS, respectivamente. A figura G
mostra o escore do infiltrado inflamatório no pulmão, sendo 5 considerado o
processo inflamatório mais grave. **P<0,01 e
##
p<0,001 comparados com o grupo
OVA. Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste
(Dunn’s Multiple Comparasion Test).
73
5.2.2 Efeito da imunização com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 sobre a
celularidade do lavado brônquio-alveolar (BAL) dos camundongos dos
diferentes grupos
A tabela IV mostra a celularidade no lavado brônquio-alveolar dos camundongos dos
diferentes grupos. Os grupos de camundongos imunizados com Sm22.6, PIII e
Sm29 tiveram menores números de células totais e de eosinófilos no BAL quando
comparados ao grupo que não recebeu imunização (p<0,05). Nas demais
populações
celulares
não
houve
diferença
significativa
comparando-se
camundongos imunizados com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 com aqueles não
imunizados. O grupo IPSE não diferiu do grupo OVA em relação ao número de
células totais e aos tipos celulares avaliados.
74
Tabela IV. Número de células totais e contagem diferencial (x 105) no BAL dos
camundongos asmáticos não imunizados e imunizados com os diferentes antígenos
do S. mansoni
Grupos
Células
de camundongos
totais
PBS
10,2 ± 6,8*
OVA
Eosinófilos
Neutrófilos
Linfócitos
Macrófagos
0,1 ± 0,05
2,8 ± 1,3
3,9 ± 3,2
5,9 ± 3,6
69 ± 18
55 ± 19
2,2 ± 1,4
7,0 ± 2,2
4,0 ± 1,9
Sm22.6
30 ± 12*
12 ± 3*
3,9 ± 2,2
10,4 ± 7,4
7,7 ± 6,6
PIII
27 ± 8*
6,9 ± 5*
3,5 ± 1,0
10,1 ± 3,4
6,7 ± 3,2
Sm29
36 ± 6*
16 ± 3*
3,3 ± 1,8
14 ± 1,8
5,3 ± 0,8
IPSE
68 ± 21
52 ± 29
3,2 ± 1,9
7,5 ± 3
5,4 ± 2,0
#
Valores expressos em células/mm3 (média ± DP); #p<0,001 e *p<0,05 comparados
com o grupo OVA. Kruskal-Wallis com pós-teste (Dunn’s Multiple Comparasion
Test).
75
5.2.3
Mediadores
inflamatórios
em
camundongos
imunizados
e
não
imunizados com os antígenos do S. mansoni
Os níveis de IgE específica para OVA foram avaliados nos diferentes grupos de
camundongos (Figura 11A). Comparados ao grupo não imunizado, os camundongos
imunizados com Sm22.6, PIII e Sm29 apresentaram menores níveis de IgE
específica para OVA (p<0,05 para Sm22.6 e PIII, e p<0,01 para o grupo Sm29).
Inesperadamente, no grupo de camundongos imunizados com IPSE os níveis deste
isotipo de anticorpo também foram significativamente menores comparados ao grupo
não imunizado (p<0,05).
A peroxidase eosinofílica (EPO) é uma enzima produzida pelo eosinófilo e sua
produção está relacionada diretamente a presença e ativação destas células (Strath
e cols. 1985). A figura 11B mostra os níveis da enzima EPO no pulmão nos
diferentes grupos de camundongos asmáticos imunizados ou não com os antígenos
de S. mansoni. Camundongos imunizados com Sm22.6 e PIII apresentaram
menores níveis da enzima EPO quando comparados àqueles não imunizados. Nos
grupos Sm29 e IPSE não houve diferença estatisticamente significante comparados
ao grupo OVA.
76
IgE epecífica para OVA
(DO)
(A)
1.0
*
*
**
0.5
*
#
OVA
Sm22.6
PIII
Sm29
IPSE
PBS
0.0
(B)
EPO no pulmão (DO)
2
1
*
**
#
0
Figura 11. Níveis de IgE específica para OVA no soro (A) e de peroxidase
eosinofílica (EPO) no pulmão (B) dos camundongos não imunizados e imunizados
com os antígenos Sm22.6, PIII, Sm29, IPSE e PBS, respectivamente. Os resultados
são expressos em densidade ótica (DO) a 492 nm (média ± SD). *p<0,05, **p<0,01 e
#
p<0,005 em relação ao grupo OVA.
77
5.2.4 Perfil de citocinas no BAL nos diferentes grupos de camundongos
As figuras 12A, B, C e D mostram, respectivamente, os níveis de IL-4, IL-5, IL-10 e
IFN-γ, nos diferentes grupos de camundongos avaliados nesse estudo. Quando se
avaliou as citocinas IL-4 e IL-5, que mais contribuem para o processo inflamatório
envolvido na patogênese da asma, observou-se que, em relação ao grupo OVA, os
grupos Sm22.6 e PIII apresentaram menores níveis destas citocinas (Figuras 12A e
12B, respectivamente). Por outro lado, os níveis da citocina modulatória IL-10 foram
significativamente maiores no grupo que recebeu imunização com Sm22.6
comparado ao grupo não imunizado (Figura 12C; p<0,05), enquanto que não houve
diferença significativa nos níveis desta citocina nos grupos imunizados com PIII e
Sm29 em relação ao grupo OVA.
Desde que IFN-γ e TNF tem sido associados a um agravamento da lesão tecidual na
asma (Hansen e cols. 1999), os níveis destas citocinas foram também determinados.
Os níveis de IFN-γ foram menores no BAL do grupo Sm29, quando comparados ao
grupo OVA (Figura 12D; p<0,05). Não houve diferença significativa nos níveis desta
citocina entre os demais grupos em relação ao grupo OVA. Os níveis de TNF foram
menores que 50 pg/mL para todos os grupos avaliados (dados não mostrados).
Desde que apenas para o grupo Sm22.6 os níveis de IL-10 foram significativamente
maiores que o grupo OVA, foi avaliado se havia diferença na relação IL-10/IL-4 entre
os grupos (Figura 12E). Observou-se um aumento na relação IL-10/IL-4 no BAL dos
grupos imunizados com os antígenos Sm22.6 e PIII quando comparados aos
encontrados nos camundongos que não receberam imunização (Figura 12E; p<0,01
e p<0,05, respectivamente).
78
(A)
(B)
200
800
IL-5 (pg/mL)
IL-4 (pg/mL)
150
*
100
*
**
50
600
*
400
**
200
##
0
0
(C)
(D)
100
300
IFN-γ (pg/mL)
IL-10 (pg/mL)
150
*
50
200
100
*
0
0
(E)
IL-10 / IL-4
1.00
0.75
0.50
**
*
OVA
Sm22.6
PIII
Sm29
IPSE
PBS
0.25
0.00
Figura 12. Efeito da imunização com antígenos de S. mansoni sobre a produção de
citocinas no BAL. Níveis de IL-4, IL-5, IL-10 e IFN-γ nos diferentes grupos de
camundongos (Figuras A, B, C e D, respectivamente). A figura 12E mostra a relação
entre os níveis de IL-10 e IL-4 no BAL dos grupos avaliados. Os resultados são
expressos em média ± DP. *p<0,05, **p<0,01 e #p<0,005 comparados com o grupo
OVA.
79
5.2.5 Frequência (%) de células CD4+ no pulmão dos diferentes grupos de
camundongos, expressando a molécula Foxp3 e a citocina IL-10
Na tentativa de caracterizar melhor os mecanismos regulatórios envolvidos na
modulação da resposta inflamatória das vias aéreas pelos antígenos Sm22.6, PIII e
Sm29, uma vez que apenas no grupo de camundongos imunizados com Sm22.6
observou-se um aumento na produção de IL-10 no BAL, foi avaliada a freqüência de
células CD4+ expressando Foxp3 (Fgura 13A) e CD4+ expressando IL-10 (Figura
13B) nos diferentes grupos de camundongos. Nos camundongos imunizados com
Sm22.6 e PIII houve um aumento significativo na freqüência de células CD4+Foxp3+
quando comparados com os não imunizados (p<0,05 em ambos). No grupo que
recebeu o antígeno Sm29 houve uma tendência de maior freqüência destas células
em relação ao grupo OVA (p=0,06). Por outro lado, a frequência destas células
expressando IL-10 foi mais alta apenas no grupo imunizado com a proteína Sm22.6
em relação ao grupo OVA (Figura 13B; p<0,05).
80
(A)
Céluas TCD4+Foxp3+ (%)
6
4
*
*
2
OVA
Sm22.6
PIII
Sm29
IPSE
PBS
0
(B)
Células TCD4+IL-10+ (%)
0.75
*
0.50
0.25
0.00
Figura 13. Frequência de células TCD4+Foxp3+ (A) e TCD4+IL-10+ (B) em células do
pulmão de camundongos asmáticos imunizados ou não com os antígenos de S.
mansoni. Suspensões celulares isoladas de pulmões de camundongos foram
marcadas para expressão da molécula de superfície CD4 e para expressão
intracelular de Foxp3 e IL-10, e então analisadas por citometria de fluxo na região
dos linfócitos selecionados pelo gráfico de tamanho/granulosidade. Os resultados
são expressos em % (média ± DP). *p<0,05 em relação ao grupo OVA. Análise
estatística realizada pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste (Dunn’s Multiple
Comparasion Test).
81
6. DISCUSSÃO
Estudos vêm demonstrando que a infecção pelo Schistosoma mansoni previne a
atopia e a asma, tanto em humanos (Lynch e cols. 1993; Lynch e cols. 1998; Araujo
e cols. 2000; Nyan e cols. 2001; van den Biggelaar e cols. 2001; Cooper e cols.
2004), como em modelo experimental (Mangan e cols. 2006; Mo e cols. 2008;
Pacifico e cols. 2009). É bem documentada a habilidade da infecção pelo
Schistosoma sp ou de antígenos do parasita em induzir mecanismos modulatórios
da resposta imune, a exemplo da indução da produção de IL-10 (Gazzinelli e Colley
1992; Williams e cols. 1994; Araujo e cols. 1996; Finkelman e cols. 1997; Mwatha e
cols. 1998; Velupillai e cols. 2000), de células regulatórias, a exemplo das células
CD4+CD25+ (Yang e cols. 2007; Pacifico e cols. 2009) e da molécula inibitória da
ativação celular, o CTLA-4 (Zouain e cols. 2004; Oliveira e cols. 2009). Desde que
nestes estudos tem se avaliado o efeito da infecção pelo S. mansoni, da injeção do
ovo do parasita, ou ainda de antígenos brutos sobre o desenvolvimento da asma, o
objetivo deste trabalho foi avaliar se as proteínas recombinantes Sm22.6 e Sm29 e o
antígeno purificado PIII do S. mansoni possuem habilidade para modular a resposta
inflamatória na asma tanto in vitro por CMSP de indivíduos asmáticos, como em
modelo experimental de inflamação das vias aéreas induzida por OVA.
A escolha dos antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 para serem utilizados neste estudo
decorreu do fato de todos eles serem localizados na membrana e/ou tegumento do
verme adulto. Proteínas secretadas ou localizadas na superfície de Schistosoma sp,
que estão em íntimo contato com os tecidos do hospedeiro devem ser mais eficazes
em desencadear processos imunorregulatórios, possivelmente como mecanismo de
escape do sistema imune (Simpson e cols. 1990). A maioria dos antígenos
associados à membrana presentes no tegumento do S. mansoni não apresenta
reatividade cruzada com antígenos do ovo, os quais estão envolvidos na
imunopatologia associada a esta doença (Simpson e cols. 1990).
Dois dos antígenos utilizados neste trabalho, o Sm22.6 e o Sm29, são proteínas
recombinantes. Sabe-se que o uso das proteínas recombinantes em imunologia
representa uma importante ferramenta na pesquisa. Essas proteínas têm sido
utilizadas para estudos dos mecanismos de regulação da resposta imune do
82
hospedeiro e dos mecanismos envolvidos na resistência e susceptibilidade para
doenças parasitárias. Desde que tem sido demonstrada a habilidade dos parasitas
em interferir na resposta imune para outros antígenos não relacionados (Sabin e
cols. 1996; Malhotra e cols. 1999) tem sido grande o interesse em identificar
antígenos parasitários com potencial em modularem doenças não parasitárias, como
as doenças inflamatórias de base imunológica. Resultados interessantes de
prevenção destas doenças têm sido demonstrados (Weinstock e cols. 2002).
Os mecanismos responsáveis por esse fenômeno vêm sendo avaliados, contudo
sabe-se que este efeito modulador não depende do parasita vivo, haja vista que
antígenos oriundos desses patógenos possuem essa mesma propriedade
moduladora (Velupillai e cols. 2000). Os possíveis mecanismos para explicar a
modulação pelo S. mansoni incluem a indução da produção de células e moléculas
regulatórias por este parasita ou por frações antigênicas oriundas do mesmo
(Zaccone e cols. 2003; Yang e cols. 2007; Zheng e cols. 2008).
Por outro lado, tem sido discutido que na asma existe uma deficiência na produção
de IL-10. Estudos mostraram que células de indivíduos asmáticos produzem baixos
níveis de IL-10 (Borish e cols. 1996; Araujo e cols. 2004) e que a IL-10 tem papel
protetor na asma, sendo produzida por células de pacientes que se beneficiam com
o uso da imunoterapia (Akdis e cols. 1998; Akdis e Blaser 2001).
Existem outras evidências de que a IL-10 modula a resposta imune envolvida na
patogênese das doenças alérgicas (Grzych e cols. 1991; Hansen e cols. 1999; Brito
e cols. 2000; Velupillai e cols. 2000). Estes achados justificariam a busca da
identificação de antígenos de S. mansoni capazes de induzir a produção de IL-10 por
células de asmáticos, e de modular o processo inflamatório envolvido nesta doença.
No presente trabalho, os antígenos do S. mansoni, Sm22.6, PIII e Sm29 estimularam
a produção de IL-10, não apenas por células de indivíduos cronicamente infectados
pelo S. mansoni, mas de asmáticos não infectados, enquanto que os antígenos
SWAP e SEA só induziram elevada produção de IL-10 nos indivíduos infectados
pelo S. mansoni. Estudos têm mostrado a habilidade de antígenos de Schistosoma
sp induzirem a produção de citocinas por CMSP de indivíduos não infectados, sendo
inclusive maiores níveis quando comparados aos indivíduos infectados (van der Kleij
e cols. 2002). Similarmente aos nossos achados, este estudo mostrou que nos
83
indivíduos não infectados não houve resposta a estimulação pelo SEA. Estes
resultados dão suporte a outros que mostraram que a exposição crônica aos
antígenos parasitários levam a uma alteração na responsividade aos receptores tipo
toll (TLRs) (van der Kleij e cols. 2004). Um dos mecanismos para explicar essa
hiporresponsividade aos antígenos parasitários seria a proteção do hospedeiro
contra inflamação excessiva, garantindo a sobreviência do parasita.
Neste estudo foi demonstrado que os linfócitos TCD4+, monócitos e células
regulatórias foram as principais células envolvidas na expressão de IL-10 antígenoespecífica nos asmáticos não infectados pelo S. mansoni. Estes resultados estão de
acordo com estudos que demonstraram que na infecção pelo S. mansoni a IL-10 é
produzida tanto por células da resposta imune inata, quanto por células T
específicas, células regulatórias e por células B (Hesse e cols. 2004; Mangan e cols.
2004; Yang e cols. 2007). Adicionalmente, em estudos anteriores realizados pelo
nosso grupo, foi observado que as células CD14+ e CD4+CD25+ foram as principais
fontes produtoras de IL-10 por células de indivíduos asmáticos infectados pelo S.
mansoni estimuladas com o antígeno 1 do Dermatophagoides pteronyssinus (Der p1)
(Oliveira e cols. 2009). Estes dados sugerem que os antígenos avaliados neste
estudo induzem a produção de IL-10 por mecanismos semelhantes aos já descritos
para indivíduos infectados. Este é um achado bastante interessante, desde que o
aumento na freqüência de células CD4+CD25+ expressando IL-10 está associado ao
bom prognóstico da imunoterapia em indivíduos asmáticos (Francis e cols. 2003).
No presente estudo, foram observadas baixas produções de IL-5, IL-13, IFN-γ e TNF
in vitro em resposta aos antígenos de Sm22.6, PIII e Sm29, o que é uma vantagem,
considerando que estas citocinas estão relacionadas à patogenia da asma pelo
agravamento do processo inflamatório (Stephens e cols. 2002; Cho e cols. 2005;
Nakajima e Takatsu 2007).
Adicionalmente, testamos neste trabalho a hipótese de que os antígenos Sm22.6,
PIII e Sm29 seriam capazes de aumentar os níveis da citocina regulatória IL-10 e
diminuir os níveis de IL-5 por células de indivíduos asmáticos estimuladas com o Der
p1, desde que tem sido mostrado que células de indivíduos asmáticos produzem
baixos níveis de IL-10 e altos níveis de IL-5 quando estimuladas com este antígeno
(Araujo e cols. 2004). Nós observamos um aumento na produção de IL-10 quando os
84
antígenos do S. mansoni foram adicionados às culturas estimuladas com Der p1 e
uma diminuição nos níveis de IL-5 pela adição do Sm22.6 e do Sm29. O antígeno
PIII não foi capaz de modular a produção de IL-5 específica para Der p1, embora
tenha induzido a produção de IL-10 em culturas estimuladas com este antígeno.
Na segunda parte deste estudo foi avaliada a habilidade dos antígenos Sm22.6, PIII
e Sm29 em regularem a resposta inflamatória alérgica em modelo murino de
inflamação das vias aéreas induzida por OVA. Foi observada uma alta redução no
infiltrado peri-bronqueal e no número de células totais e eosinófilos no BAL nos
camundongos asmáticos imunizados com estes antígenos quando comparados aos
não imunizados ou imunizados com o IPSE.
A migração de leucócitos nas vias aéreas é uma das principais causas da
patogênese da asma e está associada diretamente ao agravamento do processo
inflamatório (Busse e Lemanske 2001). Dentre os leucócitos, os eosinófilos são as
células que merecem um papel de destaque neste processo (Koller e cols. 1995).
Estas células podem secretar citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-12 e IL-13),
modulatórias (TGF-β) e quimiocinas (RANTES e eotaxina-1), além de mediadores
lipídicos e leucotrienos. Estas moléculas têm efeitos pró-inflamatórios, incluindo
modulação positiva dos sistemas de adesão, regulação do tráfego celular, ativação e
regulação da permeabilidade vascular, secreção de muco e constricção da
musculatura lisa. Além disso, os eosinófilos são considerados as principais células
efetoras nos processos de lesão tecidual, através da liberação de grânulos tóxicos,
proteases e mediadores lipídicos (Gleich 1990; Gleich e cols. 1993).
Nós observamos também que houve uma redução significativa nos níveis de IgE
específica para OVA em todos os grupos de camundongos imunizados com as
proteínas do S. mansoni, enquanto os níveis de EPO foram menores nos grupos
Sm22.6 e PIII quando comparados ao grupo que não foi imunizado. A EPO é uma
proteína catiônica que representa 25% dos grânulos dos eosinófilos. Ela está
relacionada à ativação destas células, tendo um papel importante na patologia da
asma, como revisado por Rothenberg (Rothenberg e Hogan 2006).
Os antígenos Sm22.6 e PIII tiveram também um importante efeito modulatório sobre
a produção das citocinas do tipo Th2, IL-4 e IL-5, evidenciado pelos baixos níveis
85
destas citocinas no BAL dos camundongos imunizados, quando comparados aos
não imunizados. A IL-5 tem um papel importante no recrutamento dos eosinófilos
para as vias aéreas, sendo o processo de maturação destas células na medula
ósseas até sua ativação e infiltração nos tecidos dependente de IL-5 (Foster e cols.
1996). Por outro lado, a IL-4 age nas células B induzindo a síntese de IgE (de Vries
e Yssel 1996). Este anticorpo participa na patogênese da asma pela ligação aos
mastócitos, basófilos e eosinófilos, levando a liberação de mediadores inflamatórios
quando em contato com o alérgeno. Neste trabalho foi observado menores níveis de
IgE alérgeno-específica no grupo de camundongos imunizados com os antígenos do
S. mansoni comparados aos não imunizados. Esta é uma evidência adicional que
estes antígenos são hábeis em prevenir a inflamação alérgica mediada pela
resposta Th2.
Em camundongos imunizados com Sm29, a despeito do fato de que houve uma
redução no número de células inflamatórias, eosinófilos e IgE específica para OVA,
comparados com os camundongos não imunizados, a diminuição dos níveis de IL-4
e IL-5 não alcançaram significância estatística. Esta diminuição, porém, pode ter sido
efetiva em reduzir a produção de IgE e o crescimento de eosinófilos ou mesmo o seu
recrutamento, sem entretanto, ser suficiente para alterar a atividade da EPO no
pulmão.
Neste estudo utilizou-se o antígeno presente no ovo do S. mansoni, o IPSE como
controle positivo, desde que este antígeno é um indutor da produção de citocinas do
tipo Th2 na esquistossomose (Schramm e cols. 2003; Schramm e cols. 2007). Como
esperado, em camundongos imunizados com IPSE os parâmetros Th2, como o
número de eosinófilos, níveis de EPO, IL-4 e IL-5 foram comparáveis aos
camundongos asmáticos não imunizados, entretanto, inexplicavelmente, no grupo
IPSE houve uma redução nos níveis de IgE específica para OVA.
Além das citocinas do tipo Th2, avaliamos também neste estudo a produção de
citocinas Th1, IFN-γ e pró-inflamatória TNF, além da citocina regulatória IL-10.
Observamos que os níveis de IFN-γ e TNF no BAL dos camundongos imunizados
não diferiram significativamente em relação aos não imunizados. Este dado reforça a
idéia que a modulação da resposta do tipo Th2 pelos antígenos do parasita não foi
86
devido a um aumento na resposta do tipo Th1, como também demonstrado por nós
no estudo da resposta imune induzida por estes antígenos em células de asmáticos
in vitro. Este é um importante achado, desde que, como anteriormente citado,
citocinas do tipo Th1 podem contribuir para o processo inflamatório na asma
(Stephens e cols. 2002). Outros estudos têm demonstrado que as infecções
helmínticas ou antígenos destes parasitas são capazes de regularem a resposta
alérgica através da ação de citocinas e células regulatórias não envolvendo o
balanço Th1/Th2 (Itami e cols. 2005; Pacifico e cols. 2009). Com relação a citocina
regulatória IL-10, nós observamos que os níveis desta citocina no BAL dos
camundongos imunizados com Sm22.6 foram mais elevados que no grupo OVA. A
relação IL-10/IL-4 entretanto, foi mais alta no grupo imunizado com Sm22.6 e
também no grupo imunizado com PIII, em relação ao grupo não imunizado. É
provável que a IL-10 não seja o único mecanismo envolvido na modulação da
inflamação alérgica em resposta à imunização com os antígenos de S. mansoni,
desde que a supressão da migração de célula inflamatórias nas vias aéreas e da
produção de IgE foi vista em camundongos imunizados com Sm29 comparados aos
não imunizados, a despeito dos baixos níveis de IL-10 no BAL destes camundongos.
A possibilidade de que existem outros mediadores modulatórios agindo por uma via
independente de IL-10 é apoiada por estudo prévio do nosso grupo que mostrou que
células T regulatórias protegem camundongos infectados pelo S. mansoni contra
inflamação das vias aéreas induzida por OVA através de um mecanismo
independente de IL-10 (Pacifico e cols. 2009). Outros autores mostraram que a
infecção com o helminto Nippostrongylus brasiliensis suprimiu a inflamação das vias
aéreas de uma maneira dependente ou independente de IL-10 (Wohlleben e cols.
2004; Trujillo-Vargas e cols. 2007). Estes estudos observaram que, mesmo para um
único parasita, diferentes mecanismos modulatórios da resposta alérgica podem
existir.
No presente estudo, a frequência de células TCD4+Foxp3+ foi significativamente
maior nos grupos Sm22.6 e PIII, comparados ao grupo OVA. Houve também uma
tendência a um aumento na frequência destas células no grupo dos camundongos
asmáticos imunizados com a proteína Sm29, em relação ao grupo que não recebeu
imunização. Entretanto, apenas em camundongos imunizados com Sm22.6 houve
87
um aumento significativo nos níveis de células TCD4+ expressando IL-10,
comparados aos camundongos não imunizados. Corroborando com estes dados,
altos níveis de IL-10 foram observados apenas no BAL dos camundongos
imunizados com Sm22.6 em relação aos não imunizados. É possível que as células
TCD4+Foxp3+ ajam através do contato célula-célula para inibirem os mediadores
inflamatórios Th2 nos outros grupos de camundongos. No grupo Sm29 não foi
observado um aumento na produção de IL-10 no BAL e na freqüência de células
TCD4+Foxp3+, ao passo que houve uma redução na celularidade pulmonar, no
número de células totais e de eosinófilos no pulmão e nos níveis de IgE específica
para OVA, o que não pode ser explicado pelos parâmetros regulatórios avaliados
neste estudo.
Certamente existem outros mecanismos, além da IL-10 e da expressão de células
CD4+Foxp3+ envolvidas na modulação da asma pelos antígenos do S. mansoni.
Estes mecanismos podem incluir a regulação das vias de co-estimulação de
linfócitos T bem conhecidas, como as interações CD80/CD86:CD28/CTLA4 e
CD40:CD40L.
Outras
moléculas
co-estimulatórias
também
poderiam
estar
envolvidas como segundo sinal de ativação/modulação das células T, a exemplo da
via envolvendo ICOS:ICOSL, PD-1:PD-L1/PD-L2 e OX40:OX40L, uma vez que tem
sido demonstrado a participação destas moléculas no controle das doenças
alérgicas, como revisado por Kroczek e Hamelmann (Kroczek e Hamelmann 2005).
Neste estudo foram identificados antígenos do S.manoni capazes de modular a
resposta inflamatória alérgica na asma. Adicionalmente, foram identificados alguns
mecanismos envolvidos nesta modulação. Estes resultados portanto, poderão
fornecer subsídios importantes para novos estudos e para o desenvolvimento de
estratégias para prevenção e/ou tratamento das doenças alérgicas.
88
7. RESUMO DOS RESULTADOS
1. Os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 avaliados neste estudo induziram a produção
in vitro de altos níveis de IL-10 e baixos níveis de IL-5, IFN-γ, TNF e IL-13 por CMSP
de indivíduos asmáticos não infectados pelo S. mansoni;
2. A principal fonte produtora de IL-10 foram as células TCD4+CD25+ e os
monócitos;
3. A adição de Sm22.6, PIII e Sm29 às culturas estimuladas com Der p1 levaram a
um aumento nos níveis de IL-10, bem como a adição do Sm22.6 e Sm29 levaram a
uma redução nos níveis de IL-5 pelas células estimuladas com Der p1.
4. Em modelo experimental de inflamação das vias aéreas induzida por OVA a
imunização com os antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 reduziu o número de células
totais e de eosinófilos no BAL, e o infiltrado de células inflamatórias na região peribronqueal.
5. A imunização com estes os antígenos resultou em redução dos níveis séricos de
IgE específica para OVA, e a imunização com Sm22.6 e PIII em redução dos níveis
de peroxidase eosinofílica no pulmão dos camundongos imunizados, comparados
aos não imunizados.
6. Em relação aos níveis de citocinas no BAL, os camundongos imunizados com os
antígenos Sm22.6 e PIII apresentaram menores níveis de IL-4 e IL-5 e o grupo
Sm29 menor produção de IFN-γ em relação ao grupo que não recebeu imunização.
7. Apenas nos camundongos imunizados com o antígeno Sm22.6 foram observados
níveis mais elevados de IL-10 no BAL e de células TCD4+ expressando esta citocina,
entretanto, a relação IL-10/IL-4 também foi elevada no grupo que recebeu o
antígeno PIII. A freqüência de células TCD4+Foxp3+ foi também significativamente
maior nos grupos Sm22.6 e PIII, comparados ao grupo não imunizado.
89
8. CONCLUSÕES
Os antígenos do S. mansoni avaliados neste estudo, Sm22.6, PIII e Sm29 possuem
a habilidade para modularem a resposta inflamatória envolvida na patogênese da
asma in vitro, e em modelo experimental de asma induzido por OVA, possuindo
potencial para imunoterapia das doenças alérgicas.
90
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102
10. ANEXOS
A. SUBMISSÃO E APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA
103
104
105
B. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E PRÉ-ESCLARECIDO (TCLPE)
106
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PARTICIPAR DO
ESTUDO
Nome do Projeto: Modulação da Resposta Imune Alérgica por Antígenos de
Schistosoma mansoni
Investigador Principal: Maria Ilma Andrade Santos Araújo, Médica, Serviço
Imunologia, Hospital Universitário Prof. Edgard Santos – UFBA, Rua João da Botas
s/n, Canela, CEP 40.110-160, Salvador-BA
Nome do Paciente:_________________________________________________
Convite e Objetivo:
Você está sendo convidado(a) a participar de um estudo que tem como objetivo
avaliar a associação entre a asma e a infecção por helmintos.
Esta participação implica na sua concordância em submeter-se, periodicamente,
durante um ano, aproximadamente, a exames para determinar a presença de alergia
e parasitoses, que consistem em: responder a um questionário com perguntas sobre
alergias, submeter-se a exames clínicos, além da coleta de amostras de sangue e
de amostras de fezes.
Além das informações aqui presentes você pode perguntar tudo sobre o estudo ao
seu médico.
Participação Voluntária:
A sua participação no estudo é voluntária e você estará contribuindo para o melhor
entendimento da sua doença. Você é livre para recusar a participar do estudo, ou se
retirar em qualquer época após o seu início sem afetar ou prejudicar a qualidade e a
disponibilidade da assistência médica que lhe será prestada.
Finalidade do estudo:
Este estudo tem a finalidade de avaliar a influência da verminose no
desenvolvimento de alergia e asma.
Procedimentos:
Caso concorde em participar do estudo, você receberá os frascos coletores de
fezes, que deverão ser devolvidos, para que possamos realizar os exames
parasitológicos. Em seguida, você doará 20mL de sangue venoso, que será coletado
por profissional capacitado para tal, com o auxílio de seringas e agulhas
descartáveis.
107
Duração do Estudo:
Após a assinatura do termo de consentimento, sua participação no estudo terá uma
duração máxima prevista de 6 meses.
Confidencialidade:
Qualquer informação obtida durante este estudo será confidencial sendo apenas
compartilhada com outros membros da equipe. Os resultados serão divulgados na
forma de comunicação científica, não permitindo a identificação individual dos
participantes.
Análise dos Riscos e Benefícios:
A retirada de sangue venoso é um procediemento médico de rotina e, em casos
raros pode provocar dor leve e sangramento após retirada da agulha. Caso isso
aconteça, todos os cuidados serão tomados por profissionais devidamente
habilitados.
Retorno dos Benefícios para o Sujeito e para a Sociedade:
Estudos que contribuem para identificação dos mecanismos envolvidos na proteção
da asma pela infecção com parasitas, podem levar ao desenvolvimento de novos
tratamentos para alergia.
As pessoas que se submeterem aos exames receberão, se desejarem, os resultados
dos mesmos. No caso de detectarmos a presença de parasitas intestinais, você será
tratado gratuitamente e, no caso de observarmos a presença de doença alérgica,
você receberá instruções para o tratamento da mesma.
Custos:
Você não terá custos com a participação no estudo e nem receberá pagamento por
sua participação.
Esclarecimentos:
Qualquer dúvida que você tenha sobre o que está escrito neste consentimento ou
sobre os procedimentos que constam desse projeto de pesquisa, poderá entrar em
contato com Dra. Maria Ilma Araujo, coordenadora do projeto, médica do Serviço de
Imunologia do HUPES-UFBA, João das Botas, s/n – Canela, telefone (071) 32377353, ou com o Comitê de Ética em Pesquisa da Maternidade Climério de Oliveira,
na pessoa do Dr. Antônio Barata, no endereço Rua Padre Feijó, 240 – Canela,
telefone (071) 3203-2740.
108
Consentimento:
Se você leu o consentimento livre e esclarecido ou este lhe foi explicado e você
concorda em participar voluntariamente deste estudo, favor assinar o nome abaixo.
A você será entregue uma cópia deste formulário.
__________________________________
Assinatura do Participante ou Responsável
_________________________________
Assinatura do Pesquisador
Local:_________________________ Data_____/_____/_____ e Hora:________
109
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA MENORES DE
IDADE (MENORES DE 18 ANOS)
Projeto: Modulação da Resposta Imune Alérgica por Antígenos de Schistosoma
mansoni.
Investigador Principal : Maria Ilma Andrade Santos Araújo, Hospital Universitário
Prof. Edgard Santos, Rua João das Botas s/n, Canela, 40110-160, Salvador-BahiaBrazil.
Comitê de Ética: Maternidade Climério de Oliveira/UFBA-Rua Padre Feijó 240,
Ambulatório Magalhães Neto, 30 andar, Canela-Salvador-Bahia. Tel: 71-3203-2740
Nome do paciente: ______________________________________________
Número de Identificação no Projeto: _________________________________
Convite e objetivo: Você está sendo convidado a participar de um estudo científico.
O propósito deste estudo é avaliar a associação entre a asma e a infecção por
helmintos. A principal doença que nós estudaremos será a alergia respiratória, mas
nós daremos atenção a outras infecções.
Nós perguntaremos a você sobre a sua saúde. Um médico fará exame físico em
você. Isto não causará dor em você. Em seguida iremos solicitar amostra de fezes
para avaliar a possibilidade de estar com alguma verminose. Então, nós tiraremos
um pouco de sangue (cerca de duas colheres de sopa ou uma xícara de café
pequena) de seu braço usando uma seringa e agulhas descartáveis para realizar
alguns exames que ajudarão a explicar a doença. Nós esperamos através deste
estudo esclarecer mais sobre a doença, entendê-la e assim poderemos preveni-la
no futuro.
Você pode não participar deste estudo. Se você quer nos ajudar, por favor, assine
ou coloque sua impressão digital abaixo.
___________________________________________________________________
Assinatura ou impressão do paciente
Data
_________________________________________________________________
Assinatura ou impressão do responsável
Data
________________________________________________________________
Testemunha
Data
110
COMPROMISSO DO PESQUISADOR
Discuti as questões acima apresentadas com os participantes do estudo ou
com o seu representante legalmente autorizado.É minha opinião que o indivíduo
entende os riscos, benefícios e direitos relacionados a este projeto.
______________________________________
Assinatura do pesquisador
____________
Data
111
C. PUBLICAÇÕES: 2006 - 2009
1. CARDOSO, L.S., OLIVEIRA, S.C., GÓES, A.M., PACÍFICO, L.G., MARINHO,
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