Pesquisa de produção de metalobetalactamase NDM em bacilos

PROGRAMA DE APRIMORAMENTO
PROFISSIONAL
SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE
COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS
FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO FUNDAP
PEDRO ERNESTO BIMONTI
Pesquisa de produção de metalo-betalactamase NDM em bacilos Gramnegativos isolados de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto - USP
RIBEIRÃO PRETO
2015
PEDRO ERNESTO BIMONTI
Pesquisa de produção de metalo-betalactamase NDM em bacilos Gramnegativos isolados de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto - USP
Monografia apresentada ao Programa de
Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP e
FUNDAP, elaborada no Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo
–
USP/
Departamento
de
Microbiologia, sob a orientação do Prof. Dr.
Roberto Martinez.
Área de Cordenação: Microbiologia/
Controle de Infecção Hospitalar
Orientador(a): Prof. Dr. Roberto Martinez
Supervisor(a) Titular: Rosa Helena A. R.
Gironi
RIBEIRÃO PRETO
2015
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a
fonte.
Catalogação da Publicação
Serviço de Documentação Microbiológica
Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP da FUNDAP
Bimonti, Pedro Ernesto.
Pesquisa de produção de metalo-betalactamase NDM em bacilos Gram-negativos
isolados de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto - USP
Orientadores: Prof. Dr. Roberto Martinez.
Palavras chaves. NDM1, metalo-betalactamase, carbapenêmicos.
RESUMO
Desde a primeira droga antibacteriana descoberta, a penicilina, travamos uma
guerra imensurável contra uma das leis da natureza, a sobrevivência, e as teorias de
Darwin, especialmente uma, a teoria da seleção natural. É sabido que a resistência
bacteriana vem sendo um grande problema mundial e esta guerra está longe de ser
acabada.
Com a mais ampla e potente classe de antimicrobianos, os carbapenêmicos.
Acreditávamos estar a salvos por um tempo maior, porém essa calmaria logo se
dissipou com uma nova seleção, agora por pressão de uso e até abuso desses
medicamentos.
Seja naturalmente, ou pelo uso indiscriminado de antibióticos, as bactérias
conhecidas como New Delhi Metallo(NDM1) logo se disseminaram, possuindo um
ion de zinco na enzima betalactamase, que produzem metalo-betalactamase. O
gene codificador (NDM-1) pode ser transmitido de forma horizontal através de
plasmídeos para outras bactérias, conferindo então novos clones resistentes aos
carbapenêmicos.
Essa bactéria foi registrada pela primeira vez na Suíça em 2009 por um paciente
previamente hospitalizado na Índia em 2008.
No Brasil o primeiro caso registrado pela ANVISA foi em 03 de abril de 2013 no
município de Porto Alegre, RS.
Através de testes fenotípicos com técnicas disponibilizadas pela ANVISA este
trabalho procurou indícios dessa nova resistência em bacilos Gram-negativos
isolados de pacientes no Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto, SP.
Não foram encontrados, bactérias produtoras de metalo-betalactamase NDM no
Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto
Palavras chave: NDM1, metalo-betalactamase, carbapenêmicos.
i
LISTA DE TABELAS
Bactérias, clinica, material, teste fenotípico para
TABELA 1 metalo-betalactamase e resultados do Vitek
9
ii
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
CCIH (Comissão de Controle de Infecção Hospitalar)
CLM clinica medica
CTI centro de terapia intensiva
EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético)
GIN Ginecologia
HEM hematologia
IMP Imipenem
MEM Meropenem
MI Moléstia Infecciosa
NDM (New Delhi Metalo-betalactamase)
NEF nefrologia
PCR polymerase chain reaction
iii
SUMÁRIO
1. INTRODUCÃO ............................................................................................... 1
1.1.
Resistência bacteriana ........................................................................ 1
1.2.
Carbapenemicos.................................................................................. 1
1.3.
Resistencia carbapenêmicos ..............................................................2
1.4.
Metalo-betalactamase ........................................................................3
1.5.
Sobre NDM .........................................................................................3
1.6.
NDM no Brasil ....................................................................................4
2. OBJETIVO ...................................................................................................5
3.
MATERIAIS E METODOS.....................................................................6
3.1.
Preparação dos discos com EDTA ....................................................6
3.2.
Preparação, suspensão bacteriana, e semeadura ............................6
3.3.
Preparação do teste fenotípico ..........................................................6
3.4.
Leitura do teste fenotípico .................................................................6
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................7
5. CONCLUSÃO...............................................................................................8
6. REFERÊNCIAS ...........................................................................................11
iv
1. INTRODUÇÃO
A resistência bacteriana é um problema mundial estando associada aos altos custos
de um hospital. O uso inadequado dos antibióticos consiste na disseminação da
resistência bacteriana.
Nessa analise entra o carro chefe para determinar o perfil dos micros organismos e
discernir a droga de escolha para um tratamento eficaz, além de ser responsável
pelo monitoramento de populações microbianas dentro do âmbito hospitalar ou da
comunidade.
O laboratório de microbiologia deve estar sempre preparado, amparando o hospital e
a CCIH (comissão de controle de infecção hospitalar) a controlar a disseminação de
infecções hospitalares. (ANVISA. Modulo 3. Principais Síndromes Infecciosas 2010)
1.1. Resistência bacteriana
A resistência aos antimicrobianos tem sido frequente no mundo todo,
possivelmente como consequência de seu uso indiscriminado. Ao longo da sua
evolução, microrganismos desenvolveram mecanismos versáteis de resistência para
os efeitos tóxicos dos antibióticos. (MOREIRA, et al 2004)
1.2. Carbapenêmicos.
Os antibióticos da classe dos carbapenêmicos desenvolvem um papel importante
em nosso arsenal antimicrobiano, eles possuem um amplo espectro de atividade e
inclui bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Como resultado, eles são
frequentemente usados em última instância por pacientes gravemente doentes ou
suspeitos de abrigar bactérias multirresistentes. (PAPP-WALLACE et al 2011)
Carbapenêmicos são ativos contra uma gama de bactérias Gram-positivas e Gramnegativas, incluindo Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Neisseria
spp., Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., Enterobacter spp.,
Bacteroides spp. e Clostridium spp. Tienamicina foi o primeiro antibiótico
carbapenêmico a ser descoberto, foi isolado a partir de Streptomyces cattleya.. No
entanto, a tienamicina é quimicamente instável e é metabolizada por uma enzima
1
renal dihydropeptidase humana. Em vez disso, um derivado de N-formimidoílo de
tienamicina mais estável (imipenem) é utilizado clinicamente, em combinação com
cilastatina, que é um inibidor da enzima dihydropeptidase. Outros carbapenêmicos
têm sido desenvolvidos para uso clínico, incluindo o meropenem e ertapenem, que
não são bons substratos para a dihydropeptidase renal, adquirindo maior
estabilidade. Os recentes avanços na nossa compreensão da genética e bioquímica
da produção de carbapenêmicos em bactérias pode levar à produção de novos
antibióticos carbapenem através da exploração de enzimas e sistemas bacterianos.
(SARAH et al 2005)
1.3. Resistencia a carbapenêmicos
Como todos os agentes antimicrobianos beta-lactâmicos, os carbapenêmicos atuam
por inibição da síntese da parede celular bacteriana, por ligação e inativação de
proteínas de ligação de penicilina (PBPs). Carbapenêmicos são ativos contra a
maioria das beta-lactamases incluindo as AmpC, e as de espectro estendido.
A resistência surge quando as bactérias adquirem ou desenvolvem mudanças
estruturais dentro de suas PBPs, quando aderirem metalo-betalactamases
(degradam rapidamente os carbapenêmicos) ou quando há alteração na
permeabilidade de membrana. (ZHANEL et al 2007)
As enzimas carbapenemases são as beta-lactamases com a capacidade mais
versátil de hidrolisação, são hábeis a hidrolisar penicilinas, cefalosporinas,
monobactâmicos e carbapenêmicos. As bactérias que produzem essas betalactamases podem causar serias infecções, que são particularmente difíceis de
combater em razão de restarem poucos antibióticos que atuam sobre elas.
(QUEENAM 2007)
Atualmente são encontradas 3 grandes classes de carbapenemases, as metalobeta-lactamases (IMP, VIM, NDM) as OXA-carbapenemases (mais frequente em
enterobactérias OXA-48) e as carbapenemases do tipo KPC, sendo a KPC e a NDM
de extrema relevância com rápida e ampla disseminação. (ANVISA, Nota técnica,
2013)
2
1.4. Metalo beta-lactamase
A primeira metalo-betalactamase descoberta há 20 anos foi produzida de uma cepa
de Bacillus cereus.
As metalo-betalactamases requerem íons de zinco para catalisar a hidrólise de betalactâmicos Eles exibem um perfil de substrato de largo espectro que catalisa a
hidrólise de uma ampla gama de antibióticos beta lactâmicos, incluindo penicilinas,
cefalosporinas, carbapenemos, cefamicinas. (PAGE, BADARAU et al 2008)
1.5. Sobre NDM
Nova Delhi metallo beta lactamase-1 (NDM-1) vem se mostrando uma ameaça
mundial, pela primeira vez reportada in 2008 na Suécia de um paciente previamente
hospitalizado na índia. A NDM-1 associa-se com cepas bacterianas capazes de
exibir uma resistência a multidrogas incluindo os aminoglicosídeos e as
fluoroquinolonas. (Mariappan Shanthi et al 2014)
New Delhi metalo-betamactamase (NDM) foi detectada pela primeira vez em 2009
na Suíça em uma Klebsiella pneumoniae. Desde então, diferentes espécies
bacterianas foram isoladas carregando o gene blaNDM, a maioria no sub continente
indiano, porém com grande disseminação no mundo todo. (Ana Paula D'Alincourt
Carvalho-Assef et al 2013)
O surgimento de novas β-lactamases com atividade de hidrolisar os carbapenêmicos
mais a associação a mecanismos de resistência a outras classes de antibióticos, a
frequência com que causam infecções, a alta mortalidade com a qual eles estão
associados, e o potencial para a sua transmissão generalizada de elementos
genéticos móveis, representa um grande desafio. O gene NDM-1 é encontrado num
plasmídeo altamente transmissível para outras bactérias. As bactérias NDM-1
positivas são capazes de colonizar o trato gastrointestinal de humanos por períodos
prolongados e estão espalhadas pela contaminação de água e superfícies
ambientais. A facilidade e frequência das viagens internacionais tem contribuído a
rápida disseminação global. (GOVIND et al 2013)
O surgimento de blaNDM-1 em associação com outros genes de resistência
demonstra a rápida evolução de bactérias e a capacidade para adquirir e manter os
genes de resistência diferentes. Este fato é preocupante, pois as opções de
3
antimicrobianos disponíveis para o tratamento dessas infecções são decrescentes.
Os padrões distintos observados em isolados clínicos sugere que blaNDM-1 tenha
se espalhado em silêncio nos hospitais. (QUILES ET AL. 2014)
1.6. NDM no Brasil
No Brasil ao primeiro caso registrado de produção de carbapenemase NDM também
foi detectada pela ANVISA em 03 de abril de 2013 no município de Porto Alegre, RS,
sendo 3 bactérias pertencentes ao grupo Enterobater cloacae e um por Providencia
rettigeri. (ANVISA,Nota Técnica, 2013)
Em 2013 no Rio de Janeiro RJ, o gene NDM foi identificado em Proteus rettgeri e
Enterobacter cloacae. (QUILES et al 2014)
Em 2014 no Rio de Janeiro RJ, foi reportado o primeiro caso de um Acinetobacter
baumanii possuindo o gene NDM1 no Brasil. (PILLONETTO, et al, 2014)
4
2. OBJETIVO
Pesquisar o fenótipo metalo-betalactamase (New Delhi metalo-betalactamase) ou
NDM em bacilos gram-negativos isolados de pacientes do Hospital das Clínicas de
Ribeirão Preto
5
3. MATERIAIS E METODOS
Após ser realizado o teste de sensibilidade antibacteriana de bacilos gramnegativos, foram selecionadas as bactérias com resistência aos carbapenêmicos,
imipenem, meropenem e ertapenem, sendo o antibiograma feito no Vitek 2 Compact
automated system (bioMérieux Clinical Diagnostics, France). Depois de selecionadas
foi realizado o teste de indução gênica para metalo-betalactamase de acordo com a
nota técnica da ANVISA Nº 01/2013; conforme descrito a seguir.
3.1. Preparação dos discos com EDTA
Depositar sobre a face interna de uma placa de Petri estéril e a seguir dispensar
10µL de solução de EDTA. Deixar evaporar o excesso de umidade por cerca de
20minutos. Carbapenêmicos degradam com a presença de umidade; portanto a
estocagem dos discos e desaconselhável.
3.2. Preparação, suspensão bacteriana, e semeadura em placas de MullerHinton
Preparar suspensão bacteriana com turbidez equivalente ao padrão 0.5 da escala de
McFarland em salina 0.9% estéril. Umedecer o swab na suspensão, eliminar o
excesso e espalhar homogeneamente a suspensão bacteriana sobre a superfície do
agar Muller-Hinton em placa 15 x 90 mm Após a evaporação do excesso de
umidade aplicar os discos e incubar por 18 a 24 horas a 36 °C. Os testes fenotípicos
consistem em uma triagem. Apenas os testes moleculares, como PCR com
iniciadores específicos e sequenciamento são confirmatórios.
3.3.Preparação do teste fenotípico
Após a preparação dos discos e a preparação das placas, colocar os discos de
Imipenem e Meropenem sem aditivo e Imipenem e Meropenem com aditivo em cada
placa.
3.4. Leitura do teste fenotípico
Isolados com diferença de diâmetro ≥ 5 mm para o carbapenêmico (imipenem e
meropenem) com EDTA em relação ao carbapenêmico sem EDTA deverão ser
considerados potenciais produtores de metalo-betalactamase (IMP, VIM. NDM)
6
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram avaliados 11 bacilos Gram-negativos de janeiro a abril de 2014 resistentes
aos carbapenêmicos, cuja espécie, material de origem, clínica, antibiograma e os
testes estão relacionados na tabela 1.
Não se encontrou qualquer bactéria produtora de metalo-betalactamase NDM.
Contudo, o teste fenotípico consiste em triagem que é sujeito a resultados falso
positivos. Testes moleculares, como PCR com indicadores específicos ou
sequenciamento, são mais sensíveis e confirmatórios. Apesar do pequeno número
de isolados bacterianos estudado, é provável que espécies bacterianas NDM não
tenham chegado até a região de Ribeirão Preto SP. Como esses microrganismos
disseminaram-se rapidamente pelo mundo, é interessante continuar a monitorizarão
fenotípica da carbapenemase NDM, detectando e buscando evitar que também se
disseminem entre os pacientes do Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto SP
7
5. CONCLUSÃO
A corrida contra a resistência a multi drogas bactérianas vem crescendo no mundo
inteiro, sem tempo previsto aparecem novas resistências, sem novas drogas o cerco
vai ficando mais perigoso e a medicina preventiva mais importante. Este trabalho
mostra que mesmo com novas resistências ainda não fora verificada NDM no
Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto SP, como Sun Tzu em a Arte da Guerra
disse:
-A suprema arte da guerra é derrotar o inimigo sem lutar
8
Tabela 1: Bactérias, clínica, material, teste fenotípico para metalo-betalactamase e
resultados do Vitek
Isolado Bactéria
Clinica Material IPM
MEM IPM
MEM IMP MEM
EDTA EDTA Vite Vitek
k
1
2
Acinetobacter CTI
Aspirado 11mm
12mm 11mm
12mm R
R
baumanii
Traqueal
Acinetobacter URO
Urina
21mm
17mm 21mm
17mm R
R
Urina
9mm
9mm
12mm
13mm R
R
CLM
Sangue
10mm
9mm
11mm
9mm
R
R
HEM
Sangue
10mm
10mm 10mm
10mm R
R
NEF
Sangue
17mm
15mm 17mm
15mm R
R
NEF
Sangue
14mm
16mm 13mm
13mm R
R
Acinetobacter GIN
Cateter
9mm
9mm
5mm
5mm
R
R
Cateter
10mm
5mm
10mm
5mm
R
R
baumanii
3
Pseudomonas URO
aeroginosa
4
Klebsiella
pneumoniae
5
Klebisiella
pneumoniae
6
Klebisiella
pneumoniae
7
Klebisiella
pneumoniae
8
baumanii
9
Acinetobacter CTI
baumanii
9
10
11
Klebsiella
Radiol
Abscess 17mm
pneumoniae
ogia
o/figado
Klebsiella
MI
Urina
17mm
14mm 17mm
13mm R
R
13mm 17mm
13mm R
R
pneumoniae
Enterobactérias: S= MEM ≥ 23 IMP≥ 23 R= MEM ≤ 19 IMP ≤ 19
Pseudomonas spp S= MEM ≥ 19mm IMP≥ 19mm R= MEM≤15mm IMP ≤15mm
Acinetobacter spp S= MEM≥ 18mm IMP≥ 22mm R= MEM≤ 14mm IMP≤18mm
Com EDTA ≥ 5mm positivo para metalo-betalactamase
10
6. REFERENCIAS
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multirresistentes. Nota Técnica, N.01/2013, Brasil
ANVISA. Microbiologia clinica para o controle de infecção relacionada a assistência
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12