PRODUÇÃO DE ENZIMAS EXTRACELULARES POR Ceriporiopsis

PRODUÇÃO DE ENZIMAS EXTRACELULARES POR Ceriporiopsis subvermispora
DURANTE CULTIVO SUBMERSO
1
Jessica Rubira Gamba, 2 Robson de Almeida Faria, 3 Débora Barbeta Grinet, 4 Walter de Carvalho
1
Bolsista de Iniciação Científica PIBIC/CNPq; Discente do curso de Engenharia Bioquímica
Bolsista de Mestrado Fapesp; Discente do curso de Biotecnologia Industrial
Bolsista de Iniciação Científica Fapesp; Discente do curso de Engenharia Bioquímica
4
Professor
2
3
1,2,3,4
Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, Departamento de Biotecnologia. Estrada
Municipal do Campinho s/n, Lorena - SP, CEP 12602-810
e-mail: [email protected]
RESUMO - Atualmente, a biodegradação da madeira com fungos ligninolíticos tem sido
estudada com vistas à aplicação na biopolpação, processo no qual a madeira é biotratada com
um fungo anteriormente à polpação. Para este fim, os fungos de decomposição branca são os
mais adequados. Dentre eles, destaca-se o basidiomiceto Ceriporiopsis subvermispora, o qual
produz duas enzimas extracelulares relacionadas com a degradação da lignina, manganês
peroxidase (MnP) e lacase (Lac). Este estudo teve como objetivo avaliar a cinética da produção
dessas enzimas em cultivo submerso do fungo em meio de composição definida. A máxima
o
produção de MnP (0,19 ± 0,03 UI/mL) ocorreu no 18 dia de cultivo, momento no qual já havia
ocorrido um grande consumo de açúcares redutores e o fungo já exibia atenuação na
o
velocidade de crescimento. A maior atividade de Lac, 0,07 ± 0,01 UI/mL, foi detectada no 6 dia
de cultivo. Durante a fermentação, não se detectou variações elevadas no pH e na
condutividade elétrica do meio.
Palavras-Chave: Ceriporiopsis subvermispora, manganês peroxidase, lacase.
INTRODUÇÃO
Fungos de decomposição da madeira têm
um importante papel no ciclo global de carbono.
Os principais tipos são os que realizam decomposição branda (soft-rot fungi), parda (brown-rot
fungi) e branca (white-rot fungi), sendo os últimos
os mais adequados para biopolpação e outras
aplicações industriais como biorremediação e biobranqueamento.
Entre os fungos de decomposição branca,
existem aqueles que promovem a degradação
simultânea de todos os componentes da madeira
e aqueles que causam a degradação seletiva da
lignina. Dentre estes últimos destaca-se o basidiomiceto Ceriporiopsis subvermispora, que vem
sendo considerado para degradar a lignina, sendo
altamente seletivo para este fim (Ferraz et al.
2003). Tal seletividade se deve a sua ineficiência
em degradar a celulose da madeira. Estima-se
que essa degradação limitada pode estar envolvida com a inibição da redução de Fe3+, o que previne a degradação de polissacarídeos nas reações de Fenton, e à falta da atividade de celobiohidrolases no seu sistema celulolítico (Aguiar et
al. 2008).
Estudos recentes mostraram que C. subvermispora produz duas enzimas extracelulares
associadas à despolimerização da lignina, lacase
e manganês peroxidase, enquanto que uma ter-
ceira enzima associada a esta mesma função,
lignina peroxidase, não foi detectada (Souza-Ctuz
et al. 2004).
A lacase (EC 1.10.3.2) é uma enzima que
catalisa a remoção de elétrons de grupos hidróxifenólicos e aminoaromáticos, formando radicais
fenoxila e amino, respectivamente (Giese et al.
2004). A manganês peroxidase (EC 1.11.1.13)
também apresenta potencial redox suficiente para
abstrair elétrons somente de estruturas fenólicas,
embora na presença de mediadores apropriados
sua ação também possa ser estendida também
para estruturas não fenólicas (Bao et al., 1994;
Kirk e Cullen 1998). Ambas enzimas têm potencial para aplicação na polpação e na indústria de
papel.
O presente trabalho teve como objetivo estudar a produção de enzimas extracelulares oxidativas por C. subvermispora em meio definido
submetido à agitação constante.
MATERIAIS E MÉTODOS
Microrganismo e preparo do inoculo
Ceriporiopsis subvermispora, cepa SS3,
gentilmente cedido pelo Prof. M. Akhtar da
empresa Biopulping International, Madison-WI,
USA, foi mantido em placas de Petri com meio
contendo 2% de extrato de malte e 2% de agar a
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o
27 C durante 7 dias. A partir destas placas,
mantidas em refrigerador, foi obtido o micélio para
produção do inóculo.
O fungo foi repicado em Erlenmeyer de 2 L
contendo 200 mL de meio líquido composto por
2,4% (p/v) de extrato de batata/dextrose e 0,7%
(p/v) de extrato de levedura. O meio foi
esterilizado a 121ºC/15 min e após resfriamento
foi inoculado com 20 discos de 8 mm de diâmetro
provenientes das placas de Petri recém
cultivadas. Após 12 dias de incubação estática a
27 ºC, o micélio crescido em meio líquido foi
filtrado, lavado com 300 mL de água esterilizada e
macerado em 100 mL de água também
esterilizada usando um liquidificador de alumínio
para a maceração. Da suspensão obtida, foi
retirada uma alíquota de 20 mL que foi filtrada em
papel de filtro previamente seco e pesado em
pesa-filtro. O micélio retido mais o papel de filtro
mais o pesa-filtro foram, então, secos a 105 ºC
até massa constante para a determinação da
quantidade de micélio (base seca) contido na
suspensão recém preparada. Com base nessa
determinação, foi definido o volume de suspensão
necessário para proporcionar uma concentração
de 500 mg de micélio por L de meio em cada
frasco de cultivo.
Preparo do meio de cultivo
O meio de cultivo (pH 4,5) foi constituído,
por litro de solução, por: 10 g de glicose, 10,0 mM
de tartarato de amônio, 10 mM de ácido
transaconítico, 2,0 g KH2PO4, 0,5 g de MgSO4 X 7
H2O, 0,1 g de CaCl2 X 2H2O, 1,0 mg de tiamina
HCl e 1,0 mL de solução de elementos traço. Esta
última foi constituída, por litro, por: 15 g de ácido
nitriloacético, 1,0 g de FeSO4 X 7H2O, 1,8 g de
CoCl X 6H2O, 1,0 g de ZnCl2 X 7H2O, 0,07 g de
Al2(SO4)3 X 18H2O, 0,1 g de CuSO4 X 5H2O, 0,1 g
de H3BO3, 0,1 g de NaMoO4 X 2H2O, 30 g de
MgSO4 X 7H2O, 10 g de NaCl, 0,82 g de CaCl2 e
5 g de MnSO4 X H2O. As soluções foram
autoclavadas isoladamente a 121 ºC/15min,
previamente à formulação do meio de cultura.
A recuperação do micélio foi realizada por
filtração, onde o conteúdo de cada Erlenmeyer foi
transferido para um funil de inox com filtro de fibra
de vidro (AP40, Millipore) previamente pesado,
acoplado a um Kitasato mantido sob vácuo. O
filtrado foi recolhido e congelado para posteriores
análises (atividade enzimática, teor de açúcares
redutores, pH e condutividade). O conjunto
micélio mais filtro foi recolhido em um pesa-filtro e
então seco a 105 ºC até massa constante para
determinação da concentração de micélio (massa
seca).
Determinação das atividades enzimáticas
A atividade de lacases foi determinada
utilizando-se ABTS [ácido 2,2’-azino-bis(3etilbenzotiazolina-6-sulfônico)] como substrato
(Bourbonnais et al.1998). A reação de oxidação
foi conduzida em 0,3 mL de tampão citrato-fosfato
50 mM e pH 5,0, 0,1 mL de água, 0,5 mL de
extrato enzimático e 0,1 mL de ABTS 1 mM.
Monitorou-se a oxidação do substrato a 420 nm
-1
-1
(ε420nm = 36.000 M cm ). Uma unidade de
atividade enzimática foi considerada como a
quantidade de enzima capaz de catalisar a
formação de 1 µmol de ABTS oxidado por minuto.
A atividade de manganês peroxidases foi
determinada acompanhando-se a oxidação de
vermelho de fenol (ε610nm = 22.000 M-1 cm-1). A
mistura reacional foi constituída por: 1,5 mL de
tampão succinato de sódio 50 mM (pH 3,2), 1,5
mL de lactato de sódio 50 mM, 0,5 mL de
vermelho de fenol 0,1%, 0,5 mL de sulfato de
manganês 1 mM, 0,25 mL de albumina bovina 1,8
%, 0,25 mL de peróxido de hidrogênio 2,0 mM e
0,5 mL de extrato enzimático. Após o início da
reação, frações de 1,0 mL foram retiradas do tubo
contendo a mistura reacional a cada 1 min e
transferidas para tubos de ensaio contendo 65 µL
de hidróxido de sódio 6,5 M, previamente à leitura
da absorbância a 610 nm. Uma unidade de
atividade enzimática foi considerada como a
quantidade de enzima capaz de catalisar a
formação de 1 µmol de vermelho de fenol oxidado
por minuto.
Condição de cultivo
Determinação do teor de açúcares redutores
O cultivo submerso foi conduzido em
frascos Erlenmeyer de 125 mL autoclavados a
121 ºC/15 min. Após resfriados, foram
adicionados 30 mL do meio de cultivo estéril.
Os frascos (duplicatas) foram inoculados
conforme descrito anteriormente, e incubados a
27 ºC e agitados a 180 rpm por um período de 21
dias, com a retirada periódica de amostras (1
frasco = 1 amostra) .
Recuperação do micélio e determinação do
crescimento fúngico
O teor de açúcares redutores nos extratos
foi analisado pelo método do DNS e sua
concentração foi calculada com base em uma
curva de calibração feita com glicose. Em um tubo
de ensaio foram adicionados 0,5 mL de extrato,
1,0 mL de água deionizada e 3,0 mL de DNS.
Para o branco foi utilizado 1,5 mL de água
deionizada e 3,0 mL de DNS. As misturas foram
levadas ao banho-maria a 100 ºC por 5 min. Após
resfriar
a
temperatura
ambiente,
foram
adicionados 20 mL de água deionizada ao tubo e
leu-se a absorbância a 540 nm.
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Medição do pH e da condutividade
Para medir o pH e a condutividade das
amostras, utilizou-se um pHmetro e um
condutivímetro, respectivamente, devidamente
calibrados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nesse trabalho foi avaliada a produção das
enzimas MnP e Lac durante o cultivo submerso,
em meio definido, de C. subvermispora. Foram
analisadas as atividades destas enzimas
juntamente com o crescimento do fungo, o
consumo de glicose, e a variação de pH e
condutividade.
A variação das atividades de MnP e Lac é
apresentada na Figura 1.
Figura 1 – Atividades enzimáticas de Lac e
MnP. As barras de erro são baseadas no
desvio padrão de duplicatas de cultivo.
Em relação à atividade de manganês
peroxidase, nota-se um aumento constante
durante todo o cultivo, ocorrendo uma pequena
queda já no final da fermentação. A maior
atividade, 0,192 ± 0,028 UI/mL, é observada no
18o dia de cultivo, momento no qual já havia
ocorrido um grande consumo de açúcares
redutores e o fungo já exibia atenuação na
velocidade de crescimento (Figura 2). Visto que a
o
partir do 3 dia já é possível registrar atividade de
MnP, que mantém-se durante todo o período,
infere-se que este meio seja propício para
produção da mesma.
Para a atividade de lacase, nota-se um
perfil da expressão enzimática com oscilações ao
longo do período de cultivo. A máxima atividade,
o
0,071 ± 0,006 UI/mL, ocorreu no 6 dia de cultivo,
apresentando picos menores com atividades de
0,062 ± 0,024 UI/mL aos 12 dias e 0,051 ± 0,007
UI/mL aos 18 dias de cultivo.
Verifica-se que, em termos de produção de
Lac e MnP, o cultivo em questão favoreceu a
produção
da
segunda
enzima.
Este
comportamento é semelhante ao encontrado
quando C. subvermispora é cultivado em cavacos
de madeira, onde ocorre maior expressão da
atividade de MnP em relação à atividade de Lac
(Vicentin e Ferraz, 2007). Um estudo realizado
por Couto et al. (2000), onde os autores
cultivaram o fungo P. chrysosporium imobilizado
em espuma de poliuretano em um meio definido
suplementado com Tween 80 (0,05 % v/v),
também levou à expressão de atividade de MnP
durante toda a fermentação já a partir do 4º dia de
cultivo, obtendo-se um valor máximo em torno de
350 U/L. Naquele estudo, entretanto, não foi
encontrada atividade de Lac.
No decorrer do cultivo, os perfis de
consumo de glicose, crescimento de biomassa,
pH e condutividade também foram traçados.
O consumo de açúcares redutores e o
crescimento de micélio são apresentados na
Figura 2.
Figura 2 – Perfil do consumo de açúcares
redutores e do crescimento de micélio durante
a fermentação. Barras de erro baseadas no
desvio padrão de duplicatas de cultivo.
A concentração de biomassa demonstrou
aumento linear até o 9º dia de cultivo, atingindo
um valor de 2,67 ± 0,70 g/L. A partir desse
período é possível notar uma atenuação no
crescimento, com uma concentração final de 3,48
± 0,07 g/L.
Observou-se que a concentração de
açúcares redutores caiu de 6,31 ± 0 g/L no tempo
zero até uma concentração de 2,28 ± 0,05 g/L aos
9 dias de cultivo, período esse em que a
concentração de biomassa aumentou 7,5 vezes.
A partir desse ponto, nota-se um consumo
gradual de açúcares redutores até o final da
fermentação, atingindo de consumo de 93 %.
A variação dos valores de pH e
condutividade dos extratos é exibida na Figura 3.
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Figura 3 – Variação do pH e da condutividade
durante o cultivo. Os valores de desvio são
baseados no desvio padrão da duplicata do
cultivo.
Não se detectaram variações elevadas no
pH durante o cultivo, indicando que o tampão foi
efetivo para o controle desta variável. De fato, em
um estudo prévio sobre mineralização de lignina
sintética por C. subvermispora em meio definido,
comprovou-se que o fungo não metaboliza os
componentes do tampão (Tapia e Vicuña, 1995).
A pequena flutuação nos valores da
condutividade ao longo do cultivo pode ser
justificada pela decomposição de ácidos por MnP,
pela secreção de compostos como oxalato,
malonato e glioxilato pelo fungo, e pela
mineralização de oxalato no meio (Urzúa et al.
1998).
CONCLUSÕES
O estudo demonstra a potencialidade deste
cultivo em particular para a produção de
manganês
peroxidase
pelo
fungo
C.
subvermispora.
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AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Fapesp e ao
CNPq pelo apoio financeiro.
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