Monografia final - cabeçalho e rodapé

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS–GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
SÍNTESE E ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DE NOVAS
TIAZOLIDINADIONAS
IANE BEZERRA VASCONCELOS SANTOS
RECIFE
2009
Iane Bezerra Vasconcelos Santos
SÍNTESE E ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DE NOVAS
TIAZOLIDINADIONAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação
em
Ciências
Biológicas,
como parte dos requisitos para obtenção do
Grau de Mestre em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta
Co-orientadora: Profa. Dra. Teresinha Gonçalves da Silva
RECIFE
2009
Santos, Iane Bezerra Vasconcelos
Síntese e atividades antiinflamatória e antinociceptiva de novas
tiazolidinadionas / Iane Bezerra Vasconcelos Santos. – Recife: O Autor,
2009.
107 folhas: fig.; tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCB. Departamento de Ciências Biológicas, 2009.
Inclui bibliografia e anexo.
1. Tiazolidinas 2. Atividade antiinflamatória 3. Nocicepção 4.
Inflamação I Título.
615.276
CDU (2.ed.)
UFPE
iii
DEDICATÓRIA
A Minha família,
a minha mãe Mercês,
ao meu pai Ivon, in memorian
a minha irmã Soraide
aos meus irmãos Igo e Samuel
as minhas sobrinhas Fernanda e Mayara
e ao meu esposo Marcos.
Com vocês aprendi
a sonhar alto (Marcos)
a sorrir com meus acertos e rir de meus erros (Soraide)
a levantar após cada queda e continuar (Mãe)
a acreditar num futuro melhor (Mãe)
a aguardar o tempo de cada um (Pai)
a respeitar a vida em suas mais diversas formas (Soraide)
a ter uma enorme firmeza de caráter e (Mãe, pai, Marcos e Soraide)
a ter compaixão com os outros, principalmente
comigo, nesse louco redemoinho que chamamos
viver. (Mãe, pai, Soraide, Marcos, Fernanda, Mayara, Igo e Samuel)
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, inteligência suprema e constante em nossas vidas, com o qual podemos
contar em todas as ocasiões;
Fatalmente corro o risco de esquecer alguém que contribuiu de alguma forma para
meu aprendizado nesse período de minha vida. Por isso, se ao final desta longa
lista, você não se encontrar, por favor, me perdoe e receba meu sincero
agradecimento no fundo de seu coração;
Ao meu orientador, professor Ivan da Rocha Pitta, do Departamento de Antibióticos
da Universidade Federal de Pernambuco, pela orientação deste trabalho e pela
oportunidade da minha integração ao GPIT (Grupo de Pesquisa em Inovação
Terapêutica);
A minha co-orientadora, professora Teresinha Gonçalves da Silva, também do
Departamento da Universidade Federal de Pernambuco, pelo incentivo, amizade e
por transmitir tanta sabedoria e conhecimento com imensa humildade. Minha imensa
gratidão;
As professoras Suely Lins Galdino e Maria do Carmo Alves de Lima, do Laboratório
de Planejamento e Síntese de Fármacos - LPSF/GPIT do Departamento de
Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, pela credibilidade da minha
presença na grande e eficiente equipe do referido estabelecimento, como estudante
desde a iniciação científica, propiciando o desenvolvimento das atividades científicas
e, conseqüente, realização deste trabalho;
A Flávia De Toni Uchôa, pelos bons momentos de aprendizado, amizade e por ter
aceitado julgar este trabalho;
A todos os amigos e companheiros do Departamento de Antibióticos da
Universidade Federal de Pernambuco, que se fizeram presentes e contribuíram com
v
os momentos alegres e tensos que tanto incentivaram a minha permanência no
grupo e o apoio ao desenvolvimento desta pós-graduação;
Aos meus queridos amigos e companheiros, do Laboratório de Bioensaios para
Pesquisa de Fármacos: Maria Juliana, Thiago Lins, Diana, Ingrid, Anne, Sílvia,
Tatiane, Rodrigo, Katariny, Sirlene, Marília, Rafaella, Larissa, Clarissa e Clayton,
pelos momentos agradáveis de aprendizado, trocas de experiências e de muito
companheirismo;
Aos meus amigos de turma do mestrado, Maria Juliana, Thiago Lins e Flávia
Lucena, pela troca de conhecimentos, pelo companheirismo e pela amizade;
Aos meus amigos da graduação, da Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Paulo, Ana Roberta e Patrícia pela contínua satisfação em tê-los como amigos e de
desfrutar dos momentos sábios que vivenciamos;
Aos animais de laboratório, com um pedido de desculpas, mas são verdadeiros
solidários;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, pela
concessão da bolsa de estudos e auxílio financeiro;
Ao meu esposo, Marcos, pelo seu amor, por me entender tão bem, por me apoiar e
incentivar sempre. Te amo!
A toda minha família.
vi
“Sem a curiosidade que me move, que me inquieta, que me insere na busca,
não aprendo nem ensino”
Paulo Freire
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
ix
LISTA DE ESQUEMAS
x
LISTA DE TABELAS
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
xii
RESUMO
xv
ABSTRACT
xvi
1 - Introdução
17
2 - Revisão da literatura
20
2.1 - Processo inflamatório
20
2.1.1 - Atuação de neutrófilos na resposta inflamatória
24
2.1.2 - Atuação de monócitos/macrófagos na resposta inflamatória
26
2.1.3 - Mediadores químicos da resposta inflamatória
27
2.1.3.1 - Citocinas e quimiocinas
27
2.1.3.2 - Óxido nítrico (NO)
30
2.2 – Agentes Antiinflamatórios
32
2.2.1 – Agentes antiinflamatórios esteroidais
32
2.2.2 – Agentes antiinflamatórios não-esteroidais - AINEs
33
2.3 - Mecanismos da transmissão da dor
35
2.4 - PPARγ - Um modulador da expressão gênica inflamatória
37
2.5 - Tiazolidinadionas (TZDs)
39
3 - Objetivos
42
3.1 - Geral
42
3.2 - Específicos
42
4 - Parte química
43
4.1 - Reagentes e solventes
43
4.2 - Metodologia – Diagrama de síntese
43
4.2.1 - Síntese da tiazolidina-2,4-diona
44
4.2.2 - Síntese da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona
44
4.2.3 - Método geral para a obtenção dos derivados 3-benzil-5benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas
4.3- Análise Espectroscópica dos Derivados 3-benzil-5-benzilideno-
45
47
viii
tiazolidina-2,4-dionas através do método de espectroscopia de
infravermelho.
4.4- Análise Espectroscópica dos Derivados 3-benzil-5-benzilideno-
48
tiazolidina-2,4-dionas através do método de espectroscopia de
1
ressonância
magnética
nuclear
de
hidrogênio
-
RMN H
(δ
ppm/DMSO-d6).
5- Parte biológica
49
5.1 - Animais
49
5.2 - Substâncias utilizadas
50
5.3 - Delineamento experimental
50
5.3.1 - Toxicidade aguda
50
5.3.2 - Atividade antiinflamatória
50
5.3.3 - Atividade antinociceptiva
51
5.4 - Protocolos experimentais
51
5.4.1 - Toxicidade aguda
52
5.4.2 - Permeabilidade vascular induzida por ácido acético
52
5.4.3 - Avaliação da atividade antiinflamatória – peritonite induzida por
53
tioglicolato
5.4.4 - Avaliação da atividade antiinflamatória – peritonite induzida por
54
zimosan
5.4.5
-
Avaliação
da
atividade
antinociceptiva
–
contorções
55
5.4.6 - Avaliação da atividade antinociceptiva – indução do efeito
55
abdominais pelo ácido acético
nociceptivo por formalina
5.4.7 – Análise estatística
56
6 - Resultados e discussão
57
7 - Conclusões
66
8 - Referências bibliográficas
67
9 - ANEXOS
86
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Resposta inflamatória composta das suas possíveis fases de
22
desenvolvimento.
FIGURA 2: Tempo de ação dos mediadores químicos da 1ª fase da
inflamação.
FIGURA 3: Diferenciação, liberação, recrutamento e ativação de
23
26
neutrófilos.
FIGURA 4: Citocinas e diferenciação de células T helper.
28
FIGURA 5: Mecanismo de ação do TNFα na disfunção endotelial.
29
FIGURA 6: Fármacos antiinflamatórios não esteroidais: (a) Paracetamol,
33
(b) Fenilbutazona, (c) Indometacina, (d) Ibuprofeno.
FIGURA 7: Mecanismo da ciclooxigenase.
34
FIGURA 8: Transmissão dos estímulos dolorosos (SNC).
36
FIGURA 9: Alvos celulares e moleculares para ações antiinflamatórias
38
dos PPARs.
FIGURA 10: Atividades transcricionais dos PPARs: (a) transativação, (b)
39
transrepressão e (c) repressão.
FIGURA 11: Estruturas químicas de agonistas PPARγ.
40
FIGURA 12: Derivados 3-benzil-5-benzilideno-tiazolidina-2,4-diona; a –
45
LPSF/GQ-104; b – LPSF/GQ-158; c - LPSF/GQ-159; d – LPSF/GQ-130.
FIGURA 13: Análise da permeabilidade vascular: Grupo dos animais
53
experimentais (A); Pré-tratamento com os LPSF/GQs (B); Injeção do azul
de Evans (i.v) no plexo retro-orbital (C); Administração do ácido acético,
via intraperitoneal (D); Coleta do exsudato (E); Medida da permeabilidade
através de teste colorimétrico, no aparelho ELISA.
FIGURA 14: Coleta de leucócitos peritoneais em camundongos: Grupo
54
dos animais experimentais (A); Pré-tratamento com os LPSF/GQs (B);
Indução da peritonite (tioglicolato ou zymosan) (C); Injeção da solução de
EDTA na cavidade abdominal(D); Coleta do exsudato (E); Contagem dos
leucócitos.
FIGURA 15: Efeito dos novos derivados tiazolidínicos na permeabilidade
vascular induzida por ácido acético. (Todos os efeitos foram significativos,
para mais ou para menos, em relação ao grupo controle.
62
x
LISTA DE ESQUEMAS
ESQUEMA 01: Diagrama de síntese.
44
xi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Sinais cardinais da inflamação: função dos mediadores
20
eicosanóides.
TABELA 2: Quadro comparativo entre a inflamação aguda e
23
crônica.
TABELA 3: Freqüências de absorção no infravermelho, em cm-1, dos
derivados 3-benzil-5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas.
TABELA 4: Deslocamentos químicos (δ) em ppm dos derivados 3-benzil-
47
48
5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas.
TABELA 5: Efeitos dos novos derivados tiazolidínicos sobre a migração
celular induzida por Tioglicolato de sódio a 3%.
TABELA 6: Estudo dose-resposta do derivado tiazolidínico LPSF/GQ-130
58
59
na peritonite induzida por tioglicolato 3%.
TABELA 7: Estudo dose-resposta do derivado tiazolidínico LPSF/GQ-130
60
na peritonite induzida por zimosan.
TABELA 8: Efeito dos compostos LPSF/GQs (130 e 159) sobre as
63
contorções induzidas por ácido acético.
TABELA 9: Efeito do composto LPSF/GQ-130 sobre a nocicepção
induzida por formalina.
64
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGE
Produto de glicosilação avançada (advanced glycosylation end
products)
AR
Artrite reumatóide
0
Graus Celsius
C3a
Anafilotoxina 3a
C5a
Anafilotoxina 5a
COX -1
Ciclooxigenase-1
COX -2
Ciclooxigenase-2
CGRP
Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
CC
Classe de quimiocina CC
CX3C
Classe de quimiocina CX3C
CXC
Classe de quimiocina CXC
DNA
Ácido desoxirribonucléico
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
ED50
Concentração da droga efetiva para 50% dos indivíduos
EPP
Fenilpropionato de etila
GI
Gastrointestinal
GPIT
Grupo de Pesquisa em Inovação Terapêutica
HETE
Ácido hidroxieicosatetranóico
IASP
Associação Internacional de Estudos da Dor
ICAM-1
Molécula de adesão intercelular-1
IFNγ
Interferon gama
IL
Interleucina
iNOS
Óxido nítrico sintase induzida
i.p
Via intraperitoneal
Kg
Kilograma
LDL
Lipoproteína de baixa densidade
LOX
Lipoxigenase
LPSF
Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos
LPS
Lipopolissacarídeo bacteriano
LTB4
Leucotrienos B4
C
xiii
LTC4
Leucotrienos C4
LTD4
Leucotrienos D4
LTF4
Leucotrienos F4
LT
Linfotoxina
LXA4
Lipoxina A4
LXB4
Lipoxina B4
MCP-1
Proteína quimioatraente de monócitos-1
mg
Miligrama
ml
Mililitro
MIP-1α
Proteína inflamatória-1α dos macrófagos
MMP-9
MSD
Metaloproteinase - 9
Merck Sharp & Dohme
NFkB
Fator nuclear kappa-B
nm
Nanômetro
NO
Óxido nítrico
NOS
Óxido nítrico sintase
NSAIDs
Drogas antiinflamatórias não-esteróides
OVA
Ovalbumina
PAF
Fator de agragação plaquetária
PAMP
Padrões moleculares associados ao patógeno
PAI-1
Inibidor de ativação de plasminogênio
PBS
Solução de tampão fosfato
P.F.
Ponto de fusão
PG
Prostaglandina
PGD2
Prostaglandina D2
PGE2
Prostaglandina E2
PGF2α
Prostaglandina F2α
PGI2
Prostaciclina
PGHS
Prostaglandina-endoperóxido sintase
PLA2
Fosfolipase A2
PMNL
Leucócitos polimorfonucleares
v.o
Via oral
PPAR
Receptores ativados por proliferadores de peroxissomas
xiv
Proteína G
Proteína regulatória ligada a um nucleotídeo guaninico
RAGE
Receptor do produto final de glicosilação
RANTES
Quimiocina reguladora da ativação na expressão e secreção
de células T normais.
Rdt
Rendimento
Rf
Razão de frente
ROS
Espécies reativas de oxigênio
RXR
Receptor do ácido retinóico
s
Segundos
STAT4
Sinal transdutor e ativador de transcrição 4
STAT6
Sinal transdutor e ativador de transcrição 6
TLR
Receptor Toll-like
TNF-α
Fator de necrose tumoral α
TNFR
Receptor do fator de necrose tumoral
TPA
12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato
TXA2
Tromboxano A2
TZD
Tiazolidinadiona
VCAM-1
Molécula de adesão celular vascular-1
VEGF
Fator de crescimento vascular endotelial
µmol
Micromol
µg
micrograma
xv
RESUMO
O receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama (PPARγ) é membro de
uma família de receptores nucleares e atua como fator de transcrição regulando
várias vias metabólicas relacionadas a processos inflamatórios. Dentre os agonistas
deste receptor, incluem-se as tiazolidinadionas (TZDs) que ao promoverem a sua
ativação, regulam vários genes envolvidos na inflamação e na dor. Assim, o
presente estudo teve como objetivos a síntese e a avaliação das atividades
antiinflamatória e antinociceptiva de quatro derivados tiazolidínicos. Para o estudo
da atividade antiinflamatória foram avaliados a migração de leucócitos para cavidade
peritoneal induzida por tioglicolato de sódio e zimosan e a medida da permeabilidade
vascular induzida por ácido acético. Para avaliação da atividade antinociceptiva dos
compostos LPSF/GQ-159 e LPSF/GQ-130 foram utilizados os testes das contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético e o de indução do efeito nociceptivo por
formalina. A administração oral das quatro TZDs sintetizadas (10µmol/Kg) inibiu a
migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal. Os percentuais de inibição dessa
resposta variaram entre 57 e 70%. Resultados similares foram obtidos com o
LPSF/GQ-130 (3, 10, 30µmol/Kg), o qual mostrou um melhor perfil antiinflamatório.
Os efeitos apresentados foram similares aos produzidos pela indometacina (75% de
inibição celular). Na investigação da ação dos compostos LPSF/GQ-130 e
LPSF/GQ-159 (30µmol/Kg) na 1ª fase da inflamação, foi constatado que apenas um
deles, o primeiro, foi ativo em inibir a permeabilidade vascular, sugerindo
envolvimento do LPSF/GQ-159 apenas na segunda fase do processo inflamatório,
reduzindo o número de neutrófilos ou macrófagos na cavidade peritoneal. Os
compostos LPSF/GQ-130 e o LPSF/GQ-159 apresentaram efeito antinociceptivo
significativo em relação ao controle, ainda que de maneira moderada. No teste da
formalina
o
composto
LPSF/GQ-130
apresentou
melhor
ação
na
fase
antiinflamatória (2ª fase) do teste. Em síntese, constatou-se que os protótipos
tiazolidinônicos bioativos possuem propriedades antiinflamatórias e analgésicas,
destacando o LPSF/GQ-130 que provavelmente, atua na segunda fase da
inflamação.
Palavras-chave: tiazolidinas; inflamação; nocicepção
xvi
ABSTRACT
The receptor activated by the proliferated peroxisomes gamma (PPARγ) is a member
of a family of nuclear receptors and acts as a transcription factor regulating several
metabolic pathways related to inflammatory processes. Among the agonists of this
receptor, are included thiazolidinediones (TZDs) that promote its activation and
regulate several genes involved in inflammation and pain. The present study aimed
at the synthesis and evaluation of anti-inflammatory and antinociceptive activities of
four thiazolidine derivatives. To study the anti-inflammatory activity was evaluated the
leukocytes migration to the peritoneal cavity induced by sodium thioglycolate and
zymosan and the extent of vascular permeability induced by acetic acid. For
evaluation of antinociceptive activity of compounds LPSF/GQ-159 and LPSF/GQ-130
tests were used for writing induced by acetic acid and the induction of the nociceptive
effect of formalin. Oral administration of the four synthesized TZDs (10µmol/Kg)
inhibited the migration of neutrophils into the peritoneal cavity. The percentage of
inhibition of the response ranged between 57 and 70%. Similar results were obtained
with the LPSF/GQ-130 (3, 10, 30µmol/Kg), which showed the best anti-inflammatory
profile. The effects have been similar to those produced by indomethacin (75%
inhibition of cell). In the investigation of the action of the compounds LPSF/GQ-130
and LPSF/GQ-159 (30µmol/Kg) in the 1st phase of inflammation, it was found that
only one of the first, was active in inhibiting the vascular permeability, suggesting
involvement of LPSF/GQ-159 only in the second phase of the inflammatory process,
reducing the number of neutrophils or macrophages in the peritoneal cavity. The
compounds LPSF/GQ-130 and LPSF/GQ-159 showed significant antinociceptive
effect compared with the control, even moderate. In the formalin test of the
compound LPSF/GQ-130 presented better anti-inflammatory action phase (2nd
phase) of the test. In summary, it was found that the prototypes thiazolidinones had
bioactive anti-inflammatory and analgesic properties, highlighting the LPSF/GQ-130
which
probably
acts
in
the
second
Keywords: thiazolidine, inflammation, nociception
phase
of
inflammation.
PPARγ
INTRODUÇÃO
17
1. Introdução
As
pesquisas
que
conduzem
à
concepção
de
novos
fármacos
e
medicamentos têm se desenvolvido no mundo inteiro graças aos avanços dos
conhecimentos técnico-científicos nos campos da Química, Modelagem Molecular,
Tecnologia Farmacêutica, Farmacologia, Imunologia, Medicina, entre outros, os
quais impulsionam a preparação de novas moléculas bioativas e o desenvolvimento
de modelos de avaliação biológica, firmados a partir do entendimento dos
mecanismos fisiopatológicos. Seguindo este enfoque, é possível identificar novos
alvos terapêuticos que conduzam ao desenvolvimento de abordagens originais no
âmbito da inovação terapêutica.
Há vários séculos o homem vem usando plantas e ervas para tratar a febre e
aliviar a dor. A primeira substância química isolada foi a salicilina, sendo seus efeitos
antipiréticos demonstrados em 1929 por Leroux (BRENOL, XAVIER e MARASCA,
2000). Nesta busca incessante, diversas investigações de novos insumos e
introdução de inovações para o desenvolvimento de novos fármacos estão sendo
realizadas.
Uma das áreas que vem despertando interessantes pesquisas é a que
envolve processos inflamatórios, em virtude das condições patológicas as quais ela
pode subsidiar, levando ao desenvolvimento de doenças como asma crônica, artrite
reumatóide, esclerose múltipla, osteoartrite, lupus eritematoso e psoríase. A
inflamação é a maneira como o corpo lida com infecções e danos nos tecidos, mas
existe um bom equilíbrio entre os efeitos benéficos da inflamação e seu potencial de
destruição tecidual em longo prazo, podendo ser potencialmente prejudicial. Dessa
forma, de maneira positiva, trata-se de um interessante aporte de defesa, entretanto,
se não controlada, viabiliza seu lado negativo, promovendo as diversas patologias já
mencionadas (SIMMONS, 2006). Assim, com a persistência da liberação de
mediadores primários que causam sensibilização de nociceptores ou sua ativação, é
estabelecida a dor.
Santos, I.B.V
18
Diferentes abordagens terapêuticas têm sido usadas com o objetivo de
atenuar a dor associada a distintas condições patológicas e sintomas das doenças
inflamatórias. Uma das abordagens mais comuns é a farmacoterapia. Dentre os
casos inflamatórios crônicos, destaca-se a artrite reumatóide (AR), uma doença
sistêmica que afeta as juntas, tendões, músculos e tecidos fibrosos. Estudos
estimam uma prevalência de 4,5% na faixa etária de 55 a 75 anos (LAURINDO,
2006 apud Lopes et al., 2006; ALAMANOS, 2005).
O processo inflamatório crônico pode ser tratado por diferentes intervenções
terapêuticas, visto sua complexidade e a diversidade de mediadores fisiológicos
envolvidos. A maneira clássica compreende o emprego de inibidores da
prostaglandina-endoperóxido sintase (PGHS) ou cicloxigenase, enzima responsável
pela transformação do ácido araquidônico (AA), liberado pela fosfolipase A2 (PLA2),
em prostaglandinas (PGs) flogísticas (VANE, BAKHLE e BOTTING, 1998). Vane e
seus colaboradores, em 1971, identificaram o mecanismo de ação dos
medicamentos antiinflamatórios não-esteroidais clássicos, os quais inibem a
produção das prostaglandinas através da inibição da ciclooxigenase-1(COX-1) e da
ciclooxigenase-2(COX-2).
Hoje, a estratégia de tratamento para doenças inflamatórias envolve
principalmente interrupção da síntese ou ação de mediadores críticos que conduzem
a resposta à lesão, promovendo modificações estruturais, baseadas na existência de
receptores específicos, com conformação espacial particular capaz de desencadear
os processos que conduzem à resposta biológica (GAYATHRI et al., 2007).
No entanto, apesar dos grandes avanços na compreensão subjacente a
fisiopatologia das condições inflamatórias e o advento de muitos medicamentos,
pouco tem sido feito com a tradução desse conhecimento para as clínicas e para
identificação de terapias adequadas.
Recentemente, foi identificado um alvo biológico possuidor de um
interessante potencial para a terapêutica antiinflamatória, o receptor ativado por
proliferadores de peroxissoma (PPAR). Este é um fator de transcrição pertencente a
uma superfamília de receptores nucleares, que foi inicialmente identificado como
essencial no metabolismo de glicose (DESVERGNE et al, 2006 apud KNETHEN et
al., 2007). Assim, agonistas sintéticos do PPARγ, chamados tiazolidinadionas
Santos, I.B.V
19
(TDZs), são usados na terapia do diabetes tipo 2, como sensibilizadores de insulina
(YKI-JARVINEN, 2004). Contudo, a eficiência destes agonistas não se restringe
apenas a esta propriedade terapêutica, pois assumem também propriedades
antiinflamatórias, que têm sido caracterizadas em células do sistema imune, como
linfócitos B e T, monócitos, macrófagos, células dendríticas, e granulócitos (APPEL
et al., 2005; LI, PASCUAL E GLASS, 2000; RICOTE et al, 1998; TAUTENHAHN,
BRUNE e VON-KNETHEN, 2003; WANG et al., 2001; YANG et al., 2000). Assim,
vários tipos de células são potenciais alvos para os efeitos antiinflamatórios de
ligantes PPARγ.
Neste contexto, os derivados tiazolidínicos constituem uma interessante
classe
de
compostos
heterociclos
para
os
quais
diversas
propriedades
farmacológicas vêm sendo confirmadas nas últimas décadas. Albuquerque e
colaboradores (1999) revelaram em seus estudos atividade antimicrobiana destes
compostos.
Leite
e
colaboradores
(2007),
integrantes
do
Laboratório
de
Planejamento e Síntese de Fármacos (LPSF/GPIT/UFPE) do Departamento de
Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, constataram que compostos
da referida natureza foram eficientes na redução dos níveis de glicose em
camundongos hiperglicêmicos. E, recentes sínteses de compostos tiazolidínicos com
atividade
antiinflamatória,
também
realizadas
no
(LPSF/GPIT/UFPE)
foram
confirmadas por Santos (2005), Couto (2006), Pereira (2007) e Magalhães (2007).
Dessa forma, este trabalho teve como objetivos a síntese de novos protótipos
bioativos tiazolidinônicos e a avaliação das suas atividades antiinflamatória e
antinociceptiva.
Santos, I.B.V
PPARγ
REVISÃO DE LITERATURA
20
2. Revisão da literatura
2.1. O processo inflamatório
A inflamação tem uma história antiga e rica, intimamente relacionada com
histórias e guerras, feridas e infecções. Trata-se de um mecanismo de defesa
natural do organismo a qualquer agressão eventualmente sofrida, seja ela de
natureza física, química ou biológica. Suas características clínicas são bem
estabelecidas, datando aproximadamente 3000 a.C., tempo em que se evidenciaram
os sinais mais proeminentes na inflamação aguda: área avermelhada, edemaciada,
quente e dolorosa. E, um quinto sinal clínico, a perda ou alteração da função (functio
laesa), foi posteriormente adicionado por Virchow, estando a mesma relacionada
com fenômenos tais como o espasmo do músculo liso bronquiolar e restrição de
movimento de uma articulação inflamada. Na tabela 01 estão apresentados estes
sinais, promovidos pelos mediadores da inflamação derivados do ácido araquidônico
- eicosanóides (LUENGO, 2005; KUMAR, ABBAS e FAUSTO, 2005; RANG, DALE e
RITTER, 2003).
Tabela 01: Sinais cardinais da inflamação: função dos mediadores eicosanóides
(Adaptado de JÚNIOR e DANTAS, 2000)
SINAIS
ESTIMULAM SINAIS
INIBEM SINAIS
Vasoconstricção
PGFα, TXA2, LTC4
LTD4, LTF4
Quimiotáticos para leucócitos
LTB4, HETEs
LXA4, LXB4
Permeabilidade vascular
LTC4, LTD4
LXA4
Dor e hiperalgesia
PGE2, PGI2, LTB4
LXA4
Febre
PGE2, PGI2
LXA4
Vasodilatação (eritema)
PGI2, PGE1, PGE2,
LXA4
PGD2
Edema (inchaço)
PGE4, LTB4
LXA4, LXB4, LTB4
A inflamação aguda pode ser determinada em minutos até dias, sendo
confirmada pela presença de neutrófilos e fluidos protéicos (exsudato). Este
processo é finalizado quando o estímulo que causou a injúria é removido e todos os
mediadores são inibidos (ZHANG, 2008). Desta maneira, a sua intensidade mostraSantos, I.B.V
21
se diretamente proporcional ao tamanho do trauma sofrido. É considerado um
interessante aporte de defesa, uma vez que tem como objetivos: localizar a região
agredida, eliminar o agente agressor e remover os tecidos degenerados, preparando
a área lesada para reparação (JÚNIOR e DANTAS, 2000). Assim, envolve uma série
de eventos celulares e vasculares dinâmicos, bem coordenados que dependem da
chegada de leucócitos inflamatórios para o local da lesão. Há uma complexa
variedade de células (neutrófilos, macrófagos e células mononucleares), e diversas
moléculas inflamatórias, tais como prostaglandinas (PGs), o óxido nítrico (NO),
citocinas pró-inflamatórias como fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 1
(IL-1), interleucina 12 (IL-12), interferon γ (IFN-γ), e quimiocinas. Os neutrófilos são
as primeiras células a migrarem para o foco inflamado (MIYAZAKI et al., 2000; KEY
et al.,1982; ADAMS e HAMILTON., 1984).
Entretanto, têm sido confirmados diversos casos em que a resposta
inflamatória escapa aos mecanismos de controle, desencadeando desordens
inflamatórias. O evento passa a ganhar características sistêmicas, podendo se autoperpetuar e provocar a disfunção de diversos órgãos e sistemas. Dentro de todo
este contexto, a resposta imune adquirida específica mostra-se atuante, melhorando
acentuadamente a eficácia das respostas inatas não imunológicas, pois é uma
resposta mais complexa. Esta resposta envolve principalmente linfócitos, que podem
ser divididos em três principais grupos: as células B, responsáveis pela produção de
anticorpos; as células T, importantes na fase de inibição da resposta imune e as
células Natural Killer, ativas durante a resposta inata não imunológica. Desta
maneira, a figura 01 mostra a resposta inflamatória que abrange dois componentes:
uma reação inata ou de fase aguda, não imunológica, relacionada aos eventos que
ocorrem localmente no interior dos tecidos, a nível de vasos sanguíneos; e uma
resposta imune ou resposta de fase crônica, a qual é adquirida e específica,
tornando a resposta de defesa a um microrganismo invasor mais eficaz, sendo
caracterizada pela proliferação celular (TLASKALOVA-HOGENOVA et al., 2005).
Santos, I.B.V
22
Figura 01: Resposta inflamatória composta das suas possíveis fases de desenvolvimento. (Adaptado
de MÃNNEL, 2007)
Partindo destes pressupostos, este aparato, de acordo com sua repercussão,
costuma ser dividido em três fases: a inflamação aguda, a resposta imune e a
inflamação crônica. A primeira fase (1 hora) envolve a liberação de histamina e
serotonina e a segunda fase (mais de 1 hora) é mediada por prostaglandinas, que
são produtos da ciclooxigenase, e a continuidade entre as duas fases é fornecida
por cininas, que são grupo de polipeptídeos autacóides que atuam localmente na
produção da dor, vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e síntese de
prostaglandinas. Além disso, compreendem um subgrupo de numerosos mediadores
que contribuem para a resposta inflamatória. Esta seqüência de acontecimentos
pode ser visualizada na figura 02 (PERIANAYAGAM et al., 2006). A seguir, a tabela
2 mostra, resumidamente, as diferenças básicas entre a fase aguda e a crônica da
inflamação.
Santos, I.B.V
23
Figura 02: Tempo de ação dos mediadores químicos da 1ª fase da inflamação.
Tabela 2: Quadro comparativo entre a inflamação aguda e crônica
Aguda
Duração
Curta duração
Crônica
Semanas, meses, até anos.
( 3 dias)
Natureza
Exsudativa
Proliferativa
Tipo celular
Neutrófilos macrófagos
Linfócitos, plasmócitos, fibroblastos,
macrófagos
pH
Santos, I.B.V
Ácido
Básico
24
2.1.1. Atuação de Neutrófilos na resposta inflamatória
As células que participam da reação inflamatória foram classificadas por
Spector (1980) da seguinte forma: células endoteliais; células próprias do tecido
(mastócitos, fibroblastos e macrófagos fixos) e células migratórias (leucócitos
sangüíneos). Dentre estas, as primeiras a alcançarem o foco inflamatório são os
neutrófilos - leucócitos granulócitos polimorfonucleares - PMN, formados na medula
óssea, e como o próprio nome diz, possuem núcleo pleomórfico, multilobulado,
citoplasma granuloso e medem cerca de 10 µm de diâmetro. Estão envolvidas nas
fases iniciais da inflamação, e em infecções bacterianas, particularmente as
causadas por bactérias piogênicas, as quais produzem pus, aparecem em elevado
número no sangue e nos tecidos afetados. Derivados de precursores da medula
óssea são células terminais, as quais não se diferenciam em outro tipo celular, e
possuem uma vida média curta, de aproximadamente dois a três dias. Este fato, e
mais o de que são células extremamente móveis, explica em parte porque
predominam nas fases iniciais do processo inflamatório em relação às demais
células. Estes grânulos, que são classificados em primários, secundários e terciários,
de acordo com suas características de eletrondensidade à microscopia eletrônica,
são ricos em enzimas digestivas, como hidrolases, peroxidases e fosfatases ácidas,
lisozimas, etc. Os neutrófilos são caracteristicamente células fagocitárias, com uma
membrana celular bastante aderente e suprimento lisossomal generoso em seu
citoplasma. A fagocitose é acompanhada por uma atividade metabólica explosiva da
célula, com grande aumento no consumo de oxigênio (JÚNIOR e DANTAS, 2000).
Entretanto, os neutrófilos apesar de, fisiologicamente, atuarem como células
fagocitárias, acredita-se que possam contribuir para o agravamento do processo
lesivo, durante trauma tecidual em seres humanos e em animais de experimentação
(TAOKA et al., 1997; TAOKA e OKANMA, 1998).
O acúmulo de leucócitos, principalmente neutrófilos e células derivadas de
monócitos, é a característica mais importante da reação inflamatória, vindo a
constituir-se no verdadeiro elemento do processo. Os leucócitos incorporam e
degradam bactérias, complexos imunes e restos de células necróticas, e as suas
enzimas lisossomais contribuem de outras formas com a resposta defensiva do
hospedeiro. Entretanto, leucócitos podem prolongar a inflamação e aumentar o dano
Santos, I.B.V
25
tecidual pela liberação de enzimas, mediadores químicos e radicais livres, que são
tóxicos para os tecidos. A seqüência desses eventos é dividida, para fins didáticos,
em (RANG et al., 2003):
1) Marginação e rolamento: Aumento do número de neutrófilos na periferia
vascular, devido às mudanças das condições hemodinâmicas, como a diminuição da
velocidade do fluxo sanguíneo (estase). Seguida de ligação fraca dos leucócitos ao
endotélio, por meio das moléculas de adesão (E-selectina, P-selectina). Ação
estimulada pelas citocinas TNFα e IL-1.
2) Adesão: Ligação de alta afinidade estabelecida entre outras moléculas de
adesão, as Integrinas, e seus ligantes (ICAM-1, VCAM-1), sob o também estímulo
das citocinas TNFα e IL-1.
3) Transmigração (diapedese) e quimiotaxia: migração dos neutrófilos para fora
do vaso até o local em que se encontra o patógeno invasor, atraídos pelas
quimiotaxinas – C5a, LTB4, IL-8, dentre outras.
4)
Fagocitose
e
degradação
intracelular:
Os
neutrófilos
destroem
os
microrganismos, através dos produtos tóxicos do oxigênio. A seguir, digerem
enzimaticamente os mesmos.
Na figura 03 está representada a seqüência desses eventos leucocitários,
referente ao processo pelo qual leucócitos móveis escapam dos vasos sangüíneos
para os tecidos perivasculares.
Santos, I.B.V
26
Figura 03: Diferenciação, liberação, recrutamento e ativação de neutrófilos (Adaptado de Eyles et al,
2006).
2.1.2. Atuação de Monócitos/Macrófagos na resposta inflamatória
Assim como os neutrófilos, os monócitos também chegam à área da
inflamação, porém várias horas após estes. Nos tecidos, os monócitos são
transformados em macrófagos. A adesão ao endotélio e a migração para o tecido
seguem um padrão semelhante ao dos neutrófilos, apesar de a quimiotaxia dos
monócitos envolver quimiocinas adicionais – MCP-1 e RANTES (KUMAR et al.,
2005a).
Macrófagos que apresentam um padrão considerado normal possuem uma
morfologia arredondada, enquanto o padrão ativado é espraiado, dotada de um
espalhamento. Nas reações inatas, estas células ligam-se ao lipopolissacarídeo e a
outros PAMPs (padrões moleculares associados ao patógeno) por intermédio de
receptores específicos de superfície celular. Esta ligação permite o englobamento de
restos teciduais e células mortas, e a estimulação da produção e da liberação de
citocinas TNF, ILs, PAF, o fator de macrófagos quimiotáxico para neutrófilos e
quimiocinas, que atuam sobre as células endoteliais vasculares, conforme já
Santos, I.B.V
27
descrito, atraindo outros leucócitos para área, promovendo febre. Estas células
ainda secretam NO, radicais livres etc (RANG et al., 2003; GORDON, S., 2001;
HERMANN, et al., 2001).
2.1.3- Mediadores químicos da resposta inflamatória
Dentre os mediadores inflamatórios, podemos destacar produtos da
degranulação de mastócitos, como a histamina e a serotonina, responsáveis durante
o desenvolvimento de um processo inflamatório, pela vasodilatação e aumento da
permeabilidade vascular; componentes do sistema complemento, destacando as
anafilotoxinas C3a e C5a, importantes na estimulação da secreção de mediadores
por mastócitos e importante papel quimiotático, como citado anteriormente;
mediadores lipídicos, como os leucotrienos, as prostaglandinas e o fator de ativação
plaquetária, os quais são derivados da metabolização do ácido araquidônico pelas
enzimas ciclooxigenase ou lipooxigenase (HERSCHMAM, 1996; GONZALEZ-REY et
al., 2007). As citocinas compõem uma numerosa família de peptídeos que incluem
IFNγ, ILs, TNF, vários fatores de crescimento e as quimiocinas. A bradicinina,
também se destaca entre os mediadores químicos envolvidos no processo
inflamatório, promovendo vasodilatação, extravasamento plasmático e aderência de
neutrófilos (CALIXTO et al., 2004). Além destes, mediadores peptídicos, como as
neurocininas e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), dentre
outros, também exercem um importante papel no processo inflamatório (OKAJIMA e
HARADA, 2006).
2.1.3.1. Citocinas e Quimiocinas
As citocinas são definidas como pequenas proteínas (8-80 kDa de peso
molecular), que normalmente atuam de maneira autócrina (na própria célula que a
produziu) ou parácrina (nas células vizinhas). A produção destas potentes
moléculas, normalmente, é transitória e rigorosamente controlada. Existem,
aproximadamente, mais de 100 diferentes citocinas humanas identificadas, e muitas
outras estão por ser descritas. Ligadas a receptores específicos na membrana
celular, estabelecem uma cascata que leva à indução, ao favorecimento ou à
inibição de vários genes no núcleo celular (RANG et al., 2003).
Santos, I.B.V
28
As citocinas são geralmente sintetizadas pelos linfócitos e macrófagos após
estimulados por toxinas, injúria ou mediadores inflamatórios. Linfocinas, monocinas,
interleucinas,
fatores
de
crescimento
propriedades
gerais
a
meia-vida
etc,
curta,
são
citocinas.
modulam
a
Compõem
resposta
suas
imune,
produção/modulação de vários tipos de células, redundância, interação com outras
citocinas e adquire reconhecimento através de receptores específicos (ZHANG,
2008). A figura 04 exemplifica uma destas características, dando enfoque na
diferenciação das células T helper, as quais estão envolvidas na ativação de
macrófagos (JÚNIOR e DANTAS, 2000).
Figura 04: Citocinas e diferenciação de células T helper (Adaptado de O'Shea et al, 2002)
As principais citocinas envolvidas no retardamento da resposta inflamatória
são IL-1 (monócitos/macrófagos, células endoteliais, linfócitos T, queratinócitos,
fibroblastos, células da glia, astrócitos e neutrófilos), TNFα (monócitos/macrófagos,
linfócitos T e B, fibroblastos, eosinófilos e astrócitos), INFγ (linfócitos T e B), pois as
mesmas induzem respostas inflamatórias e imunes, dentre as quais a indução da
expressão das moléculas de adesão (como a ICAM-1), o que facilita a adesão dos
leucócitos para a realização da diapedese. Isto ocorre devido as mesmas ativarem o
fator de transcrição NF-kB (Nuclear factor Kappa B) (ZHANG, 2008).
O TNFα é umas das citocinas pleiotrópicas por promover influência a uma
considerável variedade de células. Algumas atividades dele são comuns para
diferentes doenças, como artrite reumatóide, doença de Crohn e psoríase, que
modulam o recrutamento e a proliferação celular, morte celular e regulação imune
Santos, I.B.V
29
(CHOY e PANAYI, 2001; FELDMANN, 2002; SCHOTTELIUS et al., 2004). A figura
05 aborda um dos mecanismos de ação do TNFα, através do qual promove seus
efeitos antiinflamatórios. Atualmente, o TNFα tem se destacado por ser considerado
um mediador central da relação entre citocinas mediadoras da imunidade,
inflamação e câncer (LIN e KARIN, 2007; BALKWILL e COUSSENS, 2004). A
ativação do NFk-B pelo TNFα tem sido focada para induzir a expressão de genes
que inibem a apoptose, estimulam a proliferação celular, e participam da invasão e
metástase em tumor (MAYO e BALDWIN, 2000). A partir de alguns fatores de risco
(Diabetes, Isquemia / reperfusão, Obesidade, Aterosclerose), esta citocina próinflamatória atua contribuindo para a disfunção vascular, através do mecanismo
proposto na figura 06 (ZHANG, 2008).
Figura 05: Mecanismo de ação do TNFα na disfunção endotelial
(Adaptado de ZHANG, 2008).
Em se tratando de citocinas com baixo peso molecular e com função
quimiotática, fala-se de quimiocinas, as quais controlam a migração de leucócitos,
fazendo com que os mesmos locomovam-se ao longo de um gradiente químico.
Funcionam como coordenadores de trânsito nas reações inflamatórias e
Santos, I.B.V
30
imunológicas, além de causar degranulação de mastócitos e promover a
angiogênese. Diferente das citocinas abordadas anteriormente, estas possuem um
mecanismo de transdução de sinais através de receptores acoplados a proteína G
(RANG et al., 2003).
As
quimiocinas
são
apresentadas
sobre
o
endotélio
inflamado
e interagem com seus receptores expressos em leucócitos. Elas podem ser divididas
em subfamílias com base em suas estruturas químicas (de acordo com a localização
do resíduo conservado de cisteína nas proteínas maduras). Assim, nas quimiocinas
C-X-C um aminoácido separa as duas primeiras cisteínas conservadas, fazendo
parte deste grupo a IL-8, quimiotática para neutrófilos; nas quimiocinas C-C as duas
cisteínas conservadas são adjacentes, neste grupo incluem-se a proteína de
quimioatração
do
monócito-1
(MCP-1),
eotaxina,
proteína
inflamatória
do
macrófago1α (MIP-1α) e RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed
and secreted), atraem monócitos, eosinófilos, basófilos e linfócitos; e, finalmente as
quimiocinas CX3C contendo três aminoácidos entre as duas cisteínas, neste há
apenas uma, denominada fractalcina potente quimiotático para monócitos e células
T (KUMAR, ABBAS e FAUSTO, 2005b).
A identificação de quimiocinas que fornecem sinais direcionais para migração
celular, um quarto de um século atrás, provocou um grande interesse nas indústrias
farmacêuticas, especialmente porque estas ativam receptores acoplados a uma
proteína regulatória ligada a um nucleotídeo guanínico (proteína “G”), constituída por
19 receptores com cerca de 50 ligantes diferentes. Um intenso esforço tem sido
empreendido para a real compreensão de seus papéis em distúrbios inflamatórios.
As
abordagens
têm
sido
variadas,
utilizando
anticorpos
neutralizantes,
camundongos geneticamente modificados e quimiocinas diversas as quais possuem
propriedades antagônicas (JOHNSON et al., 2005).
2.1.3.1-
Óxido nítrico (NO)
O NO, um mediador pleiotrópico da inflamação, foi descoberto nos anos 80,
como um fator liberado pelas células endoteliais que causava vasodilatação,
relaxando o músculo liso vascular. Por ter sido identificado como uma molécula
sinalizadora, vem sendo associado a uma variedade de processos fisiológicos no
Santos, I.B.V
31
corpo humano. O NO é uma molécula lipossolúvel, gasosa e com um tempo de
meia-vida de poucos segundos que é produzida a partir do aminoácido L-arginina
através da óxido nitrico sintase (NOS) (GOMES e BEL, 2003; ZHANG, DAWSON e
DAWSON, 2006).
A NOS induzida (iNOS) foi primeiro identificada em macrófagos e seus efeitos
se apresentam em locais com inflamação crônica (SAGIN et al., 2004). O controle
da
expressão
da
iNOS
ocorre
principalmente
em
nível
de
transcrição,
freqüentemente devido à ação sinérgica de dois mediadores. Embora o mecanismo
de indução ainda não esteja completamente esclarecido, o NF-κB está relacionado
com a indução da NOS por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS). O cérebro expressa
as três isoformas da enzima NOS, e embora cada isoforma possa desempenhar um
discreto papel fisiológico, o NO gerado pode atuar tanto em processos fisiológicos
como patológicos (DUNCAN e HEALES, 2005).
Nas condições fisiopatológicas, o aumento nas concentrações de NO pode
causar lesão celular, já que pode promover a formação de radicais livres
favorecendo os danos do estresse oxidativo (WEI et al., 2003). Além disso, a
produção excessiva de NO pode contribuir para um processo denominado
excitotoxicidade glutamatérgica que é descrita como uma condição resultante da
liberação excessiva de glutamato e a conseqüente entrada de cálcio no terminal
pós-sináptico e ativação da NOS cálcio-dependente (DUNCAN e HEALES, 2005). O
exato mecanismo pelo qual o NO contribui para determinadas doenças
neurodegenerativas não está completamente entendido. Há evidências de que esta
molécula, está associada com o processo de excitotoxicidade, danos ao DNA e
modificações de proteínas, os quais podem promover mecanismos patogênicos
envolvidos em processos neurodegenerativos, ocasionando grande parte do dano
cerebral que ocorre em várias doenças neurodegenerativas (ZHANG et al, 2006).
Moon e colaboradores (2008) demonstraram que a administração de
curcumim, um pigmento amarelo isolado do rizoma da Curcuma longa, minimizou
significativamente inflamação asmática induzida por Ovalbumina (OVA), devido a
supressão da expressão da iNOS e do NO. Além de inibir o recrutamento de
leucócitos dentro do pulmão e regular o equilíbrio de células Th1 e Th2 (células
atuantes na resposta imune celular, ativando macrófagos e sintetizando anticorpos,
Santos, I.B.V
32
respectivamente), retardando a inflamação das vias aéreas induzida também por
OVA.
2.2. Agentes antiinflamatórios
Desde a antiguidade o homem procura encontrar meios para aliviar a dor, a
febre, entre outras enfermidades. Com a descoberta dos mecanismos da
fisiopatologia das doenças inflamatórias, abriu-se uma janela para investigação de
substâncias
medicamentosas
que
pudessem
interromper
o
circuito
desta
sinalização.
Desta maneira, quando a inflamação perde o controle, a solução normalmente
utilizada é a administração de medicamentos antiinflamatórios esteróides e não
esteróides. O objetivo inicial com a administração desses medicamentos é modular a
exacerbação da inflamação, evitando a potencialização da agressividade flogógena
inicial (LEMANSKE e BUSSE, 2006). Os fármacos antiinflamatórios possuem
mecanismos de ação diferentes entre si. Assim, o maior entendimento a cerca das
suas funções fornecerá subsídios ao uso desses tipos de medicamentos de forma
menos mais segura.
2.2.1 Agentes antiinflamatórios esteroidais
Os antiinflamatórios esteroidais, também denominados de glicocorticóides ou
corticosteróides, fazem parte de um grupo de hormônios cujo mecanismo clássico
de ação envolve a interação com um receptor de glicocorticóides e a regulação da
expressão de proteínas. Os corticosteróides são substâncias que derivam de
hormônios produzidos pela glândula adrenal, são análogos a hidrocortisona
(DEVLIN, 1998).
Estes agentes exercem papéis importantes na regulação de diversos
processos fisiológicos, assim como metabolismo, proliferação celular, diferenciação,
inflamação e resposta imune. Através da utilização destes agentes ficou
estabelecido um tratamento um tanto quanto especial para as doenças inflamatórias
– asma, artrite reumatóide, artrite psoríatica, lúpus eritematoso, doença de Crohn,
esclerose múltipla e vasculite sistêmica (GAYATHRI et al., 2007).
Santos, I.B.V
33
2.2.2. Agentes antiinflamatórios não-esteroidais – AINEs
Os
agentes
antiinflamatórios
não-esteroidais
(AINEs)
estão
entre
os agentes terapêuticos mais amplamente utilizados no mundo inteiro. Estes
fármacos apresentam três tipos principais de efeitos: antiinflamatório, analgésico e
antipirético. De uma maneira geral todos estes afeitos resultam da inibição da
enzima ciclooxigenase, e conseqüente inibição das prostaglandinas e tromboxanos,
mediadores lipídicos sintetizados por muitas células, em detrimento de algum
estímulo químico ou mecânico. Na figura 06 estão representadas as estruturas
químicas de alguns representantes.
Figura 06: Fármacos antiinflamatórios não esteroidais: (a) Paracetamol, (b) Fenilbutazona,
(c) Indometacina, (d) Ibuprofeno.
Ciclooxigenase ou prostagladina-endoperóxido sintase é uma enzima chave na
síntese de prostaglandinas a partir de seu precursor, ácido araquidônico, como
mostra a figura 07. Ela existe sob três isoformas: COX-1(constitutiva); COX-2
(induzida) e, recentemente um novo tipo tem sido postulado, a COX-3, baseada na
variante COX-1 no cérebro do cão (CHANDRASEKHARAN et al, 2002). Devido a
existência de diferentes COXs, a origem das prostaglandinas são diferentes, sendo
a COX-1 responsável pelo aparecimento das prostaglandinas constitutivas e a COXSantos, I.B.V
34
2 pela síntese de prostaglandinas inflamatórias. Estas produzem notáveis efeitos
que envolvem muitas funções biológicas como mediação da dor, febre e inflamação.
A inibição de sua biossíntese pelas NSAIDs causa grandes mudanças nas funções
fisiopatológicas do organismo (BOTTING, 2006).
Como representantes destes fármacos, tem-se a aspirina, indometacina,
piroxicam (AINEs seletivos para COX-1); diclofenaco sódico, meloxicam, o rofecoxib
e celecoxib, seletivos para a isoforma 2, introduzidos em 1999, no Brasil, pela Merck
Sharp & Dohme (MSD) e Pfizer/Searle, respectivamente (REITZ e SEIBERT, 1995;
LOMBARDINO, 1985; LAGES et al., 1998; WALLACE e CHIN, 1999; SIMMONS,
2006).
A inibição da migração de polimorfonucleares e monócitos têm sido sugeridos
como importante mecanismo de ação dos agentes antiinflamatórios não-esteroidais
(AINEs). Mas no que diz respeito às vias da enzima lipooxigenase, que dão origem
aos leucotrienos, mostrou-se insensível à ação dos antiinflamatórios não-esteróides.
Entretanto, os fármacos que conseguem inibir ciclooxigenase e lipooxigenase
possuem ação antiinflamatória superior (FRANCHIMONT, 2004; XIAOYU, 2003;
JOYCE et al., 2001).
Figura 07: Mecanismo da ciclooxigenase (Adaptado de JONES et al., 2008)
Santos, I.B.V
35
Apesar dos seus efeitos terapêuticos, o uso destes agentes vem custando um
alto preço, pois promovem sérios danos gastrointestinais (GI) e cardiovasculares, e
podem inclusive, promover óbitos (BRUNE e HINZ, 2004). A começar pelo alvo
COX-1, a qual promove reações gastrintestinais desagradáveis. Em seguida, o alvo
COX-2, que apesar de muitas expectativas quanto ao mesmo, também proporcionou
reações cardiovasculares, causando eventos trombóticos. E como conseqüência
destes achados, alguns dos AINEs seletivos para COX-2, como o rofecoxibe e
valdecoxib, foram retiradas do mercado (ANVISA, 2005). Para fortalecer a idéia, no
dia 03 de outubro de 2008 a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
emitiu parecer sobre o uso de antiinflamatórios da classe dos inibidores da COX-2. A
MSD informou que foi interrompida a comercialização da apresentação de
ARCOXIAR 120mg no Brasil, revelando, segundo estudos, eventos cardiovasculares
trombóticos (www.msdonline.com.br / acesso: 08/10/08).
Atualmente, a clínica para melhorar a qualidade de vida dos pacientes com
processos inflamatórios, porém nenhum ideal, sobretudo para aquelas condições
crônicas. Existem os medicamentos antiinflamatórios esteroidais e os nãoesteroidais, os quais têm como objetivo modular a exacerbação da inflamação,
evitando a potencialização da agressividade flogógena inicial. Os dados encontrados
na literatura relatando os efeitos adversos causados com o uso desses
antiinflamatórios, além do mal causado a população pelas doenças inflamatórias
crônico-degenerativas, na fase mais produtiva do homem, justificam a importância
na busca de novos fármacos antiinflamatórios. Desta forma, permanece a incerteza
sobre a melhor abordagem terapêutica para pacientes que requerem AINEs, em
particular aqueles com fatores de risco GI ou cardiovascular.
2.3. Mecanismos da transmissão da dor
A inflamação é geralmente associada à dor como um processo secundário
resultante da liberação de mediadores álgicos (HUNSKAAR e HOLE, 1987;
OSADEBE e OKOY´E, 2003). O conceito de dor hoje mundialmente usado é o da
Associação Internacional de Estudos da Dor (IASP) e afirma que a dor é uma
experiência sensorial e emocional desagradável, associada a dano presente ou
potencial, ou descrita em termos de tal dano. É uma experiência complexa que
Santos, I.B.V
36
envolve não apenas a transdução da informação gerada pelo estímulo nocivo, mas
também o processamento cognitivo e emocional pelo cérebro.
A dor se inicia em áreas periféricas como pele, órgãos internos ou qualquer
região fora do sistema nervoso central, isto é, fora do cérebro e da medula espinhal.
Sendo assim, encostar a mão em uma chapa quente é um dos eventos que ativa
neurônios conhecidos como nociceptores, que reagem especificamente a estímulos
danosos, como temperatura ou pressão mecânica extrema e substâncias produzidas
pelo organismo em resposta a uma lesão ou inflamação (HANSSON, 2005).
As fibras nociceptivas possuem duas extremidades: uma delas, a que detecta
sensações, se projeta para regiões periféricas onde inerva pequenas porções de
tecido; a segunda extremidade estende-se até o interior do corno medular espinhal.
O corpo celular dos nociceptores fica entre esses dois segmentos, em uma estrutura
fora da medula espinhal. Quanto o agente nocivo é detectado pela extremidade
periférica, na pele ou algum outro órgão, um impulso elétrico é disparado e
propagado por toda a fibra nervosa até atingir uma região da medula espinhal
(BASBAUM e JULIUS, 2006). A figura 08 ilustra todo este processo descrito.
Um das estratégias terapêuticas atuantes para os estágios de dor aguda e
crônica, desde a última década, é a combinação de substâncias opióides e nãoopiódes (SCHNITZER et al., 1999; GAMMAITONI et al., 2003; RAFFA, 2006).
Figura 08: Transmissão dos estímulos dolorosos (SNC)
(www.dol.inf.br/Html/CompreendendoDor.html - ACESSO 24/10/08)
Uma das propostas terapêuticas no tratamento da dor é a prescrição de
analgésicos, os quais didaticamente estão classificados em dois grupos: os nãoSantos, I.B.V
37
opióides e os opióides (ASHBURN e STAATS, 1999).
Agentes
antiinflamatórios
não-esteroidais,
paracetamol
e
analgésicos
adjuvantes constituem o primeiro grupo. Os AINEs são os analgésicos mais
freqüentemente utilizados nos quadros dolorosos, principalmente nas alterações
músculo- esqueléticas. A analgesia destes fármacos deve-se ao mesmo mecanismo
de ação, já relatado para as atividades antiinflamatórias (MACPHERSON, 2000).
2.4. PPARγ – Um modulador da expressão gênica inflamatória
PPARs pertencem a uma grande família de receptores hormonais nucleares,
da qual faz parte o receptor de esteróides e o receptor do hormônio tireoidiano. Tal
como estes outros receptores nucleares, PPARs funcionam vinculados a ligantes
específicos, sejam eles de natureza endógena (ácidos graxos insaturados, PGJ2,
LTB4) ou sintética (TZDs, fibratos, AINEs). Assim ao interagir com seu ligante,
mantendo parceria com o receptor do ácido retinóico (RXR), o receptor é ativado,
promovendo a atividade de genes alvo em suas regiões promotoras. Diversos
estudos têm estabelecido uma importante função dos PPARs, na regulação do
metabolismo energético e diferenciação celular. Estudos subseqüentes têm
identificado uma possível função dos PPARs no controle da inflamação, bem como
da biologia vascular. Grande parte da investigação publicada sobre estes receptores
tem sido realizada através da descoberta de agonistas sintéticos dos mesmos,
incluindo os estudos com as tiazolidinadionas relacionados aos seus efeitos
sensibilizadores da insulina (GLASS, 2006; SHULMAN e MANGELSDORF, 2005).
Até o momento, três isoformas de PPARs foram caracterizados: PPARα,
PPAR δ/β, e PPARγ. Estudos intensivos de PPARs durante últimos anos têm
demonstrado a sua importância para as atividades fisiológicas e patológicas em
diversos tecidos. A figura 09 aponta os diversos alvos celulares relacionados a estes
receptores (GERVOIS et al., 2005).
O receptor ativado por proliferadores de peroxissomos de isoforma γ
(PPARγ), também conhecido como NR1C3, foi inicialmente identificado como
essencial no metabolismo de glicose (DESVERGNE et al, 2006 apud KNETHEN et
al., 2007 ), é principalmente expresso em tecidos adiposos onde desempenha um
papel importante no metabolismo lipídico (FERRE, 2004; LINFORD et al., 2007).
Santos, I.B.V
38
Entretanto, nos últimos anos, PPARs também têm surgido como principais
reguladores de respostas inflamatórias e imunes, abrindo uma nova área para o
desenvolvimento de medicamentos úteis no tratamento das doenças inflamatórias
crônicas tais como: aterosclerose, obesidade induzida por resistência insulínica, e de
doenças neurodegenerativas (DAYNES e JONES, 2002; KOSTADINOVA, R.,
WAHLI, W., MICHALIK, L., 2005). A figura 09 mostra os diversos alvos para ações
do PPAR, relacionados a inflamação. O efeito antiinflamatório destes receptores
envolve o mecanismo de modulação negativa das citocinas pró-inflamatórias, como
está representado na figura 10. Ainda nesta figura, são mostradas as diferentes
formas de estabelecimento da atividade transcricional dos PPARs (transativação,
transrepressão e repressão), através das quais podem ativar e inibir a expressão de
variados genes (HEIKKINEM, S., AUWERX, J., ARGMANN, C.A, 2007).
Figura 09: Alvos celulares e moleculares para ações antiinflamatórias dos PPARs (Adaptado de
STRAUS e GLASS, 2007)
Santos, I.B.V
39
Figura 10: Atividades transcricionais dos PPARs: (a) transativação, (b) transrepressão e (c)
repressão (Adaptado de RICOTE e GLASS, 2007).
2.5. TIAZOLIDINADIONAS (TZDs)
As
tiazolidinadionas,
também
conhecidas
como
glitazonas,
foram
originalmente desenvolvidas por screening de análogos do ácido clofíbrico como
antioxidante, no início de 1980, no Japão (KAWMATSU et al., 1980; YOSHIOKA et
al., 1989). Elas possuem uma estrutura química parcial comum, tiazolidina-2,4diona.
Alguns fármacos deste grupo foram aprovados, pelo Food and Drug
Administration (FDA) para o tratamento do diabetes tipo 2. Eles exercem efeitos
hipoglicêmicos através de sua ligação ao PPAR, regulando a expressão de genes
envolvidos na sensibilidade a ação da insulina. Desta forma, em 1997, a FDA
aprovou a Troglitazona, a primeira TZD avaliada na clínica nos Estados Unidos e no
Japão. Porém, os sérios efeitos colaterais ocorridos pelo seu uso, fez com que fosse
retirada do mercado, em março de 2000. Fatos como estes, motivaram os
pesquisadores a desenvolverem novas glitazonas. Assim, em 1999, a FDA aprovou
dois novos fármacos da classe das TZDs: o maleato de rosiglitazona (Avandia) e o
cloridrato de pioglitazona (Actos), em uso na atualidade, em vários países incluindo
os Estados Unidos, Japão, Brasil e países da Europa. As estruturas de algumas
estão representadas na figura 11 (SALTIEL e OLEFSKY, 1996).
Santos, I.B.V
40
Figura 11: Estruturas químicas de agonistas PPARγ.
A rosiglitazona é conhecida por suas ações antiinflamatórias através da
ativação do PPAR-γ, pois esta leva à inibição da transcrição do NFkB. Assim,
rosiglitazona atenua a expressão dos genes pró-inflamatórios, e conseqüentemente
a produção de citocinas desta natureza. Estes fatos foram confirmados através de
um estudo realizado, onde esta TZD atuou neuroprotegendo isquemia cerebral e
hemorragia intracerebral (ALLAHTAVAKOLI et al., 2006; CHEN et al., 2006; LUO et
al., 2006; PEREIRA et al., 2006; ZHAO et al., 2007).
Assim como o relato citado acima, diversos estudos ratificam o potencial
efeito antiinflamatório das TZDs quando estas estabelecem a alta afinidade com o
PPARγ, repercutindo na inibição da expressão da proteína quimiotática de
monócitos (MCP-1) e das moléculas de adesão leucocitária (VCAM-1) - processos
iniciais na gênese da inflamação vascular; inibição da matriz metaloproteinase enzima implicada na ruptura da placa aterosclerótica, efeito modulador do gene do
PAI-1, e potente efeito estimulador sobre a secreção da adiponectina. A
adiponectina parece ter um efeito direto sobre a função vascular, estimulando a
produção de óxido nítrico e, conseqüentemente, melhorando a função endotelial (RE
et al., 1999) (LIU et al., 2005) (CHEN et al., 2003).
O nosso grupo de pesquisa, inserido no Laboratório de Planejamento e
Síntese de Fármacos – LPSF/GPIT/UFPE – obteve resultados de atividade
antiinflamatória apresentada por tiazolidinas nos trabalhos desenvolvidos por Uchôa
Santos, I.B.V
41
(2008) e Miranda (2008), os quais serviram de estímulo para a síntese de novos
derivados tiazolidínicos, almejando a obtenção de compostos que possam melhorar
o tratamento de enfermidades inflamatórias.
Santos, I.B.V
PPARγ
OBJETIVOS
42
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
Obter
novas
moléculas
tiazolidinadionas
com
potenciais
atividades
antiinflamatória e/ou antinociceptiva.
3.2. Objetivos específicos
• Sintetizar novas moléculas tiazolidinadionas partindo de uma tiazolidina-2,4diona;
• Elucidar as estruturas químicas dos compostos sintetizados pelos métodos
espectroscópicos de infravermelho e ressonância magnética nuclear de
hidrogênio ;
• Avaliar a atividade antiinflamatória dos compostos sintetizados através do
modelo da peritonite induzida pelo tioglicolato e pelo zimosan;
• Avaliar a atividade antiinflamatória dos compostos sintetizados na primeira
fase da inflamação através do modelo da permeabilidade vascular;
• Avaliar a atividade analgésica dos compostos tiazolidínicos sintetizados.
Santos, I.B.V
PPARγ
PARTE QUÍMICA
43
4. Parte química
4.1. Reagentes, solventes e equipamentos
Os reagentes utilizados foram ácido cloroacético, tiouréia, acetato de etila,
benzeno, cianoacetato de etila, etanol, n-hexano, piperidina, Cloreto de 2-cloro-6flúor-benzil, cloreto de 2,4-dicloro-benzil, 2-nitro-benzaldeído, 4-flúor-benzaldeído, 4benzilóxi-benzaldeído, 4-cloro-benzaldeído, hidróxido de potássio. Os reagentes e
solventes utilizados na síntese dos compostos e para suas análises pertencem às
marcas Sigma, Aldrich, Acros, Merck, Vetec ou Quimis.
Na cromatografia em camada delgada foram utilizadas placas de sílica gel 60
Merck F254, de 0,25 mm de espessura, reveladas em luz ultravioleta (254 ou 366 nm)
ou através de vapores de iodo.
A caracterização estrutural foi realizada através da espectrofotometria de
absorção no infravermelho (IV), em espectrofotômetro FTIR Bruker Modelo IFS 66,
pastilhas de KBr. Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio
(RMN1H) foram efetuados em espectrofotômetro Varian Modelo Plus 300 MHz. Os
espectros de massas foram registrados sobre impacto eletrônico a 70 Ev em
espectrômetro R1010C Delsi-Nermag, acoplado a CPG HP5890. Para determinação
dos pontos de fusão foi utilizado aparelho Quimis Modelo 340.27.
4.2. Metodologia – Diagrama de síntese
O Esquema 1 apresenta o diagrama de síntese proposto para a preparação
de
novas
(LPSF/GQ).
Santos, I.B.V
moléculas
da
série
3-benzil-5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas
44
Esquema 01: Diagrama de síntese
4.2.1. Síntese da tiazolidina-2,4-diona
Em um balão foram adicionados a tiouréia e o ácido cloroacético, previamente
dissolvido em água. A mistura foi aquecida por 18 horas e em seguida mantida sob
refrigeração por 24 horas. Os cristais formados foram separados por filtração e
purificados através de recristalização em água destilada.
4.2.2. Síntese da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona
Em um balão foram adicionados a tiazolidina-2,4-diona e etanol absoluto. Em
seguida foi adicionada gota a gota uma solução de hidróxido de potássio em etanol
absoluto. Após 10 minutos a temperatura ambiente, o haleto de benzil foi adicionado
e a mistura foi aquecida a 65ºC por 4 horas. A mistura reacional foi resfriada e o
precipitado formado foi filtrado e purificado através de recristalizações em etanol.
Santos, I.B.V
45
4.2.3. Método geral para a obtenção dos derivados 3-benzil-5-benzilidenotiazolidina-2,4-dionas
Foram introduzidos em um balão a 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e
2-ciano-3-fenil-acrilato de etila substituídos (LPSF/IP), em etanol absoluto como
solvente e piperidina como catalisador. A mistura foi aquecida lentamente até atingir
50ºC durante 2 horas. O precipitado que se formou durante o tempo reacional, foi
separado por filtração ainda quente e purificado por lavagens sucessivas com etanol
absoluto. Após purificação foram obtidos os derivados 3-benzil-5-benzilidenotiazolidina-2,4-dionas, representados pela figura 13, e logo mais adiante, descritos
os seus nomes químicos e as suas características físico-quimicas.
Figura 12: Derivados 3-benzil-5-benzilideno-tiazolidina-2,4-diona; a – LPSF/GQ-104;
b – LPSF/GQ-158; c - LPSF/GQ-159; d – LPSF/GQ-130.
Santos, I.B.V
46
•
5-(4-Benziloxi-benzilideno)-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona
(LPSF/GQ-104)
P.F. 153-155 ºC
Rdt = 72 %
Rf= 0,70 n-hex/AcOEt 7:3
•
3-(2-Cloro-6-flúor-benzil)-5-(2-nitro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona
(LPSF/GQ-158)
P.F. 139-140ºC
Rdt = 65 %
Rf= 0,75 n-hex/AcOEt 6:4
•
3-(2-Cloro-6-flúor-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona
(LPSF/GQ-159)
P.F. 175-176ºC
Rdt = 53 %
Rf= 0,73 n-hex/AcOEt 7:3
•
5-(4-Cloro-benzilideno)-3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona
(LPSF/GQ-130)
P.F. 156-157 ºC
Rdt = 50 %
Rf= 0,52 n-hex/AcOEt 7:3
Santos, I.B.V
47
4.3. Análise Espectroscópica dos Derivados 3-benzil-5-benzilidenotiazolidina-2,4-dionas através do método de espectroscopia de infravermelho.
Tabela 03. Freqüências de absorção no infravermelho, em cm-1, dos derivados 3-benzil-5benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas.
COMPOSTO
C=O
C=C
1685
1595
1934
1603
1690
1599
1685
1603
CH2
O
O
C
H
Cl
N
S
O
F
LPSF/GQ-104
O2N
H
O
C
Cl
N
S
F
O
LPSFGQ-158
F
H
O
C
Cl
N
S
O
F
LPSF/GQ-159
Cl
H
O
C
N
S
Cl
O
Cl
LPSF/GQ130
Santos, I.B.V
48
4.4. Análise Espectroscópica dos Derivados 3-benzil-5-benzilidenotiazolidina-2,4-dionas através do método de espectroscopia de ressonância
1
δ ppm/DMSO-d6).
magnética nuclear de hidrogênio - RMN H (δ
Tabela 04. Deslocamentos químicos (δ) em ppm dos derivados 3-benzil-5-benzilideno-tiazolidina-2,4dionas.
Estrutura
CH=
CH2
OCH
Hidrogênios
Hidrogênios
Hidrogênios
2
Benzilidênicos
Benzílicos
Benziloxi
7,24 (t, 1H)
CH2
O
7,87
O
C
H
N
S
O
4,97
5,19
Cl
F
7,59 (d, 2H)
J= 8,7 Hz
J= 9 Hz
7,34 (d, 1H)
7,34 – 7,48
7,19 (d, 2H)
J= 8,1 Hz
(m, 5H)
J= 9 Hz
7,40 (t, 1H)
LPSF/GQ-104
J= 8,4 Hz
7,73 (d, 1H)
O2N
H
O
C
Cl
N
S
O
8,14
4,99
-
J= 7,5 Hz
7,38 (d, 1H)
8,21 (d, 1H)
J= 7,2 Hz
J= 7,2 Hz
7,34 (t, 1H)
7,89 (dd, 1H)
J= 8,4 Hz
J= 7,5 Hz
7,42 (dd, 1H)
7,74 (dd, 1H)
J= 8,1 Hz
-
F
J= 7,2 Hz
LPSF/GQ-158
F
H
O
C
Cl
N
S
O
7,94
4,99
-
F
7,72 – 7,35
7,43 – 7,21
(m, 4H)
(m, 3H)
-
LPSF/GQ-159
Cl
7,37 (dd, 2H)
H
O
C
N
S
7,65 (dd, 4H)
J= 8,4 Hz
J= 9 Hz
7,68 (s, 1H)
Cl
7,98
O
Cl
LPSF/GQ-130
Santos, I.B.V
4,88
-
-
PPARγ
PARTE BIOLÓGICA
49
5) Parte Biológica
5.1 Animais
Estudar a inflamação peritoneal em animais experimentais, respeitando as
condições éticas que acompanham o uso dos mesmos, constitui um bom meio para
um melhor entendimento das interações fisiopatológicas que acometem as
desordens inflamatórias (RHODEN e RHODEN, 2006)
Embora quase todos os animais convencionais de experimentação tenham
sido utilizados, aqueles de menor porte são os mais frequentemente empregados.
Este fato foi constatado depois de um levantamento realizado compreendendo
48
estudos, sendo verificado que 78,39% dos pesquisadores usaram rato e
camundongo como animais de experimentação (RHODEN e RHODEN, 2006).
Firmando um protocolo ideal, a escolha do animal experimental é um fator a ser
considerado.
Para o desenvolvimento deste trabalho, foram utilizados camundongos
albinos Swiss (Mus musculus) de ambos os sexos, com faixa etária de 60 dias e
peso variando entre 25 e 30 g, provenientes do Biotério do Departamento de
Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Todos os procedimentos
realizados seguiram as diretrizes preconizadas pelo Manual sobre Cuidados e Usos
de Animais de Laboratório (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, 2003),
com inúmeros esforços para minimizar o número e o sofrimento dos animais
utilizados.
Inicialmente, os camundongos foram submetidos a um período de adaptação,
sendo mantidos em gaiolas sob condição padronizada de iluminação (ciclo
claro/escuro de 12 horas), temperatura de 22 ± 2ºC e recebendo água ad libitum e
dieta padrão. Após este estágio, foram realizados os experimentos. Os
procedimentos experimentais foram realizados sempre pela manhã, e concluídos
num mesmo dia. Os protocolos utilizados foram aprovados pelo Comitê de Ética na
Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pernambuco (processo
nº. 23076, 0040,13/2008-35).
Santos, I.B.V
50
5.2 Substâncias utilizadas
EDTA
Azul de Evans (Sigma);
Tioglicolato de sódio a 3%;
Zimosam (Sigma);
Ácido acético;
Cetamina e xilazina (50 e 10 mg/Kg, respectivamente);
NaCl a 0,9%
5.3 Delineamento experimental
5.3.1. Toxicidade aguda
Os animais selecionados para este ensaio foram camundongos fêmeas:
1. GRUPO LPSF/GQ (n=3), tratamento com o LPSF/GQ-130
5.3.2. Atividade antiinflamatória
A atividade antiinflamatória dos LPSF/GQs foi avaliada utilizando diferentes
mediadores inflamatórios, com o objetivo de demonstrar a possível atividade
antiinflamatória dos compostos, bem como propor um provável mecanismo de ação.
Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais, conforme
homogeneidade dos seus pesos corporais:
1. GRUPO SALINA (n=8), injeção de solução salina na cavidade peritoneal, sem
tratamento prévio;
2. GRUPO CONTROLE NEGATIVO (n=8), injeção do agente flogístico na
cavidade peritoneal, sem tratamento prévio;
3. GRUPO LPSF/GQ (n=8), injeção do agente flogístico na cavidade peritoneal,
com tratamento prévio dos LPSF/GQs;
Santos, I.B.V
51
4. GRUPO REFERÊNCIA (n=8), injeção do agente flogístico na cavidade
peritoneal, com tratamento prévio da substância referência;
5.3.3. Atividade antinociceptiva
Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais, conforme
homogeneidade dos seus pesos corporais:
1. GRUPO CONTROLE NEGATIVO (n=10), indução do estímulo, sem
tratamento prévio;
2. GRUPO LPSF/GQ (n=10), indução do estímulo, com tratamento prévio dos
LPSF/GQs;
3. GRUPO REFERÊNCIA (n=10), indução do estímulo, sem tratamento prévio,
com tratamento prévio da substância referência;
5.4. Protocolos experimentais
Não há dúvida que os modelos experimentais, utilizados hoje em dia,
contribuem bastante para o entendimento de processos inflamatórios. Entretanto, é
importante saber discernir os pontos fortes e fracos do modelo, possibilitando uma
real extensão dos resultados experimentais para testes clínicos. Desde 1950,
inúmeros modelos experimentais de indução de peritonite, com mecanismos
diferentes do ponto de vista qualitativo e quantitativo, foram e vêm sendo descritos
na literatura. Tendo em vista este leque de oportunidades, a escolha de um modelo
dependerá da finalidade do estudo. O processo inflamatório pode ser induzido
através de diferentes estímulos - carragenina, zimosan, tioglicolato de sódio,
dextrana, ácido acético, óleo de Cróton, dentre outros (CARVALHO, 1998; ROWLEY
E BENDITT, 1956; BONHOMME-FAIVRE, 2000; DOHERTY et al., 1985;
KOLACZKOWSKA et al., 2001a).
Desta forma, foi escolhido para avaliar a atividade antiinflamatória dos novos
derivados tiazolidínicos os protocolos experimentais de peritonites induzidas por
tioglicolato e zymosan (BONHOMME-FAIVRE, 2000; DOHERTY et al., 1985;
KOLACZKOWSKA et al., 2001a).
Santos, I.B.V
52
5.4.1. Toxicidade aguda
Toxicidade oral aguda refere-se aos efeitos adversos ocorridos após a
administração oral de uma dose única de uma substância, ou múltiplas doses
dadas num prazo de 24 horas.
No presente estudo, esta atividade foi realizada expondo os animais (n=3) a
uma dose única de 2000mg/kg do composto LPSF/GQ-130 pela via oral. Os
camundongos, após o tratamento foram monitorados por 60 minutos, foram inclusos
nas observações diversos parâmetros comportamentais – irritação, sonolência,
frêmito vocal, ptose, defecação, dentre outros. Passado este período, foram
observados até 24 horas. O experimento teve duração de 14 dias. Ainda, foi
monitorada a ingestão da ração pelos animais e o peso corporal, diariamente. A
metodologia seguida foi desenvolvida segundo os pesquisadores Roll, Höfer-Bosse
e Kayser (1986).
5.4.2. Permeabilidade vascular induzida por ácido acético
A permeabilidade vascular foi avaliada segundo o método descrito por Whittle
(1964). A mesma foi induzida por ácido acético, em camundongos albinos adultos de
ambos os sexos. Estes foram deixados em jejum e com água a vontade por um
período de 6 horas. Passado este período, os camundongos foram submetidos a um
pré-tratamento com as substâncias investigadas – LPSF/GQ-130 e LPSF/GQ-130,
ambas na dose de 30µmol/kg, por via oral. Após 1 hora do tratamento foi realizada a
injeção no plexo retro-orbital (02 mL / camundongo) do corante Azul de Evans 1%,
em seguida administrou-se a solução de ácido acético 1% no peritônio dos animais,
objetivando causar a peritonite aguda. Cada animal recebeu 0,5 mL. Após um
intervalo de 30 minutos, os animais foram sacrificados, sob anestesia associativa de
cetamina com xilazina. Compondo a etapa de coleta do exsudato, foram injetados na
cavidade peritoneal 2 mL de Solução de NaCl 0,9%, para que assim, o exsudato
peritoneal fosse coletado e centrifugado a 200 × g durante 10 min. A absorbância do
sobrenadante foi lida a 610 nm por meio do método ELISA (thermo plate).
Santos, I.B.V
53
Figura 13: Análise da permeabilidade vascular: Grupo dos animais experimentais (A); Pré-tratamento
com os LPSF/GQs (B); Injeção do azul de Evans (i.v) no plexo retro-orbital (C); Administração do
ácido acético, via intraperitoneal (D); Coleta do exsudato (E); Medida da permeabilidade através de
teste colorimétrico, no aparelho ELISA.
5.4.3. Avaliação da atividade antiinflamatória – peritonite induzida por
tioglicolato
Os camundongos, em jejum de 6 horas, foram divididos em grupos e tratados
(v.o) com as substâncias teste (10µmol/kg), indometacina (28µmol/kg), rosiglitazona
(10µmol/kg) e solução salina. Após 1 hora do tratamento, foram submetidos ao
ensaio de peritonite, recebendo a administração i.p de 0,5 mL de solução de
tioglicolato 3%. Após quatro horas, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical, sendo injetados na cavidade peritoneal 2 mL de PBS heparinizado (10
UI/mL). A contagem de leucócitos totais migrados foi realizada em câmara de
Neubauer, com amostras do PBS recuperadas (BONHOMME-FAIVRE, 2000). A
figura 17 representa todo o procedimento utilizado para a realização deste ensaio.
Santos, I.B.V
54
Figura 14: Coleta de leucócitos peritoneais em camundongos: Grupo dos animais experimentais (A);
Pré-tratamento com os LPSF/GQs (B); Indução da peritonite (tioglicolato ou zymosan) (C); Injeção da
solução de EDTA na cavidade abdominal(D); Coleta do exsudato (E); Contagem dos leucócitos.
5.4.4. Avaliação da atividade antiinflamatória – peritonite induzida por zimosan
Os camundongos, em jejum de 6 horas, foram divididos em grupos e tratados
(v.o) com as substâncias teste (10µmol/kg), indometacina (28µmol/kg), rosiglitazona
(10µmol/kg) e solução salina. Após 1 hora do tratamento, foram submetidos ao
ensaio de peritonite, recebendo a administração i.p de 0,5 mL de solução de
zimosan (0,2mg/mL). Após quatro horas, os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical, sendo injetados na cavidade peritoneal 2 mL de PBS
heparinizado (10 UI/mL). A contagem de leucócitos totais migrados foi realizada em
câmara de Neubauer, com amostras do PBS recuperada (DOHERTY et al., 1985;
KOLACZKOWSKA et al., 2001a).
Santos, I.B.V
55
5.4.5. Avaliação da atividade antinociceptiva – contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético em camundongos
O ensaio foi realizado utilizando a técnica descrita por Koster, 1959. Os
camundongos foram tratados 1 hora antes por via oral com as substâncias teste LPSF/GQs 130 e 159, ambos na dose de 30 µmol/kg. Em seguida foi administrado
na cavidade peritoneal dos animais 0,5 mL da solução de ácido acético (1%), o que
fez induzir as contorções abdominais, para tornar viável a avaliação dos possíveis
efeitos analgésicos dos compostos em estudo. O número de contorções abdominais
ocorridos entre 5 e 20min após a injeção do ácido acético injeção foi registrado.
Indometacina (28 µmol/kg) foi utilizada como fármaco de referência.
5.4.6. Avaliação da atividade antinociceptiva – Indução do efeito nociceptivo
por formalina
Para avaliar esta atividade os animais foram divididos em 2 lotes (n=10), em
seguida receberam as substâncias de acordo com o grupo a que pertenciam por via
oral, um grupo recebeu a substância teste LPSF/GQ-130 na dose de 30µmol/kg,
outro o veículo e o terceiro grupo a dipirona (26µmol/kg), como fármaco de
referência. Decorrido o tempo de 60 minutos da administração da droga teste e do
veículo, os animais receberam a injeção de 20 µL de formalina a 1 % na pata
traseira direita e em seguida foi mensurada a sensitividade utilizando um cronômetro
observando o tempo acumulado em segundos durante o qual o animal lambe a pata
nos primeiros 5 minutos (fase 1), e depois, de 20 a 25 minutos (fase 2) totalizando o
tempo de 30 minutos. O estímulo doloroso foi induzido pela injeção de 20 µL de
formalina a 1 % na pata traseira direita do camundongo. O tempo total do
experimento foi de 30 minutos (HUNSKAAR, 1987). Determinou-se o percentual de
inibição nos grupos tratados com LPSF/GQ-130 em comparação ao grupo controle.
Santos, I.B.V
56
5.4.7. Análise estatística
Todos os resultados numéricos estão expressos como média ± erro padrão.
Os dados foram estatisticamente analisados através do teste ANOVA, usando
Microcal Origin versão 7.0.p< 0,05 foram considerados significativos.
Santos, I.B.V
PPARγ
RESULTADOS E DISCURSSÃO
57
6. Resultados e Discussão
No presente estudo foi demonstrado que os compostos LPSF/GQ-104,
LPSF/GQ-130, LPSF/GQ-158 e LPSF/GQ-159 (10µmol/kg) apresentaram efeito
antiinflamatório em modelos experimentais in vivo. Todavia, antes das investigações
destas propriedades terapêuticas, foi realizado o teste da toxicidade aguda com o
LPSF/GQ-130, onde foi observado que apesar dos animais terem apresentado
alguns comportamentos não habituais, como baixo frêmito vocal, tremores, ptose e
sonolência, a nova TZD não levou nenhum animal a óbito com a dose única
investigada (2000mg/kg). Durante 14 dias foi feita a monitorização da ingestão
alimentar não sendo observada nenhuma variação de peso significativa em relação
ao grupo controle. Os resultados demonstraram baixa toxidade da molécula
avaliada, dados que estão de acordo com estudos realizados por Santos e
colaboradores (2005).
Os resultados da atividade antiinflamatória dos derivados LPSF/GQs,
utilizando como agente flogístico o tioglicolato de sódio a 3% estão mostrados na
tabela 3. Os quatro compostos sintetizados e os fármacos de referência
(indometacina e rosiglitazona) inibiram a resposta inflamatória induzida por
tioglicolato de sódio a 3%. De acordo com a análise estatística, os LPSF/GQs
demonstram efetividade na inibição da resposta inflamatória, tendo como destaque o
derivado LPSF/GQ-130, que apresentou uma inibição da migração celular de 70,4%.
Em virtude deste composto ter sido o que apresentou melhor atividade, foi
selecionado para investigação do mecanismo de ação.
A seleção dos fármacos de referência, indometacina e rosiglitazona, foi feita
levando-se em consideração o fato do primeiro se tratar de um agente
antiinflamatório, inibidor preferencial da COX-1, bastante conhecido e o segundo por
ser uma glitazona agonista PPARγ.
Santos, I.B.V
58
Tabela 05. Efeitos dos novos derivados tiazolidínicos sobre a migração celular induzida por
Tioglicolato de sódio a 3%.
Dose (µ
µMol / Kg) e
via de
administração
Número de PMNL
(por cavidade)
± S.E
celular (%)
LPSF/GQ-158
10
v.o
10,8± 0,8 x 105
58,5
LPSF/GQ-159
10
v.o
10,1± 0,8 x 105
61,1
11,12±0,7 x 10
LPSF/GQ-104
10
v.o
LPSF/GQ-130
10
v.o
Derivados tiazolidínicos
Inibição da
migração
5
57,5
b
b
b
7,7 ± 0,5 x 105*
70,4
6,5 ± 0,5 x 105
75,1
INDOMETACINA
28
v.o
ROSIGLITAZONA
10
v.o
13,8± 0,6 x 105
45,4
-
26,2 ± 1,5 x 105
-
CONTROLE (Salina)
a
Os valores representados são significativos (a) em relação ao grupo controle, para o intervalo de
confiança de 95% (ANOVA, teste de Bonferrori). PMNL = Leucócitos polimorfonucleares. (b) =
resultados não significativamente diferentes entre grupos.
Santos, I.B.V
59
O estudo realizado com o composto LPSF/GQ-130 em três doses,
representado na tabela 4, apresentou o mesmo perfil do experimento anterior.
Porém, não foi observada uma relação dose-dependente, tornando inviável a
determinação da ED50.
Tabela 06. Estudo dose-resposta do derivado tiazolidínico LPSF/GQ-130 na peritonite induzida
por tioglicolato 3%.
Derivados tiazolidínicos
LPSF/GQ-130
CONTROLE
Dose(µ
µMol / Kg) e
via de
administração
Número de PMNL
(por cav.)
± S.E
3
v.o
8,9 ± 1,4 x 10
10
v.o
7,7 ± 0,5 x 105
30
v.o
8,5 ± 0,6 x 10
-
26,2 ± 1,5 x 105
Inibição da
migração
celular (%)
5
66,0
a
b
70,4
5
67,3
b
-
Os valores representados são significativos (a) em relação ao grupo controle, para o intervalo de
confiança de 95% (ANOVA, teste de Bonferrori). PMNL = Leucócitos polimorfonucleares. (b) =
resultados não significativamente diferentes entre grupos.
Estudos recentes têm demonstrado o potencial dos derivados tiazolidínicos
em inibir a resposta inflamatória. Alguns derivados tiazolidínicos foram sintetizados e
mostraram efeito antiinflamatório através de diferentes modelos de inflamação –
peritonite e air pouch, ambos induzido por carragenina (Miranda, 2008; Uchoa,
2008). De acordo com Szanto e Nagy (2008), esta propriedade terapêutica advém
da relação existente entre as TZDs e a ativação do receptor PPARγ.
A peritonite é uma condição inflamatória freqüentemente com morbidade e
mortalidade severas, como etiologia pode incluir bactérias, fungos e parasitas. A
peritonite ocorre quando um foco infeccioso intra-abdominal desencadeia uma
resposta sistêmica. Esta resposta se caracteriza por ativação nos sistemas de
cascata (complemento, coagulação, cininas, fibrinólise), células (endoteliais,
leucócitos, monócitos, macrófagos e mastócitos) e liberação de mediadores (radicais
livres de oxigênio, histamina, eicosanóides, fatores de coagulação e citocinas)
Santos, I.B.V
60
(TEITEAUM, 2006; FERRAZ e FERRAZ, 2002). Este ensaio avaliou a migração
leucocitária por meio da contagem de leucócitos presentes no exsudato liberado na
cavidade peritoneal, após a administração de um agente flogístico. No modelo de
peritonite induzida por tioglicolato, ambas a células, mastócitos e macrófagos, atuam
no aumento da permeabilidade vascular (KOLACZKOWSKA et al, 2002). De acordo
com a resposta inflamatória apresentada pelos LPSF/GQs, através do modelo de
peritonite, sugere que estas moléculas estejam inibindo o mesmo perfil celular.
Neste estudo, os resultados demonstram que o LPSF/GQ-130 apresentou atividade
antiinflamatória significativa, revelando uma inibição de 70,4% em relação ao grupo
controle.
Para avaliar a participação de outras células, como os neutrófilos no
mecanismo de ação dos LPSF/GQs, foi realizada, também, a peritonite induzida por
zimosan, cujos resultados se encontram na tabela 5.
Tabela 07. Estudo dose-resposta do derivado tiazolidínico LPSF/GQ-130 na peritonite induzida
por zimosan.
Derivados tiazolidínicos
LPSF/GQ-130
Dose(µ
µMol / Kg) e
via de
administração
Número de PMNL
(por cav.)
± S.E
celular (%)
3
v.o
14,0 ±1,6 x 105
46,3
10
v.o
15,0 ± 0,7 x 10
30
v.o
ROSIGLITAZONA
10
v.o
INDOMETACINA
28
v.o
CONTROLE
-
5
9,1 ± 0,6 x 105
8,5 ± 1,1 x 105
12,5± 1,8 x 10
5
25,4 ± 0,8 x 105
Inibição da
migração
40,6
a
b
b
64,1
66,2
52,3
-
Os valores representados são significativos (a) em relação ao grupo controle, para o intervalo de
confiança de 95% (ANOVA, teste de Bonferrori). PMNL = Leucócitos polimorfonucleares. (b) =
resultados não significativamente diferentes entre grupos.
Santos, I.B.V
61
Entretanto, nos experimentos com tioglicolato e zimosan, não foi observada
uma relação dose-dependente. Podendo este perfil estar relacionado à solubilidade
do produto ou absorção errática, tornando inviável a determinação da ED50.
Kolaczkowska
e
colaboradores
(2006a)
injetaram
zimosan
intraperitonealmente em camundongos, e revelaram a presença da MMP-9, um
estímulo crítico para a infiltração de neutrófilos para o foco da inflamação. Desta
forma, foi comprovada a eficácia dos compostos quanto à inibição da migração
celular, seja de neutrófilos ou macrófagos, visto que de acordo com o agente
flogístico utilizado, há o recrutamento inicial de um ou de outro perfil celular
(KOLACZKOWSKA et al, 2002). Desta forma, a atividade antiinflamatória
apresentada pelo LPSF/GQ-130, na peritonite induzida por zimosan, sugere a
inibição de neutrófilos e macrófagos.
A redução dos polimorfonucleares pode refletir algum efeito citotóxico de
antiinflamatórios
não-esteroidais.
Segundo
Ale
et
al,
1988,
os
fármacos
antiinflamatórios atuam sobre a superfície da membrana plasmática dos leucócitos,
particularmente dos monócitos, inviabilizando sua capacidade de fagocitose fato que
pode ser atribuído a uma possível ação dos compostos avaliados.
A atividade antiinflamatória é uma das diversas funções atribuídas aos
agonistas do PPAR. PPARγ inibe o recrutamento de macrófagos para os locais de
inflamação reprimindo a transcrição de proteína quimiotática de monócitos-1(MCP-1)
e seu receptor CC quimiocina receptor 2 (CCR2) nos macrófagos (BABAEV et al.,
2005; BARLIC et al., 2006; CHEN et al., 2005; HAN et al., 2000; SHAH et al., 2007).
PPARγ e seus agonistas têm sido utilizados para o estudo de doenças inflamatórias.
Muitas doenças humanas e modelos animais foram analisados, revelando que
ativadores testados para este receptor inibiam a progressão de doenças e agiam no
controle da reação inflamatória. Estes estudos envolvem investigações in vivo e ex
vivo, os quais mostram a ativação do PPARγ.
No presente estudo os compostos testados apresentaram atividades
antiinflamatórias promissoras frente a vários agentes inflamatórios.
No intuito de avaliar a ação dos LPSF/GQs na liberação de aminas vasoativas
(histamina, bradicinina, serotonina) e formação de edema, foi avaliada a
permeabilidade vascular induzida por ácido acético. Na figura 18, são observados os
Santos, I.B.V
62
resultados obtidos com o referido ensaio, o qual foi expresso em termos da
concentração do corante (µg / camundongo), que extravasou na cavidade peritoneal.
Figura 15: Efeito dos novos derivados tiazolidínicos na permeabilidade vascular induzida por ácido
acético. (Todos os efeitos foram significativos, para mais ou para menos, em relação ao grupo
controle.
Os resultados mostram que as TZDs LPSF/GQ-159 e rosiglitazona nas doses
testadas não reduziram a permeabilidade vascular induzida por ácido acético,
portanto não possuindo efeito na primeira fase da resposta inflamatória,
caracterizada pela ação das aminas bioativas, ao contrário, aumentou a
permeabilidade vascular. Estes achados estão de acordo com os dados de
Yamakawa e colaboradores (2000), Jozkowicz e colaboradores (2001), onde
demonstraram que a Rosiglitazona promoveu o aumento da expressão do fator de
crescimento
endotelial
vascular
(VEGF),
resultando
em
alterações
na
microcirculação, bem como retenção de líquido e consequentemente o edema.
Assim, ao invés de reduzir, aumentou a permeabilidade vascular.
Em contrapartida, o LPSF/GQ-130 mostrou-se eficiente, assim como a
indometacina (AINE), em inibir a permeabilidade vascular. Sugere-se que este
comportamento possa ser decorrentes da diferença entre suas estruturas químicas.
Provavelmente, o LPSF/GQ-159 atua apenas na segunda fase da inflamação aguda,
envolvendo mediadores como eicosanóides, citocinas e quimiocinas, sem interferir
na liberação de mediadores com histamina, serotonina e bradicinina.
Santos, I.B.V
63
Ward e Lentsch (2002) analisaram as características das três etapas que
envolvem a resposta inflamatória aguda: aumento da permeabilidade vascular,
levando a fuga de fluidos e proteínas para o espaço extravascular, compondo a
exsudação; aderência de leucócitos às células endoteliais seguida por sua
transmigração para o tecido lesionado, e ativação de macrófagos residentes
no
tecido, os quais liberam citocinas e quimiocinas através do mecanismo dependente
ao fator nuclear de transcrição NFkB. A resposta inflamatória pode ser bloqueada,
suprimida ou modulada por pelo menos quatro mecanismos: (a) neutralização ou
destruição de mediadores pró-inflamatórios através de enzimas do plasma e dos
tecidos,(b) produção de mediadores antiinflamatórios IL-4, IL-10, sintetizados por
macrófagos e células T, relacionada com a ativação do NFkB, (c) ativação dos
precursores colinérgicos e adrenérgicos, e(d) regulação por vias sinalizadoras
intracelulares que negativamente atuem em receptores envolvidos na resposta
inflamatória. O equilíbrio entre os elementos pró e antiinflamatórios é um
determinante essencial na contenção da reação inflamatória e suas conseqüências
sobre a integridade do tecido lesionado.
Além da avaliação da atividade antiinflamatória, foi verificado se o LPSF/GQ130 também estava envolvido na atividade antinociceptiva, através do ensaio das
contorções induzidas por ácido acético e pela nocicepção induzida por formalina. A
tabela 6 e 7 mostram os dados resultantes destes ensaios, respectivamente.
Tabela 08. Efeito dos compostos LPSF/GQs (130 e 159) sobre as contorções induzidas por
ácido acético.
Tratamento
Dose (µmol / Kg)
Controle
LPSF/GQ-130
LPSF/GQ-159
Dipirona
Os valores representados (a média ±
controle (a) (N = 8).
Santos, I.B.V
30
30
26
erro
Contorções e
% inibição
estiramentos
83,4± 0,7
62,1± 0,3
25,4
55,4± 0,1
33,6
22,6± 4,8
73,0
padrão) são significativos (P < 0.05) em relação ao grupo
64
Tabela 09. Efeito do composto LPSF/GQ-130 sobre a nocicepção induzida por formalina.
Tempo de lambida da pata (s) %
Composto
Dose
Média
Média
Proteção
Proteção
(µmol / Kg)
1ª Fase
2ª Fase
1ª Fase
2ª Fase
46 ± 0,4
48 ± 1,0
-
-
Controle
Dipirona
26
20 ± 2,4
8 ± 1,9
56%
83%
LPSF/GQ-130
10
44 ± 0,4
21 ± 0,3
4%
56%
Os valores representados (a média ± erro padrão) são significativos (P < 0.05) em relação ao grupo
controle (a) (N =10).
Os resultados encontrados para o LPSF/GQ-130 e o LPSF/GQ-159,
demonstram que eles possuem efeito analgésico moderado, inibindo as contorções
abdominais pelo ácido acético em 25,4% (LPSF/GQ-130) e 33,6% (LPSF/GQ-159).
Estes achados indicam, portanto, que esta atividade pode ser decorrente da inibição
direta ou indireta da liberação de mediadores pró-inflamatórios induzida pelo ácido
acético, como prostaglandinas e citocinas. O modelo utilizado é considerado
relativamente simples, com pouca especificidade, de fácil observação, rápido e com
boa sensibilidade a várias substâncias analgésicas e a fármacos antiinflamatórios
não-esteroidais (KOSTER et al, 1959; BLANE, 1967; BLUMBERG et al, 1965;
SIEGMUND et al, 1957 a,b). O ácido acético atua indiretamente causando a
liberação de substâncias endógenas envolvidas na modulação da nocicepção,
incluindo a bradicinina, serotonina, histamina e as prostaglandinas (RAO et al., 2005;
WITKIN t al., 1961). Recentemente, Ribeiro e colaboradores (2000) mostraram que a
nocicepção induzida por este estímulo depende também da liberação de citocinas,
como a IL-1β, TNFα, IL-8 a partir de macrófagos e basófilos residentes na cavidade
abdominal, e que em conjunto com os outros mediadores mencionados
anteriormente, podem induzir a nocicepção característica observada neste modelo.
A realização do segundo modelo de nocicepção proposto – nocicepção
induzida por formalina – corroborou para a ação periférica dos agentes LPSF/GQs
(159 e 130), uma vez que somente houve a ação antinociceptiva dos compostos na
segunda fase do estímulo. O teste da formalina é um dos modelos mais utilizados
para explicar os mecanismos de dor e analgesia, com melhores resultados do que
os testes que utilizam estímulos mecânicos ou térmicos. Este teste é constituído por
Santos, I.B.V
65
duas fases: a primeira, neurogênica, resulta da atividade química irritante da
formalina sobre os neurônios nociceptivos; a segunda fase, tônica, é conseqüência
das mudanças provocadas pelo estímulo nociceptivo sobre os neurônios do corno
posterior. (TJOLSEN, 1992). O fármaco de referência utilizado, a dipirona na dose
de 26µmol/Kg, parece atuar exercendo bloqueio direto da hiperalgesia inflamatória
por
PGE2,
supostamente
promovendo
dessensibilização
dos
nociceptores
periféricos (Lorenzetti, Ferreira, 1985). Este mecanismo de dessensibilização,
provavelmente envolve a ativação da via óxido-nítrico – GMPc no nociceptor (Duarte
et al., 1992; Lorenzetti, Ferreira, 1996). Os resultados deste ensaio permitem sugerir
que o derivado tiazolidínico avaliado (LPSF/GQ-130) compartilha alguns dos
mecanismos comuns já descritos para o dipirona.
Em conclusão, neste estudo foram obtidas resultados importantes dos
LPSF/GQs frente às investigações em modelos in vivo de inflamação e nocicepção,
uma vez que foram efetivos em inibir a nocicepção periférica e, mais
consideravelmente, a migração celular. Desta forma, sugerimos que estas
moléculas, com o destaque para o LPSF/GQ-130, são potenciais candidatos a
fármacos antiinflamatórios e analgésicos.
Santos, I.B.V
PPARγ
CONCLUSÕES
66
7. Conclusões
Após a realização deste trabalho, que teve como propósito identificar novos
fármacos do grupo das TZDs biologicamente ativos frente às enfermidades
inflamatórias, pudemos concluir que:
Os compostos obtidos foram caracterizados estruturalmente através dos
métodos clássicos de análise espectroscópica de ressonância magnética
nuclear de hidrogênio e infravermelho, além de determinadas as propriedades
físico-químicas.
Nos modelos de inflamação testados, os novos derivados avaliados
mostraram bons resultados antiinflamatórios, dando um destaque para o
LPSF/GQ-130.
Na avaliação da atividade antinociceptiva, realizada através das contorções
induzidas pelo ácido acético, as TZDs LPSF/GQ-130 e LPSF/GQ-159
apresentaram resultados moderados. E, o ensaio da nocicepção induzida por
formalina pôde confirmar a ação antinociceptiva periférica das LPSF/GQs
avaliadas.
Apenas
um
dos
compostos
avaliados,
o
LPSF/GQ-130,
inibiu
a
permeabilidade vascular, enquanto o outro apresentou efeito oposto,
sugerindo que estes comportamentos possam ser decorrentes da diferença
entre suas estruturas químicas.
Santos, I.B.V
PPARγ
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
67
8. Referências Bibliográficas
ADAMS, D.O., HAMILTON, T.A. The cell biology of macrophage activation. Annu.
Rev. Immunol. 2, 283–318. 1984.
ALAMANOS, Y.; Drosos AA.
Epidemiology
of
adult
rheumatoid
arthritis.
Autoimmun. Rev.;4(3):130-6. 2005.
ALBUQUERQUE, J.F.C.; ROCHA FILHO, J.A.; BRANDÃO, S.S.F.; LIMA, M.C.A.;
XIMENES, E.A.; GALDINO, S.L.; PITTA, I.R.; CHANTEGREL, J.; PERRISSIN, M.;
LUU-DUC,
C.
Synthesis
And
Antimicrobial
Activity
Of
Substituted
Imidazolidinediones And Thioxoimidazolidinones. Il Farmaco, V. 54, P. 77-82,
Nov.1999.
ALLAHTAVAKOLI,
M.,
SHABANZADEH,
A.P.,
SADR,
S.S.,
PARVIZ,
M.,DJAHANGUIRI, B. Rosiglitazone, a peroxisome proliferator-activated receptorgamma ligand, reduces infarction volume and neurological deficits in an embolic
model of stroke. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33 (11), 1052–1058. 2006.
ALLE, N.; ALLE, N.; MARCHESANO, L.H. Determinação dos efeitos das drogas
antiinflamatórias não esteróides(Indometacina,Butazona, Clinoril, Naprozil, Benflogin
e Inflaril) nos leucogramas de ratos portadores de processo inflamatório crônico.
Ver. Odont. USP. v. 2, n.2, p.120-126, abr./jun., 1988.
APPEL S., MIRAKAJ V., BRINGMANN A., WECK M. M., GRUNEBACH F. AND
BROSSART P. PPAR-gamma agonists inhibit toll-like receptor-mediated activation of
dendritic cells via the MAP kinase and NF-kappaB pathways. Blood, 106, 3888–
3894. 2005.
ASHBURN, M.A., STAATS, P.S. Management of chronic pain. Lancet. v.353:18651869. 1999.
Santos, I.B.V
68
AZEBAZE, A.G.B., MEYER, M., VALENTIN, A., NGUEMFO, E.L., FOMUM, T.Z.,
PERIANAYAGAM, J.B., SHARMA, S.A., PILLAI, K.K. Anti-inflammatory activity of
Trichodesma
indicun
root
extracts
in
experimental
animals.
Journal
of
Ethnopharmacology 104, 410–414. 2006.
BABAEV, V.R., YANCEY, P.G., RYZHOV, S.V., KON, V., BREYER, M.D.,
MAGNUSON, M.A., FAZIO, S., LINTON, M.F. Conditional knockout of macrophage
PPARgamma increases atherosclerosis in C57BL/6 and low-density lipoprotein
receptor-deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25, 1647–1653. 2005.
BALKWILL, F., COUSSENS, L. M. Cancer: an inflammatory link. Nature.
431,405−406. 2004.
BARLIC, J., ZHANG, Y., FOLEY, J.F., MURPHY, P.M. Oxidized lipid-driven
chemokine receptor switch, CCR2 to CX3CR1, mediates adhesion of human
macrophages to coronary artery smooth muscle cells through a peroxisome
proliferator-activated receptor gamma-dependent pathway. Circulation 114, 807–
819. 2006.
BASBAUM, A.I, JULIUS, D. Toward better pain control. Sci. Am. 294(6):60-67. 2006.
BLANE, G.F. Blockade of bradykinin induced nociception in the rat as a test for
analgesic drugs with particular reference to morphine antagonists. J. Pharmacol., v.
19, p. 367-376, 1967.
BLUMBERG H.; WOLF,P.S.; DAYTON, U.B. Use of the writing test for evaluating
analgesic activity of narcotic antagonists. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., v. 118,p. 763766, 1965.
BOTTING, R.M. Cyclooxigenase: Past, present and future. A tribute to John R. Vane
(1927-2004).Journal of Thermal Biology, 31: 208-219. 2006.
Santos, I.B.V
69
BONHOMME-FAIVRE, L., DEPRAETERE, P., SAVELLI, M.P, AMDIDOUCHE D. ,
BIZI, E., SEILLER, M. AND ORBACH-ARBOUYS, S. Charcoal
suspension
for
tumor labelling modifies macrophage activity in mice. Life Sciences, Vol. 66, No.
9, pp. 817-827, 2000.
BRENOL, J.C.T.; XAVIER, R.M.; MARASCA, J. Antiinflamatórios Não Hormonais
(Ainhs) Convencionais. Revista Brasileira De Medicina, Ed. Especial, V.57 P. 1-12,
2000.
BROWNING, L.M., KREBS, J.D., JEBB, S.A. Discrimination ratioanalysis of
inflammatory markers: implications for the study of inflammation in chronic disease.
Metabolism. 53, 899–903. 2004.
BRUNE, K., HINZ, B. Selective cyclooxygenase-2 inhibitors: similarities and
differences. Scand J Rheumatol. v.33:1-6. 2004.
CALIXTO, JB., CAMPOS, M.M., OTUKI, MF., SANTOS, AR.
Anti-inflammatory
compounds of plant origin. Part II. Modulation of pro-inflammatory cytokines,
Chemokines and adhesion molecules. Planta Med. 70(2):93-103. 2004.
CARVALHO, J.C.T. Validação química-farmacológica da espécie vegetal Pterodon
emarginatus Vog. (atividade antiinflamatória). São Paulo, 184 p. Dissertação de
Doutorado - FCF/USP, 1998.
CHANDRASEKHARAN, N.V., DAI, H., ROOS,K.L, EVANSON, N.K., TOMSIK, J.,
ELTON, T.S., SIMMONS,D.L. COX-3, a cyclooxigenase-1 variant inhibited by
acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, and
expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13926-13931. 2002.
CHEN, H., MONTAGNANI, M., FUNAHASHI, T., SHIMOMURA, I, QUON, MJ.
Adiponectin stimulates production of nitric oxide in vascular endothelial cells. J Biol
Chem; 278:45021-6. 2003.
Santos, I.B.V
70
CHEN, Y., GREEN, S.R., HO, J., LI, A., ALMAZAN, F., QUEHENBERGER, O. The
mouse CCR2 gene is regulated by two promoters that are responsive to plasma
cholesterol and peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 332, 188–193. 2005.
CHEN, S.D.,WU, H.Y., YANG, D.I., LEE, S.Y., SHAW, F.Z., LIN, T.K., LIOU,C.W.,
CHUANG, Y.C. Effects of rosiglitazone on global ischemia-induced hippocampal
injury and expression of mitochondrial uncoupling protein 2. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 351 (1), 198–203. 2006.
CHOY, E. H. S.; PANAYI, G. S. Cytokine pathways and joint. 2001.
CHUNG J.H. Primary human T cells toward apoptosis. Ageing Research Reviews.
7126–136 2008.
COUTO,J.A. Novos Compostos 5-(4-metil-sulfonil-benzilideno)-Imidazolidínicos
e Tiazolidínicos: Síntese, Elucidação Estrutural e Atividade Antiinflamatória.
2006. (Mestrado em Biotecnologia de Produtos Bioativos) Departamento de
Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco. Recife. Brasil.
DAYNES R.A., JONES D.C. Emerging roles of ppars in inflammation and immunity,
Nat. Rev., Immunol. v.2 748–759. 2002.
DESVERGNE B., MICHALIK L. AND WAHLI W.
Transcriptional regulation of
metabolism. Physiol. Rev., 86, 465–514. 2006. In: KNETHEN, A.V., SOLLER, M.,
BRÜNE, BERNHARD. Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR γ) and
sepsis. Arch. Immunol. Ther. Exp., 55, 19–25. 2007.
DEVCHAND, P.R., KELLER, H., PETERS, J.M., VAZQUEZ, M., GONZALEZ, F.J.,
WAHLI, W. The PPARa-leukotriene B4 pathway to inflammation control. Nature. v.
384 39–43. 1996.
Santos, I.B.V
71
DEVLIN, T.M. Manual de bioquímica com relações clinicas. São Paulo: Edgard
Blucher, p. 265-269, 1998.
DOHERTY, N. S., P. POUBELLE, P. BORGEAT, T. H. BEAVER, G. L. Westrich, and
N. L. Schrader. Intraperitoneal injection of zymosan in mice induces pain,
inflammation and the synthe-sis of peptidoleukotriens and prostaglandin E2.
Prostaglandins. 30:769–789. 1985.
DUARTE, I. D.; SANTOS, I. R.; LORENZETTI, B. B.; FERREIRA, S. H. Analgesia by
direct antagonism ofnociceptor sensitization involves the arginine - nitric oxide cGMP pathway. Eur. J. Pharmacol., v.217, p.225-227, 1992.
DUNCAN, A.J., HEALES, S.J.R. Nitric oxide and neurological disorders. Molecular
Aspects of Medicine. 26, 67-96. 2005.
EYLES, J.L., ROBERTS, A.W., METCALF, D., WICKS, I.P. Granulocyte colonystimulating factor and neutrophils—forgotten mediators of inflammatory disease.
Nature Clinical Practice Rheumatology. 2, 500-510. 2006.
FELDMANN, M. Development of anti-TNF therapy for rheumatoidarthritis. Nat Rev
Immunol 2, 364−371.inflammation in rheumatoid arthritis. N Engl J Med 344,
907−916. 2002.
FERRÁNDIZ, M.L.; ALCARAZ, M.J. Anti-inflammatory activity and inhibition of
arachidonic acid metabolism by flavonoids. Agens and Actions, v. 32, n. ¾, p. 283288, 199l.
FERRAZ, A.A.B, FERRAZ, E.M. Sepse Abdominal Programa de Atualização de
Antibióticos em Cirurgia. 3:1-25. 2002.
FERRE, P. The biology of peroxisome proliferators-activated receptors: relationship
with lipid metabolism and insulin sensitivity. Diabetes .53, S43–S50. 2004.
Santos, I.B.V
72
FRANCHIMONT, D. Overview of the actions of glucocorticoids on the immune
response: a good model to characterize new pathways of immunosuppression for
new treatment strategies. Ann N Y Acad Sci., v. 1024, p. 124-37, 2004.
GAMMAITONI,
A.R.,
GALER,
SCHLAGHECK,T.Effective
B.S.,
ness
LACOUTURE,
and
P.,
DOMINGOS.
safety
of
J.,
new
oxycodone/acetaminophenformulatio ns with reduced acetaminophen for the
treatment of low back pain. Pain Med. 4:21–30. 2003.
GAYATHRI,
B.,
MANJULA,
N.,
VINAYKUMAR,
K.S.,
LAKSHMI,
B.S.,
BALAKRISHNAN, A. Pure compound from Boswellia serrata extract exhibits antiinflammatory property in human PBMCs and mouse macrophages through inhibition
of TNFa, IL-1b, NO and MAP kinases. Int. Immunopharmacol. 7, 473–482. 2007.
GAYATHRI,
B.,
MANJULA,
N.,
VINAYKUMAR,
K.S.,
LAKSHMI,
B.S.,
BALAKRISHNAN, A. Pure compound from Boswellia serrata extract exhibits antiinflammatory property in human PBMCs and mouse macrophages through inhibition
of TNFa, IL-1b, NO andMAP kinases. Int. Immunopharmacol. 7, 473–482. 2007.
GERVOIS, P., FRUCHARTM, J.C., STAELS, B. Inflammation, dyslipidaemia,
diabetes and PPARs: pharmacological interest of dual PPARalpha and PPARgamma
agonists. Int. J. Clin. Pract. Suppl. 143, 22–29. 2005.
GLASS C. Going nuclear in metabolic and cardiovascular disease. J Clin Invest;
116:556–560. 2006.
GOMES, M.Z., BEL, E.A. Effects of eletrolytic and 6 hydroxydopamine lesions of rat
nigrostriatal patway on nitric oxide synthase and nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate diaphorase. Brain Research Bulletin. 62, 107-115. 2003.
GONZALEZ-REY E, CHORNY A, DELGADO M. Regulation of immune tolerance by
anti-inflammatory neuropeptides. Nature Rev. Immunol. 7(1):52-63. 2007.
Santos, I.B.V
73
GORDON, S. Macrophage Function Disorders. Encyclopedia Life S'ciences; 1: I-II.
2001.
HABIBI, N.S.; RIDA, S.M.; BADAWAY, E.A.M; FAHAMY, H.T.Y.; GHOZLAN, H.A.
Shyntesis And Antimicrobial Activity Of Rhodanine Derivates. European Journal Of
Medicinal Chemistry, V.32. P.759-762, 1997.
HANSSON, P.T. Neuropathicpain: definition, epidemiology, classification, and
diagnostic work-up. An Updated Review: Refresher Course Syllabus. IASP Press.
Pain. Seattle pp 91-95. 2005.
HAN, K.H., CHANG, M.K., BOULLIER, A., GREEN, S.R., LI, A., GLASS, C.K.,
Quehenberger, O. Oxidized LDL reduces monocyte CCR2 expression through
pathways involving peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J. Clin.
Invest. 106, 793–802. 2000.
HEIKKINEM, S., AUWERX, J., ARGMANN, C.A. PPARgamma in human and mouse
physiology. Biochim Biophys Acta. V.1771. 2007.p.999-1013, 2007.
HERMANN,
G.E.;
ROGERS,
R.C.;
BRESNAHAN,
J.C.;
BEATTIE,
M.S.
TumorNecrosis Factor-AlphaInduces Cfos and Strongly. Potentiates GlutamateMediated CellDeath in the Rat Spinal Cord. Neurobiology of Disease.; 8:590-599.
2001.
HERSCHMAM HR. Prostaglandin synthase 2. Biochim. Biophys. Acta. 5:
1299(1):125-140. 1996.
HUNSKAAR, S., HOLE, K. The formalin test in mice: dissociation between
inflammatory and non-inflammatory pain. Pain. v. 30, 103–104.1987.
JOHNSON, Z., SCHWARZ, M., POWER, C.A., WELLS, T.N., PROUDFOOT, A.E.
Multi-faceted strategies to combat disease by interference with the chemokine
system. Trends. Immunol. 26, 268–274. 2005.
Santos, I.B.V
74
JONES, R., RUBIN, G., BERENBAUM, F., SCHEIMAN, J. Gastrointestinal and
Cardiovascular Risks of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs. The American
Journal of Medicine, Vol 121, No 6, June. 2008.
JOYCE, D. A., GIMBLETT, G., STEER, J. H. Targets of glucocorticoid action on
TNF-alpha release by macrophages. Inflamm Res., v. 50, n. 7, p. 37-40, 2001.
JOZKOWICZ, A., COOKE, JP., GUEVARA, I., HUK, I., FUNOVICS, P., PACHINGER
O, et al. Genetic augmentation of nitric oxide synthase increases the vascular
generation of VEGF. Cardiovasc Res. 51:773–83. 2001.
JÚNIOR, J.F.S., DANTAS, C.J.S. Mecanismos celulares e moleculares da
inflamação. Rio de Janeiro: Editora Médica e Científica, 1: 5-12. 2000.
KAWAMATSU Y, SARAIE T, IMAMIYA E, NISHIKAWA K AND HAMURO Y. Studies
on
antihyperlipidemic
agents.
I.
Synthesis
and
hypolipidemic
activities
of
phenoxyphenyl alkanoic acid derivatives. Arzneim Forsch / Drug Res; 30: 454-459.
1980.
KEY, M.E., HOYER, L., BUCANA, C., HANNA, M.G. Mechanisms of macrophagemediated tumor cytolysis. Adv. Exp.Med. Biol. 146, 265–310. 1982.
KOENIG, W. Cardiovascular biomarkers: added value with na integrated approach?
Circulation 116, 3–5. 2007.
KOLACZKOWSKA,
PLYTYCZ,
B.,
E.,
CHADZINSKA,
OPDENAKKER,
G.,
M.,
SCISLOWSKA-CZARNECKA,
ARNOLD,
B.
Gelatinase
A.,
B/matrix
metalloproteinase-9 contributes to cellular infiltration in a murine model of zymosan
peritonitis. Immunobiol 211, 137–148. 2006a.
KOLACZKOWSKA,
E.,
SCISLOWSKA-CZARNECKA,
A.,
CHADZINSKA,
M.,
PLYTYCZ, B., VAN ROOIJEN, N., OPDENAKKER, G., ARNOLD, B. Enhanced early
Santos, I.B.V
75
vascular permeability in gelatinase B (MMP-9)-deficient mice: putative contribution of
COX-1 derived PGE2 of macrophage origin. J. Leukoc. Biol. 80, 125–132. 2006b.
KOLACZKOWSKA, E., SELJELID, R., PLYTYCZ, B. Critical role of mast cells in
morphine-mediated impairment of zymosan-induced peritonitis in mice. Inflamm.
Res. 50, 415–421. 2001a.
KOLACZKOWSKA, E., SELJELID, R., PLYTYCZ, B. Role of mast cells in zymosaninduced peritoneal inflammation in Balb/c and mast cell-deficient WBB6F1 mice. J.
Leukoc. Biol. 69, 33–42. 2001b.
KOLACZKOWSKA, E., SHAHZIDI, S., SELJELID, R., VAN ROOIJEN, N., PLYTYCZ,
B. Early vascular permeability in murine experimental peritonitis is comediated by
resident peritoneal macrophages and mast cells: crucial involvement of macrophagederived cysteinyl-leukotrienes. Inflammation 26, 61–71. 2002.
KOSTADINOVA, R., WAHLI, W., MICHALIK, L. PPARs in diseases: control
mechanisms of inflammation. Curr. Med. Chem. v12. 2995–3009. 2005.
KOSTER, R., ANDERSON, M., DE BEER, E.J. Acetic acid for analgesic screening.
Fed Proc 18: 412-416. 1959.
KUMAR, V.; ABBAS, A.K; FAUSTO, N. Patologia – Bases Patológicas das
Doenças, Editora Saunders Elsevier, 7ª edição. P. 1504, 2005a.
KUMAR, V.; ABBAS, A.K; FAUSTO, N. Patologia – Bases Patológicas das
Doenças, Editora Saunders Elsevier, 7ª edição. P. 50-88, 2005b.
LAGES, A. S.; ROMEIRO, N. C.; FRAGA, C. A. M.; BARREIRO, E. J. rofecoxib
(Vioxx) foi também lançado no Brasil como um fármaco antiinflamatório nãoesteróide que atua como inibidor seletivo de PGHS-2, representando uma segunda
geração de agentes AI, Quim. Nova 21, 761º. 1998.
Santos, I.B.V
76
LAURINDO, I.M.M. Artrite reumatóide. In: Lopes AC, Amato Neto V, organizadores.
Tratado de clínica médica. São Paulo: Roca,. v. 1, p. 1580-94. 2006.
LEITE, L.F.C.C., MOURÃO,R.H.V., LIMA, M.C.A., GALDINO,S.L., HERNANDES,M.
Z., NEVES, F.A.R., VIDAL S., BARBE,J., PITTA, I.R. Synthesis, biological evaluation
and molecular modeling studies of arylidene-thiazolidinediones with potential
hypoglycemic and hypolipidemic activities. European Journal of Medicinal
Chemistry.,42, 1263 -1271. 2007.
LEMANSKE, R.F Jr, BUSSE, W.W. Asthma: Factors underlying inception,
exacerbation, and disease progression. J Allergy Clin Immunol 2006:S456-61.
LESTAGE, J., VERRIER, D., PALIN, K., DANTZER, R.,. The enzyme indoleamine
2,3-dioxygenase is induced in the mouse brain in response to peripheral
administration of lipopolysaccharide and superantigen. Brain Behav. Immun. 16,
596–601. 2002.
LI M., PASCUAL G. AND GLASS C. K. Peroxisome proliferator-activated receptor
gamma-dependent repression of the inducible nitric oxide synthase gene. Mol. Cell.
Biol., 20, 4699–4707. 2000.
LIN, W. W., KARIN, M. A cytokine-mediated link between innate immunity,
inflammation, and cancer. J Clin Invest. 117, 1175−1183. 2007.
LINFORD, N.J., BEYER, R.P., GOLLAHON, K., KRAJCIK, R.A., MALLOY, V.L.,
DEMAS, V., BURMER, G.C., RABINOVITCH, P.S. Transcriptional response to aging
and caloric restriction in heart and adipose tissue. Aging Cell 6, 673–688. 2007.
LIU HB, HU YS, MEDCALF RL, SIMPSON RW, DEAR AE. Thiazolidinediones inhibit
TNFa induction of PAI-1 independent of PPARg activation. Biochem Biophys Res
Commun;334:30-7. 2005.
Santos, I.B.V
77
LOMBARDINO, J. G. In Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs; John Wiley & Sons;
New York. 1985.
LORENZETTI, B. B.; FERREIRA, S. H. Mode of analgesic action of dipyrone : direct
antagonism of inflammatory hyperalgesia. Eur. J. Pharmacol., v.114, p.375-381,
1985.
LORENZETTI, B. B.; FERREIRA, S. H. Activation of the arginine - nitric oxide
pathway in primary sensory neurones contributes to dipyrone - induced spinal and
peripheral analgesia. Inflamm. Res., v.45, p.308-311, 1996.
LUENGO, M.B. Uma Revisão Histórica dos Principais Acontecimentos da Imunologia
e da Framacologia na Busca do Entendimento e Tratamento das Doenças
Inflamatórias. Revista Eletrônica de Farmácia, v.2, p. 64-72, 2005.
LUO, Y., YIN, W., SIGNORE, A.P., ZHANG, F., HONG, Z., WANG, S.,GRAHAM,
S.H., CHEN, J. Neuroprotection against focal ischemic brain injury by the peroxisome
proliferators-activated receptor-γ agonist rosiglitazone. J. Neurochem. 97, 435–448.
2006.
MACPHERSON R.D. The pharmacological basis of contemporary pain management.
Pharmacol Ther, v.88:163-185. 2000.
MAGALHÃES, L.R. Síntese e Avaliação das Atividades Antiinflamatória e
Antinociceptiva
de
Derivados
5-benzilideno-3-(fenil-benzil)-tiazolidina-2,4-
diona. 2007. (Doutorado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos) Laboratório
de Tecnologia Farmacêutica – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa.
Brasil.
MÃNNEL, D.N. Advances in sepsis research derived from animal models.
International Journal of Medical Microbiology. 2007.
Santos, I.B.V
78
MAYO, M. W., & BALDWIN, A. S. (2000). The transcription factor NF-kappaB: control
of oncogenesis and cancer therapy resistance. Biochim Biophys Acta 1470,
M55−M62.
MIRANDA,
R.M.L.
Novas
Tiazolidinadionas
3,
5-Dissubstituidas:
síntese,
comprovação estrutural e avaliação da atividade antiinflamatória. Dissertação de
mestrado. Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Ciências Biológicas. 2008.
MIYAZAKI, S., MATSUKAWA, A., OHKAWARA, S., TAKAGI, K., YOSHINAGA, M.
Neu-trophil infiltration as a crucial step for monocyte chemoattractant protein (MCP1) to attract monocytes in lipopolysaccharide-induced arthritis in rabbits. Inflamm
Res 49:673–678. 2000.
MOON, D., KIMB, M., LEE, H., CHOI, Y.H., PARK, Y., HEO, M., KIMA, G. Curcumin
attenuates ovalbumin-induced airway inflammation by regulating nitric oxide.
Biochemical and Biophysical Research Communications 375: 275–279. 2008.
OKAJIMA K, HARADA N. Regulation of inflammatory responses by sensory neurons:
molecular mechanisms and possible therapeutic applications. Curr. Med. Chem. 13
(19): 2241-2251. 2006.
OSADEBE, P.O., OKOY´ E, F.B.C. Anti-inflammatory effects of crude methanolic
extract and fractions of Alchornea cordifolia leaves. Journal of Ethnopharmacology
89, 19–24. 2003.
O'SHEA J. J.; MA A. & LIPSKY P. Cytokines and autoimmunity. Nature Reviews
Immunology. 2, 37-45. (January 2002).
PEREIRA, D.T.M. Síntese, Comprovação Estrutural e Atividade Antiinflmatória
de
CompostosTiazolidinônicos-3,5-Dissubstituídos.
2007.
(Doutorado
em
Ciências Biológicas) Departamento de Antibióticos – Universidade Federal de
Pernambuco. Recife. Brasil.
Santos, I.B.V
79
PEREIRA, M.P., HURTADO, O., CARDENAS, A., BOSCA, L., CASTILLO,
J.,DAVALOS, A., VIVANCOS, J., SERENA, J., LORENZO, P., LIZASOAIN, I.,MORO,
M.A. Rosiglitazone and 15-deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 cause potent
neuroprotection after experimental stroke through noncompletely overlapping
mechanisms. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26 (2), 218–229. 2006.
PERIANAYAGAM, M. C.; MADIAS, N. E.; PEREIRA, B. J. G.; JABER, B. L. CREB
transcription factor modulates Bcl2 transcription in response to C5a in HL-60-derived
neutrophils. European Journal of Clinical Investigation: Volume 36(5), 353-361.
2006.
RANG,
H.P;
DALE,
M.M;
HITER,
J.M.
Agentes
antiinflamatórios
e
imunossupressores. In: Famacologia, Editora Guanabara Koogan, 4ª Edição, p.
189-190, 2003.
RE, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor activators target human
endothelial cells to inhibit leukocyte endothelial cell interaction. Arterioscler Thromb
Vasc Biol;19:2094-104. 1999.
REITZ, D. B. Seibert, K.; Annu. Rep. Med. Chem., 30, 179. 1995.
RFFAA R. Pharmacological aspects of successful long-term analgesia. Clin
Rheumatol. v.25: 9–15. 2006.
RHODEN, E.L., RHODEN , C.R. Princípios e Técnicas em Experimentação
Animal. Editora da UFRGS – Porto Alegre, 2006.
RIBEIRO, R.A; VALE, M.L; THOMAZZI. S.M; PASCHOALATO, A.B.P; POOLE, S;
FERREIRA, S.H; CUNHA, F.Q. Involvement of resident macrophages and mast cells
in the writhing nociceptive response induced by zymosan and acetic acid in mice.
Eur. J. Pharmacol. V. 387, p. 111-118, 2000.
Santos, I.B.V
80
RICOTE M., LI A. C., WILLSON T. M., KELLY C. J. AND GLASS C. K. The
peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of
macrophage activation. Nature, 391, 79–82. 1998.
RICOTE, M., GLASS C. K. PPARs and molecular mechanisms of transrepression.
Biochimica et Biophysica. Acta 1771 926–935, 2007.
ROLL, R., HÖFER-BOSSE, TH. E KAYSER D. New Perspectives in Acute Toxicity
Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. 1986.
ROWLEY, D.A; BENDITT, E.P. 5-hydroxytryptame and histamine as mediators of the
impury produced by agents which damage mast cells in rats. J. Exper. Med., 103:
399-415, 1956.
SAGIN, F.G., SOZMEN, E.Y., ERSOZ, B., MENTES, G. Link Between Monoamine
Oxidase and Nitric Oxide. NeuroToxicology. 25, 1-2, 91-99. 2004.
SALTIEL AR, OLEFSKY J. Thiazolinediones in the treatment of insulin resistence
and type II diabetes. Diabetes. v. 45: 1661-1669. 1996.
SANTOS, L. C.; UCHÔA, F. T.; MOURA, R. O.; LIMA, M.C.A.; GALDINO, S.L.;
PITTA, I.R.; BAERBE, J. Synthesis And Anti-Inflammatory Activity Of New
Thiazolidine-2,4-Diones,
4-Thioxothiazolidinones
And
2-Thioxoimidazolidinones.
Heterocyclic Communications, V.11(2), P.121-128, 2005.
SCHNITZER T.J, KAMIN M, OLSON, W.H. Tramadol allows reduction of naproxen
dose among patients with naproxen-responsive osteoar- thritis pain: a randomized,
double-blind, placebo-controlled study. ArthritisRheum. v.42:1370–7. 1999.
SCHOTTELIUS, A. J. G., MOLDAWER, L. L., DINARELLO, C. A., ASADULLAH, K.,
STERRY, W., EDWARDS, C. K. Biology of tumor necrosis factor-alpha-implications
for psoriasis. Exp Dermatol 13, 193−222. 2004.
Santos, I.B.V
81
SHULMAN, A.I, MANGELSDORF, D.J. Retinoid X receptor heterodimers in the
metabolic syndrome. N Engl J Med; 353:604–61. 2005.
SIEDMUND, E.A.; CADMUS, R.A.; LU, G. A method for evaluating both non-narcotic
and narcotic analgesic. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., v.95, p. 729-731. 1957a.
SIEDMUND, E.A.; CADMUS, R.A.; LU, G. Screening analgesics, incluinding aspirintype compound based upon the antagonism of chemically induced “writing” in mice.
J. Pharmacol. Exp. Ther., v.119, p. 184-193, 1957b.
SIMMONS, D.L.. What makes a good anti-inflammatory drug target? Revista.
Volume 11, Number 5/6 . p. 210-219, 2006.
SPECTOR, W.G. An Introduction to General Pathology. Churchill Livingstone, 2nd
edition, pp. 17-26. 1980.
STRAUS, D. S., GLASS, C. K. Anti-inflammatory actions of PPAR ligands: new
insights on cellular and molecular mechanisms. TRENDS in Immunology Vol.28
No.12. 551-558. 2007.
SZANTO A, A.; NAGYA, L. The many faces of PPARc: Anti-inflammatory by any
means? Immunobiology. v.213 789–803. 2008.
TAOKA, Y.; OKAJIMA, K.; UCHIBA, M.; MURAKAMI, K.; KUSHIMOTO, S.;JOHNO,
M.; NARUO, M.; OKABE, H"; TAKATSUKI, K. Role of Neutrophils in Spinal
Cordlnjury in the Rat. Neuroscience; 79:1177-1182. 1997.
TAOKA, Y.; OKANMA, K. Spinal Cord Injury in the Rat. Progre.S"s in
Neurobiology. v. 56:341-358. 1998.
TAUTENHAHN A., BRUNE B. AND VON-KNETHEN A. Activation-induced
PPARgamma expression sensitizes J. Leukoc. Biol., 73, 665–672. 2003.
Santos, I.B.V
82
TEITEAUM, I. Cloudy peritoneal dialysate: it’s not always infection. Contrib.
Nephrol. 150, 187–194. 2006.
TJӨLSEN A, BERGER OG, HUNSKAAR S, ROSLAND JH, HOLE K. The formalin
test: evaluation of the method. Pain 1992;(51):517.
TLASKALOVA-HOGENOVA, H., TUCKOVA, L., STEPANKOVA, R., HUDCOVIC, T.,
PALOVA- JELINKOVA, L., H., ROSSMANN, P., SANCHEZ D., CINOVA, J., HRNCU,
T., KVERKA, M., FROLOVA, L., UHLIZ, H., POWRIE, F., BLAND, P. Involvement of
innate immunity in the development diseases. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1051: 787-798.
2005.
TRACEY, D., KLARESKOG, L., SASSO, E.H., SALFELD, J.G., TAK, P.P. Tumor
necrosis factor antagonist mechanisms of action: A comprehensive review.
Pharmacology & Therapeutics. v.117 244–279. 2008.
UCHÔA, F.T. Síntese e avaliação da atividade antiinflamatória e seletividade de
novas 5-indol-tiazolidinadionas frente à ciclooxigenase-2. 2008. (Doutorado em
Ciências Biológicas) Universidade Federal de Pernambuco.Recife. Brasil.
VANE, J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for
aspirin-like drugs. Nat. New Biol. V. 231, p. 232-235, 1971.
VANE, J. R.; BAKHLE, Y. S.; BOTTING, R. M. Cyclooxygenase 1 and 2.Annu. Rev.
Pharmacol. Toxicol., 38, 97- 120. 1998.
MARNETT, L. J.; KALGUTKAR, A. S.
Design of selective inhibitors of
cyclooxygenase-2 as nonulcerogenic anti-inflammatory agents. Curr. Opinion
Chem. Biol., 2, 482. 1998.
WALLACE, J.; CHIN, B. Curr. Opinion in CPNS. Investigational Drugs, 1, 132.
1999.
Santos, I.B.V
83
WANG P., ANDERSON P. O., CHEN S., PAULSSON K. M., SJOGREN H. O. AND
LI S. Inhibition of the transcription factors AP-1 and NF-kappaB in CD4 T cells by
peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands. Int. Immunopharmacol.,
1, 803–812. 2001.
WARD, P. A.; LENTSCH, A. B. Endogenous regulation of the acute inflammatory
response. Molecular and Cellular Biochemistry. Volume 234-235, Number 1,
2002.
WALLACE, J., CHIN, B. O celecoxib (Celebra®) pertence à classe dos sulidos,
recentemente lançado no Brasil (1999) como um fármaco antiinflamatório nãoesteróide que atua como inibidor seletivo de PGHS-2, representando uma segunda
geração de agentes AI, Curr. Opinion in CPNS Investigational Drugs, 1, 132 .
1999.
WARD, P.A., LENTSCH, A.B. Endogenous regulation of the acute inflammatory
response. Mol. Cell. Biochem. 234–235, 225–228. 2002.
WEI, T., ZHAO, X., HOU, J., OGATA, K., SAKAUE, T., MORI, A., XIN, W. The
antioxidant ESeroS-GS inhibits NO production and prevents oxidative stress in
astrocytes. Biochemical Pharmacology. v.66, 1, 83-91. 2003.
WITKIN, L.B., HUEBNER, C.F., GALDI, F., O’KEEFE, E., SPITALETTA, P.,
PLUMMER, A.J. Pharmacognosy of 2 amino-indane hydrochloride (Su 8629): a
potent non-narcotic analgesic. Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics 133, 400–408. 1961.
WHITTLE, B.A., 1964. The use of changes in capillary permeability in mice to
distinguish between narcotic and non-narcotic analgesics. British Journal of
Pharmacology 22, 246–253.
WOOLFE, G E MCDONALD, A.D. The evaluation of the analgesic action of pethidine
hydrochloride (emerol). J. Pharmacol. Exp. Ther., Baltimore, v.80, p.300-307,
1944.
Santos, I.B.V
84
XIAOYU, H.; WAI-PING, L.; CHARIS, M.; LIONEL B. I. Inhibition of IFN-γ signaling by
glucocorticoids. The Journal of Immunology, v. 170, p. 4833–4839, 2003.
YAMAKAWA K, HOSOI M, KOYAMA H, TANAKA S, FUKUMOTO S, MORII H.
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists increase vascular
endothelial growth factor expression in human vascular smooth muscle cells.
Biochem Biophys. Res Commun; 271:571–4. 2000.
YANG X. Y., WANG L. H., CHEN T., HODGE D. R., RESAU J. H., DASILVA L. AND
FARRAR W. L. Activation of human T lymphocytes is inhibited by peroxisome
proliferator- activated receptor gamma (PPARgamma) agonists. PPARgamma coassociation with transcription factor NFAT. J. Biol. Chem., 275, 4541–4544. 2000.
YKI-JARVINEN H. Thiazolidinediones. N. Engl. J. Med., 351, 1106–1118. 2004.
YOSHIOKA T, FULITA T, KANAI T, et al. Studies on hindered phenols and
analogues. 1. Hipolipidemic and hypoglycemic agents wuth ability to inhibit lipid
peroxdation. J Med Chem; 32: 421-428. 1989.
ZHANG C. The role of inflammatory cytokines in endothelial dysfunction. Basic Res
Cardiol. 103 (5): 398-406. 2008.
ZHANG, L., DAWSON, V.L., DAWSON, T.M. Role of nitric oxide in Parkinson’s
disease. Pharmacology & Therapeutics, 109, 33-41. 2006.
ZHAO, B, SANATI, S, ELTORKY, M. diaphragm disease: complete small bowel
obstruction after long-termnonsteroidal anti-inflammatory drugs usea case report and
review of literature . Annals of diagnostic pathology. v. 9; 169– 173. 2005.
ZHAO, X., SUN, G., ZHANG, J., STRONG, R., SONG, W., GONZALES, N.,
GROTTA, J.C., ARONOWSKI, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral
Santos, I.B.V
85
hemorrhage treatment: role for peroxisome proliferator-activated receptor gamma in
microglia/macrophages. Ann. Neurol. 61 (4), 352–362. 2007.
REFERÊNICAS ONLINE:
Disponível em: www.msdonline.com.br - acesso em 08/10/08
Disponível em: www.dol.inf.br/Html/CompreendendoDor.html - Acesso 24/10/08
Disponível em: http://uvnt.universidadevirtual – Acesso: 10/10/08
Disponível em: br/vet/endoreprfarm2.htm – Acesso 08/10/08
Disponível em: www.nature.com/.../v2/n1/fig_tab/nri702_F1.html - Acesso: 01/12/08.
Disponível em: www.anvisa.gov.br – Acesso: 08/02/09
Santos, I.B.V
PPARγ
ANEXOS
86
9- Anexos
9.1- Espectros dos derivados da série 3-benzil-5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas
(LPSF/GQ).
Santos, I.B.V
87
Santos, I.B.V
88
Santos, I.B.V
89
Santos, I.B.V
90
Santos, I.B.V
91
Santos, I.B.V
92
Santos, I.B.V
93
Santos, I.B.V
94
9.2- Resumos publicados em congressos
SANTOS, I.B.V.; CAMPOS, I.A.; SILVA, T.G.; LIMA, M.C.A.; GALDINO, S.L.; PITTA,
I.R. Avaliação da atividade antiinflamatória de derivados tiazolidínicos. 40º
Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental. Águas de
Lindóia-SP. 2008.
SANTOS, I.B.V.; CAMPOS, I.A.; OLIVEIRA, C.F.; KASTRO. K.C.; CRUZ, A.C.N.;
BOTELHO, S.P.S.; LIMA, M.C.A.; GALDINO, S.L.; PITTA, I.R. Anti-inflammatory
activity of thiazolidinediones derivatives The 4th Brazilian Symposium on Medicinal
Chemistry. Porto de Galinhas -PE. 2008.
Santos, I.B.V
95
9.3- Menção honrosa
Santos, I.B.V
96
9.4- Artigo a ser submetido ao Pharmacological Research
Anti-inflammatory and antinociceptive effects of thiazolidinediones in acute
models of inflammation
Iane Bezerra Vasconcelos Santosa, Maria do Carmo Alves de Lima a, Suely Lins Galdino a Ivan da Rocha
Pitta a, Teresinha Gonçalves da Silvaa,
a Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, CEP 50670-901 Recife, Pernambuco, Brazil
Abstract
The family of transcription factors termed peroxisome proliferator-activated
receptors (PPARs) has recently been the focus of much interest for their possible role in
the regulation of inflammation and immune responses. PPARα and PPARγ have been
implicated in the regulation of macrophage and endothelial cell inflammatory responses.
New thiazolidinediones (TZDs) were evaluated in acute models of inflammation and
models of pain. This study has shown that the thiazolidine derivatives do possess
significant anti-inflammatory effects in laboratory animals for inflammation assays. The
results reveal a novel potential anti-inflammatory pathway of TZDs in inflammatory
process.
Keywords: thiazolidinediones; Peritoneal inflammation; nociception
1. Introduction
Thiazolidinediones (TZDs) are pharmacological ligands of the peroxisome
proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) that are extensively used in the
treatment of type II diabetes. PPARγ mediates ligand-dependent transcriptional
activation and repression, it was shown to be directly activated by naturally occurring
fatty acids and several synthetic compounds such as thiazolidinediones (TZDs), agonists
of PPAR- [1].
Recently, an anti-inflammatory potential for TZDs has been suggested, based on
observations that these compounds may inhibit pro-inflammatory cytokine expression in
vitro and may attenuate the inflammatory response in vivo [2]. Experimental evidence
suggests that PPARγ agonists inhibit macrophage activation as well as the associated
production of cytokines tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-2,-6,-8,
matrix metalloproteinases (MMPs), and other inflammatory mediators [3]. Activated
PPARγ, especially in T cells, is involved in the regulation of immune responses and cell
survival signaling. TZDs such as ciglitazone, troglitazone, and rosiglitazone represent a
group of synthetic PPARγ agonists [4, 5, 6, 7, 8]. PPARγ has been suggested to play a
downregulatory role in inflammatory processes, raising the hypothesis that PPARγ
ligands, such as the TZDs, could be efficient in the treatment of inflammatory disorders
[9, 10]. Beneficial effects were also reported in vivo in animal models of human
inflammatory disorders like inflammatory bowel disease [11], rheumatoid arthritis [12],
multiple sclerosis [13] and asthma [14], suggesting a general anti-inflammatory
potential for TZDs. Thus, PPARγ activation with TZDs might be a potent therapeutic
option for to control of inflammation.
Among the anti-inflammatory, the nonsteroidal antiinflammatory drugs
(NSAIDs) are the most widely prescribed of all therapeutic agents, but their therapeutic
efficacy comes at a price. Damage to the upper gastrointestinal (GI) tract was the first
unwanted effect to be recognized clinically, but other organ systems can be affected by
Santos, I.B.V
97
NSAIDs [15, 16]. Thus, we present this work four news compounds candidates for antiinflammatory drugs, of the thiazolidine-2,4-dione derivatives, 5-(4-Benzyloxybenzylidene)-3-(2-Chloro-6-fluoro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione (LPSF/GQ-104), 3(2-Chloro-6-fluoro-benzyl)-5-(2-nitro-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione
(PSF/GQ158), 3-(2-Chloro-6-fluoro-benzyl)-5-(4-fluoro-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione
(LPSF/GQ-159) and 5-(4-Chloro-benzylidene)-3-(2,4-dichloro-benzyl)- thiazolidine2,4-dione (LPSF/GQ-130) were inve. Later it´s were evaluated by model of
thioglycolate-induced peritonitis and zymosan-induced peritonitis in mice as described
in the classical method [17], for discovery of anti-inflammatory drugs more effective.
To investigate the antinociceptive activity was used for model of writhings acid acetic
acid-induced in mice and formalin test.
2. Materials and methods
EDTA
Evans blue (Sigma)
Sodium thioglycolate 3%
Zymosam (Sigma)
Acetic acid 0,9%
Ketamine and xylazine (50 and 10 mg/kg, respectively)
NaCl 0.9%
Dipyrone
2.1 Biological activity
All experimental procedures described below were approved by the Animal Care
Committee of the University of Federal of Pernambuco (processo nº 23076,
0040,13/2008-35). The mice were subjected to a period of adjustment, being kept in
cages under standardized lighting conditions (cycle light / dark, 12 hours), temperature
of 22 ± 2 º C and received water ad libitum and diet pattern.
2.2.1. Acetic acid-induced vascular permeability
The vascular permeability was assessed using the method described by Whittle
[18]. It was induced by acetic acid in adult albino mice of both sexes. These were left in
water fast and with the desire for a period of 6 hours. After this period, the mice were
subjected to a pre-treatment with the substances investigated - LPSF/GQ-130 and
LPSF/GQ-130, both at a dose of 30µmol/kg orally. After one hour of the injection
treatment was performed in the retro-orbital plexus (0.2 mL/mouse) of the Evans blue
dye 1%, then administered to the acetic acid solution 1% in the peritoneum of animals,
to cause the acute peritonitis. Each animal received 0.5 mL. After an interval of 30
minutes, the animals were sacrificed under anesthesia with xylazine, ketamine group.
Comprising the step of collecting the exudate, were injected into the peritoneal cavity of
2 mL of NaCl 0.9% solution, so that the peritoneal exudate was collected and
centrifuged at 200 × g for 10 min. The absorbance of the supernatant was read to 610
nm using the ELISA (Thermo plate).
2.2.2. Evaluation of anti-inflammatory activity - model of thioglycolate and
zymosan-induced peritonitis
Santos, I.B.V
98
The mice, fasting for 6 hours, were divided into groups and treated (vo) with the
test substances (3, 10 and 30µmol/kg), indomethacin (28µmol/kg), rosiglitazone
(10µmol/kg) and saline. After 1 hour of treatment, were subjected to the test of
peritonitis, getting the ip administration of 0.5 mL of solution of 3% thioglycolate and
solution of zymosan (0.2 mg/ml). After four hours, the animals were sacrificed by
cervical dislocation, and injected into the peritoneal cavity 2 mL of heparinized PBS (10
IU / mL). The total count of migrated leukocytes was performed in a Neubauer
chamber, with samples recovered from PBS [19, 20, 21].
2.2.3 Acetic acid-induced writhing response in mice
The test was carried out using the described technique by Koster, 1959 [22].
Mice were injected intraperitoneally with 0.1ml/10 g body weight of 1% acetic acid
solution in saline after oral administration of LPSF/GQ-159 and LPSF/GQ-130, either
in the dose 30µmol/Kg, after one hour. The number of writhing occurring between 5
and 20min after acetic acid injection was recorded. Dipyrone (26µmol/Kg) was
administrated to mice as a positive control in this experiment.
2.2.4 Evaluation of antinociceptive activity - induced by nociceptive effect of
formalin
To assess this activity the animals were divided into 2 lots (n = 10) then received
the substances according to the group to which belonged orally, one group received the
drug test LPSF/GQ-130 at a dose of 30 µmol / kg, the other vehicle and the third group
to dipyrone as the reference drug. Elapsed time of 60 minutes of administration of the
test drug and vehicle animals received an injection of 20 µL of 1% formalin in the right
rear leg and then the sensitivity was measured using a stopwatch observing the
accumulated time in seconds during which the animal licks the paw in the first 5
minutes (phase 1), then 20 to 25 minutes (phase 2) the total time of 30 minutes. The
painful stimulus was induced by injection of 20 µL of 1% formalin in the right rear paw
of mice. The total time of the experiment was 30 minutes [23]. It was determined the
percentage of inhibition in the groups treated with LPSF/GQ-130 compared to the
control group.
2.2.5 Statistical analysis
Results were analyzed using One Way ANOVA (Fischer LSD post hoc test) and
expressed as mean ± S.E.M. Difference between means of treated and control groups
was considered significant at P < 0.05.
3. Results and discussion
In this study it was demonstrated that the compounds LPSF/GQ-104, LPSF/GQ130, LPSF/GQ-158 and LPSF/GQ-159 presented antinociceptive and anti-inflammatory
effects in experimental models in vivo. However, before the investigations of these
therapeutic properties, was the test of acute toxicity with LPSF/GQ-130, where it was
observed that although the animals have shown some unusual behavior, such as voice
tremor, tremor, ptosis and somnolence, the new TZD did not take any animal to death
with a single dose investigated (2000mg/kg). For 14 days was the monitoring of food
Santos, I.B.V
99
intake is not observed any significant change in weight in the control group. The results
demonstrated low toxicity of the molecule evaluated, data that are consistent with
studies by Santos and colleagues (2005) [24]. The results of anti-inflammatory activity
of derivatives LPSF / GQs using as the phlogistic agent thioglycolate are shown in
Figure 1. The four synthesized compounds and reference drugs (indomethacin, and
rosiglitazone) inhibited the inflammatory response induced by thioglycolate. According
to statistical data, the LPSF / GQs demonstrate effectiveness in inhibiting the
inflammatory response, with the emphasis LPSF/GQ-130 derivative, which showed an
inhibition of cell migration of 70.4%. Because of his good behavior, this compound was
selected toinvestigate the mechanismo faction. The selection of the reference drug,
indomethacin, and rosiglitazone was made taking into consideration the fact that first it
is an anti-inflammatory agent, preferential inhibitor of COX-1, and the second well
known as a PPARγ agonist glitazones.
Figure 01. Effects of new thiazolidine derivatives on cell migration induced by sodium thioglycolate 3%.
Number of cells (average ± standard error) found in the peritonitis inflammatory model, four hours after
the induction of the inflammation.
The study of the compound LPSF/GQ-130 in three doses, showed the same
profile as the previous experiment. The results showed that this compound was more
active when administered at a dose of 10µmol/Kg therefore presented an inhibition of
70.4%, while the other doses were 66% and 67%, values corresponding to 7.7 x 105, 8.9
x 105 and 8.5 x 105 cells per cavity. To ratify the results were significant compared with
the control group and the group corresponding to the reference drug (indomethacin 28µmol/Kg) which responded with an inhibition of 75%, equivalent to 26.2 x 105.
However, it was observed a dose-dependent relationship, making it impossible to
determine the ED50.
Recent studies have demonstrated the potential of thiazolidine derivatives to
inhibit the inflammatory response. Some thiazolidine derivatives were synthesized and
showed anti-inflammatory effect through various models of inflammation - peritonitis
and air pouch, induced both by carrageenan [25, 26]. According to Szanto and Nagy
(2008) [27], this property comes from the therapeutic relationship between TZDs and
activation of the PPARγ receptor. The peritonitis is a common inflammatory condition
with severe morbidity and mortality, etiology and may include bacteria, fungi and
parasites. The peritonitis occurs when an intra-abdominal infection outbreak triggers a
systemic response. This response is characterized by the activation of cascade systems
(complement, coagulation, cininas, fibrinolysis), cells (endothelial, leukocytes,
Santos, I.B.V
100
monocytes, macrophages and mast cells) and release of mediators (oxygen free radicals,
histamine, eicosanóides, clotting factors and cytokines) [28. 29]. This test evaluated the
leukocyte migration through the counting of leukocytes in the exudates released into the
peritoneal cavity after administration of a phlogistic agent. In the model of peritonitis
induced by thioglycolate, both the cells, mast cells and macrophages, act on increased
vascular permeability [30]. According to the inflammatory response submitted by LPSF
/ GQs through the model of peritonitis, it was suggested that these molecules are
inhibiting the same cellular profile. In this study, the results show that LPSF/GQ-130
showed significant anti-inflammatory activity, revealing an inhibition of 70.4% in the
control group. To evaluate the participation of other cells such as neutrophils in the
mechanism of action of LPSF / GQs was held, also, the peritonitis induced by zymosan,
whose results are in Figure 3.
Figure 02. Dose-response study of the thiazolidine derivative LPSF/GQ-130 (on peritonitis induced by
zymosan. Number of cells (average ± error standard) found in the peritonitis inflammatory model, four
hours after the induction of the inflammation.
However, in experiments with thioglycolate zymosan and was not observed a
dose-dependent relationship. This profile may be related to the solubility of the product
or erratic absorption, making it impossible to determine the ED50.
Kolaczkowska and collaborators (2006) [31] injected intraperitoneally zymosan
in mice, and revealed the presence of MMP-9, a critical stimulus for the infiltration of
neutrophils to the focus of inflammation. Thus, it was proven the effectiveness of
compounds on the inhibition of cell migration, either neutrophils or macrophages, since
according to the phlogistic agent used, there is the initial recruitment of one or another
cell profile [30]. Thus, the anti-inflammatory activity by LPSF/GQ-130 in peritonitis
induced by zymosan, suggests the inhibition of neutrophils and also of macrophages.
The reduction of neutrophils may reflect a cytotoxic effect of non-steroidal antiinflammatory. According Alle et al, 1988 [32], the anti-inflammatory drugs act on the
surface of the plasma membrane of leukocytes, especially of monocytes, preventing its
ability to fact that phagocytosis can be attributed to a possible action of the compounds
evaluated. The anti-inflammatory activity is one of several functions of the PPAR
agonists. PPARγ inhibits the recruitment of macrophages to sites of inflammation by
repressing the transcription of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and its
receptor CC chemokine receptor 2 (CCR2) in macrophages [33, 34, 35, 36]. PPARγ and
its agonists have been used for the study of inflammatory diseases. Many human
diseases and animal models were analyzed, revealing that this receptor activators tested
Santos, I.B.V
101
to inhibit the progression of diseases and acted in controlling the inflammatory reaction.
These studies involve investigations in vivo and ex vivo, which show the activation of
PPARγ. In this study the compounds tested showed promising anti-inflammatory
activity against the various inflammatory agents. In order to evaluate the action of LPSF
/ GQs the release of vasoactive amines (histamine, bradykinin, serotonin) and formation
of edema, was assessed vascular permeability induced by acetic acid. In Figure 4, the
results are observed with this test, which was expressed (µg/mouse), which is a
beyondin term of the concentration of the dye the peritoneal cavity.
Figure 03. Effect of new thiazolidine derivatives in vascular permeability induced by acetic acid.
Significant effect in the control group (*).
The results show that the TZDs rosiglitazone and LPSF/GQ-159 did not reduce
the vascular permeability induced by acetic acid, therefore having no effect in the first
phase of the inflammatory response, characterized by the action of bioactive amines.
These findings are in agreement with the data of Yamakawa and colleagues (2000) [37],
Jozkowicz and collaborators (2001) [38], which demonstrated that rosiglitazone
promoted the increased expression of vascular endothelial growth factor (VEGF),
resulting changes in the microcirculation, as well as retention of fluid and consequently
the swelling. Thus, rather than reduce, the increased vascular permeability. In contrast,
the LPSF/GQ-130 was efficient, as well as indomethacin (NSAID) in inhibiting the
vascular permeability. It is suggested that this behavior can be caused by the difference
between their chemical structures. Probably the LPSF/GQ-159 operates only in the
second phase of acute inflammation, involving eicosanóides as mediators, cytokines and
chemokines, without interfering with the release of mediators histamine, serotonin and
bradykinin. Ward and Lentsch (2002) [39] analyzed the characteristics of three stages
involving the acute inflammatory response: increased vascular permeability, leading to
leakage of fluid and proteins to the extravascular space, compounding the exudation,
adhesion of leukocytes to endothelial cells followed by their transmigration to the
injured tissue, and activation of macrophages resident in tissues, which release
cytokines and chemokines through the mechanism dependent on the nuclear
transcription factor NFkB. The inflammatory response can be blocked, removed or
adjusted by at least four mechanisms: (a) neutralization or destruction of proinflammatory mediators by enzymes of plasma and tissue, (b) production of antiinflammatory mediators IL-4, IL-10, synthesized by macrophages and T cells, related to
the activation of NFkB, (c) activation of adrenergic and cholinergic precursors, and (d)
Santos, I.B.V
102
regulation by intracellular signaling pathways that act negatively on receptors involved
in inflammatory response. The balance between the pro and anti-inflammatory drugs is
a key determinant in the containment of the inflammatory reaction and its consequences
on the integrity of injured tissue.
Besides the evaluation of anti-inflammatory activity, has been verified that
LPSF/GQ-130 was also involved in the antinociceptive activity through the test of
writhing induced by acetic acid. The table 1 shows the data from this test.
The results for the LPSF/GQ-130 and LPSF/GQ-159 show that they have
moderate analgesic effect, inhibiting the writhing by acetic acid in 25.4% (LPSF/GQ130) and 33.6% (LPSF/GQ-159). These findings indicate, therefore, that this activity
may be caused directly or indirectly inhibiting the release of pro-inflammatory
mediators induced by acetic acid, such as prostaglandins and cytokines.
Table 1. Effect of thiazolidinediones derivates on acetic acid induced writhing in mice
Treatment
Dose (µmol / Kg)
Number of
% inibition
writhing
Control
83,4± 0,7
LPSF/GQ-130
30
62,1± 0,3
25,4
LPSF/GQ-159
55,4± 0,1
30
33,6
427
22,6± 4,8
73,0
Dipyrone
The values are the average ones ± standard error (N =8) for each experimental group.
Table 2. Effect of compound LPSF/GQ-130 on nociception induced by formalin.
Time to lick the paw (s) %
Compound
Dose
Average
Average
(µmol / Kg)
1st Phase
2nd Phase
46 ± 0,4
48 ± 1,0
-
-
Control
Protection
Protection
1st Phase 2nd Phase
Dipyrone
26
20 ± 2,4
8 ± 1,9
56%
83%
LPSF/GQ-130
10
44 ± 0,4
21 ± 0,3
4%
56%
The values are the average ones ± standard error (N =8) for each experimental group.
The model used is considered relatively simple, with little specificity, easy to
observe, fast and with good sensitivity to various analgesic substances and non-steroidal
anti-inflammatory drugs [40, 41, 42, 43, 44]. The acetic acid acts indirectly causing the
release of endogenous substances involved in the modulation of nociception, including
bradykinin, serotonin, histamine and prostaglandins (Witkin t al., 1961). Recently,
Ribeiro and colleagues (2000) showed that the nociception induced by this stimulus
depends on the release of cytokines such as IL-1β, TNFα, IL-8 from macrophages and
basophils residents in the abdominal cavity, which together with the other mediators
mentioned above, may induce nociception feature in this model.
The completion of the second model of nociception proposed - nociception
induced by formalin - confirmed for the peripheral action of agents LPSF / GQs (159
and 130), since there was only the antinociceptive action of the compounds in the
second phase of the stimulus. The formalin test is one of the most used models to
explain the mechanisms of pain and analgesia, with better results than the tests using
mechanical or thermal stimuli. This test consists of two stages: first, neurogenic,
resulting from the activity of the chemical irritant formalin on the nociceptive neurons,
Santos, I.B.V
103
the second phase, tonic, is a consequence of changes caused by stimulation on the
nociceptive neurons of the posterior horn. (TJOLSEN, 1992). The reference drug used,
the dose of dipyrone in 26µmol/Kg seems act exercising direct blockade of
inflammatory hyperalgesia by PGE2, supposedly promoting desensitization of
peripheral nociceptors [48]. The mechanism of desensitization, probably involves the
activation of nitric-oxide pathway - cGMP in nociceptors [49, 50]. The results of this
study suggest that the thiazolidine derivative evaluated (LPSF/GQ-130) shares some of
the common mechanisms already described for dipyrone.
4. Statistical analysis
All numerical results are expressed as standard error. The data were statistically
analyzed by ANOVA±mean 0.05 were considered significant.<using Microcal Origin
version 7.0.p
5. Conclusion
This study were obtained important results of LPSF / GQs front of investigations
in vivo models of inflammation and nociception, since they were effective in inhibiting
the peripheral nociception and, more significantly, the cell migration. Thus, we suggest
that these molecules, with emphasis on the LPSF/GQ-130 are potential candidates for
anti-inflammatory drugs and analgesics.
6. Acknowledgments
We thank the CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico, Brasil) This work was supported by grants from of CNPq and University
of Federal of Pernambuco.
7. References
1
Xu, H.; Finas, D.; Koster, F.; Griesinger, G; Friedrich, M.; Diedrich, K.; Hornung, D. Implication for Thiazolidinediones (TZDs) as
Novel Potential Anti- Inflammatory Drugs. Current Medicinal Chemistry - Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents, Volume
4, Number 5, 531-541(11). 2005.
2
Desmet C., Warze B , Gosset P, Mélotte D , Rongvauxc A, Gillet L, Fiéveza L, Seumois G. Vanderplasschend A, B Staels B.,
Lekeuxa P., Bureaua F. Pro-inflammatory properties for thiazolidinediones. Biochemical Pharmacology. 69 255–265. 2005.
3
Plutzky J. The potential role of peroxisome proliferator-activated receptors on inflammation in type 2 diabetes mellitus and
atherosclerosis.Am J Cardiol 92:34J–41J 2003.
4
Harris SG and Phipps RP .Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-gamma) activation in naive mouse T cells
induces cell death. Ann NY Acad Sci 905:297–300. 2000.
5
Harris SG and Phipps RP. The nuclear receptor PPAR gamma is expressed by mouse T lymphocytes and PPAR gamma agonists
induce apoptosis. Eur J Immunol 31:1098–1105. 2001.
6
Harris SG and Phipps RP. Induction of apoptosis in mouse T cells upon peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) binding. Adv Exp Med Biol 507:421–425. 2002.
7
Tautenhahn A, Brune B, and von Knethen A. Activation-induced PPARgamma expression sensitizes primary human T cells toward
apoptosis. J Leukoc Biol 73:665–672. 2003.
8
Soller M, Tautenhahn A, Brune B, Zacharowski K, John S, Link H, and von Knethen A (2006) Peroxisome proliferator-activated
receptor gamma contributes to T lymphocyte apoptosis during sepsis. J Leukoc Biol 79:235–243.
9
Delerive P, Fruchart JC, Staels B. Peroxisome proliferator-activated receptors in inflammation control. J Endocrinol;169:453–9.
2001.
10
Daynes RA, Jones DC. Emerging roles of PPARs in inflammation and immunity. Nat Rev Immunol;2:748–59. 2002.
Santos, I.B.V
104
11
Su CG, Wen X, Bailey ST, Jiang W, Rangwala SM, Keilbaugh SA, et al. A novel therapy for colitis utilizing PPAR-gamma ligands
to inhibit the epithelial inflammatory response. J Clin Invest. 1999 Aug;104(4):383-9.
12
Kawahito Y, Kondo M, Tsubouchi Y, Hashiramoto A, Bishop-Bailey D, Inoue K, et al. 15-Deoxy-delta(12,14)-PGJ(2) induces
synoviocyte apoptosis and suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. J Clin Invest 2000;106:189–97.
13
Natarajan C, Bright JJ. Peroxisome proliferator-activated receptorgamma agonists inhibit experimental allergic encephalomyelitis
by blocking IL-12 production, IL-12 signaling and Th1 differentiation. Genes Immun, 3:59–70. 2002.
14
Woerly G, Honda K, Loyens M, Papin JP, Auwerx J, Staels B, et al. Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma
downregulate allergic inflammation and eosinophil activation. J Exp Med,198:411–21. 2003.
15
Kean WF, Buchanan WW. The use of NSAIDs in rheumatic disorders: a global perspective. Inflammopharmacology. 13:343-370.
2005.
16
Wolfe MM, Lichtenstein DR, Singh G. Gastrointestinal toxicity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. N Engl J Med.
340:1888-1899. 1999.
17
Parsons, et al. The Fps/Fes kinase regulates leucocyte recruitment and extravasation during inflammation. Immunology.; 122, 542–
550. 2007.
18
Whittle, B.A. The use of changes in capillary permeability in mice to distinguish between narcotic and non-narcotic analgesics.
British Journal of Pharmacology 22, 246–253. 1964.
19
Bonhomme-Faivre, L. , Depraetere, P., Savelli, M.P , Amdidouche D. , Bizi, E., Seiller, M. and Orbach-Arbouys, S. Charcoal
suspension for tumor labelling modifies macrophage activity in mice. Life Sciences, Vol. 66, No. 9, pp. 817-827,2000.
20
Doherty, N. S., P. Poubelle, P. Borgeat, T. H. Beaver, G. L. Westrich, and N. L. Schrader. Intraperitoneal injection of zymosan in
mice induces pain, inflammation and the synthe-sis of peptidoleukotriens and prostaglandin E2. Prostaglandins. 30:769–789. 1985.
21
Kolaczkowska, E., Seljelid, R., Plytycz, B. Critical role of mast cells in morphine-mediated impairment of zymosan-induced
peritonitis in mice. Inflamm. Res. 50, 415–421. 2001a.
22
Koster R, Anderson M, De Beer EJ 1959. Acetic acid for analgesic screening. Fed Proc 18: 412-416.
23
HUNSKAAR, S., HOLE, K. The formalin test in mice: dissociation between inflammatory and non-inflammatory pain. Pain. v.
30, 103–104.1987.
24
Santos, L. C.; Uchôa, F. T.; Moura, R. O.; Lima, M.C.A.; Galdino, S.L.; Pitta, I.R.; Baerbe, J. Synthesis And Anti-Inflammatory
Activity Of New Thiazolidine-2,4-Diones, 4-Thioxothiazolidinones And 2-Thioxoimidazolidinones. Heterocyclic Communications,
V.11(2), P.121-128, 2005.
25
Miranda, R.M.L. Novas Tiazolidinadionas 3, 5-Dissubstituidas: síntese, comprovação estrutural e avaliação da atividade
antiinflamatória. Dissertação de mestrado. Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Ciências Biológicas. 2008.
26
Uchôa, F.T. Síntese e avaliação da atividade antiinflamatória e seletividade de novas 5-indol-tiazolidinadionas frente à
ciclooxigenase-2. 2008. (Doutorado em Ciências Biológicas) Universidade Federal de Pernambuco. Recife. Brasil.
27
Szanto A, A.; Nagya, L. The many faces of PPARc: Anti-inflammatory by any means? Immunobiology. v.213 789–803. 2008.
28
Teiteaum, I. Cloudy peritoneal dialysate: it’s not always infection. Contrib. Nephrol. 150, 187–194. 2006.
29
Ferraz, A.A.B, Ferraz, E.M. Sepse Abdominal. Programa de Atualização de Antibióticos em Cirurgia. 3:1-25. 2002.
30
Kolaczkowska, E., Shahzidi, S., Seljelid, R., Van Rooijen, N., Plytycz, B. Early vascular permeability in murine experimental
peritonitis is comediated by resident peritoneal macrophages and mast cells: crucial involvement of macrophage-derived cysteinylleukotrienes. Inflammation 26, 61–71. 2002.
31
Kolaczkowska, E., Chadzinska, M., Scislowska-Czarnecka, A., Plytycz, B., Opdenakker, G., Arnold, B. Gelatinase B/matrix
metalloproteinase-9 contributes to cellular infiltration in a murine model of zymosan peritonitis. Immunobiol 211, 137–148. 2006.
32
Alle, N.; Marchesano, L.H. Determinação dos efeitos das drogas antiinflamatórias não esteróides(Indometacina,Butazona, Clinoril,
Naprozil, Benflogin e Inflaril) nos leucogramas de ratos portadores de processo inflamatório crônico. Ver. Odont. USP. v. 2, n.2,
p.120-126, abr./jun., 1988.
33
Babaev, V.R., Yancey, P.G., Ryzhov, S.V., Kon, V., Breyer, M.D., Magnuson, M.A., Fazio, S., Linton, M.F. Conditional
knockout of macrophage PPARgamma increases atherosclerosis in C57BL/6 and low-density lipoprotein receptor-deficient mice.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25, 1647–1653. 2005.
34
Barlic, J., Zhang, Y., Foley, J.F., Murphy, P.M. Oxidized lipid-driven chemokine receptor switch, CCR2 to CX3CR1, mediates
adhesion of human macrophages to coronary artery smooth muscle cells through a peroxisome proliferator-activated receptor
gamma-dependent pathway. Circulation 114, 807–819. 2006.
Santos, I.B.V
105
35
Chen, Y., Green, S.R., Ho, J., Li, A., Almazan, F., Quehenberger, O. The mouse CCR2 gene is regulated by two promoters that are
responsive to plasma cholesterol and peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands. Biochem. Biophys. Res. Commun.
332, 188–193. 2005.
36
Han, K.H., Chang, M.K., Boullier, A., Green, S.R., Li, A., Glass, C.K., Quehenberger, O. Oxidized LDL reduces monocyte CCR2
expression through pathways involving peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J. Clin. Invest. 106, 793–802. 2000.
37
Yamakawa K, Hosoi M, Koyama H, Tanaka S, Fukumoto S, Morii H. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists
increase vascular endothelial growth factor expression in human vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys. Res Commun;
271:571–4. 2000.
38
Jozkowicz, A., Cooke, JP., Guevara, I., Huk, I., Funovics, P., Pachinger O, et al. Genetic augmentation of nitric oxide synthase
increases the vascular generation of VEGF. Cardiovasc Res. 51:773–83. 2001.
39
Ward, P. A.; Lentsch, A. B. Endogenous regulation of the acute inflammatory response. Molecular and Cellular Biochemistry.
Volume 234-235, Number 1, 2002.
40
Koster, R., Anderson, M., de Beer, E.J. Acetic acid for analgesic screening. Fed Proc 18: 412-416. 1959.
41
Blane, G.F. Blockade of bradykinin induced nociception in the rat as a test for analgesic drugs with particular reference to
morphine antagonists. J. Pharmacol., v. 19, p. 367-376, 1967.
42
Blumberg H.; Wolf,P.S.; Dayton, U.B. Use of the writing test for evaluating analgesic activity of narcotic antagonists. Proc. Soc.
Exp. Biol. Med., v. 118,p. 763-766, 1965.
43
Siedmund, E.A.; Cadmus, R.A.; Lu, G. A method for evaluating both non-narcotic and narcotic analgesic. Proc. Soc. Exp. Biol.
Med., v.95, p. 729-731. 1957a.
44
Siedmund, E.A.; Cadmus, R.A.; Lu, G. Screening analgesics, incluinding aspirin-type compound based upon the antagonism of
chemically induced “writing” in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther., v.119, p. 184-193, 1957b.
45
Witkin, L.B., Huebner, C.F., Galdi, F., O’keefe, E., Spitaletta, P., Plummer, A.J. Pharmacognosy of 2 amino-indane hydrochloride
(Su 8629): a potent non-narcotic analgesic. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 133, 400–408. 1961.
46
Ribeiro, R.A; Vale, M.L; Thomazzi. S.M; Paschoalato, A.B.P; Poole, S; Ferreira, S.H; Cunha, F.Q. Involvement of resident
macrophages and mast cells in the writhing nociceptive response induced by zymosan and acetic acid in mice. Eur. J. Pharmacol.
V. 387, p. 111-118, 2000.
47
Tjөlsen A, Berger O.G, Hunskaar S, Rosland J.H, Hole K. The formalin test: evaluation of the method. Pain 1992; (51):517.
48
Lorenzetti, B. B.; Ferreira, S. H. Mode of analgesic action of dipyrone : direct antagonism of inflammatory hyperalgesia. Eur. J.
Pharmacol., v.114, p.375-381, 1985.
49
Duarte, I. D.; Santos, I. R.; Lorenzetti, B. B.; Ferreira, S. H. Analgesia by direct antagonism ofnociceptor sensitization involves the
arginine - nitric oxide -cGMP pathway. Eur. J. Pharmacol., v.217, p.225-227, 1992.
50
Lorenzetti, B. B.; Ferreira, S. H. Activation of the arginine - nitric oxide pathway in primary sensory neurones contributes to
dipyrone - induced spinal and peripheral analgesia. Inflamm. Res., v.45, p.308-311, 1996.
Santos, I.B.V
106
TRABALHOS PARALELOS
9.5 Artigo a ser submetido a periódico internacional
Laudelina Rodrigues de Magalhães1,2, Teresinha Gonçalves da Silva2, Iane Bezerra Vasconcelos Santos2,
José Maria Barbosa Filho1, Lúcia Fernanda C. da Costa Leite4, Marcelo Hernani Zaldini3. Synthesis,
anti-inflammatory activity of new arylidene-3-(4-phenyl-benzyl)-thiazolidine-2,4diones as potential PPARγ agonists.
9.6- Resumos publicados em congresso
SANTOS, I.B.V.; MOURÃO, R.H.V.; SOUZA, T.R.C.L.; SILVA, T.G.; LIMA,
M.C.A.; GALDINO, S.L.; PITTA,I.R. - Avaliação da atividade hipoglicemiante de
novos derivados da série benzilideno- tiazolidina-2,4- dionas. II Reunião
Regional da FESBE, 2007. Anais da II Reunião Regional da FESBE. Recife,
2007.
SITONIO,
M.M.;
MAGALHÃES.L.R.;
SANTOS,
I.B.V.;
LIMA,
M.C.A.;
BARBOSA-FILHO, J.M.; SILVA, T.G.; GALDINO, S.L.; PITTA,I.R. - Avaliação
da atividade antiinflamatória de um novo derivado tiazolidínico. II Reunião
Regional da FESBE, 2007. Anais da II Reunião Regional da FESBE. Recife,
2007.
OLIVEIRA, T.B.; UCHOA, F.D.T.; COSTA, P.C.V.; SANTOS, I.B.V.; SILVA,
T.G.; LIMA, M.C.A.; GALDINO, S.L.; PITTA, I.R. – The anti-inflammatory
potential of LPSF/CR-27 in vitro and in vivo. 39º Congresso Brasileiro de
Farmacologia e Terapêutica Experimental. São Paulo. 2007.
MAGALHÃES.L.R.; CASTRO, M.C.A.B.; SANTOS, I.B.V.; SANTOS, E.;
BARROS, C.D.; SILVA, T.G.; BARBOSA-FILHO, J.M.; LIMA, M.C.A.;
GALDINO, S.L.; PITTA,I.R. Atividade antiinflamatória de um novo derivado
tiazolidínico 2,5-dissubstituído (LPSF/GQ-30). XLVII Congresso Brasileiro de
Química – CBQ. Natal. 2007.
Santos, I.B.V
107
MOURA, S.L.; SINTONIO, M.M.; CASTRO, K.C.; CRUZ, A.C.N.; SANTOS,
I.B.V.; CAMPOS, I.A.; MALTA, D.J.N.; SILVA, T.G. Avaliação da atividade
analgésica do extrato etanólico da Caesalpina férrea Mart. (Leguminosae). XX
Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil X Congresso Internacional de
Etnofarmacologia, São Paulo, 2008.
9.7- Participação em banca examinadora
Monografia: Avaliação da atividade antiinflamatória do derivado tiazolidínico
LPSF/GQ-32. Aluno Thiago Ubiratam Lins e Lins do urso de Graduação em
Biomedicina. UFPE. 2008.
Feira das Ciências. Colégio Santa Maria. Recife, 2007 e 2008.
Santos, I.B.V