Efeito de bioterápico na eosinofilia durante a SLMV

Revista de Ciências
Farmacêuticas
Básica e Aplicada
Rev Ciênc Farm Básica Apl., 2014;35(4):701-708
ISSN 1808-4532
Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences
Efeito de bioterápico na eosinofilia durante a SLMV
experimental
Luciana Camillo¹,*; Sandra Regina Pereira de Oliveira¹; Rosa Domingues Ribeiro²; Joice Margareth de Almeida
Rodolpho¹ ; Gabriel Henrique Gomes Caroccia¹; Sérgio de Albuquerque³; Fernanda de Freitas Anibal¹
Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Morfologia e Patologia, Laboratório de Parasitologia, - LAP-DMP-UFSCar;
2
Universidade de Franca –UNIFRAN;
3
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Departamento de Análises Clínicas Toxicológicas e
Bromatológicas, – DACTB-FCFRP-USP.
1
RESUMO
INTRODUÇÃO
O Toxocara canis (Tc) é um parasito pertencente ao filo
Nematódeo que possui como hospedeiro definitivo os
cães. O homem é hospedeiro paratênico e contamina-se
acidentalmente ao ingerir ovos contendo larvas infectantes
(L3) do parasito, as quais são liberadas e atravessam a
mucosa intestinal, atingem a circulação. Durante este
processo migratório, antígenos de excreção e secreção (TES)
são liberados provocando intensa reação inflamatória, do tipo
Th2, caracterizando a síndrome, denominada Larva Migrans
Visceral (SLMV). As principais características desta doença
crônica são as eosinofilias sanguínea e tecidual persistentes.
Desse modo, torna-se importante a busca por terapias que
contribuam com a redução dos quadros inflamatórios com
intensa eosinofilia. Assim, o uso deste bioterápico, produzido a
partir do extrato antigênico de ovos e larvas de (Tc), e seu efeito
no recrutamento de leucócitos totais, células mononucleares e
eosinófilos no sangue, para o espaço broncoalveolar e para a
cavidade peritoneal de camundongos infectados pelo (Tc) foi
investigado. Foram utilizados camundongos fêmeas (Swiss),
divididos nos grupos: Controle (C), Infectado (Tc), Imunizado
(Im+Tc) e Tratado (Tc+Bio). Os animais Tc, Im+Tc e Tc+Bio
receberam 500 ovos/animal por gavagem. Posteriormente,
os animais foram eutanasiados no 18º dia da infecção e o
número das células nos compartimentos foi determinado. Os
resultados obtidos demonstraram que, Im+Tc, assim como
nos Tc+Bio tiveram redução significativa dessas células nos
compartimentos analisados quando comparados grupo Tc.
Assim, sugeriu-se que a bioterapia modulou negativamente
o recrutamento de células inflamatórias, principalmente
eosinófilos no sangue, pulmão e intestino demonstrando
um potencial anti-inflamatório desse bioterápico na SLMV
experimental.
Síndrome da Larva Migrans Visceral
O termo Síndrome da Larva Migrans Visceral
(SLMV) foi introduzido pela primeira vez por Beaver
(1952), em analogia à Síndrome da Larva Migrans Cutânea,
para definir uma situação clínica que acometia crianças
com sintomas pulmonares, hepatomegalia e eosinofilia
persistente, decorrentes do processo migratório da larva de
Toxocara canis pelos diversos órgãos. Em 1969, o autor
restringiu a denominação da SLMV, mais propriamente para
situações decorrentes à infecção parasitária, desencadeada
pela migração e persistências de larvas de nematódeos
por período prolongado em tecidos de humanos, onde as
mesmas permanecem imaturas e não completam seu ciclo
biológico (Beaver et al., 1969).
O Toxocara canis é um representante do filo
Nematoda, que possui como hospedeiro definitivo os cães
e o Toxocara cati os gatos. A toxocaríase é transmitida a
esses animais pela ingestão de ovos infectantes presentes
no solo ou alimentos contaminados; pela ingestão de larvas
infectantes em tecidos de animais que funcionam como
hospedeiros paratênicos; pela migração transplacentária;
passagem da larva através do leite na lactação dos filhotes
e ingestão de larvas no estágio tardio (L4) ou adultos
imaturos (L5) presentes nos vômitos e fezes de filhotes
contaminados (Glickman & Schantz, 1981).
O homem é um hospedeiro paratênico do
Toxocara canis e se contamina pela ingestão acidental de
ovos larvados encontrados no meio ambiente. Estes, uma
vez ingeridos, resultam na liberação das larvas infectantes
no intestino delgado, as quais atravessam a mucosa
intestinal e pela via linfática atingem a circulação porta
e o fígado. Do fígado dirigem-se aos pulmões, por meio
da circulação sanguínea. Além disso, ocorre penetração
ativa das larvas na parede do intestino dando início a um
processo de migração errática que faz com que as larvas
continuem, através dos tecidos do hospedeiro, migrando
até se encistarem em algum tecido e/ou morrerem. Durante
o processo de migração, as larvas de T. canis induzem
Palavras-chave: Toxocara canis. SLMV. Eosinofilia.
Bioterápico.
Autor correspondente: Luciana Camillo, Universidade Federal de São
Carlos, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de
Morfologia e Patologia, Rod. Washington Luis, km 235; caixa postal 676.
São Carlos, SP. E-mail: [email protected]; [email protected]
Inibição de eosinófilos durante a SLMV
uma síndrome característica, denominada de Síndrome da
Larva Migrans Visceral (SLMV) (Beaver et al., 1952). Em
hospedeiros não habituais como o homem, as larvas não
sofrem ecdises e nem crescem, mas permanecem vivas
durante semanas ou até meses, porém não completam o
ciclo. Em primatas infectados experimentalmente, já foi
observado que larvas de T. canis permanecem vivas nos
tecidos por um período de dez anos (Neves et al., 2005).
O grau de infecção parasitária, o estado nutricional do
hospedeiro, a intensidade da resposta inflamatória, a
localização tecidual das larvas e a sensibilização do
hospedeiro por antígenos próprios das larvas, são fatores
considerados determinantes na gravidade com que a
SLMV pode acometer os seres humanos. Estes fatores
podem ou não estar associados, os quais podem favorecer
os indivíduos a apresentarem desde a forma assintomática
até as manifestações clássicas da síndrome. Os sintomas
mais frequentes são hepatomegalia, dor abdominal, febre,
diminuição do apetite, agitação, manifestações pulmonares
diversas como tosse e chiado no peito (Jacob et al., 2000;
Magnaval et al., 2001; Figueiredo et al., 2005), e ainda,
quadros de anemia, asma e rinite (Figueiredo et al., 2005).
Alterações cutâneas mais comumente associadas à SLMV
são os quadros urticariformes e exantema nodular, podendo
ser encontrado também quadro purpúrico (Jacob & Oselka,
1991).
A lesão típica produzida pelas larvas de Toxocara
canis é o granuloma alérgico, sendo encontrado
principalmente no fígado e pulmões de indivíduos
infectados. No centro destes, encontra-se a larva do
parasito, bem como tecido necrótico, com degeneração
fibróide, cercados por eosinófilos e monócitos. Os órgãos
mais afetados, por ordem de frequência, são o fígado, os
pulmões, o cérebro, os olhos e os gânglios (Rey, 2001;
Brown, 1977). Pode ocorrer ainda, comprometimento do
sistema nervoso central com crises convulsivas focais ou
generalizadas, distúrbio do comportamento e aumento de
eosinófilos no líquor cefalorraquidiano. Outros sintomas
evidenciados são miocardite, artrite, miosite, pleurite,
meningite, dor abdominal e vários sintomas alérgicos,
sendo muitas vezes decorrentes da resposta imunológica
exacerbada (Dao & Virmani, 1986; Bruart et al., 1987;
Bethel, 1988; Rey, 1991; Chieffi, 1987).
Resposta imune à Toxocara canis
O acometimento de um organismo pelo parasita
T. canis desencadeia um processo inflamatório em seu
hospedeiro. É caracterizada pelo aumento do fluxo
sanguíneo e da permeabilidade vascular, causados devido
à migração de células inflamatórias como linfócitos,
eosinófilos, macrófagos e neutrófilos (Abbas et al., 1997).
Durante o processo de inflamação, células locais ou o
plasma favorecem diferentes mediadores, os quais podem
ser ampliados ou modificados por mediadores liberados
pelas células inflamatórias que migraram ao local da
inflamação (Benjamini et al., 2002).
702
Infecções
helmínticas
envolvem
diversos
mecanismos de defesa devido ao tamanho e à diversidade
metabólica dos parasitos, que são antigenicamente
complexos (Machado et al., 2003). A elevada prevalência
relatada na população mundial demonstra que os
helmintos estão envolvidos com sofisticados mecanismos
moleculares, de escape, invasão e supressão do sistema
imune do hospedeiro (Maizels et al., 1984).
A larva de Toxocara canis apresenta certa
habilidade em sobreviver em seu hospedeiro por muitos
meses, ocasionando a estimulação de linfócitos T helper 2
(Th2) e consequentemente a produção de IgE e eosinofilia
por longos períodos (Buijs et al., 1997). Estudos têm
demonstrado que os antígenos liberados pelas larvas de
T. canis, parecem ser importantes na evasão do sistema
imune pelo parasito (Hallack & Cunha, 1996; Altcheh et
al., 2003). Na fase de migração as larvas liberam produtos
metabolicamente ativos e antigênicos denominados
antígenos de secreção-excreção (TES), estes constituem
uma mistura de proteínas glicosiladas com proteases. Estas
por sua vez, contribuem para que as larvas sejam recobertas
por uma espécie de cápsula de colágeno, favorecendo
um elaborado mecanismo de escape contra a reação do
hospedeiro (Hallack & Cunha, 1996; Altech et al., 2003,
Despommier, 2003). Verifica-se também, a presença
de uma fração alergênica responsável pela estimulação
de eosinófilos, o que explica a eosinofilia persistente,
característica dessa infecção. À medida que a infecção
evolui, há a organização das células inflamatórias ao redor
das larvas e seus metabólitos, constituindo assim, uma
reação granulomatosa, caracterizada por centro necrótico
contendo a larva, e circundado por células multinucleadas,
neutrófilos, monócitos e por grande número de eosinófilos.
(Hallack & Cunha, 2005).
A superfície do T. canis é reconhecida como uma
estrutura dinâmica que se modifica completa e rapidamente,
funcionando como nova fonte para altas concentrações de
antígenos. Com isto, a maior resposta do hospedeiro aos
antígenos inclui eosinofilia marcante e hiperglobulinemia
(Kayes, 1984; Rayes & Lambertucci, 1999). A eosinofilia
encontrada em pacientes com SLMV pode estar envolvida
tanto no mecanismo de defesa do hospedeiro contra o
parasita, como na reação inflamatória tecidual. O mecanismo
pelo qual os eosinófilos lesam ou matam nematódeos, pode
depender da deposição de grânulos na superfície larvária.
Nesse mecanismo, os antígenos de secreção e excreção
(TES) podem representar fatores importantes na aderência
de eosinófilos à superfície larvária (Jacob & Oselka, 1991).
Sendo assim, as manifestações clínicas e patológicas da
SLMV são resultantes do dano tecidual direto causado
pela migração larvária ou pela ação de seus metabólitos
somados à resposta inflamatória gerada pelo hospedeiro
(Beaver et al., 1952).
Tratamanto com bioterápico
Os bioterápicos são, segundo a Farmacopeia
Homeopática Brasileira, preparações medicamentosas, de
Rev Ciênc Farm Básica Apl., 2014;35(4):701-708
Inibição de eosinófilos durante a SLMV
uso homeopático, obtidas a partir de produtos biológicos,
quimicamente indefinidos: secreções, excreções, tecidos e
órgãos, patológicos ou não, produtos de origem microbiana
e alérgenos (Brasil, 1997). Com outras palavras, o Manual
de Normas Técnicas descreve os bioterápicos como
sendo produtos não quimicamente definidos que servem
de matéria-prima para preparações bioterápicas de uso
homeopático (Manual de Normas Técnicas, 2003).
Os bioterápicos são considerados medicamentos
homeopáticos por serem preparados de acordo com
a farmacotécnica homeopática, sofrendo diluição e
dinamização. Entretanto, o método é chamado de Isoterapia
ou Isopatia, visto que não segue a Leis dos Semelhantes,
mas a Lei dos Iguais. Na Isopatia, é empregado o próprio
agente etiológico, visando uma reação terapêutica. Nos
modelos de isopatia, deve haver uma identidade estrita
entre a substância diluída e a substância tóxica desafiante
(Almeida, 2008).
Para as preparações das formas farmacêuticas
derivadas, a farmacotécnica homeopática emprega três
escalas, de acordo com a proporção entre os insumos ativos
e inertes: a decimal, a centesimal e a cinquenta milesimal
(Brasil, 1997). Essa escala foi criada por Hahnemann e seus
símbolos são C, ª, nenhuma indicação ou CH [Centesimal
Hahnemanniana] (Fontes, 2005). Para a homeopatia,
quanto mais diluído, mais eficaz é o medicamento, uma vez
que a diluição seguida de sucussão, ou seja, a dinamização
é a responsável pelo aumento da força medicamentosa da
substância (César, 2003).
A literatura é escassa em trabalhos que demonstrem
os efeitos benéficos da bioterapia no tratamento de doenças
infecciosas, principalmente nas parasitoses. Atualmente
encontramos menos de duas centenas de artigos relacionados
ao tratamento bioterápico e destes, menos de vinte evidenciam
o seu uso em doenças causadas por parasitas. Dentre os
trabalhos encontrados nenhum relata o uso de bioterápico
para o controle da eosinofilia persistente durante a SLMV.
Neste sentido, avaliamos se o bioterápico produzido a partir
de ovos e lavas de T. canis apresenta efeito imunomodulador
durante a infecção por T. canis, uma vez que, a busca por
alternativas que modulem e favoreçam a diminuição dos
efeitos de processos crônicos, principalmente modulando
a eosinofilia persistente, é de grande valia no controle de
diversas desordens inflamatórias.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem
Swiss, pesando entre 15 e 18 gramas provenientes do
Biotério Central da Universidade Federal de São Carlos
- UFSCar. Os animais foram divididos em 4 grupos,
contendo 7 animais/grupo: Controle (não infectados e não
tratados), Infectado com T. canis (Tc), Tratado (infectados
e posteriormente tratados com o bioterápico) e Imunizado
(tratados com o bioterápico e posteriormente infectados),
em dois experimentos independentes.
Rev Ciênc Farm Básica Apl., 2014;35(4):701-708
Obtenção dos ovos larvados de T. canis
Os ovos foram obtidos de fêmeas do parasito
recuperadas de cães jovens através da administração de
óleo mineral (4mL) com cloridrato de piperazina (100 mg/
kg). Os cães doadores foram oriundos do recolhimento
rotineiro do Centro de Zoonoses de Municipal Ribeirão
Preto, SP. As fêmeas dos parasitos recuperadas foram
dissecadas para extração de seus úteros, os quais foram
divulsionados em placas de Petri, contendo formalina 2%.
O material foi filtrado em gaze para obtenção dos ovos e
armazenado em solução de formalina em placas de Petri,
deixados à temperatura ambiente até alcançarem o estádio
infectante (L3) (Gomes de Moraes, 1971).
Preparação do Bioterápico
Os ovos mantidos em formalina foram lavados com
PBS 1 X por 3 vezes e centrifugados a 1500 rpm durante
3 minutos. Esse extrato total de T. canis foi utilizado como
solução bruta para a produção do bioterápico que foi feito
sob a supervisão da professora Dra. Rosa Domingues
Ribeiro de acordo com protocolo já padronizado. A
técnica utilizada consiste em colocar o extrato contendo
ovos e larvas de Toxocara canis (10%) em maceração
usando solução hidroalcoólica 70% durante 06 horas.
Posteriormente o material foi filtrado para obtenção da
Solução Mãe. Logo após foram realizadas sucessivas
diluições (1/100) em álcool 70% até a obtenção de uma
solução 14CH. Em seguida, diluiu-se a 1/100 em solução
hidroalcoólica 30% para obtenção da solução 15CH.
Infecção dos camundongos com ovos de T. canis
Os camundongos foram infectados com ovos
contendo larvas (L3) de T. canis por via oral (gavagem)
com 500 ovos/0,5 mL salina, empregando-se cânulas
apropriadas.
Tratamento dos camundongos
Os grupos experimentais foram organizados de
forma a ter um grupo controle sem infecção, sem tratamento
e sem imunização; um grupo apenas infectado com 500
ovos/animal de T. canis. Os camundongos imunizados
receberam 4 doses diárias do bioterápico, sendo 5 gotas em
cada dose, durante 10 dias. Após esses 10 dias, foi feito
um intervalo de 7 dias e a infecção (desafio) foi realizada.
O grupo que recebeu o tratamento foi infectado e 1 hora
depois iniciou a administração do bioterápico. O tratamento
foi realizado de forma que 4 doses diárias de 5 gotas
foram administradas durante 18 dias. Após esse período
os animais foram eutanasiados, as amostras coletadas e as
análises foram realizadas.
Obtenção das células do lavado broncoalveolar
(LBA), peritoneal (LCP) e do sangue
No tempo 18 dias após de infecção, os animais
foram eutanasiados. As técnicas de lavagem broncoalveolar
e peritoneal foram utilizadas para recuperação de células
da cavidade pulmonar (LBA) e peritoneal (LCP). Para
703
Inibição de eosinófilos durante a SLMV
obtenção do LBA utilizou-se 1,0 mL de solução salina
tamponada (PBS), contendo 0,5% de citrato de sódio (PBS/
Citrato) empregando cânulas de polietileno introduzidas
na parte superior da traquéia, o procedimento foi repetido
duas vezes, totalizando um volume final de 2 mL. Para o
lavado da cavidade peritoneal (LCP) foi utilizado 2 mL
de PBS, contendo 0,5% de citrato de sódio (PBS/Citrato),
empregando uma agulha intraperitonealmente. O sangue foi
obtido após sangria total dos animais por punção cardíaca,
com auxílio de uma seringa contendo Heparina.
Contagem diferencial e total de células do lavado
broncoalveolar (LBA), peritoneal (LCP) e do sangue
A contagem diferencial foi feita nos esfregaços
sanguíneos e em lâminas preparadas em citocentrífuga
(LBA e LCP) (Serocito Mod. 2400-Fanem). A coloração
foi feita com o corante Panótico-Laborclin. Em cada lâmina
foram contadas 100 células, utilizando microscopia de luz
com aumento final de 1000x. O número total de células/
mm³ nos diferentes compartimentos foi determinado
empregando solução de Turk (Violeta de Genciana 0.002
g, Ácido Acético 3%) para a lise das hemáceas, na diluição
1:20 e posteriormente foram realizadas as contagens em
câmara de Neubauer.
Análise Estatística
Os gráficos foram dispostos no programa GraphPad
Prism, onde os grupos foram comparados quanto ao perfil
de células inflamatórias nos diferentes compartimentos
estudados. As análises foram dispostas em resultados
expressos com média ± EPM. Os resultados obtidos nos
diferentes experimentos foram submetidos ao método de
análise de variância Two-ANOVA. Para análise estatística
foi utilizado o programa GraphPad Instat (San Diego,
Califórnia, USA). A significância estatística foi estabelecida
em valores de p<0,05.
RESULTADOS
Avaliação do perfil celular durante a infecção por T.
canis após a imunização e o tratamento com o bioterápico
A contagem total e diferencial de células por mm³
foi determinada no período de 18 dias após a infecção por
T. canis no sangue, lavado da cavidade peritoneal (LCP)
e lavado broncoalveolar (LBA). O objetivo foi avaliar a
resposta celular à infecção, nos diferentes compartimentos,
em animais tratados ou não com o bioterápico e em animais
imunizados por ele, analisando o recrutamento celular e
classificando os tipos celulares envolvidos na resposta
imune celular contra a infecção, em células mononucleares
e eosinófilos após o tratamento ou não, e após a imunização.
Efeito do bioterápico no número de células no
sangue de animais infectados com T. canis
A figura 1 representa a contagem total e diferencial
de leucócitos no sangue de camundongos dos grupos
Controle (C), Infectado (Tc), Imunizado (Im+Tc) e Tratado
704
Rev Ciênc Farm Básica Apl., 2014;35(4):701-708
Inibição de eosinófilos durante a SLMV
(Tc+Bio). Foi observado nesses animais que, houve
significativo aumento de células totais (1A), eosinófilos
(1B) e células mononucleares (1C) nos animais do grupo
Tc em relação ao grupo C. Observamos também diminuição
significativa no número de células totais (1A), eosinófilos
(1B) e células mononucleares (1C) nos grupos Im+Tc e
Tc+Bio quando comparados somente ao grupo Tc.
Efeito do bioterápico no recrutamento de células
inflamatórias para a cavidade peritoneal de animais
infectados com T. canis
A figura 2 representa o perfil das células inflamatórias
recuperadas do lavado da cavidade peritoneal (LCP) de
animais pertencentes aos diferentes grupos experimentais.
Nossos dados mostram que houve significativo
aumento de células totais (2A), de eosinófilos (2B) e de
células mononucleares (2C) nos animais do grupo Tc
quando comparados ao grupo C. A imunização com o
bioterápico favoreceu diminuição significativa no número
de células totais (2A) e eosinófilos (2B) nos animais dos
grupos Im+Tc e Tc+Bio quando comparados ao grupo Tc.
Os animais que receberam tratamento com o bioterápico
apresentaram apenas diminuição no número de células
totais (2A) e eosinófilos (2B) , mas não foi observado
diferença significativa no número de células mononucleares
em relação ao grupo Tc (2C).
Efeito do bioterápico no recrutamento de células
inflamatórias para espaço broncoalveolar (LBA) de
animais infectados com T. canis
A figura 3 representa o perfil das células inflamatórias
recuperadas do lavado broncoalveolar (LBA) de animais
pertencentes aos diferentes grupos experimentais. Nesse
compartimento, observou-se significativo aumento de
células totais (3A), de eosinófilos (3B) e de células
mononucleares (3C) nos animais do grupo infectado em
relação aos animais do grupo controle. Observa-se também,
diminuição significativa no número de células totais (3A),
eosinófilos (3B) e células mononucleares (3C) nos grupos
Im+Tc e Tc+Bio quando comparados ao grupo infectado no
espaço alveolar desses animais.
DISCUSSÃO
A Síndrome da Larva Migrans Visceral (SLMV)
é considerada uma infecção helmíntica de distribuição
mundial, acometendo indivíduos em países em
desenvolvimento, incluindo o Brasil. A infecção por T.
canis, em diferentes organismos, promove uma reação
inflamatória sistêmica, caracterizada por eosinofilia
marcante e disseminada (Beaver et al., 1952; Faccioli et
al., 1996; Anibal et al., 2007).
A participação dos eosinófilos como células efetoras
na destruição do parasito é dada principalmente pela
ação tóxica de seus grânulos citoplasmáticos (Moqbel &
Lacy, 1999), sendo esta função importante para danificar
organismos não fagocitáveis, como por exemplo, os
Rev Ciênc Farm Básica Apl., 2014;35(4):701-708
helmintos em fase de migração tecidual (larvas) (Jacob,
2000). Uma grande variedade de distúrbios está associada
com eosinofilia (Mendes et al., 2000; Wardlaw, 1994),
no entanto, em nosso meio, esse aumento encontra-se
relacionado principalmente com as helmintíases intestinais,
bem como, com os processos alérgicos e a asma. Neste
contexto, a busca de novas terapias que possam minimizar
estes sintomas torna-se importante.
A busca por alternativas menos convencionais no
tratamento de doenças vem ganhando espaço na medicina
contemporânea. E estudos onde há possibilidade de
entendimento no âmbito da resposta do hospedeiro frente
a patógenos parasitas vêm sendo uma linha de pesquisa
de nosso grupo. Os primeiros relatos da utilização de
bioterápicos ocorreram em 1676, sendo que nestes estudos,
Robert Fludd preparou o bioterápico a partir do escarro
tuberculoso visando o tratamento da tuberculose (Labre,
2001). Outros dados da literatura revelam poucos estudos
que utilizaram bioterápicos feitos a partir de alguns
causadores de doenças parasitárias: como o Trypanosoma
cruzi (Ribero et al. 1983) e Brucella melitensis (Almeida,
1997). Berchieri e colaboradores utilizaram bioterápicos
a partir da bactéria Salmonella enteritidis, a qual é
responsável por infecções em aves e está também associada
à salmonelose humana (Berchieri et al.,2006). No entanto,
não foram encontrados estudos que demonstrassem os
705
Inibição de eosinófilos durante a SLMV
efeitos de bioterápicos durante infecções helmínticas,
principalmente aquelas causadas por nematoides, como o
Toxocara canis.
Outros estudos mostraram a importância de realizar
novas investigações sobre a eficácia de bioterápicos
preparados a partir de agentes infecciosos e agentes
parasitários no processo de imunização, visto que alguns
profissionais da saúde têm adequado algumas vacinas
pelos mesmos (Neill, 1993). Visando essa compreensão,
nosso modelo experimental, através da resposta imune
celular pode contribuir com resposta ao tratamento
com bioterápico a partir de ovos de T. canis, buscamos
duas alternativas de estudo. A primeira em que animais
receberam o bioterápico, sem previa infecção e é
desafiado com o parasita, e a outra, em que animais após
serem infectados recebem o bioterápico como opção de
tratamento, buscando avaliar se esse tratamento favorece
a modulação eosinofílica durante a infecção. Objetivando
avaliar a resposta celular frente à migração das larvas
de T. canis, nos diferentes compartimentos estudados,
observando o recrutamento celular e classificando os tipos
celulares envolvidos na resposta imune celular contra a
infecção, estudamos duas opções de uso para bioterápicos
na SLMV. Nossos dados referentes ao número de células
totais e células mononucleares demonstraram aumento
destes tipos celulares, em animais infectados e sem
tratamento/imunização, quando comparados a animais
controles (figuras 1, 2 e 3), dados esses que corroboram que
outros autores (Beaver et al., 1952; Faccioli et al., 1996;
Anibal et al., 2007).
Estudos recentes de nosso grupo demonstram que
no 18º dia após infecção com T. canis, há um aumento
significativo no número de células totais e células
mononucleares no sangue, no espaço broncoalveolar e na
cavidade peritoneal de animais infectados com T. canis
(Oliveira et al., 2013, Rodolpho et al., 2013) e (Oliveira
et al., 2013, Rodolpho et al., 2013). Carlos et al., 2011
também observaram aumento de células mononucleares
na cavidade peritoneal de animais infectado com T.
canis, corroborando com nossos achados. Neste contexto,
assim como Anibal, (2007), podemos sugerir que existem
diferentes populações de células residentes ou recrutadas
para o espaço broncoalveolar e para a cavidade peritoneal,
além dos eosinófilos característicos dessa síndrome. Esse
perfil celular diverso favorece eventos e proporcionam
a liberação de diferentes mediadores envolvidos nesse
recrutamento como citocinas, quimiocinas e mediadores
lipídicos, como leucotrienos, pelas células presentes nesse
processo. Assim, foi determinante para nosso estudo a
avaliação do 18º dia após infecção em que ocorrem os
principais eventos durante a resposta inflamatória induzida
pelo T. canis.
O intenso processo inflamatório é característico de
diversas patologias associadas às doenças parasitárias,
como SLMV (Beaver et al., 1952), esquistossomose
mansônica (Cheever et al., 2002), ascaridiose (Rey,
2001) dentre outros. E a principal célula envolvida na
706
fisiopatogênese dessas doenças é o eosinófilo. A infecção
por T. canis, em diferentes organismos, promove uma
reação inflamatória sistêmica, caracterizada por intenso
infiltrado de eosinófilos (Beaver et al., 1952; Faccioli
et al., 1996; Anibal et al., 2007), tendo estas células
importante participação na destruição organismos não
fagocitáveis, como por exemplo, os helmintos em fase de
migração tecidual (Jacob, 2000). A busca por alternativas
que possibilitem a modulação negativa do acúmulo de
eosinófilos é de grande valia. Estudos demonstraram
que o aumento significativo do número de eosinófilos,
durante a SLMV, atinge seu pico no 18º dia após infecção
(Faccioli et al., 1996; Anibal et al., 2007; Oliveira et al.,
2013). Em nosso estudo, os dados referentes ao número
de eosinófilos também demonstraram aumento deste
tipo celular, em animais apenas infectados com T. canis
nos diferentes compartimentos analisados (Figura 1B,
2B e 3B). Deste modo, nossos resultados corroboram
com estudos, os quais demonstraram o aumento de
eosinófilos durante a SLMV em diferentes modelos
como cobaias (Faccioli et al., 1996), camundongos de
diferentes linhagens como C57BL/6 (Takamoto et al.,
1998) e Balb/c (Anibal et al., 2007; Oliveira et al., 2013;
Rodolpho, et al., 2013).
A prévia estimulação do sistema imunológico
muitas vezes favorece uma resposta mais rápida e
adequada aos tratamentos de diferentes doenças. Por isso,
nesse estudo foi importante avaliar além do tratamento pós
infecção, os efeitos da imunização utilizando o bioterápico
preparados a partir de ovos e larvas de T. canis, o que faz
deste estudo inédito na literatura para terapia alternativa
da SLMV. Em relação aos procedimentos relacionados
à imunização e ao tratamento com o bioterápico,
verificamos que houve uma redução significativa no
número de eosinófilos no 18° dia após a infecção nos
diferentes compartimentos, ou seja, sangue, LCP e LBA
(figuras 1B, 2B e 3B). A migração de eosinófilos para os
diferentes tecidos é dependente de uma gama de fatores,
como moléculas de adesão, citocinas, leucotrienos, entre
outros (Anibal et al., 2007). Neste sentido, de acordo com
os dados analisados, podemos sugerir que a administração
do bioterápico promoveu efeito imunomodulador,
associado à administração prévia e/ou tratamento com
o bioterápico neste modelo. Ressaltamos, porém, que
outras análises, como a quantificação de citocinas, devem
ser realizadas para melhor compreender estes resultados.
Dessa forma, sugerimos que o tratamento e a imunização
com o bioterápico produzido a partir de ovos e larvas
de T. canis parecem interferir na ativação da resposta
celular em camundongos da linhagem Swiss, reduzindo
significativamente o número de células inflamatórias
no sangue, espaço broncoalveolar e cavidade peritoneal
(Figuras 1, 2 e 3) nesse modelo experimental. No entanto,
essa inibição ocorre por vias ainda não conhecidas.
Dessa forma, este estudo sugere que o uso do bioterápico
apresenta um efeito com ação imunomodulatória durante
a Síndrome da Larva Migrans Visceral experimental.
Rev Ciênc Farm Básica Apl., 2014;35(4):701-708
Inibição de eosinófilos durante a SLMV
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Centro de Zoonoses da Prefeitura
Municipal de Ribeirão Preto pela doação dos vermes
adultos do parasito Toxocara canis.
ABSTRACT
Biotherapic effect in eosinophilia during experimental
VLMS
Almeida CMC. Nosódios: Uma revisão crítica. 1997.
Trabalho de conclusão de curso (Especialização) - Instituto
Hahnemanniano do Brasil, 1997.
Almeida RL. Campos MC, Herrera HM, Bonamin LV,
Fonseca AH. Effects of homeopathy in mice experimentally
infected with Trypanosoma cruzi. Homeopathy.
2008;97(2):65-9.
Anibal FF, et al. Impact of MK886 on eosinophil counts
and phenotypic features in toxocariasis. Scand J Immunol.
2007;65(4):344-52.
The Toxocara canis (Tc) is a parasite that belongs to the
nematode phylum and has dogs as definitive host. The
men can be accidentally contaminated by ingesting eggs
containing infective larvae of the parasite. These larvae,
when ingested, pass through the intestinal mucosa,
reach the portal circulation and migrate through
different tissues of the host. During this process,
excretory-secretory antigens (TES) are released
causing an intense inflammatory reaction, the Th2 type,
characterizing the syndrome, called Visceral Larva
migrans (VLMS). The main features of this chronic
disease are blood and tissue eosinophilias. Thus, it is
important to search for therapies that may contribute
to the reduction of inflammatory conditions with intense
eosinophilia. In this study, we investigated the use of a
biotherapic produced from the antigenic extract from
eggs and larvae (Tc) and its effect on the recruitment
of total leukocyte, mononuclear cells and eosinophils
in blood, bronchoalveolar space and peritoneal cavity
of mice infected with (Tc). Female mice (Swiss) were
used divided in three groups: control (C), Infected (Tc)
Immunized (Im + Tc) and Treaty (Tc + Bio). The animals
Tc, Im + Tc and Tc + Bio received 500 eggs / animal
by gavage. Subsequently, the animals were euthanized
on day 18 after infection and the number of cells in the
compartments was determined. Our results showed
that, Im + Tc, as in Tc + Bio had reduced these cells in
compartments analyzed compared to Tc group. Thus, it
was suggested that the biotherapy negatively modulated
the recruitment of inflammatory cells, particularly
eosinophils in blood, lung and intestine demonstrating
an anti-inflammatory potential of the biotherapic in the
experimental VLMS.
Keywords: Eosinophils. Biotherapic. VLMS. Toxocara
canis.
Altcheh J, Nallar M, Conca M, Biancardi M, Freilij H.
Toxocariasis: aspectos clínicos y de laboratorio em 54
pacientes. Ana Pediatria. 2003;58:425-31.
REFERÊNCIAS
Cheever AW, Lenzi JA, Lenzi HL, Andrade ZA.
Experimental Models of Schistosoma mansoni Infection.
Mem Inst Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro. 2002;97:917-40.
Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS. Effector mechanisms
of immune response. JN: - Cellular and molecular
Immunology. Third edition, United States of America: W.
B. Saunders Company, 1997.
Abe Jacob CM, Oselka GW. Toxocaríase na infância.
Pediatria. 1991;13:48-55.
Rev Ciênc Farm Básica Apl., 2014;35(4):701-708
Associação Brasileira de Farmacêuticos Homeopatas.
Manual de normas técnicas para farmácia homeopática. 3.
ed. São Paulo; 2003.
Beaver P, Snyder H, Carrera G, Dent J, Lafferty J. Chronic
eosinophilia due to visceral larvae migrans. Pediatrics,
1952;9(1):7-19.
Beaver PC. Nature of visceral larva migrans. J Parasitol.
1969;55(1):3-12.
Benjamini E, Coico R, Sunshine G. Imunologia. 4.ed. Rio
de Janeiro: Guanabara Koogan; 2002.
Berchieri A. et al. Evaluation of isopathic treatment of
Salmonella enteritidis in poultry. Homeopathy. 2006;
95:94-7.
Bethel RG. Arthritis and arthralgia associated with
toxocaral infestation. Br. Med J (Clin Res), 1988;283:729.
Brasil. Ministério da Saúde. Farmacopéia Homeopática
Brasileira. 2 ed. Parte I, São Paulo: Atheneu Editora, 1997.
Brown HW. Parasitologia Clínica. 4. ed. Rio de Janeiro:
Interamericana; 1977.
Bruart J, Remacle P, Henneghien C, Jonckheer J. Pleural
effusion and Toxocara canis. Rev Mal Resp. 1987;4(1):35-7.
Buijs J, Borsboom G, Rentig M, Hilgersom WJA,
Vanwueringen JC, Jansen G, et al. Relationship between
allergic manifestations and Toxocara seropositivity: A
cross-sectional study among elementary school children.
Eur Respir J. 1997;10(7):1467-75.
César AT. Dinamização. Cultura Homeopática. 2003;5:25-41.
Chieffi PP. Síndrome de larva migrans visceral: aspectos
biológicos e clínico epidemiológicos. Rev Soc Bras Med
Trop, 1987;20(Sup I):166-7.
Dao AH, Virmani RV. Visceral larva migrans involving the
myocardium: report of two cases and review of literature.
Pathol Pediatr. 1986;6(4):449-56.
707
Inibição de eosinófilos durante a SLMV
Carlos D, Machado ER, de Paula L, Sá-Nunes A, Sorgi CA,
Jamur MC, Oliver C, Lima WT, Faccioli LH. Evidence for
eosinophil recruitment, leukotriene B4 production and
mast cell hyperplasia following Toxocara canis infection in
rats. Braz J Med Biol Res. 2011;44(4):319-326.
Moqbel R, Lacy P. Exocytotic events in eosinophils and
mast cells. Clin Exp Allergy. 1999;29:1017-22.
Despommier D. Toxocariasis: Clinical aspects,
epidemiology, medical ecology, and molecular aspects.
Clin Microbiol Rev. 2003;16(2):265-72.
Neill H. Homeopathic nosodes. Vet Record. 1993;133(2):48.
Faccioli LH, et al. IL-5 drives eosinophils from bone
marrow to blood and tissues in a Visceral Larva Migrans
Syndrome. Mediators Inflamm. 1996;5(1):24-9.
Figueiredo S, Taddei J, Menezes J, Novo N, Silva E,
Cristóvão H, et al. Clinical-epidemiological study of
toxocariasis in a pediatric population. J Pediatr (Rio J).
2005; 81(2):126-32.
Fontes OL. Farmácia Homeopática: Teoria e Prática. 2 ed.
São Paulo: Manole, 2005.
Glickman LT, Schantz PM. Epidemiology and pathogenesis
of zoonotic toxocariasis. Epidemiol Rev. 1981;3:230-50.
Gomes de Moraes, R. Parasitologia Médica. São Paulo:
Ateneu; 1971.
Hallack KA, Cunha RMC. Larva migrans visceralis. In:
Veronesi R; Focaccia, R. Tratado de infectologia. São
Paulo: Atheneu; 1996:1429-32.
Kalkofen VP. Hookworms of dogs and cats. Vet Clin North
Am Small Anim Pract, 1987;17:1341-54.
Jacob CMA, Oselka GW. Toxocaríase na infância. Pediatria
(São Paulo). 1991; 13(2):48-55.
Jacob CMA. Síndrome da larva migrans visceral por
Toxocara canis (Toxocaríasis). In: Tonelli E, Freire LMS.
Doenças infecciosas da infância e da adolescência. 2 ed.
Rio de Janeiro: Medsi; 2000:1421-31.
Naveira JB. Aspectos da biologia dos eosinófilos. Rev Bras
Maraliolog Doenças Trop. 1960;12:103-07.
Neves DP. Parasitologia Humana. 11.ed. São Paulo: Editora
Atheneu; 2005.
Oliveira SRP. Avaliação do efeito do extrato etanólico bruto
de Harpagophytum procumbens em camundongos infectados
com Toxocara canis [Dissertação – Mestrado] Programa de
Pós Graduação em Biotecnologia, UFSCar; 2013.
Rayes AA, Lambertucci JR. The association of human
toxocariasis and pyogenic abscesses. Rev Soc Bras Med.
Trop. 1999;32(4):425-38.
Rey L. Parasitologia: Parasitos e Doenças Parasitárias do
Homem nas Américas e na África. 2.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara-Koogan; 1991.
Rey L. Parasitologia. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan; 2001.
Ribeiro RD. et al. Comportamento de tripomastigotas
sanguinolas do Trypanosoma cruzi, inoculados
endovenosamente em camundongos normais e tratados
com bioterápicos. Rev Homeopatia. 1983;157:14-18.
Rodolpho JMA. Avaliação das moléculas Cd 80, CD
86 e MHCII em eosinófilos durante a Síndrome da larva
migrans visceral [Dissertação – Mestrado] Programa de
Pós Graduação em Biotecnologia, UFSCar; 2013.
Takamoto M, Isobe M, Sugane K. The role of ICAM/LFA1 and VCAM-1/VLA-4 inetractions on T helper 2 cytokine
production by lung T cell of Toxocara canis infected mice.
Immunology. 1998;95:419-26.
Kayes SG. Spleen cell response in experimental murine
toxocariasis. J Parasitol. 1984;70(4)522-9.
Wardlaw AJ, Symon FS, Walsh GM. Eosinophil adhesion
in allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol. 1994;
94(6 part 2):1163-72.
Labre P. Homéopathie Vétérinaire chez les Ovins, Bovins et
Caprins. Villeurbanne: Formation et Edition en Médicines
Naturelles Vétérinaires; 2001. 280p.
Recebido em 3 de março de 2013
Machado AB, Achkar ME. Visceral larva migrans: case
report. An Bras Dermatol. 2003;78(2):215-9.
Aceito em 3 de maio de 2013
Magnaval J, Glickman LT, Dorchies P, Morassin B.
Highlights of human toxocariasis. Korean J Parasitol.
2001;39:1-11.
Maizels RM, Savigny D, Ogilvie BM. Characterizarion of
surface and excretory antigens of Toxocara canis infective
larvae. Parasite Immunol. 1984;6:23-37.
Mendes DM, Camargo MF, Aun VV, Fernandes MFM, Aun
WT, de Mello JF. Eosinofilia. Rev Bras Alerg Imunopatol.
2000;23:84-91.
708
Rev Ciênc Farm Básica Apl., 2014;35(4):701-708