universidade ceuma pró-reitoria de pós
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0 UNIVERSIDADE CEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA PATRICIA CRISTINA SALDANHA RIBEIRO CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DO GENE blaKPC EM BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS DE HOSPITAIS DE SÃO LUIS-MA São Luís 2014 1 PATRICIA CRISTINA SALDANHA RIBEIRO CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DO GENE blaKPC EM BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS DE HOSPITAIS DE SÃO LUIS-MA Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Biologia Parasitária da Universidade CEUMA, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientadora: Profª. Drª. Maria Rosa Quaresma Bomfim Co-orientadora: Profª. Drª. Sirlei Garcia Marques São Luís 2014 2 R484d Ribeiro, Patrícia Cristina Saldanha. Caracterização fenotípica e molecular do gene blaKPC em bactérias Gram negativas de hospitais de São Luis-MA. / Patrícia Cristina Saldanha Ribeiro. - São Luís: UNICEUMA, 2014. 109 p.:il. Monografia (Mestrado) – Mestrado em Biologia Parasitária. Universidade CEUMA, 2014. 1. Bactérias Gram negativas. 2. Gene blaKPC. 3. Variantes KPC. I. Bomfim, Maria Rosa Quaresma (Orientadora). II. Grisotto, Marcos Augusto Grigolin (Coordenador). III. Marques, Sirlei Garcia (Coorientadora). IV. Título. CDU: 616.98:616-022.36 2 PATRICIA CRISTINA SALDANHA RIBEIRO CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DO GENE blaKPC EM BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS DE HOSPITAIS DE SÃO LUIS-MA Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Biologia Parasitária da Universidade CEUMA, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Aprovada: ____/____/_____ BANCA EXAMINADORA ____________________________________________________ Profª. Drª. Maria Rosa Quaresma Bomfim (Orientadora) Doutora em Ciências Biológicas Universidade CEUMA ____________________________________________________ 1º Examinador Universidade CEUMA ____________________________________________________ 2º Examinador Universidade CEUMA ____________________________________________________ 3º Examinador Universidade CEUMA 3 Aos meus pais, Pedro Batista e Edma “in memoriam”, pelos ensinamentos com grande sabedoria e pela presença constante na minha vida. Ao meu marido Washington e nossos filhos Lucas e Victor, pelo amor incondicional, incentivo, compreensão e por tornarem a minha vida cada dia mais feliz. 4 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pela vida abençoada que tenho, pelas oportunidades concedidas e por colocar no meu caminho pessoas tão especiais. À minha família amada que é meu alicerce. Agradeço a cada momento precioso que passamos juntos. Agradeço imensamente à minha orientadora Profa. Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim pela oportunidade, competência e ensinamentos. Obrigada pelo carinho e pela convivência tão agradável. Você é exemplar! À minha co-orientadora, Dra. Sirlei Garcia Marques pela confiança e incentivos que tanto contribuíram para o meu crescimento profissional. A você toda a minha admiração e amizade. Agradeço especialmente à Martina Márcia Melo Coqueiro, grande amiga, parceira e sempre disposta a ajudar. Você foi indispensável para a realização deste trabalho. Obrigada pela sua amizade. Aos meus amigos do setor da microbiologia do Hospital Universitário (Alícia, Tânia, Wanda, José Ferreira, Elissandre, Kelly, Rosália, Jossilene e Joaquim), pelo companheirismo. Sem a ajuda de vocês certamente a realização deste trabalho não seria possível. A vocês todo o meu carinho e gratidão. À Dra. Ana Luiza Bezelga e Dra. Hilma Alencar de Souto. O meu eterno agradecimento por possibilitar a minha liberação para a realização deste trabalho. À minha equipe do setor da microbiologia do Laboratório Cedro (Luciane Melônio, Yankee, Lécia, Cristianne, Thalita, Luciana, Mônica, Rosely, João, Jorge, Hudson e Carlos), pela convivência maravilhosa, pela participação na coleção das amostras e por estarem sempre disponíveis para colaborar nesta pesquisa. À família Hachem proprietários do Laboratório Cedro, local onde foi realizada parte desta pesquisa. À Profa. Andréia, pela participação e dedicação a este trabalho. Ao Prof. Sílvio Monteiro, pelo empenho e colaboração na realização da análise estatística deste trabalho. A todos os professores do Mestrado em Biologia Parasitária pelos conhecimentos adquiridos. Aos colegas, alunos do mestrado, pelos momentos de diversão e descontração durante todo o período letivo. Foi muito bom conhecer todos vocês. 5 Às minhas queridas cunhadas, Cláudia e Cristiane pelo empenho e dedicação na normatização deste trabalho. À FAPEMA, pelo auxílio financeiro. Por fim, agradeço àquelas pessoas que contribuíram direta ou indiretamente na realização desta pesquisa. 6 “Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o que era antes”. (Marthin Luther King) 7 RESUMO A rápida disseminação de bactérias produtoras de KPC representa um sério problema de saúde pública, uma vez que a infecção é difícil de ser tratada devida à escassa opção terapêutica associada ao aumento da mortalidade, duração do período de internação e custos elevados para os cofres públicos. Neste contexto, o foco do presente estudo foi pesquisar a prevalência, a detecção e identificação das variantes genéticas, por métodos moleculares, de bactérias produtoras de carbapenemases tipo KPC, em 297 isolados clínicos oriundos de pacientes de hospitais públicos e particulares de São Luis-MA que foram coletados no período de junho de 2012 a julho de 2013. Os resultados da identificação fenotípica pelo método automatizado Vitek2® (Biomérieux, França) detectou 10 gêneros bacterianos: Acinetobacter spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Pantoea spp., Proteus spp., Escherichia spp., Raoultella spp e Aeromonas spp. Destes, os mais frequentes foram Acinetobacter baumannii 128 (43,4%), Klebsiella pneumoniae 75 (25,2%) e Pseudomonas aeruginosa 42 (14,1%). Dentre os hospitais participantes do estudo, 14 pertenciam à rede pública apresentando um maior número de isolados 260 (87,20%) enquanto nos 02 hospitais particulares o quantitativo foi de 37 (12,5%) isolados. Obteve-se um perfil de multidroga resistência (MDR) aos diferentes antimicrobianos testados nos isolados dos 16 hospitais participantes. A droga que apresentou melhor atividade para todos os isolados foi a polimixina B, tanto para espécies bacterianas fermentadoras quanto para não fermentadoras. Os isolados de Acinetobacter spp e de Klebsiella pneumoniae foram sensíveis a amicacina e tigeciclina e os de Pseudomonas spp foram sensíveis a amicacina e a gentamicina. Os valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM50 e CIM90) para polimixina B foram iguais para estas três espécies de micro-organismos, demonstrando que tal fármaco foi o mais efetivo sobre esses isolados. Com relação à detecção do gene blaKPC entre os 297 isolados avaliados obteve-se 99 (33,3%) de positividade, incluindo bactérias não fermentadoras (Acinetobacter baumannii) e fermentadoras. Dentre os KPC positivos avaliados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) os micro-organismos com maior percentual foram Klebsiella pneumoniae com 78,7% e Enterobacter aerogenes com 66,7%. Das bactérias não fermentadoras de glicose incluídas neste estudo, somente a espécie A.baumannii foi portadora do gene blaKPC. A maior frequência da 8 presença do gene blaKPC entre os espécimes clínicos foi encontrada na secreção traqueal 37,7% e na urina 21,5%. Além disso, observou-se uma correlação entre a presença do gene blaKPC e o setor de internação do paciente. Na qual, encontrou-se uma taxa de 44,4% de positividade para KPC em isolados detectados de pacientes da Unidade Intermediária e 34% de isolados recuperados de pacientes das Unidades de Terapia Intensiva dos diferentes hospitais avaliados. A taxa de similaridade genética variou entre 96 e 100% entre as sequencias obtidas para os 99 isolados positivos para o gene blaKPC e sequencias existentes no Genbank. As variantes do gene blaKPC detectadas foram KCP-2 em todos isolados pertencentes às espécies fermentadoras e KPC-10 para todos os isolados da espécie A. baumannii. É importante ressaltar que não foram encontradas no Genbank depósito de sequencias para as espécies Raoultella planticola, Raoultella ornithinolytica e Pantoea spp., este achado representa a primeira descrição dessas espécies como portadoras do gene blaKPC. Os resultados da presente pesquisa apontam para uma necessidade urgente de adoção de medidas preventivas e de controle das Infecções relacionadas à assistência a saúde, não somente pelos profissionais da área de saúde, mas também pelos órgãos governamentais, seja no âmbito municipal, estadual e federal, porque a produção da enzima carbapenemase/KPC é um mecanismo emergente e de rápida disseminação, o que justifica a vigilância epidemiológica eficaz pelo constante rastreamento dos casos novos. Palavras-chave: Bactérias Gram negativas. Gene blaKPC. Variantes KPC. 9 ABSTRACT The quick dissemination of bacteria which produce KPC represent a serious public health’s problem, just because it is difficult to treat of the infection. It is due to the scarce therapeutic option associated to the increase of the mortality, duration of internation and high costs to the public treasures. In this context the phocus of the present study was to research the prevalence, the detection and identification of the genetic variants by molecular methods, of bacteria which produce carbapenemases type KPC, in 297 cliical isolated which came from patients at public and private hospitals in São Luís/Ma (Brazil). They were collected in the period from June 2012 to July 2013. The results of the phenotypical identification by the authomatized method Vitek 2® (Biomérieux, France) detected 10 bacterian genders: Acinetobacter spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Pantoea spp., Proteus spp., Escherichia spp., Raoultella spp and Aeromonas spp. From these the most frequent were Acinetobacter baumannii 128 (43,4%), Klebsiella pneumoniae 75 (25,2%) and Pseudomonas aeruginosa 42 (14,1%). Among the study participant hospitals 14 belonged to the public net presenting a major number of isolated 260 (87,20%), while at the 02 private hospitals the percentual was isolated 37 (12,5%). It was obtained a profile of multidrug resistant (MDR) to the different antimicrobian tested in the isolated of the 16 participant hospitals. The drug which presented a better performance for all the isolated a better performance for all the isolated was the polimixin B, both for bacterian fermentative species and for those mon-fermentative. The isolated Acinetobacter spp. and Klebsiella pneumoniae were sensible to amicacineand tigecycline and those of Pseudomonas spp. were sensible to the amicacine and the gentamicine. The values of the Minimal Inhibitive Concentration (CIM50 and CIM90) for polimixine B were equal to the these three species of microorganisms, so demonstrating that such a pharmacon was the most effective upon those isolated. As to the detection of the gene blaKPC among the 297 isolated avaliated it was obtained 99 (33,3%) of positiveness including bacteria non fermentative (Acinetobacter baumannii) and fermentative. Among the positive KPC avaliated by the reaction in chain of the Polimerase (PCR) the microorganisms with a major percentual were Klebsiella pneumoniae with 78,7% and Enterobacter aerogenes with 66,7%. From the nonfermentative of glucose include in this study only the species A.baumannii was a bearer of the gene blaKPC. The major frequence 10 of the presence of the gene blaKPC among the clinical specimens was found in the tracheal secretion 37,7% and in the urine 21,5%. Besides it was observed a correlation between the presence of gene blaKPC and the sector of internation of the patient. In it was found a rate of 44,4% of positiveness for KPC in isolated detected of patients at the intermediate Unity and 34% of recovered among the patients at the Unities of Intensive Therapy at from the different avaliated hospitals. The genetic similanty rate varied between 96 e 100% among the obtained sequences for the 99 positive isolated for the gene blaKPC and existent sequences in the Genbank. A variants of the gene blaKPC detected were KCP-2 in all isolated belonging to the fermentative species and KPC-10 for all the isolated of the species A. baumannii. It’s important to emphasize that it wasn’t found in the Genback a deposit of sequences for the species Raoultella planticola, Raoultella ornithinolytica e Pantoea spp., this discovery represents the first description of those species like bearers of the gene blaKPC. The results of the research point to and urgent need of adoption of preventive measures and of control of the infections related tod assistance to health, not only by professionals from the health area but also from the government organs be in the municipal, state and federal sphere, because the production of the enzyme carbapenemase/KPC is an emergent mechanism and of quick dissemination, what justifies the effective epidemiological watchfulness by the constant tract of the new cases. Key-Words: Gram negative bacteria. Gene blaKPC. Variants KPC. 11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Distribuição de frequência dos bacilos gram-negativos em diferentes hospitais de São Luis-MA, no período de Junho/12 a Julho/13............................................................................................ 59 Tabela 2 Perfil de resistência aos antibióticos e a concentração mínima inibitória em relação às espécies bacterianas não fermentadoras isoladas em hospitais de São Luis-MA, no período de Jun/12 a Jul/13................................................................................................ 61 Tabela 3 Perfil de resistência aos antibióticos e a concentração mínima inibitória em relação às espécies bacterianas fermentadoras isoladas em hospitais de São Luis-MA, no período de Jun/12 a Jul/13................................................................................................ 62 Tabela 4 Concentração inibitória mínima (µg/mL) (CIM50) e (CIM90) das linhagens frequentemente isoladas, de hospitais públicos e privados de São Luis, Maranhão, Brasil ........................................... 63 Tabela 5 Associação de Teste Hodge modificado em relação à espécie bacteriana ........................................................................................ 64 Tabela 6 Associação entre Gene blaKPC e Teste de Hodge Modificado (THM) ............................................................................................... 64 Tabela 7 Associação do gene blaKPC em relação à espécie bacteriana .......... 65 Tabela 8 Distribuição de frequência dos materiais biológicos de onde foram encontradas as bactérias com positividade para o gene blaKPC ....... 67 Tabela 9 Distribuição dos micro-organismos produtores de KPC isolados de hospitais de São Luis-MA, em relação aos espécimes clínicos, no período de Junho/12 a Julho/13 .................................................. 68 Tabela 10 Distribuição de frequência das acomodações onde foram encontradas as bactérias e gene blaKPC........................................... 69 Tabela 11 Relação entre a procedência, espécie bacteriana não fermentadora e presença do gene blaKPC ........................................ ..71 71 Tabela 12 Relação entre a procedência, espécies de bacilos gram-negativos fermentadores e presença do gene blaKPC ........................................ 72 12 Tabela 13 Porcentagem dos micro-organismos resistentes aos 74 antimicrobianos portadores do gene blaKPC ...................................... Tabela 14 Análise de similaridade genética das sequências do gene blaKPC dos isolados em relação às sequências do Genbank ....................... 76 13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AMI Amicacina AMP Ampicilina AmpC Enzima cefalosporinase cromossomal β-lactamase de classe C ARG Arginina ARI-1 Acinetobacter resistente ao imipenem (do inglês, Acinetobacter resistant imipenem) ASB Ampicilina/sulbactam AST-N239 Antimicrobial Susceptibility Test Gram negative ATCC American Type Culture Collection BHI Brain Heart Infusion BLA Beta lactamase BLAST Basic Alignment Search Tool CAZ Ceftazidima CFO Cefoxitina CIP Ciprofloxacina CLSI Clinical Laboratory Standards Institute CPM Cefepime dATP Desoxiadenosina trifosfatado dCTP Desoxicitidina trifosfatado dGTP Desoxiguanosina trifosfatado DNA Ácido desoxiribonucléico (do inglês, DeoxyriboNucleic Acid) dNTP Desoxiribonuleotídeo trifosfatado dTTP Desoxitimidina trifosfatado EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, Ethylenediaminetetraacetic acid) ERT Ertapenem ESBL Beta lactamase de amplo espectro (do inglês, Extended-Spectrum β-lactamase) EUA Estados Unidos das Américas GEN Gentamicina 14 GES Guiana- Extended Spectrum GIM German imipenemase GLY Glicina GN Gram negativo ICARE Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology IMI Imipenem IMP Imipenemase IND Chryseobacterium indologenes metaloenzyme IRAS Infecções relacionadas à assistência à saúde Kb Kilobase Kcat Constante cinética que representa catálise KPC Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase LACEN-MA Laboratório Central do Maranhão LPS Lipopolissacarídeo MBLs Metalo-beta-lactamases MDR Multidrogas- resistentes MER Meropenem MIC Concentração inibitória mínima (do inglês, minimum inhibitory concentration) NDM New Delly Metalo beta-lactamase NMCA/IMI Imipenem-hydrolyzing beta-lactamase/ not metalloenzyme carbapenemase ‘A’ NRCST National Reference Center for Susceptibility Testing OMP Proteína de membrana externa (do inglês, outer membrane protein) OXA Oxacilinase PBP Proteína ligadora de penicilina (do inglês, penicillin binding protein) PBS Solução salina tamponada com fosfato (do inglês, phosphatebuffered saline) PCR Reação em cadeia pela polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction) POL Polimixina B PRO Prolina 15 PTZ Piperacilina/Tazobactam REIPI Spanish Network Research of Infectious Disease rpm Rotação por minuto SHV Sulfhydryl Reagent Variable SIM Seoul imipenemase SME Serratia marcescens enzyme SNP Polimorfismo de nucleotídeo único (do inglês, Single Nucleotide Polymorphism) SPM São Paulo metalo β-lactamase ST Tipo de sequência (do inglês, Sequency Type) TBE Tris-Borato-EDTA TE Tris-EDTA TEM Temoriana enzyme TGC Tigeciclina THM Teste de Hodge Modificado TIG Tigeciclina Tn Transposon TSA Teste de sensibilidade aos antibióticos UTI Unidade de terapia intensiva VAL Valina VIM Verona imipenemase 16 LISTA DE SÍMBOLOS µg Micrograma µL Microlitro µM Micromolar HCl Ácido Clorídrico mg Miligrama MgCl2 Cloreto de magnésio mL Mililitros mM Milimolar mV Milivolt ng Nanograma ºC Grau Celsius pH Potencial hidrogeniônico pmol Picomol V Volts 17 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 20 2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................... 25 2.1 Principais membros da família Enterobacteriaceae com perfil de resistência aos carbapenêmicos ............................................................ 28 2.1.1 Gênero Escherichia .................................................................................... 29 2.1.2 Gênero Klebsiella ....................................................................................... 31 2.1.3 Gênero Enterobacter .................................................................................. 32 2.1.4 Gênero Proteus .......................................................................................... 33 2.1.5 Gênero Serratia .......................................................................................... 35 2.2 Gêneros bacterianos não fermentadores da glicose com perfil de resistência aos carbapenêmicos ............................................................ 36 2.2.1 Pseudomonas aeruginosa .......................................................................... 36 2.2.2 Acinetobacter spp ....................................................................................... 38 2.2.3 Epidemiologia das bactérias produtoras de KPC ....................................... 40 2.2.4 KPC no Brasil ............................................................................................. 43 2.2.5 Métodos para a detecção da produção de KPC’s ...................................... 46 3 JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 48 4 OBJETIVOS DA PESQUISA .................................................................... 50 4.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 50 4.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 50 5 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 51 5.1 Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa ......................................... 51 5.2 Tipo do estudo .......................................................................................... 51 5.3 Local do estudo e amostragem ............................................................... 51 5.4 Crítérios de inclusão ................................................................................ 51 5.5 Critérios de não inclusão ......................................................................... 52 5.6 Isolamento e identificação bacteriana .................................................... 52 5.7 Teste automatizado de susceptibilidade aos antimicrobianos ............ 52 5.8 Teste de susceptibilidade pelo método de disco-difusão .................... 53 5.9 Drogas antibacterianas testadas ............................................................ 53 18 5.10 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de carbapenêmicos pelo método epsilométrico- E-test® .......................... 54 5.11 Teste de Hodge modificado (Detecção fenotípica da produção de carbapenemase) ....................................................................................... 54 5.12 Controle de qualidade dos meios, reagentes e teste de susceptibilidade aos antimicrobianos .................................................... 55 5.13 Identificação molecular das linhagens bacterianas isoladas resistentes aos antimicrobianos carbapenêmicos ................................ 55 5.13.1 Extração do DNA das amostras microbianas ............................................. 55 5.13.2 Ensaios de PCR para a detecção do gene blaKPC ..................................... . 55 5.13.3 Análise dos produtos amplificados na PCR ................................................ 56 5.13.4 Purificação e sequenciamento dos produtos da PCR ................................ 56 5.13.5 Análise computacional das sequências ...................................................... 57 5.13.6 Análises estatísticas dos dados.................................................................. 57 6 RESULTADOS ........................................................................................... 58 6.1 Identificação das espécies bacterianas e sua distribuição em relação à procedência .............................................................................. 58 6.2 Perfil de resistência aos antimicrobianos e determinação da concentração inibitória mínima (CIM), pelo método automatizado (Vitek) e E-test........................................................................................... 60 6.3 Avaliação entre o teste de Hodge modificado (THM) e espécie bacteriana.................................................................................................. 63 6.4 Detecção do gene blaKPC nos isolados bacterianos com sensibilidade diminuída aos carbapenêmicos ....................................... 65 6.5 Distribuição de frequência dos espécimes clínicos de onde foram recuperadas as bactérias que apresentaram positividade para o gene blaKPC. ............................................................................................... 66 6.6 Distribuição da frequência das acomodações hospitalares de onde foram isoladas as bactérias multirresistentes e que apresentaram positividade para o gene blaKPC .............................................................. 69 6.7 O quantitativo de espécies de bactérias carreadoras do gene blaKPC em relação à sua procedência (hospitais de São Luís) ........................ 70 19 6.8 Sequenciamento do produto de PCR de isolados positivos para o gene blaKPC ................................................................................................ 75 7 DISCUSSÃO .............................................................................................. 78 8 CONCLUSÃO ............................................................................................ 87 REFERÊNCIAS ......................................................................................... 88 20 1 INTRODUÇÃO As bactérias são os organismos mais bem sucedidos do planeta em relação ao número de indivíduos. Elas são parte integral e inseparável da vida na terra e estão amplamente distribuídas na natureza. Muitas espécies bacterianas são inofensivas, outras são benéficas para o seu hospedeiro (homem, plantas e animais), proporcionando nutrição e proteção contra a instalação de espécies patogênicas ao indivíduo (KONEMAN, 2008). As bactérias, como os demais seres, garantem a sobrevivência de sua espécie através de algum tipo de reprodução (KONEMAN, 2008). A maioria das bactérias tem um período curto de geração, minutos ou horas, dependendo da espécie. Essa propriedade confere-lhes a capacidade de responder rapidamente às mudanças do ambiente (KONEMAN, 2008). No processo de adaptação a estas mudanças as bactérias empregam elaborados sistemas para evitar o acúmulo de mutações em seu DNA, o qual pode ser prejudicial ou letal à sua sobrevivência (KUNKEL; ERIE, 2005). Apesar da maioria das bactérias não causar doenças aos seres humanos, ao longo dos séculos, tem havido uma constante batalha entre o homem e a multidão de micro-organismos que causam infecções e doenças, e que vitimaram milhares de pessoas em todo o mundo (TENOVER, 2006). Dados sobre a resistência natural nos micro-organismos datam antes da era antibiótica onde se destacam os reservatórios ambientais e animais, tais como: solo e animais selvagens, respectivamente, os quais albergam genes de resistência aos antimicrobianos independentemente da manipulação humana. Esses reservatórios ecológicos são potencialmente impactantes nas bactérias clinicamente importantes (ALLEN et al., 2010). Informações estatísticas divulgadas mostraram que nas duas últimas décadas, aproximadamente 75% de todas as doenças humanas emergentes têm sido causada por agentes infecciosos, cujos hospedeiros naturais são animais selvagens, possivelmente devido ao aumento do contato humano com esses animais (ALLEN et al., 2010). Este fato tem ocasionado a translocação de microorganismos, a tranferência horizontal de genes de resistência aos antibióticos à manutenção desses genes mesmo na ausência de pressão seletiva (ALLEN et al., 2010). Ou ainda, pela contaminação de ambientes aquáticos com relevantes 21 produtores de enzimas carbapenemases, os quais podem favorecer e acelerar a disseminação para outros ambientes (MIRIAGOU et al., 2010). Ressalta-se que quando a penicilina foi introduzida na prática clínica, em 1941, parecia representar a decisiva vitória do homem sobre as bactérias. Os antibióticos passaram então a ser chamados de “drogas milagrosas” ou “balas mágicas” (BAQUERO, 2004; TENOVER, 2006). Entretanto, a difusão do uso clínico da penicilina trouxe ao conhecimento o fato de que entre micro-organismos sensíveis ao antibiótico poderiam surgir exemplares resistentes (TENOVER, 2006). A constatação de que a resistência bacteriana aos agentes antimicrobianos podia ser uma característica natural das espécies ou ser adquirida por estirpes individuais dentro de uma população sensível foi postulado por Fleming em 1929, ao descobrir a penicilina (TAVARES, 2000). Alguns anos mais tarde, a causa desta resistência natural foi descoberta por Abraham e Chain, que, em 1940, um ano antes da primeira publicação sobre o uso clínico da penicilina, demonstraram em extratos de E. coli uma enzima capaz de destruir a ação da penicilina, a qual denominaram penicilinase. Exemplo clássico de resistência antimicrobiana clinicamente observada foi descrito por Kirby em 1944, em isolados de Staphylococcus aureus resistentes à Penicilina (BAUER; PERRY; KIRBY, 1960; TAVARES, 2000; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010). Desde então, o fenômeno da resistência tornou-se um sério problema de saúde pública em todo o mundo, aumentando a cada ano tanto na comunidade quanto no ambiente hospitalar (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010). Desde as primeiras descrições de resistência bacteriana à penicilina, no início dos anos 40 (ABRAHAM; CHAIN, 1940; BAUER; PERRY; KIRBY, 1960), até os dias de hoje, tem crescido assustadoramente o número de espécies bacterianas com perfil de resistência a diferentes classes de antimicrobianos. A penicilinase, descoberta por Fleming em 1929, e clinicamente envolvida nos casos de resistência à penicilina, descritos por Abraham e Chain (1940); Bauer, Perry e Kirby (1960), é uma beta-lactamase, enzima que hidrolisa o anel beta-lactâmico do antibiótico pela quebra da ligação amida, perdendo assim, a capacidade de inibir a síntese da parede celular bacteriana. Um número elevado de espécies bacterianas Grampositivas e Gram-negativas apresenta a habilidade de desenvolver mecanismos enzimáticos de resistências pela produção de beta-lactamases capazes de inativar 22 as penicilinas, cefalosporinas e por vezes, monobactam (SOUSA-JUNIOR; FERREIRA; CONCEIÇÃO, 2004). As bactérias Gram negativas apresentam um número extraordinário de beta-lactamases tanto cromossômicas quanto plasmidiais (SOUSA-JUNIOR; FERREIRA; CONCEIÇÃO, 2004). A produção de beta lactamases é o mecanismo de resistência mais comum e de maior importância em bactérias Gram-negativas, outros mecanismos são modificações nas proteínas de ligação à penicilina (PBPs), alterações da permeabilidade da membrana externa, por meio da perda de porinas e hiper-expressão de bomba de efluxo (SOUSA-JUNIOR; FERREIRA; CONCEIÇÃO, 2004; LIVERMORE, 2006). Nas bactérias Gram-positivas essas enzimas são secretadas para o meio extracelular, apresentando, pois uma atividade menor quando comparadas às beta-lactamases produzidas pelas bactérias Gram-negativas que se situam no meio periplasmático (QUEENAN; BUSH, 2007). Os carbapenêmicos são antimicrobianos que têm sido muito utilizados como drogas de escolha, para o tratamento de infecções causadas por bactérias produtoras de beta lactamase de espectro ampliado (ESBLs), por resistirem à atividade hidrolítica dessas enzimas. Porém, o uso intensivo desses antimicrobianos tem resultado na emergência de isolados resistentes aos carbapenêmicos, principalmente pela expressão de diferentes enzimas carbapenemases com capacidade de hidrolizar esses antibióticos. Dentre essas enzimas, as mais prevalentes são as metalo-beta-lactamases (MBLs) (classe B Ambler, grupo 3 Bush) e KPC (classe A Ambler, grupo 2f Bush), uma serina-carbapenemase inicialmente encontrada em isolados de K. pneumoniae, dando origem a sigla KPC (GUPTA et al., 2004; KONTOPOULOU et al., 2010). A maior utilização de carbapenêmicos no ambiente hospitalar tem ocasionado pressão seletiva sobre a microbiota nosocomial, o que favorece a seleção de subpopulações de micro-organismos com sensibilidade diminuída ou resistente a esses antimicrobianos (MENDES et al., 2006). A resistência de K. pneumoniae aos carbapenêmicos (KPC) está principalmente associada à aquisição das carbapenemases mediada por plasmídeo e transposon (Tn 4401) que transfere o gene blaKPC entre as espécies da família Enterobacteriaceae (MARSCHALL et al., 2009). Inicialmente, a expansão do gene blaKPC, era de forma lenta. Até 2005, o problema era limitado quase que exclusivamente ao nordeste dos Estados Unidos. Desde então, essa enzima tem sido difundida mundialmente, devido à emergência e 23 disseminação de um clone hiperepidêmico de K. pneumoniae pan-resistente, denominada tipo de sequência multilocus 258 (ST 258) (LOLANS et al., 2010). Recentemente, no norte da Grécia foram evidenciadas variantes de Klebsiella pneumoniae KPC-2 (ST258) resistentes aos carbapenens e colistina (polimixina E) (ST258) (KONTOPOULOU et al., 2010). Pacientes colonizados com bactérias produtoras de KPC resistentes à colistina (polimixina E) podem ser importantes fontes de propagação desses patógenos. Diante do exposto, é possível inferir que o uso indiscriminado de antimicrobianos na prática clínica de rotina nos hospitais, bem como a sua utilização em larga escala em produtos não terapêuticos para consumo humano e animal tem exercido uma forte pressão seletiva sobre os micro-organismos, de modo geral, gerando adaptação e consequentemente, o surgimento de estirpes resistentes e até mesmo multirresistentes (KUNKEL; ERIE, 2005; UNGEMACH; MÜLLER-BAHRDT; ABRAHAM, 2006). Segundo Tenover (2006) a pressão seletiva exercida pelas drogas antimicrobianas sobre os micro-organismos é talvez o mais importante desencadeador da seleção de multi-resistência. O fenômeno do aparecimento e disseminação de micro-organismos com múltiplos perfis de resistência às drogas está ocorrendo tanto nos hospitais quanto nas comunidades em todo o mundo (TENOVER, 2006). A resistência bacteriana adquirida tem sido descrita em praticamente todas as espécies de bactérias, Gram-positivas e Gram-negativas, conhecendo-se detalhes dos mecanismos de aquisição de resistência e os mecanismos moleculares da manifestação da resistência (GULAY et al., 2002; VON BAUM; MARRE, 2005; JOHNSON et al., 2006). Nos últimos anos, tem aumentado mundialmente a preocupação com a identificação dos micro-organismos que apresentam perfil de resistência a múltiplas drogas empregadas na clínica médica em geral. A identificação das espécies patogênicas, bem como da origem de clones resistentes e causadores das infecções humanas são de extrema importância, uma vez que a maioria dos micro-organismos envolvidos em infecções de indivíduos hospitalizados, principalmente por longos períodos, possui a habilidade de sobreviver em UTIs, na superfície de dispositivos médico-hospitalares e equipamentos médicos durante semanas ou mesmo meses (NEELY; MALEY, 2000; GUPTA et al., 2011). 24 A identificação em laboratório de microbiologia clínica das diferentes espécies de micro-organismos patogênicos tem sido feita, geralmente, por métodos fenotípicos, os quais incluem o estudo do perfil de susceptibilidade (antibiograma), a biotipagem (bioquímico), a tipagem sorológica e a fagotipagem (LA SCOLA et al., 2006). Estes métodos consistem na avaliação das características expressas pelos micro-organismos, ou seja, que resultam da expressão de genes e que podem sofrer variações decorrentes de mudanças nas condições de crescimento, fase de crescimento e mutação espontânea (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008). Entretanto, estes métodos são complexos de executar, demorados e muitas vezes imprecisos (ESPINAL; ROCA; VILA, 2011). A necessidade de técnicas mais sensíveis, específicas, seguras e rápidas fez com que alguns métodos moleculares fossem desenvolvidos ao longo dos últimos anos. A Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) foi o primeiro grande avanço da era molecular. Ela tem sido utilizada no diagnóstico de algumas doenças causadas por vírus, fungos, bactérias e outros parasitas, tendo se mostrado altamente sensível, específica, rápida e de fácil execução (ELNIFRO et al., 2000). Considerando-se o exposto, este estudo visa contribuir para o conhecimento epidemiológico molecular de linhagens bacterianas, portadoras do gene de resistência aos carbapenêmicos, o blaKPC, em isolados recuperados a partir de amostras clínicas de pacientes internados em diferentes hospitais públicos e da rede privada, situados em São Luís, Maranhão, Brasil. 25 2 REVISÃO DA LITERATURA A resistência bacteriana pode ser definida como um conjunto de mecanismos de adaptação destes micro-organismos contra os efeitos nocivos ou letais aos quais estão sendo expostas (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010). Pesquisas têm demonstrado que as bactérias podem desenvolver mecanismos de resistências aos antimicrobianos por meio de uma variedade de mecanismos enzimáticos, sendo que algumas espécies são naturalmente resistentes a mais de um agente antimicrobiano (TENOVER, 2006). A resistência a um antimicrobiano pode ser inerente à bactéria (resistência intrínseca), ou seja, está relacionada à existência de genes contidos no micro-organismo, que codificam diferentes mecanismos bioquímicos, os quais atuam impedindo a ação da droga (TENOVER, 2006); ou pode ser adquirida através de mutações genéticas que ocorrem no microorganismo durante seu processo reprodutivo resultante de erros de cópia na sequência de bases que formam o DNA cromossômico; ou transferência por mecanismos de transdução, transformação e conjugação que, frequentemente, são adquiridos e envolvem genes situados em plasmídeos e transposons (TENOVER, 2006; JOHNSON et al., 2006; QUEENAN; BUSH, 2007). As beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL) são enzimas mediadas por genes plasmidiais não induzíveis, capazes de hidrolisar a cadeia oximino- βlactâmica presente na estrutura química da droga, o que faz com que seu espectro de ação estenda-se aos antimicrobianos beta-lactâmicos de amplo espectro, como as cefalosporinas de terceira geração e monobactam (QUEENAN; BUSH, 2007). As ESBLs resultam de mutações em genes codificadores de enzimas clássicas blaTEM (TEM-1), blaSHV e (SHV-1) e, são provenientes de pressão seletiva em ambientes onde há utilização abusiva de antimicrobianos de amplo espectro, como cefalosporinas de terceira e quarta gerações (ABREU et al., 2001). Devido ao fato da maioria das ESBLs serem codificadas por genes localizados em plasmídeos, que, em geral, carreiam genes de resistência a outros antimicrobianos, tais como aminoglicosídeos e outras classes de drogas, as estirpes produtoras dessas enzimas são na maioria dos casos multirresistentes (HONÓRIO, 2001). As enzimas ESBL são capazes de hidrolisar todas as cefalosporinas de amplo espectro, como a cefotaxima e ceftazidima, além do monobactam (aztreonam) (LAGO; FUENTEFRIA; FUENTEFRIA, 2010). Assim, pacientes com infecções causadas por Enterobactérias 26 produtoras de ESBL, não devem receber terapia com antibióticos dessa classe o que acarretaria em falha terapêutica e agravamento do quadro infeccioso (LAGO; FUENTEFRIA; FUENTEFRIA, 2010). As beta-lactamases podem ainda ser definidas de acordo com duas propriedades: funcional e molecular. Com relação as propriedades funcionais dessas enzimas, Bush e Jacoby (2010) classificaram-nas em quatro grupos (1, 2, 3 e 4), de acordo com a especificidade pelo substrato e propriedade de inativação dos inibidores de beta lactamases: ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam. A classificação molecular é baseada na sequência proteica e foi proposta por Ambler em 1980, em quatro classes moleculares (A, B, C e D) (QUEENAN; BUSH, 2007; BUSH; JACOBY, 2010). As classes A, C e D incluem as beta-lactamases que possuem uma porção serina no seu sítio ativo (serino-carbapenemases). As betalactamases das classes A, B e D são denominadas carbapenemases, pela eficiente atividade hidrolítica exercida nos antimicrobianos carbapenêmicos (QUEENAN; BUSH, 2007). As enzimas das classes A, B e D são capazes de hidrolizar o anel beta-lactâmico de penicilinas, cefalosporinas, monobactam e carbapenêmicos, representando um ponto crítico na seleção da terapia apropriada (BUSH; JACOBY, 2010). Apenas as beta-lactamases membros da classe C não possui atividade hidrolítica sobre os carbapenêmicos, embora algumas variantes expressando altos níveis de AmpC possam conferir tal resistência. Mas, outro mecanismo de resistência deve estar associado, como alteração ou perda de porinas, aumento na expressão de bombas de efluxo e expressão concomitante de beta lactamases de amplo espectro (ESBLs) (LIVERMORE, 2012). A classe molecular B é conhecida como metalo-beta-lactamase (MBL) ou metaloenzima, por possuir o metal zinco no seu sítio ativo, como cofator para a atividade enzimática. As metalo-beta-lactamases (MBLs) diferem estruturalmente das outras beta-lactamases pela presença de íons divalentes, comumente o zinco, como cofator para sua atividade catalítica, rompendo o anel beta-lactâmico e inativando o antibiótico (TENOVER, 2006; BUSH; JACOBY, 2010). As enzimas metalo-beta-lactamases têm emergido como um dos mais temidos mecanismos de resistência devido à sua capacidade de hidrolisar praticamente todos os betalactâmicos, incluindo os carbapenêmicos, e porque os seus genes são transportados em elementos móveis, plasmídeos e integrons (ARAKAWA et al., 2000). Atualmente, são conhecidas sete subclasses de MBL adquiridas: IMP (imipenemase) (OSANO et 27 al., 1994), VIM (Verona imipenemase) (LAURETTI et al., 1999), SPM (São Paulo metalo-beta-lactamase) (TOLEMAN et al., 2002), GIM (German imipenemase) (CASTANHEIRA et al., 2009), IND (Chryseobacterium indologenes metaloenzyme), SIM-1(Seoul imipenemase) que é codificada pelo gene blaSIM-1 detectado em sete A. baumannii isolados de um hospital terciário em Seul, Coréia (LEE et al., 2005) e mais recentemente, NDM-1(New-Delly Metalo beta lactamase). Três classes distintas de beta-lactamases têm a habilidade de hidrolisar as drogas carbapenêmicas: classe A, penicilinases (serina sítio ativo), classe B, metaloenzimas (metais sítio ativo) e classe D, oxacilinases (serina sitio ativo) (NORDMANN; CUZON; NAAS, 2009). A classificação molecular Ambler descreve as enzimas de cada classe: A (KPC, GES, SME-1,2 e 3 e NMC/IMI), classe B as metalo-enzimas do tipo (IMP, VIM, NDM-1, IND, SIM, SPM e GIM) e classe D as oxacillinases do tipo OXA (OXA 23-27, 40 e 48) (QUEENAN; BUSH, 2007; NORDMANN; CUZON; NAAS, 2009; MARSIK; NAMBIAR, 2011). A classe C (AmpC beta-lactamase) pode hidrolisar somente um espectro amplo de cefalosporinas, mas não hidrolisa carbapenêmicos (STEINMANN et al., 2011). É importante notar que a resistência aos carbapenêmicos pode ser mediada por outros mecanismos que não KPC, como por exemplo, a combinação de uma beta-lactamase tipo AmpC e a perda da porina ou produtoras de ESBL (LEAVITT et al., 2007). Entre os membros da classe A, a enzima KPC é predominantemente emergente nas enterobactérias, com relevância na espécie K. pneumoniae (QUEENAN; BUSH, 2007; LIVERMORE, 2012). Estas enzimas conferem resistência a todos os tipos de penicilinas, diversas cefalosporinas, monobactam e carbapenêmicos (DISPERSIO et al., 2005; NORDMANN; CUZON; NAAS, 2009). Nicoletti et al. (2013) descreveram uma nova carbapenemase da classe A, blaBKC (Brazilian Klebsiella Carbapenemase), responsável também por conferir resistência aos carbapenêmicos em Klebsiella pneumoniae de isolados clínicos. Esta nova enzima possui 39,5% de similaridade com a KPC-2 e também é mediada por plasmídeo. Desde o relato inicial, na Carolina do Norte (EUA) em 1996, de uma betalactamase tipo serina-carbapenemase (KPC-1), encontrada numa linhagem de Klebsiella pneumoniae resistente aos fármacos carbapenêmicos, o gene blaKPC tem sido detectado, principalmente em outras espécies da família Enterobacteriaceae: Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Salmonella spp (CAI et al., 2008; MARSCHALL et al., 2009; 28 SHENG et al., 2010) e em Raoultella spp. (R. planticola e R.ornithinolytica) (CASTANHEIRA et al., 2009). O gene blaKPC, que codifica a enzima KPC, está localizado em elementos genéticos móveis: plasmídeos e transposons (Tn 4401), os quais são responsáveis pela disseminação dessa enzima entre bactérias da família Enterobacteriaceae (MARSCHALL et al., 2009; CASTANHEIRA et al., 2009; KITCHEL et al., 2010). Contudo, nos últimos dez anos a disseminação do gene blaKPC tem aumentado a prevalência de resistência aos fármacos carbapenêmicos, não somente entre as enterobactérias, mas também entre outras espécies bacterianas (GUPTA et al., 2004). Os mecanismos de resistência bacteriana aos antimicrobianos carbapenêmicos ocorrem pela produção de vários tipos de enzimas, tendo três principais mecanismos envolvidos: (1) combinação de altos níveis de AmpC e perda de porinas da membrana externa ou hiperprodução de bombas de efluxo; (2) mudança na afinidade nas proteínas ligadoras de penicilina (PBP’s) e (3) produção de carbapenemases (BRADFORD et al., 2004; QUEENAN; BUSH, 2007). 2.1 Principais membros da família Enterobacteriaceae com perfil de resistência aos carbapenêmicos A família Enterobacteriaceae inclui uma grande variedade de espécies de bactérias Gram negativas, anaeróbias facultativas, em forma de bastonetes, não formadoras de esporo, a maioria móvel por meio de flagelos peritriquios. Nesta família estão incluídos os gêneros Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella e Yersinia (MIRIAGOU et al., 2003; FARMER; BOATWRIGHT; JANDA, 2007; PETRELLA et al., 2008). Algumas delas são componentes da microbiota normal do trato gastrointestinal de seres humanos e de outros animais, outras são habitantes do solo ou da água e outras ainda, podem estar implicadas em vários processos patogênicos (FARMER;BOATWRIGHT; JANDA, 2007; KONEMAN, 2008). As enterobactérias podem causar uma grande variedade de infecções na comunidade e no ambiente hospitalar, afetando hospedeiros normais e imunocomprometidos. Cerca de 80% das infecções, clinicamente significativas, são causadas por bacilos Gram-negativos da família Enterobacteriaceae, que geralmente, estão associados a altas taxas de morbidade e mortalidade, devido à resistência contra a maioria dos agentes antimicrobianos disponíveis no mercado 29 (SOUSA-JUNIOR; FERREIRA; CONCEIÇÃO, 2004; FARMER; BOATWRIGHT; JANDA, 2007). O trato gastrointestinal serve como reservatório para bactérias multiresistentes, logo a análise das fezes ou swab retal tem sido recomendado para cultura de vigilância como um componente de programas de prevenção de infecções (LOLANS et al., 2010; NORDMANN et al., 2012). Os bacilos gram-negativos como Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus e Serratia, produtores de ESBL, têm sido os mais frequentemente isolados em amostras procedentes de pacientes hospitalizados, porém também podem ser encontrados em amostras de origem comunitária. Estes isolamentos podem aparecer de forma esporádica, sem relação epidemiológica, ou dar lugar a surtos nosocomiais. A maioria dessas epidemias afeta poucos pacientes em um período curto de tempo. Entretanto, cada vez é mais frequente a descrição de surtos nosocomiais (RICE; BONOMO, 2000; SADER et al., 2001). O aumento da utilização dos antimicrobianos carbapenêmicos, considerados uma das poucas opções terapêuticas para infecções graves, causadas por bactérias Gram negativas multidroga resistentes, tem favorecido a emergência de Enterobacteriaceae expressando susceptibilidade diminuída aos carbapenêmicos (ertapenem, meropenem e imipenem), pela produção de serina carbapenemase KPC, como uma beta-lactamase capaz de hidrolisar os antibióticos carbapenêmicos, embora, outros mecanismos possam estar envolvidos (CAI et al., 2008, MARSCHALL et al., 2009). A emergência e propagação de isolados multi e pan-resistentes aos agentes antimicrobianos da classe dos beta-lactâmicos e não beta-lactâmicos, principalmente entre as bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae, é importante e preocupante devido à sua expressiva disseminação mundial, trazendo sérios problemas em relação à terapia e controle de infecção (CAI et al., 2008; NORDMANN et al., 2012). 2.1.1 Gênero Escherichia No gênero Escherichia são classificadas cinco espécies E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii e E. vulneris, porém a espécie E. coli é considerada a de maior relevância clínica. Ela é a bactéria mais comumente isolada tanto de animais quanto do homem, sendo o principal micro-organismo anaeróbio facultativo presente 30 na microbiota normal do trato intestinal do homem e da maioria dos animais de sangue quente (GYLES; FAIRBROTHER, 2004). E. coli e outras bactérias comensais da microbiota intestinal de mamíferos frequentemente formam uma relação simbiótica com seus hospedeiros, sendo importantes no desenvolvimento e regulação do sistema imunológico. Algumas estirpes podem divergir dentro de uma população tendo um caráter mais patogênico e capacidade de causar doenças. Estas estirpes, denominadas patótipos, compartilham fatores de virulência comuns e elicitam efeitos patogênicos similares (KONEMAN, 2008). A E. coli possui lipopolissacarídeo (LPS), como todas as bactérias Gram-negativas, esta molécula externa, também conhecida como endotoxina, ativa o sistema imunitário de forma desproporcionada e a vasodilatação excessiva provocada pelas citocinas produzidas pode levar ao choque séptico e morte em casos de septicemia (FARMER;BOATWRIGHT; JANDA, 2007). A E. coli tem sido comumente isolada em laboratórios clínicos de pacientes com infecção urinária, sendo considerada o principal agente etiológico desta patologia no homem. Esta bactéria tem sido associada a doenças infecciosas envolvendo todos os tecidos e sistemas orgânicos humanos, podendo estar envolvida com infecções de corrente sanguínea, de feridas, pneumonias em pacientes imunossuprimidos, enterites e meningites em neonatos (KONEMAN, 2008; FARMER, 2007). A E.coli é a segunda espécie bacteriana mais prevalente em infecções hospitalares no mundo, perdendo apenas para o S. aureus. Entretanto, nos países da América Latina, a E.coli é o micro-organismo que ocupa o primeiro lugar na lista de patógenos envolvidos nestas infecções (FEDLER; BIEDENBACH; JONES, 2006). A resistência a carbapenêmicos em E. coli é usualmente atribuída a aquisição de beta-lactamases tais como hiperprodução de AmpC combinada com a diminuição da permeabilidade da membrana externa devido à perda ou alteração de porinas e/ou a expressão de ESBL, metalo-beta-lactamases e carbapenemases do tipo KPC (LEAVITT et al., 2007). Estudos recentes têm demonstrado o aumento na detecção de algumas estirpes de E.coli já produtoras da enzima KPC, sendo identificados variantes do gene blaKPC-2 e blaKPC-3 em diferentes partes do mundo, como em Israel, nos Estados Unidos, na China e na India (LEAVITT et al., 2007; BRATU et al., 2007; CAI et al., 2008; LI et al., 2011). 31 2.1.2 Gênero Klebsiella Bactérias do gênero Klebsiella normalmente são saprófitas humanos colonizando a nasofaringe e o trato gastrointestinal. Entretanto, K. pneumoniae constitui uma importante causa de infecções comunitárias e hospitalares, frequentemente causando enterites em crianças e infecções do trato respiratório em adultos (KONEMAN, 2008). Além disso, são frequentemente agentes etiológicos de infecções urinárias em adultos e crianças (DIPERSIO et al., 2005). A K. pneumoniae é considerada como um receptor notório de genes de resistência, agregando tais genes e disseminando-os em novos locais geográficos, aumentando assim a sua frequência mundial (DAIKOS; MARKOGIANNAKIS, 2011). Tem sido relatado que o aumento na frequência dos índices de resistência em K. pneumoniae aos agentes antimicrobianos deve-se principalmente à aquisição de genes localizados em elementos genéticos móveis, como plasmídeos, transposons, ou integrons (APISARNTHANARAK; KIRATISIN; MUNDY, 2008). Com o uso intenso de antimicrobianos, as beta-lactamases clássicas, denominadas de TEM-1, TEM-2 e SHV-1, passaram a ser observadas em diferentes espécies da família Enterobacteriaceae, incluindo o gênero Klebsiella (BRADFORD, 2001). A progressão da resistência de K. pneumoniae à diferentes antibióticos tem causado grande preocupação desde a década de 1980, com o aparecimento de K. pneumoniae produtora de ESBL, ocasionando surtos em unidades neonatais de terapia intensiva (GUPTA et al., 2004). A situação mostrou-se mais alarmante no Brasil após a identificação de K. pneumoniae com concomitante expressão de metalo-beta-lactamase IMP-1 e de ESBL CTX-M6, pois a produção conjunta dessas enzimas resultou em resistência da bactéria a todos os antimicrobianos disponíveis para tratamento, inclusive aos carbapenêmicos (CASSETTARI et al., 2006). Estudos realizados a partir de surtos causados por Klebsiella ESBL(+) demonstraram que seu surgimento está frequentemente associado ao uso de cefalosporinas de terceira geração e que o profissional de saúde atua como veículo de transmissão da bactéria entre pacientes (RAHAL et al., 1998; GUPTA et al., 2004; GIANI et al., 2012). Contudo, verificou-se que o trato intestinal de indivíduos colonizados era seu principal reservatório. A restrição do uso clínico de cefalosporinas de terceira geração e o fortalecimento das normas básicas de 32 prevenção das infecções hospitalares é considerada as principais medidas para controle de surtos causados por Klebsiella ESBL (+) (CASSETARI et al., 2006). Atualmente, quinze variantes do gene blaKPC (KPC-2 a KPC-15) já foram detectadas em diferentes espécies bacterianas, em K. pneumoniae (KPC-1, 2, 3, 6, 7, 8 e 11) (PEIRANO et al., 2009; ENDIMIANI, et al., 2010a; CHEN et al., 2011; LAHEY CLINIC, 2013; WANG et al., 2014). Variantes de KPC (KPC-2 e KPC-3) foram detectadas em outras bactérias Gram negativas, incluindo Enterobacter spp., E. coli e S. marcescens (LEAVITT et al., 2007). A KPC-5 foi descrita em isolados de P. aeruginosa (WOLTER et al., 2009a). Os genes variantes KPC-4 e KCP-9 foram detectados em Enterobacter cancerogenus e E. coli, respectivamente (PALEPOU et al., 2005; HIDALGO-GRASS et al., 2009). Ainda em 2009, foi descrito a KPC-10 em A. baumannii (CHEN et al., 2011), em 2011 foram descritas as variantes blaKPC-12 e blaKPC-13, em isolados de E. cloacae (NETIKUL; KIRATISIN, 2011) e em 2014, um novo gene blaKPC-15 em K. pneumoniae (WANG et al., 2014). 2.1.3 Gênero Enterobacter O gênero Enterobacter contém na atualidade 14 espécies, isto porque o Enterobacter agglomerans foi transferido para o gênero Pantoea (Pantoea agglomerans) e o Enterobacter intermedius foi transferido para o gênero Kluyvera (Kluyvera intermedius) (KONEMAN, 2008). E. aerogenes e E. cloacae são espécies de bactérias comumente isoladas em materiais biológicos e frequentemente são isoladas em infecções humanas. Contudo, encontram-se distribuídos amplamente na água, vegetais, solo e esgoto. Muitas vezes, estes são encontrados como organismos oportunistas em infecções urinárias, trato respiratório, feridas cutâneas e, em certas ocasiões, causam septicemia e meningite (KONEMAN, 2008). Nos últimos anos, Enterobacter spp. tem surgido como um importante patógeno nosocomial participando de vários processos infecciosos principalmente em paciente hospitalizados e imunodeprimidos (SADER et al., 2001). Nos Estados Unidos (EUA), este micro-organismo é o terceiro patógeno clinicamente envolvido em pneumonias e o quinto em infecções de corrente sanguínea e sítios cirúrgicos, entre pacientes de unidade de terapia intensiva (UTI) (BRATU et al., 2005b). E. aerogenes tem sido frequentemente isolada do trato respiratório, urinário, gastrintestinal e, com menos frequência, em pele e feridas cirúrgicas (SADER et al., 33 2004). Esta espécie é normalmente caracterizada por seus altos níveis de resistência à ampicilina, amoxicilina/ácido clavulanico e cefalosporinas (SADER et al., 2004). A produção de beta-lactamases AmpC cromossomal é a maior causa de resistência aos beta-lactâmicos nas espécies de Enterobacter, outras betalactamases também podem ser produzidas por algumas espécies deste gênero. Recentemente, tem sido demonstrado que algumas estirpes podem adquirir e expressar genes que codificam a produção de ESBLs pertencentes ao grupo 2be de Bush (BUSH; JACOBY; MEDEIROS, 1995) e à classe molecular A de Ambler. A produção de ESBL mediada por plasmídeos limita diretamente as opções da terapêutica antimicrobiana, aumentando as taxas de morbidade e mortalidade (RICE; BONOMO, 2000). Mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em algumas espécies de Enterobacter são raros, mas já foram descritos casos nos EUA, constatando-se que em E. aerogenes a resistência a esta classe de antimicrobianos é atribuída à superprodução de cefalosporinase codificada por gene cromossomal e a perda da porina (YIGIT et al., 2002). Mas em 2005, Bratu e colaboradores, descreveram um isolado clínico de E. cloacae produzindo KPC-3. Após esta evidência, foi realizado estudo retrospectivo da prevalência de KPC em espécies de Enterobacter no Brooklyn, Nova York, durante os anos de 2001 a 2003 e apenas dois dos 111 isolados foram portadores do gene KPC, incluindo um isolado de E. cloacae em 2001 e um outro de E. aerogenes em 2003 (BRATU et al., 2005a). 2.1.4 Gênero Proteus As bactérias do gênero Proteus são consideradas patógenos oportunistas, principalmente para indivíduos imunodeprimidos. Este gênero inclui bacilos Gram-negativos fermentadores de glicose que geralmente estão envolvidos na maioria das infecções adquiridas em UTI, particularmente em infecções respiratórias e/ou urinárias (KONEMAN, 2008). Como em muitos membros da família Enterobacteriaceae, espécies de Proteus podem abrigar, inúmeros plasmídeos e integrons mediadores de determinantes de resistência antimicrobiana (TIBBETTS et al., 2008). A introdução de fluoroquinolonas, grupo ao qual pertencem a norfloxacina e ciprofloxacina, na década de 80, significou sem dúvida, um avanço no tratamento 34 de infecções por bactérias multirresistentes, particularmente em infecções do trato urinário (LOPES et al., 1998). Nas últimas décadas, o envolvimento de Proteus spp. em infecções nosocomiais, com taxas de resistência elevada às quinolonas, betalactâmicos e aminoglicosídeos, em geral, tem sido relatadas (LOPES et al.,1998). Por outro lado, P. mirabilis são isolados clínicos que raramente apresentam atividade de beta-lactamase sob condições usuais de crescimento (SHENG et al., 2010; ZI-KE et al., 2010). Tibbetts et al. (2008) no EUA, constataram resistência aos carbapenêmicos em P. mirabilis sendo causada por uma beta-lactamase classe A (KPC-2). Esses autores verificaram também, resistência em Proteus spp., mediada pela OXA-23 (beta-lactamase de classe D) e VIM-1 (metalo-beta-lactamase) associadas às alterações nas proteínas ligadoras de penicilinas ou proteínas de membrana externa, estas observadas por Bonnet et al. (2002). Recentemente, o gene blaKPC que codifica resistência para KPC-2 foi também detectado em isolados de P. mirabilis na China (SHENG et al., 2010). A detecção de enzimas carbapanemases em isolados de P. mirabilis é extremamente preocupante, uma vez que este micro-organismo é intrinsecamente resistente ao antibiótico de escolha (Polimixina) para tratamento de infecções ocasionadas por cepas resistentes aos carbapenêmicos (LANDMAN et al., 2008). As polimixinas são agentes catiônicos com alta afinidade pela porção lipídica dos lipopolissacarídeos da membrana externa aniônica bacteriana, levando a um efeito detergente, rompendo a integridade da membrana, com consequente extravasamento citoplasmático e ao efeito neutralizante nas propriedades biológicas da endotoxinas (LANDMAN et al., 2008). Há hipótese de que a resistência adquirida às polimixinas seja inerente ao uso excessivo ou inadequado dessas drogas quando utilizadas para tratamento de infecções causadas por linhagens multiresistentes, desencadeando uma pressão seletiva (ANTONIADOU et al., 2007). Esta resistência, embora ainda incomum entre os produtores de KPC, tem sido atribuída às modificações no radical fosfato dos lipídios A nos lipopolissacarídeos da membrana externa e a presença de bomba de efluxo (KONTOPOULOU et al., 2010). É importante ressaltar que as polimixinas são frequentemente o último recurso para o tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multidrogas-resistentes (MDR) (KONTOPOULOU et al., 2010), as quais são antibióticos re-emergentes para o tratamento de pacientes infectados por esses 35 micro-organismos (ANTONIADOU et al., 2007; TOTH et al., 2010). Apesar dos seus efeitos nefrotóxicos e neurotóxicos, o interesse sobre esta droga tem sido renovado para o tratamento de micro-organismos multi-resistentes, até que novos e efetivos agentes terapêuticos sejam desenvolvidos (LANDMAN et al., 2008). 2.1.5 Gênero Serratia A bactéria Serratia spp. é um bacilo Gram-negativo, anaeróbio facultativo que pertence a família Enterobacteriaceae cuja espécie mais comum é a S. marcescens. Distribuídos amplamente na natureza, esses micro-organismos são encontrados no solo, água, plantas e no trato intestinal de seres humanos e animais (KONEMAN, 2008). Membros deste gênero produzem pigmento vermelho característicos, conhecidos como prodigiosinas, e podem ser distinguidos de outros gêneros da mesma família pela produção de três enzimas: DNase, lipase e gelatinase. Estas enzimas são importantes fatores de patogenicidade (KONEMAN, 2008). Casos de infecções oportunistas por S. marcescens em indivíduos hospitalizados com pneumonia e septicemia, em pacientes com câncer reticulo endotelial que recebem quimioterapia têm sido cada vez mais comuns. Outras espécies que podem causar doença são: S. plymuthica, S. liquefaciens, S. rubidaea e S. odoriferae (KONEMAN, 2008). Infecções por Serratia spp. são responsáveis por aproximadamente 2% das infecções nosocomiais no trato respiratório inferior, do trato urinário, da corrente sanguínea, de feridas cirúrgicas, de pele e das mucosas em pacientes adultos (SU et al., 2003; SUNENSHINE et al., 2007; CHIANG et al., 2013). Ademais, as espécies de Serratia são reconhecidas como patógenos importantes com propriedades invasivas e alta resistência a muitos antimicrobianos utilizados na prática clínica (CHIANG et al., 2013). A presença de resistência às drogas antimicrobianas no gênero Serratia tem sido documentada devido a produção de beta-lactamase indutível tipo AmpC e ESBL. Neste contexto, os carbapenêmicos são considerados os fármacos de escolha para o tratamento de infecções causadas por estirpes multirresistentes com altos níveis de produção de cefalosporinases (AmpC) e ESBL (ZHANG et al., 2007). Entretanto, relatos de infecções oportunistas, causadas por Serratia spp., resistente aos carbapenêmicos, têm se tornado cada dia mais comum, devido à produção de 36 carbapenemases tipo KPC classe A, IMP-1, IMP-6, VIM-2 e SME-1,2 e 3 (carbapenemases específicas de S. marcescens) (QUEENAN et al., 2000; ZHANG et al., 2007). Em 2010, foram reportados três isolados de S. marcescens portadoras do gene blaKPC-2 em unidade de terapia intensiva em hospital na Grécia (TSAKRIS et al., 2010b). Como no Brasil já temos descritos casos de isolados de K. pneumoniae, E. coli e S. marcescens carreando gene blaKPC, fica evidente a emergência desse tipo de carbapenemase e sua disseminação em espécies diferentes de Enterobacteriaceae em nosso país (DEL-PELOSO; BARROS; SANTOS, 2010; TSAKRIS et al., 2010a). 2.2 Gêneros bacterianos não fermentadores da glicose com perfil de resistência aos carbapenêmicos 2.2.1 Pseudomonas aeruginosa O gênero Pseudomonas é um bacilo Gram-negativo, aeróbio obrigatório pertencente à família Pseudomonadaceae. É habitante comum do solo e da água, ocorrendo regularmente nas superfícies das plantas e ocasionalmente nas superfícies dos animais. São potencialmente oportunistas podendo causar doenças infecciosas dos tratos urinário e respiratório, dermatites, infecções dos tecidos moles, bacteremia, infecções ósseas e conjuntiva, infecções gastrointestinais, e uma variedade de infecções sistêmicas, especialmente em doentes com queimaduras graves e em imunodeprimidos (GALES et al., 2003). Por mais de quatro décadas P. aeruginosa tem mantido lugar de destaque entre os patógenos responsáveis por infecções nosocomiais em todo o mundo, com índices que variam de 10 a 15%, sendo o micro-organismo mais envolvido em infecções pulmonares, do trato urinário e de corrente sanguínea em pacientes de Unidade de Terapia Intensiva em todo o mundo (STRATEVA; YORDANOV, 2009). Infecções por P. aeruginosa estão normalmente associadas com elevada taxa de mortalidade, independentemente da terapia antimicrobiana empregada. As opções terapêuticas para estas infecções são geralmente escassas devido a uma combinação de resistência intrínseca a muitos fármacos e a capacidade de adquirir determinantes de resistência por este micro-organismo (SADER et al., 2001). 37 As espécies de Pseudomonas, além da resistência intrínseca à alguns antimicrobianos, tem habilidade em adquirir genes de resistência que conferem produção de beta-lactamase e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos, pela diminuição da expressão de proteínas de membrana (porinas), mutações na enzima topoisomerase (DNAgirase), super-regulação da bomba de efluxo e produção de beta-lactamase indutível tipo AmpC (GALES et al., 2003; BONOMO; SZABO, 2006). A resistência às cefalosporinas pode ser mediada pelas OXA beta-lactamases, enzimas que hidrolisam oxacilina e cloxacilina ocorrem de forma predominante em P. aeruginosa (BONOMO; SZABO, 2006). Entretanto, beta-lactamases do tipo TEM, encontradas com maior frequência em E. coli e K. pneumoniae, foram descritas também em P. aeruginosa (PAGANI et al., 2004). Atualmente, tem sido comumente descrito em P. aeruginosa e mais raramente em P. fluorescens, genes que codificam MBLs variante blaIMP ou blaVIM (GIRLICH et al., 2010). Outro grupo de beta-lactamase também descrito para P. aeruginosa são MBLs (metalo-beta-lactamase), conhecidas como enzimas que hidrolizam carbapenêmicos devido à presença de íons zinco em seu centro ativo agindo como co-fator na atividade hidrolítica (STRATEVA; YORDANOV, 2009). Algumas betalactamases do tipo GES são carbapenemases e podem representar o passo intermediário entre ESBL e carbapenemases da classe A, como KPC (POIREL; NAAS; NORDMANN, 2008). A produção de carbapenemases classe A tais como: GES-2, GES-5 e KPC-2 foi descrita em P. aeruginosa, mas não em outras espécies (STRATEVA; YORDANOV, 2009). ESBL do tipo GES (Guiana Extended Spectrum), também denominadas IBC, foram detectadas em P. aeruginosa na França e em Portugal (DUBOIS et al., 2002; DUARTE et al., 2003). Entre 2005 e 2006, novos genes variantes para as beta-lactamases GES, GES-5 e GES-9 foram descritos em linhagens clinicas de P. aeruginosa isoladas na China e França, respectivamente. Assim como GES-2, GES-4, GES-5 e GES-6, estas enzimas apresentam atividade hidrolítica sobre os carbapenêmicos. O primeiro relato mundial de P. aeruginosa produzindo KPC foi identificado na Colômbia (KPC-2) em 2007 (VILLEGAS et al., 2007). Seguido por relatos em Porto Rico de P. aeruginosa com duas variantes, KPC-2 e KPC-5 (WOLTER et al., 2009b), em Trinidad e Tobago foi descrito em 2009 o primeiro isolado de P. aeruginosa (KPC-2) (AKPAKA et al., 2009), nos EUA (KPC-2) em 2010 (POIREL et al., 2010), na China (KPC-2) em 2011(GE et al., 2011) e no Brasil, 38 Jácome et al. (2012) descreveram o primeiro caso de cepas de P. aeruginosa (KPC2) recuperadas de secreção traqueal de pacientes em unidade de terapia intensiva em hospital do Recife, Pernambuco, Brasil. E ainda neste mesmo ano, em Porto Rico, foi detectado o primeiro caso de P. aeruginosa co-produzindo as carbapenemases KPC e IMP, isolada da secreção abdominal de uma paciente que fora a óbito 37 dias após a internação. A associação entre estas potentes enzimas, aumenta consideravelmente a taxa de mortalidade (MARTINEZ et al., 2012). 2.2.2 Acinetobacter spp. O micro-organismo Acinetobacter spp. é um cocobacilo Gram-negativo, aeróbio estrito, não-móvel, oxidase-negativo que pertence à família Moraxellaceae. As espécies do gênero Acinetobacter são amplamente distribuídas na natureza e geralmente são consideradas não patogênicas para indivíduos saudáveis. No entanto, devido a sua capacidade de sobreviver em diversas superfícies (úmidas e secas) e em condições ambientais adversas, tornam-se importantes fontes de infecção no ambiente hospitalar para pacientes debilitados, por ser um patógeno oportunista associado ao risco iminente de morte nosocomial e surtos hospitalares (KONEMAN, 2008). Algumas linhagens são isoladas de alimentos e outras são capazes de sobreviver em diversos equipamentos médicos e até mesmo na pele humana saudável (ROBLEDO et al., 2010). Acinetobacter spp. é um patógeno predominante no ambiente hospitalar, sendo isolado principalmente de pacientes de UTI, provavelmente relacionados aos procedimentos invasivos utilizados nestas unidades (BERGOGNE-BÉRÉZIN; TOWNER, 1996; TOWNER, 1997; MARTINS et al., 2014). Alguns casos, são decorrentes de infecções não diagnosticadas ocasionadas por cateter intravascular ou por translocação de bactérias intestinais (MARTINS et al., 2014). Espécies de Acinetobacter têm emergido como importantes patógenos hospitalares e A. baumannii tem se mostrado um dos patógenos gram-negativos mais refratários à antibioticoterapia, cujas infecções são difíceis de serem tratadas, frequentemente são multirresistentes e acometendo principalmente pacientes críticos associados ao alto risco de morte (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011; ROBLEDO et al., 2010). Nos últimos anos, A. baumannii tem sido isolado de diferentes tipos de infecções oportunistas, incluindo septicemia, pneumonia, endocardite, meningite, peritonite em 39 pacientes submetidos à diálise peritoneal, infecção de pele e tecidos, e infecção do trato urinário (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). A. baumannii apresenta uma habilidade espetacular de desenvolver resistência a múltiplos agentes antimicrobianos, como beta-lactâmicos, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas, além de apresentar altas proporções de resistência-cruzada a estas drogas (BONOMO; SZABO, 2006; YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). Diferentes mecanismos de resistência em Acinetobacter spp. tem sido descritos em algumas estirpes, por apresentar múltiplos mecanismos tornandose pan-resistentes. Dentre estes, destacam-se a produção de beta-lactamases, enzimas modificadoras de aminoglicosídeo, alterações quantitativas e qualitativas das porinas de membrana externa, alterações das PBP’s, mutações nas topoisomerases e bombas de efluxo, aumento no nível de expressão de cefalosporinase cromossômica (AmpC) e presença natural de beta-lactamase blaOXA-51 (BRATU et al., 2005a; BONOMO; SZABO 2006; BRATU et al., 2008; ROBLEDO et al., 2010; PASANEN et al., 2014). Os carbapenêmicos têm se tornado as drogas de escolha contra as infecções causadas por Acinetobacter spp., em várias partes do mundo, mas o seu uso está comprometido pela emergência de estirpes produtoras de carbapenemases. Em muitos isolados da Europa, Ásia e Sul da América, a resistência aos carbapenêmicos em A. baumannii tem sido mediada pela aquisição de enzimas hidrolíticas das classes B e D (classificação de Ambler) associadas à hiperexpressão de bomba de efluxo e/ou perda de porinas da membrana externa (BRATU et al., 2005a; BRATU et al., 2008). O primeiro relato de resistência a esta classe de antibióticos em A. baumannii foi descrito por Donald et al. (2000). Os autores isolaram uma estirpe a partir do sangue de um paciente atendido em um Hospital Escocês em 1985, onde foi encontrada uma nova OXA beta-lactamase, a qual foi denominada de ARI-1 ou OXA-23, ao apresentar perfil de resistência ao imipenem. Desde então, numerosas enzimas tipo OXA, com perfil de resistência aos carbapenêmicos, têm sido encontradas em A. baumannii, bem como, a presença de duas importantes MBL’s, IMP e VIM (BONOMO; SZABO 2006). A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos têm sido isolados em países da América Latina; Argentina, Colômbia e no Brasil, onde o tipo OXA23-like foi descrito no Paraná (DALLA-COSTA et al., 2003). 40 A primeira linha de tratamento a infecções causadas por bactérias multirresistentes, especialmente as produtoras de ESBL é o uso de fármacos carbapenêmicos. Entretanto, o uso frequente destes, combinado com a transmissão de determinantes de resistência mediada por plasmídeos, transposons e genes cassettes têm contribuído para o aumento da resistência bacteriana aos carbapenêmicos (Ertapenem, Meropenem e Imipenem) entre as Enterobacteriaceae e outras famílias bacterianas (PEREZ et al., 2007). A produção de KPC confere resistência a todas as classes de antibióticos beta-lactâmicos, inclusive aqueles combinados com os inibidores padrão das beta-lactamases. Além disso, os isolados produtores de KPC são freqüentemente resistentes também às quinolonas, aminoglicosídeos e ocasionalmente à colistina e fosfomicina (BONNET, 2004). Robledo et al. (2010), ao realizarem estudo de vigilância usando bactérias multirresistentes, descreveram pela primeira vez a presença do gene KPC em isolados clínicos de Acinetobacter spp. em Porto Rico e também uma nova variante, KPC-10 em um dos isolados. Este fato acrescenta importante elemento para um organismo que já alberga múltiplos mecanismos inatos e adquiridos de resistência, com possibilidade real de transferência horizontal desta potente carbapenemase. 2.2.3 Epidemiologia das bactérias produtoras de KPC A carbapenemase do tipo KPC tem se tornado de grande interesse em saúde pública, pela sua detecção em organismos de várias espécies, em vários locais do mundo e em níveis alarmantes (COLE et al., 2009; WOLTER et al., 2009b; CALISTO et al., 2012). Sendo que, o primeiro relato de KPC-1 ocorreu em 2001, após uma pesquisa desenvolvida pelo projeto ICARE (Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology) na qual utilizaram amostras isoladas e identificadas no ano de 1996, de um Hospital na Carolina do Norte (EUA), onde os pesquisadores caracterizaram uma nova classe de carbapenemase-A em K. pneumoniae, designando KPC-1 como sendo a enzima responsável pela resistência aos carbapenêmicos (YIGIT et al., 2001). Desde então, micro-organismos (carreadores do gene blaKPC) tem continuamente se disseminado, e casos reportados em 27 estados dos Estados Unidos, além dos relatos ocorridos de surtos de KPC em todo o mundo, tem se tornando endêmico em Hospitais do Nordeste do USA, Canada, Brasil, China, 41 Colômbia, Israel e Grécia, onde as infecções foram causadas principalmente pelo clone hiperepidêmico de KPC ST258 (FONTANA et al., 2010; ZHANG et al., 2011; ZAGARIANOU et al., 2012). A sua prevalência nos países europeus tem variado significativamente com alta prevalência na Grécia, Itália, Turquia e Israel, e uma baixa prevalência nos Países nórdicos (Dinamarca, Finlândia, Islândia, Noruega e Suécia). Ainda, observa-se uma variação, em relação aos tipos de carbapenemases detectáveis nestes isolados bacterianos (GIAKKOUPI et al., 2011; CANTÓN et al., 2012; MUNOZ-PRICE et al., 2013). Na Europa (França, Alemanha, Finlândia, Noruega, Suécia e Reino Unido) casos de KPC têm sido descritos desde 2005. A recente emergência nesses países tem sido associada às pessoas que viajam em áreas endêmicas (DISPERSIO et al., 2005; NORDMANN; CUZON; NAAS, 2009). O primeiro caso de bactérias portadoras de KPC na Itália data do final de 2008, tendo como provável fonte Israel, que teve rápida e extensiva disseminação, com vários relatos de surtos em hospitais do país, revelando a presença do gene bla KPC-3. ( GAIBANI et al., 2011). Já na Suíça, os casos detectados foram transferidos da Itália com isolados portando KPC-2 e KPC-3. (CANTÓN et al., 2012; MUNOZ-PRICE et al., 2013). A presença de KPC em Israel foi reportada pela primeira vez em 2005 e na Grécia em 2007 (ZAGORIANOU et al., 2012). Em Israel, em 2006 ocorreram surtos hospitalares de K. pneumoniae produtora de KPC-2, a qual foi identificada como pertencente ao clone pandêmico ST258, oriunda dos Estados Unidos (CANTÓN et al., 2012). Contudo, a variante de KPC predominante na Grécia é a tipo 2 (KPC-2), com emergência multifocal de isolados resistentes à polimixina B (GIAKKOUPI et al., 2011). Também na Bélgica, em 2009, emergiu KPC-2 em K. pneumoniae oriunda do clone pandêmico ST258 da Grécia (CANTÓN et al., 2012; MUNOZ-PRICE et al., 2013). Já na China, uma linhagem de K. pneumoniae produzindo KPC-2, foi primeiramente reportada em 2007 e posteriormente, identificada em isolados de S. marcescens, C. freundii, E. coli e E. cloacae (ZHANG et al., 2011). Em 2009, a Spanish Network Research of Infectious Disease (REIPI), após realizar estudo de vigilância em hospitais da Espanha, detectou além de bactérias produtoras de outras carbapenemases, a presença de K. pneumoniae e C. freundii produtoras de KPC-3 e KPC-2, respectivamente. Já em Portugal, não tem 42 sido descrito casos de enzima KPC em isolados clínicos de Enterobacteriaceae, apenas em isolados de Escherichia coli recuperados de ambiente aquático (CANTÓN et al., 2012; MUNOZ-PRICE et al., 2013). Uma nova variante de KPC em P. aeruginosa resistente aos carbapenêmicos foi isolada em Porto Rico e denominada de blaKPC-5 (WOLTER et al., 2009a). Neste mesmo ano, foi publicado outra variante de KPC, a blaKPC-6. A enzima KPC-5 revelou-se intermediária entre as KPC-2 e KPC-4, diferindo da KPC-2 pela substituição de um único aminoácido (Pro103Arg), enquanto que a KPC-4 contém (Pro103Arg) mais uma troca de aminoácido adicional (Val239Gly). As variantes KPC-3, KPC-5 e KPC-6 diferem da KPC-2 pela troca de um único aminoácido. Já os genes blaKPC-3 e blaKPC-4 entre si, tem o mais alto número de trocas de nucleotídeos entre as variantes, totalizando 3 polimorfismos de nucleotídeo-único (SNPs). O gene blaKPC-2, por ter sido primeiramente descoberto, é considerado como protótipo para as demais variantes (SACHA et al., 2009; ROTH; HANSON, 2013). Dados do National Reference Center for Susceptibility Testing (NRCST) em Warsaw, sobre as estirpes isoladas em 2008-2011 na Polônia, detectaram linhagens produtoras de KPC-2 e pertencentes ao clone ST258 (CANTÓN et al. (2012). Na Hungria, houve também surto local de KPC-2 oriunda da Grécia. Mas, no Reino Unido, houve um caso isolado de Enterobacter spp. produzindo KPC-4 e outras cepas bacterianas, principalmente K. pneumoniae codificando KPC-2. Na Irlanda, o primeiro caso de Enterobacteriaceae produtora de carbapenemase foi pela enzima KPC em K. pneumoniae recuperada em 2009 de uma cultura de escarro de um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica. A mais prevalente classe de carbapenemase observada nos países nórdicos tem sido a KPC-2 e quase exclusivamente em K. pneumoniae, entretanto, casos de KPC-3 também têm sido demonstrados (CANTÓN et al. (2012). Além disso, Brink et al. (2012), reportaram pela primeira vez, a emergência de NDM e KPC-2 entre isolados clínicos de K. pneumoniae e E. cloacae na África do Sul. Os casos de Enterobacteriaceae produtoras de carbapenemase codificadas por plasmídeos, têm sido principalmente associados às linhagens importadas da Grécia, Israel, EUA e Itália. Áreas com elevada prevalência, associadas a uma relação histórica, cultural e intercambial entre populações de 43 outros países, além da transferência cruzada de pacientes, viagens, turismo médico e refugiados (CANTÓN et al., 2012). 2.2.4 KPC no Brasil No Brasil, o primeiro relato de K. pneumoniae expressando KPC ocorreu em janeiro de 2009, em quatro isolados que haviam sido coletados em Recife no ano de 2006. E os genes blaKPC-2 e blaCTX-M-2 (gene codificador de ESBL) foram detectados em todas as linhagens analisadas (MONTEIRO et al., 2009). Um segundo relato de KPC-2 ocorreu também em 2009, no Rio de Janeiro, onde 06 linhagens estudadas eram de 2007 e 2008 (PEIRANO et al., 2009). Pavez, Mamizuka e Lincopan (2009) fizeram um estudo retrospectivo regional de vigilância de isolados resistentes aos carbapenêmicos, entre os anos 2003 a 2008 e identificaram a ocorrência de K. pneumoniae (KPC-2) isolada de um paciente em um centro médico de São Paulo em 2005, evidenciando o aparecimento de isolados portadores de KPC no Brasil antes de 2006. O aparecimento de linhagens KPC foi também evidenciado por Zavascki et al. (2010), ao recuperar um isolado de K. pneumoniae produtor de KPC-2, a partir da urina de um paciente internado, oriundo da UTI de um hospital de Florianópolis. Considerando-se assim este isolado como sendo o primeiro caso do estado do Rio Grande do Sul. Desde então, relatos envolvendo micro-organismos produtores de KPC têm sido descritos em diferentes localidades brasileiras (ROSSI, 2011). Segundo dados do Jornal Folha de São Paulo, em 2009, no Distrito Federal (DF) surtos envolvendo K. pneumoniae ocorreram em 17 hospitais, públicos ou privados do DF, com pelo menos 183 casos suspeitos, sendo 107 casos como KPC, com 18 mortes (GLOBO, 2011). Segundo matéria jornalística veiculada em outubro de 2010 pelo Jornal o Estado de São Paulo, casos de KPC ocorreram em São Paulo (70 casos e 24 óbitos). Paraná (22 casos e 1 óbito), Espírito Santo, (4 casos e 2 óbitos) e na Paraíba foram registrados 18 casos e um óbito. Em relação a outras espécies produtoras de KPC no Brasil, observou-se que já em 2009, havia em circulação duas cepas de E. cloacae produtoras de KPC-2 no Rio Grande do Sul (ZAVASCKI et al., 2009). Indicando possivelmente uma maior disseminação futura dos genes KPC entre as espécies de bactérias da família Enterobacteriaceae em hospitais brasileiros. 44 Durante o período de 2006 a 2009, foi realizado um estudo epidemiológico molecular de 57 isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae produtora de KPC, oriundas de 11 hospitais localizados nos estados do Rio de Janeiro, Espírito Santos, Minas Gerais, Goiás e Pernambuco. Nos quais evidenciaram, 10 diferentes clones, com predominância do ST437 (variante do ST258) nos estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo (SEKI et al., 2011). Pereira et al. (2011) relataram 22 casos de infecções devido à K. pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos, apresentando três diferentes perfis genotípicos (A-C) isolados entre 2008 e 2010, em um hospital público em São Paulo, Brasil. Do total dos isolados analisados, seis apresentaram resistência à polimixina B, ocasionando o aumento da mortalidade entre esses pacientes. Em estudos realizados nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro foram detectadas a disseminação do gene blakpc-2, facilitado pela dispersão do complexo clonal 258, concomitantemente com a diversidade plasmidial envolvida (IncFII, IncN, IncL/M) albergando o transposon Tn4401a, bem sucedidamente disseminado, entre espécies da família Enterobacteriaceae. Isto também constitue a primeira descrição do clone ST258 no Brasil associado a um surto nosocomial em um hospital universitário da cidade de Ribeirão Preto (SP) (ANDRADE et al., 2011). Considerando o aumento do número de isolados multirresistentes no Brasil, em 2009, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) padronizou através da Nota Técnica nº 1/2010, medidas para identificação, prevenção e controle de infecções relacionadas à assistência à saúde por micro-organismos multirresistentes. Bem como, diretrizes para a detecção de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos (BRASIL, 2010). E mais recentemente foi noticiado pela mídia, casos de óbitos de pacientes infectados por linhagens de bactérias produtoras de carbapenemases do tipo KPC. Como foi observado no jornal O Diário do Nordeste, em janeiro de 2012, que noticiou um surto de KPC em Florianópolis (SC) com três mortes; e em Fortaleza (CE) 27 casos confirmados e dois óbitos. Ainda segundo este jornal, foi registrado no Maranhão, 27 casos suspeitos de KPC e morte de dois pacientes. Posteriormente, foram relatados 02 casos confirmados em duas linhagens de Enterobacteriaceae, a presença do gene blakpc, em pacientes hospitalizados em São Luis (MA) (RIBEIRO et al., 2012). Foi também evidenciado em 2012, a emergência de sete cepas de K. pneumoniae produzindo KPC-2, recuperadas de pacientes 45 hospitalizados em UTI, localizados em João Pessoa, Paraíba, Brasil (FEHLBERG et al., 2012). Estudos epidemiológicos realizados por Pereira et al. (2013) com 113 isolados de K. pneumoniae produtoras de KPC, recuperadas de 32 hospitais localizados em cinco regiões geográficas diferentes do Brasil em 2010, constataram que todos os isolados possuíam o alelo variante KPC-2, e em relação à diversidade clonal, detectaram vinte e dois clones diferentes com dispersão do complexo clonal 11 (ST11, ST437 e ST 340), que são variantes do clone ST 258. Essa disseminação foi facilitada possivelmente pelo elemento genético transposon (Tn4401 “b”) portador de gene blaKPC-2. Apesar da grande quantidade de isolados produtores de KPC, serem detectadas em K. pneumoniae, a presença do gene blaKPC-2 já foi descrita em outras espécies: S. marcescens, P. aeruginosa, P. putida, E. coli, P. mirabilis, A. baumannii, Raoultella spp, C. freundii e Enterobacter spp (D′ALINCOURT CARVALHO-ASSEF et al., 2010; DEL PELOSO; BARROS; SANTOS, 2010; ALMEIDA et al., 2012; JÁCOME et al., 2012). Considerando a dimensão continental deste país, é uma ameaça constante o isolamento de micro-organismos multidroga-resistentes, somado às dificuldades no controle da resistência bacteriana e dos laboratórios de microbiologia na confirmação desses isolados. As variantes de KPC têm diferentes susceptibilidades e propriedades hidrolíticas. Isto deve contribuir para a dificuldade que os laboratórios clínicos têm em detectar os micro-organismos produtores de KPC (ARNOLD et al., 2011). A detecção dessas enzimas em isolados clínicos é imperativa, independentemente do padrão de susceptibilidade, devido ao potencial de disseminação promíscua e evolução dessas enzimas em resposta às pressões seletivas (WOLTER et al., 2009a). Nesse contexto, esta é uma situação preocupante, porém ações locais multidisciplinares devem ser tomadas sem perder a visão global. Pois, para este problema não há fronteiras (ROSSI, 2011). A crescente detecção de casos no Brasil aponta a necessidade de contenção da disseminação desse mecanismo de resistência solicitando esforços multidisciplinares. E foi nesse contexto, que a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) determinou que todos os serviços de saúde e laboratórios no Brasil, adotassem as orientações dos procedimentos padronizados para avaliação dos testes de sensibilidade das enterobactérias, 46 segundo os critérios interpretativos preconizados na nota técnica brasileira nº 01/2013 (BRASIL, 2013). Diante do exposto, vale ressaltar que, além da resistência microbiana observada sobre diversos aspectos, os avanços tecnológicos nas áreas de assistência à saúde resultaram num aumento da complexidade assistencial, o que tornou os procedimentos cada vez mais invasivos, rompendo as barreiras naturais do paciente, expondo-o a um maior risco em adquirir infecções diversas, e, conseqüentemente, tornando o tratamento dessas infecções delicado e caro (TENOVER, 2006). Com isso, a rápida identificação de isolados bacterianos carreadores de genes blaKPC representa um grande desafio para os microbiologistas (ENDIMIANI et al., 2010a). 2.2.5 Métodos para a detecção da produção de KPC’s Na ausência de sistemas automatizados com alta sensibilidade para detectar micro-organismos com perfil de resistência aos carbapenêmicos mediada pelas enzimas KPC’s faz-se necessário a utilização de testes fenotípicos e métodos moleculares. As metodologias mais utilizadas para rastreamento de bactérias produtoras de KPC’s são: detecção de colônias típicas em meio de cultura CHROMAGAR KPC, análise por disco-difusão, E-test, bloqueadores enzimáticos (ácido fenilborônico e cloxacilina) e teste de Hodge modificado, sendo que este teste pode confirmar a presença de carbapenemase, mas não especifica a classe da enzima (ARNOLD et al., 2011). Como screening da atividade de carbapenemases, o Teste de Hodge Modificado (THM) pode ser aplicado na rotina de laboratórios de microbiologia, pois é um método simples para o rastreamento de bactérias produtoras de carbapenemase, mas, isolados ocasionais mostram resultados falso- negativos. Inicialmente esse teste foi recomendado pelo CLSI para confirmação da suspeita de bactérias produtoras de enzimas carbapenemase em espécie de Enterobacteaceae (ARNOLD et al., 2011). Como as variantes de KPC podem apresentar diferenças no perfil de susceptibilidade e propriedades hidrolíticas isto dificulta a detecção de microorganismos produtores de KPC pelos laboratórios clínicos (ARNOLD et al., 2011). A detecção por biologia molecular é sem dúvida o método mais adequado para 47 confirmação de linhagens produtoras de KPC ao se investigar a presença do gene blaKPC pela utilização da reação em cadeia pela polimerase (PCR) (COLE et al., 2009; DIENSTMANN et al., 2010). Até o momento, 15 variantes do gene blaKPC foram descritas na literatura e foram classificadas em ordem numérica sequencial (KPC-2 a KPC-15) (CHEN et al., 2011; NETIKUL; KIRATISIN, 2011; WANG et al., 2014). Estas variantes foram caracterizadas pela amplificação por PCR seguida do sequenciamento do gene blaKPC. Esta estratégia é utilizada devido à presença de substituições pontuais de nucleotídeos, geralmente dentro de quatro códons, nas posições 147, 308, 716 e 814 (CHEN et al., 2011). 48 3 JUSTIFICATIVA A produção da enzima carbapenemase, conhecida como KPC, é um mecanismo emergente, o que justifica a vigilância epidemiológica pelo constante rastreamento dos casos. A rápida disseminação de bactérias produtoras desta enzima representa um sério problema de saúde pública uma vez que a infecção é difícil de ser tratada devida a escassa opção terapêutica associada ao aumento da mortalidade, duração do período de internação e custos elevados para os cofres públicos. Por outro lado, até recentemente a enzima KPC tinha sido detectada somente em K. pneumoniae, entretanto, já foi descrita a ocorrência desta enzima em outras espécies da família Enterobacteriaceae, tais como: E. coli, Serratia spp., C. freundii, E. cloacae, P. mirabilis e Salmonella spp. Além disso, a produção de KPC já foi detectada em P. aeruginosa, em várias estirpes de Acinetobacter spp e mais recentemente em Raoultella spp. No Brasil, poucos trabalhos científicos têm descrito os gêneros, as espécies e o tipo KPC’s bacterianas que estão circulando e colocando em risco a vida de inúmeros pacientes hospitalizados. No entanto, órgãos de imprensa das grandes cidades têm veiculado e informado à população sobre os surtos e mortes que têm ocorrido em diferentes estados da federação. Neste contexto, faz-se necessário o monitoramento da disseminação de bactérias carreadoras de variantes do gene de resistência aos carbapenêmicos (blaKPC 2-15). Por outro lado, vale ressaltar que no Estado do Maranhão não existe nenhum estudo sobre a identificação das bactérias portadoras do gene blaKPC. Além disso, quando há um caso suspeito os laboratórios encaminham as amostras para o Laboratório Central do Maranhão (LACEN-MA), e este por sua vez, re-encaminha para a Fundação Osvaldo Cruz no Rio de Janeiro. Porém, o retorno dos resultados é demorado. Finalmente, a identificação por métodos fenotípicos e genotípicos das espécies bacterianas, portadoras de genes de resistência que expressam a produção de KPC’s, poderá contribuir para o conhecimento da prevalência desses micro-organismos em hospitais públicos e privados da cidade de São Luis-MA. 49 Assim, a determinação fenotípica da susceptibilidade às drogas antimicrobianas, aliadas à avaliação genotípica poderá delinear a distribuição destas linhagens bacterianas, inter e extra-hospitalares além da análise da semelhança clonal cuja informação poderá apoiar e contribuir para o sucesso do desenvolvimento de normas e estratégicas para um projeto de vigilância de Monitoramento da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde. 50 4 OBJETIVOS DA PESQUISA 4.1 Objetivo Geral Estudar a frequência, o perfil de resistência aos antimicrobianos carbapenêmicos, detecção do gene blaKPC e suas variantes em bactérias gram negativas isoladas de amostras clínicas de pacientes procedentes de hospitais da rede pública e privada de São Luis-Maranhão. 4.2 Objetivos Específicos a) Determinar a frequência de micro-organismos multirresistentes das amostras clínicas de pacientes procedentes de hospitais da rede pública e privada de São Luis-Maranhão relacionando a prevalência destes isolados entre os hospitais estudados, bem como o setor de internação; b) Determinar a concentração inibitória mínima dos antimicrobianos em isolados bacterianos que apresentaram perfil de resistência ou susceptibilidade diminuída aos carbapenêmicos; c) Detectar por métodos moleculares específicos a presença do gene blaKPC nas linhagens multidroga resistentes isoladas dos diferentes hospitais participantes; d) Estudar a diversidade genética definindo pelo sequenciamento, as variantes do gene blaKPC que estão circulando nos hospitais de São Luis-Ma. 51 5 MATERIAL E MÉTODOS 5.1 Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa Este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com seres humanos da Universidade CEUMA – UniCEUMA, em 2012, com parecer consubstanciado nº 65389. Os pacientes não foram identificados, nem foram utilizados dados clínicos referentes aos mesmos, apenas os setores de internação foram utilizados. 5.2 Tipo do estudo Estudo prospectivo e transversal. 5.3 Local do estudo e amostragem O estudo fenotípico e o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foram realizados no setor de microbiologia do Laboratório Cedro, São Luís-MA e os testes genotípicos foram realizados no Laboratório de biologia molecular de microorganismos patogênicos de interesse em saúde pública (UniCEUMA). Nos ensaios foram avaliados 297 isolados bacterianos resistentes ou com susceptibilidade diminuída aos antimicrobianos carbapenêmicos de amostras clínicas de pacientes oriundos de 14 hospitais da rede pública e 02 da rede privada de São Luis-MA, no período de junho de 2012 a julho de 2013. Estas amostras foram cedidas pelo Laboratório Cedro, São Luis-Maranhão. 5.4 Critérios de inclusão Foram incluídas no estudo todas as linhagens isoladas dos diversos materiais clínicos que apresentaram perfil de resistência ou sensibilidade diminuída a um dos antimicrobianos carbapenêmicos (Imipenem, Meropenem, Ertapenem). De acordo com as normas preconizadas pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2014). 52 5.5 Critérios de não inclusão Não foram incluídas no estudo as linhagens bacterianas isoladas de amostras clínicas de pacientes que apresentaram sensibilidade a todos os antimicrobianos carbapenêmicos. 5.6 Isolamento e identificação bacteriana As linhagens bacterianas foram isoladas a partir de amostras clínicas semeadas por esgotamento nos meios de cultura Ágar Mac Conkey (Difco, EUA), Ágar Sangue (bio Mérieux), BHI (Brain Heart Infusion – Difco, EUA) e Ágar CPS (meio cromogênico – Marcy l'Etoile, FRANCE), incubadas a 35,5º ±2ºC em estufa bacteriológica, por um período de 24-48h. Todos os micro-organismos foram codificados e estocados em caldo BHI (Difco, EUA) acrescido de 20% de glicerol para crioproteção e mantidos congelados à -70ºC. Para a identificação dos isolados bacterianos utilizou-se o método automatizado Vitek®2 Compact (bioMèrieux, Marcy l'Etoile, FRANCE). Para o preparo do inóculo bacteriano foi empregado a escala 0,5 de McFarland, por meio do densichek Vitek-bioMérieux® (bioMèrieux, Marcy l'Etoile, FRANCE), em que as colônias foram diluídas em 3 mL de soro fisiológico 0,45%. Esta suspensão bacteriana padronizada foi aspirada para dentro dos cartões de identificação por meio do módulo aspirador à vácuo. Posteriormente os cartões foram selados e submetidos à leitura das provas bioquímicas por meio de um sensor óptico. Para determinação do gênero e espécies bacterianas foram utilizados os cartões GN (Gram-negativo). 5.7 Teste automatizado de susceptibilidade aos antimicrobianos Para a execução do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foi utilizado o método automatizado Vitek® 2 Compact (bioMèrieux Marcy I'Etoile, FRANCE). Após a preparação do inóculo bacteriano padronizado, com turvação correspondente à escala 0,5 de McFarland, descrito no item 5.6, foi retirado deste inóculo uma alíquota de 145 µl e adicionado em 3 mL de soro fisiológico 0,45%. Esta suspensão foi homogeneizada e aspirada para dentro dos cartões de 53 susceptibilidade por meio do módulo aspirador a vácuo. Posteriormente, os cartões foram selados e submetidos à leitura cinética por meio de um sensor óptico. Foram utilizados os cartões AST – N239 (Antimicrobial Susceptibility Test Gram negative) para determinação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. 5.8 Teste de susceptibilidade pelo método de disco-difusão No teste de susceptibilidade manual aos antimicrobianos foi utilizado o método de disco difusão (Kirby-Bauer) e a interpretação dos resultados foi de acordo com os critérios do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2014), documento M100-S24. Para a realização do teste de susceptibilidade manual, preparou-se um inóculo bacteriano, fazendo-se uma suspensão direta de 4 a 5 colônias isoladas, em 1,8 ml de solução fisiológica 0,85% estéril e padronizada de acordo com a escala 0,5 de McFarland. Em seguida, um swab estéril foi embebido com a suspensão bacteriana e semeado em toda a superfície do Ágar Mueller-Hinton. Este procedimento fora repetido, girando-se a placa, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo em toda a superfície do Ágar. Após 15 minutos, os discos dos antimicrobianos foram adicionados com auxílio de uma pinça estéril e em seguida, as placas foram incubadas a 35,5ºC ± 2ºC em estufa bacteriológica. 5.9 Drogas antibacterianas testadas Nos testes de susceptibilidade pelo método Kirby-Bauer, foram utilizados os seguintes discos de antimicrobianos adquiridos da Oxoid®: Amicacina (30µg), Ampicilina (10µg), Ampicilina/Sulbactam (10/10µg), Aztreonam (30µg), Cefepime (30µg), Cefotaxime (30µg), Cefoxitina (30µg), Ceftazidime (30µg), Ciprofloxacina (5µg), Ertapenem (10µg), Gentamicina (10µg), Imipenem (10µg), Meropenem (10µg), Piperacilina/Tazobactam (100/10µg). As drogas utilizadas neste estudo seguiram a padronização do CLSI (2014), documento M100-S24, de acordo com cada categoria de micro-organismo isolado. 54 5.10 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de carbapenêmicos pelo método epsilométrico- E-test® Para a determinação da CIM pelo E-test® AB Biodisk foi utilizado o inóculo bacteriano correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Em seguida, um swab estéril foi embebido com este inóculo e semeado em toda a superfície do Ágar Mueller-Hinton. Este procedimento fora repetido, girando-se a placa, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo em toda a superfície do Ágar. Após 15 minutos, foram colocadas as tiras plásticas impregnadas com gradientes de concentrações crescentes dos antimicrobianos carbapenêmicos com auxílio de uma pinça estéril. A placa foi incubada por um período de 16-18h a temperatura de 35,5º±2ºC em estufa bacteriológica. A classificação do micro-organismo em sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano testado, obedeceu aos critérios preconizados pelo documento M100-S24 (CLSI, 2014). 5.11 Teste de Hodge modificado (Detecção fenotípica da produção de carbapenemase) Para a realização do teste de Hodge modificado, foi preparado um inóculo com suspensão direta da linhagem de Escherichia coli ATCC 25922, em 1,8 ml de solução fisiológica 0,85% estéril, correspondente a 0,5 da escala de McFarland que foi diluído na proporção de 1:10. Após esse procedimento, um swab estéril foi embebido nessa diluição e semeado em uma placa de Ágar Mueller-Hinton em vários sentidos até que toda a superfície do Ágar estivesse uniformemente semeada. Foi colocado sobre a superfície do Ágar Mueller-Hinton, no centro de cada placa, um disco de imipenem, ertapenem e meropenem de 10 µg. Com o auxílio de alças descartáveis foi estriada a estirpe teste, a estirpe de K. pneumoniae ATCC ® BAA-1706 como controle negativo e K. pneumoniae ATCC ® BAA-1705 como controle positivo, sempre no sentido do centro do disco de β-lactâmico até a periferia da placa de Petri, com cuidado para não tocar no disco de β-lactâmico. Estas placas foram submetidas à temperatura de 35,5º ± 2ºC em estufa bacteriológica, por um período de 16 a 20h. O critério interpretativo seguiu as determinações do documento M100-S24 (CLSI, 2014). 55 5.12 Controle de qualidade dos meios, reagentes e teste de susceptibilidade aos antimicrobianos Para controle de qualidade dos meios de cultura foram utilizadas as seguintes linhagens de referência ATCC (American Type Culture Colletion) para o controle de qualidade dos meios de cultivos, reagentes e discos de antimicrobianos: Escherichia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; Klebsiella pneumoniae ATCC ® BAA-1706; Klebsiella pneumoniae ATCC ® BAA-1705; Proteus mirabilis ATCC 7002. 5.13 Identificação molecular das linhagens bacterianas isoladas resistentes aos antimicrobianos carbapenêmicos 5.13.1 Extração do DNA das amostras microbianas Para a extração do DNA genômico, dos isolados clínicos, foi utilizado o “Wizard® Genomic DNA Purification Kit” (Promega) seguindo-se o protocolo original do fabricante. A concentração e a pureza do DNA extraído foram verificadas em gel de agarose 1,2%, contendo um marcador de massa molecular. 5.13.2 Ensaios de PCR para a detecção do gene blaKPC Neste estudo foram utilizados iniciadores, considerados universais para a detecção das variantes de KPC, em diferentes gêneros bacterianos, previamente descritos na literatura por Yigit et al. (2001). Iniciadores senso: (5′- ATGTCACTGTATCGCCGTCT-3′) e anti-senso (5′-TTACTGCCCGTTGACGCCC-3′). Este par de iniciadores amplificam a sequência completa do gene blaKPC (882 nucleotídeos). As Reações de PCR específica foram feitas em termociclador Mastercycler (Eppendorf) num volume final de 25 µL contendo 20 pmol de cada iniciador específico MgCl2 (1,5 mM), Taq DNA polimerase (1 U), 2,5 µL do tampão de PCR 10 X [100 mM Tris-HCl (pH 9,0) e 2 µL do DNA. A reação de amplificação foi sob as seguintes condições: 94ºC por 3 minutos (desnaturação inicial) seguidos de 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 52ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e um passo de extensão final a 72ºC por 5 minutos. 56 5.13.3 Análise dos produtos amplificados na PCR Para verificar a eficiência da PCR e determinar o tamanho do fragmento de DNA amplificado foram aplicados em gel de agarose 1,2%, em torno de 8 µL do produto da PCR acrescido de 2 µL de tampão de amostra (Blue/Orange 6X Loading Dye (Promega, EUA). O gel foi submetido à eletroforese em tampão TBE 0,5X (Trisborato-EDTA) [100mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a 100 V durante 1 hora (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATIS, 1989). Após a eletroforese, os géis foram corados com Gel Red da Biotium (1:1000), durante 20 minutos e observados em transiluminador ultravioleta. Para a determinação do tamanho dos produtos da PCR foi incluído em cada corrida um marcador de tamanho molecular 1Kb DNA ladder (INVITROGEN, Life Technologies, EUA). 5.13.4 Purificação e sequenciamento dos produtos da PCR A purificação do fragmento específico de 882 pb, do gene blaKPC, obtido por PCR, foi feita usando-se o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (PROMEGA) segundo as orientações do fabricante. Para verificar a pureza, a integridade e a concentração do produto purificado foi feito em gel de agarose 1,2%, utilizando como padrão de massa e tamanho molecular o Massruler DNA ladder mix (Fermentas). Com o objetivo de identificar quais espécies bacterianas que carreiam as variantes do gene blaKPC que estão circulando nos hospitais de São Luis-MA foi feito o sequenciamento do produto da PCR purificado no passo anterior. O sequenciamento de cada produto purificado foi feito pelo método da terminação da cadeia por dideoxinucleotídeos (SANGER; NICKELEN; COULSON, 1977), em ambas as direções da dupla fita (senso positivo e senso negativo) com o “Kit ABI Prism BigDye” no sequenciador automático ABI 3130 Genétic Analyser (Applied Biosystems). As amostras foram sequenciadas pelo menos três vezes em cada sentido da fita perfazendo um total de seis sequências da mesma amostra. Todos os sequenciamentos foram feitos pela empresa Myleus Biotecnologia Ltda, sediada em Belo Horizonte-MG. 57 5.13.5 Análise Computacional das sequências Para verificar a qualidade das sequências os eletroferogramas obtidos durante o processo de seqüenciamento foram analisados no programa de dados ChromasPro (http://www.technelysium.com.au/chromas.html). A similaridade entre as seqüências nucleotídicas obtidas foi verificada com o auxílio do programa BLASTn do pacote BLAST 2.0 (Basic Alignment Search Tool – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (ALTSCHUL et al., 1997), de onde também foram selecionadas as seqüências de KPC’s de referência para as análises comparativas. Foram escolhidas pelo menos duas sequencias de cada tipo de KCP’s do banco de dados para serem alinhadas pelo programa MEGA versão 4.0 (TAMURA et al., 2007). As substituições de nucleotídeos dentro dos quatro códons (147, 308, 716 e 814) já conhecidos (CHEN et al., 2011), bem como aqueles ainda não descritos foram avaliadas e anotadas para a determinação dos tipos de KPC’s encontradas nas amostras estudadas. 5.13.6 Análises estatísticas dos dados Os dados foram analisados pelo programa estatístico IBM SPSS Statistics 20 (2011). Inicialmente, foi feito a estatística descritiva, ou seja, tabela de frequência das variáveis analisadas. Posteriormente, para se avaliar a associação entre as variáveis espécies bacterianas gene blaKPC, Teste de Hodge Modificado foi feito o teste não paramétrico de qui-quadrado de independência. E para verificar se a frequência de casos em relação à procedência, à acomodação e ao material foi a mesma foi feito o teste de qui-quadrado de aderência. O nível de significância (α) foi de 5%, ou seja, foi considerado significativo quando p < 0,05. 58 6 RESULTADOS 6.1 Identificação das espécies bacterianas e sua distribuição em relação à procedência No presente estudo foram avaliados 297 micro-organismos, entre os quais foram identificados 10 gêneros bacterianos: Acinetobacter spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Pantoea spp., Proteus spp., Escherichia spp., Raoultella spp e Aeromonas spp. O resultado quantitativo das diversas espécies bacterianas colecionadas no período do presente estudo (junho/2012 a julho/2013) foi A. baumannii 128 (43,1%), K. pneumoniae 75 (25,2%) e P. aeruginosa 42 (14,1%), frequentemente isoladas nos hospitais A e J (Tabela 1). Dentre os hospitais participantes do estudo, observou-se que os 14 hospitais da rede pública apresentaram maior quantitativo de isolados bacterianos, 259 (87,30%), sendo o HA (26,5%) e o HJ (31,2%), em relação aos 02 hospitais da rede privada 38 (12,7%), onde somente o HL (11,7%) foi prevalente (Tabela 1). 59 Tabela 1 - Distribuição de frequência dos bacilos gram-negativos em diferentes hospitais de São Luis-MA, no período de Junho/12 a Julho/13. Espécies Pseudomonas Enterobacter Enterobacter Pantoea Proteus Escherichia Serratia Klebsiella Aeromonas Raoultella Total Procedên- % fluorescens aerogenes cloacae spp. mirabilis coli marcescens pneumoniae salmonicida planticola 2 0 0 6 0 0 0 0 24 0 1 0 78 26,3 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 18 6,1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 2,4 3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 1,3 Hosp. E 10 0 1 0 0 3 1 0 2 0 3 6 0 0 0 26 8,8 Hosp. F 3 1 8 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 15 5,1 Hosp. G 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3 Hosp. H 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0,3 Hosp. I 0 0 0 0 0 2 1 0 0 1 0 5 0 0 0 9 3 Hosp. J 44 0 16 1 0 1 3 0 0 1 0 25 0 1 1 93 31,3 Hosp. K 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 3 1 Hosp. L 5 0 5 1 0 2 4 2 1 0 1 14 0 0 0 35 11,8 Hosp. M 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 Hosp. N 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3 Hosp. O 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0,7 Hosp. P 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3 Total 128 1 42 5 1 9 19 3 3 2 5 75 1 2 1 297 100 Acinetobacter Acinetobacter Pseudomonas baumannii ursingii aeruginosa Hosp. A 37 0 8 Hosp. B 15 0 Hosp. C 6 Hosp. D cia Pseudomonas putida Legenda: Hospitais públicos (A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, M, N, O e P); Hospitais privados (K e L). Raoultella ornithinolytica 60 6.2 Perfil de resistência aos antimicrobianos e determinação da concentração inibitória mínima (CIM), pelo método automatizado (Vitek) e E-test Neste estudo analisou-se o perfil de resistência aos antimicrobianos dos isolados obtidos de amostras clinicas de diferentes hospitais. Para as espécies não fermentadoras multidroga resistentes (MDR) obtidas de 16 hospitais participantes a droga que apresentou melhor atividade foi a polimixina B. Seguidos da amicacina e tigeciclina para isolados de Acinetobacter spp., e amicacina e gentamicina para isolados de Pseudomonas spp. Já os demais antibióticos apresentaram percentual de resistência acima de 50% (Tabela 2). Entre as bactérias gram-negativas fermentadoras foi observado que os isolados apresentaram valores elevados de CIMs para a maioria dos agentes antimicrobianos testados, com exceção à polimixina B. Percentuais baixos de resistência a amicacina foram observados para a maioria dos isolados bacterianos analisados. Os isolados de K. pneumoniae mostraram-se sensíveis à amicacina e tigeciclina; enquanto que os isolados de R. planticola apresentaram sensibilidade somente à amicacina e a R. ornithinolytica mostrou sensibilidade à amicacina, gentamicina e tigeciclina. Já as linhagens de Serratia marcescens, que são intrinsecamente resistentes à polimixina B, apresentaram alta sensibilidade à fluoroquinolona (ciprofloxacina) (Tabela 3). Com relação à CIM aos antimicrobianos amicacina, polimixina B, tigeciclina, ciprofloxacina e gentamicina os valores de CIM50 e CIM90 foram calculados para diferentes agentes antimicrobianos em relação aos isolados de A. baumannii, K. pneumoniae e P. aeruginosa (Tabela 4). Os valores de CIM50 e CIM90 para polimixina B foram iguais para os três micro-organismos analisados, demonstrando que tal fármaco foi o mais efetivo sobre esses isolados. Observou-se também que a tigeciclina apresentou menor valor de CIM50 e CIM90 para isolados de A. baumannii mostrando a tendência de susceptibilidade para isolados desta espécie. Todas as linhagens de bactérias foram sensíveis frente à amicacina. Enquanto que para os antimicrobianos ciprofloxacina e gentamicina, os isolados de P. aeruginosa, apresentaram uma alta sensibilidade, com baixas concentrações de CIM50 e CIM90, demonstrando uma tendência de susceptibilidade a esses 61 antimicrobianos. Os demais isolados pertencentes ao presente estudo não puderam ter as CIM50 e CIM90 determinadas devido ao número insuficiente de isolados. Tabela 2 - Perfil de resistência aos antibióticos e a concentração mínima inibitória em relação às espécies bacterianas não fermentadoras isoladas em hospitais de São Luis-MA, no período de Jun/12 a Jul/13 Espécies não fermentadoras Acinetobacter baumannii Acinetobacter ursingii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Antibiótico % resistência CIM % resistência CIM % resistência CIM % resistência CIM % resistência Amicacina 22,7 ≥64 0 4 28,6 ≥ 64 0 ≤2 0 Ampicilina 100 ≥32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 Amp/sulbac 72,7 ≥32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 Aztreonam 100 ≥64 100 ≥ 64 NR NR NR NR NR NR Cefalotina 100 ≥64 100 ≥ 64 NR NR 100 ≥ 64 100 ≥ 64 Cefepime 97,7 ≥64 100 ≥ 64 64,3 ≥ 64 100 ≥ 64 60 ≥ 64 Cefotaxima 100 ≥64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 NR NR 100 ≥ 64 Cefoxitina 100 ≥64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 Ceftazidima 99,2 ≥64 100 ≥ 64 71,4 ≥ 64 100 ≥ 64 80 ≥ 64 Ciprofloxacina 96,9 ≥4 0 ≤ 0,5 69 ≥4 100 ≥4 40 ≥4 Polimixina B 0 ≤0,5 0 ≤ 0,5 0 ≤ 0,5 0 ≤ 0,5 0 ≤ 0,5 Gentamicina 53,1 ≥16 100 ≥ 16 59,5 ≥ 16 0 ≤ 1 20 ≥ 16 Imipenem 100 ≥16 100 ≥ 16 100 ≥ 16 100 ≥ 16 100 ≥ 16 Meropenem 100 ≥16 100 ≥ 16 100 ≥ 16 100 ≥ 16 100 ≥ 16 Ertapenem NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR Piper/tazob 100 ≥128 100 ≥128 78,6 ≥ 128 0 16 60 ≥ 128 Tigeciclina 0,8 4 NR NR 100 ≥8 100 ≥8 100 ≥8 Total NR= Não realizado 128 1 42 1 CIM 16 5 62 Tabela 3 - Perfil de resistência aos antibióticos e a concentração mínima inibitória em relação às espécies bacterianas fermentadoras isoladas em hospitais de São Luis-MA, no período de Jun/12 a Jul/13. Klebsiella pneumoniae Antibiótico Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Serratia marcescens Espécies fermentadoras Proteus Pantoea spp. mirabilis Raoultella planticola Raoultella ornithinolytica Escherichia coli Aeromonas salmonicida % resist. CIM % resist. CIM % resist. CIM % resist. CIM % resist. CIM % resist. CIM % resist. CIM % resist. CIM % resist. CIM % resist. CIM Amicacina 12 ≥ 64 5,3 ≥ 64 33,3 ≥ 64 80 ≥ 64 0 16 33,3 ≥ 64 0 16 0 4 0,0 ≤2 0 4 Ampicilina 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100,0 ≥ 32 100 ≥ 32 Amp/sulbac 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100 ≥ 32 100,0 ≥ 32 100 ≥ 32 Aztreonam 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100,0 ≥ 64 100 ≥ 64 Cefalotina 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100,0 ≥ 64 100 ≥ 64 Cefepime 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100,0 ≥ 64 100 ≥ 64 Cefotaxima 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100,0 ≥ 64 100 ≥ 64 Cefoxitina 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100,0 ≥ 64 100 ≥ 64 Ceftazidima 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100 ≥ 64 100,0 ≥ 64 100 ≥ 64 Ciprofloxacina 93,3 ≥4 89,5 ≥4 55,6 ≥4 0 ≤ 0,25 66,7 ≥4 66,7 ≥4 100 ≥4 100 ≥4 50,0 ≥4 0 ≤ 0,5 Polimixina B 10,7 64 0 ≤ 0,5 0 ≤ 0,5 100 ≥ 16 0 ≤ 0,5 100 ≥ 16 100 ≥16 100 ≥ 16 0,0 ≤ 0,5 NR NR Gentamicina 52 ≥ 16 68,4 ≥ 16 11,1 ≥ 16 40 ≥ 16 33,3 ≥ 16 66,7 ≥ 16 100 ≥16 0 ≤1 50,0 ≥ 16 0 ≤1 85,3 ≥ 32 42,1 ≥ 32 88,9 ≥ 32 80 ≥ 16 33,3 ≥ 16 100 ≥ 32 100 ≥16 100 ≥ 16 0,0 ≤1 100 ≥ 16 Meropenem 84 ≥ 32 42,1 ≥ 32 88,9 ≥ 32 80 ≥ 16 33,3 ≥ 16 66,7 ≥ 32 50 ≥16 100 ≥ 16 0,0 ≤ 0,25 100 ≥ 16 Ertapenem 100 ≥ 32 100 ≥ 32 88,9 ≥ 32 100 ≥8 100 ≥8 100 ≥ 32 100 ≥8 100 ≥8 100,0 ≥8 100 ≥8 Piper/tazob 100 ≥ 128 94,7 ≥ 128 88,9 ≥ 128 100 ≥ 128 100 ≥ 128 66,7 ≥ 128 100 ≥ 128 100 ≥ 128 100,0 ≥ 128 0 16 Tigeciclina 21,3 ≥8 52,6 ≥8 22,2 ≥8 40 ≥8 NR NR 100 ≥8 100 4 0 2 0,0 ≤ 0,5 NR NR Imipenem 75 19 9 5 3 3 2 1 2 1 63 Tabela 4 - Concentração inibitória mínima (µg/mL) (CIM50) e (CIM90) das linhagens frequentemente isoladas, de hospitais públicos e privados de São Luis, Maranhão, Brasil. Isolado bacteriano (N.) CIM50 (µg/mL) CIM 90 (µg/mL) 16 32 Polimixina B (POLB) ≤ 0,5 ≤ 0,5 Tigeciclina (TIG) ≤ 0,5 ≤ 0,5 16 16 ≤ 0,5 ≤ 0,5 2 2 Amicacina (AMI) ≤ 2 4 Polimixina B (POL B) ≤ 0,5 ≤ 0,5 Ciprofloxacina (CIP) ≤ 0,25 ≤ 0,25 Gentamicina (GEN) ≤ 1 2 Acinetobacter baumannii (128) Amicacina (AMI) Klebsiella pneumoniae (75) Amicacina (AMI) Polimixina B (POL B) Tigeciclina (TIG) Pseudomonas aeruginosa (42) Valores de CIMs considerados sensíveis segundo CLSI, 2014 (M100-S24) e NOTA TÉCNICA (ANVISA Nº 1/2013): AMICACINA (AMI) ≤ 16µg/mL; POLIMIXINA B (POLB) ≤ 2µg/mL; TIGECICLINA (TIG) ≤ 1µg/mL; CIPROFLOXACINA (CIP) ≤ 1 µg/mL e GENTAMICINA (GEN) ≤ 4 µg/mL Fonte: Elaborado pela autora. 6.3 Avaliação entre o teste de Hodge modificado (THM) e espécie bacteriana A Tabela 6 mostra o número total de isolados e o resultado do teste de Hodge modificado (THM), na qual foi constatada uma associação estatisticamente significante (p= 0,017) em relação às espécies bacterianas avaliadas. Observou-se que o micro-organismo que apresentou maior positividade foi a K. pneumoniae com 59 (78,7%) casos do total de 75 isolados, seguindo-se por E. cloacae 7 (36,8%). Para as bactérias não fermentadoras (Acinetobacter spp. e Pseudomonas spp.) não há padronização deste teste no documento M100-S24 (CLSI, 2014). Logo, para estes micro-organismos o THM não foi realizado. 64 Tabela 5 - Associação de Teste Hodge Modificado em relação à espécie bacteriana. T. Hodge Modificado (THM) Espécie Total p** 128 128 0,017 0 1 1 0 0 42 42 Pseudomonas putida 0 0 5 5 Pseudomonas fluorescens 0 0 1 1 Enterobacter aerogenes 1 7 1 9 Enterobacter cloacae 6 7 6 19 Pantoea spp. 2 1 0 3 Proteus mirabilis 1 1 1 3 Escherichia coli 0 0 2 2 Serratia marcescens 2 3 0 5 Klebsiella pneumoniae 6 59 10 75 Aeromonas salmonicida 1 0 0 1 Raoultella planticola 0 2 0 2 Raoultella ornithinolytica 0 1 0 1 Negativo Positivo NR* Acinetobacter baumannii 0 0 Acinetobacter ursingii 0 Pseudomonas aeruginosa Total 19 81 197 297 NR*= Não Realizado; p**<0,05. Teste não paramétrico de qui-quadrado de independência Com relação à associação entre o teste de Hodge modificado e a presença da carbapenemase KPC (gene blaKPC) foi observado uma positividade para os dois testes em 64 (98,47%) isolados (Tabela 6). Dos micro-organismos analisados, apenas 17 (48,57%) dos isolados bacterianos apresentaram positividade para o THM, mas não tiveram a detecção do gene blaKPC confirmada e apenas um isolado apresentou positividade para o gene blaKPC mas teve o THM negativo. Tabela 6 - Associação entre Gene blaKPC e Teste de Hodge Modificado (THM) THM Gene blaKPC Negativo % Positivo % Total % Positivo 17 48,57 64 98,47 81 81 Negativo 18 51,43 1 1,53 19 19 Total 35 65 100 100 p*< 0,05; Teste não paramétrico de qui-quadrado de independência. 100 100 p* < 0,0001 65 6.4 Detecção do gene blaKPC nos isolados bacterianos com sensibilidade diminuída aos carbapenêmicos Analisando a associação do gene blaKPC em relação à espécie bacteriana, verificou-se que esta correlação é estatisticamente significante. Pois, a detecção da presença do gene blaKPC entre os 297 isolados avaliados obteve-se 99 (33,4%) de positividade, incluindo bactérias não fermentadoras (A. baumannii) e fermentadoras (Tabela 7). Quanto à detecção do gene blaKPC, houve positividade em R. planticola (100%), R. ornithinolytica (100%), K. pneumoniae 59 (78,7%), E. aerogenes 6(66,7%) seguidos pelas demais espécies, E. coli 1 (50%), S. marcescens (40%), Pantoea spp. 1 (33,3%), E. cloacae 6 (31,6%) e A. baumannii 21 (16,4%) (Tabela 7). Tabela 7 - Associação do gene blaKPC em relação à espécie bacteriana gene blaKPC Espécie Negativo Positivo Total p* < 0,0001 n % n % 107 83,6 21 16,4 128 Acinetobacter ursingii 1 100 0 0 1 Pseudomonas aeruginosa 42 100 0 0 42 Pseudomonas putida 5 100 0 0 5 Pseudomonas fluorescens 1 100 0 0 1 Enterobacter aerogenes 3 33,3 6 66,7 9 Enterobacter cloacae 13 68,4 6 31,6 19 Pantoea spp. 2 66,7 1 33,3 3 Proteus mirabilis 3 100 0 0 3 Escherichia coli 1 50 1 50 2 Serratia marcescens 3 60 2 40 5 Klebsiella pneumoniae 16 21,3 59 78,7 75 Aeromonas salmonicida 1 100 0 0 1 Raoultella planticola 0 0 2 100 2 Raoultella ornithinolytica 0 0 1 100 1 198 66,6 99 33,4 297 Acinetobacter baumannii Total p*< 0,05; Teste não paramétrico de qui-quadrado de independência 66 6.5 Distribuição de frequência dos espécimes clínicos de onde foram recuperadas as bactérias que apresentaram positividade para o gene blaKPC A Tabela 8 mostra a frequência das amostras clínicas em relação à detecção do gene blaKPC. Esta disposição de dados permite visualizar a diversidade de amostras biológicas analisadas, bem como a presença do gene blaKPC e esta distribuição possui correlação estatisticamente significante com valor de p < 0,0001. A maior frequência observada para o gene blaKPC entre os espécimes clínicos analisados, no período do estudo, foi na secreção traqueal 37,7% (24/112), urina 21,5% (30/64), sangue 14,5% (17/43), swab nasal 10,8% (11/32) e swab anal (retal) com 15 (5,1%) das amostras estudadas, destas 5 (33,3%) apresentaram positividade para o gene blaKPC (Tabela 8). Os espécimes dos demais sítios anatômicos avaliados apresentaram baixa frequência, provavelmente devido a não uniformidade quantitativa entre os materiais colecionados no período do estudo (Tabela 8). Através da distribuição dos micro-organismos produtores de KPC em relação aos espécimes clínicos de onde os mesmos fornam recuperados, observouse que os mais frequentes foram: K. pneumoniae com 59 casos, oriundas de diferentes tipos de espécimes clínicos, sendo o maior número da urina, seguindo de 12 isolados de A. baumannii da secreção traqueal (Tabela 9) 67 Tabela 8 - Distribuição de frequência dos materiais biológicos de onde foram encontradas as bactérias com positividade para o gene blaKPC Material Total % blakpc + % positividade Secreção traqueal 112 37,7 24 21,4 Urina 64 21,5 30 46,8 Sangue 43 14,5 17 39,5 Swab nasal 32 10,8 11 34,4 Swab anal 15 5,0 5 33,3 Fragmento ferida 7 2,4 2 28,6 Fragmento ósseo 3 1,0 1 33,3 Fezes 2 0,7 2 100 Lavado brônquico 2 0,7 0 0 Ponta cateter 2 0,7 2 100 Escara 1 0,3 0 0 Frag necrose calcaneo 1 0,3 1 100 Fragmento tecido 1 0,3 0 0 Líq.peritonial 1 0,3 0 0 Liquido pleural 1 0,3 0 0 Sec abdominal 1 0,3 0 0 Sec óstio gastro 1 0,3 1 100 Sec. abscesso 1 0,3 1 100 Sec. retrocavidade gástrica 1 0,3 1 100 Sec. ferida operatória 1 0,3 0 0 Secreção de dreno 1 0,3 1 100 Secreção ocular 1 0,3 0 0 Secreção purulenta 1 0,3 0 0 Tendão 1 0,3 0 0 Úlcera de pressão 1 0,3 0 0 297 100,0 99 33,3 Total 2 = 1371,6 p < 0,0001; Teste de qui-quadrado de aderência 68 Tabela 9 - Distribuição dos micro-organismos produtores de KPC isolados de hospitais de São Luis-MA, em relação aos espécimes clínicos, no período de Junho/12 a Julho/13 Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniae Serratia marcescens Pantoeae spp Enterobacter cloacae 12 8 - 1 1 - - 1 1 Total KPC+ 24 Urina - 24 - - 2 3 1 - - 30 Sangue 4 11 1 - - 1 - - - 17 Swab nasal Swab anal 3 1 4 3 1 - - 2 - 1 1 - - - 11 5 Sec óstio gastro - 1 - - - - - - - 1 Ponta cateter - 1 - - - - - - 1 2 Fezes - 2 - - - - - - - 2 Fragmento ósseo - - - - 1 - - - - 1 Secreçao de dreno - 1 - - - - - - - 1 - 2 - - - - - - - 2 1 - - - - - - - - 1 Secreção de abscesso - 1 - - - - - - - 1 Secreção retrocavidade - 1 - - - - - - - 1 21 59 2 1 6 6 1 1 2 99 Material clínico Secreção traqueal Fragmento de Ferida operatória Fragmento Necrose calcâneo Total . Enterobacter aerogenes Escherichia coli Raoultella ornithinolytica Raoultella planticola 69 6.6 Distribuição da frequência das acomodações hospitalares de onde foram isoladas as bactérias multirresistentes e que apresentaram positividade para o gene blaKPC Neste estudo foi observada a existência de uma correlação entre a frequência das acomodações hospitalares e a presença do gene blaKPC (p < 0,0001) (Tabela 10). A distribuição de micro-organismos KPC positivos detectados por setor hospitalar revelou que 58 (34%) dos isolados foram positivos para o gene blaKPC dos 171 casos recuperados de amostras oriundas da UTI. Por outro lado, várias acomodações pontuaram a presença de bactérias produtoras de KPC, com exceção, a UTI pediátrica, posto, enfermaria e sala de pré-parto. Neste contexto, um dado despertou atenção quanto à detecção do gene blaKPC em isolados de pacientes de setores como Unidade Intermediária, com 8 (44,4%) do total de 18 casos e 4 (30,8%) dos 13 casos registrados na emergência (Tabela 10). Tabela 10 - Distribuição de frequência das acomodações onde foram encontradas as bactérias e gene blaKPC Acomodação N° de casos % UTI 171 57,6 58 34,0 Clínica médica 40 13,5 13 32,5 Emergência 13 4,4 4 30,8 Unid Intermediária 18 6,1 8 44,4 UTI neo 13 4,4 2 15,4 Oncologia 9 3,0 3 33,3 Centro cirúrgico 8 2,7 3 37,5 Semi-intensiva 9 3,0 3 33,3 UTI Pediátrica 5 1,7 0 0 Posto 2 0,7 0 0 Enfermaria 3 1,0 0 0 Clínica Cirúrgica 2 0,7 2 100 Pediatria 1 0,3 1 100 Pré-parto 1 0,3 0 0 SPA Oncologia 1 0,3 1 100 Unidade Renal 1 0,3 1 100 Total 297 100 = 1414,8 p < 0,0001; Teste de qui-quadrado de aderência 99 33,3 2 blaKPC + % positividade 70 6.7 O quantitativo de espécies de bactérias carreadoras do gene blaKPC em relação à sua procedência (hospitais de São Luís) Em relação ao total de bactérias não fermentadoras de glicose incluídas neste estudo, somente a espécie A.baumannii foi portadora do gene blaKPC (Tabela 12). Sendo que, o maior número dos isolados desta espécie foi recuperado do HA (37/10 (27%)), seguida do HB (15/5 (33,3%)), HC (6/1 (16,7%)), HD (3/1 (33,3%)) e HJ (44/4 (9,1%)), todos estes hospitais são públicos. Os resultados dos testes de detecção do gene blaKPC entre as bactérias fermentadoras de glicose mostraram que todos os isolados das espécies P. mirabilis e A. salmonicida não eram portadores do gene em questão. Já os isolados da espécie K. pneumoniae foram encontrados altos percentuais de positividade em todos os hospitais participantes onde foram isolados este micro-organismo. As demais espécies apesar de terem sido isoladas em uma frequência inferior à K. pneumoniae tiveram elevada positividade em relação à presença do gene blaKPC (Tabela 12). 71 Tabela 11 - Relação entre a procedência, espécie bacteriana não fermentadora e presença do gene blaKPC Espécie Procedência Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Acinetobacter ursingii Pseudomonas fluorescens Hosp. A 37/10 (27) 8 2 0 0 Hosp. B 15/5 (33,3) 1 0 0 1 Hosp. C 6/1 (16,7) 1 0 0 0 Hosp. D 3/1 (33,3) 1 0 0 0 Hosp. E 10 1 0 0 0 Hosp. F 3 8 1 1 0 Hosp. G 1 0 0 0 0 Hosp. H 0 0 0 0 0 Hosp. I 0 0 0 0 0 Hosp. J 44/4 (9,1) 16 1 0 0 Hosp. K 1 0 0 0 0 Hosp. L 5 5 1 0 0 Hosp. M 2 1 0 0 0 Hosp. N 0 0 0 0 0 Hosp. O 1 0 0 0 0 Hosp. P 0 0 0 0 0 Total 128 42 5 1 1 72 Tabela 12 - Relação entre a procedência, espécies de bacilos gram-negativos fermentadores e presença do gene blaKPC Espécie Procedência Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Serratia marcescens Pantoea spp. Proteus mirabilis Escherichia coli Raoultella planticola Aeromonas salmonicida Raoultella ornithinolytica Total % Hosp. A 24/18 (75,0) 6/1 (16,7) 0 0 0 0 0 1/1 (100) 0 0 78 26,3 Hosp. B 0 1/1(100) 0 0 0 0 0 0 0 0 18 6,1 Hosp. C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 2,4 Hosp. D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 1,3 Hosp. E 6/6 (100) 1 3/3 (100) 3/2 (66,7) 0 2 0 0 0 0 26 8,8 Hosp. F 0 0 1/1 (100) 1 0 0 0 0 0 0 15 5,1 Hosp. G 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3 Hosp. H 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3 Hosp. I 5/5 (100) 1/1 (100) 2/1 (50) 0 0 0 1/1 (100) 0 0 0 9 3 Hosp. J 25/20 (80) 3 1 0 0 0 1 1/1 (100) 0 1/1 (100) 93 31,3 Hosp. K 0 1/1 (100) 0 0 0 0 0 0 1 0 3 1 Hosp. L 14/10 (71,4) 4/2 (50) 2/1 (50) 1 2 1 0 0 0 0 35 11,8 Hosp. M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 Hosp. N 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3 Hosp. O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0,7 Hosp. P Total 0 1 0 0 0 1/1 (100) 0 0 0 0 0 0 1 0,3 75 19 9 5 1 3 1 2 1 1 297 100 73 A Tabela 13 mostra a porcentagem dos isolados resistentes aos antimicrobianos carbapenêmicos e portadores do gene blaKPC. Ressalta-se que neste estudo não foi detectado o gene blaKPC nos isolados de A. ursingii, A. salmonicida, P. mirabilis, P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida. Muito embora, esses microorganismos tenham apresentado fenotipicamente resistência ou susceptibilidade diminuída aos carbapenêmicos. 74 Tabela 13 - Porcentagem dos micro-organismos resistentes aos antimicrobianos e portadores do gene blaKPC Espécie % resistentes com o gene blaKPC Número AMI AMP ASB ATM CFL CEF CTX CFO CAZ CIP POLB GEN IMP MER ERT PTZ TIG blaKPC + Acinetobacter baumannii 23,8 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 47,6 100 100 NR* 100 0 21 Acinetobacter ursingii --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0 --- Aeromonas salmonicida Enterobacter aerogenes 50,0 100 100 100 100 100 100 100 100 33,3 0 16,7 83,3 83,3 83,3 83,3 33,3 6 Enterobacter cloacae 20,0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 60 100 100 100 100 40 6 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 100 0 0 100 100 NR* 1 13,6 100 100 100 100 100 100 100 100 83,1 11,9 52,5 94,9 88,1 100 100 20,3 59 Pantoea spp. 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 100 100 100 100 100 NR* 1 Proteus mirabilis --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0 Pseudomonas putida --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0 Raoultella planticola 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50 100 100 100 2 Raoultella ornithinolytica 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 100 100 100 100 0 1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 100 50 100 100 100 100 50 2 Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Serratia marcescens Legenda: NR=Não realizado 75 6.8 Sequenciamento do produto de PCR de isolados positivos para o gene blaKPC Identificação do gene blaKPC e de suas variantes foi obtida pelo sequenciamento do fragmento específico de 882pb que foi amplificado por PCR com os iniciadores senso e anti-senso e o DNA dos isolados, analisados nesta pesquisa. A similaridade entre as sequencias obtidas, foi realizada por meio do alinhamento destas, com as sequências nucleotídicas de diferentes espécies bacterianas portadoras do gene blaKPC constantes no Genbank. Os resultados dos alinhamentos que revelaram índices de similaridade nucleotídicas variaram entre 96 e 100%, entre as amostras analisadas e as sequências do Genbank, demonstrando que a região sequenciada é altamente conservada e que a variante predominante entre as bactérias fermentadoras foi do tipo 2 (KPC-2). Enquanto que, entre a linhagem de A. baumannii a variante predominante foi a tipo 10 (KPC-10) (Tabela 14). É importante ressaltar que não foram encontradas no Genbank depósito de sequencias para as espécies R. planticola, R. ornithinolytica e Pantoea spp., por isso, na Tabela 14 não foi colocado o grau de similaridade. Entretanto, este achado representa a primeira descrição dessas espécies como portadoras do gene blaKPC no Brasil. Todas as sequências obtidas foram depositadas no Genbank para a geração do número de acesso público. 76 Tabela 14 - Análise de similaridade genética das sequências do gene blaKPC dos isolados em relação às sequências do Genbank Isolado nº. Hospital/Setor Espécime clínico Tipo do gene blaKPC Tamanho sequenciado 03 04 06 19 20 21 23 24 25 30 32 33 35 36 59 60 61 62 Hosp.A/UI/ST Hosp. E/UTI/SN Hosp.L/UTI/U Hosp.L /UTI/U Hosp.A/CM/SN Hosp.J/CC/S Hosp.J /UI/S Hosp.J /UTI/U Hosp.J /CC/S Hosp.J /SPA/U Hosp.J /CM/SOG Hosp.A/UTI/ST Hosp.J /UI/U Hosp.J /CC/PC Hosp.A/UTI/ SN Hosp.A/UTI/S Hosp.L /CM/F Hosp.J /ONCO/U KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 882 882 882 882 882 882 865 882 882 882 882 882 882 882 882 882 882 882 63 Hosp.F/UTINEO/SN KPC-2 882 65 67 69 73 74 75 77 Hosp.L/UTI/S Hosp.L/EM/U Hosp.J /UTI/ ST Hosp.A/SI/U Hosp.L/CM/U Hosp.L /UTI/Osso Hosp.A/UTI/ST KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-10 865 882 882 872 882 882 882 78 Hosp.I/CM/U KPC-2 882 79 Hosp.J /UTI/ST KPC-2 882 110 Hosp.J /UI/ST KPC-2 882 111 112 113 114 121 125 126 134 136 137 141 145 146 152 154 156 163 178 189 192 194 196 200 Hosp.E/UTI/S Hosp.J /CC/U Hosp.J /UI/ST Hosp.J /UTI/U Hosp.E/UTI/S Hosp.A/CM/SA Hosp.B/UTI/SN Hosp.J /UI/ST Hosp.J /UI/SD Hosp.A/UTI/S Hosp.I/UN/U Hosp.A/UTI/S Hosp.A/CM/U Hosp.L/UTI/U Hosp.J /ONCO/U Hosp.A/UTI/U Hosp.J /CC/FNC Hosp.A/UTI/S Hosp.L/UTI/SN Hosp.J /UTI/S Hosp.A/UTI/ST Hosp.A/UTI/ST Hosp.J /UI/ST KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-10 KPC-10 KPC-10 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-10 KPC-10 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 KPC-2 882 882 882 882 882 882 882 882 862 862 562 882 882 882 882 882 882 882 882 882 860 853 882 Identidade K.pneumoniae Serratia marcescens K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae Raoultella planticola Enterobacter cloacae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae Enterobacter aerogenes K.pneumoniae Enterobacter cloacae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae Enterobacter cloacae A. baumannii Enterobacter aerogenes K.pneumoniae Raoultella ornithinolytica Serratia marcescens K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae A. baumannii A. baumannii A. baumannii K.pneumoniae K.pneumoniae Escherichia coli K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae A. baumannii A. baumannii K.pneumoniae K.pneumoniae K.pneumoniae Raoultella planticola K.pneumoniae Similaridade % 99 99 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99 99 # 99 99 99 99 100 100 99 99 99 99 99 99 100 99 # 100 99 99 99 99 99 99 99 99 100 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 100 # 99 77 K.pneumoniae 100 K.pneumoniae 100 K.pneumoniae 100 Enterobacter 204 Hosp.E/EM/U KPC-2 873 99 aerogenes Enterobacter 205 Hosp.E/EM/U KPC-2 882 99 aerogenes Pantoea spp 207 Hosp.O/UTI/ST KPC-2 882 # K.pneumoniae 208 Hosp.A/CM/U KPC-2 882 99 Enterobacter 211 Hosp.E/UTI/S KPC-2 882 99 aerogenes K.pneumoniae 212 Hosp.E/UTI/S KPC-2 858 99 A. baumannii 226 Hosp.A/UTI/SN KPC-10 882 99 A. baumannii 227 Hosp.B/UTI/ST KPC-10 882 99 A. baumannii 229 Hosp.A/UTI/ST KPC-10 857 97 A. baumannii 230 Hosp.J /UTI/ST KPC-10 853 96 A. baumannii 231 Hosp.B/ UTI/ST KPC-10 882 100 A. baumannii 232 Hosp.A/SI/ST KPC-10 853 96 A. baumannii 233 Hosp.B/UTI/S KPC-10 882 99 A. baumannii 235 Hosp.B/UTI/ST KPC-10 853 96 A. baumannii 236 Hosp.A/UTI/SN KPC-10 882 99 A. baumannii 240 Hosp.D/UTI/ST KPC-10 853 96 A. baumannii 241 Hosp.A/UTI/ST KPC-10 882 100 A. baumannii 246 Hosp.C/UTINEO/S KPC-10 882 99 A. baumannii 247 Hosp.A/UTI/ST KPC-10 882 100 A. baumannii 250 Hosp.J /UTI/ S KPC-10 882 99 K.pneumoniae 260 Hosp.J /ONCO/U KPC-2 882 100 Enterobacter cloacae 261 Hosp.B/CM/SN KPC-2 882 99 K.pneumoniae 264 Hosp.A/UTI/SN KPC-2 882 100 K.pneumoniae 265 Hosp.E/ UTI/PC KPC-2 882 99 K.pneumoniae 267 Hosp.A/UTI/ ST KPC-2 882 99 K.pneumoniae 268 Hosp.E/UTI/U KPC-2 882 99 K.pneumoniae 269 Hosp.E/UTI/FFO KPC-2 882 99 K.pneumoniae 270 Hosp.I /PED/U KPC-2 864 100 Enterobacter cloacae 271 Hosp.I /CM/U KPC-2 882 99 K.pneumoniae 291 Hosp.A/UTI/SA KPC-2 882 100 K.pneumoniae 292 Hosp.J /UTI/S KPC-2 864 99 A. baumannii 298 Hosp.A/SI/ST KPC-10 866 99 K.pneumoniae 299 Hosp.J /CM/FFO KPC-2 882 99 Enterobacter cloacae 314 Hosp.K/UTI/ST KPC-2 863 99 K.pneumoniae 315 Hosp.L/UTI/SN KPC-2 863 98 K.pneumoniae 316 Hosp.L/UTI/U KPC-2 882 99 K.pneumoniae 317 Hosp.L/UTI/U KPC-2 858 99 K.pneumoniae 320 Hosp.A/UTI/F KPC-2 861 99 K.pneumoniae 321 Hosp.A/UTI/U KPC-2 882 99 Enterobacter 323 Hosp.L/UTI/SA KPC-2 882 99 aerogenes K.pneumoniae 325 Hosp.I /UTI/SA KPC-2 868 99 K.pneumoniae 326 Hosp.I /UTI/SAb KPC-2 867 99 K.pneumoniae 327 Hosp.I /UTI/SR KPC-2 869 99 K.pneumoniae 328 Hosp.I /UTI/SA KPC-2 882 99 Legenda: UTI=Unidade de terapia intensiva; UI=Unidade Intermediária; CC=Clínica Cirúrgica; CM= Clínica Médica; ST=Secreção traqueal; EM=Emergência; FO=Ferida operatória; SI=Semi Intensiva, SN=Swab nasal; S=Sangue, U=Urina; SA=Swab anal; # =Sequência que não consta no Genbank; FNC=Fragmento de necrose calcaneo; FFO= Fragmento de ferida operatória; Serviço de pronto atendimento Oncológico; CC=Centro Cirúrgico; PED=Pediatria; SOG =Secreção de óstio gástrico; PC=Ponta Cateter; F=Fezes, SD=Secreçao de dreno, UN=unidade renal; SAb=Secreção de abscesso; SR=Secreção de retrocavidade. 201 202 203 Hosp.E/EM/U Hosp.A/CM/U Hosp.A/CM/U KPC-2 KPC-2 KPC-2 882 882 882 78 7 DISCUSSÃO Desde o primeiro relato da detecção de Klebsiella pneumoniae produtora da enzima serina-carbapenemase, mundialmente conhecida como KPC, esforços têm sido feitos na busca de um método fenotípico ideal para rastrear a produção desta enzima. Mas, ainda não há metodologias que possam ser utilizadas rotineiramente na condução do diagnóstico clínico-laboratorial. Nesse aspecto, há necessidade da confirmação da presença do gene blaKPC por técnicas de biologia molecular para definição da produção de KPC (YIGIT et al., 2001). Este estudo evidenciou a disseminação de linhagens bacterianas multirresistentes, isoladas de amostras clínicas de pacientes oriundos de vários sistemas de saúde (hospitais) públicos e privados de São Luis-MA-Brasil, que expressaram fenótipo de resistência ou susceptibilidade diminuída aos antimicrobianos carbapenêmicos. Pelo método fenotípico automatizado foi possível identificar as diversas espécies bacterianas colecionadas no período do presente estudo (junho de 2012 a julho de 2013), sendo que a maioria pertencia à espécie A. baumannii, as duas outras espécies mais frequentemente isoladas foram K. pneumoniae e P. aeruginosa. Estes dados foram concordantes com a prevalência de microorganismos multirresistentes notificados pelos hospitais de São Luis, no período de janeiro/2012 a dezembro/2012, através do relatório de atividades da Coordenação Estadual de Controle de Infecção Hospitalar (Cecih-MA). No qual, foi demonstrado a prevalência de A. baumannii (37,2%), seguido da P. aeruginosa (18,6%) e K. pneumoniae (8%) (MARANHÃO, 2012). Considerando a frequência bacteriana, o A. baumannii e K. pneumoniae foram mais isolados nos hospitais A e J, enquanto que a P. aeruginosa foi mais encontrada no Hospital J. Estes são hospitais públicos de alta complexidade que recebem pacientes provenientes de vários municípios do Estado. Geralmente se tratam de pacientes graves, imunocomprometidos e que necessitam de tempo de internação prolongado. Os carbapenêmicos vêm sendo muito utilizados na prática clínica como último recurso no tratamento de infecções com risco de morte ocasionado por vários micro-organismos multirresistentes, pela sua estabilidade diante de várias betalactamases, tal como a ESBL. Entretanto, sua eficácia tem sido ameaçada pela 79 emergência de enzimas beta-lactamases hidrolisando os antibióticos carbapenêmicos (CARVALHO et al., 2009). A resistência bacteriana tem sido um dos principais problemas de saúde pública em todo mundo (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010). A extensiva resistência às drogas antimicrobianas testadas nas diferentes espécies bacterianas recuperadas dos espécimes clínicos dos hospitais avaliados neste estudo evidencia provavelmente, uma resistência cruzada entre os vários antibióticos. Uma explicação plausível está no fato de que os genes que codificam carbapenemases estão localizados em elementos genéticos móveis (plasmídeos e transposons) que geralmente carreiam genes responsáveis por resistência a outros antibióticos (ZAVASCKI; BULITTA; LANDERSDORFER, 2013). A emergência de beta-lactamases das classes A, B e D (Ambler) tem causado várias mudanças de paradigma em relação à terapia contra bacilos Gram negativos. Isto não teria tanto interesse, se a descoberta e desenvolvimento de novos antimicrobianos tivessem evoluído tão rápida e efetivamente como a habilidade desses microrganismos em se tornar resistentes aos antibióticos. E em decorrência dessa realidade, os médicos têm ressuscitado “velhos” antibióticos, tais como, as polimixinas, como último recurso na terapêutica contra infecções por tais micro-organismos (ZAVASCKI; BULITTA; LANDERSDORFER, 2013). Em relação às espécies de bactérias analisadas foi observado que vários isolados apresentaram resistência à maioria dos agentes antimicrobianos testados, exceto à polimixina e a amicacina. Nenhum estudo até então, tem sido categórico em afirmar que o antimicrobiano amicacina seja uma opção terapêutica de escolha no tratamento de tais micro-organismos. Mas, esta evidência tem emergido um interesse importante principalmente para aqueles isolados que possuem resistência intrínseca à polimixina. Em decorrência da resistência entre vários patógenos hospitalares, o agente antimicrobiano polimixina, altamente tóxico e muito utilizado no início dos anos 80 para tratar infecções causadas por bacilos Gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos, voltou a ser utilizado para tratar infecções causadas por isolados sensíveis apenas a este componente (CARVALHO et al., 2009). Hirsch e Tam (2010) concluíram que, tratamentos eficazes para infecções causadas por isolados produtores de KPC são desconhecidos. Mas, nos casos em que foram adotados monoterapia com polimixinas (polimixina B e colistina) 80 obtiveram baixas taxas de sucesso clínico, mas essas taxas se elevaram quando associaram à polimixina, a tigeciclina ou gentamicina. Um estudo subsequente observou que, a combinação entre tigeciclina e polimixina, apresentou sinergismo contra A. baumannii com alto nível de resistência aos carbapenêmicos (DI CARLO et al., 2011). Segundo Bratu et al. (2008), o nível aumentado de expressão do sistema efluxo em isolados de A. baumannii foi correlacionado ao nível reduzido de susceptibilidade à tigeciclina. Além disso, um relato muito preocupante foi sinalizado por Caneiras et al. (2012), que publicaram o primeiro caso de A. baumannii produzindo KPC-3 em Portugal resistente a todos os antimicrobianos avaliados, incluindo colistina e tigeciclina. Evidenciou-se também que os micro-organismos testados apresentaram percentual de resistência elevado para a maioria dos antimicrobianos analisados e a amicacina apresentou boa atividade frente a esses isolados. Em relação à tigeciclina, a qual surgiu recentemente, como opção terapêutica promissora, foram evidenciados elevados valores CIMs frente à maioria dos isolados analisados nesta pesquisa. A classe de antibiótico polimixina, conhecida desde 1947, e representada pela polimixina B e polimixina E (colistina), associada à tigeciclina (representante da glicilciclina) têm recentemente sido o que há de melhor no tratamento dos patógenos gram-negativos MDR mais problemáticos (ESBL e linhagens produzindo carbapenemase) (DI CARLO et al., 2011). Ensaios de determinação de CIM90 para antimicrobianos, dentre eles polimixina B têm demonstrado que esta droga exibe uma atividade de inibição variável contra linhagens clinicas de P. aeruginosa, com valores que podem ser superiores à 64 µg/mL ou iguais à 1 µg/mL (VAN DER HEIJDEN et al., 2007; VAARA et al., 2012). O mesmo foi observado para linhagens de A. baumannii e K. pneumoniae (VAARA et al., 2012; LAT et al., 2011). Sendo assim os valores de CIM90 observados neste estudo estão abaixo do esperado, uma vez que existe uma tendência ao aumento dos valores de CIM para polimixina, como mostram os trabalhos reportados por outros autores (CANEIRAS et al., 2012). Isto é preocupante, principalmente em relação ao aumento da frequência de linhagens de K. pneumoniae resistentes à polimixina B e E (ELEMAM; RAHIMIAN; MANDELL, 2009; LEE et al., 2009a; NEONAKIS et al., 2010; ZARKOTOU et al., 2010). Em 2010, o CLSI recomendou a utilização do rastreamento da produção da enzima carbapenemase e sua confirmação, como componente padrão do teste 81 de sensibilidade em todos os membros da família Enterobacteriaceae isolados em laboratórios de diagnóstico de rotina (CLSI, 2010). E nesta pesquisa, com relação à produção da enzima carbapenemase tipo KPC triada pelo teste fenotípico de Hodge modificado, verificou-se uma forte associação entre o mesmo e a presença do gene blaKPC nos ensaios de PCR, ao ser evidenciado a positividade entre os dois teste. Entretanto, a positividade do teste de hodge modificado não confirma a presença de KPC, e sim, o envolvimento de alguma carbapenemase que pode ser KPC ou não, no fenótipo de resistência dos isolados. Similarmente ao presente estudo, Shanmugam, Meenakshisundaram e Jayaraman (2013) ao determinarem o padrão de resistência aos antibióticos e prevalência do gene blaKPC em espécies da família Enterobacteriaceae isoladas em um hospital na India, obtiveram entre os 46 isolados resistentes aos antimicrobianos carbapenêmicos, 38 (82,6%) amostras apresentando THM positivo e o gene blaKPC foi detectado em apenas 31 (67,4%) destes isolados. Nas amostras que não tiveram o gene blaKPC detectável, sugere-se a presença de outras carbapenemases, com exceção da KPC. Um estudo por Raghunathan, Samuel e Tibbets (2011) evidenciaram através de ensaios de PCR em tempo real que, dos 61 isolados que apresentaram THM positivo 82% (50/61), foram também positivos para o gene blaKPC, e aqueles isolados que tiveram o THM negativos, a presença do gene blaKPC foi negativa em 87% (13/15). Um outro estudo feito na Itália, mostrou que 32/38 (84%) das cepas resistentes aos carbapenêmicos avaliadas pelo THM mostraram a produção de carbapenemase e a detecção do gene blaKPC por PCR tiveram 38/38 (100%) de positividade. Ou seja, há forte correlação entre os resultados do THM e PCR para KPC (MOSCA et al., 2013). Com relação à presença do gene blaKPC, entre as diferentes espécies de micro-organismos, Arnold et al. (2011), constataram que a bactéria K. pneumoniae permanece a mais prevalente espécie portadora de KPC. No entanto, em um estudo descritivo sobre a prevalência de carbapenemases em bactérias da família Enterobacteriaceae oriundas de quatro hospitais de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil, mostrou que K. pneumoniae foi também a espécie mais frequente albergando este gene, apresentando uma taxa de (66%) das amostras (PINTO et al.., 2014). Este dado corrobora os resultados da presente investigação nos hospitais de São Luis, Maranhão, Brasil. Na qual, obteve-se 78,7% de positividade 82 em K. pneumoniae para o gene blaKPC, entre os micro-organismos mais frequentemente recuperados das amostras biológicas avaliadas. Apesar da enzima KPC ter sido detectada em P. aeruginosa (VILLEGAS et al., 2007), outros autores têm observado que em linhagens de Pseudomonas spp, a presença do gene blaKPC é menos frequente em relação a outros bacilos Gramnegativos (MIRIAGOU et al., 2003; WOLTER et al., 2009b). Porém, no presente estudo, todos os isolados de Pseudomonas submetidos à análise, não portavam o gene blaKPC. Em estudo de vigilância de patógenos nosocomiais feito por Zulueta et al. (2011) no México, além da K. pneumoniae foi detectado também o A. baumannii como portador do gene blaKPC em 7 dos 31 isolados analisados. Entretanto, AlAgamy et al. (2013), ao reportarem os resultados de um estudo realizado em 2011, objetivando investigar a presença de várias β-lactamases, em 55 isolados de A. baumannii com susceptibilidade reduzida aos antimicrobianos carbapenêmicos de um hospital de Riyadh, Arábia Saudita. Não evidenciaram o gene blaKPC em nenhuma amostra. Logo, o alto nível de resistência aos carbapenens encontrado foi consistentemente atribuído aos genes blaOXA-23 ou blaOXA-24. Este estudo sinalizou que, em espécies de Acinetobacter spp., a classe D de Ambler (oxacilinases) é mais prevalente em relação às demais classes. Entretanto, no presente estudo foi evidenciado um quantitativo de 21(16,4%) de cepas de Acinetobacter portando o gene blaKPC entre 128 amostras analisadas. Nesta pesquisa ao se correlacionar o tipo de espécime clínico, de onde os isolados bacterianos foram recuperados, com a presença do gene blaKPC observouse que apesar do baixo número de amostras de swab retal colecionados para análise, a detecção deste gene foi de 33,3%. Este achado corrobora os resultados encontrados por Pinto et al. (2014) que obtiveram maior parcela de positividade para o gene blaKPC nos isolados oriundos de swab retal, sendo o mesmo considerado importante marcador para cultura de vigilância. Esta observação é importante, pois sugere deficiência no rastreamento de bactérias multirresistentes, pelas comissões responsáveis, considerando que o grande reservatório de resistência bacteriana transmissível por elementos genéticos móveis são os pacientes colonizados. Logo, no intuito de mapear os pacientes internados, devem ser realizadas culturas a partir de swab retal e perianal nas unidades para controle de novos casos (GIJÓN et al., 2012). Esta conduta reforça a conscientização da importância 83 epidemiológica para detecção de micro-organismos produtores de carbapenemases e melhorias dos programas de medidas para controle de infecções relacionadas à assistência à saúde – IRAS (GIJÓN et al., 2012; PAPADIMITRIOU-OLIVGERIS et al., 2012). Assim, a presença de bactérias multirresistentes em várias regiões do Brasil e do mundo reflete as dificuldades atuais do controle de infecções. Deste modo, a prevenção é essencial uma vez que o tratamento é difícil, por conta da alta resistência aos antibióticos (GIJÓN et al., 2012; PAPADIMITRIOU-OLIVGERIS et al., 2012). Os resultados do presente estudo mostraram que a espécie A. baumannii foi a mais isolada, a partir de espécime clínico oriundo do trato respiratório, quando comparada aos demais micro-organismos e outros tipos de espécimes clínicos. Estes dados concordam com os achados de Perez et al. (2010) que ao realizarem estudos epidemiológicos com A. baumannii e K. pneumoniae, em hospitais do nordeste de Ohio, descreveram que a fonte mais comum de A. baumannii multirresistente foi o trato respiratório (paciente com tubo de traqueostomia ou endotraqueal). Ao contrário de K. pneumoniae resistente aos carbapenêmicos, com frequentes isolamentos no trato urinário, principalmente de pacientes sondados (PEREZ et al., 2010). Semelhantemente, Lee et al. (2009b), observaram em estudo realizado na Coréia do Sul, uma alta frequência de isolados de Acinetobacter spp., multirresistentes do trato respiratório (escarro). Com relação ao setor hospitalar de internação do paciente e a presença do gene blaKPC, observou-se micro-organismos portadores deste gene em isolados de pacientes oriundos de quase todas as acomodações hospitalares, destacando-se a UTI como possuidora do maior quantitativo destes isolados e em concordância com este resultado, Giakkoupi et al. (2011) mostraram que 150 (47%) de 320 isolados clínicos KPC positivos na Grécia, no período entre 2009 e 2010, foram oriundos de pacientes lotados em UTI. Além da UTI, outras unidades apresentaram percentuais de positividade para o gene blaKPC, principalmente entre aquelas nas quais acomodam pacientes multi-invadidos, imunocomprometidos e debilitados necessitando período de permanência hospitalar prolongado. A presença de 30,8% de casos positivos para o gene blaKPC, isolados de pacientes da emergência, reforçam a hipótese de veiculação e disseminação de genes de resistência na comunidade. Estes casos, entretanto, se tratam de 84 pacientes que foram transferidos de outras unidades de saúde ou que permaneceram internados por mais de 24h em outro hospital. Os isolados de Acinetobacter ursingii, Aeromonas salmonicida, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida utilizados neste estudo, não possuíam o gene blaKPC. Entretanto, estes microorganismos apresentaram fenotipicamente resistência ou susceptibilidade diminuída aos carbapenêmicos testados. Em concordância com várias literaturas (MONTEIRO et al., 2009; ROBLEDO et al., 2010; MUNOZ-PRICE et al., 2013), comprovaram que as espécies bacterianas que portam o gene blaKPC realmente não permitem que os antimicrobianos beta-lactâmicos exerçam seus efeitos antibacterianos. Tais drogas incluem: penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos e monobactâmicos, todas elas agem por inibir a síntese da parede celular (DISPERSIO et al., 2005; NORDMANN; CUZON; NAAS, 2009). Quanto ao percentual de resistência entre os micro-organismos fermentadores portadores do gene blaKPC foi observado um elevado nível de sensibilidade para polimixina, entretanto, é preocupante a emergência de algumas linhagens apresentando resistência à este antimicrobiano, inclusive aqueles patógenos que possuem resistência intrínseca a esta classe de antibiótico. A literatura tem descrito a presença K. pneumoniae produtora de KPC-3 resistente à colistina (Polimixina E) em hospitais da Sicília-Itália (MEZZATESTA et al., 2011; CUZON et al., 2010). Adicionalmente, foram descritas em 3,4% dos isolados clínicos de A. baumannii MDR, colecionados de janeiro a maio/2009 em 17 hospitais em Porto Rico, carbapenemases da classe A de Ambler tipo KPC, variantes KPC-2, -3 4 e -10 (ROBLEDO et al., 2010). Um estudo mais recente observou que, apesar da evidente disseminação da carbapenemase tipo KPC em A. baumannii causando surtos nosocomiais, há o envolvimento de vários tipos de carbapenemases nessa espécie bacteriana, associadas ou não a outros mecanismos ditos não enzimáticos, incluindo mudanças nas proteínas de membrana externa (OMPs), bomba de efluxo e alterações nas proteínas ligadoras de penicilinas (PBP) (ZARRILLI et al., 2013). Em relação às demais espécies analisadas, todas foram sensíveis frente à polimixina, ou seja, este antibiótico ainda pode ser utilizado como boa opção de tratamento de infecções causadas por A. baumannii, E. aerogenes, E. cloacae, E. coli e Pantoea spp. Seguida da amicacina, mesmo apresentando percentuais variáveis de resistência. Essas observações são motivos de grandes preocupações 85 em relação às opções terapêuticas para tratar infecções ocasionadas por esses micro-organismos, uma vez que a colistina está entre as poucas drogas ativas contra bactérias gram-negativas multidroga-resistente (MDR) produtoras de KPC, principalmente se associada à tigeciclina e aminoglicosídeos (HIRSCH; TAM, 2010). É postulado que as polimixinas exercem seus efeitos inibitórios por aumentar a permeabilidade da membrana citoplasmática bacteriana, causando extravasamento do conteúdo celular bacteriano. Seu mecanismo de ação é importante porque não depende do envolvimento de enzimas (TENOVER, 2006). A serina-carbapenemase tipo KPC é codificada pelo gene bla KPC e mediada por elementos genéticos móveis – plasmídeos e transposons Tn4401 contribuindo para sua rápida disseminação (KITCHEL et al., 2009), é a enzima mais frequentemente encontrada entre as bactérias fermentadoras, principalmente na K. pneumoniae, na qual foi identificada pela primeira vez e por esse motivo recebeu esta nomenclatura – KPC (YIGIT et al., 2001). Mas, esta carbapenemase pode ser encontrada em outras espécies bacterianas conforme detectada neste estudo. Além de conferir resistência a todos os antibióticos beta-lactâmicos, as opções terapêuticas para tratamento são quinolonas, aminoglicosídeos e polimixina B ou combinações de agentes antimicrobianos dos quais existem poucos dados sobre a eficácia (ENDIMIANI et al, 2008). A positividade para o gene blaKPC normalmente envolve a presença concomitante de outras enzimas que podem agir sinergicamente, além dos mecanismos, dito não-enzimáticos associados, atribuindo fenótipo de resistência aos carbapenêmicos (YIGIT et al., 2001; KITCHEL et al., 2009). Então, em decorrência desses fatores, observou-se que os isolados manifestavam também resistência a outras classes de antibióticos, entretanto, não albergavam o gene da carbapenemase KPC. No presente estudo todos os isolados que apresentaram o gene blaKPC foram sequenciados e suas variantes identificadas. Para os isolados pertencentes às espécies fermentadoras a variante identificada foi a KPC-2 e para a espécie A. baumannii a variante identificada foi a KPC-10. Esses dados corroboram os achados de Marchaim et al. (2008) ao descreverem a presença do gene blaKPC variante 2 (KPC-2) nos isolados de E. coli, K. pneumoniae e Enterobacter spp. A KPC-2 foi também encontrada em Enterobacter spp. e em Klebsiella oxytoca in New York City (BRATU et al., 2005a). Kitchel et al. (2009) e Zacharczuk et al. (2011) afirmaram 86 que, a KPC tem se tornado o maior desafio terapêutico com as variantes KPC-2 e KPC-3. As quais, são predominantes nos Estados Unidos e Europa. No Brasil, Peirano et al. (2009) descreveram que, dos 6 isolados clínicos avaliados no Rio de Janeiro, todos foram descritos como KPC-2. Além disso, Fehlberg et al. (2012) detectaram 07 cepas de K. pneumoniae produzindo KPC-2 na Paraíba. Outros estados do Brasil já evidenciaram a emergência de isolados produdores de KPC-2, são eles: São Paulo, Recife e Porto Alegre (ZAVASCKI et al., 2009; MONTEIRO et al., 2009; CABRAL et al., 2012). Este estudo é pioneiro no Estado do Maranhão, por analisar um número significante de isolados bacterianos multirresistentes oriundos de diferentes hospitais públicos e privados de São Luis, com a expressiva detecção do gene blaKPC variante 2, sendo a mais alta até então evidenciada no Brasil. Além disso, detectou-se pela primeira vez na literatura nacional a presença deste gene em dois isolados de Raoultella planticola, um em Raoultella ornithinolytica e um em Pantoea spp. 87 8 CONCLUSÃO As linhagens bacterianas que apresentaram maior frequência no período do estudo foram: Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa, com predominância em amostras oriundas da UTI e principalmente em isolados da rede pública hospitalar; Para as espécies fermentadoras e não fermentadoras multidroga resistentes (MDR), as drogas que exibiram melhores atividades de inibição bacteriana foram polimixina B e amicacina. Exceto àquelas linhagens que são intrinsecamente resistente à polimixina B; A detecção do gene blaKPC foi de 99 (33,4%) entre os isolados avaliados com predominância em Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumannii; Através do alinhamento das amostras sequenciadas e as sequências do Genbank, os índices de similaridades nucleotídicas variaram entre 96 a 100% com predominância da variante tipo 2 (KPC-2) entre as bactérias fermentadoras. Enquanto que, entre a linhagem de Acinetobacter baumannii a variante predominante foi a do tipo 10 (KPC-10). 88 REFERÊNCIAS ABRAHAM, E. P.; CHAIN, E. A enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Nature, p. 146:837, 1940. ABREU, A. G.; MARQUES, S. G.; MONTEIRO-NETO, V.; CARVALHO, R. M. L.; GONÇALVES, A. G. Nosocomial infection and characterization of extended-spectrum β-lactamases-producing Enterobacteriaceae in northeast Brazil. Rev Soc Bras Med Trop., v. 44, n. 4, p. 441-446, 2011. AKPAKA, P. E.; SWANSTON, W. H.; IHEMERE, H. 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