Imunologia_Prática_ensaios Imunidade celular2015

Propaganda
An
es
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
METODOLOGIAS PARA AVALIAÇÃO
DA RESPOSTA IMUNE CELULAR
un
o
lo
gi
a-
Elsa Anes
Imunologia Práticas
MICF-FFUL
An
es
L/
E
ls
a
Objectivos (métodos)
F-
FF
U
• Isolamento de células (Ficoll, esferas magnéticas, FACS)
• Quantificação de células (Citometria de fluxo)
• Tipagem de células (Citometria de fluxo)
un
o
lo
gi
a-
M
IC
• Avaliação da estimulação de células (marcadores de
superfície, produção de ILs, citocinas, moléculas de
adesão: por IF, CF, imunohistocoloração, ELISA,
Western-blot)
• Ensaios de viabilidade celular e avaliação de
citotoxicidade (azul tripan, Anexina V, MTT)
ELSA ANES
FFUL
un
o
An
es
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
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ls
a
• Isolamento de células (Ficoll,
esferas magnéticas, FACS,)
ELSA ANES
3 FFUL
un
o
An
es
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
• Isolamento de células (Ficoll
esferas magnéticas, FACS)
ELSA ANES
2014
FFUL
un
o
An
es
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
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L/
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ls
a
• Isolamento de células (Ficoll
esferas magnéticas, FACS)
ELSA ANES
2014
FFUL
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
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An
es
• Isolamento de células (Ficoll
esferas magnéticas, FACS)
ELSA ANES
5 FFUL
FF
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Linf TCD4+
Linf TCD8+
(Linf. TH)
(Linf. TC)
un
o
lo
gi
a-
M
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Linf B
ls
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An
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Reconhecimento de Antigénios pelos
Linfócitos B e T
ELSA ANES
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ls
a
Métodos para Detecção e Quantificação de
Linfócitos
M
IC
F-
FF
U
• Citometria de Fluxo: baseada em anticorpos
monoclonais específicos para cada tipo de marcador
celular
• Kits específicos para CD3, CD4 e CD8
• Análise espécie-específica
un
o
lo
gi
a-
• Quantitativo total / relativo
• CD4/CD8
ELSA ANES
FFUL
M
IC
F-
FF
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a
METODOLOGIA
FSC (Forward Scatter)
Detector de dispersão de luz
em ângulo de 90º Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
un
o
lo
gi
a-
Fonte de Luz Incidente: Laser
de Argon a 488 nm
Detector de dispersão de
luz frontal Tamanho celular
ELSA ANES
FFUL
M
IC
F-
FF
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L/
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ls
a
METODOLOGIA
FSC (Forward Scatter)
Detector de dispersão de luz
em ângulo de 90º Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
un
o
lo
gi
a-
Fonte de Luz Incidente: Laser
de Argon a 488 nm
Detector de dispersão de
luz frontal Tamanho celular
ELSA ANES
FFUL
An
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M
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F-
FF
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L/
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METODOLOGIA
un
o
lo
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CÉLULA
ELSA ANES
FFUL
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L/
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METODOLOGIA
FF
U
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
a-
M
IC
F-
LASER
ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
un
o
lo
gi
CÉLULA
ELSA ANES
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Laser
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M
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METODOLOGIA
ELSA ANES
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un
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Laser
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FF
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gi
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M
IC
F-
1)Suspensão de
células
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ls
a
METODOLOGIA
ELSA ANES
FFUL
un
o
Laser
An
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FF
U
lo
gi
a-
M
IC
F-
1)Suspensão de
células
L/
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ls
a
METODOLOGIA
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula
ELSA ANES
FFUL
un
o
Laser
An
es
FF
U
lo
gi
a-
M
IC
F-
1)Suspensão de
células
L/
E
ls
a
METODOLOGIA
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula
3)Dispersão lateral
de luz
3)Dispersão de luz
para a frente
ELSA ANES
FFUL
FF
U
4)Filtro
un
o
Laser
lo
gi
a-
M
IC
F-
1)Suspensão de
células
L/
E
ls
a
An
es
METODOLOGIA
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula
3)Dispersão lateral
de luz
3)Dispersão de luz
para a frente
ELSA ANES
FFUL
FF
U
4)Filtro
un
o
Laser
lo
gi
a-
M
IC
F-
1)Suspensão de
células
L/
E
ls
a
An
es
METODOLOGIA
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula
5)A luz refletida passa
através de filtros e é
detectada por tubos
fotomultiplicadores que
convertem o sinal luminoso
em sinal eletrónico
3)Dispersão lateral
de luz
3)Dispersão de luz
para a frente
ELSA ANES
FFUL
FF
U
4)Filtro
un
o
Laser
lo
gi
a-
M
IC
F-
1)Suspensão de
células
L/
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ls
a
An
es
METODOLOGIA
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula
6) Análise
de dados
5)A luz refletida passa
através de filtros e é
detectada por tubos
fotomultiplicadores que
convertem o sinal luminoso
em sinal eletrónico
3)Dispersão lateral
de luz
3)Dispersão de luz
para a frente
ELSA ANES
FFUL
An
es
ls
a
METODOLOGIA
FF
U
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E
Anticorpos monoclonais marcados
Linfócito TCD8
a-
M
IC
F-
Linfócito TCD4
Laser
un
o
lo
gi
Luz fluorescente
Citometria de fluxo
Contagem das
células
ELSA ANES
FFUL
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METODOLOGIA
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
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L/
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ls
a
Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)
un
o
Cada ponto significa uma célula identificada pelo citómetro.
Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente
ELSA ANES
FFUL
E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente
An
es
METODOLOGIA
ls
a
Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência)
L/
E
Neste quadrante
estão as células CD4+ e CD3+
(linfócitos Th)
lo
células CD4- e CD3-
gi
Neste quadrante estão as a-
M
IC
F-
FF
U
células CD4+ e CD3-
Neste quadrante estão as un
o
(células que não linfócitos)
Neste quadrante estão as
células CD4- e CD3+
(outros linfócitos que não
Th)
ELSA ANES
FFUL
An
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un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
Metodologia para quantificação de linfócitos
- Citometria
Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have
features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology
ELSA ANES
FFUL
An
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un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
Metodologia para quantificação de linfócitos
- Citometria
Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have
features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology
ELSA ANES
FFUL
An
es
Metodologia para quantificação de células e
nível de infecção - Citometria
10
4
10
3
infected cells
b
)
10
4
10
3
non infected cells
L/
E
! a
)
ls
a
Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., and Anes, E. 2010. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in
Macrophages.Microscopy: Science, Technology, Applications and Education A. Méndez-Vilas and J. Díaz- Álvarez (Eds.), Pub: Formatex
Research Center- Vol 1, pg 614-621, ISNN(13):978-84-614-6189-9 Microscopy Book series.
blue MOI 5 green MOI10 red MOI20
% of Max
80
FF
U
FL1-H
SSC-H
95 .3
10 2
100
c
)
10 2
0.94
60
40
10 1
10 1
0
10
0
10
d
)
20 0
40 0
60 0
FSC-H
80 0
10
e
)
10 2
SSC-H
10 3
0
FL1-H
10 1
10 2
FL1-H
10 3
10 4
4
f
)
MOI 10
10
10 0
10 4
3
10 2
**
*
**
30 .8
gi
10 2
lo
10 1
0
0
un
o
SSC-H
10 1
a-
3
93 .5
10
10 0
4
MOI 20
10
0
10 00
M
IC
10
F-
20
20 0
40 0
60 0
FSC-H
80 0
10 00
10 1
10
0
10 0
10 1
10 2
SSC-H
10 3
10 4
ELSA ANES
FFUL
un
o
lo
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M
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F-
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An
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Vias de Transdução do
Sinal - Linfócitos T
ELSA ANES
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un
o
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a-
M
IC
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FF
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a
An
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Vias de Transdução do
Sinal - Linfócitos T
ELSA ANES
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ls
a
Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal
a-
M
IC
F-
FF
U
• Western Blot – anticorpos específicos para cada
molécula participante de cada cadeia de transdução de
sinal
• Anticorpos específicos para mediadores fosforilados e
não fosforilados
• Tempo dependentes e dose dependentes
un
o
lo
gi
• Controles internos e externos importante
ELSA ANES
FFUL
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
An
es
Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal
Andrade et al. 2004. The vaccinia virus-stimulated mitogen-activated protein kinase (MAPK)
pathway is required for virus multiplication. Biochemistry Journal
ELSA ANES
FFUL
An
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lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
Métodos para Avaliação de Transdução de Sinal
un
o
Campos et al. 2004. Impaired production of proinflammatory cytokines and host resistance to acute infection with Trypanosoma cruzi in mice lacking functional myeloid differentiation factor 88.
Journal of Immunology.
ELSA ANES
FFUL
An
es
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a
L-selectinas e adressinas
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
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L/
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dirigem os linfócitos para
os tecidos linfoides
ELSA ANES
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M
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Integrinas são importantes na
adesão leucocitária
a-
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An
es
An
es
FF
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ls
a
Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão
M
IC
F-
• Imunohistoquímica, Imunofluorescência Indireta –
avaliação qualitativa e semi-quantitativa da expressão
de moléculas de adesão em diferentes órgãos
• Avaliação in vivo, ex-vivo, biópsias, cortes histológicos
un
o
lo
gi
a-
• Citometria de Fluxo – avaliação in vitro, células
cultivadas, ex-vivo – marcadores específicos
un
o
lo
gi
a-
M
IC
Subranamian et al. 2012. Signaling through L-­‐selectin mediates enhanced chemotaxis of lymphocyte subsets to secondary lymphoid tissue chemokine. Journal of Immunology.
F-
An
es
FF
U
L/
E
ls
a
Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão
un
o
lo
M
IC
gi
a-
Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver. Hepatology.
F-
An
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FF
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a
Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão
un
o
An
es
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
Métodos para avaliação de Moléculas de Adesão
Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver. Hepatology.
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
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ls
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es
Métodos para avaliação de estimulação celular
ELSA ANES
FFUL
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
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L/
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An
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Métodos para avaliação de estimulação celular
ELSA ANES
FFUL
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
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L/
E
ls
a
An
es
Métodos para avaliação de estimulação celular
ELSA ANES
FFUL
An
es
ls
a
Métodos de doseamento de citocinas
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
• ELISA Sandwich/(ELISPOT: Enzyme-Linked ImmunoSpot) – a
partir de sobrenadante de células em cultura após diferentes
estímulos – citocinas secretadas após estímulo ou in situ a
partir de células secretoras.
• Citometria de Fluxo – beads contendo anticorpos específicos
contra citocinas
• Citometria de Fluxo – citocinas intracitoplasmáticas, contagem
do número de células produtoras – efeito celular
• Western-blot - quantificação de proteínas num gel e detecção
imunológica com anticorpo.
• Através de visualização em microscópio (histocoloração,
imunofluorescência), conta-se o número de células marcadas.
ELSA ANES
FFUL
An
es
un
o
lo
gi
a-
M
IC
diferenças entre ELISA e ELISPOT
F-
http://www.elispot.biz/ebz_el01.htm
FF
U
L/
E
ls
a
ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE
CITOCINAS
ELSA ANES
FFUL
ls
a
An
es
Métodos de doseamento de citocinas:
ELISPOT
FF
U
FM
IC
agi
un
o
lo
ELISpot overcomes
certain limitations of
ELISA. Moreover,
combining both
techniques in one
experiment supplies
additional
information, e.g. it is
possible to
calculate the mean
production of a
cytokine by single
stimulated cell (e.g.
pg per cell).
L/
E
a modification of a
traditional sandwich
ELISA
immunoassay
ELSA ANES
FFUL
An
es
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
Métodos de doseamento de citocinas:
ELISPOT vs ELISA
a-
ELISPOT Detects the Number of cells secreting cytokine of interest (e.g. n/1 million cells) gi
ELISA Detects the Concentration of the cytokine of interest produced by all cells in the culture (e.g.
pg/1 ml of supernatant)
un
o
lo
In many situations, detection of interleukin 2 (IL-2) in cell cultures with ELISA appears impossible,
because cultured cells instantly consume the secreted IL-2. In contrast to ELISA, ELISpot is not
affected by cytokine consumption, and thus very well suitable for the detection of cells secreting
IL-2
ELSA ANES
FFUL
An
es
Avaliação da produção de IFN-γ
Suspeito
a-
un
o
lo
gi
Sangue
+
PPD
FF
U
Coleta
do
sobrenadante
F-
Controles
negativo
e positivo
Cultura
de
sangue total
M
IC
sangue
24 h
L/
E
ls
a
(por exemplo, em paciente suspeito de infeccão por Mybacterium tuberculosis)
ELISA
detecção
de IFN-γ
Leitura de densidade óptica
ELSA ANES
Avaliação dos resultados
FFUL
An
es
T-cell interferon-γ release assays for the diagnosis of M. tuberculosis infection
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
(A) For the ELISA (QuantiFERON-TB Gold
in tube), venous blood is incubated in
precoated tubes (either coated with
ESAT-6, CFP-10 and TB 7.7, or coated with
phytohemagglutinin as a positive control,
or uncoated as a negative control). Tubes
are incubated to allow effector memory
cells to release interferon- upon MHCIImediated antigen contact. (B) Following
overnight incubation, the tubes are
centrifuged and plasma can either be
stored up to 8 weeks or interferonconcentration can be analyzed directly by
optical density reading at 420 nm
wavelength. (C) Results are expressed as
IU/ml. (D) For the ELISPOT (T.Spot-TB),
2.5 105 mononuclear cells are isolated
from venous blood in microtiter plate wells
in the presence of ESAT-6 and CFP-10, or
phytohemagglutinin as a positive control,
or in the absence of antigen as a negative
control. (E) Wells are precoated with a
carpet of monoclonal antibodies against
interferon- at the bottom. Antigen-reactive
T cells in the wells release interferon- upon
antigen contact, which is subsequently
bound to the antibodies.
un
o
lo
gi
a-
Detection and colour
reaction:
In the cell culture (ELISpot)
plate
In the supernatant in a
separate ELISA plate
Lange C et al. (2007) Rapid immunodiagnosis of tuberculosis in a woman receiving
anti-TNF therapy Nat Clin Pract Rheumatol 3: 528–534 doi:10.1038/ncprheum0571
ELSA ANES
FFUL
An
es
Métodos de doseamento de citocinas: western-blot e ELISA
Mtb infection activates Caspase-1
ls
a
Increased bacterial burden enhances activation of Caspase-1 and IL-1β
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
IL-1β secretion from Mtb infected macrophages is DEPENDENT on Caspase-1 activation
Mishra, B. B., Moura-Alves, P., Sonawane, A., Hacohen, N., Griffiths, G., Moita, L. F. and Anes, E. (2010),
Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 is a potent activator of the NLRP3/ASC inflammasome. Cellular
Microbiology, 12: 1046–1063. doi: 10.1111/j.1462-5822.2010.01450.x
ELSA ANES
FFUL
An
es
Métodos de doseamento de citocinas: western-blot e ELISA
Mtb infection activates Caspase-1
ls
a
Increased bacterial burden enhances activation of Caspase-1 and IL-1β
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
IL-1β secretion from Mtb infected macrophages is DEPENDENT on Caspase-1 activation
Mishra, B. B., Moura-Alves, P., Sonawane, A., Hacohen, N., Griffiths, G., Moita, L. F. and Anes, E. (2010),
Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 is a potent activator of the NLRP3/ASC inflammasome. Cellular
Microbiology, 12: 1046–1063. doi: 10.1111/j.1462-5822.2010.01450.x
ELSA ANES
FFUL
An
es
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
ELISA SANDWICH PARA DOSEAMENTO DE
CITOCINAS
un
o
Lim et al 2009.The Effects of Heat-Killed Wild-Type Lactobacillus casei Shirota on Allergic Immune Responses in an Allergy Mouse Model. International Archives of Allergy and Immunology,
ELSA
ANES
FFUL
An
es
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
O doseamento de citocinas também pode ser
feito por Citometria de fluxo
ELSA ANES
FFUL
M
IC
F-
FF
U
L/
E
citocinas secretadas: beads cobertas com Ac anti-­‐citocina
ls
a
An
es
O doseamento de citocinas também pode ser
feito por Citometria de fluxo
un
o
lo
gi
a-
citocinas intracelulares
ELSA ANES
40 FFUL
un
o
An
es
F-
M
IC
lo
gi
a-
Peripheral-blood mononuclear
cells were stimulated with
staphylococcal enterotoxin B (for
6 hours) then permeabilized and
stained with antibodies specific
for various cell-surface markers
and intracellular cytokines. In this
example, orange clusters consist
of CD4+ T cells (arrow 1),
whereas green and yellow
clusters consist of CD8+ T cells
(arrow 2). Cluster analysis can
quickly identify CD4+ T cells that
express CD45RO and
interleukin-2 (IL-2) (arrow 3),
together with interferon- (IFN-)
(arrow 4).
FF
U
L/
E
ls
a
O doseamento de citocinas
intracelulares também pode ser
feito por Citometria de fluxo
ELSA ANES
41 FFUL
An
es
L/
E
O teste cutâneo determina a capacidade de diferentes alergenos produzirem uma
reação de pápula e eritema .
aspecto de uma reação
FF
U
aspecto de uma reação
logo após injeção
lo
gi
a-
M
IC
F-
após 5 horas
un
o
•
ls
a
Detecção da Hipersensibilidade Tipo I
alergeno diluído
de 1:10 até 1:1000
ELSA ANES
FFUL
An
es
Teste Radioalergoadsorvente (RAST)
ls
a
Mede o nível sérico de anticorpos IgE específicos contra determinado componente alergénico ao
paciente.
FF
U
F-
lavagem
M
IC
soro do paciente contendo antialergeno IgE
L/
E
discos com
componente
alergénico suspeito
un
o
lo
gi
a-
adição de anti IgE humana marcada
lavagem
detecção
ELSA ANES
FFUL
TIPO III
Os imunocomplexos formados no sangue
são depositados no tecido renal, dando
aspecto granular.
An
es
IMUNOFLUORESCÊNCIA DE REAÇÕES DE
HIPERSENSIBILIDADE TIPOS II E III
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
TIPO II
Os anticorpos se depositam de forma linear
sobre a membrana basal glomerular.
Os cortes de rim comparam o padrão de imunofluorescência de um paciente com Lupus
Eritematoso Sistêmico (predomínio de hipersensibilidade tipo III) ELSA
e um paciente com Síndrome de Goodpasture (predomínio de hipersensibilidade tipo II). ANES
FFUL
ls
a
Testes cutâneos
An
es
Detecção da Hipersensibilidade Tipo IV
L/
E
No teste epicutâneo - aplica-se uma baixa dose do antigénio suspeito numa área da pele
do paciente . Antigénio
a-
M
IC
F-
FF
U
Pode haver desenvolvimento de eczema dentro de 48 a 72 h.
un
o
lo
gi
EPIDERME
DERME
GORDURA
SUBCUTÂNEA
ELSA ANES
FFUL
ls
a
Testes cutâneos
An
es
Detecção da Hipersensibilidade Tipo IV
L/
E
•Teste tuberculínico – o derivado protéico purificado de Mycobacterium tuberculosis,
PPD, é injetado por via intradérmica. M
IC
F-
FF
U
Nesse teste analisa-se o surgimento de vermelhidão e enduração no local da injeção,
que podem surgir depois de 24 a 72h em indivíduos pré-sensibilizados.
a-
EPIDERME
un
o
lo
gi
DERME
GORDURA
SUBCUTÂNEA
ELSA ANES
FFUL
An
es
L/
E
ls
a
APRESENTAÇÃO CLÍNICA E HISTOLÓGICA
DO TESTE TUBERCULÍNICO
M
IC
2. 5 a 10mm: repetir o
exame
F-
1. nenhuma reação:
normal
FF
U
Resposta ao teste:
gi
a-
3. > 10mm: positivo
para tuberculose
un
o
lo
4. Paciente HIV +,
>5mm: positivo para
tuberculose
ELSA ANES
FFUL
An
es
M
IC
F-
FF
U
L/
E
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a
• Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul
trypan/alamar-blue, Anexina V, MTT)
un
o
lo
gi
a-
azul trypan
ELSA ANES
48 FFUL
PI: propidium iodide
un
o
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gi
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M
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F-
FF
U
L/
E
ls
a
An
es
• Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul
tripan, Anexina V, MTT)
ELSA ANES
49 FFUL
PI: propidium iodide
un
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gi
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M
IC
F-
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U
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An
es
• Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul
tripan, Anexina V, MTT)
ELSA ANES
49 FFUL
An
es
un
o
lo
gi
a-
M
IC
F-
FF
U
L/
E
ls
a
• Ensaios de viabilidade celular e avaliação de citotoxicidade (azul
tripan, Anexina V, MTT)
ELSA ANES
50 FFUL
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