CARACTERIZAÇÃO DE UMA PIROFOSFATASE INORGÂNICA
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CARACTERIZAÇÃO DE UMA PIROFOSFATASE INORGÂNICA SOLÚVEL EM EMBRIÕES DO CARRAPATO BOVINO Rhipicephalus microplus EVENILTON PESSOA COSTA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES MARÇO – 2009 ii CARACTERIZAÇÃO DE UMA PIROFOSFATASE INORGÂNICA SOLÚVEL EM EMBRIÕES DO CARRAPATO BOVINO Rhipicephalus microplus EVENILTON PESSOA COSTA “Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual Fluminense, como do parte Norte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências”. ORIENTADOR: Prof. Dr. Carlos Logullo CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ MARÇO – 2009 iii CARACTERIZAÇÃO DE UMA PIROFOSFATASE INORGÂNICA SOLÚVEL EM EMBRIÕES DO CARRAPATO BOVINO Rhipicephalus microplus EVENILTON PESSOA COSTA “Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia Universidade Estadual Fluminense, como do parte da Norte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências”. Defendida em 5 de Março de 2009. Comissão Examinadora: __________________________ Carlos Logullo (Orientador) – Prof. Associado do Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos – UENF. iv __________________________ Jorge H. Fernandez (Co-Orientador) – Prof. Associado do Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos – UENF. __________________________ Anna Okorokova (Examinadora) – Profª. Associada do Laboratório de Fisiologia e Biologia de Microorganismos – UENF. __________________________ Gustavo L. Resende (Examinador) – Pesquisador Visitante do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores – Fiocruz. __________________________ Sergio D. Sasaki (Examinador) – Prof. Adjunto do Centro de Ciências Naturais e Humanas – UFABC. v Dedico esta dissertação a todos aqueles que amam o que fazem! vi AGRADECIMENTOS Aos meus pais, irmão e namorada por participarem e influenciarem positivamente na formação do homem que tenho me tornado. Ao meu orientador, amigo e formador! Pelos conselhos, críticas, incentivos e oportunidades! Muito obrigado Logullo! Ao Eldo, agora doutor! Pela orientação, amizade, conselhos, críticas e por ter aceitado revisar o meu trabalho! Ao prof. Arnoldo! Pela orientação, amizade, sugestões, discussões, críticas e incentivos! Ao prof. Hernandez! Pela orientação, amizade, sugestões, discussões, críticas e incentivos! Ao Gustavo L. Rezende! Pelas discussões, idéias, críticas, sugestões e também por ter aceitado participar da minha banca de dissertação! Ao prof. Sérgio D. Sasaki! Pelas discussões, idéias, críticas, sugestões e também por ter aceitado participar da minha banca de dissertação! A profª. Ana! Pelas discussões, idéias, críticas, sugestões e também por ter aceitado participar da minha banca de dissertação! Ao Jorge Moraes (UFRJ-Macaé), Milane (UFRRJ) e ao Hernandez pelas críticas e sugestões em minha defesa de projeto de mestrado! A todos os estudantes de IC e de Pós-Graduação do nosso grupo que fazem com que tenhamos um ótimo ambiente de trabalho! A todos os estudantes e professores do nosso departamento! Aos amigos da UENF e minha vida pessoal! A todos que contribuíram direta ou indiretamente para o bom andamento deste trabalho! A CAPES (projeto PROCAD) e a FAPERJ (bolsa)! A UENF pelo ótimo ensino! vii SUMÁRIO RESUMO ix ABSTRACT x 1 – INTRODUÇÃO 1 1.1 – O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 1.2 – O ciclo de vida do R. (B.) microplus 1.3 – Ovogênese e embriogênese 1.4 – Aspectos estruturais das pirofosfatases inorgânicas 1.5 – Aspectos funcionais das pirofosfatases inorgânicas 1.6 – Pirofosfatases inorgânicas transmembrana 1.7 – Estado da arte 2 – OBJETIVO 1 2 3 4 6 7 8 9 2.1 – Objetivo Geral 2.2 – Objetivos Específicos 3 – MATERIAL e MÉTODOS 9 9 10 3.1 – Animais 3.2 – Manutenção dos ovos 3.3 – Clonagem e análise da seqüência de cDNA codificante para a RmPPase 3.4 – Enriquecimento da amostra 3.5 – Dosagem de proteína 3.6 – Parâmetros cinéticos 3.7 – Análise da transcrição relativa da RmPPase ao longo da embriogênese e em fêmeas partenóginas e teleóginas 3.8 – Modelagem por homologia da RmPPase 4 – RESULTADOS 10 10 4.1 – Identificação e clonagem da PPase solúvel do R. (B.) microplus 4.2 – Caracterização dos parâmetros cinéticos: atividade pirofosfatásica presente nos embriões do R. (B.) microplus 4.3 – Análise da transcrição relativa da RmPPase durante o desenvolvimento embrionário e em fêmeas adultas do R. (B.) microplus 4.4 – Modelagem por homologia da RmPPase 5 – DISCUSSÃO 14 6 – CONCLUSÕES 38 7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40 8 – ANEXOS 49 viii 10 11 11 11 12 13 14 17 24 26 30 RESUMO O carrapato bovino Rhipicephalus microplus é um parasita hematófago que gera prejuízos econômicos da ordem de bilhões de dólares tanto aos agropecuaristas nacionais quanto aos internacionais. Este trabalho se propôs a caracterizar uma pirofosfatase inorgânica solúvel (PPase) de embriões do carrapato bovino utilizando abordagens bioquímicas, moleculares e computacionais. As PPases são enzimas que catalisam a hidrólise do pirofosfato inorgânico em duas moléculas de ortofosfato. Esta reação sustenta termodinamicamente muitas vias biossintéticas (DNA, RNA, proteínas). A seqüência de nucleotídeos da RmPPase foi confirmada após clonagem, apresentando 100% de identidade com a seqüência disponibilizada pelo TIGR e homóloga com outros modelos experimentais. A RmPPase foi caracterizada por comparação através de alinhamentos múltiplos de sua seqüência de aminoácidos deduzida com outras PPases obtidas no NCBi e no “Protein Data Bank”, bem como pela análise da árvore filogenética e ensaios cinéticos. Nestes ensaios comprovou-se que a RmPPase tem sua atividade crescente durante a 1ª fase da embriogênese, porém no início da 2ª fase diminui, aumentando em seguida e se mantendo estável até próximo a eclosão do embrião. Os dados cinéticos sugerem que o cálcio compete com o magnésio pelo sítio ativo promovendo inibição que pode ser revertida com o aumento da concentração de magnésio. Identificou-se ainda que a RmPPase foi inibida por EDTA e fluoreto exceto 12º e 15º dia (EDTA), 6º e 18º dia (fluoreto). O cálcio promoveu inibição durante toda a 1ª fase da embriogênese, contudo, do início da 2ª fase até o 12º dia a RmPPase foi insensível e no 15º dia teve sua atividade estimulada fortemente. A expressão relativa, analisada por PCR em tempo real, mostrou que o seu RNAm está presente no intestino, corpo gorduroso e ovários das fêmeas parcialmente e completamente engurgitadas, sendo o ovário o órgão que mais expressa esta enzima. Quando se analisou a taxa de transcrição em fêmeas vitelogênicas e não vitelogênicas identificou-se que os ovários de fêmeas vitelogênicas expressam 1,5 vezes mais que as outras. Durante a criação do modelo computacional observou-se que duas cisteínas (Cis83-Cis284) podem estar fazendo ponte dissulfeto e tal característica ainda não foi descrita na literatura para esta classe de enzima. Os dados da modelagem por homologia sugerem ainda que a RmPPase é um membro incomum da família I das pirofosfatases inorgânicas solúveis. ix ABSTRACT The cattle tick Rhipicephalus microplus is a blood sucking ectoparasite that causes economics impairments of order of billion dollars to national and international farmers. The present work proposes to characterize a soluble inorganic pyrophosphatase (PPase) from embryos of the cattle tick using biochemical, molecular and computational approaches. The PPases are enzymes that catalyze the hydrolysis of pyrophosphate in two molecules of orthophosphate. This reaction supports thermodynamically many biosynthetic pathways (DNA, RNA, proteins). The nucleotides sequence of RmPPase was confirmed after cloning, presenting 100% identity with the sequence available on TIGR and homologous with other experimental models. The RmPPase was characterized by comparison through multiple alignments of its deduced amino acid sequence with other PPases from NCBi and Protein Data Bank, as well as by analysis of the phylogenetic tree and kinetic assays. In these assays it was shown that the RmPPase has its activity increasing during the 1st phase of embryogenesis, however in the 2nd phase the activity decreased in the first moment, increasing immediately afterwards and staying stable until close to the hatching of the embryo. The kinetic data suggest that the calcium vie with magnesium by active site promoting inhibition that can be reverted with the increase of magnesium concentration. In addition, it was identified that the RmPPase was inhibited by EDTA and fluoride except 12th and 15th day (EDTA), 6th and 18th (fluoride). The calcium promoted inhibition during all 1st phase of embryogenesis, however, at the beginning of 2nd phase until 12th day the RmPPase was insensitive and in the 15th day its activity was strongly stimulated. The relative expression, analyzed by real-time PCR, showed that its RNAm is present in the midgut, fat body and ovaries of partially and completely engorged females, being the ovary the tissue that most express this enzyme. When the levels of transcription in vitellogenic and non-vitellogenic females were analyzed, the expression in ovary of vitellogenic females was 1.5 times higher than the others. During the creation of a computational model it was observed that two cysteines (Cys83-Cys284) could be making disulphide bridge, where such characteristic has not yet been described in literature for this enzyme class. The data of homology modeling still suggest that RmPPase is an unusual member of pyrophosphatases. x family I of the soluble inorganic 1 1 – Introdução 1.1 – O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus O carrapato é um artrópode ectoparasita obrigatório que infesta um grande número de espécies de vertebrados terrestres. Até o momento foram descritas 866 espécies de carrapatos (Horak et al., 2002). Os carrapatos são vetores mais versáteis que os mosquitos, pelo fato de poderem transmitir uma maior quantidade de organismos patogênicos tais como vírus, fungos, rickettsiae, bactéria e protozoários durante o processo de alimentação (Sonenshine, 1991). O Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Fig. 1-A) é o ectoparasita do bovino de maior importância (econômica, médica e etc...) no hemisfério sul. O R. microplus originou-se provavelmente na Ásia, quando mamíferos e pássaros substituíram, já no período terciário, os répteis como vertebrados dominantes (Hoogstraal, 1985; Rocha, 1999). Adaptou-se perfeitamente ao clima dos países tropicais, onde o calor e a umidade proporcionaram condições favoráveis à sobrevivência e manutenção da espécie (Powel e Reid, 1982; Rocha 1999). Esses artrópodes, ectoparasitos hematófagos, são descritos em três famílias sendo duas principais com o maior número de espécies: a Argasidae e a Ixodidae. Os argasídeos (carrapatos moles) alimentam-se do sangue dos seus hospedeiros, repetidas vezes, abandonando-os em seguida (Sonenshine, 1991). As fêmeas efetuam várias posturas, alternando com a alimentação sangüínea. Cada postura não ultrapassa 150 ovos, sendo um número pequeno, quando comparado aos cerca de 3000 ovos (Fig. 1B) dos ixodídeos (carrapatos duros). Nos ixodídeos (Fig. 1A) a alimentação é prolongada, ingerindo grandes quantidades de sangue, chegando a atingir em até cem vezes a sua massa corporal inicial, devido à ingestão de sangue do hospedeiro vertebrado (Sonenshine, 1991). O sangue é utilizado como única fonte de energia para o desenvolvimento destes carrapatos. Grande parte do alimento é processada, transferida e armazenada nos ovos que apresentam uma cor amarronzada. Esta coloração é devida à vitelina, que em carrapatos é classicamente descrita como uma heme-proteína (Boctor e Kamel, 1976; Rosell e Coons, 1991; James e Oliver Jr, 1997). 2 (A) (B) Figura 1) Carrapato bovino (R. microplus) parasitando o seu hospedeiro em (A). Uma fêmea em seu momento de postura em (B). Foto “A” retirada de http://icb.usp.br/~marcelcp/Imagens/carr7.jpg (disponível on line em 02/2009) e foto “B” retirada de http://www.ufrgs.br/depbiot/201/images/postura.jpg (disponível on line em 02/2009). 1.2 – O ciclo de vida do Rhipicephalus (Boophilus) microplus O R. microplus durante todo o seu ciclo de vida parasita um único hospedeiro, preferencialmente o bovino. Durante sua fase de vida parasitária a teleógina (fêmea ingurgitada, aquela que completou o estágio de alimentação sangüínea) (Fig. 2) se desprende do hospedeiro e procura um local adequado nas pastagens para dar início a postura dos ovos. Ao término da postura a fêmea morre. Os ovos eclodem e dão origem às larvas. Estas sobem as gramíneas e arbustos e ali ficam aguardando a passagem do seu hospedeiro. A larva pode sobreviver até quatro meses (em condições ideais de temperatura e umidade relativa local) sem contato com o hospedeiro. Após se fixar no bovino e alimentar-se de seu sangue (Fig. 2) durante alguns dias, a larva sofre muda da cutícula e se transforma em ninfa, que por sua vez, se ingurgita, sofre ecdise e se diferencia em macho ou fêmea. Após a cópula a fêmea passa para a fase de parcialmente ingurgitada (ou partenógena) e, ao final, como fêmea totalmente ingurgitada desprende-se do hospedeiro. A duração da fase parasitária no bovino é de aproximadamente 21 dias, com um grande aumento de sua massa corpórea nas últimas 24 horas do ingurgitamento. No solo, após um período de descanso, que dura de 1 a 2 dias, a fêmea inicia a postura. Os machos permanecem mais tempo no hospedeiro e podem fecundar outras fêmeas. 3 Figura 2) Esquema representativo do ciclo de vida do Rhipicephalus microplus. Se ciclo de vida é divido em duas fases: A primeira fase é chamada de: fase de vida livre; a segunda fase: fase de vida parasitária, já fixado ao hospedeiro (bovino). Figura retirada de Gonzáles (1974). 1.3 – Ovogênese e embriogênese Durante a ovogênese são armazenadas grandes quantidades de proteínas, lipídeos e glicídeos para o crescimento dos ovócitos. A principal proteína de reserva dos ovos de artrópodes é a vitelina, a qual é derivada de um precursor hemolinfático, a vitelogenina. A vitelogenina é adquirida pelos ovócitos através de endocitose mediada por receptor (Sappington e Raikhel, 1998) e é acumulada em estruturas chamadas grânulos de vitelo e recebe o nome de vitelina (Fagotto, 1990; Yamamoto e Takahashi, 1993; Logullo et al., 1998). Vitelinas de todos os grupos de artrópodes são lipoglicoproteínas fosforiladas de alta massa molecular. No entanto, a mais peculiar característica das vitelinas de carrapatos é a presença de heme associada à proteína, dando aos ovos a sua cor marrom (Boctor e Kamel, 1976; Rosell e Coons, 1991). Assim, além de prover aminoácidos para o embrião, como são classicamente descritas, as vitelinas provavelmente são proteínas de reserva de heme usada para o crescimento de carrapatos (Logullo et al., 2002). O desenvolvimento dos embriões do carrapato bovino se dá de forma semelhante ao da D. melanogaster. Depois da fertilização e da fusão dos núcleos do espermatozóide e do óvulo, o núcleo do zigoto passa por uma série de rápidas divisões mitóticas, ao contrário da maioria dos embriões de animais, não há clivagem do citoplasma. O resultado é um sincício no qual muitos núcleos estão 4 presentes em um citoplasma comum. O embrião essencialmente permanece como uma única célula durante o seu desenvolvimento inicial (Wolpert et al., 2000). Nosso grupo mostrou os momentos morfológicos mais marcantes na embriogênese do R. microplus, como a formação de um blastoderma sincicial no terceiro dia (Fig. 3C), do blastoderma celular no quinto dia (Fig. 3D) e a completa segmentação do embrião no sétimo dia do desenvolvimento (Fig. 3F) (Campos et al., 2006). Figura 3) Morfologia dos embriões do R. microplus. Ovos permeabilizados com diferentes dias de ovoposição foram submetidos à microscopia confocal a laser. (A) Sem marcação (somente auto-fluorescência); (B-F) Marcação com laranja de acridina; (E) Marcação com azul de Evans. (A, D, E) 6 dias; (B) 1 dia; (C) 4 dias; (F) embrião de 7 dias. Uma projeção em preto e branco de uma reconstrução tridimensional de um embrião segmentado é mostrado no painel “F”. Note que somente o córion é auto-fluorescente (painel “A”). A marcação com laranja de acridina e azul de Evans mostram: o núcleo e a célula, respectivamente. 1.4 – Aspectos estruturais das pirofosfatases inorgânicas A pirofosfatase inorgânica solúvel (PPase, EC 3.6.1.1) catalisa a hidrólise do pirofosfato inorgânico (PPi) a ortofosfato (Pi) (Fig. 4). Isso é essencial para a vida (Chen et al., 1990; Lundin et al., 1991; Sonnewald, 1992), impulsionando termodinamicamente diversas reações de biossíntese (Kornberg, 1962). Duas famílias de PPases não-homólogas são conhecidas até o momento. A família I é comumente encontrada em todos os tipos de organismos e a família II, sendo encontradas até o momento somente em procariotos (Bacillus subtilis). As duas famílias compartilham uma pequena identidade seqüencial entre si (Young et al., 1998; Shintani et al., 1998). As PPases solúveis mais estudadas são a hexamérica 5 de Escherichia coli e a dimérica de Saccharomyces cerevisiae. Estas enzimas tem sido extensivamente caracterizadas por cristalografia de raios-X (Kankare et al., 1994; Heikinheimo et al., 1996; Harutyunyan et al., 1996; Harutyunyan et al., 1997), mutações sítio-dirigido, bem como o seu mecanismo de hidrólise (Salminem et al., 1995; Pohjanjoki et al., 1998; Käpylä et al., 1995; Volk et al., 1996; Avaeva et al., 1996a; Avaeva et al., 1996b; Fabrichniy et al., 1997; Oksanen et al., 2007). Figura 4) A hidrólise do pirofosfato é catalisada pela pirofosfatase inorgânica. Nos animais e em muitos micróbios, as altas quantidades de PPi geradas como um subproduto do anabolismo são imediatamente hidrolisados por um pirofosfatase inorgânica abundante em uma reação altamente exergônica (Taiz e Zeiger, 2006). Em eubactéria e arqueobactéria, as PPases da família I podem ocorrer como homohexâmeros (Fig. 5A) ou como homodímero a partir de eucarioto inferior (Fig. 5B). Até o presente momento, todas as PPases da família II caracterizadas ocorrem como homodímero. As subunidades das PPases hexaméricas possuem em média uma massa molecular entre 19-22 kDa enquanto que as diméricas podem variar entre 31-40 kDa por subunidade (Tammenkosky et al., 2005). Por outro lado, todas as PPases solúveis da família I, tem seu sítio ativo composto pelos mesmos 13 resíduos polares funcionalmente importantes, o qual se reflete na conservação do mecanismo catalítico (Heikinheimo et al., 1996; Harutyunyan et al., 1996). Apesar das duas famílias apresentarem uma baixíssima identidade seqüencial e estrutura global entre si, há uma impressionante similaridade no arranjo espacial de seis resíduos chaves do sítio ativo, exemplificando um bom exemplo de evolução convergente de enzimas (Merckel et al., 2001; Ahn et al., 2001). 6 (A) (B) Figura 5) Modelos estruturais de pirofosfatases inorgânicas solúveis. (A) EcPPase (E. coli, homohexâmero; número de acesso: PDB 1OBW). (B) ScPPase (S. cerevisiae, homodímero; número de acesso: PDB 1M38). As esferas em grafite ou preto representam os átomos de magnésio. Em “A” o gradiente de cor faz referência as subunidades. Em “B” o gradiente de cor faz referência à região N-terminal até a região C-terminal. Todas as PPases da família I estudadas até o momento requerem cátions metálicos como cofatores. Contudo, as PPases de bactérias, levedura e mamíferos foram descritas por serem fortemente inibidas por Ca2+ a concentrações fisiológicas (Felix e Fleisch, 1975; Kurilova et al., 1984; Mitchell e Minnick, 1997; Yang e Wensel, 1991a). Seu mecanismo de inibição foi investigado por Samygina e colaboradores (2001) onde se concluiu que o Ca2+ impede o ataque nucleofílico da molécula de água que participa da rede de coordenação ao pirofosfato. 1.5 – Aspectos funcionais das pirofosfatases inorgânicas Funcionalmente, a família II difere da família I pela sua preferência por Mn2+ ao invés de Mg2+ como cofator. O Mg2+ é o melhor cofator para as PPases da família I e ele também ativa na mesma proporção as PPases da família II, contudo, o Mn2+ confere uma atividade 20 vezes maior para as PPases da família II do que o Mg2+ (Parfenyev et al., 2001; Zyryanov et al., 2004). Acredita-se que a diferença na especificidade ao cofator ocorra devido a presença de resíduos de histidina no sítio ativo das PPases da família II. Há um total de três destes resíduos, dois agindo como ligantes que coordenam o íon metálico e um terceiro que coordena o pirofosfato (Merckel et al., 2001; Ahn et al., 2001). Até 2005 nenhum resíduo de histidina havia sido encontrado no sítio ativo de qualquer uma das seis PPases da família I, cujas estruturas foram resolvidas por Cristalografia de raios-X (Heikinheimo 7 et al., 1996; Kankare et al., 1994; Teplyakov et al., 1994; Leppanen et al.,1999; Liu et al., 2004). Tammenkosky e colaboradores (2005), descreveram estruturalmente uma PPase de Mycobacterium tuberculosis, a qual mesmo pertencendo a família I, apresenta dois resíduos de histidina (His21 e His86) em seu sítio ativo. Contudo, sua principal atividade ainda ocorre na presença de Mg2+ como cofator. Em eucariotos fotossintéticos (Chlamydomonas reinhardtii) foi descrito por Gómez-Garcia e colaboradores (2006) as primeiras PPases monoméricas naturais presentes em plastídios (mitocôndria e cloroplasto). A C. reinhardtii (alga verde) possui duas PPases dependentes de Mg2+, uma localizada no cloroplasto e outra localizada na mitocôndria. Neste trabalho foi mostrado que ambas as enzimas possuem os mesmos resíduos funcionais conservados que já foram descritos nos demais membros das PPases da família I (Lahti et al., 1990; Cooperman et al., 1992; Baykov et al., 1999). As PPases solúveis podem representar até 0,1-0,5 % do total de proteína celular. As concentrações de pirofosfato citossólico em tecidos vegetais fotossintéticos são mantidas a concentrações milimolares (0,2-0,5 mM), claramente superior quando comparado a das leveduras (2,0-5,0 µM), sugerindo que essas enzimas podem estar compartimentalizadas ou fortemente reguladas. Isso também sugere que o pirofosfato pode ter um importante papel como um doador de energia no metabolismo vegetal (Kankare et al., 1996; Heikinheimo et al., 1996). Embora a existência de PPases em vegetais superiores tenha sido documentada (Baltscheffsky et al., 1998; Nakanishi e Maeshima, 1998) poucos trabalhos foram publicados sobre a sua caracterização e papel fisiológico. 1.6 – Pirofosfatases inorgânicas transmembrana Em plantas, bactérias, protozoários e mais recentemente em células de artrópodes (Motta et al., 2003 e 2009) tem sido descrito uma pirofosfatase inorgânica transmembrana (H+-PPase), a qual funciona como uma bomba de prótons reversível. Essas H+-PPases são muito grandes (quando comparadas com as PPases solúveis) e não possuem qualquer grau de identidade com qualquer uma das duas famílias de PPases (Zhen et al., 1997; Baltscheffsky et al., 1998; Nakanishi e Maeshima, 1998). 8 1.7 – Estado da arte Muito se tem avançado nos estudos relacionados a esta classe de enzima. Todavia, pouco se sabe sobre a importância metabólica das PPases em humanos. Mas já é sabido que sua expressão é aumentada em associação com o hipertiroidismo (Koike et al., 2006) e em células cancerosas (Chen et al., 2002; Tomonaga et al., 2004; Lexander et al., 2005). Outra deficiência evidente nesta área do conhecimento é a falta de relatos sobre a influência destas enzimas em artrópodes. Até a presente data, a pirofosfatase inorgânica tem sido mais estudada em arqueobactéria, procariotos, fungos e alguns mamíferos. Recentemente, dois trabalhos caracterizaram desordens orgânicas em humanos originadas por PPases mitocondriais. Em C. elegans, o silenciamento do gene resultou em atraso dos estágios larvais e danos graves para o verme adulto (Ko et al., 2007). Em nosso conhecimento, a única descrição de uma PPase de artrópode foi com D. melanogaster. Neste trabalho foi caracterizado um complexo protéico onde uma das subunidades (± 38 kDa) apresenta atividade pirofosfatásica (Gdula et al., 1998). A importância desta enzima em sua descrição clássica, como nas reações de biossíntese e/ou outras funções ainda a serem descobertas pode fornecer subsídios para o desenvolvimento de novas estratégias de combate ao carrapato bovino R. microplus. 9 2 – Objetivos 2.1 – Objetivo geral O presente trabalho visa caracterizar as propriedades bioquímicas e moleculares da pirofosfatase inorgânica solúvel durante o desenvolvimento embrionário e em fêmeas de dois diferentes estágios de maturação (partenógina e teleógina) do carrapato bovino R. microplus. 2.2 – Objetivos específicos Identificar, clonar e avaliar a seqüência codificante para a RmPPase para comprovação do nosso modelo experimental. Analisar com ferramentas computacionais sua seqüência de aminoácidos deduzida para classificá-la com relação a qual família pertence. Analisar o perfil de atividade da RmPPase durante a embriogênese, bem como sua sensibilidade a inibidores. Analisar o perfil de expressão relativa da RmPPase durante a embriogênese e nos principais órgãos (intestino, corpo gorduroso e ovário) das fêmeas (partenóginas e teleóginas) do R. microplus. Criar um modelo estrutural da RmPPase por homologia. 10 3 – Material e Métodos 3.1 – Animais Foram utilizados nas experiências carrapatos da espécie R. microplus criados em bovinos na Faculdade de Veterinária do Rio Grande do Sul. Os hospedeiros foram mantidos isolados em estábulos, ou seja, sem contato com o campo. As larvas ficam 21 dias no dorso do bovino, período no qual ocorre a queda das teleóginas. O estábulo foi lavado e as fêmeas adultas coletadas com auxílio de peneiras, sendo, então, utilizadas para postura dos ovos que, posteriormente, foram usados nos experimentos. 3.2 – Manutenção dos ovos Os ovos foram mantidos à temperatura de 28º C e umidade relativa de 80%, foram coletados a partir de fêmeas adultas engurgitadas, sendo que os dias de desenvolvimento são contados a partir da ovoposição e o desenvolvimento dos ovos interrompido por congelamento à – 20o C. 3.3 – Clonagem e análise da seqüência de cDNA codificante para a RmPPase O RNA total de embriões com 6 dias de desenvolvimento foi extraído usando o reagente TRIzol® (Invitrogen). Dois microgramas do RNA total foram transcritos reversamente usando o kit Superscript pre-amplification system (Invitrogen). Para a amplificação do cDNA codificante (Anexo 8.1) para a PPase solúvel do R. microplus (RmPPase), foram desenhados os seguintes primers específicos: forward 5'ATGCTCTGGCAAGGCGTCATTGGG3' e reverse 5'CTTGAGGCACACGAAGTGCCACTTGTC3' e a polimerase usada para tal foi a Elongase (Invitrogen). As condições de reação foram: desnaturação inicial a 94º C por 3 min, 30 ciclos de 30 seg a 94º C, 30 seg a 66º C para o anelamento, 2 min a 68º C para extensão e 5 min a 68º C para a extensão final. Ao fragmento amplificado de 1023 pb lhe foi adicionado mais alguns nucleotídeos de adenina. O vetor de clonagem pGEM-T Easy (Promega) foi clivado nos sítios de restrição para EcoRI. Posteriormente, o inserto foi clonado no vetor pGEM-T Easy usando a ligase T4-DNA (Invitrogen) gerando o plasmídeo pGEM-T Easy-RmPPase. Células competentes do tipo E. coli XL1-Blue foram transformadas por eletroporação com o plasmídeo resultante e selecionados em meio ágar LuriaBertani (LB) contendo ampicilina (100 µg/mL). A integridade da seqüência 11 codificadora para a RmPPase foi confirmada por PCR, clivagem da construção e análise dos seqüenciamentos. 3.4 – Enriquecimento da amostra Para cada dia da embriogênese analisado foram homogeneizados 550 mg de ovos em tampão: Tris-HCl 100 mM pH 8,0, KCl 150 mM, glicerol 10% (v/v), leupeptina 10 M, pepstatina 1 µM e 1 mM de PMSF. O procedimento foi realizado em almofariz e mantido resfriado a 4º C. Em seguida, o extrato cru foi centrifugado a 100.000 X g por 40 min a 4º C. O sobrenadante (fração solúvel) foi coletado, guardado em tubo de vidro e mantido resfriado a 4º C. 3.5 – Dosagem de proteína Foi utilizada a metodologia de Bradford (1976) para a quantificação das proteínas totais contidas nas frações solúveis. A curva padrão foi obtida usando albumina do soro bovino (BSA). 3.6 – Parâmetros cinéticos Para a obtenção destes dados foram utilizados embriões com 6 dias de desenvolvimento (dia de maior atividade pirofosfatásica). Da mesma forma, este ensaio foi realizado utilizando a fração solúvel correspondente. O meio reacional tem volume de 100 µL total, sendo o tampão: MOPS-Tris 50 mM pH 7,0; 600 µM MgCl2, 100 mM KCl e 300 µM Na4PPi. Foram adicionados ao meio reacional 25 µg de proteína. A atividade pirofosfatásica foi considerada quando as amostras foram incubadas a 30º C por 15 min. Foi utilizado sal de pirofosfato (Na4PPi - Sigma) como substrato. A reação foi interrompida com a adição de 100 µL de TCA 50% (w/v). Foram utilizados também: EDTA, cálcio e fluoreto de sódio para avaliar a sensibilidade da PPase solúvel presente nas frações enriquecidas. O Pi formado foi quantificado de acordo com o método de Fiske e Subbarow (1925). O resultado foi lido em um espectrofotômetro (Shimadzu UV-visível - 1240) a 750 nm. O pH ótimo de atividade da RmPPase foi avaliado seguindo a mesma metodologia utilizada por Abreu e colaboradores (2004). 12 3.7 – Análise da transcrição relativa da RmPPase ao longo da embriogênese e em fêmeas partenóginas e teleóginas Para avaliar a taxa de transcrição do RNAm para a PPase solúvel, o RNA total foi extraído do intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas partenóginas e teleóginas e ovos com 1, 3, 5, 7, 9, 12, 15 e 18 dias de desenvolvimento. Os carrapatos foram lavados com etanol 70% e rinsados com tampão PBS (NaPO4 100 mM e NaCl 500 mM, pH 7,6) antes da dissecção do intestino, ovário e corpo gorduroso sob um microscópio. O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol® (Invitrogen) obedecendo as recomendações do fabricante. A quantidade e a qualidade do RNA foram estimadas espectrofotometricamente levando em consideração a relação 260/280 nm. Um micrograma do RNA total foi transcrito reversamente a 37º C usando o kit High-capacity cDNA Reverse Transcription kit com primers aleatórios de acordo com as recomendações do fabricante (Applied Biosystems). A quantificação do RNAm para a RmPPase foi realizada por PCR quantitativo (qPCR) usando o kit de amplificação Light Cycler Fast Start DNA master plus SYBR Green I em capilares de vidro no equipamento Light Cycler (Roche Applied Science). Para a amplificação da RmPPase (Anexo 8.3), foram desenhados primers específicos (forward 5' ATGCTCTGGCAAGGCGTCATTGGG 3' e reverse 5'CTTGAGGCACACGAA-GTGCCACTTGTC3') para permitir a amplificação de um produto de PCR de 99 pb. Como controle interno, o cDNA codificante para a proteína ribossomal 40S (EW679928) foi amplificado com os primers: forward 5′GGACGACCGATGGCT-ACCT3′ e reverse 5′TGAGTTGATTGGCGCACTTCT3' (amplificando um produto de PCR de 69 pb). As condições de ensaio do PCR em tempo real foram: 10 min a 95º C para ativação da polimerase seguido por 35 ciclos de 10 seg a 95º C, 5 seg de anelamento a 54º C para a RmPPase e 47º C para o 40S e extensão a 72º C por 5 seg. Completada a amplificação, a análise da curva de melting foi executada da seguinte forma: desnaturação a 95º C por 15 seg e anelamento a 45º C por 30 seg seguido por um aumento gradual de temperatura (taxa de transição de 0,1º C/seg) até 85º C com aquisição contínua da fluorescência. A curva padrão para RmPPase e 40S foram determinadas com diluições de cDNA (1/2, 1/5, 1/10 e 1/20) em triplicata e para as análises foram adicionadas 10 ng de cDNA para cada reação. Um resultado positivo foi determinado pela identificação do valor do ponto mínimo de corte (CP) no qual a emissão do fluoróforo reporter pode 13 ser observada acima do background. A quantidade relativa de RmPPase produzida por unidade de 40S foi calculada para cada amostra. Cada análise foi conduzida em triplicata. A razão da transcrição relativa do gene da RmPPase de cada experimento foi calculada de acordo com o modelo matemático descrito por Pfaffl (2001) no programa Relative Expression Software Tool (REST-MCS V2.0; Pfaffl et al., 2002). 3.8 – Modelagem por homologia da RmPPase O modelo tridimensional da RmPPase foi construído por homologia baseado em uma PPase solúvel com sua estrutura protéica previamente resolvida por cristalografia de raios-X e depositada no banco público de proteínas RCSB Protein Data Bank. Critérios como: maior proximidade filogenética e/ou maior percentual de identidade (a partir de 50%) em relação à seqüência primária do R. microplus foram utilizados para a seleção da proteína molde. Os procedimentos de implementação do modelo tridimensional foram realizados com o programa Modeller9v4 (Eswar et al., 2006) e visualizados pelo NOC v3.0.7. Todos os modelos gerados foram enviados para os servidores web Verify3D e ProCheck para avaliação da qualidade estéreo-química. Todos os procedimentos foram realizados sob supervisão do prof. Jorge H. Fernandez (LQFPP-UENF). 14 4 – Resultados 4.1 – Identificação e clonagem da PPase solúvel do R. microplus. Este trabalho foi iniciado com a busca por seqüências de proteínas que pudessem estar envolvidas com o processo de acidificação de grânulos vitelo em artrópodes. Checando o banco de dados do R. microplus no TIGR (em 2007) foi encontrado 1 seqüência de nucleotídeos (Anexo 8.1) que codifica para uma PPase solúvel. Após uma série de análises, chegou-se à conclusão de que esta está completa. Após a atualização anual do banco de dados (em 2008), foi encontrado mais uma seqüência, que também codifica para uma PPase solúvel. Este trabalho manteve o estudo com a primeira seqüência encontrada. Posteriormente, a seqüência de nucleotídeos foi inserida em vetor de clonagem (Figs. 6-A e 6-B.II) e então seqüenciada para a confirmação de nosso modelo experimental. Finalmente, após uma série de seqüenciamentos, chegou-se à conclusão que a nossa seqüência compartilha 100% de identidade com à disponibilizada pelo TIGR (Anexo 8.1). Avaliando sua seqüência primária de aminoácidos (Anexo 8.5) através de alinhamentos múltiplos (Fig. 7) com seqüências de PPases solúveis de outros modelos experimentais, utilizando o programa ClustalX v1.81 (Tompson et al., 1997) identificou-se que o “motif” DxDxxD característico das PPases solúveis da família I estava conservado, o que nos ajudou em sua classificação e, desta forma, nos permitiu chamá-la de RmPPase (R. microplus pirofosfatase inorgânica solúvel). A RmPPase possui 341 aa (Fig. 9; Anexo 8.5), massa molecular teórica de 38,7 KDa (Fig. 9) e ponto isoelétrico teórico de 5,56 (Prot-Param, www.expasy.org). O alinhamento múltiplo da seqüência de aa da RmPPase nos revelou a conservação de aa muito importantes, dentre eles: o motif de assinatura (Fig. 7) das PPases da família I (já citado anteriormente) que é composto por três resíduos de Asp nas posições 169, 171 e 174 (PROSITE PDOC00325). Notavelmente, 13 (dados não mostrados) dos 17 resíduos funcionalmente importantes e presentes no sítio-ativo da RmPPase também estão conservados. Ainda na busca por domínios conservados, foram encontrados os 4 resíduos envolvidos com a estabilização do dímero (Fig. 7 e 16). Além disso, potenciais locais para fosforilação (Caseína cinase II) e N-miristilação foram preditas pelo programa SCAN PROSITE (ExPASy). Através de uma análise filogenética (Fig. 8) foi possível identificar que a RmPPase converge com outras PPases da família I, estando mais próxima de enzimas da mesma classe 15 em outros artrópodes. Primeiramente, foi gerado um alinhamento múltiplo pelo ClustalX, em seguida este foi usado para construir a árvore filogenética pelo método Neighbor-joining no programa TreeCon V1.3b (Van de Peer e Wachter, 1994). Os valores de bootstrap foram obtidos testando a árvore 100 vezes. Foram dadas ao programa 20 seqüências de PPases da família I e 10 da família II. Por fim, dois grandes grupos foram criados, um grupo maior contendo somente PPases da família I (dependentes de Mg) e um grupo menor representando a família II (dependentes de Mn). Também foi investigado a composição percentual de todos os aa da RmPPase (Fig. 9). Através desta comparação de composição identificou-se que o seu conteúdo varia em torno de 30-50% com relação à similaridade e 50-60% com a identidade para outras PPases (Tabela 1). Uma característica também conservada na RmPPase é a baixa ocorrência de resíduos de Cis na proteína (Fig. 9). Outro aspecto cinético importante que reforça a afirmativa de que esta enzima pertence à classe das PPases solúveis foi a análise de seu pH ótimo de atividade (Fig. 10). Os ensaios de atividade pirofosfatásica com as apresentaram pico de atividade em torno do pH 7,0. frações ultra-centrifugadas 16 (A) (B) Figura 6) Clonagem do cDNA codificante para uma PPase solúvel no vetor de clonagem pGEM-T Easy (A). Confirmação da clonagem por PCR (B.I) e em seguida por clivagem do vetor (enzima de restrição EcoRI) e liberação do inserto (B.II). 17 Motif de assinatura das PPases família I: Figura 7) Alinhamento múltiplo da RmPPase com mais 18 seqüências de PPases da família I, sendo 12 de eucariotos e 6 de procariotos. Os resíduos conservados e os funcionalmente importantes para o sítio ativo foram destacados da seguinte forma: resíduos que coordenam o Mg2+ (caixa vermelha), que coordenam o PPi (caixa azul), resíduo envolvido com o ataque nucleofílico da molécula de água (caixa verde), resíduos envolvidos com a estabilização do dímero (caixa amarela). As cisteínas conservadas foram destacadas com caixas pretas arredondadas. Uma cisteína exclusiva do R. microplus localizada no C-terminal foi destacada por uma elipse vermelha. Os números de acesso das seqüências: T. castaneum (XP_967051.1), A. aegypti (ABF18311.1), N. vitripennis (P_001604166.1), D. melanogaster (AAC97112.1), R. microplus (TIGR, TC12266), A. suun (BAC66617.1), C. elegans (NP_001023074.1), D. rerio (NP_001017833.1), T. marmorata (AAD50298.1), X. tropicalis (CAJ83623.1), H. sapiens (AF154065_1), B. taurus (NP_001069864.1), S. cerevisiae (PDB: 1M38), P. furiosos (PDB: 1TWL), P. horikoshii OT3 (PDB: 1UDE), E. coli (PDB: 2EIP), R. prowazekii (PDB: 3D53), S. acidocaldarius (PDB: 1QEZ) e H. pylori (PDB: 2BQX). 18 PPases família II Procariotos Artrópodes PPases família I Eucariotos Figura 8) Árvore filogenética gerada pelo programa Treecon v1.3b após alinhamento no ClustalX v1.81. Um total de trinta (30) seqüências de PPases da família I (citossólica, mitocondrial e de cloroplasto) e da família II foram utilizadas. Os números de acesso das seqüências são: B. taurus cit (NP_001068586.1), H. sapiens mit (AAG36781.1), S. cerevisiae cit (NP_009565.1), S. cerevisiae mit (NP_013994.1), C. reinhardtii clor (CAC42762.1), C. reinhardtii cit (XP_001694912.1), L. major acidocalcissoma (AAQ72355.1), C. incerta clor (ABA01129.1), B. subtilis (PDB: 1K23), S. gordonii (PDB: 1K20), B. anthracis (YP_028894.1), S. saprophyticus (YP_300962.1), V. cholerae (YP_001217236.1), P. profundum (ZP_01219255.1), L. acidophilus (AAV42969.1), T. yellowstonii (YP_002248843.1), S. pneumoniae (CAR69279.1), S. aureus (CAG40997.1), os demais já foram citados na Fig. 7. 19 Figura 9) Análise computacional das seqüências de PPases da família I pelo programa BioEdit v7.0.9. Composição e massa molecular teórico da RmPPase. Organismos Identidade Similaridade C. elegans 41,1 % 53,3 % H. sapiens 44,3 % 57,6 % A. suum 45,9 % 60,7 % T. marmorata 46,9 % 58,6 % X. tropicalis 48,5 % 60,2 % B. taurus 49,1 % 61,0 % D. melanogaster 50,7 % 64,4 % D. rerio 51,3 % 64,3 % A. aegypti 51,6 % 65,6 % N. vitripennis 54,2 % 70,6 % T. castaneum 54,4 % 64,3 % Tabela 1) Percentual de identidade e similaridade em relação a seqüência primária do RmPPase que foram alinhadas na figura 9. 20 4.2 – Análise dos parâmetros cinéticos: atividade pirofosfatásica presente nos embriões do R. microplus. Durante o processo de fracionamento celular, todas as organelas foram retiradas de nosso extrato cru. Isto garante que os nossos resultados não estão sendo influenciados por isoformas mitocondriais. A confirmação que esta enzima pertence à família I foi obtida pelas análises dos parâmetros cinéticos que, de um modo geral, nos mostrou que ela é fortemente ativada por magnésio e inibida por cálcio, fluoreto e EDTA (Fig.11). O perfil de atividade da RmPPase citossólica foi monitorado nos principais momentos do desenvolvimento do embrião. Pode-se observar que ela é mantida ativa durante todo o processo (Fig. 11). Com 24 h de desenvolvimento a atividade quantificada foi de aproximadamente 2/3 em comparação ao momento de pico (6º dia), estágio este em que o embrião está em processo de celularização. Uma pequena queda ocorre no 9º dia, momento de completa segmentação do embrião. Sua sensibilidade ao EDTA a uma concentração final de 1,0 mM no meio reacional foi o suficiente para reduzir à atividade a zero, com exceção do 12º e 15º dia. Sua resposta ao cálcio ocorreu de uma forma diferenciada, dependendo do dia analisado. No 1º, 3º, 6º e 18º dia o cálcio atuou como um inibidor, semelhante ao descrito na literatura com exceção do 9º e 12º dia. Contudo, para o 15º dia atuou como um estimulador. O 15º dia apresentou um pico de aproximadamente 2/3 em comparação ao 6º dia do controle, dia em que observamos a maior atividade. O fluoreto de sódio é um inibidor clássico da pirofosfatase inorgânica, observamos que sua atividade foi reduzida fortemente em comparação ao controle, contudo, o 6º e o 18º dia foram um pouco menos sensíveis (Fig. 11). Através de ensaio de competição de íons (Fig. 12) foi possível constatar que o cálcio é capaz de reverter o efeito ativador do magnésio. Neste sentido, simulamos uma situação onde com um aumento crescente das concentrações de magnésio, o seu principal ativador, a RmPPase teria a sua atividade recuperada, após inibição com 500nM de cálcio. Percebeu-se que ela possui uma afinidade muito maior pelo cálcio do que pelo magnésio, sendo revertido o efeito inibidor em 50% somente após a adição de 100nM (Fig.12). Os dados sugerem que este tipo de inibição é do tipo competitiva e reversível. Atividade (pmol de Pi/min/ g de proteína) 21 150 125 100 75 50 25 0 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 10.5 pH Figura 10) pH ótimo de atividade da PPase presente na fração citossólica de embriões com 6 dias de desenvolvimento. Os resultados representam uma média ± o desvio padrão de três experimentos independentes realizados em triplicata. 22 Ca2+ [500 nM]F Atividade pmol Pi/min/g de proteína Controle 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1º d 3º d 6º d 9º d 12º d 15º d 18º d 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1º d 3º d 6º d 9º d 12º d 15º d 18º d Atividade pmol Pi/min/g de proteína EDTA [1,0 mM]F 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 NaF [1,0 mM]F 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1º d 3º d 6º d 9º d 12º d 15º d 18º d Dias de desenvolvimento 1º d 3º d 6º d 9º d 12º d 15º d 18º d Dias de desenvolvimento Figura 11) Perfil de atividade da RmPPase durante a embriogênese e efeito dos inibidores. Os resultados representam a média ± o desvio padrão de três experimentos independentes realizados em triplicata. 23 % de atividade 100 75 50 25 0 C Ca2+ EDTA Mg 2+ Mg 2+ Mg 2+ Molibidato 200 µM + + + + + + Ca2+ 500 nM - + - + + + EDTA 1,0 mM - - + - - - Mg2+ 100 nM - - - + - - 2+ - - - - + - 2+ - - - - - + Mg 500 nM Mg 1,0 µM Figura 12) Competição dos íons pelo sítio ativo da enzima e tentativa de recuperação de atividade pirofosfatásica com o aumento gradativo do íon preferencial (magnésio). Ensaio realizado com fração solúvel de embriões com 6 dias de desenvolvimento. Os resultados representam a média de dois experimentos independentes realizados em triplicata. 24 4.3 – Análise da transcrição relativa da RmPPase durante o desenvolvimento embrionário e em fêmeas adultas do R. microplus. Com o objetivo de caracterizar o papel fisiológico da RmPPase, foi analisado sua transcrição relativa durante a embriogênese. A razão da transcrição relativa da RmPPase durante a embriogênese do R. microplus se deu de forma relativamente constante ao longo de todo o processo (Fig. 13). Vale ressaltar que a quantidade de transcritos do 18º dia de embriogênese e muito próxima a do 1º dia. Isto sugere que a quantidade de RNAm, do 1º dia de embriogênese, que codificam para a RmPPase são de origem materna, já que o embrião não teria condições de produzi-lo neste momento. Para evidenciar se a RmPPase estaria sendo sintetizada pelas células ovarianas analisou-se seus transcritos em diferentes órgãos e nos ovos nos primeiros estágios do desenvolvimento embrionário. Os ovários chegam a ter aproximadamente 2,0 vezes mais transcritos do que os outros órgãos. Isto pode estar relacionado ao fato do embrião de 1º dia ter tanto RNAm e estaria então sendo internalizada pelos ovócitos durante a ovogênese e posteriormente estocada nos ovos (Fig. 14). Também foi investigado o perfil de expressão da RmPPase nos órgãos mais importantes da fêmea do carrapato em relação ao estágio de partenogênese e vitelogênese. Pode-se perceber que a variação na quantidade de transcritos entre as fêmeas partenóginas e teleóginas é pequena (Fig.14). 25 Figura 13) Transcrição relativa da PPase solúvel durante a embriogênese do R. microplus. A transcrição relativa da PPase foi determinada de acordo com a metodologia desenvolvida por Pfaffl (2002) e usando o gene ribossomal 40S como gene de referência. Figura 14) Transcrição relativa da PPase solúvel nos órgãos e embriões fêmeas completamente (teleog) ou parcialmente engurgitadas (part). A transcrição relativa da PPase foi determinada de acordo com a metodologia desenvolvida por Pfaffl (2002) e usando o gene ribossomal 40S como gene de referência. 26 4. 4 – Modelagem por homologia da RmPPase. Utilizando o alinhamento de seqüências de aa que já haviam sido estruturalmente resolvidas e depositadas no Protein Data Bank e buscando seqüências de organismos dos mais diversos conseguiu-se chegar a um grau de confiabilidade para dar início a modelagem molecular da RmPPase (Fig. 7). Pode-se encontrar na seqüência primária da RmPPase que: os 5 aa envolvidos com a coordenação do magnésio, do pirofosfato, bem como os 4 aa que estão envolvidos com a estabilização do dímero, todos estão conservados na RmPPase. Outra investigação realizada foi nas cisteínas. Segundo a literatura, é uma característica das PPases solúveis possuírem poucos aa de cisteínas e as que existem não se alinham com as de outros organismos. Em nosso alinhamento múltiplo (Fig. 7) foi percebido que, diferente do que foi dito na literatura (Lee et al., 2007), algumas cisteínas se alinharam e o quanto elas se apresentavam conservadas ou não dependia, exclusivamente, do grupo taxonômico selecionado para as análises. Outro dado interessante foi perceber que a RmPPase possui uma cisteína na região Cterminal que não alinha com nenhuma outra seqüência. Para construir um modelo estrutural teórico da RmPPase necessitava-se de uma outra PPase com sua estrutura atômica já resolvida para servir de molde. Buscando por uma estrutura no Protein Data Bank, foram encontradas 65 PPases já resolvidas estruturalmente. O organismo que apresentou uma estrutura molecular com um grau de identidade mais próximo do nosso foi a S. cerevisiae. Sua PPase apresentou 56% de identidade com a seqüência primária do R. microplus. Com o modelo tridimensional pronto (Fig. 17), pode-se observar como os aa envolvidos com o sítio ativo estão arranjados espacialmente. Segundo o modelo, os aa que estão envolvidos com a coordenação do magnésio estão dispostos numa região superior do sulco do sítio ativo (Fig. 15). Os aa envolvidos com a coordenação do pirofosfato estão na parte inferior ((Fig. 15)). Quatro aa estão envolvidos com a estabilização do dímero (Fig. 16) estando dispostos em duas alças logo atrás do sulco do sítio ativo. Na primeira alça: arginina 51 e triptofano 52. Segunda alça: arginina 127 e valina 128. Durante a avaliação do modelo criado por homologia (Fig. 14 e 15) percebeuse que duas cisteínas nas posições 83 e 284 estavam arranjadas espacialmente a uma distância de 3,38 Å, sugerindo uma provável ponte dissulfeto entre esses dois 27 resíduos. O segundo modelo (Fig. 15) foi construído com uma ligação dissulfeto entre esses resíduos. Figura 15) Modelo estrutural da RmPPase focado no sítio ativo. Os sítios de ligação ao pirofosfato e metais estão conservados na RmPPase. As esferas vermelhas grandes representam os átomos de magnésio, os asteriscos vermelhos representam as moléculas de água, o pirofosfato (PPi) se encontra clivado, por isso só visualizamos o ortofosfato (Pi). Os aa que compõem essas características conservadas estão sendo mostrados. Os resíduos E58, D115, D120, D147 e D152 estão envolvidos com a coordenação dos íons magnésio e os resíduos K56, R78, Y93, Y192 e K193 estão envolvidos com a coordenação do substrato (pirofosfato). 28 Figura 16) Domínios conservados. Disposição espacial dos 4 aas conservados envolvidos com a estabilização do dímero. Na primeira alça: 51R (arginina 51) e 52W (triptofano 52). Segunda alça: 127R (arginina 127) e 128V (valina 128). As cisteínas 83 e 284 a uma distância de 3,38 Å, sugerindo uma ponte dissulfeto entre os dois resíduos. 29 Figura 17) Alinhamento tridimensional das estruturas das PPases do R. microplus (RmPPase) e da S. cerevisiae (ScPPase, pdb 1M38). Somente os monômeros das estruturas são mostrados. A subunidade da RmPPase é mostrado em verde e em vermelho o da ScPPase. 30 5 – Discussão O desenvolvimento embrionário do R. microplus ocorre de forma semelhante ao da D. melanogaster, como foi mostrado pelo nosso grupo (Campos et al., 2006). Do 1º ao 7º dia de ovoposição o embrião passa de um blastoderma sincicial (até o 3º dia) para um embrião completamente segmentado (7º dia). Deste ponto em diante, o embrião entra numa 2ª fase de desenvolvimento onde eclode no 21º dia após a ovoposição. O rápido desenvolvimento deste organismo requer uma sincronia bem fina da utilização de fontes energéticas como: carboidratos (Moraes et al, 2006), lipídeos (Campos et al., 2006) e proteínas (vitelina, uma heme-proteína de embriões ovíparos como no caso do R. microplus como mostrado por Logullo e colaboradores em 2002). Com relação ao processamento de proteínas, inicia-se no 4º dia de ovoposição um processo chamado “acidificação dos grânulos de vitelo” também já mostrado pelo nosso grupo (Abreu et al., 2004). Este fenômeno é essencial para o processamento de proteínas de vitelo como duas proteinases aspárticas já caracterizadas, a BYC e a THAP (Logullo et al., 1998, Sorgine et al., 2000) e cisteínicas (Renard et al., 2000). Essas proteínas possuem atividade ótima em pH ácido. Como sugerido por Abreu et al. (2004), essa diminuição do pH em grânulos de vitelo pode estar correlacionado com o aumento de atividade de uma bomba de prótons dependente de ATP. O mesmo fenômeno da acidificação dos grânulos do ovo ocorre em Bombyx mori, também proposto por Yamahama e colaboradores (2003) o envolvimento de uma H+-ATPase neste processo. Aprofundando os estudos relacionados a este fenômeno, buscou-se na literatura outros grupos de enzimas que pudessem acoplar a hidrólise de doadores de fosfato (ATP e GTP) ao bombeamento de prótons H+ para o interior de vesículas ou grânulos. Um grupo em especial nos chamou a atenção, pois utiliza pirofosfato, ao invés de ATP, como doador de fosfato e bombeia prótons para o interior de organelas. As próton pirofosfatases ou H+-PPases, como também são conhecidas, apresentam algumas particularidades: ela tem sido encontrada e caracterizada em vacúolos de plantas, cromatóforos de bactérias fotossintéticas, arqueobactéria, membrana plasmática e acidocalcissoma de parasitas tais como T. cruzi, P. falciparum e T. gondii (Baltscheffsky et al., 1999; Rodrigues et al., 2000; Mitsuda et al., 2001; Docampo e Moreno, 2001; Pérez-Castineira et al., 2002). Interessante notar que essa enzima coexiste com a H+-ATPase nas plantas e organelas de 31 parasitas (Drozdowicz e Rea, 2001). Não havia qualquer evidência de uma H+PPase ocorrer em células animais, até que em 2003 Motta e colaboradores publicaram um trabalhando onde sugerem que há atividade de uma próton pirofosfatase em frações membranares de ovário e ovos de Rhodnius prolixus e estaria evolvida no processo de acidificação de compartimentos ácidos. A síntese de DNA, RNA, proteínas e polissacarídeos libera moléculas de PPi ao final da adição de cada unidade monomérica. Conseqüentemente, a taxa de produção de PPi em células em crescimento são particularmente altas (Klemme, 1976) e assim teriam que ser contrabalanceada por caminhos metabólicos eficientes, supõem-se. De fato, em todas as células estudas a atividade pirofosfatásica é capaz in vitro de converter rapidamente PPi em Pi (Josse e Wong, 1971; Cooperman, 1982). A hidrólise do pirofosfato catalisada pela enzima pirofosfatase inorgânica (PPase, EC 3.6.1.1) foi proposta a muitos anos atrás (Kornberg, 1962) por estar impulsionando termodinamicamente um grande número de reações biossintéticas. Essa enzima tem se mostrado essencial para a viabilidade de bactérias, leveduras e nematódeos (Chen et al., 1990; Lundin et al., 1991; Ko et al., 2007). Também tem sido proposto que sua atividade pode ser essencial para assegurar a fidelidade da replicação do DNA (Herbomel e Ninio, 1980). Atualmente, a família I das PPases encontra-se muito bem estuda com relação a sua estrutura atômica (bactérias e leveduras) e mecanismo catalítico (levedura) (Oksanen et al., 2007). Contudo, um único trabalho foi publicado, com nematódeos, mostrando evidências que o silenciamento deste gene pode gerar prejuízos sérios ao indivíduo, podendo levá-lo a morte (Ko et al., 2007). A RmPPase (Fig. 7-17) possui características estruturais e cinéticas similares a outras PPases de eucariotos já descritas como: D. melanogaster NURF-38 (290 aa; 32,7 kDa; pI 5,43), A. suum (360 aa; 40,6 kDa; pI 7,1), C. elegans (361 aa; 45 kDa), H. sapiens (289 aa; 32,7 kDa; pI 5,54), B. taurus (289 aa; 33 kDa; pI 5,27) e S. cerevisiae (289 aa; 32,3 kDa; pI 5,36) (Gdula et al., 1998; Islam et al., 2003; Ko et al., 2007; Fairchild e Patejunas, 1999; Yang e Wensel, 1991b; Kolakowski Jr et al., 1988). Os aminoácidos envolvidos com o sítio ativo são conservados em comparação com outras PPases (Fig. 7, 15 e 16). O alinhamento múltiplo das seqüências de PPases solúveis nos permite sugerir que, com relação ao sítio ativo, 32 há um mecanismo responsável em garantir que eventos de substituição e deleção tenham uma freqüência extremamente baixa nessa região da seqüência de DNA, o que reforça a idéia de que as PPases solúveis são muito importantes para a manutenção da vida (Kornberg, 1962; Chen et al., 1990; Sonnewald, 1992; Ko et al., 2007). Verificou-se também que a RmPPase apresentou maior grau de identidade e similaridade com as PPases de artrópodes (Tabela 1) e a composição percentual dos aminoácidos (Fig. 9) confirmou a baixa ocorrência de cisteínas como proposto por Lee et al., 2007. Após o alinhamento múltiplo da RmPPase, foi gerado uma árvore filogenética (Fig. 8) para analisar o quanto a RmPPase convergiria ou divergiria das demais, o que também nos ajudaria em sua classificação. A RmPPase formou um grupo com as demais PPases de artrópodes e convergiu com as PPases da família I. Segundo a árvore, as PPases solúveis da família II tiveram origem num ancestral comum que também gerou as PPases da família I. Dados de cristalografia de raios-X têm sugerido que essas duas famílias possuem origens distintas, visto que possuem uma identidade seqüencial baixíssima (S. cerevisiae versus B. subtilis, 12%, matriz BLOSUM62) e nenhuma similaridade estrutural global (Ahn et al., 2001). Contudo, as similaridades do sítio ativo, incluindo uma molécula de água coordenada por dois íons metálicos, sugere que o mecanismo catalítico das PPases da família II é análogo ao das PPases da família I (Merckel et al., 2001), um exemplo interessante de evolução convergente de enzimas. Os trabalhos científicos abordam mais os aspectos: bioquímicos, moleculares e estruturais das PPases solúveis, tanto da família I quanto da família II. A família I é a mais bem estudada e tem todos os passos do seu mecanismo de hidrólise do pirofosfato já muito bem documentado (Oksanen et al., 2007). Contudo, conseguiuse identificar apenas um trabalho com artrópodes que foi publicado (Gdula et al., 1998), mas a descreve como um componente de um complexo protéico (NURF) de 140 kDa envolvido com a remodelagem da cromatina. Três outros relatos descrevem a importância da PPase nos processos de desenvolvimento e estágios larvais dos parasitas A. suun (Islam, et al., 2003; Islam, et al., 2005) e C. elegans (Ko et al., 2007). Até a presente data, nenhum trabalho descreve a pirofosfatase durante todo desenvolvimento embrionário de qualquer organismo, muito menos de um artrópode. Neste sentido, realizamos uma varredura de atividade RmPPase e sua sensibilidade 33 aos principais inibidores durante os principais dias da embriogênese do R. microplus (Fig. 11). O perfil de atividade apresentou as seguintes características: durante a 1ª fase da embriogênese (formação do blastoderma celular), quando o embrião está em rápido processo de divisão celular, percebemos um aumento de atividade no 3º e 6º dia (em comparação com o 1º dia). O que faz sentido e que também é explicado na literatura científica (Klemme, 1976). No 9º dia de embriogênese (quando o embrião se encontra completamente segmentado) observamos uma queda na atividade, a qual se equipara ao 1º dia. Como mostrado pelo grupo (Campos et al., 2006) o início da embriogênese é um processo completamente dirigido por fatores maternais que foram depositados no ovócito durante ovogênese. Com o blastoderma celular formado (6º dia), o embrião assume o controle do seu próprio desenvolvimento. Este dado é importante, pois sugere uma correlação entre o perfil de atividade (Fig. 11) com a expressão relativa da RmPPase (Fig. 13). A quantidade de transcritos do 1º dia é maior do que no 3º, 6º e principalmente 9º dia, sugerindo que tais transcritos são de origem materna. Comparativamente, a atividade da RmPPase é um pouco menor, o que também é esperado pois o embrião ainda não está celularizado (Campos et al., 2006). No 9º dia foi observado uma queda na expressão relativa (Fig. 13), o que também ocorre com a atividade deste dia (Fig. 11). Após a completa segmentação do embrião (7º dia), observamos que o 12º e o 15º dia de embriogênese há um aumento tanto na atividade (Fig. 11) quanto na expressão relativa (Fig. 13). Segundo a expressão relativa durante a embriogênese (Fig. 13) a quantidade de transcritos do 12º dia até próximo a eclosão (18º dia) não sofre grandes oscilações. A baixa atividade da RmPPase quantificada no 18º dia se deve a erros de manipulação e os ensaios referentes a esse dia em especial serão repetidos. Sendo os primeiros dias da embriogênese um processo dirigido por fatores sintetizados pela mãe, investigou-se o perfil de expressão relativa para RmPPase nos órgãos (intestino, corpo gorduroso e ovário) de fêmeas parcialmente ingurgitadas (partenóginas) e completamente ingurgitadas (teleóginas) (Fig. 14). De fato, o ovário é o órgão que mais sintetiza a RmPPase, o que também ocorre com a THAP (Pohl et al., 2008) e GSK-3β (Logullo et al., 2009) já documentadas pelo 34 nosso grupo. Esses dados sugerem que o aumento do RNAm para a RmPPase é um processo estimulado pela vitelogênese. Observou-se que as quantidades de RNAm para RmPPase no intestino das fêmeas teleóginas eram menores do que em fêmeas partenóginas, o mesmo foi observado com a GSK-3β (Logullo et al., 2009) e o inverso com a THAP (Pohl et al., 2008). Isto sugere que em teleóginas, há uma reorientação de recursos energéticos para os ovários e consecutivamente a produção de novos indivíduos seja garantida. Com relação ao corpo gorduroso, não se observou oscilações significativas entre partenóginas e teleóginas, o mesmo foi observado com a GSK-3β (Logullo et al., 2009) e o inverso com a THAP (Pohl et al., 2008). Durante os ensaios de inibição (Fig. 11), observamos que o cálcio, um inibidor clássico para as PPases solúveis, (Felix e Fleisch, 1975; Kurilova et al., 1984; Yang e Wense, 1992; Mitchell e Minnick, 1997) o qual impede o ataque nucleofílico da molécula de água que participa da coordenação do pirofosfato (Avaeva et al., 2000; Samygina et al., 2001), inibiu a atividade da RmPPase em até 100% (6º dia) durante a primeira fase da embriogênese. Interessante notar que o nono e o décimo segundo dia (quando o embrião apresenta segmentação completa) não houve inibição da RmPPase e o 15º dia foi fortemente estimulado, voltando a inibi-la no 18º dia, fato que nos surpreendeu. Um único trabalho na literatura reporta uma ocorrência dessas. Como foi mostrado por Gómez-García e colaboradores (2004) a PPase solúvel de Leishmania major é dependente de cálcio e sua atividade quando estimulada por magnésio é de somente 20% em comparação ao estímulo por cálcio. Análises na seqüencia sugerem que a LmsPPase possui uma substituição que é importante para a coordenação do pirofosfato (Arg78Gly) e que isto pode estar contribuindo para a troca do metal ativador, sugerindo uma adaptação importante para a enzima que vive num ambiente com altas concentrações de cálcio. Investigou-se a seqüência de aminoácidos da RmPPase solúvel em busca de substituições desse tipo (dados não mostrados). Em nosso alinhamento múltiplo adicionamos a seqüência da LmsPPase. Não encontramos tais substituições na seqüência primária da RmPPase. Acreditamos que outros fatores possam estar influenciando esse estímulo na atividade, por exemplo, uma contaminação de PPases mitocondriais. Para os demais inibidores (EDTA e NaF) a sensibilidade ocorreu de forma clássica (Motta et al., 2003; Gómez-Gárcia et al., 2004; Samygina, et al., 2006; Motta 35 et al., 2008). O meio reacional contendo 1 mM de EDTA foi o suficiente para inibir em até 100% a sua atividade, demonstrando que a RmPPase é dependente de íons metálicos para a hidrólise do pirofosfato. O mesmo foi visto com fluoreto de sódio (Fig. 11). Com relação ao efeito inibidor promovido pelo cálcio, investigamos a possibilidade de recuperar a atividade da enzima (Fig. 12). Nossa hipótese era: se o cálcio compete com o magnésio pelos sítios de coordenação de metais da PPase (Samygina, et al., 2006), o aumento gradativo das concentrações do seu principal cátion estimulador (magnésio), proporcionaria uma maior competição destes pelos sítios de coordenação? Por fim, a enzima teria o cálcio expulso de seu sítio ativo e a atividade seria recuperada. As análises computacionais (ScanProsite) da seqüência de aminoácidos não sugeriram nenhum domínio com função de controle alostérico (dados não mostrados). Ao final do experimento, constatamos a recuperação de 100% da atividade da RmPPase, mesmo na presença de 500 nM cálcio que promoveu até 100% de inibição (Fig. 11). As PPases eucarióticas possuem alto grau de identidade entre si (Sivula et al., 1999) e quando comparadas com as procarióticas também é possível observar o alto grau de conservação dos aminoácidos envolvidos com o sítio ativo (Lahti, et al., 1990) o que sugere o seu alto grau de importância nas vias de biossíntese (Kornberg, 1962) e no catabolismo do pirofosfato inorgânico (Chen et al., 1990). A RmPPase apresenta alto grau de identidade com as PPases eucarióticas (Tabela 1). Segunda a literatura, é uma característica das PPases solúveis não possuírem resíduos de cisteínas conservados (Lee et al., 2007). Mimura e colaboradores (2005) identificaram a formação de uma ponte dissulfeto na H+-PPase de Streptomyces coelicolor e concluíram que essa enzima é regulada por controle redox. Além de regular a enzima, resíduos de cisteína e pontes dissulfeto também estão associadas com a termoestabilidade da proteína (Meyer et al., 2002; Tatara et al., 2005). Somente um trabalho correlaciona resíduos de cisteína de PPases solúveis com termoestabilidade (Lee et al., 2007) e a insensibilidade a agentes redutores de sulfidrilas (Salminen et al., 2002). De posse dessas informações, iniciou-se a modelagem por homologia da RmPPase (Figs. 15-17). Primeiramente, foi realizado um alinhamento múltiplo (Fig. 7) da RmPPase com mais 18 seqüências sendo 7 delas referente a PPases com sua estrutura 3D resolvidas por cristalografia de raios-X. Foi concluído que a RmPPase possui conservado: os 5 resíduos de aminoácidos que são responsáveis pela 36 coordenação dos íons metálicos (Fig. 7 e 15), os 5 resíduos responsáveis pela coordenação do pirofosfato (Fig. Fig. 7 e 15) e os 4 resíduos responsáveis pela estabilização do dímero (Fig. 7 e 16). Com relação a este último domínio (composto por 2 alças), observamos que a primeira alça composta pelos aminoácidos Arg e Trp são altamente conservados em eucariotos, mas na segunda alça o primeiro aminoácido por ser uma Arg ou Lis e o segundo aminoácido Val ou Ile (hidrofílicos básicos e hidrofóbicos, respectivamente). A confirmação desses dados foi feita utilizando o programa CDD (Marchler-Bauer et al., 2007) disponível no NCBi. Com relação à análise das cisteínas observamos que: algumas cisteínas são conservadas para um mesmo grupo taxonômico (Fig. 7). Por exemplo, o primeiro grupo de cisteínas conservadas só é encontrado nos artrópodes, dois grandes grupos de cisteínas são conservados em quase todos os eucariotos, dois grupos em mamíferos e peixes, um grupo em anfíbio e peixes e dois grupos em mamíferos, diferente do que foi dito por Lee e colaboradores (2007). Na região C-terminal da RmPPase foi observado uma cisteína não alinhada (Fig. 7). Durante a análise do modelo criado por homologia, foi verificado que a cisteína 284 (342 no alinhamento) e a cisteína 83 (conservada em artrópodes, 137 no alinhamento) estavam posicionadas espacialmente a uma distância de 3,38 Å sugerindo uma possível ponte dissulfeto entre esses dois resíduos. Com a re-modelagem da RmPPase havendo uma ponte dissulfeto entre esses dois resíduos a distância diminuiu para 2,12 Å. Os dois modelos foram enviados para checagem nos servidores web Verify3D e ProCheck. O modelo com ponte dissulfeto foi eleito o melhor baseado em suas qualidades estéreo-químicas (dados não mostrados). Finalmente, foi realizado uma sobreposição tridimensional da RmPPase com a ScPPase (Fig. 17) e assim foi observado que a RmPPase possui homologia estrutural com a PPase citossólica de S. cerevisiae (número de acesso no Protein Data Bank:1M38). Até a presente data, nenhuma das PPases solúveis com sua estrutura atômica resolvida por cristalografia de raios-X (65) apresentaram uma ponte dissulfeto. Futuramente, a cristalização e resolução da estrutura atômica da RmPPase faz parte de nossos projetos, visto que a confirmação dessa característica coloca a RmPPase como um novo membro da grande família I das PPases solúveis, abre portas para o desenvolvimento racional de fármacos, além de entendermos a contribuição que a ponte dissulfeto proporciona para uma pirofosfatase do carrapato bovino. O presente trabalho contribui para um melhor entendimento do metabolismo 37 de pirofosfato e polifosfato (indiretamente) do carrapato bovino R. microplus e faz parte de um objetivo maior que é entender o funcionamento do metabolismo energético do embrião para futuramente selecionar novos candidatos a vacina e/ou planejamento racional de fármacos. 38 6 – Conclusões I – A seqüência de nucleotídeos RmPPase clonada e a seqüência de aminoácidos deduzida apresentou valores de: tamanho, massa molecular e pI teóricos semelhantes ao de outras PPases de eucariotos já descritas na literatura. II – A RmPPase é uma pirofosfatase inorgânica citossólica da família I (dependente de magnésio) possuindo conservado o “motif” de assinatura “DxDxxD” característico desta família. III – A RmPPase apresenta um perfil de atividade crescente na 1ª fase de embriogênese (formação do blastoderma celular) com uma queda no 9º dia do início da 2ª fase da embriogênese com posterior aumento (12º dia) e estabilização até próximo a eclosão. IV – Na embriogênese, a RmPPase é inibida por cálcio durante a 1ª fase de desenvolvimento. Já na 2ª fase, ela não é inibida e no 15º dia é fortemente estimulada. EDTA e fluoreto promoveram inibições de até 100%. V – A RmPPase possui atividade ótima em torno de pH 7,0, característico de sua classe. VI – O cálcio compete com o magnésio pelo sítio ativo de forma reversível. VII – Os dados de expressão relativa sugerem que o ovário é o principal órgão de síntese para a RmPPase, em ambas as fêmeas partenóginas e teleóginas. O intestino de fêmeas teleóginas tem sua taxa de transcrição diminuída em comparação com as partenóginas, sugerindo uma re-orientação metabólica em fêmeas teleóginas. O ovário de fêmeas teleóginas sintetizam mais RNAm para RmPPase do que os ovários das partenóginas, sugerindo que este aumento é um processo estimulado pela vitelogênese. VIII – A RmPPase possui alto grau de identidade com as PPases eucarióticas, principalmente com as dos artrópodes. 39 IX – Os dados computacionais propõem que a RmPPase possui conservado os 13 resíduos funcionalmente importantes para o sítio ativo, bem como os 4 resíduos envolvidos com a estabilização do dímero. X – Alguns resíduos de cisteínas estão conservados dentro de um mesmo grupo taxonômico. XI – O conjunto de dados obtidos pelo modelo computacional da RmPPase criado por homologia sugere a descoberta de um novo membro da família I das pirofosfatases inorgânicas citossólicas. XII – Segundo os dados obtidos da modelagem por homologia, a ponte dissulfeto é uma particularidade da RmPPase. 40 7 – Referências bibliográficas Abreu, L., Valle, D., Manso, P. P. A., Façanha, A. 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Amplificação de uma pequena região do cDNA codificante para a PPase solúvel do R. microplus Forward: 5’GGATGAGGCCAACAACATTT3’; Tm = 53,6° C (20 pb) Reverse: 5’TTGATGGGGTTCAGAGGTTC3’; Tm = 54,5° C (20 pb) Produto: 99 pb ORF: 376-1239 (859 pb); fase de leitura 1 (+) ATGGCTTTCTCAACAGTCGAGAGAGGTTGTCCCAACACCATGAGCTACCAGATGTACTTTCG AAAGGGCGACAAATACATCTCGCCTTTCCATGATATCCCCATGTTTGCGGATGAGGCCAACA >>>>>>>>>>>>>> ACATTTACAACATGGTTGTCGAAGTGCCTCGCTGGACAAATGCGAAGATGGAGATGAATACC >>>>>> <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< AAGGAACCTCTGAACCCCATCAAGCAGGACATAAAGAAAGGAAAGCTACGCTATGTCCACAA CTGCTTTCCTCATCACGGTTACATCTGGAATTATGGTGCCATCCCACAGACTTGGGAGGACC CAAACCACGTAGATGACAAGACCAACTGCAAGGGAGACAACGACCCTATTGATATCTGTGAG ATTGGCTATCGGGTGGCTAAGAGAGGCGAGGTGATACAAGTAAAGATCCTTGGCGTCGTGGC ACTGGTTGACGAGGGGGAAACTGACTGGAAGCTGCTTGCTATTGATGTCAATGATCCTCTGG CAAAGGACCTAAACGATGTTGGAGATATTGAAAAGCACATGCCCGGTCTTCTCAAGGCAACT ACTGAATGGTTTCGCATATATAAGATTCCCGATGGCAAGCCAGAGAACCAGTTTGCATTTAA TGGCGAAGCTAAGAACAAGGAGTTTGCAGAGAAAGTCATTGCAGAAACTCATGAGTTTTGGA AGGCGCTGGTGCAACGCTTTGATACTTCTCCATTGAACTGCTTTACTACTGTCCACACTGGA TCTCCACACCATATTAGTGATGACGAAGCTACTTCCATAGTCAATTTTACACCAGAGCTTGG TTTTGATGCCGGCAGAGATGATATTGTGGACAAGTGGCACTTCGTGTGCCTCA 8.4) Primers para real-time PCR. Amplificação de uma pequena região do cDNA codificante para a proteína ribossomal 40S (controle interno) do R. microplus Forward: 5’GGACGACCGATGGCTACCT3’; Tm = 47° C (19 pb) Reverse: 5’TGAGTTGATTGGCGCACTTCT3’; Tm = 47° C (21 pb) Produto: 69 pb 51 8.5) Seqüência de aminoácidos predita da RmPPase a partir do cDNA clonado MLWQGVIGITVLLIATQVPLAWEPALEMLSHVGKIFTTGLLRGAPPRLGYNSATMAFSTVER GCPNTMSYQMYFRKGDKYISPFHDIPMFADEANNIYNMVVEVPRWTNAKMEMNTKEPLNPIK QDIKKGKLRYVHNCFPHHGYIWNYGAIPQTWEDPNHVDDKTNCKGDNDPIDICEIGYRVAKR GEVIQVKILGVVALVDEGETDWKLLAIDVNDPLAKDLNDVGDIEKHMPGLLKATTEWFRIYK IPDGKPENQFAFNGEAKNKEFAEKVIAETHEFWKALVQRFDTSPLNCFTTVHTGSPHHISDD EATSIVNFTPELGFDAGRDDIVDKWHFVCLK 8.6) Trabalho publicado em colaboração durante o mestrado Campos, E., Façanha, A. R., Costa, E. P., Vaz Jr. I. S., Masuda, A., Logullo, C. Exopolyphosphatases in nuclear and mitochondrial fractions during embryogenesis of the hard tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. 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