TCC FINAL - Daiane Orlando

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UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ
Área de Ciências da Saúde
Curso de Graduação em Farmácia
Daiane Orlando
PREVALÊNCIA DE ROTAVÍRUS EM AMOSTRAS DE FEZES A PARTIR DA ANÁLISE DE
LAUDOS ARQUIVADOS NA VIGILÂNCIA SANITÁRIA DE CHAPECÓ – SC NOS ANOS DE
2005 A 2009.
Chapecó-SC, 2010
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DAIANE ORLANDO
PREVALÊNCIA DE ROTAVÍRUS EM AMOSTRAS DE FEZES A PARTIR DA ANÁLISE DE
LAUDOS ARQUIVADOS NA VIGILÂNCIA SANITÁRIA DE CHAPECÓ - SC NOS ANOS DE
2005 A 2009.
Monografia de Conclusão de Curso apresentada à
UNOCHAPECO como parte dos requisitos para
obtenção do grau de Bacharel em Farmácia.
Orientador: Prof. Msc Ilo Odillon Vila Dias.
Chapecó - SC, Jun. 2010
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BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
ILO ODILON VILLA DIAS
Professor Orientador
Msc. em Biologia Celular e Molecular
Professor titular da UNOCHAPECÓ
_________________________________________
SILVANA MURARO WILDNER
Msc. em Engenharia Biomédica
Professor titular da UNOCHAPECÓ
_________________________________________
GENI PORTELA GAMBORGI
Msc. em Medicina (Nefrologia)
Professor titular da UNOCHAPECÓ
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AGRADECIMENTOS
Quero agradecer primeiramente a Deus por ter me iluminado e ao meu pai que
mesmo não estando mais ao meu lado pude senti-lo me guiando nesta trajetória.
À minha mãe, deixo aqui o meu mais sincero obrigado, obrigado por ter sido minha
base, obrigado pelos sacrifícios feitos para me proporcionar sempre mais, obrigado pelas
palavras de motivação e obrigado ter estado sempre presente. Ao meus irmãos, que são os
laços que sempre ligarão o meu passado ao meu futuro, reconheço com imenso carinho por
estarem comigo e me incentivarem a crescer e a buscar novos conhecimentos.
Não posso deixar de homenagear os meus mestres que se dedicaram aos ensinos,
os profissionais das áreas de farmácia por terem me auxiliado e dado espaço para praticar e
conhecer um pouco da rotina de atividades de trabalho de um profissional farmacêutico.
Por final, mas não menos importante, agradeço aos meus amigos, que por muitas
vezes me ouviram, me aconselharam, me fizeram sorrir e aproveitar cada momento de uma
vida acadêmica que vem chagando ao fim.
Passou tanto tempo desde o primeiro dia de aula na universidade, e do dia que
precisei pensar no futuro e fazer difíceis decisões, mas maior é o tempo que já se passou
das brincadeiras lúdicas, da emoção de fazer 15 anos, do primeiro amor e com ele também
a primeira dor de amor. Cresci, e comigo aflorou os desejos de fazer o meu próprio caminho.
Hoje, me sinto realizada, pois esta etapa da minha vida foi alcançada.
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EFÍGRAFE
“A vida é aquilo que acontece enquanto você está planejando o futuro.”
John Lennon
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RESUMO
Introdução: No Brasil, e em países desenvolvidos, o impacto da contaminação do rotavírus
é apontado como um problema que afeta o desenvolvimento infantil, o desenvolvimento
social, gera custos pela demanda aos serviços médicos, atendimento ambulatorial, pronto
atendimento, hospitalizações e a perda de dias de trabalho, de escola e gastos com
médicos. Desenvolvimento: O rotavírus é uma das maiores causas de quadros de diarréia
aguda, por ser uma patologia grave que causa diarréia profusa, náuseas, vômitos, febre alta
e se não for tratada pode levar à morte devido ao alto grau de desidratação. A sua
contaminação é pela via fecal-oral, pela água contaminada, alimentos e também objetos
contaminados, pelo contato com pessoas infectadas pelo rotavírus, falta de saneamento
básico e higiene, sendo uma questão de saúde pública, envolvendo um grande número de
internamentos em hospitais e postos de saúde gerando um grande custo com o tratamento
dos pacientes. Pode atingir jovens, adultos e idosos, mas as crianças são as mais
acometidas. Metodologia: Foram analisadas as amostras coletadas pelo Laboratório
Municipal de Análises Clínicas e Ambientais de Chapecó – SC e encaminhadas para o
Lacen (Laboratório Central de Saúde) em Florianópolis, que em seguida eram
encaminhados para o Instituto Adolfo Lutz para a identificação da cepa infectante. Os laudos
foram arquivados na vigilância sanitária, sendo eles positivas ou negativas desde o ano de
2005 até o ano de 2009. Nestes laudos foram observadas as informações referentes à
idade, os resultados, independente de negativo ou positivo e os métodos utilizados nas
analises. Resultados e discussão: No ano de 2005 foram encontrados 36 casos suspeitos
de rotavírus, 15 do sexo masculino e 21 do sexo feminino. Desses 36, 10 obtiveram
resultados positivos para o antígeno de rotavírus. No ano de 2006, foram encontrados 24
casos suspeitos de contaminação por rotavírus, destes apenas 3 obtiveram resultado
positivo, 2 do sexo feminino e 1 do sexo masculino. Nos anos de 2007 a 2009, foram
analisados 77 casos suspeitos de diarréia por rotavírus, destes exames realizados todos
obtiveram resultados negativos para pesquisa de rotavírus. Conclusão: Devido à ocorrência
de surtos de diarréia por rotavírus, em creches ou mesmo nos domicílios, a partir do ano de
2006 o Ministério da Saúde viu a necessidade de implantar a vacinação contra rotavírus no
calendário anual de vacinas. As crianças que foram mais acometidas tinham idades de zero
a um ano, obtendo uma maior positividade das amostras.
Palavras-chave: rotavírus, diarréia, infecção.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
EGPA – Eletroforese em gel de poliacrilamida
ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FDA - United States Food and Drug Administration
GERV - Gastro Enterite Retroviral Grave
ISPV – Partícula Subviral infecciosa / intermediário
LACEN - Laboratório Central de Saúde Pública de Santa Catarina
MDDA- Monitorização da Doença Diarréica Aguda
NSP – Proteínas não estruturais
OMS – Organização Mundial da Saúde
PATH - Program for Appropriate Technologies in Health
RE – Retículo endoplasmático
SDS-PAGE – Dodecil sulfato de sódio
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LISTA DE FIGURAS
Gráfico 1 – Prevalência do rotavírus por gênero no ano de 2005................................32
Gráfico 2 – Prevalência do rotavírus no ano de 2005..................................................32
Gráfico 3 – Prevalência do rotavírus no ano de 2005 por faixa etária........................33
Gráfico 4 - Prevalência do rotavírus por gênero no ano de 2006................................35
Gráfico 5 – Prevalência do rotavírus no ano de 2006..................................................35
Gráfico 6 – Prevalência do rotavírus por faixa etária no ano de 2006.........................36
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SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 10
2.
OBJETIVOS ................................................................................................................. 11
3.
2.1
Objetivo Geral........................................................................................................ 11
2.2
Objetivos Específicos ............................................................................................ 11
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................................... 12
3.1
Rotavírus: estrutura, transmissão, instalação e patologia ...................................... 12
3.2
A diarréia, suas complicações, prevenção e tratamento ........................................ 18
3.3
Métodos imunoenzimáticos de identificação do ratavírus ...................................... 24
3.3.1
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ................................................. 25
3.3.1.1
Ensaio para anticorpo – método indireto (sorologia) ....................................... 26
3.3.1.2
Ensaio para antígeno – método de captura .................................................... 26
3.3.2
Western blotting – eletroforese........................................................................... 27
4.
PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS ..................................................................... 30
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 31
CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 39
ANEXOS.............................................................................................................................. 42
10
1 INTRODUÇÃO
O rotavírus é um vírus que pertence à família Reoviridae causadora diarréia grave,
freqüentemente acompanhada de febre e vômito. É considerado um dos mais importantes
agentes causadores de gastroenterites e óbitos em crianças menores de cinco anos, em
todo o mundo (Revista de Saúde Pública, 2006).
Pode ser transmitido por água, alimentos e objetos contaminados, por pessoa a pessoa
e, também por secreções respiratórias, iniciando-se a replicação após a ingestão do vírus
(VRANJAC, 2004).
Embora possam infectar indivíduos de todas as idades, a diarréia aguda geralmente
ocorre em crianças na faixa etária de seis meses a dois anos que freqüentam ambientes
fechados como creches e pré-escolas.
No Brasil, e em países desenvolvidos, o impacto da contaminação do rotavírus é
apontado como um problema que afeta o desenvolvimento infantil, o desenvolvimento
social, gera custos pela demanda aos serviços médicos, atendimento ambulatorial, pronto
atendimento, hospitalizações e as perdas de dias de trabalhos, de escola e gastos com
médicos.
Embora as evidências demonstrem o declínio da mortalidade nessa última década, em
algumas áreas subdesenvolvidas a diarréia por rotavírus permanece uma das principais
causas de morte em crianças recém-nascidas até dois anos de idade.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Identificar a prevalência de rotavírus em amostras de fezes de adultos e crianças a partir
da análise de laudos arquivados na vigilância sanitária de Chapecó - SC entre os anos de
2005 e 2009.
2.2 Objetivos Específicos
- Especificar em qual idade há maior incidência de rotavírus;
- Identificar qual método tem maior eficácia nos resultados;
- Identificar em qual dos gêneros teve maior incidência de rotavírus;
12
3
3.1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Rotavírus: estrutura, transmissão, instalação e patologia
Segundo Maza, Pezzlo e Baron (1999) as partículas de rotavírus medem
aproximadamente 70nm de diâmetro e tem a aparência de uma roda, por isso, o nome Rota
da palavra latina para roda. A parte central contém 11 segmentos de RNA dupla-fita e é
circundado por um capsídeo que tem 92 capsômeros. A clivagem do capsídeo externo ativa
o vírus para a infecção e produz uma partícula subviral infecciosa/intermediária
(ISVP)(MURRAY et al., 2004). Até o momento, são reconhecidos sete diferentes grupos de
rotavírus, designados de A a G. Os rotavírus do grupo A destacam-se como os de maior
importância epidemiológica (VACINA contra rotavírus, 2006).
As VP4, VP6 e VP7 são as proteínas principais que atuam de forma antigênica,
induzindo a formação dos anticorpos neutralizantes, provoca uma resposta imunológica
protetora formando a base da classificação atual em que os rotavírus são divididos em
grupos A-H (VP6), e genótipos ou sorotipos P (VP4) e G (VP7). Os sorotipos são
determinados pelos métodos imunológicos, e os genótipos por métodos moleculares
(COSTA et al., 2006).
O capsídeo externo é constituído de proteínas, que circundam um cerne de
nucleocapsídeo que inclui enzimas para a síntese do RNA e 10 ou 11 segmentos genômicos
diferentes de RNA de duplo filamento. De maneira semelhante ao capsídeo do vírus da
influenza, o capsídeo do rotavírus é preenchido aleatoriamente com mais de 10 ou 11
segmentos genômicos para gerar vírions com um conjunto completo de diferentes
segmentos. Além disso, pode ocorrer a redistribuição dos segmentos gênicos com a
conseqüente criação de vírus híbridos (MURRAY et al., 2004).
O vírus não possui envelope e formam-se três camadas concêntricas. Essas
camadas envolvem o genoma que é composto pelos 11 segmentos genômicos. Cada um
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desses 11 segmentos genômicos codificam uma proteína, conhecendo-se 6 proteínas
estruturas (VP) e 5 proteínas que não são estruturais (NSP). A proteína VP6 é conhecida
como o antígeno responsável pela classificação do rotavírus em sete grupos (A-G) e em
quatro subgrupos (II, II, não-I, e não-II, I+II), e ela envolve três proteínas associadas ao
núcleo, sendo elas a VP1, a VP2 e a VP3 e também o genoma (BRICKS, 2005).
Os tipos mais comuns são G1, G2, G3 e G4e para estes estão sendo desenvolvidas
vacinas. Já G8 e G12 são encontrados muito raramente. Os tipos G6 e G10 eram
considerados como exclusivos de bovinos, mas já foram encontrados em diarréias infantis.
O tipo G9 prevalece na Índia, e é reconhecido como genótipo emergente no mundo todo na
década de 1990, hoje é considerado como o quinto G tipo de importância clínica (COSTA et
al., 2006).
O rotavírus é um vírus que pertence a família Reoviridae causadores de diarréia
grave, freqüentemente acompanhada de febre e vômito. Hoje em dia é considerado um dos
mais importantes agentes causadores de gastroenterites e óbitos em crianças menores de
cinco anos, em todo o mundo. A maioria das crianças se infecta nos primeiros anos de vida,
porém os casos mais graves ocorrem com mais frequencia em crianças até dois anos de
idade (Revista de Saúde Pública, 2006)
O rotavírus é uma espécie que pertence ao gênero Coltivirus. Tamanho varia de
60nm a 80nm com morfologia variável. Sua simetria é icosaédrica e não possui envelope
lipídico. Seu habitat natural é o trato gatrointestinal de seres humanos e também de animais.
Devido a sua preferência de habitat, a sua porta de entrada se dará pelo trato
gastrointestinal, causando as conhecidas gastroenterites. Sua distribuição é mundial e sua
transmissão é de forma fecal-oral através do contato direto de animais com humanos
(KONEMAN et al., 2008).
O processo de organização do rotavírus é semelhante aquela observada em vírus
com envelope, na qual os cernes dos rotavírus se associam a proteína viral NS28, na parte
externa do retículo endoplasmático (RE), e adquirem sua proteína do capsídeo externo VP7
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e uma membrana, durante o brotamento do RE. Ocorre perda da membrana do RE, e o
vírus abandona a célula através de lise celular (MURRAY et al., 2004).
De acordo com Bricks (2005), a camada externa do vírus contém os antígenos
neutralizantes principais, sendo, a proteína VP7 (proteína G) e a proteína VP4 (proteína P).
Os segmentos genômicos do rotavírus codificam proteínas estruturais e não-estruturais. As
proteínas do cerne incluem atividades enzimáticas necessárias para a transcrição do RNA
mensageiro (RNAm). Essas proteínas incluem uma enzima de revestimento 5`-metil
guanosina RNAm e uma RNA polimerase. A proteína VP4 do rotavírus se localizada nos
vértices do capsídeo e se estendem pela superfície como proteínas em espículas. Possui
diversas funções, incluindo hemaglutinação e fixação do vírus, além de induzir a formação
de anticorpos neutralizantes. A VP4 é ativada por clivagem pela protease, expondo uma
estrutura semelhante aquela das proteínas de fusão dos paramixovírus. Sua clivagem é
necessária para a penetração produtiva do vírus nas células. A proteína de fixação VP7 dos
rotavírus induz a formação de anticorpos neutralizantes. (MURRAY et al., 2004).
Os vírions do rotavírus são relativamente estáveis em condições como: temperatura
ambiente, tratamento com detergentes, desinfetantes comuns, aos extremos de pH de 3,5 a
10, e até mesmo ao congelamento e descongelamento proteolíticos (MURRAY et al., 2004) .
Eles mantem o seu poder de infecção por vários meses nas temperaturas entre 4oC e 20oC
(BRICKS, 2005).
Favorecem ao aumento de incidência e à etiologia viral os seguintes fatores: idade
reduzida, deficiências nutricionais, práticas inadequadas de higiene física e alimentar,
desmame precoce, aglomerações no domicílio e institucionais, ausência de saneamento
básico nos locais de permanência, acesso em água contaminada e período quente do ano
(verão) (SOUZA et al., 2002).
O elevado potencial disseminador e a grande variedade de cepas circulantes do
rotavírus, favorecidos por fatores como clima, que em países com clima temperado vai
desde o outono até a primavera, e em regiões tropicais as infecções ocorrem o ano todo,
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como também conglomerados urbanos de alta densidade populacional, convivência em
creches e outros ambientes fechados, mostram que, além das medidas tradicionais de
higiene e de saneamento básico para sua prevenção, a perspectiva real para o seu controle
seria a introdução de uma vacina eficaz e segura no calendário de vacinação infantil
(Revista de Saúde Pública, 2006).
Os rotavírus que são eliminados em grande concentração nas fezes, podem ser
transmitidos por água, alimentos e objetos contaminados, por pessoa a pessoa e, também
por secreções respiratórias, mecanismos esses que permitem a disseminação explosiva da
doença. Segundo a Revista de Saúde Pública de 2006, o rotavírus tem uma alta taxa de
excreção, sendo cerca de um trilhão de partículas virais/ml de fezes transmitidos pela via
fecal-oral (VRANJAC, 2004). Recentemente detectou-se partículas de RNA do rotavírus em
amostras sanguíneas e também em alguns órgãos de crianças que desenvolveram doença
grave (BRICKS, 2005).
A replicação do rotavírus se inicia através da ingestão do vírus. O capsídeo externo
do vírion protege o nucleocapsídeo interno e o cerne do meio ambiente, especialmente do
ambiente ácido do trato grastointestinal. Bricks (2005) afirma que os rotavírus só se
multiplicam nas células epiteliais que são maduras do intestino delgado, iniciando a infecção
na parte proximal e seguindo para a distal. O vírion completo é, a seguir, parcialmente
digerido no trato gastrointestinal e provavelmente ativado, através da clivagem da protease,
perda de proteínas do capsídeo externo (σ3/VP7) e clivagem da proteína σ1/VP4, para
produzir a ISVP. A proteína σ1/VP4 no vértice da ISVP se liga a glicoproteínas contendo
ácido siálico sobre as células epiteliais e outras células, a ISVP do rotavírus parece penetrar
diretamente através da membrana da célula-alvo. Os vírions completos podem ser captados
por endocitose mediada por receptores, entretanto, trata-se de uma via final para o rotavírus
(MURRAY et al., 2004).
A ISVP libera o cerne no citoplasma, e as enzimas do cerne iniciam a produção do
RNAm. O RNAm de filamento duplo sempre permanece no cerne. A transcrição do gene
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ocorre em duas fases, precoce e tardia, antes da replicação do genoma. O filamento do
RNA de sentido negativo é utilizado como molde pelas enzimas do cerne do vírion, que
sintetizam RNAm individuais, revestimentos 5`-metil guanosina e uma cauda de 3`poliadenilato. A seguir, o RNAm deixa o cerne e é traduzido. Posteriormente, as proteínas
dos vírions e os segmentos do RNA de sentido positivo se associam em estruturas
semelhantes a cernes, que se agregam a grandes inclusões citoplasmáticas. Os segmentos
de RNA positivos são copiados para produzir RNA negativo nos novos cernes, replicando o
genoma de duplo filamento. Os novos cernes ou geram mais RNA positivo ou se organizam
em vírion (MURRAY et al., 2004).
O rotavírus tanto de humanos como de animais, são divididos em sorotipos, grupos e
subgrupos. Os sorotipos são diferenciados especialmente pela proteína VP7 do capsídeo
externo e, em menor grau, pela proteína VP4 que é uma proteína secundária do capsídeo
externo. Os grupos são determinados principalmente com base na antigenicidade de VP6 e
na motilidade eletroforética dos segmentos genômicos. Foram identificados sete grupos de
A a G de rotavírus humano e de animais, com base na proteína VP6 do capsídeo interno. A
doença humana é causada pelo grupo A e, ocasionalmente, pelos rotavírus dos grupos B e
C (MURRAY et al., 2004).
Cepas novas de rotavírus podem surgir com mutações ou reagrupamentos genéticos
entre cepas de RVa e RVh, as cepas que correspondem ao mesmo genogrupo apresentam
reagrupamento genético com maior freqüência quando comparados com genogrupos
diferentes. Mas também existe a possibilidade de mutação e reagrupamentos genéticos de
cepas RVh diferentes (BRICKS, 2005).
Os Rotavírus A são considerados, em escala universal, importantes agentes
etiológicos de diarréia aguda em bebês e crianças menores de dois anos de idade, e é uma
das causas mais comuns de hospitalização de crianças na faixa etária de zero a quatro anos
(ANDREASI et al., 2007).
17
O rotavírus quando instalado no organismo age penetrando nos enterócitos, os quais
se rompem e são substituídos por células com propriedades absortivas imaturas. Essas
células se caracterizam por apresentar pequeno número de microvilosidades, que apesar
desse parâmetro conseguem exercer sua propriedade secretória. Observa-se redução da
Na/K ATPase, responsável pelo processo de absorção intestinal do sódio acoplado á
glicose, havendo redução da absorção de sódio como também redução da absorção de
água. Há também redução da atividade das dissacaridases, principalmente da lactase,
comprometendo o desdobramento dos dissacarídeos e sua absorção, promovendo um
aumento da osmolaridade do lúmen intestinal, e conseqüentemente, aumento do afluxo de
líquido. Há lesão direta da borda em escova, causando diarréia aguda secretória, com má
absorção dos nutrientes, perda de fluidos e eletrólitos, que muito freqüentemente leva à
desidratação (CAMPOS et al., 2002). O açúcar que não é absorvido pode sofrer ação das
bactérias que colonizam as porções mais distais do intestino, resultando na eliminação de
fezes com pH ácido, gerando a diarréia de natureza osmótica (CAUAS et al., 2006).
Os rotavírus infectam enterócitos das microvilosidades do intestino delgado, onde
multiplicam–se, no citoplasma, causando danos ao seu mecanismo de transporte. Segundo
Bricks (2005) a aderência do vírus nas células do intestino depende de uma hemaglutinina
chamada VPR em forma de espículas que facilita a sua aderência. Em pesquisas
recentemente realizadas, verificou–se que a patogenicidade do rotavírus é multifatorial, e a
capacidade deste vírus induzir à secreção de fluido intestinal é atribuída, em parte, à
produção da enterotoxina "NSP4", a qual é responsável por lesões teciduais observadas em
animais modelos (RODRIGUES et al., 2004).
O rotavírus pode sobreviver ao ambiente ácido do estômago tamponado ou no
estômago após uma refeição. Aproximadamente oito horas após a infecção, são observadas
inclusões citoplasmáticas contendo proteínas e RNA recém-sintetizados. Até 1010 partículas
virais por grama de fezes são eliminadas durante a doença. Estudos realizados em biopsias
de intestino delgado de lactentes mostram a ocorrência de encurtamento e diminuição das
18
microvilosidades, com infiltração de células mononucleares na lâmina própria (MURRAY et
al., 2004).
No Brasil, e em países desenvolvidos, a importância do rotavírus está relacionada ao
impacto da doença na população, correspondido pelos seus danos à saúde. Afeta o
desenvolvimento infantil, o desenvolvimento social, gera custos pela demanda aos serviços
médicos, atendimento ambulatorial, pronto atendimento, hospitalizações e as perdas de dias
de trabalhos, de escola, gastos com medicamentos e transportes (Revista de Saúde
Pública, 2004).
Estima-se que o período de incubação da doença diarréica causada por rotavírus
seja de 48 horas. Os principais achados clínicos em pacientes hospitalizados são vômito,
diarréia que pode variar de moderada a grave, febre e desidratação. Nessa forma de
diarréia não são observados leucócitos ou sangue. A gastroenterite por rotavírus é uma
doença autolimitada, e a recuperação é geralmente completa, não deixando seqüelas.
Entretanto, a infecção pode ser fatal em lactentes que vivem em países em desenvolvimento
e que se encontram desnutridos e desidratados antes da infecção (MURRAY et al., 2004).
3.2
A diarréia, suas complicações, prevenção e tratamento
Nas infecções pelo rotavírus, são observados espectros que abrangem as formas
assintomáticas, subclínicas e o quadro clássico, em geral caracterizado pelo início repentino
com vômitos e febre alta, e em seguida diarréia profusa. Esses sintomas, dependendo da
intensidade, chegam a desidratação do tipo isotônica, sendo considerada como o principal
determinante de morte por esses agentes entre crianças até um ano de vida (OLIVEIRA;
LINHARES, 1999).
É considerado diarréia sempre que ocorra um aumento do número das evacuações
por dia, durando de horas a dias, sendo caracterizada como aquosa ou pastosa ou de
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consistência diminuída, tendo um número excessivo de água e eletrólitos eliminados nas
fezes (GOMES; LUCENA; BARROS, 2005).
De maneira semelhante a cólera, a infecção por rotavírus impede a absorção de
água e íons, que no conjunto, resultam em diarréia aquosa. A proteína NSP4 pode atuar de
maneira semelhante a uma toxina, promovendo o influxo de íon cálcio para dentro dos
enterócitos, liberação de ativadores neuronais e alteração neuronal na absorção da água. A
perda de líquidos e de eletrólitos pode acarretar desidratação grave e mesmo morte, se o
tratamento não incluir reposição hidroeletrolítica (MURRAY et al., 2004).
Embora as evidências demonstrem o declínio da mortalidade nessa última década,
em algumas áreas subdesenvolvidas a diarréia por rotavírus permanece uma das principais
causas de morte em crianças recém-nascidas até dois anos de idade (VRANJAC, 2004).
A morbidade associada à diarréia também é importante, as crianças são acometidas
por um a dez episódios de diarréia anuais. Os episódios de diarréia podem variar de um
quadro leve, apresentando diarréia líquida e com uma duração limitada a quadros graves
apresentando febre, vômitos e desidratação. As conseqüências da infecção por rotavírus
estão relacionadas com a idade. Embora possam infectar indivíduos de todas as idades, a
infecção sintomática, isto é, a diarréia, geralmente ocorre em crianças na faixa etária de seis
meses a dois anos. O rotavírus tem sido a principal causa de surtos de diarréia nosocomial,
em creches e pré-escolas. Apesar de a doença diarréica ocorrer primariamente em crianças,
também é comum em jovens e adultos, associada a surtos esporádicos de diarréia em
ambientes que ficam fechados como escolas, ambientes de trabalho e hospitais (VRANJAC,
2004).
As crianças recém-nascidas apresentam uma proteção maior contra o rotavírus,
devido aos anticorpos que são transferidos pela mãe durante o término da gestação. As
crianças prematuras podem apresentar um quadro grave, levando muitas vezes ao óbito.
Quando há reincidência de rotavírus em adultos e crianças, estes apresentam quadros mais
leves ou até mesmo assintomáticos (BRICKS, 2005).
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A incidência da diarréia está sendo estimada por meio do programa de Monitorização
da Doença Diarréica Aguda (MDDA), implantado no estado de São Paulo, em 1999,
consegue-se por meio desse programa detectar surtos e epidemias por doenças que são
veiculadas por água e alimentos. Os dados quantitativos de diarréia que são coletados por
município pelo programa e ainda permitem estruturar outros estudos para conhecer a
etiologia das diarréias (VRANJAC, 2004).
Os surtos de rotavírus vêem sendo freqüentemente detectados pelo programa de
MDDA, a partir da investigação do aumento de casos de diarréia nas semanas que são
colhidos os dados epidemiológicos. O aumento dos surtos por rotavírus pode ser observado
ao longo do tempo, mesmo sendo considerada a maior sensibilidade do sistema de
vigilância em captação das diarréias. Em 1999, entre o total de surtos de diarréia com
etiologia identificada, 7,7% correspondiam a surtos de rotavírus, e em 2004, mais de 20%
dos surtos foram causados por este agente (VRANJAC, 2004).
A imunidade a infecção requer a presença de anticorpos, principalmente a
imunoglobulina A (IgA), na luz do intestino, essa IgA inativa o vírus no interior das células
epiteliais. Anticorpos adquiridos de maneira ativa ou passiva (incluindo anticorpos do
colostro e do leite materno) podem diminuir a gravidade da doença, mas não impedem a
reinfecção de maneira consistente. Na ausência de anticorpos, a inoculação do vírus,
mesmo em pequena quantidade, causa infecção e diarréia. A infecção em lactentes e em
crianças de pouca idade é geralmente sintomática, enquanto em adultos é normalmente
assintomática (MURRAY et al., 2004).
A principal complicação no quadro de infecção por rotavírus é sem dúvida a
desidratação, levada pela perda excessiva de água e eletrólitos. De acordo com Murray et al
(2004) os casos mais graves de diarréia por rotavírus são em crianças que apresentam
quadro de desnutrição. A desnutrição na infância em termos populacionais é uma doença de
origem multifatorial e complexa que tem relação com a pobreza. Geralmente ocorre quando
o organismo não recebe os nutrientes necessários para realizar o seu metabolismo
21
fisiológico, devido à falta de aporte ou problema na utilização do que lhe é ofertado. Assim
sendo, na maioria dos casos, a desnutrição é o resultado de uma ingestão insuficiente de
alimentos com valor nutritivo ou como causa de doenças (CAUAS et al., 2006).
A desnutrição afeta todos os sistemas e órgãos, nenhuma das funções até o
momento estudadas nesta condição tem se mostrado normal. De longe, a adaptação mais
importante é a redução do trabalho corporal em todos os seus níveis de organização. A
desnutrição tem efeitos adversos no mecanismo imunológico específico e inespecífico,
aumentando a susceptibilidade às infecções (diarréia e pneumonia), estabelecendo um ciclo
vicioso, com agravamento do estado nutricional por diminuição da ingestão, aumento das
perdas, má absorção e comprometimento da mobilização dos estoques corporais (CAUAS
et al., 2006).
Não existe tratamento antiviral específico para a infecção por rotavírus. A morbidade
e mortalidade associadas a diarréia por rotavírus resultam da desidratação e do
desequilíbrio eletrolítico. O tratamento de suporte tem como objetivo repor os líquidos, com
conseqüente correção do volume sanguíneo e do desequilíbrio eletrolítico e ácido-básico
(MURRAY et al., 2004).
Devido à importância epidemiológica do rotavírus nas diarréias graves, tem-se feito
inúmeros esforços para a elaboração de uma vacina eficaz para o combate da doença. O
desenvolvimento da vacina de rotavírus foi ajustado para a distribuição de cepas de vírus
vivos, atenuadas, por via oral. Atualmente, várias vacinas estão sendo desenvolvidas e
testadas dentro do Programa de Vacina de Rotavírus da PATH – Program for Appropriate
Technologies in Health. O objetivo da vacina é prevenir a diarréia grave, que pode levar à
desidratação, reduzindo assim a morbidade e a mortalidade infantil (VRANJAC, 2004).
De acordo com Bernstein (2007), a inclusão de uma vacina que tenha efetividade
contra o rotavírus no calendário de imunização dos recém-nascidos nos países
industrializados poderia reduzir as taxas de hospitalização decorrentes de desidratação
causadas por diarréia em crianças pequenas de 40 a 60%. Mais importante é ressaltar que
22
o uso de uma vacina em escala mundial poderia reduzir em aproximadamente 10 a 20% o
número total de mortes causadas pela diarréia.
Foram preparadas vacinas a partir de rotavírus animais, com o rotavírus do macaco
rhesus (RRV-TV, RotaShield®) e o vírus da diarréia do bezerro Nebraska (RIT4237). Essas
vacinas compartilham determinantes antigênicos com o rotavírus humano, não causam
doença no homem e proporcionam alguma proteção contra a infecção. Foram também
preparadas vacinas recombinantes rhesus-humana. Uma vacina desse tipo foi aprovada
pela United States Food and Drug Administration (FDA), mas ela foi recolhida devida a
incidência de intussuscepção, caracterizada como uma invaginação do intestino que causa
obstrução no intestino, com isquemia e edema, pode levar a infarto e perfusão intestinal,
óbito, peritonite e sepse (BRICKS, 2005). As vacinas não protegem contra todos os
sorotipos do rotavírus (MURRAY et al., 2004).
A vacina contra o rotavírus foi incluída pelo Ministério da Saúde no calendário básico
de vacinação no Brasil no ano de 2006, sendo obrigatória a aquisição da vacina para o
grupo etário vulnerável as infecções, as quais seriam crianças recém-nascidas até dois anos
de idade (Revista de Saúde Pública, 2004).
Os rotavírus são adquiridos em uma fase precoce da vida. Sua natureza ubíqua
torna difícil limitar a transmissão e a infecção pelo vírus. Consequentemente, pacientes
hospitalizados com a doença devem ser isolados, para limitar a transmissão da infecção
para outros pacientes suscetíveis (MURRAY et al., 2004).
Atualmente existem duas vacinas recém-produzidas que foram submetidas a ensaios
de fase III. Uma é a vacina pentavalente com amostras virais de origens bovina e humana,
geneticamente reestruturadas (RotateqTM), desenvolvida pelo laboratório Merck (EUA). A
outra, que vem sendo investigada em larga escala nos países desenvolvidos e em
desenvolvimento é a RotarixTM (RIX4414), desenvolvida pelo laboratório GlaxoSmithKline
Biologicals, Bélgica (ARAUJO et al., 2007). Em seu artigo, Bricks (2005), afirma que essas
23
duas vacinas apresentam baixo risco de teratogenicidade quando comparadas com o grupo
placebo, também não foram associadas com a intussuscepção.
Araujo et al. (2007) descreve a RIX4414 como uma amostra G1P[8] de rotavírus de
origem humana, atenuada. É derivada da amostra 89-12 após passagens em cultivo celular
e clonagem. Essa amostra apresentou resultados promissores nos estudos de eficácia
realizados nos EUA, com leve reatogenicidade. Em estudos de dosagem com crianças
finlandesas e ensaios de fase III realizados na Finlândia, América Latina (Brasil, México e
Venezuela) e Cingapura, a RIX4414 mostrou-se altamente eficaz contra a Gastro Enterite
Retroviral grave (GERV). As duas doses mais altas da vacina conferiram 53,9 a 81,5% de
proteção contra casos graves e 81,2 a 93,0% de proteção contra hospitalização devido à
gastroenterite causada por rotavírus (BERNSTEIN, 2007).
A imunogenicidade após a vacinação, mostra que a vacina induziu a produção de
anticorpos IgA em aproximadamente 40% dos vacinados após uma dose e em 70% após
duas doses da vacina, o que é compatível com a baixa imunogenicidade às vezes
observada nas vacinas orais realizadas com apenas uma dose em outros países em
desenvolvimento. É importante notar que a vacina não interferiu na rotina vacinal das
crianças, demonstrando que pode ser administrada como parte do calendário de imunização
(BERNSTEIN, 2007).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que, novas vacinas devem ser
testadas com métodos padronizados rigorosamente, em países em desenvolvimento ou
desenvolvidos, visando identificar os fatores que possam vir a comprometer a efetividade
das vacinas e o impacto da vacinação na população (BRICKS, 2005).
Diversas doenças parasitárias e infecciosas tem no meio ambiente uma fase de seu
ciclo de transmissão, como por exemplo, uma doença com o rotavírus, é de veiculação
hídrica com transmissão oral-fecal. A implantação de um sistema de saneamento, nesse
caso, significaria interferir no meio ambiente, de maneira a interromper o ciclo de
transmissão dessa doença (CASTRO et al., 2001).
24
A Organização Mundial da Saúde (OMS) define saneamento como controle de todos
os fatores do meio físico do homem, que exercem ou podem exercer efeito deletério sobre
seu bem estar físico, mental e social. Portanto, é evidente que pela sua própria definição o
saneamento é indissociável do conceito de saúde (CASTRO et al., 2001).
O controle da transmissão das doenças, além da intervenção em saneamento e dos
cuidados médicos, completa-se quando é promovida a educação sanitária, adotando hábitos
de higiene com a utilização e manutenção adequadas das instalações sanitárias e melhoria
da higiene pessoal, doméstica e também dos alimentos (CASTRO et al., 2001).
3.3
Métodos imunoenzimáticos de identificação do rotavírus
O enzimaimunoensaio é um método quantitativo em que a reação antígeno-anticorpo
é monitorada por medida da atividade enzimática. Além da sensibilidade elevada, poder ser
adaptado a estes testes simples e também a automação sofisticada (FERREIRA; ÁVILA,
2001).
O enzimaimunoensaio é classificado em dois tipos: homogêneo e heterogêneo. Nos
ensaios homogêneos, o complexo antígeno-anticorpo não precisam ser separados, pois a
interação antígeno-anticorpo modula a atividade enzimática. Já nos ensaios heterogêneos,
é necessário que a separação seja feita, pois a atividade enzimática não é alterada pela
reação antígeno-anticorpo (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
Para ser utilizada em imunoensaio, a enzima deve ter os seguintes requisitos: alta
atividade específica e o produto da reação enzimática deve ser estável, de fácil
quantificação e ter um alto coeficiente de extinção molar para facilitar a detecção de
pequenas quantidades de enzima; ela tem que ser estável; ser facilmente obtida em forma
purificada; ser facilmente conjugada a vários antígenos, anticorpos e haptenos, sem perda
de sua atividade; ter um preço acessível (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
25
3.3.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
O termo ELISA foi utilizado pela primeira vez por Engvall e Perlmann, em 1971, e
identifica um ensaio heterogêneo, diferente dos métodos enzimáticos até então utilizados,
que envolviam colorações imuno-histoquímicas pela técnica de imunoperoxidase. O seu
princípio básico é a imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida, enquanto outro
reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática
como da imunológica do anticorpo (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
A fase sólida pode ser constituída por partículas de agarose, poliacrilamida, dextran,
poliestireno, etc. As placas plásticas são mais difundidas, porque permitem a realização de
múltiplos ensaios e automação (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, a
precisão pode ser elevada se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem
padronizados. Uma atenção especial deve ser dada à fase sólida, cujas propriedades
variam de acordo com a composição. O grau de pureza do antígeno ou do anticorpo na fase
sólida é muito importante, pois qualquer material heterólogo competirá pelo espaço na
placa. Para a pesquisa de antígeno, o anticorpo deve estar livre de impurezas, podendo-se
utilizar antígenos purificados por cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais,
peptídeos sintéticos ou peptídeos obtidos a partir da tecnologia recombinante (FERREIRA;
ÁVILA, 2001).
Pelas características de alta sensibilidade e especificidade, bem como de rapidez,
baixo custo, simplicidade técnica, versatilidade, objetividade de leitura e possibilidade de
adaptação a diferentes graus de automação, o teste ELISA é empregado na detecção de
antígenos ou anticorpos, em um número muito grande de sistemas. O teste ELISA substituiu
o radioimunoensaio em vários laboratórios, pois além de possuir sensibilidade comparável,
não apresenta problemas decorrentes da utilização de radioisótopos, também está
26
substituindo outras técnicas como a imunofluorescência, a aglutinação, etc (FERREIRA;
ÁVILA, 2001).
3.3.1.1 Ensaio para anticorpo – método indireto (sorologia)
O método indireto tem sido amplamente utilizado para a pesquisa de anticorpos,
apresentando como vantagens a possibilidade de utilizar um único conjugado, em diferentes
sistemas, e conjugados classe-específicos, para a determinação de anticorpos de diferentes
classes (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
No método básico, placas de plástico são sensibilizadas com o antígeno que, depois
de um bloqueio, reage com os anticorpos da amostra. O conjugado antiimunoglobulina
humana reage com o anticorpo capturado pelo antígeno e a reação é revelada com uma
solução cromogênica. A reação é interrompida e a intensidade da cor é estimada a olho nu
ou fotometricamente. O grau de degradação do substrato, geralmente indicado pela
intensidade de cor da solução, é proporcional a concentração do anticorpo presente na
amostra (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
3.3.1.2 Ensaio para antígeno – método de captura
O método de captura com excesso de anticorpo marcado é o utilizado para
antígenos polivalentes. A fase sólida é sensibilizada com anticorpo específico. A amostra em
teste, onde vai ser pesquisado o antígeno, é incubada a fase sólida e incuba-se a seguir, o
excesso de anticorpo específico conjugado a enzima. A reação é revelada pela adição do
substrato, a taxa de degradação é proporcional a concentração do antígeno (FERREIRA;
ÁVILA, 2001).
27
3.3.2 Western blotting – eletroforese
Esse método se baseia em que as proteínas são separadas, de acordo com o
tamanho, pela eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio
(SDS-PAGE), após a separação, são transferidas eletroforeticamente do gel para uma
membrana de nitrocelulose, ou outra equivalente, onde ficam imobilizadas, como se fossem
uma réplica do padrão de bandas do gel. Após a membrana ser bloqueada, é feita a
identificação imunológica das frações separadas e transferidas imergindo as tiras de
nitrocelulose em solução contendo anticorpos específicos para as frações. Assim os
anticorpos se ligam aos antígenos imobilizados e são levados colocando-se a membrana em
solução contendo antiimunoglobulina marcada com a enzima. Para visualizar, adiciona-se o
cromógeno que, pela ação da enzima dá origem a um precipitado colorido (FERREIRA;
ÁVILA, 2001).
‘
Uma das etapas mais importante para a obtenção de resultados satisfatórios é o
preparo da amostra submetida a SDS-PAGE. Esse preparo tem por objetivo a solubilização
das proteínas da amostra. O processo em que as proteínas são solubilizadas envolve um
grau de desnaturação, embora muito complexo generalizar um método geral, a uréia pode
ser empregada, assim como detergentes não- iônicos (Triton X-100, Nonidet P-40),
detergentes aniônicos (SDS, desoxicolato de sódio) ou também agentes redutores de
pontes dissulfeto (β-mercaptoetanol, ditiotreitol). Para serem empregados esses agentes ou
combinações, depende das propriedades físicas e químicas das proteínas em estudo e
também dos objetivos da pesquisa (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
O SDS utilizado no Western blotting é um detergente aniônico, se liga as regiões das
proteínas que são hidrofóbicas em quantidades proporcionais ao seu peso molecular,
concedendo-lhes carga negativa, fazendo com que elas migrem para o pólo positivo, sendo
separadas com uma facilidade maior por eletroforese. Ele também provoca a quebra das
pontes dissulfeto, favorecendo o dobramento das subunidades em forma de hastes semi-
28
rígidas, do qual o tamanho é diretamente proporcional ao seu peso molecular. Assim, é
função da sua massa e depende do tamanho dos poros do gel a migração dessas proteínas,
onde essa migração é proporcional a concentração de acrilamida-poliacrilamida, sendo que
as proteínas mais pequenas migram mais rapidamente (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
O Western blotting combina a seletividade da eletroforese em gel com a
especificidade do imunensaio, permitindo que proteínas individuais, mesmo em misturas
complexas possam ser detectadas e analisadas. É um método qualitativo, sendo que o
aparecimento de uma banda em um blot indica a presença de um antígeno na mistura que
foi submetida a eletroforese ou de um anticorpo na amostra ensaiada na membrana
(FERREIRA; ÁVILA, 2001).
Existem vários sistemas de detecção que podem ser utilizados, os que são mais
empregados são os conjugados enzimáticos e nestes, as enzimas mais utilizadas são
peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactosidase e glicose oxidase (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
Com os conjugados enzimáticos, a avidina-biotina, também pode ser empregada
como sistema de amplificação. Além de substratos que darão produtos coloridos, podem ser
utilizados outros sistemas de detecção com substratos fluorescentes ou luminescentes, que
permita que as bandas sejam quantificadas (FERREIRA; ÁVILA, 2001).
O Western blotting pode ser utilizado na pesquisa tanto de anticorpos como de
antígenos, sendo um importante auxiliar no diagnóstico de doenças infecciosas. Com esse
método, pode-se determinar se há um anticorpo ou um antígeno em uma amostra, e
também saber qual é a sua especificidade, se o preparado é puro ou não, identificar quais
as proteínas estão sendo reconhecidas por um anticorpo, distinguir diferentes perfis de
anticorpos de acordo com a fase da doença ou infecção ou de acordo com a presença ou
ausência de infecção, ainda diferenciar entre cepas não-patogênicas e patogênicas, e etc.
(FERREIRA; ÁVILA, 2001).
A eficiência da transferência é dependente do tamanho da proteína, da corrente
elétrica utilizada, da membrana, da porcentagem de acrilamida no gel, o pH do tampão,
29
presença de metanol ou SDS no tampão. Se for empregado o tampão com pH acima do
ponto isoelétrico da maior parte das proteínas, elas terão carga negativa e migrarão para o
pólo positivo independentemente da presença de SDS onde a membrana está colocada
(FERREIRA; ÁVILA, 2001).
30
4
PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS
Foram analisadas as amostras coletadas pelo Laboratório Municipal de Análises
Clínicas e Ambientais de Chapecó – SC e encaminhadas para o Lacen (Laboratório Central
de Saúde) em Florianópolis - SC, que em seguida eram encaminhados para o Instituto
Adolfo Lutz – SP para a identificação da cepa infectante. Os laudos foram arquivados na
vigilância sanitária, sendo eles positivas ou negativas desde o ano de 2005 até o ano de
2009. Nestes laudos foram observadas as informações referentes a idade, os resultados,
independente de negativo ou positivo e os métodos utilizados nas analises.
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Unochapecó e pelo
Secretário Municipal de Saúde do Município de Chapecó, Nemésio Carlos da Silva,
autorizando a coleta dos dados no banco de dados da Vigilância Epidemiológica de
Chapecó - SC. Em anexo segue o termo de consentimento livre e esclarecido com a
assinatura do gestor, autorizando a pesquisa.
31
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram avaliados os resultados disponíveis no período de 2005 a 2009 arquivados no
banco de dados da vigilância epidemiológica do município de Chapecó – SC
correspondentes a incidência de diarréia causada por rotavírus, bem como idade, sexo e os
respectivos métodos utilizados na análise.
Os dados são arquivados na vigilância epidemiológica, onde os resultados chegam
em primeira mão e uma via, é posteriormente encaminhada para o laboratório municipal,
tornando o acesso aos resultados com maior eficiência.
A pesquisa foi realizada a partir de suspeita clinica nos pacientes, dependendo da
avaliação dos sintomas para a realização do exame de identificação do rotavírus. Nesses
casos, a sintomatologia era identificada pelo médico consultado, e se o mesmo achasse
necessário era realizado o exame para confirmação. Geralmente os critérios para a
realização do exame são; doença diarréica aguda, febre, vômito de origem desconhecida
que perdurem há pelos menos dois dias sem melhora. Esses critérios são estabelecidos
pelos próprios médicos de acordo com o quadro clinico do paciente.
Nem todos os pacientes que estavam com os sintomas realizavam o exame, pois,
devido à demora para liberação dos resultados, e de acordo com a suspeita do quadro
diarréico, os pacientes já eram tratados evitando assim a evolução do caso.
Os exames realizados nesse período foram um total de 137, sendo que 13 obtiveram
resultados positivos e 124 obtiveram resultados negativos.
No ano de 2005 foram encontrados 36 casos suspeitos de rotavírus, 15 do sexo
masculino e 21 do sexo feminino. Desses 36, 10 obtiveram resultados positivos para o
antígeno de rotavírus, correspondendo a 27,78% do total de casos, sendo que desses 10
resultados positivos 7 eram do sexo masculino, e 3 do sexo feminino, o restante de 26 casos
obtiveram resultados negativos, correspondentes a 72,22% do total, conforme os gráficos 1
e 2 a seguir:
32
Gráfico 1 – Prevalência do rotavírus por gênero no ano de 2005
Gráfico 2 – Prevalência do rotavírus no ano de 2005
Em relação aos dados correspondentes à faixa etária, foram encontrados 7 casos
abaixo de 1 ano de vida, destes 7 casos, 5 obtiveram resultados positivos para o antígeno
de rotavírus enquanto que somente 2 resultaram em negativo. Já na faixa etária de 1 ano
até os 5 anos de idade, os casos saltaram para 19, sendo que apenas 3 foram positivos e o
33
restante foram negativos. Outras idades como de 6 a 10 anos também foram avaliadas,
nessa faixa de idade foram encontrados 6 casos, destes apenas 2 obtiveram positividade.
Também ocorreram casos em adultos de 20, 23, 37 e 58 anos ambos do sexo feminino, e
destes todos obtiveram resultado negativo, conforme gráfico 3.
Gráfico 3 – Prevalência do rotavírus no ano de 2005 por faixa etária
Neste estudo, foram encontrados resultados positivos em crianças até os 10 anos de
idade, sendo que sua maior ocorrência foi até um ano de vida. Isso ocorre devido a algumas
crianças com mais de um ano de vida, já tenham sido infectadas pelo rotavírus de forma
assintomática, com isso diminuindo sua infecção e ganhando imunidade, ou seja, proteção a
infecções por rotavírus (COSTA et al., 2004).
Para melhor compreensão, a imunidade frente aos diferentes genótipos do rotavírus
é demonstrada pelo fato de que tanto na infecção pelo vírus selvagem, aquele adquirido
através da contaminação, ou pela infecção ocorrida pelo vírus vacinal, adquirido através da
vacinação, induzem a uma resposta imune protegendo o indivíduo contra as outras formas
graves da doença em sucessivas infecções (COSTA; CARDOSO; GRISI, 2005).
A amamentação tem desencadeado uma proteção eficaz contra as infecções
causadas por rotavírus que normalmente parecem durar somente enquanto o aleitamento
materno é praticado. Por isso a importância da amamentação no primeiro ano de vida da
34
criança, podendo levar ao deslocamento da faixa etária de maior incidência do primeiro para
o segundo ano de idade, em crianças amamentadas exclusivamente no seio materno
(COSTA; CARDOSO; GRISI, 2005).
O método mais utilizado foi o imunoenzimático (ELISA) de captura para detecção de
antígeno de rotavírus, que representou cerca de 55,56% de todos os exames realizados, e o
de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) realizou em torno de 44,44% exames para
detecção do rotavírus. Em relação à positividade dos métodos, o imunoenzimático (ELISA)
de captura para detecção de antígeno de rotavírus representou 40% do total dos resultados
positivos, e o método de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) representou 60%, ou
seja, correspondeu a uma maior positividade dos resultados.
O Western blotting ou eletroforese em gel de poliacrilamida apresentou uma maior
positividade, porque sua metodologia se baseia na pesquisa dos anticorpos, e o método
ELISA tem como objetivo a pesquisa pelo antígeno, sendo que este nem sempre pode ser
detectado na amostra.
No ano de 2006, foram encontrados 24 casos suspeitos de contaminação por
rotavírus, destes apenas 3 obtiveram resultado positivo, 2 do sexo feminino e 1 do sexo
masculino, correspondendo a 12,5% do total, e 21 foram negativos, correspondentes a
87,5% do total, conforme exposto no gráfico número 4 e 5.
35
Gráfico 4- Prevalência do rotavírus por gênero no ano de 2006
Gráfico 5 – Prevalência do rotavírus no ano de 2006
Relacionando os casos com as idades, apenas 2 crianças de 1 ano de idade
estavam infectadas, e um adulto de 18 anos. O restante dos 21 casos não obtiveram
resultados positivos em nenhuma faixa de idade, até mesmo as crianças com menos de 1
ano de vida, que no ano de 2005 foram as mais infectadas.
36
Gráfico 6 – Prevalência do rotavírus por faixa etária no ano de 2006
Neste ano de 2006, foi utilizado o método imunoenzimático (ELISA) de captura para
detecção de antígeno de rotavírus e sorologia para rotavírus (ELISA). O método mais
utilizado foi o método imunoenzimático (ELISA) de captura para detecção de antígeno de
rotavírus que correspondeu a 75% das análises obtendo positividade em 1 dos casos, e o
método de sorologia para rotavírus (ELISA) que correspondeu a 25%, e obteve positividade
em 2 casos.
Se forem comparados os testes utilizados nesse trabalho, percebe-se que a
eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA-PAGE), ou Western blotting, tem uma
especificidade e uma seletividade maior do que os outros diferentes métodos ELISA, pois,
ele utiliza combinadamente a seletividade presente na eletroforese em gel, com a
especificidade do ensaio imunológico.
Nos anos de 2007 a 2009, foram analisados 77 casos suspeitos de diarréia por
rotavírus, destes exames realizados todos obtiveram resultados negativos para pesquisa de
rotavírus.
Esses resultados devem-se ao fato de que as crianças começaram a ser vacinadas
no ano de 2006. Com essa imunização houve uma diminuição expressiva nos casos
37
positivos para rotavírus, diminuindo bruscamente os quadros graves de infecções intestinais
e internamentos de acordo com a vigilância epidemiológica do município de Chapecó.
O rotavirus a partir do ano de 2009 tornou-se uma das doenças de notificação
compulsória obrigatória, pois é uma doença de alta transmissibilidade e de fácil propensão a
surtos, naquelas faixas etárias que não foram beneficiadas com a vacina.
As vacinações contra rotavírus fazem parte do calendário de vacinações de acordo
com o Ministério da Saúde desde o ano de 2006. A faixa etária beneficiada é de zero a
quatro meses de idade, não podendo exceder esta faixa, e também por não ter estudos
suficientes após esta idade, avaliando seu risco x benefício. As crianças que não foram
vacinadas até estas idades estarão consequentemente fora do calendário de vacinação e
não poderão mais fazer a vacina.
38
6 CONCLUSÃO
As crianças que foram mais acometidas tinham idades de zero a um ano, obtendo uma
maior positividade das amostras, pois era nessa faixa etária que ocorriam os casos mais graves.
Os testes eram feitos de acordo com a gravidade que o paciente apresentava, sendo
realizado somente para fins epidemiológicos, pois devido à demora e custo muito alto para a
obtenção dos resultados, os mesmos eram tratados para evitar maiores complicações ou a
evolução do quadro clínico.
O método mais utilizado para identificação do rotavírus foi o Western blotting,
obtendo também uma maior positividade das amostras. Isso deve-se ao fato de que esse
teste se baseia na pesquisa de anticorpos, facilitando a identificação, pois o antígeno nem
sempre está presente na amostra.
Por fim, fica clara a necessidade de implantação de um método que seja mais
acessível, tendo um menor custo, de diagnóstico rápido, e que tenha uma boa margem de
especificidade e seletividade, para que todos os laboratórios possam realizar a identificação
do rotavírus e não somente os laboratórios de grande porte.
39
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8 ANEXO