natal / rn 2016 associação da imunoexpressão das

MELKA COÊLHO SÁ
ASSOCIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS
XRCC1, TFIIH E XPF COM CARACTERÍSTICAS
CLINICOPATOLÓGICAS E SOBREVIDA EM CARCINOMA
EPIDERMOIDE DE LÍNGUA ORAL
NATAL / RN
2016
MELKA COÊLHO SÁ
ASSOCIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS
XRCC1, TFIIH E XPF COM CARACTERÍSTICAS
CLINICOPATOLÓGICAS E SOBREVIDA EM CARCINOMA
EPIDERMOIDE DE LÍNGUA ORAL
NATAL / RN
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ASSOCIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS XRCC1,
TFIIH E XPF COM CARACTERÍSTICAS CLINICOPATOLÓGICAS E
SOBREVIDA EM CARCINOMA EPIDERMOIDE DE LÍNGUA ORAL
Tese apresentada ao Colegiado do
Programa de Pós-Graduação em
Patologia Oral da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de Doutor em Patologia Oral.
Orientadora: Profª. Drª. Roseana de Almeida Freitas
NATAL / RN
2016
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Sá, Melka Coêlho.
Associação da imunoexpressão das proteínas XRCC1, TFIIH E XPF com características clinicopatológicas e sobrevida em carcinoma epidermoide de língua oral /
Melka Coêlho Sá. – Natal, RN, 2016.
109 f.: il.
Orientadora: Profª. Drª. Roseana de Almeida Freitas.
Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia.
1. Carcinoma de células escamosas – Tese. 2. Neoplasias bucais– Tese. 3.
Reparo do DNA – Tese. 4. Dano ao DNA– Tese. I. Freitas, Roseana de Almeida. II.
Título.
“Por causa da tua palavra, lançaremos as redes”
(Lc 5,1-11)
DEDICATÓRIA
Ao Deus que se faz morada em cada ser humano,
Aos meus ex, futuros e eternos alunos e pacientes.
“Eu vi um menino correndo.
Eu vi o tempo brincando ao redor do caminho daquele menino.
Eu pus os meus pés no riacho e acho que nunca os tirei.
O sol ainda brilha na estrada eu nunca passei.
Eu vi a mulher preparando outra pessoa.
O tempo parou pra eu olhar para aquela barriga.
A vida é amiga da arte. É a parte que o sol me ensinou.
O sol que atravessa essa estrada que nunca passou.
Por isso uma força me leva a cantar.
Por isso essa força estranha no ar.
Por isso é que eu canto, não posso parar.
Por isso essa voz tamanha.
Eu vi muitos cabelos brancos na fronte do artista o tempo não para e, no entanto,
ele nunca envelhece.
Aquele que conhece o jogo, do fogo das coisas que são.
É o sol, é a estrada, é o tempo, é o pé e é o chão.
Eu vi muitos homens brigando. Ouvi seus gritos.
Estive no fundo de cada vontade encoberta, e a coisa mais certa de todas as
coisas. Não vale um caminho sob o sol.
E o sol sob a estrada, é o sol sobre a estrada, é o sol.”
(Força Estranha, Caetano Veloso)
AGRADECIMENTOS
Gratidão, virtude dos sábios, foi e é um sentimento presente em toda minha jornada
acadêmica e vida. Entendo que minha jornada no Programa de Pós Graduação em
Patologia Oral foi iniciada antes mesmo de morar em terras potiguares, recebi
estímulos: positivos e desafiadores. Neste momento, sinto-me confortável em expor
meus agradecimentos, que não serão breves.
Primeiramente gostaria de agradecer às minhas fontes inspiradoras e motivacionais:
a Deus que em seu mistério trino se faz presente em cada pessoa e inspira o
surgimento de dons diversos; à minha família (nuclear e comunitária) e aos meus
mestres Profª. Drª. Marcoeli, Prof. Dr. Jorge D’Alburqueque Lossio, Profª Teresinha
Rego, Prof. Dr. Amilton Raposo e Profª Drª Roseana de Almeida. Antes mesmo de
conhecê-los, já rezava por cada e Deus que sempre atende as minhas orações,
destinou-me profissionais éticos, dedicados, zelosos e prudentes que são meus
espelhos de carreira acadêmica e de vida. Sou “pupila” de grandes EDUCADORES.
De cada um guardo experiências incríveis, o que me destina a responsabilidade e o
desafio de tornar-me educadora segundo seus ensinamentos e exemplos. Obrigada
mestres, por assumirem com amor suas vocações!
Esta pesquisa, bem como toda a minha vida profissional, só foi realizada por existir
uma imensa fonte de estímulo: o Deus que se fez presente em cada um dos meus ex
alunos e pacientes, neste grupo por ter tido contato com alguns incluo os pacientes
que foram objeto desta pesquisa. Experiências construtivas que me despertaram o
exercício da docência buscando postura ética e humana. Agradeço também aos meus
futuros alunos e pacientes, busco aprimoramento profissional para poder oferecer
trabalho de qualidade. Compartilho o pensamento do meu pastor amigo, Pe Tony: “ a
sociedade espera de cada profissional postura ética, primor no exercício laboral e
responsabilidade pelo produto do seu trabalho”.
Sou reflexo do conjunto de experiências que presencie, das amizades que construí e
principalmente das circunstâncias que superei. Não possuo uma história de vida de
privações pois todos meus familiares não poupam esforços para o meu conforto,
diferente da história de vida do meu pai, minha mãe, tios, tias e avôs. Presencie a
FOME, a DOR e a SEDE em vários momentos compartilhados com meus pacientes e
alunos. Verdadeiramente não há experiência mais reveladora do que a da miséria e
do poder transformador da educação. O solo rachado da seca, enchentes, violência,
drogas, dificuldades financeiras nada disso foi capaz de apagar o brilho nos olhos de
alunos e pacientes ávidos por conhecimento.
Este brilho nos olhos era muito além do encantamento era a percepção da mudança
que estava ocorrendo em cada um juntamente com o empoderamento do
conhecimento e no descobrir-se como protagonista de sua própria vida. Educação,
para mim é um tema muito familiar, minhas avós e tias avós dedicavam-se nos meus
estudos. No entanto até o meu primeiro contato com a sala de aula, não imaginava
que possuía dom para docência. Foram meus alunos que me revelaram a esta
vocação. Sempre pensei em ser dentista clínica. Mestrado? Planejamento
estratégico? Sala de aula? Doutorado? Nada disso estava nos meus planos.
Não foram as forças das circunstancias que me levaram a realizar mestrado e
doutorado. Foi a força da decisão de entregar a minha vida a Deus e deixar-se
direcionar pelos caminhos divinos. A fé foi e é uma companheira fiel, quando me falta
este combustível possuo uma legião de amigos que oram por mim. Agradeço
profundamente a todos meus amigos, anjos intercedores, que pela força de suas
orações, palavras amigas e de apoio auxiliaram nos momentos difíceis na trajetória
do doutorado. Obrigada a minha amiga-irmã Ana Patricia, a minha chefa Jamilla
Mirck, a minha melhor aquisição de 2010 – Joseana Leitão, a prima Bárbara, a minha
mãe Concita, a meu pai João, a Rafaella, ao João, aminha sobrinha Ava Beathriz, aos
meus primos-irmãos (Almir, Lucas, Iago e Goeth), as minhas madrinhas (Karla e
Mercedes), aos amigos da Pastoral da Juventude de Teresina – em especial aos
irmãos de fé do MANÁ, ao meu best friend pe Luis Eduardo, ao pe Tony, ao Don
Juarez, aos amigos do PSF48, a Carolina Tavares, a Luciana Azevedo, aos amigos
do mestrado da UFPI , ao meu namorido Victor e a minha nova família baiana e
paraibana. Vocês aquecem meu coração e iluminam minha vida.
Na primeira vez que conheci o Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral fui
apresentada à alegria e ao entusiasmo de Prof. Roseana. Lembro-me de cada detalhe
de nossa conversa, mas o que mais me marcou em nosso primeiro encontro foi o zelo,
o carinho e dedicação que a minha futura orientadora depositava na conversa. Não,
eu não fui encantada, naquele momento eu percebi que aquele brilho no olhar dos
meus alunos também estava nos olhos de Prof.ª Roseana. Gostaria de agradecer a
minha orientadora por manter este brilho no olhar, por ter depositado confiança, pelos
conselhos e principalmente pelo exemplo de vida. Parafraseando pe Tony: “Conselhos
ajudam, mas o exemplo arrasta!” A Sra. possui atitudes coerentes com seus
ensinamentos. Obrigada
Agredeço especialmente ao Prof. Dr. Leão pelos ensinamentos e por todos os cafés
e conversas prazerosas que tivemos, nas pessoas do Prof. Dr. Leão e da Profª Drª
Lélia Batista, agradeço a todos os professores (Prof. Dr. Costa, Profª Drª Hebel, Prof.
Dr. Carlos, Profª. Drª. Ericka, Prof. Dr. Manoel, Profª Drª Lelia Maria, Profª Drª Ana
Miriam, Profª Drª Marcia, Profª Drª Patricia, Prof. Dr. Bruno) e funcionários (Lourdes,
Gracinha, Hévio, Ricardo e Sandra) do Programa de Pós Graduação em Patologia
Oral da UFRN que com dedicação edificam nossa querida pós, neste agradecimento
faço extensão ao Prof. Kenio, Prof. Noro (entusiasta da formação e educadores), aos
funcionários do Departamento de Odontologia e a todos do Laboratório de Bioquímica
e do Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutico (Tecbiofar), pessoas
com quem tive o prazer de conviver.
Obrigada especialmente a Sandrinha por sempre ter uma conversa prazerosa e
abraço confortante.
Agradeço carinhosamente aos alunos (Denise Helén, Ana Luisa, Clarissa, Natália,
Roseane, Jamille, Francisco Jadson, Edilmar, Fernanda, Vilson, Laura, Laudenice,
Marcelo, Tiago, Andreia, Viviane, Maria Luiza, Luciana, Salomão, Rafaela, Eduardo,
Luis Arthur, Thalita, Leorik, Mara, Mariana, Rodrigo, Hugo, Amanda, Angelica,
Jefferson) e ex alunos (Aguida, Felipe, Emilia, Ana Rafaela, Fernando, Rodrigo,
Marcelo, Stefania, Maiara, Nazareno, Adriana, Keila Martha, Joabe, Emeline) do
Programa por compartilhar: lar, cafés, estímulos, tempo, conhecimentos,dificuldades,
receitas, canetinhas, viagens, quarto, abraços, missas, orações, sorrisos, academia,
almoço, livros, lágrimas, gritos, angústias, saidinhas, saladas, aulas, filmes, caronas,
histórias, orientador, decepções, embriaguez,
alegrias, tristezas, “orgasmos”
científicos, vitórias, sorvete, finais de semana, material da arquivologia, dúvidas,
bebidas, beijos, armário e fotos (muitas fotos). Formamos verdadeiramente uma
família “patológica”.
Preciso fazer destaque aos meus amigos irmãos acolhedores. Keila Martha que me
apresentou carinhosamente o universo chamado “patox”, sua dedicação é inspiradora,
amiga obrigada! Joabe, cristão impar, amigo das horas difíceis e fáceis obrigada pela
amizade e companheirismo. Maria Luiza é a minha prima “mutada”, pessoa de
simpatia única que emana harmonia, paciência, perseverança e tranquilidade. Sempre
com atitudes positivas me ajudava nas inúmeras dificuldades, enfrentamos juntas o
desafio da descrição da morfologia das lesões, a estatística e a ansiedade do nosso
futuro. Thalita é uma irmã especial, agradeço pelo entusiasmo, dedicação e prior
depositado nas pesquisas que realizamos juntas. Desejo que estes anos
compartilhados sejam o início de nossa parceria, as maranhenses vão dominar o
mundo. Tereza de Lisiex, Felipe, Stefânia, Barbara, Natália e Viviane obrigada pela
convivência fraterna em nosso lar.
Agradeço a Capes e ao Cnpq pelo custeio desta pesquisa
Por fim, mas não menos importante, agradeço a todos que compõem a Liga Norte
Riograndense Contra o Câncer: pacientes, funcionários (Narjara, Michelle, Eduardo,
Renata) e voluntários. O rigor técnico, ambiente profissional e extremo zelo pelo bemestar do paciente são apenas algumas características que merecem destaque nos
hospitais da Liga. Estas características são inspiradoras para minha atuação
profissional. Aqueles corredores me trouxeram à memória momentos que já vivencie,
a coesão da equipe lembrava-me locais onde já trabalhei, o estímulo dos funcionários
lembrava-me o brilho no olhar dos alunos no primeiro dia de estágio, o sucesso de um
tratamento era a alegria de uma vitória profissional e pessoal. No entre e sai das salas,
visualizava o futuro e o presente, algumas vezes a morte e a ausência eram mais
presentes. No exercício do desapego, tenho a necessidade de fazer o meu melhor
hoje, pois o presente é a nossa dádiva divina.
RESUMO
RESUMO
Sistemas de reparo do DNA, genes e proteínas, são essenciais para manutenção da
integridade do genoma, evitando graves doenças como o câncer. Desrregulação na
expressão destas proteínas vem sendo associado tanto ao risco do desenvolvimento,
como na evolução de variados cânceres humanos com destaque para o carcinoma
epidermoide oral. O objetivo deste trabalho foi analisar a imunoexpressão das
proteínas de reparo do DNA, XRCC1, THIIF e XPF em carcinoma epidermoide de
língua oral (CELO) e investigar associação com parâmetros clínicos, histopatológicos,
de desfecho e sobrevida em cinco anos. Setenta e quatro casos de CELO foram
analisados por meio da técnica da imuno-histoquímica de forma semiquantitativa.
Observou-se alta expressão das proteínas pesquisadas nas células parenquimatosas,
identificando associação significativa da elevada expressão de XRCC1 com melhor
estadiamento clínico (p=0,02). A regressão de Cox revelou tamanho do tumor
(p<0,01), comprometimento linfonodal (p=0,04), estágio do tumor (p=0,02) e
profundidade de invasão >4mm (p=0,05) como fatores prognósticos para CELO. Os
resultados deste experimento sugerem que as proteínas XRCC1, TFIIH e XPF
participam do processo de tumorigênese, entretanto a imunoexpressão das mesmas
não pode ser utilizada como indicador independente de prognóstico para CELO.
Palavras-chave: Carcinoma epidermoide oral, Reparo de DNA; XRCC1; TFIIH; XPF
ABSTRACT
ABSTRACT
DNA repair systems, genes and proteins are essential for genome integrity
maintenance, avoiding serious diseases such as cancer. Deregulation in the
expression of those proteins has been associated with both the risk of development
and evolution of various human cancers, including oral squamous cell carcinoma. The
purpose of this study was to analyze the immunoreactivity of the DNA repair proteins
XRCC1, THIIF and XPF in oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) and to
investigate its association with clinical and histopathological parameters, outcome and
5-year survival rate. Seventy-four cases of OTSCC were analyzed semi-quantitatively
through immunohistochemistry. We observed that DNA repair proteins were highly
expressed in parenchymal cells; however, we only observed a significant association
between XRCC1 high expression and better clinical staging (p=0,02). Cox regression
showed that tumor size (p<0,01), lymph node involvement (p=0,04), tumor stage
(p=0,02) and depth of invasion> 4mm (p=0,05) were prognostic factors. The results of
this experiment suggest that XRCC1, TFIIH and XPF participate in the tumorigenic
process, however, their immunoexpression may not be used as an independent
prognostic indicator for OTSCC.
Keywords: Oral Squamous Cell Carcinoma; DNA Repair Gene; XRCC1; TFIIH; XPF
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
Esquema da via de reparo de DNA por excisão de base
(CHRISTMANN et al., 2003)
40
Figura 2
Esquema da via de reparo de DNA por excisão de nucleotídeo
(CHRISTMANN et al., 2003)
42
Figura 3
Casos de carcinoma epidermoide de língua oral registrados, entre
janeiro de 2001 a dezembro de 2010, no arquivo da Liga Norte
Riograndense Contra o Câncer segundo seleção para o estudo.
Natal- RN, 2016
58
Figura 4
Carcinoma epidermoide de língua oral - parâmetros de análise
histopatológicos propostos por Brandwein-Gensler et al. (2005) e
Almangush et al. (2015): (A) invasão perineural (barra de escala
100µm); (B) pouco infiltrado inflamatório (barra de escala de
200µm);(C) Padrão de invasão tipo 5 (barra de escala 500µm); (D)
Profundidade tumoral de 14.300,75 µm (barra de escala 5000 µm);
(E e F) tumor budding, barra de escala 100µm. Natal – RN, 2016
(Pannoramic Viewer, H/E)
62
Figura 5
Carcinoma epidermoide de língua oral – (A) Elevada
imunomarcação para XRCC1 no front tumoral; (B) Detalhe da
imunoexpressão da proteína XRCC1 em núcleo; (C) Elevada
imunomarcação para TFIIH no front tumoral ; (D) Detalhe da
imunoexpressão da proteína TFIIH em núcleo e citoplasma; (E)
Elevada imunomarcação para XPF no front tumoral ; (F) Detalhe da
imunoexpressão da proteína XPF em núcleo e citoplasma (A,C,D
barra de escala identificando valor de 1000µm; B,E,F barra de
escala identificando 100 µm, Pannoramic Viewer, HIDEF)
64
Figura 6
Sobrevida global dos pacientes com carcinoma epidermoide de
língua oral selecionados para o estudo. Natal – RN, 2016
65
Figura 7
Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as
co-variáveis (A) gênero, (B) idade, (C) tamanho do tumor (T), (D)
comprometimento linfonodal no diagnóstico (N), (E) estadiamento
clínico TNM e (F) a presença de metástase linfonodal com
confirmação histopatológica em carcinoma epidermoide de língua
oral. Natal – RN, 2016
66
20
Figura 8
Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as
co-variáveis (A) tratamento e (B) recidiva loco-regional em
carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
67
Figura 9
Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para o
parâmetros de análise histopatológicos dos casos de carcinoma
epidermoide de língua oral (A) invasão perineural, (B) infiltrado
inflamatório, (C) padrão de invasão, (D) gradação final pelo sistema
de Brandwein-Gensler et al. (2005. Natal – RN, 2016
69
Figura 10
Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para o
parâmetros de análise histopatológicos dos casos de carcinoma
epidermoide de língua oral (A) tumor budding, (B) profundidade e
(C) gradação final pelo sistema de Almangush et al. (2015). Natal –
RN, 2016
70
Figura 11
Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as
covariáveis da imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (A)
XRCC1, (B)TFIIH e (C) XPF nas células do front tumoral de
carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
72
Quadro 1
Sistema de gradação de malignidade recomendado por
Brandwein-Gensler et al. (2005)
52
Quadro 2
Parâmetros histopatológicos avaliados no modelo de gradação BD
proposto por Almangush et al. (2015)
53
Quadro 3
Clone, especificidade, fonte, diluição, recuperação antigênica e
incubação dos anticorpos primários
54
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Parâmetros clínicos e demográficos dos casos de carcinoma epidermoide
de língua oral selecionados para análise de sobrevida. Natal –RN, 2016
59
Tabela 2
Parâmetros clínicos de seguimento dos casos de carcinoma epidermoide
de língua oral selecionados para análise de sobrevida. Natal –RN, 2016
60
Tabela 3
Distribuição absoluta e relativa dos parâmetros de análise histopalógicos
dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por
Brandwein-Gensler et al. (2005) e Almangush et al. (2015). Natal – RN,
2016
61
Tabela 4
Análise da imunorreatividade das proteínas XRCC1,TFIIH e XPF dos
casos de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
63
Tabela 5
Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordoo com parâmetros clínico e
demográficos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal
–RN, 2016
68
Tabela 6
Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordo com parâmetros de análise
histopatológicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral
segundo proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) e Almangush et al.
(2015). Natal –RN, 2016
71
Tabela 7
Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordo com os parâmetros de
expressão das proteínas de reparo do DNA (TFIIH, XPF e XRCC1) nas
células do front tumoral de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal
– RN, 2016
72
Tabela 8
Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral, de acordo com a imunoexpressão das proteínas de reparo do
DNA (TFIIH, XPF e XRCC1), o estadiamento clínico TNM, a presença de
metástase linfonodal, o tratamento,a presença de recidiva loco-regional e
o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2016
74
Tabela 9
Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral que possuem cinco anos de acompanhamento, de acordo com
a gradação de malignidade recomendado por Brandwein-Gensler et al.
(2005) e por Almangush et al. (2015) e a imunoexpressão das proteínas
de reparo do DNA (TFIIH, XPF e XRCC1) Natal – RN, 2016
75
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AP - Apurínico ou apirimidínico
ADH - Enzima álcool desidrogenase
ADP-Ribose - Adenosina difosfato, do inglês “adenosine diphosphate ribose”
APEX1 – Apurinico/apiridinico endonuclease 1, do inglês “apurinic/apyrimidinic
endonuclease 1”
BER - Reparo de excisão de base; do inglês “base excision repair”
CEO - Carcinoma epidermoide oral
CELO- Carcinoma epidermoide de língua oral
CSA - Síndrome de cockayne grupo A, do inglês “cockayne syndrome group A”
CSB - Síndrome de cockayne grupo B do inglês “cockayne syndrome group B”
DNA – Ácido desoxirribonucleico; do inglês “deoxyribonucleic acid”
ERCC1 – Excisão reparação grupo cross-complementação 1, do inglês “excision
repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1”
ERCC2 – Excisão reparação grupo cross-complementação 2, do inglês “excision
repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 2”
ERCC4 - Excisão reparação grupo cross-complementação 4, do inglês “excision
repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 4”
FANCD2 – Anemia Fanconi complemento D2; do inglês “fanconi anemia
complementation group D2”
FEN – Enzima endonuclease flap1; do inglês “flap structure-specific endonuclease”
GGR- Reparo do genoma global, do inglês “global genome repair”
HPV - Papiloma Vírus Humano
HR – do inglês “hazard ratio”
HR – Reparo por recombinação; do inglês “homologous recombination’
HR23B – Proteina Rad23 homologa B; do inglês“RAD23 homolog B protein”
IC- Intervalo de confiança
MAPKAP – Proteína quinase mitogênica ativada pela quinase; do inglês “ mitogenactivated protein kinase-activated protein kinase”
MLH1 – do inglês “mut-L homologin 1 “
MMR - Reparo de mal pareamento; do inglês “mismatch repair”
mRNA- Ácido ribonucleico mensageiro; do inglês “messenger ribonucleic”
MSH2 – do inglês “mismatch repair protein 2”
MUS81 – do inglês “ MUS81 Structure-Specific Endonuclease Subunit”
NER - Reparo de excisão de nucleotídeo; do inglês “nucleotide excision repair”
NHEJ- Junção de pontas não homólogas; do inglês “non-homologous end joining”
OGG1 - 8-oxoG-DNA glicosilase
OR – do inglês odds ratio
pb- pares de base, do inglês “pair base”
PAR - do inglês, “protein accretion rate”
PARP – do inglês, “ poly- (ADP-ribose) polymerase”
PARP1- Polymerase 1; do inglês “poly ADP-ribose”
PCNA- do inglês, “proliferating cell nuclear antigen”
Polβ - do inglês “polymerase (DNA directed), beta”
RhoA - do inglês, “ras homolog family member A”
Rac- do inglês, “Ras-related protein Rac”
Rad S- do inglês, “DNA repair exonuclease RadS homolog”
Rad 1- do inglês, “DNA repair exonuclease Rad1 homolog”
Rad53- do inglês, “DNA repair exonuclease Rad53 homolog”
Rad15- do inglês, “DNA repair exonuclease Rad15 homolog”
Rad 16- do inglês, “DNA repair exonuclease Rad16 homolog”
RNA- Ácido ribonucleico; do inglês “ribonucleic acid”
RNA polII- RNA polimerase II
ROS- Espécies reativas de oxigênio do inglês, “reactive oxygen species”
RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase
TA - Temperatura ambiente
TCR- Reparo acoplado à transcrição
TDP1- do inglês “tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1”
TEM- Transição epitélio-mesenquimal
TFIIH – Fator de transcrição IIH; do inglês transcription factor II H
Tg – Timina glicol
TNM - Tamanho do tumor, envolvimento do linfonodo regional e envolvimento por
metástase à distância; do inglês tumor-node-metastasis
UV- ultra violeta
XP - do inglês “Xeroderma pigmentosum complementary”
XPA - do inglês - “Xeroderma pigmentosum complementation group A”
XPB- do inglês -“Xeroderma pigmentosum complementation group B”
XPC- do inglês “Xeroderma pigmentosum complementation group C”
XPD - do inglês “Xeroderma pigmentosum complementation group D”
XPF - do inglês “Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency,
complementation group F”
XPG - do inglês, “Xeroderma pigmentosum complementation group G”
XRCC1 - do inglês, “X-ray repair cross-complementing group 1”
yH2AX - do inglês, “ gama histon H2AX”
3’-AP liase – b-liase do inglês “3' AP-endonucleases ou AP-liases”
8-oxoGuo - 8-oxo-7,8-diidroguanosina
SUMÁRIO
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 276
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 29
2.1 CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL (CEO) ................................... 30
2.2 MECANISMOS DE REPARO DO DNA ........................................... 36
2.1.1 Proteínas do reparo do DNA por excisão de base ............... 39
2.1.2 Proteínas do reparo do DNA por excisão de nucleotídeo .. 41
3 PROPOSIÇÃO .............................................................................................. 48
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 49
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ........................................................... 50
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO.................................................. 50
4.3 POPULAÇÃO .................................................................................. 50
4.4 AMOSTRA ....................................................................................... 50
4.4.1 Critérios de inclusão ........................................................ 50
4.4.2 Critérios de exclusão ....................................................... 51
4.5 COLETA DE DADOS CLÍNICOS ..................................................... 51
4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO.............................................................. 51
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ................................................. 53
4.7.1 Técnica de coloração imuno-histoquímica .................... 53
4.7.2 Análise do perfil imuno-histoquímico ............................ 55
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................. 55
4.8.1 Análise de sobrevida ....................................................... 55
4.8.2 Análise de desfecho ........................................................ 56
5 RESULTADOS .............................................................................................. 58
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................... 58
5.2 RESULTADOS MORFOLÓGICOS .................................................. 60
5.4 ANÁLISE DE SOBREVIDA .............................................................. 65
5.5 ANÁLISE DE DESFECHO ............................................................... 73
6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 77
7 CONCLUSÕES ............................................................................................. 85
8 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 87
APÊNDICES .................................................................................................... 95
ANEXO .......................................................................................................... 103
26
INTRODUÇÃO
27
1 INTRODUÇÃO
Agentes carcinogênicos provocam agressões ao DNA que podem resultar
alterações celulares determinando ganhos e perdas de propriedades, resultando na
aquisição de fenótipo maligno. O câncer oral está entre as dez neoplasias malignas
de maior incidência na população mundial, onde 95% correspondem ao carcinoma
epidermoide oral (CEO). Apesar de todo o avanço no conhecimento científico e
desenvolvimento tecnológico, este câncer ainda apresenta elevadas taxas de
morbidade e mortalidade atribuídas, segundo Tseng et al. (2015), a fatores como
diagnóstico tardio, comprometimento linfonodal e altas taxas de recorrências.
No processo de carcinogênese, o genoma adquire alterações que promovem a
distúrbios de proliferação e de diferenciação celular (SIMARD; TORRE; JEMAL,
2014). O genoma humano codifica informações para proteger sua integridade, com
destaque para os genes de reparo dos danos ao DNA essenciais para manutenção
da integridade do genoma. Mutações nestes genes de reparo são responsáveis pela
formação de tumores e desenvolvimento doenças hereditárias caracterizadas por
alterações metabólicas complexas e pelo desenvolvimento de resistências das células
malignas a drogas (PRATESI et al., 2011). Apesar de existirem mecanismos atuantes
no reparo de danos do DNA, tem sido demonstrada variabilidade de expressão das
proteínas envolvidas
nesse
processo de
reparo,
o
que vem
suscitando
questionamentos a respeito de sua possível associação com o prognóstico tumoral.
Considerando a alta frequência do CEO na população mundial e os desfechos
distintos de lesões com estadiamentos clínicos e histopatológicos semelhantes,
pesquisas vêm buscando possíveis biomarcadores prognósticos para esta neoplasia,
com destaque para pesquisas sobre a expressão imuno-histoquímica de proteínas
envolvidas nos processos determinantes do controle do comportamento celular (AN
et al., 2007; ANG et al., 2011; DURR et al., 2013; FARNEBO et al., 2015).
Pesquisas na área da oncologia vêm relacionando a expressão imunohistoquímica variada das proteínas de reparo do DNA com riscos distintos ao
desenvolvimento do câncer e com respostas diferentes ao tratamento oncológico.
Entretanto, poucos estudos têm investigado essa variabilidade em lesões de CEO
28
localizados no mesmo sítio anatômico. Assim, este estudo tem como objetivo avaliar
a imunoexpressão das proteínas XRCC1, TFIIH e XPF em uma série de casos de
carcinoma epidermoide de língua oral e investigar possíveis associações com
parâmetros prognósticos.
29
REVISÃO DA LITERATURA
30
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL (CEO)
O câncer oral é um grupo de neoplasia categorizada em câncer de cabeça e
pescoço que possui incidência global de pouco mais de 640.000 casos/ano (SIEGEL
et al., 2014). No Brasil, estimou-se para os anos de 2014/2015, o surgimento de
15.290 novos casos de câncer na cavidade oral, sendo que destes, 11.140 ocorreriam
em homens e 4.350, em mulheres (INCA,2016).
O carcinoma epidermoide, também denominado carcinoma de células
escamosas ou carcinoma espinocelular, representa uma neoplasia maligna de origem
epitelial responsável por 90% dos cânceres orais. O CEO é mais comum em homens
na razão de 2:1 mulher, na quinta década de vida. No entanto, observa-se um
incremento da incidência desta neoplasia em pacientes jovens com menos de 40
anos, em pacientes idosos e em indivíduos do sexo feminino em alguns países. Fatos
que sinalizam para uma possível alteração no perfil dos pacientes acometidos pelo
CEO (HILLY et al., 2013; TROELTZSCH et al., 2014).
Procurando investigar a frequência do CEO em pacientes jovens, Mesquita et
al. (2014) realizaram uma revisão sistemática selecionando 17 artigos com total de
57.064 pacientes. A frequência de jovens (idade menor que 45 anos) em cada estudo
variou de 1% a 100%, sendo 5,03% a frequência total. Apesar desta tendência geral
nos estudos selecionados, a idade, o gênero e o sitio de acometimento também
exibiram variações, segundo as diferenças geográficas, sócio-econômicas e de etnia.
Estas diferenças foram justificadas por alterações genéticas e epigenéticas que
podem predispor à carcinogênese oral (KHAMMISSA et al.,2014, RYDRYCH et
al.,2014).
A localização anatômica do CEO é fator de influência no prognóstico,
considerando-se que os tumores apresentam comportamento clínico diferente
conforme sua localização. Os principais sítios de acometimento do CEO é a língua
oral (região de ventre lingual e 2/3 anteriores deste órgão) e o assoalho, sendo
mucosa jugal, área retromolar, gengiva, palato mole, outras áreas envolvidas. Os
sítios anatômicos de maior acometimento pelo CEO mudam de acordo com variações
31
geográficas, pois refletem os diferentes fatores a que uma determinada população
está exposta (SIMARD; TORRE; JEMAL,2014).
A língua oral tem sido o principal sítio de acometimento na Inglaterra, Estados
Unidos e Coreia, provavelmente pelo consumo de tabaco associado ao álcool
(GANLY; PATEL; SHAH, 2012; RIKARDSEN et al., 2014). Na Ásia, a mucosa jugal é
a localização mais comum, devido ao hábito de mascar betel (NIU et al., 2015). Em
países tropicais, a população é bastante exposta à radiação solar, levando à alta
incidência de carcinoma epidermoide em lábio inferior (SIMARD; TORRE; JEMAL,
2014, FERNÁNDEZ et al. 2015).
O CEO possui etiologia complexa e multifatorial, fatores extrínsecos e
intrínsecos interagem interferindo no surgimento e progressão desta condição
maligna. Os fatores extrínsecos incluem o consumo de tabaco, do álcool, a radiação
ultravioleta (restrito aos casos de carcinoma epidermoide em lábio, sobretudo o
inferior), dieta e fatores biológicos (SCULLY; BAGAN, 2009). Como fatores
intrínsecos, podem ser citados, o estado sistêmico, alterações hormonais, a
desnutrição e alterações genéticas cumulativas. A exposição crônica da mucosa oral
aos carcinógenos produz mutações genéticas e epigenéticas e a instabilidade no
genoma do ceratinócito oral, o que resulta em erros na replicação genética e no
processo de reparo do DNA, eventos que convergem para a progressão do ciclo
celular, desequilíbrio da apoptose e progressão das células neoplásicas (SPANO et
al.2012, INGLEHART; SCANLON; D’SILVA, 2014).
O hábito de fumar ou mascar tabaco é um dos principais fatores de risco para
o CEO. Os principais xenobióticos presentes no tabaco são as nitrosaminas
específicas do tabaco e os radicais livres que impedem a ação antioxidante das
enzimas glutationas peroxidase e desintegra os lipídios por peroxidação. Com a
diminuição de mecanismos antioxidantes na célula, o DNA é alvo de danos oxidativos
que provocam a formação de ligações covalentes em todo o genoma inclusive na
proteína de reparo p53 (STADLER et al., 2008).
Outro fator extrínseco importante é o álcool, que ao ser consumido, é
transformado em acetaldeído no fígado pela ação da enzima álcool desidrogenase
(ADH). Em situações de consumo excessivo de álcool não há aumento na oferta de
32
ADH suficiente para a metabolização do etanol, sendo este processo realizado por
uma via alternativa, através do citocromo p450, tendo como produto final espécies
reativas de oxigênio (ROS), moléculas desencadeadoras de danos celulares
importantes. O etanol e o acetaldeido exercem, também, efeito de solvente no epitélio
da mucosa oral o que pode facilitar a permeabilidade de outros carcinógenos nas
membranas celulares, fato que justifica o efeito carcinogênico sinérgico do etilismo e
tabagismo no CEO (ZYGOGIANNI et al., 2011).
Os vírus oncogênicos podem desempenhar um papel principal em uma grande
variedade de câncer em mucosas da região de cabeça e pescoço. A carcinogênese
viral está relacionada com a morfologia distinta do epitélio de revestimento das
mucosas. Desta forma, infecção pelo vírus Epstein-Barr está associada ao surgimento
de câncer em região de nasofaringe, enquanto infecções pelo Papiloma Vírus Humano
(HPV), especialmente o subtipo 16, relaciona-se com o surgimento de câncer em
região de orofaringe. Devido à elevada incidência de CEO em jovens não etilistas e
não tabagistas, nos últimos anos, estudos buscam investigar a presença de infecções
por HPV nesta população e os relatórios são unânimes em afirmar que não há
suficientes evidências para incluir a infecção por HPV como fator causal da
carcinogênese do CEO (ZHANG; SANT’ANA FILHO; NÖR, 2012, WITTEKINDT et al.,
2012, BUSSU et al.,2013, DENG et al.,2014, TROELTZSCH et al.,2014, WOODS et
al.,2014).
O estado nutricional do paciente e sua dieta interferem no delicado equilíbrio
de metabolização e eliminação de carcinógenos. Dietas ricas em vegetais e frutas
oferecem ao indivíduo uma série de substâncias antioxidantes como carotenos,
flavonoides, ferro, vitamina A, C, e E, além do folato, que previnem os eventos de
estresse oxidativo celular (SCULLY; BAGAN, 2009).
O desenvolvimento do câncer depende não somente de alterações genéticas
ou epigenéticas em células neoplásicas. O tumor é formado por células ancoradas no
estroma em que se originam, onde existem células de defesa que buscam eliminar o
clone anômalo. As células neoplásicas interagem com as suas congêneres, matriz
extracelular, células do estroma (fibroblastos e mastócitos) e com células de defesa.
Nesta interação as células neoplásicas desenvolvem mecanismos diversos: perda de
expressão de antígenos tumorais e de moléculas coestimuladoras bem como o
33
mascaramento antigênico, secreção de produtos imunossupressores, que permitem
que células neoplásicas se evadam da resposta imunológica à medida que avança a
progressão tumoral. Portanto, os carcinógenos induzem alterações no estroma bem
como na resposta do sistema imunológico do hospedeiro (BRASILEIRO, 2011,
INGLEHART; SCANLON; D’SILVA, 2014).
A manifestação clínica do CEO é bastante variável, podendo apresentar-se
como lesões exofíticas, endofiticas, ulceradas, endurecidas, exibindo sangramento,
associada a linfadenopatias palpáveis, sintomatologia dolorosa com relato de
dificuldade de mastigação, deglutição e fala. No entanto, lesões iniciais podem exibir
aparência clínica exofítica vegetante, papilar, verruciforme, leucoplásica, eritroplásica
e eritroleucoplásica que, normalmente, não possuem sintomatologia dolorosa
associada. Para auxiliar a classificação e o estadiamento do câncer, o Comitê
Americano de Câncer desenvolveu o sistema de estadiamento TNM que é baseado
no tamanho do tumor primário (T); quantificação de metástase linfonodais de acordo
com o tamanho, número e distribuição (N); e a presença de metástase distantes (M).
O sistema TNM é um parâmetro de avaliação clínica que auxilia a escolha do
tratamento e prediz com boa segurança o prognóstico do paciente. Entretanto, possui
a limitação de não fornecer informações biológicas referentes aos componentes
celulares malignos (KREPPEL et al., 2011).
Morfologicamente, o CEO exibe proliferação de células escamosas em
diferentes graus de diferenciação, dispostas em lençol, ilhas, finos cordões e células
dispersas de permeio a estroma de tecido conjuntivo fibroso que exibe de fraco a
intenso infiltrado inflamatório. Quando bem diferenciado, as células malignas exibem
grandes agregados celulares, disceratose e formação de pérolas de ceratina. Em
lesões moderadamente e mal diferenciadas, destaca-se o arranjo frouxo das células
onde há perda do fenótipo epitelial e aquisição de fenótipo mesenquimal. Frente à
exuberante heterogeneidade nos padrões morfológicos do CEO, alguns sistemas de
gradação foram propostos na busca de identificar aspectos morfológicos preditivos do
prognóstico desta neoplasia (BRODERS, 1941, BRYNE, 1991, BRANDWEINGENSLER et al., 2005, ALMANGUSH, et al., 2015).
No sistema de gradação proposto por Broders et al. (1941), as lesões eram
classificadas conforme o estágio de diferenciação e sua semelhança com o epitélio
34
escamoso estratificado em bem, moderado e pobremente diferenciado. Avaliação
restrita às células tumorais e dificuldade na obtenção de consenso na classificação
das lesões que apresentam populações celulares heterogêneas foram algumas
deficiências deste sistema. Anneroth, Batsakis e Luna (1987) em seu modelo de
gradação estabeleceram os seguintes critérios: grau de ceratinização, pleomorfismo
nuclear, número de mitoses, estágio de invasão, padrão de invasão e infiltrado
inflamatório.
Bryne et al. (1991) sugeriram que a relação entre tumor e hospedeiro ocorre
dentro do chamado front de invasão tumoral e que as células desta localização exibem
alterações semelhantes às células metastáticas. Neste sistema, os parâmetros
analisados são os morfológicos relativos à população celular do tumor (grau de
ceratinização e pleomorfismo celular) e da relação tumor-hospedeiro (padrão de
invasão e infiltrado inflamatório).
Outra gradação que merece destaque é a proposta por Brandwein-Gensler et
al. (2005) que orienta que a análise deve ser realizada em toda a extensão do front
invasivo e o pior padrão de invasão deve ser o considerado. O grande avanço deste
sistema é a forma de avaliação criteriosa do padrão de invasão, infiltrado inflamatório
e invasão perineural, além do acréscimo do padrão de invasão tipo 5, que corresponde
à presença de células ou ninhos tumorais com pelo menos 1mm de tecido sadio
interposto entre estas e o front de invasão.
Almangush et al. (2015) avaliaram seis parâmetros histopatológicos em CEO:
o grau de diferenciação tumoral, pior padrão de invasão, resposta linfocitária do
hospedeiro, invasão perineural, presença de tumor de brotamento (tumor budding) e
a profundidade de invasão. Buds são pequenos aglomerados de células neoplásicas
(ninhos de até cinco células) indiferenciadas na margem invasiva do tumor sendo
sugerido como um sinal da presença da transição epitélio-mesenquimal nas células
neoplásicas de carcinoma colorretal, de mama e de língua. A análise dos autores
verificou que profundidade de invasão maior que quatro milímetros e a presença de
mais de cinco buds são critérios de simples aplicação e que fornecem um modelo
preditivo recorrência loco-regional que auxiliaria no planejamento de protocolos de
atendimento individualizado para o carcinoma epidermoide de língua oral (CELO).
35
A presença de padrões morfológicos heterogêneos é um fato que dificulta a
padronização de parâmetros que possam ser universalmente utilizados como
indicadores prognósticos para CEO. Estudos de validação de distintos sistemas de
gradação histopatológica em CELO, com variados estágios TNM, buscam superar as
limitações que um único modelo de gradação possa apresentar (KESKI-SÄNTTI et al.,
2007, BASTID,2012, ALMANGUSH et al., 2015, KOLOKYTHAS et al., 2015, SINHA
et al.,2015).
A ressecção cirúrgica com esvaziamento ganglionar é a terapêutica principal
do CEO. No entanto, em algumas situações clínicas como estágio avançado da lesão
e em pacientes que possuem condições clínicas inapropriadas para o procedimento
cirúrgico, é indicada a radioterapia e/ou quimioterapia prévia. Durante a ressecção
cirúrgica é necessária a análise morfológica transoperatória da margem cirúrgica livre
de lesão que deve ser de pelo menos 5mm de tecido sadio e quando da
impossibilidade de aplicação desta orientação, deve-se estabelecer tratamento
adjuvante aos pacientes como radioterapia associada ou não à quimioterapia
(ANDERSON; SISSONK; MONCRIEFF, 2015).
O prognóstico de pacientes portadores de tumores de cabeça e pescoço está
significativamente relacionado com a presença de linfonodo cervical metastático. A
condição linfática parece ser o maior determinante da evolução clínica do paciente
(PREUSS et al., 2007, THIAGARAJAN et al., 2014). No estudo de meta analise
realizado por Thompson et al. (2013), observou-se a presença de metástase linfonodal
oculta em 31% dos pacientes o que influencia significativamente o tratamento e o
prognóstico do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço.
Apesar da facilidade do diagnóstico precoce do CEO, dois terços dos
diagnósticos desta neoplasia ocorrem em estágios avançados. O estágio avançado
do tumor é o principal fator que interfere negativamente no prognóstico do CEO, por
necessitar de tratamentos agressivos, mutiladores e geralmente estar associado à
metástase cervical (GÜNERI; EPSTEIN, 2014).
O desenvolvimento de metástase envolve eventos moleculares que são
ativados em cascata durante a tumorigênese, promovendo a disseminação das
células neoplásicas do sitio primário para estruturas anatômicas distantes e
36
subsequente proliferação em um segundo sitio anatômico. Esta cascata se caracteriza
pelos seguintes eventos: desenvolvimento de novos vasos sanguíneos, mecanismos
tumorais de evasão do sistema imune, invasão e migração através da membrana
basal e da matriz extracelular, adesão das células neoplásicas no endotélio capilar e
crescimento tumoral em sitio secundário. Processos de remodelação das adesões
célula a célula e célula matriz são necessários para que a célula epitelial neoplásica
obtenha capacidade migratória. A migração pode ocorrer de forma unitária (singlecell) ou de forma coletiva. Essas estratégias migratórias envolvem diferenças na
atividade de proteases extracelulares, adesão celular mediada por integrinas e
caderinas e rearranjo do citoesqueleto. Adicionalmente, há a participação do estroma
tumoral que através da interação com outras células desenvolve o microambiente
favorável à progressão tumoral. (INGLEHART; SCANLON; D’SILVA, 2014, WANG et
al., 2014).
A migração unitária da célula neoplásica ocorre por meio de duas diferentes
estratégias: fibroblastoide e padrão ameboide. Na maioria dos casos, as células
individuais saem da periferia do tumor, desenvolvem mecanismos de perda da
polaridade epitelial e desenvolvimento da mesenquimal, processo denominado
transição epitélio-mesenquimal (TEM). Este processo é, atualmente, um importante
alvo de pesquisa para o entendimento maior do desenvolvimento de metástase. As
características principais da TEM é o rompimento da adesão célula a célula, aquisição
da morfologia fibroblastoide, alta capacidade de interação com estroma e elevadas
taxas de proliferação (BASTID, 2012, ATTRAMADAL, et al., 2015, MARKWELL;
WEED,2015).
2.2 MECANISMOS DE REPARO DO DNA
Evolutivamente, foram selecionadas várias estratégias para tolerar ou reparar
danos causados no material genético celular. Existem cinco mecanismos principais
envolvidos no reparo do DNA: reparo por excisão de base (BER –“base excision
repair”), reparo por excisão de nucleotídeo (NER– “nucleotide excision repair”), reparo
por mal pareamento (MMR- “mismatch repair”), reparo por quebra de dupla fita
(recombinação homóloga e junção terminal não homóloga) e reparo direto (exclusivo
de organismos procariotos e eucariotos não placentários). Cada via utiliza uma série
37
de genes e proteínas específicas para detecção e remoção do dano com posterior
reconstrução da dupla hélice (RICCERI; MATULLO; VINEIS, 2012).
As bases oxidadas do DNA são primeiramente corrigidas pelo mecanismo de
reparo por excisão de bases, conhecido por atuar, principalmente, em modificações
causadas por agentes endógenos. O mecanismo molecular do BER inicia-se pelo
reconhecimento e excisão de bases danificadas pelas DNA-glicosilases com ou sem
atividade 3’-AP liase associada. A excisão da base resulta em um sítio abásico (APapurínico ou apirimidínico) com ou sem incisão 3’, que é reconhecido por outro grupo
de enzimas, as AP-endonucleases, que fazem a incisão na extremidade 3’ ou 5’ do
sítio AP, gerando uma lacuna que é preenchida através de polimerização e ligação de
novos nucleotídeos à sequência de DNA (BERRA;MENCK; DI MASCIO, 2006).
O NER é um dos processos de reparo que atua principalmente em danos
provocados por agentes exógenos que causam distorção da dupla-hélice do DNA,
como aqueles causados por luz UV. O processo do NER nas células humanas envolve
a ação de mais de 30 proteínas que atuam em 5 passos sucessivos: reconhecimento
da lesão; abertura da dupla hélice de DNA onde está localizada a lesão; dupla incisão
distante a alguns nucleotídeos dos lados 5’ e 3’ do sítio da lesão; síntese do novo
DNA utilizando como molde a fita não danificada e ligação da porção 5’ da nova fita
sintetizada à cadeia pré-existente. O NER possui atividade heterogênea em regiões
distintas do genoma e prossegue mais rapidamente e com maior fidelidade na fita
transcrita de um gene ativo que na fita ou em um gene não transcrito. Esse processo,
dependente da ação da RNA polimerase II (RNApolII), denomina-se reparo acoplado
à transcrição (TCR), que assegura um rápido reparo dos genes ativos em contraponto
com o reparo do genoma global (GGR), iniciado por um complexo de reconhecimento
diferente (CHEADLE; SAMPSON; MUTYH, 2007).
O MMR corrige pares errôneos de bases e alças desemparelhadas no DNA,
eventualmente introduzidos por erros de replicação, ou lesões que interfiram com a
atividade replicativa das DNA-polimerases. O MMR é a principal via de reparo da
instabilidade de microssatélite. Alterações nesta via, principalmente polimorfismos nos
genes MSH2 e MLH1, são observadas em portadores da Síndrome do Câncer
Colorretal Hereditário, de Tumor de Wilms e em pacientes jovens com CEO. (DINIZ et
al., 2013, KOSTRZEWSKA-POCZEKAJ et al., 2013).
38
A instabilidade de microssatélites do genoma é encontrada entre 7 a 100% nos
pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço, sendo mais prevalente nos pacientes
jovens, com idade menor que 45 anos. Estudos apontam que a manutenção desta
via de reparo MMR através da forte imunoexpressão das proteínas MSH2 e MLH1
está relacionada ao melhor prognóstico do CEO (THEOCHARIS et al, 2011, PEREIRA
et al, 2013).
Outro mecanismo importante na proteção da molécula de DNA é o reparo por
recombinação, capaz de reparar a quebra da dupla cadeia de DNA, dano criado por
vários processos normais da célula ou por agentes exógenos, como irradiação
ionizante. Existem dois caminhos envolvidos no reparo por recombinação:
recombinação homóloga (HR – “homologous recombination”), que assegura um
reparo bastante preciso; e junção de pontas não homólogas (NHEJ – “nonhomologous end joining”), sujeito a erro (ALBERTS et al, 2010)
Pesquisadores vêm propondo a existência de interação entre os diferentes
mecanismos de reparo de DNA. Por exemplo, embora TCR tenha sido inicialmente
descrito como sendo responsável pela remoção de lesões induzidas por luz UV, é hoje
reconhecido por ser um fenômeno mais geral que opera em outros tipos de lesões no
DNA. Entre estas, podemos citar as lesões oxidativas geradas por irradiação ionizante
ou induzidas por ROS como timina glicol (Tg) e 8-oxo-7,8-diidroguanosina (8oxoGuo)10. Outro exemplo pode ser a interação entre NER e MMR, onde MSH2 foi
descrita por interagir fisicamente com alguns componentes do NER. Estes eventos
sugerem que os mecanismos de reparo de DNA, apesar de possuir especificidade por
determinados danos, trabalham de uma forma bastante integrada (BERRA ;MENCK;
DI MASCIO, 2006).
A instabilidade genômica compõe um dos eventos principais da carcinogênese
e progressão tumoral. O reconhecimento dos mecanismos que preservam a
integridade do DNA auxilia na predição, no prognóstico e na terapia personalizada em
oncologia, uma vez que o aparecimento de resistência ao tratamento, invasão e
metástase são processos relacionados com mutações específicas em diversas
neoplasias. No CEO, as lesões cromossômicas mais comuns são influenciadas pelo
acúmulo de danos e defeitos no sistema de reparo do DNA (JENKINS et al., 2013).
39
2.1.1 Proteínas do reparo do DNA por excisão de base
O mecanismo do BER inicia-se na atividade de uma enzima DNA-glicosilase
lesão específica e completa-se seguindo por um dos dois sub-caminhos: um curto
(‘short-patch’ BER) o mais frequente, no qual apenas um nucleotídeo é substituído,
ou um longo (‘long-patch’ BER), onde de 2 a 13 nucleotídeos são substituídos. Falhas
no BER têm sido associadas a mutações em alguns genes desta via como o ‘X-ray
repair cross-complementing group 1’ (XRCC1), ‘apurinic/apyrimidinic endonuclease 1’
(APEX1), 8-oxoG-DNA glicosilase (OGG1) e Poly (ADP-Ribose) Polymerase 1
(PARP1), as quais possuem fundamental importância na via BER. Estudos no campo
da genética verificaram que esses genes possuem polimorfismos com potencial para
modular a função e alterar a capacidade do reparo (CHEADLE; SAMPSON; MUTYH,
2007).
A XRCC1 é uma proteína que possui 633 aminoácidos e peso de 70kDa e
está envolvida no BER, participando como uma proteína multidomínio que serve como
âncora nesse mecanismo, interagindo com a maioria das enzimas envolvidas nesse
processo. A XRCC1 não possui atividade catalítica por si própria, mas possui ação
moduladora de diferentes etapas do BER e na quebra de fita simples do DNA
(CHRISTMANN, 2003).
A interação e formação de um complexo com as proteínas DNA polimerase β,
DNA ligase III e poly (ADP-ribose) polimerase ocorrem através das regiões N-terminal,
C-terminal com a polinucleotídeo quinase humana, trazendo o complexo próximo ao
sítio de dano do DNA (Figura 1). Dessa forma, a XRCC1 fornece uma ligação física
nas etapas de incisão e ligação do BER (GINSBERG et al., 2011, JAREMKO et al.,
2007).
As bases danificadas removidas durante a BER são removidas pela DNA
glicosilase, a qual recruta a Pol β para o local para inserir de um a vários nucleotídeos,
podendo seguir dois caminhos: o curto (dano indireto) e longo (dano direto).
Posteriormente, a XRCC1 é recrutada para o local depois da incisão inicial e serve
para estabilizar a estrutura intermediária do DNA, como os sítios sem bases, para que
outras enzimas de reparo possam atuar, inserindo os novos nucleotídeos. Naqueles
casos em que o dano foi provocado por agentes endógenos diretos, como a oxidação
40
ou alquilação, a BER segue a via longa, pois a Pol β não pode remover a porção
terminal 5’-dRP porque ela está oxidada ou reduzida, sendo necessário recrutamento
de outras proteínas como a PARP, PCNA e FEN, Figura 1 (GINSBERG et al., 2011).
Figura 1 - Esquema da via de reparo de DNA por excisão de base (CHRISTMANN et
al., 2003)
Mahjabeen et al. (2014), quantificaram mRNA de XRCC1 e avaliaram
imunoexpressão desta proteínas em pacientes com carcinoma epidermoide de
cabeça e pescoço. A análise da expressão de mRNA identificou 64% casos com baixa
regulação, 30% alta e 6% não foi identificado alteração. A análise da imunorreação
identificou 48% casos com fraca, 32% moderada e 20% forte ao investigar a diferença
da expressão segundo parâmetros de desfecho os autores não
observaram
diferenças. Entretanto, identificaram que tumores mal diferenciados exibiram menor
expressão em relação aqueles bem diferenciados.
A relação entre a ocorrência de tolerância e resistência a quimioterápicos e a
elevada expressão da proteína XRRC1, bem como seu mRNA correspondente, tem
41
sido relatada em estudos clínicos retrospectivos com pacientes acometidos por
diversos tipos de cânceres: gástrico, colorretal, ovariano, esofaringe e fígado. Os
resultados suportam a hipótese de que a elevada da expressão tumoral de XRCC1
pode ser um fator preditivo de menor resposta clínica ao tratamento quimioterápico
possuindo , principalmente em terapias que utilizam a cisplatina. (OLAUSSEN et al.,
2006; JENKINS et al., 2013).
O mecanismo de ação da cisplatina está relacionado à formação de adutos
na fita do DNA, o que impede a replicação e transcrição da fita. Células que possuem
o sistema de reparo eficiente são propícias a apresentarem resistência à terapia com
cisplatina. A remoção do complexo cisplatina DNA é realizada por diversas proteínas
de reparo do DNA, com destaque a XRCC1 (LANGER et al., 2012).
2.1.2 Proteínas do reparo do DNA por excisão de nucleotídeo
A via de reparo de DNA por NER inclui mais de 35 genes e possui a função
de remover danos induzidos, principalmente, por raios ultravioleta (dímeros de
pirimidina) e adutos de DNA associados com exposição a agentes químicos (WOGAN
et al., 2004).
NER é um dos principais meios pelo qual as células de mamíferos removem
as lesões de DNA causadas por agentes endógenos e exógenos. A via NER repara
lesões volumosas, como dímeros de pirimidina, outros fotoprodutos ultravioletas,
adutos químicos volumosos e “cross-links”. No processo de reparo, os produtos de
mais de uma dúzia de genes estão envolvidos nesta via, que envolve pelo menos
quatro etapas: (a) o reconhecimento do dano por um complexo de proteínas ligadas,
incluindo XPC, (b) estabilização do DNA pelo complexo TFIIH que inclui XPD; (c)
remoção do fragmento danificado “single-stranded” (geralmente cerca de 27-30 pb)
por moléculas incluindo ERCC1 e complexo XPF e (d) ligação para restaurar a
estrutura de DNA normal. Proteínas envolvidas nestes quatro passos foram
identificadas por meio de estudos de reparo ao DNA em indivíduos com xeroderma
pigmentoso (XP) (HAKEM, 2008).
Neste processo, o reconhecimento do dano é executado pelo complexo XPC
formado pelas proteínas XPC, HR23B e Centrina-2, que se liga à fita de DNA não
lesionada (NOUSPIKEL, 2009). O complexo TFIIH (transcription factor II H), que é um
42
heterodímero com duas helicases diferentes – XPD (atividade 5’- 3’) e XPB (atividade
3’- 5’) ligadas à um complexo quinase ciclina-ativada (cyclin-activated kinase), é
recrutado e separa a dupla fita de DNA envolvendo a mutação (JENSEN et al., 2011).
Posteriormente, um complexo XPA se liga à fita de DNA lesionada, sendo seguido
pela chegada de um complexo de incisão que consiste das endonucleases XPG e
XPF (NOUSPIKEL, 2009). Este evento causa a excisão de 25 a 30 nucleotídeos,
incluindo o DNA lesionado. Logo depois, a DNA-polimerase δ ou a ε sintetiza
novamente a fita de DNA. Ocasionalmente, a enzima DNA-ligase III une as
extremidades formadas pela remoção dos nucleotídeos (CHRISTMANN et al., 2003;
JENSEN et al., 2011) (Figura 2).
Figura 2 - Esquema da via de reparo de DNA por excisão de nucleotídeo
(CHRISTMANN et al., 2003)
43
A via de reconhecimento que envolve o complexo XPC é denominada reparo
de genoma global, “global genome repair”, e corrige falhas em todo o genoma. O
reconhecimento do dano pelo reparo de transcrição unida, “transcription-coupled
repair”, que repara genes ativamente transcritos, envolve o retardamento da RNApolimerase, seguido pelo recrutamento de moléculas sinalizantes, como as proteínas
CSA “cockayne syndrome group A” ou CSB “cockayne syndrome group B” (JENSEN
et al., 2011).
O XPD (“Xeroderma pigmentosum complementation group D”), complexo
TFIIH 80, também conhecido como ERCC2 “excision repair cross-complementing
rodent repair deficiency, complementation group 2” é um tipo de gene de reparo de
DNA por excisão de nucleotídeos. Esta via é uma das mais importantes na remoção
de danos no DNA causados por carcinógenos do tabaco, bem como de distorções na
dupla hélice que podem interferir no pareamento das bases obstruindo a replicação e
a transcrição, além de reparar danos causados por drogas alquilantes, análogos da
platina e radiação (AN et al., 2007).
Ye et al. (2012), identificaram o envolvimento da proteína XPD (complexo
TFIIH 80) em displasia e carcinomas de células escamosas de colo uterino, através
da quantificação do mRNA por RT-PCR e imunoexpressão em tecido parafinado. Os
casos de carcinoma de células escamosas apresentaram maiores níveis de XPD. Os
autores justificam que mudanças no padrão de transcrição de XPD resultam em níveis
elevados do mRNA e acúmulo de proteínas que não são capazes de realizar
corretamente o processo de reparo do DNA. Os autores acrescentam que são
necessárias mais pesquisas que possam esclarecer os mecanismos específicos
envolvidos no acúmulo de mRNA e proteína XPD na carcinogênese de células
escamosas.
Dentre os genes envolvidos no reparo do DNA na via NER, também se
menciona o gene ERCC4 ou XPF, que foi inicialmente identificado a partir de
indivíduos com xeroderma pigmentoso do grupo F (XPF). Esse gene possui uma
sequência de 2751 pb de comprimento, é composto por 11 éxons e codifica uma
proteína chave de mesmo nome (ERCC4 ou XPF) que forma um complexo estável
com a proteína ERCC1 e realiza uma incisão na terminação 5’ da lesão reconhecida
do DNA, enquanto que a proteína XPG realiza uma incisão na terminação 3’ da lesão.
44
A família XPF de genes é evolutivamente conservada. Existe uma extensa homologia
entre XPF humanos, Drosophila Mei-9, Saccharomyces cerevisiae Rad1 e S. pombe
Rad16, todos possuindo funções semelhantes no NER (FAN et al., 1999).
Jagdis et al. (2013) verificaram em seus estudos que a imunoexpressão
nuclear de XPF apresentou níveis baixos nos casos de carcinoma nasofaringe não
metastático; entretanto, não foi possível Identificar relação da imunomarcação desta
proteína de reparo com o tempo de desenvolvimento de recorrência locorregional,
com o tempo de sobrevida livre de doença e com o tempo de sobrevida global.
A compreensão do mecanismo de resistência a drogas na terapia do câncer
é necessária para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, e
pesquisadores têm correlacionado a regulação aumentada de vários genes de reparo
do DNA com resistência às drogas. A relação do XPF com resistência a drogas pode
ser deduzida a partir de estudos sobre seu parceiro ERCC1, MUS81 e o TDP1 (LIU
et al., 2007, KOBERLE et al., 2010).
Xuelei et al. (2015) realizaram um estudo de meta-análise com o objetivo de
investigar a hipótese que a superexpressão de ERCC1 pode interferir na resposta
clínica de regimes de quimioterapia e radioterapia no tratamento do carcinoma
epidermoide em região de cabeça e pescoço. Os pesquisadores reuniram 193 estudos
com total de 1263 pacientes, identificando o efeito da expressão do ERCC1 na
sobrevida de pacientes com carcinoma epidermoide da raça asiática, não sendo um
fator preditivo aos pacientes não asiáticos. A análise da relação entre expressão do
ERRC1 e a resposta ao tratamento, só foi possível demonstrar que a baixa expressão
do ERCC1 é um fator preditivo positivo à sobrevida dos pacientes asiáticos. Devido
ao escasso número de estudos com populações não asiáticas, a presente metaanálise não pode identificar esta relação nestas populações. Os autores destacam,
ainda, que devem ser investigada a relação entre as proteínas de vias de reparo do
DNA distintas, a citar ERCC1 e XPF, pois são vias que convergem ao mesmo tipo de
resposta, o reparo do dano do DNA e interferência no mecanismo de ação de
fármacos que promovem o dano ao DNA.
Tem sido demonstrado que um risco aumentado ao carcinoma epidermoide
de cabeça e pescoço está associado com redução da capacidade de reparo do DNA.
45
Na pesquisa de Wei et al. (2005), foi verificado que os casos de carcinomas
epidermoides de cabeça e pescoço apresentavam níveis mais baixos de expressão
para todas as proteínas NER, particularmente XPC e XPF, com redução em cerca de
25%. Além disso, houve associação da baixa expressão XPF com um maior risco para
o desenvolvimento desta neoplasia (OR, 11,5; IC 95%, 2,01-56,6).
Estudos têm relatado que a via NER pode estar associada à resistência de
células tumorais à cisplatina na terapia do câncer. Tumores testiculares de células
germinativas têm mostrado menor sensibilidade à cisplatina, e isso tem sido
correlacionado a baixos níveis do complexo de proteína NER, ERCC1/XPF (WELSH
et al., 2004).
Pouco se sabe sobre os níveis de ERCC1-XPF em tecidos e em linhagens de
células de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Koberle et al. (2010)
investigaram mRNA e níveis da proteína ERCC1 e XPF em linhagens de células de
carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço e linhagens de células tumorais de
testículos e examinou a correlação entre níveis de ERCC1 e XPF e a resistência
celular à cisplatina. Esse estudo não revelou diferença significativa na expressão de
mRNA do ERCC1 ou XPF nas linhagens analisadas. No entanto, os resultados
indicaram
uma
contribuição
da
proteína
XPF
na
resistência
à
cisplatina.Posteriormente, a expressão da proteína XPF e ERCC1 foi investigada em
tecido de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço e foram encontrados níveis
significativamente maiores de XPF em pacientes com metástases. Estes resultados
indicam uma contribuição da proteína XPF à quimiorresistência à cisplatina, além de
sugerir que carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço com metástases possuem
menor capacidade de resposta à cisplatina.
Buscando a relação da imunoexpressão de proteinas de reparo do DNA (XPF,
ERCC1, FANCD2, PAR, ƴH2AX, MLH1 e MAPKAP) com o tipo de resposta ao
tratamento quimioterápico, Seiwert et al. (2014) selecionaram
pacientes com
carcinoma de cabeça e pescoço com estágio TNM IV. Ao final dos ciclos de quimio e
radioterapia os pacientes que apresentaram elevada imunoexpressão de
exibiram as piores evoluções clinicas
XPF
segundo os critérios de RECIST (29,7%
resposta completa, 51,4% resposta parcial, 18,9% doença estável) em comparação
com os pacientes que apresentaram menor imunoexpressão de XPF. Entretanto,
46
estes pesquisadores verificaram não existir associação da imunoexpressão de XPF e
a sobrevida global de paciente com carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço.
Adicionalmente, os autores afirmam que a heterogeneidade dos cânceres da região
de cabeça e pescoço sugere que a ação antineoplásica da terapêutica será diferente
conforme o sitio anatômico, uma vez que existem distintos mecanismos de reparo do
DNA envolvidos em cada região anatômica.
47
PROPOSIÇÃO
48
3 PROPOSIÇÃO
A proposição deste experimento foi analisar a imunoexpressão das proteínas
dos genes de reparo do DNA XRCC1, TFIIH e XPF em carcinoma epidermoide de
língua oral, investigando possíveis associações com os seguintes parâmetros
prognósticos: estadiamento clínico, grau histopatológico de malignidade, presença de
metástase linfonodal e sobrevida de 05 anos. Com esta pesquisa, pretende-se
contribuir com o maior entendimento a respeito do papel destas proteínas no
desenvolvimento do CELO.
.
49
MATERIAL E MÉTODOS
50
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A presente pesquisa é parte integrante da pesquisa intitulada “Correlações
clinicopatológicas, imuno-histoquimicas e de resposta ao tratamento quimioterápico e
radioterápico com polimorfismo em genes de reparo do DNA em pacientes com
Carcinoma de Células Escamosa de Cabeça e Pescoço”, que foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Dr. Luiz Antônio da Liga Norte Riograndense
Contra o Câncer CAAE:22714.1.0000.5293, Parecer: 838.556 (Anexo A). Os
pacientes incluídos no estudo foram devidamente esclarecidos quanto aos objetivos
da pesquisa e, quando concordarem em participar, foram convidados a assinar o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O presente trabalho é um estudo longitudinal retrospectivo com análise de
características clínico-histopatológicas e a imunoexpressão das proteínas dos genes
de reparo do DNA (XRCC1, TFIIH e XPF) em casos de carcinoma epidermoide de
língua oral (CELO).
4.3 POPULAÇÃO
A população deste estudo é representada pelos pacientes com CELO
atendidos na Liga Norte Riograndense Contra o Câncer nos anos de 2001 a 2010.
4.4 AMOSTRA
A amostra deste estudo foi por conveniência, constituída por todos os casos
selecionados segundo os seguintes critérios de inclusão e exclusão.
4.4.1 Critérios de inclusão
Foram incluídos na amostra, apenas os casos de CELO tratados por ressecção
cirúrgica do tumor primário, que apresentaram quantidade suficiente de tecido
neoplásico no bloco de parafina, possibilitando a avaliação histológica do front de
51
invasão tumoral e cujos prontuários dos pacientes contenham informações relativas à
presença ou ausência de metástase linfonodal com comprovação histopatológica.
4.4.2 Critérios de exclusão
 Foram excluídos da amostra lesões de recorrência ou de doença residual
 Para análise de desfecho os casos que não possuíam data do óbito ou
informação clínica de cinco anos após o diagnóstico foram excluídos.
4.5 COLETA DE DADOS CLÍNICOS
Através do preenchimento da ficha de coleta (Apêndice B) foi realizado o
levantamento das variáveis clínicas: gênero, idade, presença de metástase linfonodal
(ou TNM quando possível), tipo de tratamento e estado atual da doença. Quando
constante nos prontuários, foram anotadas as seguintes datas: primeira recidiva locoregional, metástase linfonodal, presença de novo tumor primário, metástase à
distância, óbito e último seguimento.
O cálculo do tempo de sobrevida global foi obtido da seguinte forma:

Tempo de sobrevida global = data do último seguimento ou do óbito –
data do início do tratamento;
4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO
Para o estudo morfológico os cortes histológicos de 5µm de espessura de
CELO, corados pela técnica de rotina da hematoxilina e eosina (H.E.) foram
escaneados com auxílio do equipamento Scanner Panoramic MIDI (3DHISTECH Kft.
29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121). As imagens foram
analisadas através do programa de visualização Panoramic Viewer 1.15.2
(3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121) em
diferentes amplitudes.
Todos os casos foram analisados utilizando-se dois métodos distintos de
gradação histopatológica: um proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) (Quadro
1) e outro, por Almangush et al. (2015) (Quadro 2). Esta análise foi realizada por dois
patologistas previamente treinados, sempre no front de invasão tumoral em momentos
52
distintos e sem acesso a informações clínicas do caso que estava sendo avaliado. Os
casos que apresentaram classificação discordantes foram reavaliados até obter
consenso no valor do parâmetro.
Quadro1- Sistema de gradação de malignidade recomendado por Brandwein-Gensler
et al. (2005)
Parâmetro
Valor
Escore 0
Escore 1
Escore 3
Nenhuma
Nervos com menos
de 1mm de diâmetro
Contínuo
Grandes agregados
Grandes nervos,
diâmetro maior igual
a 1mm
Pouco ou nenhum
Padrão 1,2 ou 3
Padrão 4
Padrão 5
Invasão perineural
Infiltrado linfocítico
Pior Padrão de Invasão
No sistema de gradação proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) (Quadro
1), o padrão de invasão 1 consiste em lesões com bordas infiltrativas bem delimitadas,
padrão 2 quando as células tumorais se organizam em cordões, bandas e/ou
trabéculas sólidas infiltrativas, padrão 3 em pequenos grupos ou cordões celulares
infiltrativos com mais de 15 células, padrão 4 em dissociação celular disseminada e
pronunciada, em pequenos grupos e/ou individual com menos de 15 células e padrão
5 em infiltração tumoral vastamente dispersa, com pelo menos 1mm de tecido sadio
interposto entre as ilhas satélites e o front de invasão. Foi considerado para
pontuação, o pior padrão de invasão encontrado no espécime. A análise de cada
parâmetro resultou em um escore que somados resultam em um valor total com a
seguinte classificação: 0 (lesões de baixo risco), 1 ou 2 (lesões de risco intermediário)
e 3 a 9 (lesões de alto risco).
A segunda análise morfológica realizada foi seguindo o modelo de gradação BD
(B- tumor budding; D-depth of invasion) recomendado por Almangush et al. (2015).
Esta análise propõe a avaliação dos parâmetros: profundidade do tumor (ponto de
corte de 5mm) e a presença de pequenos aglomerados constituídos por menos de 05
células (bud) no front de invasão tumoral em um campo com amplitude de 200
(Quadro 2). Nesta análise, os escores são interpretados da seguinte forma: 0 (lesão
de baixo risco); 1 (lesão de risco intermediário) e 2 (lesões de alto risco de recorrência
loco-regional e baixa sobrevida).
53
Quadro 2 - Parâmetros histopatológicos avaliados no modelo de gradação BD
proposto por Almangush et al. (2015)
Valor
Parâmetro
Profundidade de invasão
escore 0
escore 1
escore 2
Até 4mm
Profundidade até 4mm e
presença de mais 5
buds OU
Profundidade maior que
4mm e possuir até 5
buds
Maior que 4mm
Até 5 buds
Tumor budding
Mais que 5 buds
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
4.7.1 Técnica de coloração imuno-histoquímica
Toda amostra selecionada, incluída em parafina, foi submetida a cortes
histológicos de 3 µm de espessura, que foram estendidos em lâminas de vidro,
previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo à base de
organosilano (3-aminopropyltrietoxy-silano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA).
Os cortes histológicos foram corados pelo método da imunoperoxidase através da
técnica do polímero de dextrano, utilizando-se anticorpos anti-XRCC1, -TFIIH e -XPF
e a diaminobenzidina como cromógeno, de acordo com protocolo descrito a seguir:
1) Desparafinização: 2 banhos em xilol, ambos por 10 minutos à temperatura ambiente
(TA);
2) Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis. Álcool etílico absoluto I (5
minutos) TA; álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto III (5
minutos) TA; álcool etílico 95°GL (5 minutos) TA; álcool etílico 80°GL (5 minutos) TA;
3) Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°
por 10 minutos, à temperatura ambiente;
4) Lavagem em água corrente por 10 minutos;
5) Três ou 4 passagens em água destilada;
6) Recuperação dos sítios antigênicos (Quadro 3);
7) Lavagem em água corrente por 5 minutos e 2 passagens em água destilada;
8) Duas incubações dos cortes, pelo período de 15 minutos cada, em solução de
peróxido de hidrogênio 10 volumes, em uma proporção de 1/1 para bloqueio da
peroxidase endógena tecidual;
9) Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada;
54
10) Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;
11) Incubação dos cortes com os anticorpos primários (Quadro 3) diluídos em solução
diluente Diamond (Cell Marque; Rocklin CA, USA);
12) Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;
13) Incubação com solução amplificadora (HiDef, Cell Marque; Rocklin CA, USA)
durante 15 minutos - TA;
14) Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;
15) Incubação com o anticorpo polimerizado à peroxidase (HiDef, Cell Marque;
Rocklin CA, USA) durante 15 minutos, à temperatura ambiente;
16) Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;
17) Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina (Liquid DAB + Substrato, Dako
North America, Carpinteria, CA, USA), durante 7 minutos – TA;
18) Lavagem em água corrente por 10 minutos;
19) Duas passagens em água destilada;
20) Contracoloração com hematoxilina de Mayer por 5 minutos - TA;
21) Lavagem em água corrente – 10 minutos;
22) Duas passagens em água destilada;
23) Desidratação em cadeia ascendente de etanóis. Álcool etílico 80°GL (2 minutos)
TA; álcool etílico 95°GL (2 minutos) TA; álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA;
álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
24) Diafanização em dois banhos de xilol: xilol 1 (2 minutos) e xilol 2 (2 minutos);
25) Montagem da lamínula em resina Permount ® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ,
USA).
Quadro 3 - Clone, especificidade, fonte, diluição, recuperação antigênica e incubação
dos anticorpos primários
Especificidade e
Clone
XRCC1 Ab-1
(clone 33-2-5)
TFIIH p80
(H-150)
XPF Ab-1
(clone 219)
Fabricante
Diluição
Lab Vision
1:2000
Santa Cruz
Biotechnology
1:1000
Lab Vision
1:800
Recuperação Antigênica
Citrato pH 6,0, Pascal 121 oC,
microodas 2x5’
Citrato pH 6,0,Pascal 121 oC,
microodas 2x5’
Citrato pH 6,0, Pascal 121 oC,
microodas 2x5’
Incubação
Overnight
Overnight
Overnight
55
4.7.2 Análise do perfil imuno-histoquímico
Foi realizada uma análise descritiva da imunoexpressão das três proteínas
utilizadas, quanto à intensidade da reação (intensa, moderada ou fraca) e à
imunolocalização celular da reação (nuclear, citoplasmática ou ambos).
Para a análise semiquantitativa da imunoexpressão das proteínas XRCC1, TFIIH
e XPF foram analisadas células neoplásicas do front tumoral de CELO. Inicialmente,
a imunorreatividade foi quantificada para núcleo e citoplasma, separadamente
segundo categorias propostas por Huang et al. (2013): 0 - até 10%´de células
positivas; 1 de 11% a 50% de células positivas; 2 - > 50% de células positivas.
Posteriomente para análise estatística os casos foram estratificados em baixa e
alta expressão celular, independentemente da localização da imunorreação, de
acordo com o seguinte critério: baixo (até 50% de células positivas) e alto (>50% de
células) como proposto por Seiwert et al., 2014.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As informações clinicas, morfológicas e imuno-histoquímicas das proteínas de
reparo da amostra do presente estudo foram tabuladas no software Microsoft Excel
(Microsoft Corporation, USA) e posteriormente transferidas para o software SPSS 20
for Windows (Statistical Package for Social Sciences; IBM, USA) para análise
estatística. Inicialmente, foi realizada uma análise descritiva, e posteriormente, a
variáveis quantitativas apresentadas na forma de frequências absolutas e relativas,
enquanto a variável idade foi descrita por meio de média e desvio-padrão.
4.8.1 Análise de sobrevida
As taxas de sobrevida foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e a
comparação das curvas de sobrevida foram feitas através do teste de log-rank,
adicionalmente realizou-se a regressão de Cox com o auxílio do software STATA 1.0.
56
4.8.2 Análise de desfecho
Procurando identificar a relação existente entre a imunoexpressão das proteínas
de reparo do DNA (XRCC1, TFIIH e XPF) com o desfecho da doença selecionou-se
os casos que possuíam registro de óbito ou cinco anos de seguimento após o
diagnóstico da doença atendendo aos critérios de inclusão e exclusão. Foram
consideradas duas variáveis de desfecho: presença de recidiva loco-regional e estado
da doença (óbito ou remissão da doença, um foi excluído desta análise por apresentar
doença em progressão como desfecho).
Em seguida, para avaliar a associação entre os valores de imunoexpressão com
as variáveis gradação histopatológica e os diferentes desfechos dos casos de CELO
os dados foram submetidos aos testes Qui-quadrado de Pearson e nos casos que não
foi possível utilizá-lo, foi usado o teste Exato de Fisher. Foi adotado nível de
significância de 5% para todos os testes, sendo considerados significativos os valores
de p≤0,05.
57
RESULTADOS
58
5 RESULTADOS
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Entre janeiro de 2001 e dezembro de 2010 foram diagnosticados 282 CELO
nos hospitais da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, dos quais 133 (47,16%)
foram tratados por ressecção cirúrgica, que era condição necessária para seleção da
amostra. Segundo os critérios de inclusão estabelecidos para este estudo, foram
eliminados os casos cujo material arquivado era insuficiente para análise do “front” de
invasão tumoral ou quando não encontrado no arquivo. A amostra final ficou
constituída por 74 casos, nos quais realizou-se investigação de sobrevida. A análise
de desfecho foi realizada somente com os casos que possuíam o registro de 05 anos
de seguimento ou registro de óbito (n=51, 68,92%) (Figura 3).
Dos 74 casos selecionados, a maioria era de homens na proporção 2:1, etilistas
e tabagistas que exibiram estágio III ou IV do estadiamento clínico TNM (Tabela 1). A
idade média dos pacientes foi de 62,69 (±14,84) anos, onde 43,2% (n=32) possuíam
idade até 60 anos e 56,8% (n=42), idade maior que 60 anos.
Figura 3 - Casos de carcinoma epidermoide de língua oral registrados, entre janeiro de 2001 a
dezembro de 2010, no arquivo da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer segundo seleção para o
estudo. Natal- RN, 2016
282 diagnósticos
138 cirurgias
74 selecionados para estudo
56 (42,10%) blocos não encontrados
8 (6,01%) casos que não exibiram front
51 casos possuíam 5 anos de seguimento
Fonte: Liga Norte Riograndense Contra o Câncer
59
Tabela 1 - Parâmetros clínicos e demográficos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral
selecionados para análise de sobrevida. Natal –RN, 2016
Parâmetro
n(%)
Gênero
Masculino
Feminino
49 (66,2)
25 (33,8)
Idade
10 a 40 anos
41 a 59 anos
60 a 74 anos
> 75 anos
4 (5,4)
27 (36,5)
29 (39,2)
14 (18,9)
Tabagismo
Não
Sim
Não informado
10 (13,5)
55 (74,3)
9 (12,2)
Etilista
Não
Sim
Não informado
19 (25,7)
40 (54,1)
15 (20,3)
Tamanho do tumor (T)*
T1
T2
T3
T4
Não informado
16 (21,6)
32 (43,2)
19 (25,7)
6 (8,1)
1 (1,4)
Comprometimento de linfonodos (N)*
N0
N1
N2
Não informado
38 (51,4)
20 (27,0)
15 (20,3)
1 (1,4)
Estágio do tumor*
I ou II
III ou IV
Não informado
Legenda: * Um caso não apresentou os valores do estadiamento clínico TNM
Fonte: Liga Norte Riograndense Contra o Câncer
29 (39,2)
44 (59,5)
1 (1,4)
A presença de comprometimento linfonodal comprovado histologicamente foi
observada em 47,3% da amostra sendo a maioria identificada no início do tratamento.
O tratamento de escolha para maioria dos casos foi constituído pelas três
modalidades: cirurgia, radioterapia e quimioterapia, sendo que apenas 4,1%
realizaram tratamento prévio à cirurgia.
Dezoito casos (24,3%) foram tratados
somente com cirurgia e 56 (75,7%), com cirurgia e outras formas de tratamento.
Quanto à presença de recidiva loco-regional, ocorreu em 32,4% dos casos e
destes, dois casos apresentaram mais de uma recidiva e 7 casos preenchiam os
critérios descritos como novo segundo tumor primário. Frente à baixa frequência de
novo segundo tumor primário, este evento foi adicionado ao parâmetro presença de
recidiva loco-regional na análise de desfecho. A presença de metástase à distância
foi observado em 5 (6,8%) casos (Tabela 2).
60
Tabela 2 - Parâmetros clínicos de seguimento dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral
selecionados para análise de sobrevida. Natal –RN, 2016
Parâmetro
Metástase linfonodal (comprovação histopatológica)
Ausente
Presente
n (%)
35 (47,3)
39 (52,7)
Etapa do comprometimento linfonodal
Início do tratamento
Durante o tratamento
37 (94,9)
2 (5,1)
Tratamento
Cirurgia
Cirurgia e radio ou cirurgia e quimio
Cirurgia, radio e quimio
Tratamento prévio a cirurgia
18 (24,3)
24 (32,4)
29 (39,2)
3 (4,1)
Presença de novo tumor primário
Não houve
Carcinoma epidermoide
Carcinoma não epidermoide
66 (89,2)
7 ( 9,5)
1 (1,4)
Recidiva loco-regional
50 (67,6)
24 (32,4)
Não
Sim
Número de recidiva loco-regional
1
Mais de 1
22 (91,7)
2 (8,3)
Metástase à distância
69 (93,2)
5 (6,8)
Não
Sim
5 anos de seguimento
Não
Sim ou há data do óbito
Fonte: Liga Norte Riograndense Contra o Câncer
23 (31,1)
51 (68,9)
5.2 RESULTADOS MORFOLÓGICOS
A análise morfológica dos casos de CELO segundo o modelo proposto por
Brandwein-Gensler et al. (2005), demonstrou 59,5% dos casos classificados como de
risco intermediário, sendo os parâmetros invasão perineural em pequenos nervos e a
presença de invasão tipo 4 os de maior frequência (64,9% e 77% respectivamente).
Na análise morfológica utilizando o sistema proposto por Almangush et al (2015),
identificou-se maior frequência de mais de 5 buds e profundidade tumoral maior que
4mm (58,1% e 77,0%) o que agrupou a maioria dos casos na classificação de alto
risco (Figura 4 e Tabela 3).
61
Tabela 3 - Distribuição absoluta e relativa dos parâmetros de análise histopalógicos dos casos de
carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) e
Almangush et al. (2015). Natal – RN, 2016
Parâmetro
Invasão perineural
n (%)
Não há
Em nervos pequenos
26 (35,1)
48 (64,9)
Infiltrado linfocitário
Contínuo
Em placas
Pouco ou nenhum
41 (55,4)
18 (24,3)
15 (20,3)
Pior padrão de invasão
Padrão 1, 2 ou 3
Padrão 4
Padrão 5
14 (18,9)
57 (77,0)
3 (4,1)
Gradação final pelo sistema de Brandwein Gensler
Baixo risco
Risco intermediário
Alto risco
4 (5,4)
44 (59,5)
26 (35,1)
Tumor budding
Até 5
5 ou mais
31 (41,9)
43 (58,1)
Profundidade de invasão
Até 4mm
Maior que 4 mm
17 (23,0)
57 (77,0)
Gradação final pelo sistema de Almangush
Baixo risco
Risco intermediário
Alto risco
Fonte: Elaboração própria
12 (16,2)
24(32,4)
38 (51,4)
62
Figura 4 – Carcinoma epidermoide de língua oral - parâmetros de análise histopatológicos propostos por Brandwein-Gensler et al. (2005) e Almangush et al. (2015): (A) invasão perineural (barra de
escala 100µm); (B) pouco infiltrado inflamatório (barra de escala de 200µm);(C) Padrão de invasão tipo 5 (barra de escala 500µm); (D) Profundidade tumoral de 14.300,75 µm (barra de escala
5000 µm); (E e F) tumor budding, barra de escala 100µm. Natal – RN, 2016 (Pannoramic Viewer, H/E)
1.175,5 µm
Fonte: Elaboração própria
62
63
5.3 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS
A reatividade aos anticorpos anti-XRCC1, -TFIIH e -XPF foi observada em
todos os casos, sendo considerada positiva toda célula que mostrou coloração
acastanhada em núcleo e/ou citoplasma, independente da intensidade. A proteína
XRCC1 mostrou marcação nuclear de intensidade moderada a fraca na maioria dos
casos. Destaca-se que apenas dois casos de toda amostra exibiram células
neoplásicas com imunorreatividade citoplasmática. A expressão de TFIIH nas
células
neoplásicas
foi
predominantemente
citoplasmática
com
fraca
imunorreatividade. A proteína XPF exibiu moderada a forte imunorreatividade
nuclear e citoplasmática na maioria dos casos (Tabela 4 e Figuras 5).
Tabela 4 – Análise da imunorreatividade das proteínas XRCC1,TFIIH e XPF dos casos de carcinoma
epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
Parâmetros
Intensidade nuclear de XRCC1
Fraca
Moderada
Forte
Expressão nuclear de XRCC1
Até 10%
11% a 50%
>50%
Intensidade nuclear de TFIIH
Fraca
Moderada
Forte
Expressão nuclear de TFIIH
Até 10%
11% a 50%
>50%
Intensidade citoplasmática de TFIIH
Fraca
Moderada
Forte
Expressão citoplasmática de TFIIH
Até 10%
11% a 50%
>50%
Intensidade nuclear de XPF
Fraca
Moderada
Forte
Expressão nuclear de XPF
Até 10%
11% a 50%
>50%
Intensidade citoplasmática de XPF
Fraca
Moderada
Forte
Expressão citoplasmática de XPF
Até 10%
11% a 50%
>50%
Fonte: Elaboração própria
n (%)
42 (56,8)
21 (28,4)
11 (14,9)
9 (12,2)
16 (21,6)
49 (66,2)
57 (77,0)
16 (21,6)
1 (1,4)
56 (75,7)
5 (6,8)
13 (17,6)
61 (82,4)
12 (16,2)
1 (1,4)
9 (12,2)
9 (12,2)
56 (75,7)
16 (21,6)
32 (43,2)
26 (35,1)
9 (12,2)
14 (18,9)
51 (68,9)
20 (27,0)
34 (46,0)
20 (27,0)
3 (4,1)
6 (8,1)
65 (87,8)
64
XPF
TFIIH
XRCC1
Figura 5 – Carcinoma epidermoide de língua oral – (A) Elevada imunomarcação para XRCC1 no
front tumoral; (B) Detalhe da imunoexpressão da proteína XRCC1 em núcleo; (C) Elevada
imunomarcação para TFIIH no front tumoral ; (D) Detalhe da imunoexpressão da proteína TFIIH em
núcleo e citoplasma; (E) Elevada imunomarcação para XPF no front tumoral ; (F) Detalhe da
imunoexpressão da proteína XPF em núcleo e citoplasma (A,C,D barra de escala identificando valor
de 1000µm; B,E,F barra de escala identificando 100 µm, Pannoramic Viewer, HIDEF)
Fonte: Elaboração própria
65
5.4 ANÁLISE DE SOBREVIDA
A taxa de sobrevida global em cinco anos nos pacientes estudados foi de
58,03% com mediana de 28 meses (Figura 6).
Figura 6 - Sobrevida global dos pacientes com carcinoma epidermoide de língua oral selecionados
para o estudo. Natal – RN, 2016
0.25
0.50
S (t)
0.75
1.00
Sobrevida global
0.00
n = 74
0
20
40
60
Meses
Fonte: Elaboração própria
Para todas as co-variáveis foi utilizado o estimador de Kaplan-Meier para
obtenção das curvas de sobrevida. As Figuras 7 a 11 compreendem as curvas de
sobrevida estimadas para as co-variáveis clinicas, demográficas, de seguimento,
de análise histopatológica e da imunorreatividae das proteínas de reparo do
DNA,TFIIH, XPF, e XRCC1.
Foi realizado o teste de log-rank para verificar se havia associação das covariáveis com o tempo de sobrevida dos pacientes e através de regressão de Cox
obteve-se o HR de cada variável (Figura 7 a 11e Tabelas 5, 7 e 9).
66
Figura 7 - Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as co-variáveis (A)
gênero, (B) idade, (C) tamanho do tumor (T), (D) comprometimento linfonodal no diagnóstico (N),
(E) estadiamento clínico TNM e (F) a presença de metástase linfonodal com confirmação
histopatológica em carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
Gênero
0.00
0.00
0.25 S (t)0.50
0.50
0.25 S (t)
0.75
0.75
1.00
1.00
Idade
0
20
40
0
60
20
40
A
Masculino
até 60 anos
B
Feminino
Maior que 60 anos
p = 0,22
p = 0,51
Tamanho do tumor (T)
0.25
0.25
(t)
S
0.50
(t)
S
0.50
0.75
0.75
1.00
1.00
Comprometimento de linfonodos (N)
0.00
0.00
0
20
40
Meses
T1 E T2
C
60
0
20
D
T3 E T4
p < 0,03
Meses
N0
40
60
N1 ou N2
p = 0,03
Estágio do tumor
0.25
S (t)
(t)
S0.50
0.75
0.75
1.00
1.00
Metástase linfonodal
0.00
0.00
0.25
0.50
60
Meses
Meses
0
E
20
Estagios I ou II
p = 0,51
Fonte:
Elaboração própria
Meses
40
0
60
F
Estagios III ou IV
p < 0,01
20
Meses
Ausente
40
60
Presente
p = 0,12
67
Figura 8 - Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as co-variáveis (A)
tratamento e (B) recidiva loco-regional em carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
Tratamento
0.00
0.00
0.25
0.25
S (t)
(t)
S0.50
0.50
0.75
0.75
1.00
1.00
Recidiva loco-regional
0
20
40
60
0
Meses
A
Apenas cirurgia
20
40
60
Meses
B
Cirurgia e outros
Ausente
Presente
p = 0,37
Fonte: Elaboração própria
A regressão de Cox demonstrou que dentre as variáveis clinico-patológicas,
o tamanho do tumor (T), metástase para linfonodos (N) e estadiamento clínico TNM
e profundidade de invasão demonstraram possuir associação significativa com o
óbito por CELO (Tabelas 5 a 7).
p = 0,27
68
Tabela 5 - Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordoo com parâmetros clínico e demográficos
dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal –RN, 2016
Parâmetro
N
Nº de
óbitos
Sobrevida
em 5 anos
(%)
IC 95%
HR (IC 95%)
Gênero
Masculino
Feminino
49
25
14
12
63,66
47,86
46,11 – 76,85
26,29 – 66,61
1,60(0,74 – 3,47)
0,23▲
32
42
13
13
52,15
62,50
31,78 – 69,08
43,93 – 76,45
0,77(0,36 – 1,67)
0,51▲
10
55
4
19
60,00
60,81
25,27 – 82,72
45,44 – 73,08
0,97(0,34 -2,81)
0,96▲
19
40
5
16
72,70
54,44
46,27 – 87,64
36,57 – 69,25
0,82(0,28 – 2,43)
0,73▲
48
25
11
14
73,32
27,80
56,87– 84,31
9,80– 49,38
3,08(1,39 – 6,86)
<0,01▲
38
35
9
16
69,57
48,26
49,40– 8297
29,47 – 64,76
2,40(1,06 – 5,48)
0,04▲
29
44
5
20
76,99
47,57
53,05– 89,78
30,65– 62,70
3,24(1,21 – 8,66)
0.02▲
35
39
9
17
66,87
51,08
45,68 – 81,33
33,04– 66,53
1,87(0,83 – 4,22)
0,12▲
20
54
4
22
68,94
55,41
35,78 – 87,41
40,31 – 68,13
1,62(0,56 – 4,71)
0,38▲
50
24
14
12
63,68
48,75
46,07 – 76,89
27,45 – 67,08
1,54(0,71 – 3,32)
0,28▲
Idade
Até 60 anos
> 60 anos
Tabagismo
Não
Sim
Etilista
Não
Sim
Tamanho do tumor (T)*
T1 ou T2
T3 ou T4
Comprometimento de
linfonodos (N)*
N0
N1, N2 e N3
Estágio do tumor*
I ou II
III ou IV
Metástase linfonodal
Não
Sim
Tratamento
Só cirurgia
Cirurgia e outros
Recidiva loco-regional
Não
Sim
▲
p
Legenda: HR - hazard ratio regressão de Cox; * Um caso não foi possível identificar os valores
de estadiamentoTNM; IC 95% - intervalo de confiança de 95%
Fonte: Elaboração própria
69
Figura 9 - Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para o parâmetros de análise
histopatológicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral (A) invasão perineural, (B)
infiltrado inflamatório, (C) padrão de invasão, (D) gradação final pelo sistema de Brandwein-Gensler
et al. (2005. Natal – RN, 2016
1.00
(t)
S 0.50
0.00
0.25
0.00
0.25
(t)
S 0.50
0.75
(t)
S0.50
0.25
0.00
0
40
Ausente
20
Em pequenos nervos
p = 0,14
40
60
0
20
Meses
60
Meses
Contínuo
Pouco ou nenhum
B
Em placas
p = 0,97
Padrão 1 2 ou 3
Padrão 5
C
0.75
1.00
Gradação final pelo sistema de Brandwein-Gensler
0
20
40
60
Meses
D
Fonte: Elaboração própria
Baixo risco
Alto risco
40
60
Meses
0.25 S (t) 0.50
A
20
0.00
0
Padrão de invasão
0.75
1.00
Infiltrado linfocitário
0.75
1.00
Invasão Perineural
Risco intermediário
p = 0,74
Padrão 4
p = 0,75
70
Figura 10- Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para o parâmetros de análise
histopatológicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral (A) tumor budding, (B)
profundidade e (C) gradação final pelo sistema de Almangush et al. (2015). Natal – RN, 2016
Profundidade
0.00
0.00
0.25
0.25
(t)
S0.50
(t)
S
0.50
0.75
0.75
1.00
1.00
Tumor budding
0
20
40
60
0
Meses
Até 5
20
40
B
p = 0,11
Até 4mm
Maior que 4mm
Gradação final pelo sistema de Almangush
0.75
0.50
S (t)
0.25
0.00
0
20
40
60
Meses
C
Fonte: Elaboração própria
60
Meses
5 ou mais
1.00
A
Baixo risco
Alto risco
Risco intermediário
p = 0,05
p = 0,03
71
Tabela 6 - Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordo com parâmetros de análise histopatológicos
dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por Brandwein-Gensler et al.
(2005) e Almangush et al. (2015). Natal –RN, 2016
Parâmetro
Sobrevida
em 5 anos
(%)
N
Nº de
óbitos
26
48
6
20
71,48
51,34
41
18
15
14
6
6
14
57
3
IC 95%
HR (IC 95%)
p
47,01 – 86,13
34,94 – 65,52
1,96(0,79 – 4,89)
0,15▲
60,59
55,28
55,28
42,32 – 74,68
13,72 – 26,01
13,72 – 26,01
1( - -)
1,12 (0,43 – 2,91)
1,07(0,41 – 2,79)
-0,82▲
0,88▲
4
21
1
67,31
55,59
50,00
34,03 – 86,47
40,07 – 68,60
0,06 – 91,04
1(- -)
1,48(0,51 – 4,31)
1,67(0,18 – 14,95)
-0,47▲
0,65▲
4
44
26
1
17
18
50,00
56,37
61,80
0,06 – 91,04
39,11 – 70,47
37,65 – 78,89
1 (- -)
0,57(0,07 – 4,32)
0,47(0,05 – 3,81)
-0,59▲
0,48▲
31
43
7
19
71,14
49,46
50,41 – 95,90
32,51 – 64,32
1,99(0,83 – 4,74)
0,12▲
17
57
2
24
84,42
50,85
52,45 – 96,30
35,79 – 64,08
4,12(0,97 –17,48)
0,05▲
12
24
38
0
9
17
100,00
55,56
48,03
----31,19 – 74,34
30,02 – 63,97
4,6 .10-16 (- -)
1,05 (0,47 – 2,36)
1,94 (0,86 – 4,37)
1,00▲
0,90▲
0,10▲
Invasão Perineural
Ausente
Pequenos nervos
Infiltrado Linfocitário
Contínuo
Em placas
Ausente
Padrão de invasão
1 ou 2 ou 3
4
5
Gradação final pelo
sistema de BrandweinGensler
Baixo risco
Risco intermediário
Alto risco
Tumor budding
Até 5
5 ou mais
Profundidade de invasão
Até 4 mm
> 4 mm
Gradação
final
pelo
sistema de Almangush
Baixo risco
Risco intermediário
Alto risco
Legenda: HR - hazard ratio; ▲ regressão de Cox; IC 95% - Intervalo de confiança de 95%
Fonte: Elaboração própria
72
Tabela 7 - Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordo com os parâmetros de expressão das proteínas
de reparo do DNA (TFIIH, XPF e XRCC1) nas células do front tumoral de carcinoma epidermoide de
língua oral. Natal – RN, 2016
Parâmetro
Nº de
óbitos
N
Sobrevida
em 5 anos
(%)
IC 95%
HR (IC 95%)
p
XRCC1
0,86 (0,58 – 1,26)
0,44▲
Baixo
25
11
52,29
30,33 70,31
Alto
49
15
61,71
44,32 75,10
TFIIH
1,19 (0,48 – 2,97)
0,71▲
Baixo
17
6
59,26
30,70 79,31
Alto
57
20
58,10
42,53 70,83
XPF
1,17 (0,28 – 4,97)
0,83▲
Baixo
5
2
60,00
12,57 88,18
Alto
69
24
57,90
43,72 69,71
Legenda: HR - hazard ratio; ▲ regressão de Cox; IC 95% - Intervalo de confiança de 95%
Fonte: Elaboração própria
Figura 11 - Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as covariáveis da
imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (A) XRCC1, (B)TFIIH e (C) XPF nas células do front
tumoral de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
1.00
TFIIH
0.00
0.00
0.25
0.25
(t)
S0.50
(t)
S0.50
0.75
0.75
1.00
XRCC1
0
20
40
60
0
Meses
40
Baixo
Alto
Baixo
B
p = 0,43
XPF
0.75
(t)
S0.50
0.25
0.00
0
20
40
60
Meses
C
Fonte: Elaboração própria
60
Meses
1.00
A
20
Baixo
Alto
p = 0,83
Alto
p = 0,71
73
5.5 ANÁLISE DE DESFECHO
Dos 74 casos de CELO selecionados para a investigação de sobrevida, 51 (68,92%)
possuíam registro, em prontuário, de seguimento de cinco anos após o diagnóstico. Deste
grupo, identificou-se 26 (51,0%) óbitos, 24 (47,1%) apresentaram remissão da doença e 1
(2,0%) paciente exibiu doença em progressão. Para a análise de desfecho após cinco anos de
diagnóstico de CELO foram selecionados apenas os desfechos óbito e remissão.
A investigação da relação da imunoexpressão das proteínas de reparo XRCC1, TFIIH e
XPF com parâmetros clínicos de diagnóstico e seguimento identificou que CELO com
estadiamento clínico TNM I ou II possuíam alta expressão de XRCC1 diferente do grupo
estadiamento clínico III ou IV (Tabela 11).
O teste de associação realizado entre as imunoexpressões das proteínas de reparo
XRCC1, TFIIH e XPF com os parâmetros morfológicos propostos por Brandwein-Gesler et al.
(2005) e por Almangush et al. (2015) não identificou relação entre as variáveis (Tabela 12).
74
Tabela 8 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de acordo com a imunoexpressão das proteínas de reparo do
DNA (TFIIH, XPF e XRCC1), o estadiamento clínico TNM, a presença de metástase linfonodal, o tratamento,a presença de recidiva loco-regional e o desfecho
em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2016
Parâmetro
Estadiamento*
I ou II
III ou IV
Metástase linfonodal
Ausente
Presente
Tratamento
Cirurgia
Cirurgia e radio ou cirurgia e quimio
Cirurgia, radio e quimio
Tratamento prévio a cirurgia
Tratamento
Apenas cirurgia
Cirurgia e outros
Recidiva loco-regional
Ausente
Presente
Desfecho
Remissão
Óbito
XRCC1
Baixo
Alto
p
Baixo
TFIIH
Alto
p
Baixo
XPF
Alto
p
4 (21,1)
16 (53,3)
15 (78,9)
14 (46,7)
0,02#
6 (31,6)
8 (26,7)
13 (68,4)
22 (73,3)
0,71#
1 (5,3)
3 (10,0)
18 (94,7)
27 (90,0)
0,99†
8 (33,0)
12 (46,2)
16 (66,7)
14 (53,8)
0,35#
9 (37,5)
5 (19,2)
15 (62,5)
21 (80,8)
0,15#
1 (4,2)
3(11,5)
23 (95,8)
23 (88,5)
0,61†
4 (44,4)
6 (30,0)
9 (45,0)
1 (100,0)
5 (55,6)
14 (70,0)
11(55,0)
0 (0,0)
1 (11,1)
4 (20,0)
8 (40,0)
1 (100,0)
8 (88,9)
16 (80,0)
12 (60,0)
0 (0,0)
0 (0,0)
1 (5,0)
3 (15,0)
0 (25,0)
9 (100,0)
19 (95,0)
17 (85,0)
1 (100,0)
5 (50,0)
15 (37,5)
5 (50,0)
25 (62,5)
0,49†
2 (20,0)
12 (30,0)
8 (80,0)
28 (70,0)
0,79†
0 (0,0)
4 (10,0)
10(100,0)
15 (45,5)
5 (29,4)
18 (54,5)
12 (70,6)
0,27#
9 (27,3)
5 (29,4)
24 (72,7)
12 (70,6)
0,99†
2 (6,1)
2 (11,8)
31 (93,9)
15 (88,2)
0,60†
9 (37,5)
11 (42,3)
15 (62,5)
15 (57,7)
0,73#
8 (33,3)
6 (23,1)
16 (66,7)
20 (76,9)
0,42#
2 (8,3)
2 (7,7)
22 (91,7)
24 (92,3)
0,99†
--
Legenda: * Um caso não foi possível identificar o estadiamento clínico # Qui-Quadrado; † Exato de Fisher;
--
--
--
0,57†
36 (90,0)
Não foi possível realizar teste estatístico
Fonte: Elaboração própria
74
75
Tabela 9 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral que possuem cinco anos de acompanhamento, de acordo com
a gradação de malignidade recomendado por Brandwein-Gensler et al. (2005) e por Almangush et al. (2015) e a imunoexpressão das proteínas de reparo do
DNA (TFIIH, XPF e XRCC1) Natal – RN, 2016
XRCC1
Baixo
Alto
Parâmetro
Invasão perineural
Ausente
Pequeno
Infiltrado linfocitário
Continuo
Em placa
Fraco
Pior padrão de invasão
1 ou 2 ou 3
4
5
Gradação final pelo sistema de
Brandwein-Gensler
Baixo risco
Risco intermediário
Alto risco
Tumor Budding
Até 5
5 ou mais
Profundidade de invasão
Até 4 mm
> 4 mm
Gradação final pelo sistema de
Almangush
Baixo risco
Risco intermediário
Alto risco
8 (50,0)
12 (35,3)
8 (50,0)
22 (64,7)
9 (33,3)
7 (63,6)
4 (33,3)
18 (66,7)
4 (36,4)
8 (66,7)
5 (50,0)
15 (40,5)
0 (0,0)
5 (50,0)
22 (59,5)
3 (100,0)
0 (0,0)
14 (46,7)
6 (31,6)
1 (100,0)
16 (53,3)
13 (68,4)
10 (55,6)
10 (31,3)
p
Baixo
0,32#
TFIIH
Alto
XPF
p
0,10†
p
Baixo
Alto
2 (12,5)
2 (5,9)
14 (87,5)
32 (94,1)
2 (7,4)
0 (0,0)
2 (16,7)
25 (92,6)
11 (100,0)
10 (83,3)
2 (20,0)
2 (5,4)
0 (0,0)
8 (80,0)
35 (94,6)
3 (100,0)
0,58†
7 (43,8)
7 (20,6)
9 (56,3)
27 (79,4)
7 (25,9)
2 (18,2)
5 (41,7)
20 (74,1)
9 (81,9)
7 (58,3)
2 (20,0)
10 (27,0)
2 (66,7)
8 (80,0)
27 (73,0)
1 (33,3)
--
0 (0,0)
8 (26,7)
6 (31,6)
1 (100,0)
22 (73,3)
13 (68,4)
--
0 (0,0)
1 (3,3)
3 (15,8)
1 (100,0)
29 (96,7)
16 (84,2)
8 (44,4)
22 (68,8)
0,09#
5 (27,8)
9 (28,1)
13 (72,2)
23 (71,9)
0,98#
2 (11,1)
2 (6,3)
16 (88,9)
30 (93,8)
0,61†
3 (30,0)
11 (42,5)
7 (70,0)
23 (57,5)
0,72†
3 (30,0)
11 (27,5)
7 (70,0)
29 (72,5)
0,99†
2 (20,0)
2 (5,0)
8 (80,0)
38 (95,0)
0,17†
2 (33,3)
9 (56,3)
9 (32,1)
4 (66,7)
7 (43,8)
19 (67,9)
--
2 (33,3)
4 (25,0)
8 (28,6)
4 (66,7)
12 (75,0)
20 (71,4)
2 (33,3)
0 (0,0)
2 (7,1)
4 (66,7)
16 (100,0)
26 (92,1)
--
Legenda: # Qui-Quadrado; † Exato de Fisher;
--
--
--
--
--
--
--
--
--
Não foi possível realizar teste estatístico
Fonte: Elaboração própria
75
76
DISCUSSÃO
77
6
DISCUSSÃO
O carcinoma epidermoide representa a neoplasia maligna mais prevalente em
cavidade oral, com destaque para a elevada frequência em língua e evolução
comumente associada a altos índices de morbidade e mortalidade. Possui etiologia
multifatorial onde fatores endógenos associados à ação de um ou mais agente
exógeno, determinam mudanças genéticas que progridem através de uma série de
mutações em genes específicos, resultando em erros na replicação genética e/ou no
processo de reparo do DNA. Dos fatores extrínsecos, o fumo e o álcool constituem os
principais fatores de risco para o surgimento desta neoplasia, uma vez que tais
agentes podem lesar o DNA, levando a erros que devem ser corrigidos por enzimas
envolvidas em diferentes mecanismos responsáveis pelo reparo do DNA.
Neste contexto, os genes de reparo do DNA com suas proteínas
correspondentes vêm sendo alvos de numerosas investigações a respeito de
possíveis alterações genéticas determinantes do funcionamento inadequado destas
proteínas, resultando em maior susceptibilidade individual tanto para o surgimento, de
um câncer, quanto na sua evolução. Verifica-se na literatura pertinente, escassez de
trabalhos investigando a correlação da expressão de proteínas do reparo do DNA com
o prognóstico do carcinoma epidermoide de língua.
Segundo Mahjabeen et al. (2014) o sistema de reparo desempenha papel
importante na proteção do genoma humano contra danos causados por carcinógenos
presentes no meio-ambiente, com destaque para as proteínas XRCC1 e APE1 da via
de reparo por excisão de bases (BER) e TFIIH e XPF da via de reparo por excisão de
nucleotídeos (NER). Estudo recente de Farnebo et al. (2015) demonstrou a presença
de polimorfismos em genes do reparo do DNA em pacientes com diversos tipos de
câncer, incluindo o CEO; no entanto, até o momento, poucos estudos investigaram a
expressão imuno-histoquímica das proteínas envolvidas no reparo do DNA como
biomarcadores prognósticos nesta doença.
Fundamentados nesses conhecimentos, este experimento buscou investigar se
a imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA XRCC1, TFIIH e XPF poderia ser
utilizada como possível biomarcador prognóstico em carcinoma epidermoide de língua
78
oral avaliando possíveis associações entre a imunoexpressão das proteínas e
parâmetros clinicopatológicos e sobrevida em pacientes com essa doença.
O perfil dos pacientes acometidos por CELO caracteriza-se por homens com
idade superior a 60 anos, tabagista e etilista. Comumente, o tumor é diagnosticado no
estágio III ou IV, conforme o estadiamento TNM (LI et al., 2013, FERNÁNDEZ et al.,
2015). Mesmo sem modificar este perfil, alguns estudos apontam o incremento na
incidência de CEO em mulheres, com idade inferior a 45 anos e que não possuem
hábito de etilismo e/ou tabagismo (DURR et al., 2013, PICKERING et al., 2014).
No presente estudo, observou-se idade média de 61,6 anos, prevalência de
homens tabagistas e etilistas. Em relação aos pacientes jovens identificou-se que
apenas 5,4% dos pacientes possuíam idade igual inferior a 40 anos. Estes dados
corroboram os citados na maioria dos estudos publicados na literatura (LI et al., 2013,
GUNTINAS-LICHIUS et al., 2014, MESQUITA et al., 2014, FERNÁNDEZ et al., 2015,
MIRZAEI, et al, 2015).
Dentre as variáveis
clínicas pesquisadas, tamanho do tumor (T),
comprometimento de linfonodos (N) e estágio do tumor apresentaram valor preditivo
para o CELO, identificando o forte poder preditivo do sistema TNM e de seus
parâmetros, como observado por Preuss et al.( 2007), Kreppel et al.(2011), Mucke
et al. (2014), Okuyemi, Piccirillo e Spitznagel (2014) e Thiagarajan et al. (2014).
A variabilidade na apresentação de características morfológicas do carcinoma
epidermoide suscita a investigação de parâmetros morfológicos como possíveis
parâmetros preditivos de recidiva loco-regional e até mesmo da sobrevida do paciente.
Sistemas de gradação histopatológica de malignidade vêm sendo propostos desde a
década de 20. Em 2005, Brandwein-Gensler et al. publicaram um esquema de
classificação para o CE baseado nos parâmetros: presença de invasão perineural,
distribuição do infiltrado inflamatório e pior padrão de invasão tumoral.
Na presente pesquisa observou-se maior frequência de invasão perineural em
pequenos nervos, infiltrado inflamatório contínuo e padrão de invasão tipo 4,
parâmetros que direcionaram a classificação da maioria da amostra como risco
intermediário. A análise de sobrevida não identificou valor preditivo nos parâmetros
propostos nesta gradação semelhantes ao resultado de Sawazaki-Calone et al. (2015)
79
e diferente dos apresentados por Brandwein-Gensler et al. (2005). Esta discordância
reflete a variabilidade em parâmetros clínicos, tamanho amostral e número de óbitos
das amostras de cada estudo. Adicionalmente Sawazaki-Calone et al. (2015)
descrevem que a inconsistência de resultados pode ser atribuído à subjetividade na
classificação de alguns parâmetros do sistema proposto por Brandwein-Gensler.
Segundo Almangushu et al. (2015), a classificação do infiltrado inflamatório é o
parâmetro que apresenta maior discordância.
Nossos resultados da análise morfológica pelo sistema de Almangush et al.
(2015) identificam maior frequência de casos de CELO com alto risco, elencando
profundidade de invasão como parâmetro com valor prognóstico (HR 4,12, IC 95 0,9717,48). Adicionalmente, observamos valores de sobrevida em cinco anos menor nos
casos de CELO com profundidade de invasão maior que 4 mm e gradação final pelo
sistema classificado como alto risco. Resultados semelhantes foram observados por
Ahmedhajiomar et al. (2015), Attramadal et al. (2015) e Sawazaki-Calone et al. (2015).
Estes achados podem estar relacionados à dispersão das células tumorais
frequentemente encontrada em lesões com elevada profundidade. As dispersões
destas células facilitam a migração e a tumorigênese, eventos que convergem ao
maior potencial invasivo e desenvolvimento de metástase.
O parâmetro denominado tumor budding é definido pelos autores como
pequenos agrupamentos celulares que refletem a transição epitelial-mesenquimal. Foi
investigado por Wang et al. (2011) e Xie et al.(2015) que identificaram a presença de
mais de 5 buds como fator preditivo independente para CELO. Em nossa pesquisa,
não foram observados resultados semelhantes neste parâmetro; entretanto
analisando o conjunto dos parâmetros da gradação de Almanghush et al. (2015)
identificamos seu forte poder preditivo nos CELO analisados.
Destaca-se que ao comparar os resultados dos dois sistemas de gradação
utilizados nesta pesquisa, a gradação de Almangush et al. (2015) exibiu resultados
mais expressivos. Acreditamos que a maior objetividade dos parâmetros desta
gradação direciona a identificação de fator preditivo para CELO.
A busca de biomarcadores prognósticos que indiquem o nível de
agressividade tumoral e de resposta do tumor/hospedeiro ao tratamento é objetivo de
numerosas pesquisas. Dentre estas, merecem destaque aquelas que analisam o
80
padrão de expressão, através de método imuno-histoquímico, de diversas proteínas
envolvidas com processos relacionados com a tumorigênese. Alguns destes
experimentos vêm demonstrando associação de proteínas do reparo do DNA tanto
com o risco para o desenvolvimento de alguns cânceres como para o estabelecimento
de agressividade e sensibilidade a radio e/ou quimioterapia.
No presente estudo, observou-se de uma maneira geral, elevada
imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA XRCC1, TFIIH e XPF em células de
CELO. Observamos que a proteína XRCC1 exibiu marcação predominantemente
nuclear semelhante ao descrito por Ang et al. (2011) em carcinoma epidermoide de
cabeça e pescoço e por Huang et al. (2013) em carcinoma colorretal.
Contraditoriamente Mahjabeen et al. (2014) descrevem imunoexpressão de XRCC1
em núcleo e citoplasma em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Os próprios
autores descrevem que a imunolocalização citoplasmática de XRCC1 é um achado
contraditório ao que é relatado e que investigações anteriores do seu grupo de
pesquisa identificaram a presença de mutação no gene desta proteína, o que pode
influenciar da diminuição de expressão desta proteína, interferindo na incidência de
carcinoma de cabeça e pescoço na população paquistanesa, entretanto, o mecanismo
exato permanece desconhecido.
A proteína TFIIH apresentou-se predominantemente citoplasmática e
fracamente nuclear, localização equivalente à descrita por Ye et al. (2012) em
carcinomas uterinos, enquanto a proteína XPF apresentou-se predominantemente
nuclear e citoplasmática padrão semelhante ao descrito por Seiwert et al. (2014) em
carcinomas da região de cabeça e pescoço.
Em relação à proteína XRCC1 a presente pesquisa identificou elevada
expressão na maioria dos casos (66,2%) de forma semelhante ao descrito por Ang et
al. (2011) que identificaram 55,8% dos casos de carcinoma epidermoide de cabeça e
pescoço com superexpressão de XRCC1.
Diferentemente, Mahjabeen et al. (2014) descrevem redução de mRNA da
proteína XRCC1 e redução de sua imunoexpressão em pacientes com carcinoma
epidermoide de cabeça e pescoço. A expressão de mRNA identificou 64% de casos
com baixa regulação, 30% alta e 6% não foi identificada alteração. Enquanto a análise
da imunorreação identificou 48% casos como fraco, 32% moderado e 20% forte.
81
Esta diferença de resultados pode ser explicada pela tumorigenêse dos
cânceres da região de cabeça e pescoço que exibe um padrão heterogêneo de
expressão de proteínas, por vezes específico do sitio anatômico como descrito por
Seiwert et al (2014). Destaca-se que há escassez de pesquisas que investigam
proteínas de reparo do DNA em CELO pela técnica de imuno-histoquímica.
A investigação da relação da imunoexpressão de XRCC1 e sobrevida
realizada na presente pesquisa não identificou valor preditivo desta proteína.
Diferentemente, Ang et al. (2011) descrevem que alta expressão de XRCC1 está
associada a menor sobrevida em carcinoma de cabeça e pescoço.
No presente estudo, estadiamentos clínicos TNM I e II apresentaram
associação com maior imunoexpressão de XRCC1 evento não observado nas
investigações de Ang et al. (2011) e Mahjabeen et al. (2014). Esta distribuição pode
ser justificada, em parte, pela amostra do estudo possuir número reduzido de casos
com estadiamento I e II (39,2%) em relação ao estadiamento III e IV (59,5%).
A investigação da imunoexpressão de XRCC1 realizada nesta pesquisa não
identificou associação com a presença de recidiva loco-regional e óbito; entretanto,
observa-se que estes dois parâmetros apresentam maior frequência no grupo com
alta expressão (70,6% e 57,7%, respectivamente). Adicionalmente, observou-se que
níveis elevados de XRCC1 nos casos que possuíam mais de 5 de buds em CELO
embora estes dados não tenham significado estatístico, podem sinalizar a relação de
níveis elevados desta proteína com os piores desfechos.
Estudo realizado por Abdel-Fatah et al. (2013) identificou que a
superexpressão de XRCC1 está associada aos piores desfechos em carcinoma
ovariano. Entretanto, estudos realizados com melanoma (BHANDARU et al., 2014) e
carcinoma de colo uterino (BAJPAI et al., 2013) demonstram que níveis elevados de
XRCC1 estão relacionados aos melhores parâmetros clínicos, morfológicos e de
seguimento destas neoplasias.
A elevada imunoexpressão de XRCC1 identificada em diversos cânceres está
relacionada com distintos desfechos, fato que sugere que esta proteína pode exercer
efeito reparativo em células tumorais promovendo a progressão com desenvolvimento
de resistência a terapêutica e metástase. Entretanto, a XRCC1 também pode exercer
82
efeitos protetores ao paciente. Concordamos com Lianos et al. (2014) que descreve
que a heterogeneidade interpaciente e intratumoral são os eventos que melhor
explicam os eventos de progressão tumoral, aparecimento de resistência e potencial
metastático. Na dinâmica da progressão tumoral, quando uma via metabólica
encontra-se prejudicada outras relações são estabelecidas, circunstância favorecida
pela variação genotípica dos clones tumorais.
A maioria dos casos de CELO da presente pesquisa exibiu elevada
imunomarcação para TFIIH, evidenciada predominantemente em citoplasma e com
intensidade fraca nas células do front tumoral. Na investigação da relação desta
expressão com parâmetros clínicos, morfológicos e de desfecho não encontramos
associações estatisticamente significantes. Entretanto, os casos de CELO que
exibiram invasão perineural, apresentaram elevada imunoexpressão de TFIIH.
Embora este dado não tenha significado estatístico este parâmetro, indicador de
agressividade tumoral, pode estar relacionado a elevada expressão desta proteína.
Estudo de Chen et al. (2015), através de análise proteômica, identificou associação
da proteína TFIIH com a gradação morfológica em carcinoma epidermoide de laringe.
A XPF foi outra proteína da NER analisada no presente estudo, apresentando
elevada imunoexpressão nuclear e citoplasmática com intensidade moderada. Estes
resultados são semelhantes aos observados por Vaezi et al. (2011), que identificaram
elevada imunoexpressão de XPF em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço,
com destaque aos localizados na cavidade oral em relação aos outros sítios. Os
pacientes que apresentaram imunoexpressão abaixo da mediana possuíram
sobrevida de 1 ano de 28%, enquanto aqueles que demonstraram imunoexpressão
acima da mediana, 53%.
Na presente pesquisa não identificamos relação da elevada expressão de
XPF com parâmetros clínicos e de desfecho. Semelhantemente, Jagdis et al. (2013)
não identificaram relação da imunoexpressão nuclear de XPF em carcinoma de
nasofaringe não metastático com o tempo de desenvolvimento de recorrência locoregional, tempo de sobrevida livre de doença e tempo de sobrevida global.
No entanto Seiwert et al. (2014) identificaram que pacientes com carcinoma
epidermoide de cabeça e pescoço com estágio IV que apresentaram maior
imunoexpressão de XPF exibiram as piores evoluções clinicas em comparação com
83
aqueles que apresentaram menor imunoexpressão da proteina. Entretanto, estes
pesquisadores não verificaram associação da imunoexpressão de XPF com a
sobrevida global de pacientes com carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço,
resultado semelhante ao descrito em nossa pesquisa.
Esta pesquisa como toda pesquisa retrospectiva, apresenta algumas
limitações. Utilizar material arquivado implica na influência de fatores como condições
de catalogação, de armazenamento e processamento histológico dos blocos de
CELO. As diferenças de resultados encontrados na literatura em pesquisas que
utilizam a técnica imuno-histoquímica, no qual incluímos este estudo, deve-se a
limitações de diversas naturezas. Diversidades nas etapas laboratorias, na
categorização da expressão das proteínas são fatores que dificultam a ideal
comparação entre os diversos estudos publicados.
Nossos resultados identificam que a alta imunoexpressão das proteínas
XRCC1, THFIIH e XPF não está relacionada com parâmetros clínicos e
histopatológicos nos casos de CELO analisados, não podendo ser utilizado como
marcador prognóstico. Acredita-se que o sitio anatômico é um fator importante na
iniciação e progressão tumoral. Novos estudos com amostras maiores e envolvendo
diferentes técnicas são necessários para identificar mecanismos moleculares que
interferem a atividade das proteínas de reparo do DNA e o potencial preditivo de cada
proteína.
84
CONCLUSÕES
85
7
CONCLUSÕES
Com base nos resultados desta pesquisa, pode-se concluir que:
1. As variáveis tamanho do tumor (T), comprometimento linfonodal (N), estágio
do tumor e profundidade de invasão > 4 mm podem ser utilizados como fatores
prognósticos para carcinoma epidermoide de língua oral.
2. A elevada imunoexpressão das proteínas XRCC1, TFIIH e XPF observada
neste estudo não apresentou associação significativa com os parâmetros
clínicos estudados (estadiamento clínico, metástase, recidiva e desfecho) ou
com parâmetros de gradação histopatológica em CELO, com exceção da
elevada imunoexpressão de XRCC1 que se mostrou significativamente
associada a estadiamento clínico melhor.
3. Mesmo reconhecendo a importância das proteínas XRCC-1, TFIIH e XPF no
desenvolvimento e progressão do carcinoma epidermoide de língua oral,
nossos resultados indicam que a sua expressão imuno-histoquímica não
possui valor prognóstico para este tipo de câncer.
86
REFERÊNCIAS
87
8 REFERÊNCIAS
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94
APÊNDICES
95
APÊNDICE A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
96
97
APÊNDICE B – Ficha para coleta de dados clínicos
Ficha para anotação:
Data: ____/____/_______
Nº do prontuário:____________
Nº na Patologia:______________
Coleta de informações do prontuário
Nome:_______________________________________________
Gênero: ______Idade:______ Data de nascimento: ___/____/________
Localização:_____________
Estadiamento: T______ N_______ M _______
Data da biópsia excisional: ____/_____/______
Data do início do tratamento: ____/_____/______
Tratamento recebido: (
) {[1-cirurgia; 2-radioterapia; 3-quimioterapia], mais de um
tratamento, colocar os nº correspondentes}
Metástase linfonodo: (
) ____/____/_______
Metástase à distância: (
)
Recidiva Local (
) ____/____/_______
Data de diagnóstico de Metástase: ____/____/_______
Estado da doença: (
)
Data do último seguimento ( ) ou data do óbito _____/_____/_____
Estado da doença: [1-remissão completa, 2-remissão parcial, 3-doença estável, 4doença em progressão, 5-óbito por câncer, 6-óbito por não câncer]
Metástase linfonodo: [1-sim, 2-não]
Metástase à distância: [1-sim, 2-não]
Outras informações
Bebe?
Sim ( )
Não: (
tempo:____________
)
Quantidade dose/dia: ______________ Por quanto
Fuma?
Sim ( )
Não: (
tempo:___________
)
Quantidade cigarro/dia: _____________ Por quanto
98
APENDICE C- Resultados não apresentados
Tabela 13 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral de acordo com a recidiva loco-regional, o desfecho e o estadiamento clínico
TNM em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2015
Parâmetro
Estadiamento clínico*
I e II
Total
p
III e IV
Recidiva loco-regional
Ausente
Presente
16 (50,0)
3 (17,6)
16 (50,0)
14 (82,4)
32 (100,0)
17 (100,0)
0,03#
10 (41,7)
20 (80,0)
24 (100,0)
25 (100,0)
<0,01#
Desfecho
Remissão
Óbito
Legenda: # Qui-Quadrado
Fonte: Elaboração própria
14 (58,3)
5 (20,0)
Tabela 14 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral de acordo com a recidiva loco-regional e o desfecho em cinco anos de
acompanhamento. Natal –RN, 2015
Parâmetro
Metástase linfonodal
Ausente
Presente
Total
p
Recidiva loco-regional
Ausente
Presente
18 (54,5)
6 (35,3)
15 (45,5)
11 (64,7)
33 (100,0)
17 (100,0)
0,20#
15 (62,5)
9 (34,6)
9 (37,5)
17 (65,4)
24 (100,0)
26 (100,0)
0,05#
Desfecho
Remissão
Óbito
Legenda: # Qui-Quadrado
Fonte: Elaboração própria
99
Tabela 15 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral de acordo com tratamento, a metástase linfonodal, a presença de recidiva
loco-regional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2015
Recidiva loco-regional
Parâmetro
Ausente
Presente
8 (88,9)
12 (60,0)
12 (60,0)
1 (100,0)
1 (11,1)
8 (40,0)
8 (40,0)
0 (0,0)
8 (80,0)
25 (62,5)
2 (20,0)
15 (37,5)
18 (75,0)
15 (57,7)
6 (25,0)
11 (42,3)
Desfecho
p
p
Remissão
Óbito
6 (66,7)
9 (45,0)
9 (45,0)
0 (0,0)
3 (33,3)
11 (55,0)
11(55,0)
1 (100,0)
6 (60,0)
18 (45,0)
4 (40,0)
22 (55,0)
0,49†
15 (62,5)
9 (34,6)
9 (37,5)
17 (65,4)
0,05#
Tratamento
Cirurgia
Cirurgia e radio ou cirurgia e quimio
Cirurgia, radio e quimio
Tratamento prévio a cirurgia
Tratamento
Apenas cirurgia
Cirurgia e outros
Metástase
--
0,46†
--
linfonodal
(comprovação histopatológica)
Não
Sim
0,20#
Legenda:# Qui-Quadrado; † Exato de Fisher; - - Não foi possível realizar teste estatístico
Fonte: Elaboração própria
Tabela 16 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral de acordo desfecho e a presença de recidiva loco-regional em cinco anos
de acompanhamento. Natal – RN, 2015
Parâmetro
Desfecho
p
Remissão
Óbito
19 (57,6)
5 (29,4)
14 (42,4)
12 (70,6)
Recidiva loco-regional
Ausente
Presente
0,06#
Legenda:# Qui-Quadrado; † Exato de Fisher; - - Não foi possível realizar teste estatístico
Fonte: Elaboração própria
100
Tabela 17 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermóide de língua oral, de acordo com a gradação
de malignidade recomendado por Brandwein-Gensler et al. (2005), o estadiamento clínico TNM, a presença de metástase
linfonodal, a recidiva loco-regional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2015
IP
Parâmetro
Ausente
Pequenos
IL
p
PPI
p
Contínuo
Em
placas
Fraco
1 ou 2 ou 3
4
GH
p
5
p
BR
RI
AR
Estadiamento
*
I ou II
III ou IV
Metástase
Ausente
Presente
8(42,1)
8(26,7)
11(57,9)
22(73,3)
0,26#
12(63,2)
15(50,0)
2(10,5)
9(30,0)
5(26,3)
6(20,0)
--
2(10,5)
8(26,7)
15(78,9)
21(70,0)
2(10,5)
1(3,3)
--
0(0,0)
1(3,3)
11(60,0)
19 (63,3)
8(42,1)
10(33,0)
10(41,7)
6 (23,1)
14(58,3)
20(76,9)
0,16#
14 (58,3)
13 (50,0)
4(16,7)
7(26,9)
6(25,0)
6(23,1)
0,68#
4(16,7)
6(23,1)
18(75,0)
19(73,1)
2(8,3)
1(3,8)
--
1(4,2)
0(0,0)
13(54,2)
17(65,4)
10(41,7)
9 (34,6)
Recidiva locoregional
Ausente
Presente
11(33,3)
5(29,4)
22(66,7)
12(70,6)
0,78#
19(57,6)
8(47,1)
6(18,2)
5(29,4)
8(24,2)
4(23,5)
--
5(15,2)
5(29,4)
27(81,8)
10(58,8)
1(3,0)
2(11,8)
--
0(0,0)
1(5,9)
21(63,6)
9(52,9)
12(36,4)
7(41,2)
Desfecho
Remissão
Óbito
10(41,7)
6(23,1)
14(58,3)
20(76,9)
0,16#
13 (54,2)
14(53,8)
5(20,8)
6(23,1)
6(25,0)
6(23,1)
--
6(25,0)
4(15,4)
16(66,7)
21(80,8)
2(8,3)
1(3,8)
--
0(0,0)
1(3,8)
13(54,2)
17(65,4)
11(45,8)
8(30,8)
-
Legenda: IP - IP - Invasão perineural; IL- Infiltrado linfocitário; PPI – Pior padrão de invasão; GH- Gradação Histológica; BR- Baixo risco; RI – Risco intermediário;
AR- Alto risco; # Qui-Quadrado; - - Não foi possível realizar teste estatístico
Fonte: Elaboração própria
105
101
Tabela 18 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de acordo com a gradação
de malignidade recomendado por Almangush et al. (2015), a metástase linfonodal, o estadiamento clínico TNM, a recidiva
loco-regional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2015
Tumor budding
p
Parâmetro
Até 5
Estadiamento*
I ou II
III ou IV
Metástase
Ausente
Presente
Recidiva loco-regional
Ausente
Presente
Desfecho
Remissão
Óbito
>5
Profundidade de
invasão
Até 4 mm
GH
p
> 4mm
p
BR
RI
AR
7 (36,8)
11 (36,7)
12 (63,2)
19 (63,3)
0,99#
6 (31,6)
4 (13,3)
13 (68,4)
26 (86,7)
0,16†
3 (15,8)
3 (10,0)
7(36,8)
9(30,0)
9 (47,4)
18 (60,0)
--
9 (37,5)
9 (34,6)
15 (62,5)
17 (65,4)
0,83#
5 (20,8)
5 (19,2)
19 (79,2)
21 (80,8)
0,89†
3 (12,5)
3 (11,5)
8 (33,3)
8 (30,8)
13 (54,2)
15 (57,7)
--
11 (33,3)
7 (41,2)
22 (66,7)
10 (58,8)
0,58#
8 (24,2)
2 (11,8)
25 (75,8)
15 (88,2)
0,46†
4 (12,1)
2 (11,8)
11 (33,3)
5 (29,4)
18 (54,5)
10 (58,8)
--
11 (45,8)
7 (26,9)
13 (54,2)
19 (73,1)
0,16#
8 (33,3)
2 (7,7)
16 (66,7)
24 (92,3)
0,02†
6 (25,0)
0 (0,0)
7 (29,2)
9 (34,6)
11(45,8)
17 (65,4)
--
Legenda: IP - IP - Invasão perineural; IL- Infiltrado linfocitário; PPI – Pior padrão de invasão; GH- Gradação Histológica; BR- Baixo risco; RI – Risco intermediário;
AR- Alto risco; # Qui-Quadrado; † Exato de Fisher; - - Não foi possível realizar teste estatístico
Fonte: Elaboração própria
106
102
ANEXO
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte Riograndense
Contra o Câncer
104