PDF da tese

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CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL
CAMPUS DE PATOS-PB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
BACTÉRIAS QUE DEGRADAM MONOFLUOROACETATO DE SÓDIO
EXPEDITO KENNEDY ALVES CAMBOIM
PATOS-PB
2012
2
EXPEDITO KENNEDY ALVES CAMBOIM
BACTÉRIAS QUE DEGRADAM MONOFLUOROACETATO DE SÓDIO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária da Universidade Federal de Campina
Grande como requisito parcial para obtenção do título de
Doutor em Medicina Veterinária.
Prof. Dr. Franklin Riet-Correa
Orientador
Profa. Dra. Marcia Almeida Melo
Co-Orientadora
PATOS-PB
2012
3
FICHA CATALOGRÁFICA
Dados de Acordo com AACR2, CDU E CUTTER
Biblioteca Setorial - CSTR/UFCG – Campos de Patos/PB
C176b
2012
Camboim, Expedito Kennedy Alves
Bactérias que degradam monofluoroacetato de sódio / Expedito
Kennedy Alves Camboim - Patos: CSTR/PPGMV, 2012.
56 f.
Inclui bibliografia.
Orientador (a): Franklin Riet-Correa
Tese (Doutorado em Medicina Veterinária). Centro de Saúde e
Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande.
1 – Toxicologia veterinária. 2 – Biologia molecular. 3 – Bactérias. 4 –
Fluoroacetato dehalogenase – Título.
CDU: 615.9
4
Nome: CAMBOIM, Expedito Kennedy Alves
Título: Bactérias que degradam monofluoroacetato de sódio
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária da Universidade Federal de Campina
Grande como requisito parcial para obtenção do título de
Doutor em Medicina Veterinária.
Aprovada em 09/11/ 2012
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________
Prof. Dr. Franklin Riet-Correa - Orientador
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos/PB
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
___________________________________________
Prof. Dr. Luciano Nakazato
Universidade Federal do Mato Grosso – Cuiabá/MT
Laboratório de Biologia Molecular
___________________________________________
Prof. Dr. Edson Moleta Colodel
Universidade Federal do Mato Grosso – Cuiabá/MT
Departamento de Clínica Médica Veterinária
___________________________________________
Prof. Dr. Sergio Santos Azevedo
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos/PB
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
___________________________________________
Prof. Dr. Sara Vilar Dantas Simões
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos/PB
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
5
"Uma família feliz nada mais é do que o paraíso antecipado".
Aos meus pais Davi e Preta, irmãos Kadmu e Kadna,
pelo carinho, dedicação e compreensão,
dedico.
6
AGRADECIMENTOS
Ao Deus Pai, por guiar-me nesta caminhada, por me dar forças para enfrentar as
dificuldades do dia a dia e por estar presente iluminando os caminhos de minha vida.
Aos meus pais Davi e Maria de Fátima (Preta) e irmãos Kadmu e Kadna pelo amor,
carinho e incentivos constantes em mais uma vitória em nossas vidas.
Aos meus tios, primos, avós, por fazerem uma família unida e feliz.
A minha Co-orientadora, que foi orientadora, Professora Marcia e ao Professor
Paulo Andrade, pela confiança, atenção, amizade e pela minha formação.
Ao meu Orientador Professor Riet, pelos ensinamentos e exemplo profissional.
Aos professores Sara, Eldinê, Rosane, Flávio, Edisio, Sérgio, Moraes, Olaf, Pedro
Isidro, Carlos Peña e Josemar Marinho pelos ensinamentos profissionais e pessoais.
Aos colegas e amigos de Pós-Graduação: Adriana, André, Clarice, Adílio, Renault,
Lizziane, Valéria, Tatyane, Albério, Giovana, Luciano e Rômulo pela amizade e por
lutarem pelos seus ideais e darem continuidade ao aprendizado.
A equipe do laboratório de Biologia molecular: Tereza, Eduardo Vaz, Vanessa,
Arthur, Aline, Gilsane, pela convivência, trabalhos realizados, apoio que me ofereceram,
pelos momentos de desabafo e amizade, que foram essenciais para esse sucesso.
À UFCG e ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária pela
oportunidade de oferecer este curso de Pós-Graduação.
À UFPR por ter colaborado para conclusão da pesquisa, especialmente aos
professores Emanuel Maltempi e Fábio Pedrosa, a Michelle, Walter, Marcelo e Helisson.
Ao INCT para o controle de plantas tóxicas por ter financiado toda esta pesquisa.
À EMATER Paraíba e aos meus colegas e amigos Bruno, Branco, Bezerra, Jailson,
Cícero, Chico Acácio, Bosco, Ronaldo, Socorro, Mariazinha, Luzimar, Geovanne
Medeiros, Jeferson, Alexandre Alfredo, Romero, Marineide, Marconi, Alan Bergman,
Franklyn, Marcigleudo, Madeline, Celiane, Esdras e Vespucci pelo profissionalismo,
companheirismo e amizade.
Aos membros da banca examinadora, por aceitarem o convite e por suas valiosas
considerações.
A todos os amigos que tenho.
Todas estas pessoas foram muito importantes para mim durante esta caminhada.
Muito obrigado!
7
SUMÁRIO
Introdução ...........................................................................................................
Referências .........................................................................................................
Pag.
8
9
CAPÍTULO I
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil
Resumo ...............................................................................................................
Introdução............................................................................................................
Material e Métodos ….........................................................................................
Coleta das amostras ...............................................................................
Isolamento bacteriano ..........................................................................
Identificação da sequência do gene 16S rRNA .....................................
Análise das sequências e filogenia ........................................................
11
12
13
13
13
14
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Resultados ...........................................................................................................
Discussão ............................................................................................................
Referências .........................................................................................................
15
19
21
CAPÍTULO II
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de
rúmen de caprino no Brasil
Resumo ...............................................................................................................
Introdução............................................................................................................
Material e Métodos ….........................................................................................
Coleta e processamento das amostras ..............................................
Isolamento bacteriano ..........................................................................
Identificação da sequência do gene 16S rRNA .....................................
Análise das sequências e filogenia ........................................................
25
26
27
27
27
28
28
Resultados e Discussão........................................................................................
Referências .........................................................................................................
29
35
CAPÍTULO III
Ubiquidade da fluoroacetato dehalogenase em bactérias: uma abordagem in silico
Resumo ...............................................................................................................
Abstract ..................................................................................................
Introdução............................................................................................................
Material e Métodos ….........................................................................................
Resultados e Discussão........................................................................................
Referências .........................................................................................................
Considerações finais ...........................................................................................
40
41
41
43
43
53
56
8
LISTA DE TABELAS
Pag.
CAPITULO I
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil
Tabela 1 Resultados do BLAST para as sequências do gene 16S rRNA obtidas de
bactérias isoladas de amostras de solo e plantas .....................................
16
CAPITULO II
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen de
caprino no Brasil
Tabela 1 Resultados do alinhamento local das sequências bacterianas de 16S rRNA
dos isolados que degradam fluoroacetato. As sequências foram comparadas
àquelas depositadas no National Center for Biotechnology Information,
utilizando
o
algoritmo
regular
BlastN
disponível
em
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Os organismos com sequências
similares aos isolados ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) estão
listadas na segunda coluna. Os valores dos parâmetros de escore total,
cobertura e identidade máxima estão apresentados nas colunas 3 a 5. O
código de acesso ao GenBank está apresentado em parênteses ................
30
CAPITULO III
Ubiquidade da fluoroacetato dehalogenase em bactérias: uma abordagem in silico
Tabela 1 Alinhamento das sequências de fluoroacetato dehalogenases entre
Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini str. lupac 08
(gi|386690726), Moraxella sp. (gi|216773) e Rhodopseudomonas palustris
(gi|81829712) e as sequências enzimáticas de bactérias que possuem a
mesma tríade catalítica (seleção em preto), motivos estruturais (seleção em
cinza claro) e confirmado/ provável resíduo de sítio ativo (seleção em cinza
escuro) ...............................................................................................
45
Tabela 2 Alinhamento das sequências de fluoroacetato dehalogenases entre
Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini str. lupac 08
(gi|386690726), Moraxella sp. (gi|216773) e Rhodopseudomonas palustris
(gi|81829712) e as 108 sequências enzimáticas de bactérias que possuem
algumas alterações no sítio ativo. Tríade catalítica (seleção em preto),
motivos estruturais (seleção em cinza claro) e confirmados/ prováveis
resíduo de sítio ativo (seleção em cinza escuro) ....................................
47
Tabela 3 Percentual de substituição dos aminoácidos do sítio ativo das 108
sequências disponíveis no banco de dados de sequências proteicas do
NCBI, em relação à fluoroacetato dehalogenase de Burkholderia sp.
(gi|95102016) .....................................................................................
51
9
LISTA DE FIGURAS
Pag.
CAPITULO I
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil
Figura 1 Árvore filogenética baseada em sequências 16S rRNA pelo método de
máxima parcimônia. ECPB01 a ECPB07 representam os códigos dos
isolados
e
Methanobacterium
sp.
MO-MB1
(gi|311141366|dbj|AB598270.1|) o grupo externo. A história evolucionária
foi inferida utilizando o método de Máxima parcimônia. A árvore consenso
do bootstrap foi inferida a partir de 1000 repetições e representa a história
evolutiva do táxon examinado. O percentual de árvores de consenso nos
quais os táxons se agruparam no bootstrap (1000 réplicas) é mostrado perto
dos ramos. A árvore foi obtida utilizando o método Close-NeighborInterchange com algoritmo de busca nível 1, no qual as árvores iniciais
foram obtidas mediante a adição aleatória de sequências (10 réplicas). A
análise evolutiva foi realizada pelo método MEGA5 .....................................
18
Figura 2 Taxa de degradação do fluoroacetato de sódio por bactérias isoladas de
amostras de solo e plantas no Estado da Paraíba, Brasil. Os símbolos são
como se segue. O círculo branco: ECPB01, o triângulo preto: ECPB02, o
quadrado preto: ECPB03, o círculo cinza: ECPB04, o quadrado cinza:
ECPB05, o triângulo cinza: ECPB06, o círculo preto: ECPB07 ...................
19
CAPITULO II
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen
caprino no Brasil
Figura 1 Árvore filogenética baseada nas sequências do gene do 16S rRNA por
análise de Máxima Parcimônia. ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721)
são os códigos dos isolados. Em parênteses estão os códigos do GenBank. É
apresentada a relação entre ECPB08 (JQ345720) (a), ECPB09 (JQ345721)
(b), os táxons relacionados e os grupos externos Achromobacter ruhlandii, A.
denitrificans e Starkeya novella. A árvore de consenso bootstrap inferida a
partir de 1000 repetições mostra a história evolutiva dos táxons analisados.
Escala de 0,002: distância evolutiva .......................................................
32
Figura 2 Taxa de degradação de fluoroacetato de sódio por bactérias isoladas de
rúmen caprino. Isolado ECPB08 (quadrado cinza claro), isolado ECPB09
(losango preto), e P. fluorescens (triângulo cinza escuro, controle positivo).
33
8
INTRODUÇÃO
As plantas e os animais são habitantes de nosso planeta em relação de mútuo
benefício. Em casos específicos, esta relação ocasiona o aparecimento de intoxicações por
plantas em animais de produção, relatados no Brasil desde a introdução dos primeiros
bovinos. Isto ocorre porque ao sofrer predação pelos animais as plantas desenvolveram
mecanismos físicos e químicos de defesa contra a herbivoria. Entre os mecanismos
químicos, sintetizados a partir do seu metabolismo secundário, substâncias químicas
podem promover quadros de intoxicação em animais que ingerirem estas plantas
(BARBOSA et al., 2007). Entre estas substâncias, uma destaca-se por causar quadros de
intoxicações que levam o animal ao óbito, é o monofluoroacetato de sódio (MFA).
Composto altamente letal, responsável por causar anualmente milhares de mortes de
ruminantes no Brasil, ocasionando perdas econômicas significativas. No Brasil, o grupo de
plantas tóxicas mais importante é o das plantas que causam morte súbita associada ao
exercício, em que o MFA está envolvido (TOKARNIA et al., 2000). Tentativas de
controlar esta intoxicação pelos métodos tradicionais, incluindo a utilização de herbicidas,
o uso de cercas para isolar as áreas onde as plantas ocorrem, ou eliminação das mesmas
por métodos mecânicos não têm apresentado resultado satisfatório. Outra forma de
controle desta intoxicação seria através da indução de resistência dos animais a essas
plantas. Isto pode ser possível utilizando-se microrganismos que codificam a enzima
fluoroacetato dehalogenase, capaz de metabolizar o MFA. Esta tentativa foi realizada na
Austrália, através da inoculação no rúmen, de cepas da bactéria Butyrivibrio fibrisolvens
modificadas geneticamente com a introdução de um gene, proveniente de uma espécie de
Moraxella, que codifica uma dehalogenase, capaz de degradar este composto, reduzindo os
sinais clínicos da intoxicação por este composto (GREEG et al. 1998).
Esta tese teve o objetivo de isolar e identificar bactérias de solo e de rúmen que
degradam fluoroacetato de sódio, bem como estudar a enzima envolvida neste processo. A
mesma está dividida em três artigos, formatados de acordo com o que estabelece a
NORMA Nº 01/2011 de 03 de junho de 2011 do Programa de Pós-Graduação em Medicina
Veterinária da UFCG, Campus de Patos/PB (Anexo 1). O primeiro capítulo é um artigo de
pesquisa, publicado na The Scientific World Journal, que aborda o isolamento de bactérias
de solo e plantas capazes de degradar MFA. O segundo capítulo é uma pesquisa publicada
na mesma revista, e descreve o isolamento de duas bactérias de rúmen caprino, capazes de
9
degradar MFA. O terceiro capítulo refere-se a uma análise computacional de sequências
enzimáticas disponíveis no banco de dados do NCBI, para caracterização catalítica como
fluoroacetato dehalogenase, ao apresentarem conservados tríade catalítica e sítio ativo.
REFERÊNCIAS
Barbosa, R. R.; Ribeiro Filho, M. R.; Silva, I. P. & Soto-Blanco, B. Plantas tóxicas de
interesse pecuário: importância e formas de estudo. Acta Veterinaria Brasílica, v.1, n.1,
p.1-7, 2007.
Gregg K., hamdorf b., Henderson K., Kopency J., Wong C. Genetically modified ruminal
bacteria protect sheep from fluoroacetato poisoning. Applied and Environmental
Microbiology. v. 64, n. 9, p. 3496-3498, 1998.
Tokarnia C.H., Döbereiner J. & Peixoto P.V. 2000. Plantas Tóxicas do Brasil. Helianthus,
Rio de Janeiro. 310p.
10
CAPÍTULO I
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil
(Defluorination of sodium fluoroacetate by bacteria from soil and plants in Brazil)
Publicado na ―The Scientific World Journal‖ (anexo 2), de acordo
com o que estabelece a Norma nº 01/2011 de 03 de junho de 2011,
do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFCG,
Campus de Patos/PB.
11
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil
Expedito K. A. Camboim1, Michelle Z. Tadra-Sfeir2, Emanuel M. de Souza2, Fabio de O.
Pedrosa2, Paulo P. Andrade3, Chris S. McSweeney4, Franklin Riet-Correa1 e Marcia A.
Melo1
1
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Campina Grande,
Patos, Paraíba, Brasil.
2
Laboratório de Fixação Biológica de Nitrogênio, Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná, Brasil.
3
Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Genética, Recife, Pernambuco,
Brasil.
4
CSIRO Livestock Industries, Queensland Bioscience Precinct, St Lucia, Qld, Austrália
Autor para correspondência
Marcia A. Melo, Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de
Campina Grande. Av. Universitária, s/n, Bairro Sta. Cecília, Patos, Paraíba, Brasil. CP:
64, CEP: 58708-110. e-mail: [email protected]
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar bactérias capazes de degradar fluoroacetato
de sódio (FS) em amostras de solo e plantas, coletadas em áreas onde são encontradas
plantas que contêm fluoroacetato tais como Mascagnia rigida e Palicourea aenofusca. As
amostras foram cultivadas em meio mineral acrescido de 20 mmol L −1 de fluoroacetato de
sódio. Através do sequenciamento do gene 16S rRNA os sete isolados foram identificados
como Paenibacillus sp. (ECPB01), Burkholderia sp. (ECPB02), Cupriavidus sp.
(ECPB03), Staphylococcus sp. (ECPB04), Ancylobacter sp. (ECPB05), Ralstonia sp.
(ECPB06), e Stenotrophomonas sp. (ECPB07). Todos os sete isolados degradaram o FS
contido no meio, alcançando uma taxa de degradação de 20 mmol L −1 de íon flúor. Dos
12
isolados, seis são descritos pela primeira vez como capazes de degradar FS. No futuro,
alguns destes microorganismos podem ser utilizados para estabelecer no rúmen uma
população bacteriana capaz de degradar o fluoroacetato de sódio e proteger ruminantes de
intoxicações por este composto.
INTRODUÇÃO
No Brasil, treze espécies de plantas que causam morte súbita associada a esforço
físico são responsáveis por cerca de 500.000 mortes de bovinos por ano: Palicourea
marcgravii, P. aeneofusca, P. juruana, P. grandiflora, Pseudocalymma elegans,
Arrabidaea bilabiata, A. japurensis, Mascagnia rigida, M. elegans, M. pubiflora, M. aff.
rigida, M. exotropia, e M. sepium [1, 2]. O Fluoroacetato de sódio (FS) foi identificado
como o princípio ativo de P. maracgravii [3] e A. bilabiata [4] e provavelmente está
presente em outras plantas destes gêneros. Ele atua interrompendo o ciclo do ácido
tricarboxílico (TCA), sendo primeiro convertido a fluorcitrato que inibe a enzima aconitase
e succinato desidrogenase, resultando em acúmulo de citrato nos tecidos e plasma e,
finalmente, causando privação de energia e morte animal [5].
O uso de FS é proibido no Brasil, ocorrendo exclusivamente como produto natural
em plantas. Na Austrália, o composto é usado em iscas impregnadas para o controle de
coelhos, raposas, cachorro do mato e outras populações de mamíferos; contudo, quando
introduzido no ambiente pode selecionar microorganismos capazes de degradar FS [6].
A degradação microbiológica do fluoroacetato de sódio é catalisada pela
haloacetato halidohidrolase, a qual é capaz de quebrar a forte ligação do carbono-flúor [7].
Vinte e quatro microorganismos que degradam FS foram isolados de solo na Austrália
Central,
pertencentes
a
sete
gêneros
bacterianos
(Acinetobacter,
Arthrobacter,
Aureobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Weeksella, e Streptomyces) e quatro gêneros de
fungos (Aspergillus, Fusarium, Cryptococcus e Penicillium) [8].
A possibilidade para prevenir intoxicações por fluoroacetato em ruminantes através
da inoculação ruminal de bactérias geneticamente modificadas, contendo um gene que
codifica uma fluoroacetato dehalogenase vem sendo investigada [9, 10]. Uma pesquisa
aprofundada em amostras retiradas do ambiente, tais como solo, folhas e conteúdo do trato
digestivo de herbívoros que estão em contato com o FS, seria importante para verificar a
13
diversidade e ocorrência de microorganismos capazes de degradar esta toxina. No futuro,
genes que codificam enzimas provenientes destes microorganismos podem ser utilizados
em engenharia genética para modificar bactérias que colonizam o rúmen para que se
tornem capazes de degradar FS de plantas tóxicas, protegendo os animais da intoxicação
por este composto.
Este estudo objetivou isolar e identificar bactérias capazes de degradar o
fluoroacetato de sódio proveniente de amostras de solo e plantas coletadas no Estado da
Paraíba, Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta das amostras
Amostras de solo e plantas foram coletadas no Estado da Paraíba, Brasil, em áreas
onde Mascagnia rigida e Palicourea aenofusca estavam presentes. As amostras de solo
foram coletadas na base das plantas, 1 a 8 cm de profundidade. Folhas e flores também
foram coletadas. As amostras foram colocadas individualmente em tubos tipo Falcon de 50
mL e enviadas ao laboratório sob refrigeração para cultivo imediato das bactérias
associadas.
Isolamento bacteriano
O isolamento bacteriano foi realizado em tubos tipo Falcon de 50 mL em meio
mineral
(Brunner),
acrescido
(http://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ
com
Medium457.pdf)
vitaminas
e
20
milimoles (mmol) L−1 de fluoroacetato de sódio (Sigma-Fluka) como única fonte de
carbono. Este meio será aqui designado de meio Brunner. As amostras foram incubadas a
28°C em um agitador orbital. Após 48 horas, um (1) mL do cultivo primário foi transferido
para tubos de ensaio, contendo nove (9) mL de meio Brunner e incubados sob as mesmas
condições descritas acima.
A defluoração do FS foi mensurada com eletrodo seletivo para F− (Thermo
Electron Corporation) em placas de 24 poços, contendo 500 μL de cultura e 500 μL de
Total Ionic Strength Adjustment Buffer-TISAB (diaminociclohaxano, cloreto de sódio e
ácido acético glacial, pH 5.5). A liberação de íon flúor proveniente da degradação
14
microbiana do fluoroacetato de sódio foi expressa em milimoles. A taxa de defluoração de
20 mmol L−1 de FS corresponde a liberação de 20 mmol L−1 F−.
As amostras que apresentaram defluoração do FS foram cultivadas em diluições
seriadas de 10−1 a 10−9. Para obter colônias puras, a maior diluição que apresentou
defluoração do FS foi plaqueada em Ágar Brunner (meio Brunner acrescido com 1% de
Ágar) e incubada a 28°C por 72 horas. Subsequentemente, cada colônia foi usada para
inocular três tubos de ensaio contendo nove (9) mL de meio Brunner, que foram
monitorados quanto à defluoração do FS. Pseudomonas fluorescens (DSM 8341) foi
utilizada como controle positivo para atividade da fluoroacetato dehalogenase. Nove mL
de meio Brunner foram incubados sem inóculo bacteriano, sob as mesmas condições, para
avaliar a estabilidade da degradação do FS.
A amostra padrão (Pseudomonas fluorescens DSM 8341) e as bactérias isoladas de
solo e plantas foram cultivadas em meio Brunner em concentrações crescentes de FS (20
mmol L−1, 40 mmol L−1, 60 mmol L−1 e 80 mmol L−1 a 200 mmol L−1) para avaliar a
maior taxa de defluoração. Adicionalmente, para avaliar a defluoração na presença de
outras fontes de carbono, a amostra padrão e as bactérias isoladas de solo e plantas foram
também cultivadas em meio Brunner enriquecido com extrato de levedura e glicose, sob as
seguintes concentrações: (1) somente meio Brunner; (2) meio suplementado com extrato
de levedura 0.01% e glicose 2%; (3) meio com extrato de levedura 0.01%; (4) meio com
glicose 2%.
Identificação da sequência do gene 16S rRNA
As bactérias que apresentaram atividade de defluoração foram identificadas por
amplificação do gene 16S rRNA pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) e posterior
sequenciamento. A extração de DNA foi realizada com Brazol® (LGC Biotecnologia) de
acordo com as especificações do fabricante. A amplificação do gene 16S rRNA foi
efetuada em tampão contendo 0.5 µM dos primers
27F e 1492R [11], 2U de Taq DNA
polimerase, 0.2 mM de dNTP, 100 ng de DNA e água ultra pura para volume final de 20
µL. No controle negativo, o volume de DNA foi substituído por água ultra-pura. Os
produtos de amplificação foram aplicados em gel de agarose 1% e submetidos à
eletroforese. O DNA foi corado com brometo de etídio e as bandas visualizadas em
capturador de imagem (UVP- BioImaging Systems).
15
A reação de sequenciamento foi realizada utilizando-se kit BigDye (Applied
Biosystems), de acordo com as recomendações do fabricante, e os produtos sequenciados
no sequenciador da Genetic Analyzer 3500 XL (Applied Biosystems).
Análise das sequências e filogenia
As sequências do gene 16S rRNA foram montadas com o programa CAP3
(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php). As sequências de DNA foram analisadas através do
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) disponível no website do National Center
for Biotechnology Information (NCBI - www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST). A identificação
das espécies foi baseada no escore máximo, na identidade e no valor de cobertura. O banco
de dados do Greengenes e workbench (http://greengenes.lbl.gov) foi utilizado para
corroborar com a identificação das espécies. A árvore filogenética foi gerada com o
programa
MEGA
5
usando
os
parâmetros
padrões
(http://www.megasoftware.net/mega.php) [12, 13].
RESULTADOS
Após a análise das sequências dos genes 16S rRNA, sete isolados foram
identificados como Paenibacillus sp. (ECPB01), Burkholderia sp. (ECPB02), Cupriavidus
sp. (ECPB03), Staphylococcus sp. (ECPB04), Ancylobacter sp. (ECPB05), Ralstonia sp.
(ECPB06) e Stenotrophomonas sp. (ECPB07) (Tabela 1). Cupriavidus sp. e Ralstonia sp.
foram isolados em amostras de solo e plantas, enquanto Paenibacillus sp., Burkholderia sp.
e Ancylobacter sp. foram encontrados em amostras de solo e, Staphylococcus sp. e
Stenotrophomonas sp. foram isolados de amostras de plantas.
16
TABELA 1. Resultados do BLAST para as sequências do gene 16S rRNA obtidas de
bactérias isoladas de amostras de solo e plantas.
Código
do
isolado
Espécie mais
similar
Origem
do
isolado
Tamanho
Cobertura Escore Valor de Identidade
sequência
(%)
Máximo cobertura
(%)
16S rRNA
ECPB01
Paenibacillus sp.
Solo
1425
99
2619
0.0
99
ECPB02
Burkholderia sp.
Solo
1398
99
2553
0.0
99
ECPB03
Cupriavidus sp.
Solo e
Planta
1398
99
2540
0.0
99
ECPB04
Staphylococcus
sp.
Planta
1402
100
2569
0.0
99
ECPB05
Ancylobacter sp.
Solo
1368
99
2435
0.0
99
ECPB06
Ralstonia sp.
Solo e
Planta
1407
99
2551
0.0
99
Stenotrophomonas
Planta
1417
99
2606
0.0
sp.
*
Gêneros foram identificados baseados sobre o escore máximo, identidade e cobertura.
ECPB07
Objetivando um suporte adicional à atribuição de gênero que foi baseada no escore
máximo, na identidade e na cobertura do BLAST, as sequências foram previamente
aparadas para ter o mesmo tamanho e foi construída uma árvore filogenética,
identificando-se que cinco isolados eram filogeneticamente relacionados (Figura 1):
Ancylobacter sp., três Burkholderiaceae (Cupriavidus sp., Ralstonia sp. e Burkholderia sp.)
e Stenotrophomonas sp. Duas outras espécies, Paenibacillus sp. e Staphylococcus sp.
formam um grupo heterogêneo.
99
17
FIGURA 1. Árvore filogenética baseada em sequências 16S rRNA pelo método de
máxima parcimônia. ECPB01 a ECPB07 representam os códigos dos isolados e
Methanobacterium sp. MO-MB1 (gi|311141366|dbj|AB598270.1|) o grupo externo. A
história evolucionária foi inferida utilizando o método de Máxima parcimônia. A árvore
consenso do bootstrap foi inferida a partir de 1000 repetições e representa a história
evolutiva do táxon examinado. Ramos com valores de bootstrap abaixo de 50% foram
recolhidos. O percentual de árvores de consenso nos quais os táxons se agruparam no
bootstrap (1000 réplicas) é mostrado perto dos ramos. A árvore foi obtida utilizando o
método Close-Neighbor-Interchange com algoritmo de busca nível 1, no qual as árvores
iniciais foram obtidas mediante a adição aleatória de sequências (10 réplicas). A análise
utilizou oito (8) sequências de nucleotídeos. As posições com espaços ou dados perdidos
foram eliminadas. Foram consideradas um total de 1235 posições no conjunto de dados
final. A análise evolutiva foi realizada pelo método MEGA5.
Todos os isolados bacterianos apresentaram atividade de degradação do FS,
alcançando um nível de liberação de 20 mmol L−1 de íon flúor, após 32 horas de incubação
em meio Brunner, contendo 20 mmol L−1 de FS (Figura 2). O mesmo resultado foi
observado com a amostra controle de Pseudomonas fluorescens (DSM 8341). Não houve
liberação de íon flúor quando o meio Brunner foi incubado na ausência de bactérias.
18
FIGURA 2. Taxa de degradação do fluoroacetato de sódio por bactérias isoladas de
amostras de solo e plantas no Estado da Paraíba, Brasil. Os símbolos são como se segue. O
círculo branco: ECPB01, o triângulo preto: ECPB02, o quadrado preto: ECPB03, o círculo
cinza: ECPB04, o quadrado cinza: ECPB05, o triângulo cinza: ECPB06, o círculo preto:
ECPB07.
Quando as amostras foram cultivadas em diferentes concentrações de FS, a taxa
máxima de defluoração foi de 140 mmol L−1 F− em 140 mmol L−1 de concentração. Nas
maiores concentrações de FS (160 mmol L−1, 180 mmol L−1 e 200 mmol L−1), o nível de
degradação permaneceu em 140 mmol L−1. Quando os isolados foram cultivados em meio
Brunner acrescido de outras fontes de carbono (extrato de levedura 0,01% e glicose 2%),
um intenso crescimento bacteriano foi observado após 24 horas, porém a degradação de FS
apenas alcançou 20 mmol L−1 F− entre 48 a 64 horas com 20 mmol L−1 de FS na
concentração inicial.
19
DISCUSSÃO
Ancylobacter sp., as Burkholderiaceaes (Cupriavidus sp., Ralstonia sp. e
Burkholderia sp.) e Stenotrophomonas sp. pertencem às classes de Alfa, Beta e Gama
proteobacteria, respectivamente.
As duas outras espécies,
Staphylococcus
famílias
sp.,
são
das
Paenibacillaceae
Paenibacillus sp. e
e
Staphylococcaceae,
respectivamente, formando um grupo heterogêneo; a atribuição do gênero baseada sobre os
valores do BLAST foi coerente com a árvore filogenética, que está de acordo com a
filogenia destas bactérias. A existência de uma atividade similar de haloácida dehalogenase
entre microorganismos distantemente relacionados, isolados em uma área restrita, sugere
uma pressão seletiva comum e efetiva, atuando sobre um amplo conjunto de
microorganismos de solo.
As sequências genômicas das espécies Burkholderia sp., Cupriavidus taiwanensis,
Staphylococcus saprophyticus, Paenibacillus sp., Ralstonia sp. e Stenotrophomonas
maltophilia estavam disponíveis no banco de dados de genoma do NCBI. O genoma de
Ancylobacter dichloromethanicus ainda não foi sequenciado, porém, há uma sequência de
16S rRNA para esta espécie depositada no Genbank. Dos gêneros listados acima, a
Burkholderia sp. era a única para qual já havia citação sobre a fluoroacetato dehalogenase
(Fac-Dex FA1) [14]. Para Cupriavidus sp., Staphylococcus sp., Paenibacillus sp.,
Ralstonia sp., Stenotrophomonas sp. e Ancylobacter sp. as dehalogenases estavam
anotadas como proteína com domínio de hidrolase dehalogenase haloácida [15, 16],
hidrolase tipo dehalogenase haloácida [17, 18], 2-haloalcano dehalogenase [17, 18],
haloacetato dehalogenase [18, 19], e diclorometane dehalogenase [20]. Contudo, quando os
sete isolados foram cultivados na presença de FS o substrato foi degradado. Este achado
pode ser explicado pela inespecificidade das dehalogenases, que podem usar como
substrato outros compostos estruturalmente similares ao FS, processo conhecido como
adaptação cruzada [21]. Liu et al. [22] verificaram que a fluoroacetato dehalogenase
degrada outros compostos halogenados como cloroacetato, bromoacetato, iodoacetato e
dicloroacetato. Resultados similares foram obtidos por Donnelly e Murphy [23], que
encontraram atividade da fluoroacetato dehalogenase sob cloroacetato, bromoacetato e etil
fluoroacetato. O FS também pode ser degradado pela L-2 haloácida delalogenase [24].
Outra possibilidade é a transferência lateral de genes que codificam fluoroacetato
dehalogenase.
20
Embora outras bactérias ambientais como Moraxella sp. [25], Acinetobacter,
Arthrobacter, Aureobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Weeksella e Streptomyces [8]
também apresentem atividade de fluoroacetato dehalogenase, não existem relatos
anteriores sobre a referida atividade de microorganismos pertencentes a qualquer das seis
espécies descritas aqui: Cupriavidus sp., Staphylococcus sp., Paenibacillus sp., Ralstonia
sp., Stenotrophomonas sp. e Ancylobacter sp., para os quais os genes de haloácida
dehalogenases foram anotados nos genomas das cinco primeiras espécies. Por isso, é
sensato assumir que todos os sete isolados têm os genes de fluoroacetato em seus
cromossomos e não em plasmídeos, o que é um suporte adicional da existência de uma
pressão ambiental seletiva forte, durável e comum sobre estes organismos.
Em todos os isolados ocorreu defluoração após 32 horas de cultivo, com a liberação
de 20 mmol L−1 de íon flúor na presença de 20 mmol L −1 de FS. Estes resultados foram
similares aos relatados por Davis et al. [26] com Burkholderia sp., que também degradou
FS em 32 horas, liberando 20 mmol L−1 F− com 20 mmol L−1 de FS.
Os cultivos dos isolados em diferentes concentrações de FS indicaram que a maior
taxa de degradação foi 140 mmol L−1 F− com 140 mmol L−1 de substrato. Para as maiores
concentrações de FS a taxa de defluoração não aumentou, o que pode ser devido à exaustão
dos outros nutrientes.
Quando as bactérias foram cultivadas em meio Brunner acrescido de extrato de
levedura e glicose, a atividade da dehalogenase foi tardia, provavelmente devido à
disponibilidade de outras fontes de energia e a difícil quebra da forte ligação carbono-flúor
do fluoroacetato [7].
Em conclusão, sete bactérias capazes de degradar o fluoroacetato foram isoladas de
solo e plantas, das quais seis não foram previamente descritas como capazes de degradar o
FS. A possibilidade de usar algumas destas bactérias para estabelecer no rúmen, uma
população bacteriana capaz de degradar o fluoroacetato e proteger ruminantes de
intoxicações por este composto, deve ser explorada no futuro.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi apoiado pelo INCT para o controle de plantas tóxicas. Projeto
número: 573534/2008-0.
21
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24
CAPÍTULO II
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen
caprino no Brasil
(Isolation of sodium fluoroacetate degrading bacteria from caprine rumen in Brazil)
Publicado na ―The Scientific World Journal‖ (anexo 3), de acordo
com o que estabelece a Norma nº 01/2011 de 03 de junho de 2011,
do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFCG,
Campus de Patos/PB.
25
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen
caprino no Brasil
Expedito K. A. Camboim1, Arthur P. Almeida1, Michelle Z. Tadra-Sfeir2, Felício Garino
Jr1, Paulo P. Andrade3, Chris S. McSweeney4, Marcia A. Melo 1 e Franklin Riet-Correa1
1
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Campina Grande,
Patos, Paraíba, Brasil.
2
Laboratório de Fixação Biológica de Nitrogênio, Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular, Universidade Federal do Paraná.
3
Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Genética, Recife, Pernambuco,
Brasil.
4
CSIRO Livestock Industries, Queensland Bioscience Precinct, St Lucia, Qld, Australia.
Autor para Correspondência
Marcia A. Melo, Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de
Campina Grande. Av. Universitária, s/n, Bairro Sta. Cecília, Patos, Paraíba, Brasil. CP:
64, CEP: 58708-110. E-mail: [email protected]
RESUMO
O objetivo deste artigo foi descrever o isolamento de duas bactérias que degradam
fluoroacetato de sódio de rúmen caprino. Os animais foram caprinos adultos, machos,
mestiços, com fistula ruminal, alimentados com feno e pastagem nativa. O líquido ruminal
foi obtido através das fístulas ruminais e 100 μL foi inoculado imediatamente em meio
mineral acrescido de 20 mmol L−1 de fluoroacetato de sódio (FS), incubados a 39° C em
agitador orbital. Pseudomonas fluorescens (DSM 8341) foi utilizada como controle
positivo para a atividade da fluoroacetato dehalogenase. Dois isolados foram identificados
por sequenciamento do gene 16S rRNA como sendo Pigmentiphaga kullae (ECPB08) e
Ancylobacter dichloromethanicus (ECPB09). Estas bactérias degradaram FS, liberando 20
26
mmol L−1 de íon flúor, após 32 horas de incubação em meio Brunner, contendo 20 mmol
L−1 de fluoroacetato de sódio. Não há relatos anteriores da atividade de fluoroacetato
dehalogenase em P. kullae e A. dichloromethanicus. Medidas de controle para prevenir
intoxicação por plantas, incluindo uso de cercas, herbicidas ou outros métodos de
eliminação das plantas tóxicas, foram mal sucedidas para evitar intoxicações por plantas
contendo fluoroacetato no Brasil. Desta forma, P. kullae e A. dichloromethanicus podem
ser utilizadas para colonizar o rúmen de animais susceptíveis para evitar a intoxicação por
plantas que contem fluoroacetato.
INTRODUÇÃO
No Brasil, o grupo de plantas tóxicas mais importante é o que causa ―morte súbita‖
durante esforço físico, responsável por cerca de 500.000 mortes de bovinos anualmente, e
composto por 13 espécies de plantas, pertencentes a 3 famílias: Rubiaceae (Palicourea
marcgravii, P. aeneofusca, P. juruana e P. grandiflora); Bignoniaceae (Pseudocalymma
elegans, Arrabidaea bilabiata e A. japurensis); e Malpighiaceae (Mascagnia rigida, M.
elegans, M. pubiflora, M. aff. rigida, M. exotropica e M. sepium) [1–10]. P. marcgravii é a
planta tóxica mais importante do Brasil e M. rigida é a mais importante no Nordeste do
Brasil [11]. O fluoroacetato de sódio foi identificado como princípio ativo em P.
marcgravii, A. bilabiata [12, 13] e M. rigida [14]. Nas outras plantas o princípio ativo
ainda não foi identificado, porém é provável que também seja fluoroacetato de sódio [15],
que atua interrompendo o ciclo do ácido tricarboxílico, sendo primeiro convertido a
fluorcitrato, que por sua vez inibe a enzima aconitase, resultando em acumulo de citrato
nos tecidos e plasma e finalmente causando privação de energia e morte animal [16]. A
degradação microbiológica do fluoroacetato de sódio é catalisada pela fluoroacetato
dehalogenase, que cliva a forte ligação do carbono-flúor [17], mas também cliva, embora
de forma menos eficiente, outras ligações tais como carbono-cloro, carbono-bromo e
carbono-iodo [18]. Fluoroacetato de sódio também pode ser defluorado pela L-2 haloácida
dehalogenases [19].
Várias bactérias de solo têm a capacidade de degradar o fluoroacetato de sódio. Na
Austrália Central, foram isolados sete gêneros bacterianos que degradam o fluoroacetato,
incluindo
Acinetobacter,
Arthrobacter,
Aureobacterium,
Bacillus,
Pseudomonas,
Weeksella e Streptomyces [20]. Recentemente, foi descrito o isolamento de sete estirpes
27
bacterianas isoladas de amostras de solo no Brasil, pertencentes aos gêneros Ancylobacter,
Burkholderia, Cupriavidus, Paenibacillus, Staphylococcus, Stenotrophomonas e Ralstonia
[21]. Contudo, um único isolado bacteriano ruminal, pertencente ao filo Synergistetes, foi
relatado como sendo capaz de degradar o fluoroacetato de sódio [22, 23]. Como resultados
de nossa tentativa para verificar a ocorrência natural de microorganismos que degradam
fluoroacetato existentes no sistema digestivo de animais, relatamos aqui o isolamento de
duas novas bactérias que degradam o fluoroacetato de amostras de rúmen caprino.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e processamento das amostras
Os animais foram caprinos adultos, machos, mestiços, com fistula ruminal,
alimentados com feno e pastagem nativa e água ad libitum. Os animais foram criados no
Hospital Veterinário da Universidade de Campina Grande, Nordeste do Brasil, e não
tinham acesso a áreas com plantas tóxicas contendo fluoroacetato.
O líquido ruminal foi obtido através das fístulas ruminais e inoculado
imediatamente em tubos de ensaio.
Isolamento bacteriano
O isolamento bacteriano iniciou pela inoculação de 100 μL de fluido ruminal em
tubos contendo 9 mL em meio mineral (Brunner) acrescido com vitaminas
(http://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ Medium457.pdf) e 20 mmol
L−1 de fluoroacetato de sódio (FS) (Sigma-Fluka) como única fonte de carbono. Este meio
será aqui designado de meio Brunner. As amostras foram incubadas a 39°C em um
agitador orbital. Após 48 horas, 1 mL do cultivo primário foi transferido para tubos de
ensaio, contendo 9 mL de meio Brunner e incubados sob as mesmas condições, descritas
acima.
A defluoração do FS foi mensurada com eletrodo seletivo para F− (Thermo
Electron Corporation) em placas de 24 poços, contendo 500 μL de cultura e 500 μL de
Total Ionic Strength Adjustment Buffer-TISAB (diaminociclohexano, cloreto de sódio e
ácido acético glacial, pH 5.5). A liberação de íon flúor proveniente da degradação
microbiana do fluoroacetato de sódio foi expressa em milimoles (mmol), a taxa de
defluoração de 20 mmol L−1 de FS corresponde a liberação de 20 mmol L−1 F−.
28
As amostras que apresentaram defluoração do FS foram cultivadas em diluições
seriadas de 10−1 a 10−9. Para obter colônias puras a maior diluição que apresentou
defluoração do FS foi plaqueada em Agar Brunner (meio Brunner acrescido com 1% de
Agar) e incubada a 39°C por 72 horas. Subsequentemente, cada colônia foi usada para
inocular três tubos de ensaio contendo 9 (nove) mL de meio Brunner, que foram
monitoradas quanto a defluoração do FS. Pseudomonas fluorescens (DSM 8341) foi
utilizada como controle positivo para atividade da fluoroacetato dehalogenase, cultivada
sob as mesmas condições, exceto a incubação que foi a 28°C [24]. Nove mL de meio
Brunner sem inóculo bacteriano foram incubados sob as mesmas condições para avaliar a
estabilidade da degradação do FS.
Identificação da sequência do gene 16S rRNA
A identificação do gênero bacteriano que apresentou atividade de defluoração foi
realizada através da amplificação do gene 16S rRNA pela Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) e posterior sequenciamento. A extração de DNA foi realizada com
Brazol® (LGC Biotecnologia) de acordo com as especificações do fabricante. A
amplificação do gene 16S rRNA foi realizada em tampão contendo 0.5 µM de 27F e
1492R dos primers universais [25], 2U de Taq DNA polimerase, 0.2 mM de dNTP e 100
ng de DNA e água ultra pura para volume final de 20 µL. No controle negativo, o volume
de DNA foi substituído por água ultra pura. Os produtos de amplificação foram aplicados
em gel de agarose 1% e submetidos a eletroforese. O DNA foi corado com brometo de
etídio e as bandas visualizadas em capturador de imagem (UVP- BioImaging Systems).
O sequenciamento foi realizado com kit BigDye de acordo com as recomendações
do fabricante (Applied Biosystems) e os produtos foram sequenciados no sequenciador da
Genetic Analyzer 3500 XL (Applied Biosystems).
Análise das sequências e filogenia
As sequências do gene 16S rRNA foram montadas com auxílio do programa CAP3
(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php). As sequências de DNA foram analisadas através do
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) disponível no website do National Center
for Biotechnology Information (NCBI - www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST). A identificação
das espécies foi baseada no escore máximo, identidade e valor de cobertura. Os dados do
Greengenes e workbench foram usados para corroborar com a identificação das espécies
(http://greengenes.lbl.gov). A árvore filogenética foi gerada com o programa MEGA 5
29
usando o método estatístico neighbor-joining (http://www.megasoftware.net/mega.php)
[26].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As sequências dos genes 16S rRNA dos dois isolados que degradam fluoroacetato
ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) foram similares aos genes 16S rRNA das
espécies Pigmentiphaga e Ancylobacter, respectivamente (Tabela 1). Com base apenas no
valor do escore, a sequência de P. kullae foi a mais similar (escore = 2237) a ECPB08,
embora outras sequências de 16S rRNA tiveram os mesmos valores nos parâmetros
cobertura e identidade. Similarmente, as sequências de Ancylobacter vacuolatus e
Ancylobacter sp.
WPCB135 foram mais similares (escore 2388) a ECPB09, mas as
diferenças nos parâmetros de alinhamento para outras sequências de 16S rRNA de
Ancylobacter foram apenas marginais. Consequentemente, não foi possível inferir a partir
dos valores do escore, quais espécies seriam filogeneticamente mais próximas a ECPB09
(JQ345721).
30
Tabela 1: Resultados do alinhamento local das sequências bacterianas de 16S rRNA dos
isolados que degradam fluoroacetato. As sequências foram comparadas aquelas
depositadas no National Center for Biotechnology Information, utilizando o algoritmo
regular BlastN disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Os organismos com
sequências similares aos isolados ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) estão
listadas na segunda coluna. Os valores dos parâmetros de escore total, cobertura e
identidade máxima estão apresentados nas colunas 3 a 5. O código de acesso ao GenBank
está apresentado em parênteses.
ECPB09
(JQ345721)
ECPB08
(JQ345720)
Isolado
(Acc.nr)
Espécies/linhagens (nº de acesso)
Escore Cobertura Identidade
(%)
máx. (%)
total
Pigmentiphaga kullae strain K24 (NR_025112.1)
2237
100
98
Pigmentiphaga daeguensis strain K110 (NR_044082.1)
2215
100
98
Pigmentiphaga daeguensis strain NML080357 (JN585327.1)
2197
100
97
Pigmentiphaga litoralis strain JSM 061001 (NR_044530.1)
2152
99
97
Ancylobacter sp. WPCB135 (FJ006900.1)
2388
99
99
Ancylobacter vacuolatus strain DSM 1277 (NR_042794.1)
2388
99
99
Ancylobacter dichloromethanicus strain DM16 (EU589386.1)
2387
99
99
Ancylobacter polymorphus strain DSM 2457 (NR_042795.1)
2372
99
99
Ancylobacter rudongensis strain AS1.1761 (NR_029047.1)
2370
99
99
Ancylobacter polymorphus T10AII (GQ921957.1)
2358
98
99
Ancylobacter aquaticus (NR_044737.1)
2351
99
98
Ancylobacter oerskovii strain NS05 (NR_042655.1)
2341
99
98
A análise comparativa das sequências usando o alinhamento global confirmou que
os isolados ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) são filogeneticamente
relacionados com os gêneros Pigmentiphaga e Ancylobacter, respectivamente (Figura 1).
Na verdade, o alinhamento global corrobora com a inferência taxonômica com base nos
resultados do alinhamento 16S rRNA para ECPB08 (JQ345720), indicando que o isolado
está relacionado com a P. kullae
K24 (Figura 1a), e está apoiado pelos resultados
anteriores sobre a taxonomia deste gênero [27, 28]. Contudo, o alinhamento global
permitiu uma melhor estimativa da posição taxonômica para ECPB09 (JQ345721),
sugerindo uma estreita relação com A. polymorphus (Figura 1b). Embora a parte superior
31
da árvore na Figura 1b apresente baixos valores de bootstrap, a totalidade do dendrograma
é consistente com os resultados apresentados por Firsova et al. [29] para o gênero
Ancylobacter.
Figura 1: Árvore filogenética baseada nas sequências do gene do 16S rRNA por análise de
Máxima Parcimônia. ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) são os códigos dos
isolados. Em parênteses estão os códigos do GenBank. É apresentada a relação entre
ECPB08 (JQ345720) (a), ECPB09 (JQ345721) (b), os táxons relacionados e os grupos
externos Achromobacter ruhlandii, A. denitrificans e Starkeya novella. A árvore de
consenso bootstrap inferida a partir de 1000 repetições mostra a história evolutiva dos
táxons analisados. Escala de 0,002: distância evolutiva.
O gênero Pigmentiphaga foi inicialmente proposto por Blümel et al. [30] com
Pigmentiphaga kullae (K24) como única espécie, que degrada compostos xenobióticos.
Em 2007, Yoon et al. [31] descreveram um novo membro do gênero, Pigmentiphaga
daeguensis ( K110T), isolado de águas residuais coletadas de tinturarias na Coréia. Mais
tarde, Chen et al. [27] e Lee et al. [28] isolaram Pigmentiphaga litoralis ( JSM 061001) e
P. soli de amostras de planície de maré no mar da China e de solo na Coréia do Sul,
respectivamente.
32
Raj e Maloy [32] propuseram a substituição no nome do gênero Microcyclus por
Ancylobacter, com uma única espécie, A. aquaticus [33]. Desde então, cinco novas
espécies foram descritas, a última sendo Ancylobacter dichloromethanicus (DM16),
isolada de solo contaminado [29]. Esta espécie usa os compostos diclorometano, metanol,
formiato e policarbonato de formaldeído como fontes de carbono e energia. Análises
enzimáticas mostraram que a presença de diclorometano dehalogenase dependente de GSH
(glutationa).
Ambos ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) cresceram em meio de cultura
contendo FS como única fonte de carbono. Estas bactérias apresentaram atividade de
degradação do FS, liberando 20 mmol L−1 de íon flúor após 32 horas de incubação em
meio Brunner com 20 mmol L−1 de FS (Figura 2). Estes resultados são similares aos
relatados por Davis et al. [34] para Burkholderia sp. A amostra controle Pseudomonas
fluorescens (DSM 8341) alcançou o mesmo nível de defluoração e não houve liberação de
íon flúor quando o meio Brunner foi incubado sem bactéria, devido à estabilidade da forte
ligação carbono-flúor do fluoroacetato [17]. Não há relatos anteriores sobre a atividade de
fluoroacetato dehalogenase para as espécies de Pigmentiphaga ou Ancylobacter.
Concentração de flúor (mM)
20
15
10
5
0
0
8
16
24
Horas após incubação
32
Figura 2: Taxa de degradação de fluoroacetato de sódio por bactérias isoladas de rúmen
caprino. Isolado ECPB08 (quadrado cinza claro), isolado ECPB09 (losango preto), e P.
fluorescens (triângulo cinza escuro, controle positivo).
33
A capacidade de defluoração de ambos isolados pode ser devida à expressão de um
gene que codifica uma fluoroacetato dehalogenase ou outra dehalogenase inespecífica.
Embora não tenha sido descrito nenhum gene de dehalogenase para Pigmentiphaga, está
depositada no GenBank uma sequência de diclorometano dehalogenase para A.
dichloromethanicus [29]. Liu et al. [35] confirmaram que a fluoroacetato dehalogenase
degrada outros compostos halogenados, tais como cloroacetato, bromoacetato, iodoacetato
e dicloroacetato, por um mecanismo de adaptação cruzada [36]. Resultados semelhantes
foram obtidos por Donnelly e Murphy [24] que observaram capacidade da fluoroacetato
dehalogenase
para
degradar
cloroacetato,
bromoacetato
e
etil
fluoroacetato.
Alternativamente, o fluoroacetato de sódio foi defluorado pela L-2 haloácida dehalogenase
[18].
Bactérias que degradam fluoroacetato de sódio, principalmente espécies de Bacillus
e Flavobacterium, foram isoladas em amostras de solo na Austrália, mesmo na ausência de
fluoroacetato no ambiente [37]. Neste estudo, duas espécies Pigmentiphaga e Ancylobacter
foram isoladas do rúmen caprino, apesar dos animais não serem alimentados com plantas
que produzam esse composto. Este achado sugere que o gene que codifica a fluoroacetato
dehalogenase é ubíquo e que sua expressão pode representar vantagem seletiva para
microorganismos, pela possibilidade da enzima degradar outros compostos, como
mencionado antes.
Por outro lado, tem sido relatado que animais que pastam em áreas onde Mascagnia
rigida está presente são mais resistentes à intoxicação do que aqueles que não têm contato
com a planta [6]. Resultados recentes de nosso grupo de pesquisa demonstram que a
resistência a intoxicação por M. rigida pode ser induzida através de administrações
sucessivas de doses não tóxicas da planta ou por transfaunação da fauna ruminal de
animais resistentes para susceptíveis (dados não publicados). Estes resultados sugerem que
tanto as alterações na microflora ruminal ou níveis sustentados de expressão de gene que
codifique uma fluoroacetato dehalogenase da microbiota endógena do rúmen são
responsáveis por esta tolerância.
Medidas de controle para prevenir intoxicações por plantas, incluindo uso de
cercas, herbicidas ou outros métodos de eliminação das plantas, foram mal sucedidas para
evitar intoxicações por plantas que contem fluoroacetato no Brasil [38]. Uma forma
alternativa pode ser através da detoxificação microbiana de plantas pela inoculação no
rúmen de bactérias que degradam fluoroacetato. Esta estratégia foi utilizada por Gregg et
al. [39] que inoculou no rúmen uma estirpe geneticamente modificada de Butyrivibrio
34
fibrisolvens com um gene que codifica uma fluoroacetato dehalogenase proveniente de
uma espécie de Moraxella, que foi eficiente em prevenir a intoxicação por fluoroacetato
em ovino. Numa abordagem alternativa, os dois isolados, Pigmentiphaga sp. e
Ancylobacter sp. são candidatos para serem utilizados na colonização do rúmen para evitar
intoxicação por plantas que contem fluoroacetato.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi apoiado pelo INCT para o controle de plantas tóxicas. Projeto número:
573534/2008-0.
35
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38
CAPÍTULO III
Ubiquidade da fluoroacetato dehalogenase em bactérias: uma abordagem in silico
(Ubiquity of fluoroacetate dehalogenase in bacteria: an in silico approach)
Artigo submetido para publicação na revista PLOS ONE, de
acordo com o que estabelece a Norma nº 01/2011 de 03 de
junho de 2011, do Programa de Pós-Graduação em Medicina
Veterinária da UFCG, Campus de Patos/PB.
39
Ubiquidade da fluoroacetato dehalogenase em bactérias: uma abordagem in silico
Expedito K. A. Camboim1, Antonio F. M. Vaz1, Tereza E. F. Rotondano1, Paulo P.
Andrade2, Franklin Riet-Correa1 e Marcia A. Melo1
1
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Campina Grande,
Patos, Paraíba, Brasil.
2
Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Genética, Recife, Pernambuco,
Brasil.
Autor para Correspondência:
Marcia A. Melo, Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de
Campina Grande. Av. Universitária, s/n, Bairro Sta. Cecília, Patos, Paraíba, Brasil. CP:
64, CEP: 58708-110. E-mail: [email protected]
40
RESUMO
Monofluoroacetato de sódio (MFA) é detectado em plantas tóxicas que causam morte
súbita em animais. Este composto é catalisado pela fluoroacetato dehalogenase, que cliva a
ligação carbono-flúor. Até o momento, existem apenas cinco descrições destas enzimas
disponíveis no banco de dados do NCBI. Por isso, realizamos uma análise comparativa de
sequências enzimáticas, utilizando como critério de seleção a conservação da tríade
catalítica, sítio ativo e motivos estruturais da fluoroacetato dehalogenase. De um total de
549 sequências proteicas obtidas do NCBI, 128 continham a tríade catalítica, o sítio ativo e
motivo estrutural encontrados na fluoroacetato dehalogenase de Burkholderia sp.
(gi|95102016), Micromonospora lupini str. lupac 08 (gi|386690726), Rhodopseudomonas
palustris (gi|81829712) e Moraxella sp. (gi|216773), sugerindo que todas são fluoroacetato
dehalogenase pela presença do mecanismo catalítico e estrutural único para defluoração do
monofluoroacetato de sódio. A identificação de 128 sequências representa um aumento de
26 vezes no número de fluoroacetato dehalogenase previamente descritas, refletindo um
mecanismo evolucionário comum; as plantas sintetizam monofluoroacetato de sódio como
mecanismo químico de defesa, o que pode favorecer a ocorrência de um mecanismo coevolutivo entre plantas e a flora bacteriana associada.
41
ABSTRACT
Sodium monofluoroacetate (MFA) is present in some poisonous plants that cause sudden
death in animals. This compound is catalyzed by a fluoroacetate dehalogenase, which
cleaves the carbon-fluorine bond. To date, there are only five descriptions of this enzyme
available at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database.
Therefore, we performed a comparative analysis of enzymatic sequences, using as criterion
for sequence selection the fluoroacetate dehalogenase catalytic triad conservation, active
site and structural motifs. From a total of 549 protein sequences selected from NCBI, 128
contained the catalytic triad, the active site and the structural motif found in the
fluoroacetate dehalogenases of Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini
str. lupac 08 (gi|386690726), Rhodopseudomonas palustris (gi|81829712) and Moraxella
sp. (gi|216773), suggesting that all are fluoroacetate dehalogenases, presenting a single
structural and catalytic mechanism for sodium monofluoroacetate defluorination. The
identification of 128 sequences represents a 26-fold increase in the amount of fluoroacetate
dehalogenase sequences previously described, suggesting the existence of a common
evolutionary mechanism; moreover, when plants synthesize MFA as a chemical defense
mechanism, they may also elicit a co-evolutionary mechanism involving plants and
associated bacterial flora.
INTRODUÇÃO
Os compostos orgânicos halogenados constituem um dos maiores grupos de
poluentes ambientais, como resultado do uso disseminado de herbicidas, inseticidas,
fungicidas, solventes, fluídos hidráulicos e de transferência de calor, plastificantes e
intermediários para síntese de químicos [1]. Estes compostos também podem ser
detectados em plantas tóxicas, sob a forma de monofluoroacetato de sódio (MFA) [2-5],
que causa morte súbita durante esforço físico em animais após ingestão [6-9]. Anualmente,
aproximadamente 500.000 mortes de bovinos ocorrem no Brasil consequente da ingestão
de plantas que contem MFA [10]. A produção de MFA por plantas como proteção contra
pressão de pastejo dos herbívoros e o desenvolvimento de resistência animal a toxina são
42
provavelmente eventos co-evolutivos [11] e a resistência animal vem sendo comumente
associada a bactérias ruminais que degradam MFA [12].
Muitos compostos halogenados de plantas tóxicas são degradados por
microrganismos, os quais usam as enzimas dehalogenases para catalisar compostos
orgânicos halogenados, por clivagem da ligação do carbono-halogênio, sendo
fundamentais para a detoxificação e biodegradação destes compostos [13]. Estas enzimas
são proteínas citosólicas que usam água como único co-substrato e geralmente não
requerem cofatores [1,13]. A degradação microbiana de MFA é catalisada pela
fluoroacetato dehalogenase, que cliva a ligação carbono-flúor [1], mas também cliva,
embora com menor eficiência, outras ligações tais como carbono-cloro, carbono-bromo e
carbono-iodo [14].
O mecanismo de reação de Burkholderia sp. FAc-DEX FA1 foi descrito por
Jitsumori et al. [15] baseado em experimentos de mutagêneses, que propôs que a tríade
catalítica é constituída por Asp104, His271 e Asp128. Inicialmente, o grupo carboxilato
nucleofílico de Asp104 ataca o átomo de carbono de MFA para deslocar o átomo de flúor,
levando à formação de um éster intermediário. No segundo passo, o éster intermediário é
hidrolisado por uma molécula ativada pela His272, que produz glicolato e regenera o grupo
carboxilato de Asp104 [16]. Adicionalmente, Chan et al. [13] propôs que poucos resíduos
do sítio ativo são considerados para caracterizar a atividade da fluoroacetato dehalogenase.
Estes resíduos compreendem um aspartato (Asp-104) atuando como nucleófilo e duas
argininas (Arg) na posição nucleófilo + 1 e nucleófilo + 4.
Até o momento existem apenas cinco descrições de bactérias que tem fluoroacetato
dehalogenase: Moraxella sp. [16], Burkholderia sp. [14], Pseudomonas fluorescens DSM
8341 [17], Micromonospora lupini str. lupac 08 [18] e Rhodopseudomonas palustris [19].
Até o momento, uma busca exaustiva por genomas de bactérias com genes que codificam
fluoroacetato dehalogenase ainda não foi realizada. Como novas bactérias isoladas de solo
e de rúmen caprino apresentando capacidade de degradar MFA foram recentemente
descritas [20,21], faz-se necessário realizar uma análise comparativa de sequências
enzimáticas disponíveis no banco de dados do NCBI, explorando a conservação da tríade
catalítica, sítio ativo e motivo estrutural da fluoroacetato dehalogenase. Nossos resultados
mostraram que os genes para fluoroacetato dehalogenase estão presentes de forma muito
mais ampla em bactérias do que previamente suspeitava-se e possuem uma alta
conservação.
43
METERIAL E MÉTODOS
Identificação e Analise das Sequências de Fluoroacetato Dehalogenase
As sequências de proteínas foram inicialmente selecionadas no site do National
Center for Biotechnology Information (NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov), usando
como
palavra-chave haloacetato
dehalogenase.
As sequências de
fluoroacetato
dehalogenases de Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini str. lupac 08
(gi|386690726), Moraxella sp. (gi|216773) e Rhodopseudomonas palustris (gi|81829712)
também foram utilizadas para pesquisa no banco de dados do NCBI através do Blastp
(Basic Local Alignment Search Tool - Protein). As sequências encontradas foram
armazenadas em formato FASTA para posterior alinhamento no programa MEGA 5.0
(http://www.megasoftware.net/mega.php) [22] pelo ClustalW. A presença dos resíduos
Asp104, Hist271 e Asp128 da tríade catalítica, o sítio ativo e o aminoácido triptofano da
posição 150 (Trp150) foram os critérios para seleção das sequências, uma vez que estes
resíduos determinam a atividade específica da fluoroacetato dehalogenase, de acordo com
Liu et al. [16], Jitsumori et al. [15] e Chan et al. [13].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um total de 549 sequências proteicas foi selecionado através da palavra-chave e
pela pesquisa do BLAST. Seguindo o alinhamento global e o uso dos critérios estruturais
estabelecidos para as prováveis atividades de fluoroacetato dehalogenases, 128 sequências
continham a tríade catalítica, o sítio ativo e o motivo estrutural encontrados na
fluoroacetato dehalogenase de Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini str.
lupac 08 (gi|386690726), Rhodopseudomonas palustris (gi|81829712) e Moraxella sp.
(gi|216773), sugerindo que todas são fluoroacetato dehalogenase. A maior e menor
sequência enzimática contem 354 aminoácidos (Burkholderia dolosa AUO158,
gi|254254471) e 262 aminoácidos (Crocosphaera watsonii WH 0003, gi|357266014),
respectivamente.
Todas as 128 sequências proteicas mantinham conservados os resíduos do sítio
ativo, tais como Phe34, Asp104, Arg105, Arg108, Asp128, His271 e Phe272 constituindo
o domínio principal e Tyr147, His149, Trp150 e Tyr212 no domínio superficial, de acordo
como proposto por Jitsumori et al. [15], baseado na análise por mutagênese da
44
fluoroacetato dehalogenase de Burkholderia sp. Outra importante observação é a presença
do Trp150, um importante resíduo envolvido na interação da enzima com o átomo de flúor
do MFA, sendo provavelmente um requisito essencial para a redução da energia de
ativação e clivagem da ligação carbono-flúor. Esta interação pode também ser necessária
para a orientação adequada deste substrato no sítio ativo da fluoroacetato dehalogenase
[15]. Alem disso, foi observado uma evidente conservação dos aminoácidos His32, Gly33,
Pro35 e Gly106, estes quatro resíduos sendo previamente descritos como motivos
estruturais das famílias de haloalcano dehalogenase tipo I e II, esterases e fluoroacetato
dehalogenase como proposto por Chan et al. [13].
Das 128 sequências, 20 apresentaram conservação da tríade catalítica e do sítio
ativo da fluoroacetato dehalogenase (Tabela 1), como proposto por Liu et al. [16],
Jitsumori et al. [15] e Chan et al. [13].
45
Tabela 1. Alinhamento das sequências de fluoroacetato dehalogenases entre Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini str. lupac
08 (gi|386690726), Moraxella sp. (gi|216773) e Rhodopseudomonas palustris (gi|81829712) e as sequências enzimáticas de bactérias que
possuem a mesma tríade catalítica (seleção em preto), motivos estruturais (seleção em cinza claro) e confirmado/ provável resíduo de sítio ativo
(seleção em cinza escuro).
46
Na base de dados do NCBI, as prováveis funções atribuídas as 20 enzimas que
apresentaram sítio ativo conservado foram: alfa/beta hidrolase, proteína do tipo alfa/beta
hidrolase, produto do gene DehH1, haloacetato dehalogenase, provável haloacetato
dehalogenase h-1, proteína hipotética, provável alfa/beta hidrolase provável haloacetato
dehalogenase e provável hidrolase. Essas sequências pertencem a dois filos bacterianos:
Actinobacteria e Proteobacteria. O primeiro filo é representado somente pelo gênero
Pseudonocardia. Todos os demais gêneros (Acidovorax, Azorhizobium, Azospirillum,
Curvibacter, Leptothrix, Maritimibacter, Methylobacterium, Oceanicola, Ralstonia,
Ramlibacter, Roseobacter, Sagittula e Xanthobacter) pertencem ao filo Proteobacteria. No
caso de Methylobacterium, duas sequências estavam disponíveis, sendo as estirpes M.
extorquens DM4 e DSM 13060, ambas com 305 aminoácidos em sua composição, porém
divergindo em seis deles, DM4: Ala32, Ser80, Ala208, Val235, Leu256 e Gln258; DSM
13060: Ser32, Arg80, Gly208, Ala235, Phe256 e Arg258. Além disso, duas sequências de
organismos não foram identificadas até o nível de gênero: um organismo pertence à família
Oxalobacteraceae e outro a ordem Rhodobacterales.
Para as demais 108 sequências, listadas na tabela 2, a tríade catalítica também está
conservada, entretanto, algumas delas apresentam substituições em aminoácidos do sítio
ativo, explicitamente: Phe34, Tyr147, His149 e Phe272. Esses aminoácidos não são parte
do consenso para a fluoroacetato dehalogenase proposta por Jitsumori et al. [15]. Além
disso, em relação aos aminoácidos propostos por Chan et al. [13] como constituintes do
motivo estrutural, a Gly102 por vezes também é substituída.
47
Tabela 2. Alinhamento das sequências de fluoroacetato dehalogenases entre Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini str. lupac
08 (gi|386690726), Moraxella sp. (gi|216773) e Rhodopseudomonas palustris (gi|81829712) e as 108 sequências enzimáticas de bactérias que
possuem algumas alterações no sítio ativo. Tríade catalítica (seleção em preto), motivos estruturais (seleção em cinza claro) e confirmados/
prováveis resíduo de sítio ativo (seleção em cinza escuro); * indica substituição dos aminoácidos.
48
Tabela 2. Continuação.
49
Tabela 2. Continuação.
50
A tabela 3 apresenta os aminoácidos do sítio ativo que não estavam totalmente
conservados entre as 108 sequências enzimáticas, bem como seus respectivos percentuais
de substituição. Não foi possível estabelecer um padrão que pudesse sugerir que estas
sequências pertencessem a diferentes famílias de dehalogenases, como por exemplo,
haloalcano dehalogenase tipo I e II ou esterases. Adicionalmente, o fato que Jitsumori et al.
[15] não perceberem que poderia haver substituições de aminoácidos nos resíduos do sítio
ativo e nos motivos estruturais pode ser explicado pelo fato de que estes autores usaram
apenas uma sequência enzimática para desenvolver seu modelo experimental.
51
TABELA 3. Percentual de substituição dos aminoácidos do sítio ativo das 108 sequências disponíveis no banco de dados de sequências
proteicas do NCBI, em relação à fluoroacetato dehalogenase de Burkholderia sp. (gi|95102016).
Aminoácidos da enzima de
Burkholderia sp. (gi|95102016)
Aminoácidos das enzimas analisadas e percentual de substituição
Phe34
H
(62,04%)
Y
(28,70%)
F
(3,70%)
N
(2,78%)
M
(1,85%)
I
(0,93%)
Tyr147
Y
(92,58%)
V
(1,84%)
A
(0,93%)
F
(0,93%)
I
(0,93%)
K
(0,93%)
His149
H
(92,59%)
W
(6,48%)
V
(0,93%)
Phe272
Y
(69,44%)
F
(24,07%)
S
(5,56%)
T
(0,93%)
N
(0,93%)
T
(0,93%)
52
A disponibilidade de 133 sequências de fluoroacetato dehalogenase em bactérias
permitirá um estudo mais amplo sobre sua característica catalítica. A identificação de 128
novas prováveis sequências representa um aumento de 26 vezes no número de sequências
de fluoroacetato dehalogenase disponíveis no banco de dados do NCBI. Embora não seja
suficiente prever completamente a especificidade das prováveis enzimas, cujas sequências
estão listadas nas tabelas 1 e 2, baseadas apenas em sua homologia dos aminoácidos com
as outras fluoroacetato dehalogenase previamente caracterizadas, nossos dados fortemente
sugerem a existência de um mecanismo catalítico e estrutural único para defluoração do
MFA. Isso pode refletir um mecanismo evolucionário comum, previamente não descrito.
A presença de uma fluoroacetato dehalogenase conservada entre diferentes filos
bacterianos, provavelmente está associada à síntese disseminada de metabolitos
secundários contendo flúor, objetivando a proteção do hospedeiro contra herbivoria e
patógenos [23,24]. De fato, Eason et al. [25] sugere que a capacidade de sintetizar MFA
pode ser muito mais frequente entre as plantas do que previamente reconhecida. Isto pode
ser uma tendência em plantas altamente tóxicas, enquanto que, os mecanismos de seleção
natural podem ocorrer sob uma pressão química muito menor. Por outro lado, as plantas
estão sujeitas a uma seleção inversa, o que pode levar a ocorrência de uma co-evolução das
plantas e da flora bacteriana associada.
53
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56
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho foi iniciado em 2008, com o objetivo de obter bactérias com atividade
de fluoroacetato dehalogenase para, futuramente, serem utilizadas na produção de inóculos
que, uma vez introduzidos no rúmen, hidrolisem o monofluoroacetato de sódio (MFA)
contido em plantas tóxicas, protegendo os animais da intoxicação.
Nessa época havia duas correntes: a do pesquisador Greeg, que tinha desenvolvido
uma bactéria modificada geneticamente, inserindo um gene proveniente de uma espécie de
Moraxella, que codifica fluoroacetato dehalogenase na bactéria Butirivibrio fibrisolvins.
Experimentalmente, a inoculação desta bactéria modificada foi eficiente na prevenção da
intoxicação por MFA em ovinos. A segunda hipótese, do Dr Chris McSweeney (CSIRO,
Austrália), colaborador deste projeto, propunha que as bactérias utilizadas deveriam ser
bactérias anaeróbicas encontradas no rúmen, que uma vez isoladas poderiam ser
multiplicadas para produzir inóculos a serem introduzidos intraruminalmente.
Neste trabalho, foram identificadas diversas bactérias aeróbicas capazes de
hidrolisar MFA, provenientes de solo, plantas e rúmen caprino. Simultaneamente,
trabalhos de nosso grupo de pesquisa, determinaram que a administração de doses não
tóxicas de Amorimia (Mascagnia) septentrionalis (tinguí), que contêm MFA, induzem
resistência à intoxicação por essa substância. Esses resultados e os resultados dos dois
primeiros trabalhos desta tese, sugerem que há normalmente no rúmen, bactérias que
hidrolisam MFA, que ao serem expostas ao substrato são induzidas a expressarem genes
que codificam uma fluoroacetato dehalogenases, protegendo o animal da intoxicação. Esta
hipótese foi verificada no terceiro capítulo desta tese, no qual se observou que a presença
destas enzimas em bactérias é bem mais disseminada do que se previa anteriormente. Esses
achados abrem caminho para novas hipóteses como, por exemplo, a utilização de MFA em
doses não tóxicas e/ou substratos químicos não tóxicos, que induzam a produção destas
enzimas pelas bactérias ruminais.