An es M IC F- FF U L/ E ls a METODOLOGIAS PARA AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE CELULAR un o lo gi a- Elsa Anes Imunologia Práticas MICF-FFUL An es L/ E ls a Objectivos (métodos) F- FF U • Isolamento de células (Ficoll, esferas magnéticas, FACS) • Quantificação de células (Citometria de fluxo) • Tipagem de células (Citometria de fluxo) un o lo gi a- M IC • Avaliação da estimulação de células (marcadores de superfície, produção de ILs, citocinas, moléculas de adesão: por IF, CF, imunohistocoloração, ELISA, Western-blot) • Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul tripan, Anexina V, MTT) ELSA ANES FFUL un o An es lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a • Isolamento de células (Ficoll, esferas magnéticas, FACS,) ELSA ANES 3 FFUL un o An es lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a • Isolamento de células (Ficoll esferas magnéticas, FACS) ELSA ANES 2014 FFUL un o An es lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a • Isolamento de células (Ficoll esferas magnéticas, FACS) ELSA ANES 2014 FFUL un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es • Isolamento de células (Ficoll esferas magnéticas, FACS) ELSA ANES 5 FFUL FF U L/ E Linf TCD4+ Linf TCD8+ (Linf. TH) (Linf. TC) un o lo gi a- M IC F- Linf B ls a An es Reconhecimento de Antigénios pelos Linfócitos B e T ELSA ANES FFUL An es L/ E ls a Métodos para Detecção e Quantificação de Linfócitos M IC F- FF U • Citometria de Fluxo: baseada em anticorpos monoclonais específicos para cada tipo de marcador celular • Kits específicos para CD3, CD4 e CD8 • Análise espécie-específica un o lo gi a- • Quantitativo total / relativo • CD4/CD8 ELSA ANES FFUL M IC F- FF U An es L/ E ls a METODOLOGIA FSC (Forward Scatter) Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular SSC (Side Scatter) un o lo gi a- Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular ELSA ANES FFUL M IC F- FF U An es L/ E ls a METODOLOGIA FSC (Forward Scatter) Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular SSC (Side Scatter) un o lo gi a- Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular ELSA ANES FFUL An es a- M IC F- FF U L/ E ls a METODOLOGIA un o lo gi CÉLULA ELSA ANES FFUL An es L/ E ls a METODOLOGIA FF U ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) a- M IC F- LASER ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC) un o lo gi CÉLULA ELSA ANES FFUL un o Laser An es lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a METODOLOGIA ELSA ANES FFUL un o Laser An es FF U lo gi a- M IC F- 1)Suspensão de células L/ E ls a METODOLOGIA ELSA ANES FFUL un o Laser An es FF U lo gi a- M IC F- 1)Suspensão de células L/ E ls a METODOLOGIA 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula ELSA ANES FFUL un o Laser An es FF U lo gi a- M IC F- 1)Suspensão de células L/ E ls a METODOLOGIA 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula 3)Dispersão lateral de luz 3)Dispersão de luz para a frente ELSA ANES FFUL FF U 4)Filtro un o Laser lo gi a- M IC F- 1)Suspensão de células L/ E ls a An es METODOLOGIA 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula 3)Dispersão lateral de luz 3)Dispersão de luz para a frente ELSA ANES FFUL FF U 4)Filtro un o Laser lo gi a- M IC F- 1)Suspensão de células L/ E ls a An es METODOLOGIA 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula 5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrónico 3)Dispersão lateral de luz 3)Dispersão de luz para a frente ELSA ANES FFUL FF U 4)Filtro un o Laser lo gi a- M IC F- 1)Suspensão de células L/ E ls a An es METODOLOGIA 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula 6) Análise de dados 5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrónico 3)Dispersão lateral de luz 3)Dispersão de luz para a frente ELSA ANES FFUL An es ls a METODOLOGIA FF U L/ E Anticorpos monoclonais marcados Linfócito TCD8 a- M IC F- Linfócito TCD4 Laser un o lo gi Luz fluorescente Citometria de fluxo Contagem das células ELSA ANES FFUL An es METODOLOGIA lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal) un o Cada ponto significa uma célula identificada pelo citómetro. Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente ELSA ANES FFUL E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente An es METODOLOGIA ls a Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência) L/ E Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3+ (linfócitos Th) lo células CD4- e CD3- gi Neste quadrante estão as a- M IC F- FF U células CD4+ e CD3- Neste quadrante estão as un o (células que não linfócitos) Neste quadrante estão as células CD4- e CD3+ (outros linfócitos que não Th) ELSA ANES FFUL An es un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a Metodologia para quantificação de linfócitos - Citometria Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology ELSA ANES FFUL An es un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a Metodologia para quantificação de linfócitos - Citometria Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology ELSA ANES FFUL An es Metodologia para quantificação de células e nível de infecção - Citometria 10 4 10 3 infected cells b ) 10 4 10 3 non infected cells L/ E ! a ) ls a Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., and Anes, E. 2010. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages.Microscopy: Science, Technology, Applications and Education A. Méndez-Vilas and J. Díaz- Álvarez (Eds.), Pub: Formatex Research Center- Vol 1, pg 614-621, ISNN(13):978-84-614-6189-9 Microscopy Book series. blue MOI 5 green MOI10 red MOI20 % of Max 80 FF U FL1-H SSC-H 95 .3 10 2 100 c ) 10 2 0.94 60 40 10 1 10 1 0 10 0 10 d ) 20 0 40 0 60 0 FSC-H 80 0 10 e ) 10 2 SSC-H 10 3 0 FL1-H 10 1 10 2 FL1-H 10 3 10 4 4 f ) MOI 10 10 10 0 10 4 3 10 2 ** * ** 30 .8 gi 10 2 lo 10 1 0 0 un o SSC-H 10 1 a- 3 93 .5 10 10 0 4 MOI 20 10 0 10 00 M IC 10 F- 20 20 0 40 0 60 0 FSC-H 80 0 10 00 10 1 10 0 10 0 10 1 10 2 SSC-H 10 3 10 4 ELSA ANES FFUL un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es Vias de Transdução do Sinal - Linfócitos T ELSA ANES FFUL un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es Vias de Transdução do Sinal - Linfócitos T ELSA ANES FFUL An es L/ E ls a Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal a- M IC F- FF U • Western Blot – anticorpos específicos para cada molécula participante de cada cadeia de transdução de sinal • Anticorpos específicos para mediadores fosforilados e não fosforilados • Tempo dependentes e dose dependentes un o lo gi • Controles internos e externos importante ELSA ANES FFUL un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal Andrade et al. 2004. The vaccinia virus-stimulated mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is required for virus multiplication. Biochemistry Journal ELSA ANES FFUL An es lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal un o Campos et al. 2004. Impaired production of proinflammatory cytokines and host resistance to acute infection with Trypanosoma cruzi in mice lacking functional myeloid differentiation factor 88. Journal of Immunology. ELSA ANES FFUL An es ls a L-selectinas e adressinas un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E dirigem os linfócitos para os tecidos linfoides ELSA ANES FFUL An es un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a Integrinas são importantes na adesão leucocitária a- gi lo un o F- M IC FF U L/ E ls a An es An es FF U L/ E ls a Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão M IC F- • Imunohistoquímica, Imunofluorescência Indireta – avaliação qualitativa e semi-quantitativa da expressão de moléculas de adesão em diferentes órgãos • Avaliação in vivo, ex-vivo, biópsias, cortes histológicos un o lo gi a- • Citometria de Fluxo – avaliação in vitro, células cultivadas, ex-vivo – marcadores específicos un o lo gi a- M IC Subranamian et al. 2012. Signaling through L-­‐selectin mediates enhanced chemotaxis of lymphocyte subsets to secondary lymphoid tissue chemokine. Journal of Immunology. F- An es FF U L/ E ls a Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão un o lo M IC gi a- Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver. Hepatology. F- An es FF U L/ E ls a Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão un o An es lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver. Hepatology. un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es Métodos para avaliação de estimulação celular ELSA ANES FFUL un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es Métodos para avaliação de estimulação celular ELSA ANES FFUL un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es Métodos para avaliação de estimulação celular ELSA ANES FFUL An es ls a Métodos de doseamento de citocinas un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E • ELISA Sandwich/(ELISPOT: Enzyme-Linked ImmunoSpot) – a partir de sobrenadante de células em cultura após diferentes estímulos – citocinas secretadas após estímulo ou in situ a partir de células secretoras. • Citometria de Fluxo – beads contendo anticorpos específicos contra citocinas • Citometria de Fluxo – citocinas intracitoplasmáticas, contagem do número de células produtoras – efeito celular • Western-blot - quantificação de proteínas num gel e detecção imunológica com anticorpo. • Através de visualização em microscópio (histocoloração, imunofluorescência), conta-se o número de células marcadas. ELSA ANES FFUL An es un o lo gi a- M IC diferenças entre ELISA e ELISPOT F- http://www.elispot.biz/ebz_el01.htm FF U L/ E ls a ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS ELSA ANES FFUL ls a An es Métodos de doseamento de citocinas: ELISPOT FF U FM IC agi un o lo ELISpot overcomes certain limitations of ELISA. Moreover, combining both techniques in one experiment supplies additional information, e.g. it is possible to calculate the mean production of a cytokine by single stimulated cell (e.g. pg per cell). L/ E a modification of a traditional sandwich ELISA immunoassay ELSA ANES FFUL An es M IC F- FF U L/ E ls a Métodos de doseamento de citocinas: ELISPOT vs ELISA a- ELISPOT Detects the Number of cells secreting cytokine of interest (e.g. n/1 million cells) gi ELISA Detects the Concentration of the cytokine of interest produced by all cells in the culture (e.g. pg/1 ml of supernatant) un o lo In many situations, detection of interleukin 2 (IL-2) in cell cultures with ELISA appears impossible, because cultured cells instantly consume the secreted IL-2. In contrast to ELISA, ELISpot is not affected by cytokine consumption, and thus very well suitable for the detection of cells secreting IL-2 ELSA ANES FFUL An es Avaliação da produção de IFN-γ Suspeito a- un o lo gi Sangue + PPD FF U Coleta do sobrenadante F- Controles negativo e positivo Cultura de sangue total M IC sangue 24 h L/ E ls a (por exemplo, em paciente suspeito de infeccão por Mybacterium tuberculosis) ELISA detecção de IFN-γ Leitura de densidade óptica ELSA ANES Avaliação dos resultados FFUL An es T-cell interferon-γ release assays for the diagnosis of M. tuberculosis infection M IC F- FF U L/ E ls a (A) For the ELISA (QuantiFERON-TB Gold in tube), venous blood is incubated in precoated tubes (either coated with ESAT-6, CFP-10 and TB 7.7, or coated with phytohemagglutinin as a positive control, or uncoated as a negative control). Tubes are incubated to allow effector memory cells to release interferon- upon MHCIImediated antigen contact. (B) Following overnight incubation, the tubes are centrifuged and plasma can either be stored up to 8 weeks or interferonconcentration can be analyzed directly by optical density reading at 420 nm wavelength. (C) Results are expressed as IU/ml. (D) For the ELISPOT (T.Spot-TB), 2.5 105 mononuclear cells are isolated from venous blood in microtiter plate wells in the presence of ESAT-6 and CFP-10, or phytohemagglutinin as a positive control, or in the absence of antigen as a negative control. (E) Wells are precoated with a carpet of monoclonal antibodies against interferon- at the bottom. Antigen-reactive T cells in the wells release interferon- upon antigen contact, which is subsequently bound to the antibodies. un o lo gi a- Detection and colour reaction: In the cell culture (ELISpot) plate In the supernatant in a separate ELISA plate Lange C et al. (2007) Rapid immunodiagnosis of tuberculosis in a woman receiving anti-TNF therapy Nat Clin Pract Rheumatol 3: 528–534 doi:10.1038/ncprheum0571 ELSA ANES FFUL An es Métodos de doseamento de citocinas: western-blot e ELISA Mtb infection activates Caspase-1 ls a Increased bacterial burden enhances activation of Caspase-1 and IL-1β un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E IL-1β secretion from Mtb infected macrophages is DEPENDENT on Caspase-1 activation Mishra, B. B., Moura-Alves, P., Sonawane, A., Hacohen, N., Griffiths, G., Moita, L. F. and Anes, E. (2010), Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 is a potent activator of the NLRP3/ASC inflammasome. Cellular Microbiology, 12: 1046–1063. doi: 10.1111/j.1462-5822.2010.01450.x ELSA ANES FFUL An es Métodos de doseamento de citocinas: western-blot e ELISA Mtb infection activates Caspase-1 ls a Increased bacterial burden enhances activation of Caspase-1 and IL-1β un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E IL-1β secretion from Mtb infected macrophages is DEPENDENT on Caspase-1 activation Mishra, B. B., Moura-Alves, P., Sonawane, A., Hacohen, N., Griffiths, G., Moita, L. F. and Anes, E. (2010), Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 is a potent activator of the NLRP3/ASC inflammasome. Cellular Microbiology, 12: 1046–1063. doi: 10.1111/j.1462-5822.2010.01450.x ELSA ANES FFUL An es lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a ELISA SANDWICH PARA DOSEAMENTO DE CITOCINAS un o Lim et al 2009.The Effects of Heat-Killed Wild-Type Lactobacillus casei Shirota on Allergic Immune Responses in an Allergy Mouse Model. International Archives of Allergy and Immunology, ELSA ANES FFUL An es un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a O doseamento de citocinas também pode ser feito por Citometria de fluxo ELSA ANES FFUL M IC F- FF U L/ E citocinas secretadas: beads cobertas com Ac anti-­‐citocina ls a An es O doseamento de citocinas também pode ser feito por Citometria de fluxo un o lo gi a- citocinas intracelulares ELSA ANES 40 FFUL un o An es F- M IC lo gi a- Peripheral-blood mononuclear cells were stimulated with staphylococcal enterotoxin B (for 6 hours) then permeabilized and stained with antibodies specific for various cell-surface markers and intracellular cytokines. In this example, orange clusters consist of CD4+ T cells (arrow 1), whereas green and yellow clusters consist of CD8+ T cells (arrow 2). Cluster analysis can quickly identify CD4+ T cells that express CD45RO and interleukin-2 (IL-2) (arrow 3), together with interferon- (IFN-) (arrow 4). FF U L/ E ls a O doseamento de citocinas intracelulares também pode ser feito por Citometria de fluxo ELSA ANES 41 FFUL An es L/ E O teste cutâneo determina a capacidade de diferentes alergenos produzirem uma reação de pápula e eritema . aspecto de uma reação FF U aspecto de uma reação logo após injeção lo gi a- M IC F- após 5 horas un o • ls a Detecção da Hipersensibilidade Tipo I alergeno diluído de 1:10 até 1:1000 ELSA ANES FFUL An es Teste Radioalergoadsorvente (RAST) ls a Mede o nível sérico de anticorpos IgE específicos contra determinado componente alergénico ao paciente. FF U F- lavagem M IC soro do paciente contendo antialergeno IgE L/ E discos com componente alergénico suspeito un o lo gi a- adição de anti IgE humana marcada lavagem detecção ELSA ANES FFUL TIPO III Os imunocomplexos formados no sangue são depositados no tecido renal, dando aspecto granular. An es IMUNOFLUORESCÊNCIA DE REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE TIPOS II E III un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a TIPO II Os anticorpos se depositam de forma linear sobre a membrana basal glomerular. Os cortes de rim comparam o padrão de imunofluorescência de um paciente com Lupus Eritematoso Sistêmico (predomínio de hipersensibilidade tipo III) ELSA e um paciente com Síndrome de Goodpasture (predomínio de hipersensibilidade tipo II). ANES FFUL ls a Testes cutâneos An es Detecção da Hipersensibilidade Tipo IV L/ E No teste epicutâneo - aplica-se uma baixa dose do antigénio suspeito numa área da pele do paciente . Antigénio a- M IC F- FF U Pode haver desenvolvimento de eczema dentro de 48 a 72 h. un o lo gi EPIDERME DERME GORDURA SUBCUTÂNEA ELSA ANES FFUL ls a Testes cutâneos An es Detecção da Hipersensibilidade Tipo IV L/ E •Teste tuberculínico – o derivado protéico purificado de Mycobacterium tuberculosis, PPD, é injetado por via intradérmica. M IC F- FF U Nesse teste analisa-se o surgimento de vermelhidão e enduração no local da injeção, que podem surgir depois de 24 a 72h em indivíduos pré-sensibilizados. a- EPIDERME un o lo gi DERME GORDURA SUBCUTÂNEA ELSA ANES FFUL An es L/ E ls a APRESENTAÇÃO CLÍNICA E HISTOLÓGICA DO TESTE TUBERCULÍNICO M IC 2. 5 a 10mm: repetir o exame F- 1. nenhuma reação: normal FF U Resposta ao teste: gi a- 3. > 10mm: positivo para tuberculose un o lo 4. Paciente HIV +, >5mm: positivo para tuberculose ELSA ANES FFUL An es M IC F- FF U L/ E ls a • Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul trypan/alamar-blue, Anexina V, MTT) un o lo gi a- azul trypan ELSA ANES 48 FFUL PI: propidium iodide un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es • Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul tripan, Anexina V, MTT) ELSA ANES 49 FFUL PI: propidium iodide un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a An es • Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul tripan, Anexina V, MTT) ELSA ANES 49 FFUL An es un o lo gi a- M IC F- FF U L/ E ls a • Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul tripan, Anexina V, MTT) ELSA ANES 50 FFUL