espectrometria de massas

INTRODUÇÃO A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS
• Espectrometria de massas: técnica que separa e
mede, em fase gasosa, a relação m/z (massa/carga)
de íons produzidos por algum método de ionização.
• Qual o princípio da separação de íons de acordo com
a relação m/z? Diferenças nas trajetórias, em alto
vácuo, sob a influência de campos elétricos e/ou
magnéticos.
• Um espectro de massas registra a abundancia
relativa de íons em função de m/z.
Aplicações e características da EM
• Algumas aplicações da EM:
(a) determinação de massa molecular com elevada
exatidão, inclusive de biomoléculas e materiais
poliméricos;
(b) identificação de substancias, mesmo em misturas
complexas;
(c) informação estrutural: conectividade dos átomos
numa molécula; informações termoquímicas;
(d) análise e padrões isotópicos.
• Algumas características importantes da EM: (i) técnica
qualitativa e quantitativa, capaz de analisar misturas
complexas; (ii) alta sensibilidade; (iii) universal e
específica; (iv) técnica rápida.
Uma breve retrospectiva histórica
• A tradição: Espectrometria de massas é uma
técnica analítica que separa e mede a relação
m/z de íons produzidos em fase gasosa pela
ionização de uma substancia química.
• Década de 60:
a) Instrumentação temperamental e não muito
utilizada como ferramenta analítica;
b) A contribuição de Carl Djerassi para a
popularização da espectrometria de massas de
substancias orgânicas. (Ver JACS e Budzikiewicz.
Djerassi e Williams “Mass Spectrometry of Organic
Compounds”, Holden-Day, 1967)
A espectrometria de massas e o
reconhecimento através de Prêmios Nobel
J. J. Thomson (1906, F)
H. G. Dehmelt (1989, F)
F. W. Aston (1922, Q)
J . Fenn (2002, Q)
W. Paul (1989, F)
K. Tanaka (2002, Q)
Uma seleção mundial de famosos da EM
K. Biemann
C. Fenselau
A. Marshall
B. Chait
G.
Cooks
F. Hillenkamp
D. Hunt
F. McLafferty
A. Nier
M. Dole
M. Karas
C. Robinson
Massa em química
2.) Massa de uma espécie isotópica específica, p. ex.
1
H 1,00783 Da
2
H 2,01210 Da
3.) Massa atômica média de um elemento químico,
Xi = fração de abundância relativa natural do isótopo
Mi
Xi
Mi
Xi
70
74
Ge 69,924250 0,2084
Ge 73,921178 0,3628
72
76
Ge 71,922076 0,2754
Ge 75,921403 0,0761
73
Ge 72,923459 0,0773
M(Ge) = 72,64
• Thomson: unidade de m/z (Dalton/carga do elétron)
• Massa média (ou química) = massa calculada usando uma média
ponderada sobre a abundancia isotópica.
• Massa nominal = massa calculada usando como número inteiro a
massa do isótopo principal, p.ex. CH4 = 16 u.
• Massa exata = massa calculada usando o valor da massa do
isótopo principal, p.ex. 12C1H379Br = 93,941011 u.
• m/z = grandeza abstrata sem unidades, ou em unidades de Th.
• Espectro de massas = registro de abundância iônica em função de
m/z.
• Pico base  sinal do íon mais abundante.
• Pico isotópico  sinal devido a outros isótopos da mesma
composição química.
• Abundancia relativa = abundancia normalizada com relação ao
pico base.
• Intensidade relativa = razão entre a intensidade do pico e o pico
base.
• Intensidade percentual = (Ii/ Ij).
Diagrama de um espectrômetro de massas
High Vacuum System
Inlet
Ion
source
Mass
Analyzer
Detector
Data
System
Diagrama de um espectrômetro de massas
Sistema de alto vácuo
Inlet
Ion
source
Mass
Analyzer
Bombas
turbomoleculares
Detector
Data
System
Introdução da amostra
High Vacuum System
Entrada
HPLC ou GC
Injeção por fluxo
Placa de amostra
Introdução direta
Ion
Source
Mass
Analyzer
Detector
Data
System
Fonte de íons
High Vacuum System
Inlet
Fonte
de íons
MALDI
ESI
APCI
EI
CI
Mass
Analyzer
Detector
Data
System
Analisador de Massa
High Vacuum System
Inlet
Ion
source
m/z
Tempo de vôo (TOF)
Quadrupolo
Armadilha de íons
Setor magnético
FTMS
Orbitrap
Detector
Data
System
Espectrômetro de massas em resumo
Ionization
Mass Sorting (filtering)
Ion
Source
Detection
Ion
Detector
Mass Analyzer
Form ions
(charged molecules)
Sort Ions by Mass (m/z)
Detect ions
100
75
Inlet
•
•
•
Solid
Liquid
Vapor
50
25
0
1330
1340
1350
Mass Spectrum
Escolha do método de ionização
Aspectos a serem considerados
•
•
•
•
•
Volatilidade da substancia.
Polarizabilidade.
Amostra pura ou mistura (gás, líquido ou sólido).
Grau de fragmentação desejado.
Sensibilidade.
Fontes principais
•
•
•
•
•
•
Ionização por elétrons (EI) ou por ionização química (CI)
Ionização por campo (FI)/ Dessorção (FD).
Ionização por íons secundários (SIMS).
FAB (fast atom bombardment).
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorpiton Ionization)
Ionização a pressão atmosférica
Electrospray (ESI)
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
Outros métodos recentes (DART, DESI,...)
Ionização por elétrons de um hidrocarboneto: energia do elétron é suficiente
para causar ionização da molécula e promover a fragmentação de M+
(M-29)+
M+
Ionização por elétrons de outro isômero C7H16: fragmentação extensa de
M+ auxiliada pela estabilidade dos fragmentos iônicos produzidos
(M-43)+
(M-15)+
Espectros de massas
por ionização por
elétrons de sistemas
inorgânicos com
padrões isotópicos
característicos:
a) caso do S8 (32S e 34S);
b) complexo de Cr (50Cr,
52Cr, 53Cr, 54Cr)
Energia eletrônica e espectrometria de massas:
Eficiência de ionização a várias energias
Espectros de massas de uma -lactama a duas energias eletrônicas
diferentes: maior fragmentação a 70 eV
Termoquímica associada a ionização por elétrons
Energia de ionização (IE)
Energia de aparecimento (AE)
Ionização química
•
Ionização produzida por uma reação química provocada por um gás
ionizado.
•
Gás reagente, p.ex. CH4
CH4+ + CH4  CH5+ + CH3
•
CH5+ é um ácido de Brønsted muito forte em fase gasosa: ionização suave
com formação de MH+ e fragmentos eventuais
M + CH5+  MH+ + CH4
•
Outros reagentes: isobutano, C4H10, NH3
C4H10 + e-  C4H9+ + H + 2 eNH3+ + NH3  NH4+ + NH2
•
Transferência de próton depende da afinidade protônica relativa entre o
substrato neutro e a base conjugada do ácido
M + H+  MH+
AP (M) = - Ho
AP (CH4) = 543,5 kJ mol-1
AP (C4H8, isobuteno ou Me2C=CH2) = 802,1 kJ mol-1
AP (NH3) = 853,6 kJ mol-1
Espectros de massa por ionização química
Íons reagentes no metano: CH5+ (m/z 17),
C2H5+ (m/z 29), C3H5+ (m/z 41)
Íons reagentes no isobutano:
(CH3)3C+ (m/z 57), C3H7+ (m/z
43)
Comparação de
espectros de massa
obtidos por ionização
eletrônica e por ionização
química (método suave
de ionização)
Comparação de espectros de
massa obtidos por ionização
eletrônica e por ionização
química (método suave de
ionização)
MALDI
• Analito dissolvido
junto com uma
substancia orgânica,
“matriz”, que possui
absorção intensa no
 do laser.
• Dessorção da
solução sólida por
um laser pulsado (ns)
de alta intensidade;
• Espectro resultante
inclui íons (M+H)+, e
outros com prótons
adicionais, retirados
da matriz.
Espectro de um anticorpo monoclonal
Relative Abundance
MALDI TOF spectrum of IgG
MH+
40000
30000
(M+2H)2+
20000
10000
(M+3H)3+
0
50000
100000
Mass (m/z)
150000
200000
Espectro (MALDI) de poli-metil metacrilato
<M> = 7100 Da
Polysulfated-Derived
Oligosaccharides
Positive-ion (a) and negativeion (b) MALDI mass spectra
of CS-D tetra with pmg.