Márcia da Costa Castilho
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL Dr. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E DA BIOLOGIA MOLECULAR DA HEPATITE B EM TRÊS COMUNIDADES DA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA MÁRCIA DA COSTA CASTILHO MANAUS 2012 MÁRCIA DA COSTA CASTILHO ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E DA BIOLOGIA MOLECULAR DA HEPATITE B EM TRÊS COMUNIDADES DA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. Wornei Silva Miranda Braga Co-Orientadora: Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira MANAUS 2012 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus amados pais Maria Odete e Mario Castilho, meu irmão Eduardo Castilho, e queridos sobrinhos André Thiago, Igor e Giovanni, e a minha filha Yasmin Castilho Barbosa da Silva - essência da minha vida. iii AGRADECIMENTOS A Deus, com Ele tudo é possível. A Universidade do Estado do Amazonas, em proporcionar o Curso de Pósgraduação em Medicina Tropical. A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, meu trabalho, minha segunda casa, pelo apoio em promover o curso de Pós-graduação em Medicina Tropical/UEA/FMT-HVD, na pessoa da Dra. Maria das Graças Costa Alecrim e Servidores. A SUFRAMA e FAPEAM por incentivar a Educação, e no fomento a Pesquisa no Estado do Amazonas. Ao Professor Dr. Wornei Silva Miranda Braga, meu orientador, pela ajuda inestimável, confiança, incentivo e, sobretudo a amizade. Minha sincera gratidão. A Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira, pela orientação, ajuda nas técnicas de biologia molecular, cumplicidade e amizade. Aos Docentes do Programa Pós-graduação em Medicina Tropical/UEA/FMT-HVD, pela formação acadêmica. Aos meus colegas de Turma: Marlúcia Garrido, Jorge Leão, Carolina Talhari e Mariana Broke, pela amizade e bons momentos durante o curso. Aos meus colegas da Gerência de Virologia: Maria Paula Mourão, Michele Bastos, Regina Figueiredo, João Bosco Gimaque, Liane Calado, Elizabeth Galusso, Evaulino Itapirema, e do Laboratório de Endemias: Heline Vasconcelos, pelo apoio, convivência e torcida. Os Professores Dr. Cristovão Alves, Dr. Felipe Naveca, Dr. Jorge Guerra e Sinésio Talhari, que gentilmente contribuíram com críticas e sugestões para o enriquecimento deste trabalho. Aos Professores Rajendranath Ramasawmy e Kátia Cavalcante, pela ajuda e sugestões na confecção dos artigos. iv Aos Profissionais da Saúde de Lábrea: Farmacêutica-Bioquímica Maria do Socorro Silva, Dr. Gabriele Lonardi, Enf. Aruzzo, Manoel Queiroz e Leandra Leal, pela alegria e entusiasmo na execução das atividades de campo. A Dom Jesús, Bispo Prelado de Lábrea, pela cessão da embarcação e tripulação do “Laguna Negra”, que nos permitiu navegar com segurança e tranquilidade pelo curso sinuoso de águas-brancas do rio Purus. Aos cidadãos do Município de Lábrea, pela acolhida, em especial as pessoas das comunidades ribeirinhas do Madeirinho, Sumaúma e Praia do Buraco, que na sua simplicidade e esperança, permitiram a realização da pesquisa. v EPÍGRAFE Na procura de conhecimentos, o primeiro passo é o silêncio, o segundo ouvir, o terceiro relembrar, o quarto praticar e o quinto ensinar aos outros. Provérbio Judaico vi RESUMO A hepatite B é considerada a principal patologia hepática no mundo, e uma das doenças infecciosas mais desafiadoras à saúde pública mundial, causando elevados índices de morbidade e mortalidade, em decorrência de patologias relacionadas à evolução da infecção crônica pelo vírus da hepatite B (VHB). No Brasil, atualmente o Ministério da Saúde estima que 15% da população já teve contato com o VHB, e os casos crônicos, devem corresponder a 1% da população brasileira. A região Amazônica, há tempos, é caracterizada como uma das regiões do mundo de maior ocorrência de infecção pelo VHB, e suas sequelas. Estudos realizados no estado do Amazonas abordavam taxas de até 18% da prevalência de portadores do HBsAg (antígeno de superfície do VHB) e do anti-HBc total (anticorpos contra o antígeno do “core” do VHB), alcançava taxas, também elevadas de 52,1%, principalmente nas calhas dos rios Juruá, Purus e médio Solimões regiões. No Brasil, a vacinação contra o VHB foi iniciada em setembro de 1989, no mesmo município de Lábrea, em crianças até nove anos de idade e profissionais de saúde passando, então a fazer parte do calendário de vacinação em todo o Estado. Estudos recentes mostram que 19 anos, após a vacinação, as taxa de prevalência diminuíram, entretanto, ainda alcançam índices elevados, principalmente entre aqueles indivíduos procedentes de áreas rurais. Neste cenário o estudo teve como objetivos: a) determinar a prevalencia de infecção pela presença dos marcadores sorológicos; b) os aspectos da biologia molecular do VHB; c) e os fatores de risco para a infecção e da transmissão do VHB. Foram avaliados 225 indivíduos de três comunidades rurais, na calha do rio Purus, município de Lábrea, Amazônia ocidental brasileira: 115 (51.1%) na comunidade Madeirinho; 59 (26.2%) na Praia do Buraco e 51 (22.7%) em Samaúma. Do total, 121 (53.8%) pertenciam ao gênero masculino; média de idade de 21,3% (1 a 78 anos), e mediana de 15 anos. 79.1 % (IC 95% 78,50-79,70) tinham evidências de infecção prévia, 23/225 (10,2 %, IC 95% 8,96-11,44) eram reativos para o HBsAg. Entre estes, a prevalência do HBeAg (antígeno "e" do VHB) foi 47.8 % (11/23), e a média de idade era de 10,8 anos (1–36 anos). Em 57 amostras reativas somente para o anti-HBc T, o DNA-VHB foi isolado, quantificado a carga viral pela PCR em tempo real. O gene S foi amplificado pela PCR e as sequências nucleotídicas obtidas pelo sequenciado direto. Em 15/23 sequências foi possível classificar os genótipos do VHB: 14 no genótipo F, em 13 no subgenótipo F/F2a, e apenas 1 no genótipo D. No gene S, no domínio da transcriptase reversa (rt) foi identificado um padrão polimórfico ( rtE11Q + rtH13Y + rtM129L + rtS137T), na maioria das sequencias, entretanto não foi detectado mutações na região do determinante “a”, associado a expressão do HBsAg. A taxa de prevalência total encontra foi alta, entretanto não foi evidenciada a infecção B oculta na população do estudo, o que sugere uma baixa prevalência. A análise dos fatores de risco indica que o VHB é transmitido principalmente horizontalmente, no meio famíliar, de um portador crônico "ativo" (HBeAg-positivo), com baixa idade, sendo estes os potenciais reservatórios do VHB, e que mantêm os bolsões de infecção e, também uma forte possibilidade da ocorrência da transmissão vertical. O genótipo F/F2a foi predominante, com padrão de polimorfismos característico, descrito pela primeira vez, o que também reforça a transmissão familiar do VHB, nesta região. Palavras chaves: Hepatite B. VHB. Prevalência. Epidemiologia molecular. Amazônia vii ABSTRACT Hepatitis B, the main liver disease worldwide, is one of the most challenging infectious diseases to public health world, causing high morbidity and mortality due to patients progression to chronic infection with hepatitis B virus (HBV). In Brazil, the Ministry of Health estimates that 15% of the population may have contact with HBV and the thus should correspond to 1% of the population. The Amazon region has long been characterized, as one of the world regions, with the highest HBV of infection and its sequelae. Several studies showed that the state of Amazonas the prevalence rates of up to 18% of HBV carriers (HBV surface antigen) and up to 52.1% for the anti-HBc (antibodies against the antigen of the "core" of HBV), mainly in the riverines of the Juruá, Purus and Solimões regions. In Brazil, vaccination against HBV was initiated in September 1989 in the city of Lábrea in children up to 9 years old and healthcare, and then in the entire state. Recent studies showed, 19 years after vaccination, the prevalence rate has declined, but is still high among individuals of rural areas. Thus the aim of the study was: a) determine the prevalence of infection by the presence of serological markers, b) molecular characterization of HBV, c) and risk factors for infection and transmission of HBV. We evaluated 225 individuals from three rural communities in the valley of the Purus river, municipality of Lábrea, western Brazilian Amazon: 115 (51.1%) in the community Madeirinho, 59 (26.2%) in Praia do Buraco and 51 (22.7%) in Samaúma. Of the total, 121 (53.8%) were male, mean age 21.3% (1-78 years), and median 15 years. 79.1% (95% CI 78.50 to 79.70) had evidence of prior infection, 23/225 (10.2%, 95% CI 8.96 to 11.44) were reactive for HBsAg. Among these, the prevalence of HBeAg ("e" antigen of HBV) was 47.8% (11/23), and the mean age was 10.8 years (1-36 years). In 57 samples only reactive for anti-HBc T, HBV-DNA was isolated and the viral load by real-time PCR. The S gene was amplified by PCR and the sequenced. In 15/23 sequences, it was possible to determinate the HBV genotype. 14 were of F, 13 of subgenotype F/F2a, and 1 of genotype D. In S gene, encoding the reverse transcriptase (rt) region this polymorphic pattern (rtE11Q + rtH13Y + rtM129L + rtS137T) was identified sequences, However no mutations in the region determinant "a" associated with expression of HBsAg were described. The overall prevalence rate is high. Of those, we did not observe the hidden B infection, which suggests a low prevalence. The analysis of risk factors indicates that HBV is transmitted primarily horizontally, in the family, a chronic carrier "active" (HBeAg-positive), low age, these potential reservoirs of HBV, and keeping the pockets of infection and also a strong possibility of the occurrence of vertical transmission. The genotype F/F2a was predominating, with a characteristic pattern of polymorphisms, described for the first time, reinforcing the familial transmission of HB, in this region. Keywords: Hepatitis B. HBV. Prevalence. Molecular epidemiology. Amazon viii LISTA DE TABELAS TABELA 1. Padrões de endemicidade da infecção pelo vírus da hepatite B ................................................................................................ 04 TABELA 2. Estimativas das prevalências de anti-HBc e HBsAg e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) e endemicidade de hepatite B para o conjunto das capitais de cada região e Distrito Federal .......................................................................... 07 TABELA 3. Modelo classificatório, adotado pelo estudo, para as amostras dos indivíduos submetidas aos testes sorológicos.................... 28 TABELA 4. Seqüências dos oligonucleotídeos pré-selecionados................ 29 ix LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Distribuição geográfica da infecção crônica pelo HBV............. 03 FIGURA 2. Distribuição da infecção pelo VHB no Brasil, 1999.................. 07 FIGURA 3. Micrografia eletrônica de formas de partículas do VHB no sangue...................................................................................... 09 FIGURA 4. Desenho esquemático da partícula infecciosa do VHB............ 10 FIGURA 5. Esquema da organização genômica do VHB......................... 11 FIGURA 6. Representação linear do genoma do HBV apresentando as fases de leitura aberta (setas largas) e os produtos proteicos correspondentes....................................................................... 13 FIGURA 7. Esquema do ciclo replicação do vírus da hepatite B no hepatócito................................................................................. 17 FIGURA 8. Localização do município de Lábrea, no mapa do Estado do Amazonas................................................................................. 25 FIGURA 9. Fluxograma para os testes laboratoriais................................... 35 x LISTA DE ABREVIATURAS a.C. Antes de Cristo ALT Alanina aminotransferase Anti-HBc Anticorpo contra o HBcAg Anti-HBe Anticorpo contra o HBeAg Anti-HBs Anticorpo contra HBsAg Anti-HCV Anticorpo contra VHC Anti-HDV Anticorpo contra VHD AuAg Antígeno Austrália C Citosina cccDNA Covalente Circular DNA CDC Centro de Controle de Doenças CHC Carcinoma hepatocelular CV Carga viral DF Distrito Federal DNA Ácido desoxirribonucléico dNTP Desoxinucleotídeo EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA Teste imunoenzimático EUA/USA Estados Unidos da América FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado G Guanidina FAPEAM Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado GEHEP Grupo de Estudos das Hepatites HBcAg Antígeno do nuclocapsídeo do vírus da hepatite B HBeAg Antígeno “e” do vírus da hepatite B HBsAg Antígeno de superfície do vírus da hepatite B HBx Proteína “x”do Vírus da Hepatite B xi HCl Ácido clórico HBIG Imunoglobulina humana contra o vírus B IC Intervalo de confiança Kilo bases Kb 2 Km Quilômetros quadrados L Lisina - aminoácido M Molar M Metionina - aminoácido mg Miligramas MgCl2 Cloreto de magnésio mL Mililitros mM Milimolar NaOH Hidróxido de sódio ng Nanograma nm Nanômetro Nt Nucleotídeos OMS Organização Mundial da Saúde OPAS Organização Panamericana de Saúde pb Pares de bases PCR Reação em cadeia da polimerase pH Potencial hidrogeniônico pmol Picomol Pol Polimerase qRT-PCR PCR em tempo Real quantitativo RNA Ácido ribonucléico SUFRAMA Superintendência da Zona Franca de Manaus TBE Tampão Tris/Borato/EDTA Tm Temperatura de fusão ou o melting T Tris Tampão tris (hidroximetil) aminometano - (HOCH2)3CNH2 ™ Marca registrada, do inglês Trade mark UI Unidades Internacionais xii V Volt – tensão elétrica V Valina VHA/HAV Vírus da hepatite A VHB/HBV Vírus da hepatite B VHC/HCV Vírus da hepatite C VHD/HDV Vírus da hepatite C YMDD Seqüência de aminoácidos tirosina, metionina, ácido aspártico e ácido aspártico xiii SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 01 1.1 1.2 1.3 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.5 1.6 A Doença........................................................................................................ Aspectos epidemiológicos.............................................................................. Modos de transmissão.................................................................................... O Vírus da hepatite B...................................................................................... Estrutura molecular do VHB........................................................................... Proteínas virais............................................................................................... Variabilidade genética e mutações................................................................. Replicação do VHB......................................................................................... A Carga viral................................................................................................... A infecção oculta pelo VHB............................................................................ 01 02 07 08 08 11 13 16 18 20 2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 23 2.1 2.2 Geral............................................................................................................... Específicos...................................................................................................... 23 23 3 METODOLOGIA ...................................................................................................... 24 3.1 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.4 3.4.1 3.4.2 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.2.1 3.5.2.2 3.5.3 3.5.3.1 3.5.4 3.5.4.1 3.5.5 24 24 25 25 25 26 26 26 26 26 27 27 28 28 29 30 31 32 32 33 Modelo de estudo........................................................................................... Local de estudo e descrição da área.............................................................. Definição dos sujeitos da investigação........................................................... População de estudo...................................................................................... Tamanho da amostra...................................................................................... Critérios de inclusão....................................................................................... Critérios de exclusão...................................................................................... Procedimentos................................................................................................ Coleta de informação e consentimento.......................................................... Coleta, procedimento e armazenamento de amostra biológica...................... Diagnóstico laboratorial.................................................................................. Determinação e classificação sorológica dos participantes........................... Detecção qualitativa do DNA-VHB................................................................. Extração do DNA a partir do plasma sanguíneo............................................. Seleção de oligonucleotídeos para a PCR e PCR em tempo real................. Reação da polimerase em cadeia.................................................................. Avaliação eletroforética dos produtos de amplificação................................... Sequenciamento direto................................................................................... Análise das seqüências.................................................................................. Reação da polimerase em cadeia em tempo real.......................................... xiv 3.5.5.1 3.5.5.2 3.6 3.7 3.8 Curvas de dissociação.................................................................................... Detecção quantitativa do DNA-VHB .............................................................. Análise dos dados........................................................................................... Instituições participantes................................................................................. Certificado de Aprovação no Comitê de Ética e Pesquisa............................. 34 34 36 36 36 4 RESULTADOS ......................................................................................................... 38 4.1 4.2 4.3 Artigo 1 aceito ................................................................................................ Artigo 2 para submissão ................................................................................ Artigo 3 para submissão ................................................................................ 38 45 53 5 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 69 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 70 7 ANEXOS .................................................................................................................. 80 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 Termo de Consentimento............................................................................... 86 Questionário.................................................................................................... 88 Certificados de Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa......................... 90 Errata do Artigo 1 ........................................................................................... 93 Depósito das sequências nucleotídicas no GenBank..................................... 94 Análises pelos algoritmos HBVSeq e HepSEQ.............................................. 97 Genotipagem do VHB pelo NCBI ................................................................... 161 1 1 INTRODUÇÃO 1.1 A Doença A hepatite B é considerada a principal patologia hepática no mundo. A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) pode induzir várias alterações hepáticas agudas, variando de hepatite sub-clínica à fulminante, e doenças crônicas, como hepatite persistente inativa, hepatite crônica ativa, cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (CHC). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), três quartos da população mundial vivem em áreas onde as taxas de infecção crônica superam 2%. Estima-se que um terço da população mundial (cerca de dois bilhões de pessoas) foi infectada pelo VHB e aproximadamente 400 milhões de pessoas encontram-se infectadas cronicamente (2, 3). Apesar da disponibilidade, eficácia e segurança das vacinas existentes desde 1982, a hepatite B permanece como uma das patologias infecciosas mais desafiadoras à saúde pública mundial, ainda causando elevados índices de morbidade e mortalidade. A cada ano, estima-se que acima de um milhão de pessoas morrem em decorrência de patologias relacionadas à evolução da infecção crônica pelo VHB, sendo a hepatite B considerada a sétima entre todas as causas de óbitos no mundo (6). Em 15 a 40% dos pacientes crônicos constata-se evolução para cirrose, descompensação hepática ou CHC. Dentre um milhão de novos casos anuais de CHC estimados, 82% são atribuídos a hepatites virais e a maioria diretamente associada ao VHB, correspondendo a aproximadamente 75% dos casos de CHC, que apresenta grande risco de morte e constituem um reservatório de indivíduos infectados por serem portadores do vírus em replicação (3, 7-10). A história das hepatites vem dos primórdios da civilização. Tem-se notícia de surtos de icterícia na Babilônia, há mais de 2500 anos, e Hipócrates (século IV a.C.) faz referência nos seus escritos à icterícia epidêmica. Já a confirmação da existência de uma forma de hepatite de transmissão parenteral foi documentada por Lüdman em 1885, durante um surto epidêmico ocorrido em Bremen, na Alemanha, após a vacinação antivaríola, que supostamente havia sido contaminada. Este achado foi confirmado por MacCallum, na Inglaterra, que conduziu estudos da transmissão em voluntários, demonstrando a transmissão oral da hepatite infecciosa e a transmissão 2 parenteral da hepatite sérica nos voluntários. É a este investigador que se deve a introdução, em 1947, dos termos hepatite A e B, para as hepatites infecciosa e sérica, respectivamente (11). No entanto, ainda não havia sido esclarecido a questão da etiologia das hepatites, e inesperadamente Blumberg e colaboradores, em 1963, investigando anticorpos contra lipoproteínas séricas em pacientes politransfundidos, evidenciaram um novo antígeno, denominado “Antígeno Austrália” (AuAg), por ter sido encontrado no soro de um aborígene australiano (12). A identificação do antígeno Austrália foi um passo importante na compreensão e diagnóstico das hepatites virais, sendo, em 1976 agraciado com o Premio Nobel de Medicina. A hepatite B foi estabelecida em 1968, quando comparado o antígeno AuAg com partículas virais esféricas e cilíndricas isoladas do soro de indivíduos infectados, por meio da microscopia eletrônica (11). Em 1970, em Londres, o australiano Dane, demonstrou a existência de uma terceira partícula, de forma esférica, em soro antígeno positivo, a partícula Dane, que se comprovou corresponder ao próprio vírus. Dane e colaboradores (1970), descreveram pela primeira vez a partícula viral íntegra do VHB (esferas de 42nm). Posteriormente, foi confirmado que a camada mais externa da partícula viral continha um antígeno idêntico ao AuAg e denominado como HBsAg (8, 11, 13). 1.2 Aspectos epidemiológicos No mundo, o índice de prevalência de infecção pelo VHB divide as áreas geográficas em três categorias distintas: alta endemicidade (>8%); média endemicidade ou intermediária (2 – 7%) e baixa endemicidade (<2%) (Figura 1). Nas áreas que correspondem à região de alta endemicidade o índice de portadores do VHB alcança até 20%, Sudeste Asiático, África Sub-Sahariana, regiões do Pacífico Sul, Alasca e Amazônia Ocidental, a infecção se dá geralmente por transmissão vertical ou na infância e, horizontalmente antes dos cinco anos de idade, por mecanismos ainda não bem definidos, provavelmente relacionados às características ambientais como a possibilidade de transmissão por insetos hematófagos ou a hábitos culturais da população, que levem a contato com sangue de um indivíduo portador (14-21). Estima-se que essas regiões de elevada 3 endemicidade contribuam com mais de 90% dos casos mundiais, sendo o VHB implicado como importante fator etiológico de hepatite crônica, cirrose hepática e hepatocarcinoma (6, 22, 23). Nas áreas de prevalência intermediária, a transmissão ocorre em todas as idades, embora a infecção na primeira infância seja responsável pela manutenção de altas taxas de infecção crônica. Nas de baixa endemicidade a infecção, em geral, ocorre na vida adulta onde a transmissão sexual e percutânea assume uma importância significativa (7, 24). Figura 1: Distribuição geográfica da infecção crônica pelo HBV, adaptado Fonte: www.cdc.gov/ncidod/diseases/hepatitis/slideset/hep_b/slide_9.htm 4 Tabela 1 – Padrões de endemicidade da infecção pelo vírus da hepatite B Endemicidade da Infecção Característica Baixa (%) Intermediária Alta (%) (%) 0,1 – 1 1–7 >8 5–7 10 – 60 70 – 90 Risco de Infecção < 20 20 – 60 > 60 Infecção Perinatal (até 1 Rara Incomum Comum < 10 10 – 60 > 20 Rara Comum Muito Comum < 10 10 – 60 > 60 Muito Comum Comum Incomum 70 – 90 20 – 50 10 – 20 Prevalência de Infecção Crônica (HBsAg +) Prevalência de Infecção Prévia (anti-HBc +) ano de idade) Infecção na Primeira Infância (1 a 5 anos) Infecção na Idade Adulta/Adolescência Fonte: França, 2005 (25), adaptado de Alter, 2003 (7) e Tanaka, 2000 (24) Para o Brasil, estimava-se que 15% da população já teria tido contato com o VHB e os casos crônicos deveriam corresponder a cerca de 1% da população. A maioria das pessoas desconhece seu estado de portador e constituem elo importante na cadeia de transmissão do VHB, o que perpetua a doença (4, 26). Estudos realizados entre as décadas de 80 e 90 indicavam uma alta prevalência do VHB na região Norte. Assim como convencionado, considerava-se que ocorriam três padrões de distribuição da hepatite B: alta endemicidade, com prevalência superior a 7%, presente na região Amazônica; algumas localidades do Espírito Santo e oeste de Santa Catarina; endemicidade moderada, com prevalência entre 2 e 7%, nas regiões Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste e baixa endemicidade, com prevalência abaixo de 2% na região Sul do país (Figura 2) (27). 5 A região amazônica, há tempos, é caracterizada como uma das regiões do mundo de maior ocorrência de hepatite pelo vírus B e suas seqüelas (16, 28-36). No Estado do Amazonas, as calhas dos rios Juruá, Purus e médio Solimões são consideradas as regiões de maior endemicidade (14, 37-41). Desde o final dos anos 60, uma forma de insuficiência hepática grave é descrita pelo nome de Febre Negra de Lábrea, devido ao primeiro relato da ocorrência desse tipo de hepatite fulminante referir essa cidade (40, 42). No Brasil, a vacinação contra o VHB foi iniciada em setembro de 1989, na cidade de Lábrea, logo se estendendo a mais de dez municípios dos rios Purus (Canutama, Pauini, Tapauá e Boca do Acre), Juruá (Eirunepé, Carauari, Itamarati e Envira) e médio Solimões (Coari e Codajás) (43). Foram vacinadas, sob a coordenação daquela primeira campanha, crianças menores de 10 anos de idade e profissionais de saúde, com três doses de vacina recombinante – que passou a fazer parte do calendário de vacinação em todo o Estado do Amazonas, a partir de 1992 (44). Anteriormente à introdução da vacina contra hepatite B na região, a prevalência de portadores do HBsAg (antígeno de superfície do VHB) variava de 15,3%, em Lábrea (37) a 18,3% em Itamarati e 15,5% em Codajás (41). A prevalência de anti-HBc total (anticorpos contra o antígeno do “core” do VHB) alcançava taxas bastante elevadas, como 52,1% em Lábrea (37), 71,4% em Itamarati e 62,5% em Codajás(41); e as taxas de prevalência do vírus da hepatite D (VHD) em indivíduos com reatividade para o HBsAg era relatada em torno de 32% (16, 40, 45). Reduções significativas nas taxas de prevalência de marcadores do VHB ocorreram em países que introduziram a vacina contra hepatite B em seus programas nacionais de imunização (46, 47). Em Taiwan, por exemplo, a taxa de prevalência de portadores do HBsAg caiu de 9,8%, em 1984, para 4,8% em 1989 e 1,3% em 1994 (48). No estudo realizado na cidade de Eirunepé, vale do rio Juruá, Amazônia Ocidental, no ano seguinte à vacinação em massa, os autores, após avaliarem casos de hepatite aguda, sugeriam que o vírus da hepatite B continuava circular 6 entre indivíduos menores de dez anos de idade, inclusive crianças vacinas adequadamente (44). Em outro estudo, na cidade de Itamarati, vale do rio Juruá, sete anos após a introdução da vacina, os autores estimaram a prevalência de marcadores do VHB e do VHD. Apesar do registro de dificuldades em razão do tamanho da amostra, foi encontrada uma prevalência de 7% para portadores do HBsAg e de 83,3% para a presença do anti-HBc total, e de 22,2% para o anti-HD (anticorpo contra o antígeno do vírus da hepatite D) entre indivíduos reativos para qualquer marcador do VHB. Esses resultados sugerem redução significativa dessas taxas na região, ainda que continuem bastante superiores às relatadas em outras regiões do país (36). No início desta década o Ministério da Saúde em convênio com a Universidade de Pernambuco e a Organização Panamericana da Saúde (OPAS) vem conduzindo junto a pesquisadores de Universidade Federais, Estaduais e de Secretarias Estaduais e Municipais de Saúde, o inquérito nacional de base populacional nas capitais brasileiras, sobre as infecções pelos vírus das hepatites A, B e C (27). Os dados parciais mostram que o país está em melhores condições, do que apontavam as estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a doença. Diferentemente do que essa instituição estimava, o país tem baixa prevalência para a hepatite B crônica. Isto é, menor que 2%. Os dados revelam que, no geral 7,44% da população do conjunto das capitais brasileiras e do Distrito Federal (DF), entre 10 a 69 anos já tiveram contato com o VHB (10 a 19 anos: 1,14% e de 20 a 69 anos: 11,5%). Desses, 0,37% da população pesquisada, em torno de 127 mil pessoas, eram portadores do VHB (10 a 19 anos: 0,055%; 20 a 69 anos: 0,6% e 10 a 69 anos: 0,37%). Outro importante aspecto revelado pela pesquisa são as diferenças regionais. A prevalência do marcador sorológico HBsAg, em adultos, varia muito de acordo com as regiões do país. Vai de 0,4% no Sudeste a 0,92% no Norte (Tabela 2) (49). 7 Tabela 2 - Estimativas das prevalências de anti-HBc e HBsAg e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) e endemicidade de hepatite B para o conjunto das capitais de cada região e Distrito Federal Figura 2: Distribuição da infecção pelo VHB no Brasil, 1999 Fonte: Silveira et al., 1999(1) ; Souto et al., 1999 (4) 1.3 Modos de transmissão O período de incubação situa-se entre 45 a 180 dias e a transmissão do VHB é usualmente por via parenteral, e, sobretudo, pela via sexual, sendo considerada uma doença sexualmente transmissível. Dessa forma, a hepatite B pode ser 8 transmitida por solução de continuidade (pele e mucosa), relações sexuais desprotegidas e por via parenteral (compartilhamento de agulhas seringas, tatuagens, piercings, procedimentos odontológicos ou cirúrgicos, etc). Outros líquidos orgânicos, como sêmen, secreção vaginal e leite materno, também podem conter o vírus e constituir-se fonte de infecção. A transmissão vertical (de mãe para filho) também é causa freqüente de disseminação do VHB em regiões de alta endemicidade (50). Outros fluidos potencialmente infectantes são: líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido pericárdico e líquido amniótico. Os fluidos não potencialmente infectantes são as fezes, urina, suor, lágrimas, saliva e vômito. Desde que não estejam contaminados com sangue, estes fluidos contêm grandes quantidades de partículas de HBsAg mas poucas partículas víricas infecciosas, o que os torna pouco eficazes na transmissão da doença (51). O vírus da hepatite B pode manter-se em superfícies, no ambiente externo, à temperatura ambiente, por períodos longos, por sete ou mais dias. A inativação se dá pela elevação da temperatura (fervura por 10 minutos), ou associado à elevação da pressão em autoclave a 121ºC por 15 minutos ou por calor seco a 160ºC, durante uma hora. Também podem ser utilizadas substâncias químicas como o hipoclorito de sódio a 1%, durante 30 minutos, ou formaldeído aquoso a 16% durante duas horas ou ainda pelo óxido de etileno, na esterilização a gás (52) Com relação ao plasma infectado, este poderá ser inativado, aquecendo-o a 60ºC, por 5 horas (53). 1.4 O Vírus da hepatite B O vírus da hepatite B é classificado como membro da família Hepadnaviridae e gênero Orthohepadnavirus. Todos os membros da família são hepatotrópicos e compartilham características estruturais e funcionais. Os demais membros do gênero Orthohepadnavirus infectam mamíferos como marmotas, esquilos e macacos. Além do homem, o VHB somente é transmissível aos chimpanzés. (8, 13, 54). 1.4.1 Estrutura molecular do VHB O vírus da hepatite B diferencia-se de outros vírus humanos por encontrar-se um vasto excesso de partículas subvirais referente ao título viral no soro dos 9 indivíduos infectados. Estas partículas (Figura 3), que consistem somente das proteínas superficiais do vírus e pequenas quantidades de lipídios, apresentam-se esféricas (20-22 nm de diâmetro) ou filamentosas (20-22 nm de diâmetro e comprimento variável) e podem ser encontradas em quantidades que podem atingir 1014 partículas/mL (1 mg/mL). O vírion apresenta-se esférico (partículas com 42 – 47nm) e possui uma bicamada superficial, sendo a mais externa constituída pelo envelope viral e a mais interna pelo nucleocapsídeo de forma icosaédrica (Core), contendo uma DNA polimerase RNA dependente - ou seja, uma transcriptase reversa - (Figura 4) (54, 55). Nos vírions, o genoma apresenta-se circular, constituído por uma fita circular parcialmente dupla de DNA e associado a DNA polimerase. O vírus da hepatite B apresenta um dos menores genomas dentre os vírus conhecidos (3 -3,3 kb) e a numeração da seqüência nucleotídica baseia-se no sítio de clivagem da enzima de restrição EcoRI ou em sítios homólogos, caso o sítio da EcoRI esteja ausente. Outros métodos de numeração também são empregados, baseados no códon inicial da proteína Core ou na primeira base do RNA pré-genômico (54, 55). Figura 3: Micrografia eletrônica de formas de partículas do VHB no sangue Fonte: Liang, 2009 (5) O genoma é constituído de uma fita de polaridade negativa (cadeia - / “antisenso”) longa apresentando extremidades 5´ e 3´ definidas, completa e codificante, 10 e outra fita de polaridade positiva (cadeia +/ “senso”) mais curta – incompleta e não codificante (Figura 4). Em virtude do modo de maturação do genoma, a porção Nterminal da polimerase viral é encontrada ligada à extremidade 5´ da fita negativa. Portanto, a fita negativa não é covalentemente fechada. A estrutura circular em dupla hélice é gerada pela existência de complementaridade entre a extremidade 5’ de ambas as cadeias – denominadas DR1 e DR2. In vivo, as partículas do HBV são secretadas das células infectadas antes que a fita dupla esteja completa, restando uma região DNA de fita simples nos capsídeos maduros (54, 55). Figura 4: Desenho esquemático da partícula infecciosa do VHB Fonte: http://viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/9.html São identificadas quatro regiões de leitura principais (Open Reading Frames ORF) ou genes que codificam as diferentes proteínas virais: Pré-C/C, Pol, S e X, definidas e sobrepostas parcialmente no genoma viral, que resultam na transcrição e tradução de sete diferentes proteínas (Figuras 4 e 5), através da utilização de códons iniciais variáveis. Todos os pares de bases no genoma do VHB estão envolvidos na codificação de, no mínimo, uma proteína viral. O genoma ainda apresenta elementos genéticos sobrepostos às regiões codificantes que regulam os níveis de transcrição. Alguns destes elementos somente são predominantemente 11 encontrados nos hepatócitos, desta forma justificando o hepatotropismo do VHB (54, 55). Figura 5: Esquema da organização genômica do VHB Fonte: Liang, 2009 (5) 1.4.2 Proteínas virais A ORF-C traduz dois tipos de produtos protéicos de acordo com o códon de iniciação utilizado: a proteína do Core, que constitui o nucleocapsídeo (HBcAg) e uma proteína precursora denominada pré-core (pré-C). Está é secretada para a luz do retículo endoplasmático, após modificação pós-tradução dando origem a proteínas – o antígeno “e” (HBeAg). Níveis elevados de HBeAg são freqüentemente encontrados no soro de pacientes altamente virêmicos, durante fase precoce em infecções agudas e estágios replicativos em algumas infecções crônicas, e também 12 em quase todos os compartimentos da célula infectada. A positividade no soro para o HBeAg é um indicador de viremia do VHB (54-56). O gene P (ORF-P) sobrepõe-se em parte do gene C e gene X, e todo o S gene, resultando na maior fase de leitura aberta do genoma do VHB. Responsável pela codificação da DNA polimerase viral que possui atividade de DNA polimerase – RNA dependente (transcriptase reversa, RNase H e Primase (proteina que funciona como iniciador –primer- à transcrição reversa do RNA pré-genômico, para a síntese de DNA (cadeia -) (54, 55). O gene S (ORF-S) é inteiramente sobreposto ao gene P, e contém três domínios - pré-S1, pré-S2 e S - e três códons de início de tradução na mesma fase de leitura, que codificam respectivamente três formas do invólucro viral: grande (L), média (M) e a pequena (S). As três proteínas de superfície do VHB são relacionadas entre si, dispondo do mesmo códon de parada e compartilhando uma região denominada domínio S, que codifica a proteína S (HBsAg) do envelope do VHB e as partículas não infectantes. A proteína S é a mais abundante e sua seqüência está presente em todos os outros, e vem sendo utilizada na classificação do VHB, através da análise da sequencia do genoma viral, ou seja, pela genotipagem. O HBsAg contém um epítopo altamente antigênico denominado determinante “a” que também permite a subtipagem do VHB pela análise sorológica com emprego de anticorpos monoclonais. A proteína pré-S1 parece reconhecer os receptores da superfície da célula, contribuindo para a especificidade dos vírus a um determinado hospedeiro (54, 55). O gene X (ORF-X) é a menor fase de leitura aberta no genoma do VHB e codifica a proteína X (HBx) que contém 154 aminoácidos, no entanto ainda não é muito bem caracterizada. Esta proteína parece ter funções essencialmente regulatórias da expressão gênica, tanto no ciclo viral e da célula hospedeira. A proteina HBx tem sido associada com o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular. Mas seu papel na replicação do vírus e patogênese em indivíduos infectados continua longe de ser completamente compreendida (54, 55, 57). 13 Figura 6: Representação linear do genoma do HBV apresentando as fases de leitura aberta (setas largas) e os produtos protéicos correspondentes Nota: As setas tracejadas verticais indicam transcrição e tradução e a seta íntegra vertical indica clivagem por proteases celulares. Fonte: França, 2005(25), adaptado de Kann, 2002(58) 1.4.3 Variabilidade genética e mutações Existe um grande interesse em identificar os subtipos e genótipos mais prevalentes, a fim de correlacioná-los com manifestações clínicas e distribuição geográfica. Inicialmente, a variabilidade do VHB é baseada em estudos sorológicos de três determinantes antigênicos, denominados “a”, “d” e “y”, e subdeterminantes (“w” e “r”) codificadas pelo gene S (HBsAg), o que permite classificar o VHB em nove subtipos sorológicos, sendo quatro os principais: “adw”, “ayw”, “adr” e “ayr”. Estes subtipos têm diferente distribuição geográfica e são úteis como marcadores epidemiológicos (53, 59). O determinante "a" é comum a todos estes subtipos e é o alvo para o anticorpo neutralizante (anti-HBs). A infecção por um dado subtipo exerce proteção cruzada em relação aos outros, assim, a coinfecção com mais do que um subtipo do VHB é rara (51). 14 Em 1988, Okamoto e colaboradores sugeriram que a variabilidade genética do HBV poderia ser utilizada na geração de um sistema de classificação que substituísse ou complementasse a classificação sorológica vigente. No presente, são reconhecidos dez grupos genômicos (ou genótipos) do VHB, designados de A a J, definidos arbitrariamente como portadores de divergência nucleotídica completa superior a 8% (60-66). Diversos estudos têm indicado padrões característicos quanto à distribuição geográfica dos genótipos do HBV, os quais somente são conhecidos parcialmente devido ao número não representativo de amostras de algumas partes do globo. O genótipo A, além de pandêmico, é mais prevalente na América do Norte, Europa (exceto a região Mediterrânea) e África Central e Meridional. Os genótipos B e C são característicos dos países asiáticos. O genótipo D, apesar de mundialmente distribuído, é mais prevalente na região Mediterrânea e Oriente Médio e o genótipo E é predominante no continente Africano (61, 67-69). O genótipo F é considerado próprio dos residentes nas Américas, verificando-se uma associação forte entre este genótipo e populações nativas das Américas Central e do Sul (70). O genótipo F apresenta a mais elevada divergência entre todos os genótipos (69, 71). Os genótipos descritos recentemente (G e H) foram encontrados na América do Norte e França (64), e América Central e México (60), respectivamente. Na Ásia, no mesmo período, foi sugerido um novo genótipo diferente dos que já haviam sido descritos anteriormente (72), e que mais tarde teria sido confirmado o genótipo I (73, 74) e, o mais recente o genótipo J, descrito, também no continente asiático (75). No Brasil, os estudos de levantamento da distribuição regional dos genótipos do HBV têm sido raros e com número reduzido de amostras. Os genótipos A, D e F foram descritos entre portadores crônicos acompanhados ambulatorialmente no Rio de Janeiro e entre pacientes submetidos à hemodiálise em Goiânia e Santa Catarina (76-79). Entre pacientes procedentes de São Paulo, os genótipos A, D e F são encontrados, em maior proporção, em indivíduos de famílias de origem ocidental, enquanto os portadores dos genótipos B ou C foram descritos entre aqueles de origem asiática (80). Entre indígenas da região Amazônica, apenas o genótipo F foi encontrado nas tribos que não mantinham contato com não-índios, enquanto que o genótipo A foi encontrado nas tribos com intenso contato com estes (81). Outros estudos conduzidos em portadores do HBsAg, naturais da Amazônia brasileira, 15 revelou maior prevalência do genótipo A, seguido do genótipo F e, em menor freqüência o genótipo D (82-84). Estudos recentes mostram que em amostras procedentes de populações indígenas, localizadas dentro dos limites do município de Lábrea, evidenciou-se em maior frequência o genótipo A, seguido do genótipo D. No entanto, o genótipo F não foi encontrado (85). O fato do genoma do VHB, mesmo sendo este constituído de DNA de fita dupla, ser replicado através de um RNA intermediário, torna-o suscetível a elevada taxa de mutações. As polimerases dos hepadnavírus não possuem a capacidade de verificação e remoção de bases incorporadas erroneamente e apresentam taxas de mutação da ordem de 10-4 a 10-5 substituições de bases/sítio/ano, ou seja, similares à taxa do gene retroviral gag (68, 86). A variabilidade genética do VHB é observada tanto como uma expressão da evolução dos genótipos virais, ou seja, o reflexo da divergência do genoma viral na população portadora, quanto por meio do surgimento de mutações em cada indivíduo isoladamente analisado (87, 88). Os desenvolvimentos em vacinação e terapia antiviral levaram ao surgimento de variantes (mutações pontuais) do VHB, e com o auxilia das técnicas de biologia molecular as descobertas, as quais vêm demonstrando importância clínica crescente. As mais conhecidas estão associadas às regiões S e C (89) A proteína S (HBsAg) é a principal alvo dos anticorpos neutralizantes antiHBs, alterações de aminoácidos nesta região do genoma, podem impedir a neutralização do vírus por estes anticorpos. As variantes são detectadas na região com as mudanças no determinante "a" do HBsAg (epítopo imunodominante, aminoácidos de 99 a 147) que escapam à vacinação e da ação protetora do terapia imunoglobulina específica (HBIG). O primeiro variante descrito foi o G145R, que é o mais comum (90). Os programas de vacinação contra o VHB universalmente têm agido como um fator de seletividade dessas variantes, o que levou a um aumento importante na sua prevalência. Estudos em Taiwan, 10 anos após a vacinação, mostraram que a prevalência global de positividade do DNA do VHB em crianças caiu de 8,6-2,1%, enquanto as mutações do determinante 'a' subiram de 7,8% para 28,1% (91). 16 As variantes do promotor do core e pré-core originam vírus que não produzem HBeAg. A mutação mais comum do promotor do core apresenta uma alteração dupla A1762T e G1764A que diminui o RNA mensageiro do pré-core, e assim, a secreção de HBeAg (92). Foram descritas variantes do promotor do core em associação com infecção pelo VHB fulminante (10% dos casos) e hepatite crônica progressiva (27%) (93). A variante do pré-core mais comum tem um códon de terminação (stop códon) prematuro (G1896A) que previne a translação do polipeptídeo do précore eliminando assim a produção de HBeAg, mas mantendo-se a produção do peptídeo do core. Estas variantes encontram-se, sobretudo em pacientes sem o HBeAg com os genótipos B, C e D. Foram descritos casos severos de hepatite aguda e crónica associados com mutantes do pré-core, mas em geral o significado patológico destes mutantes não é bem claro (89). Têm também sido encontradas mutações no gene da polimerase em pacientes que fazem terapêutica antivíral, que passam a desenvolver resistências a estes fármacos. Os mutantes da polimerase mais bem caracterizados são os que ocorrem no decurso da terapêutica com lamivudina. Estes mutantes têm alterações no domínio catalítico "YMDD" da enzima polimerase, conferindo resistência à lamivudina e outros nucleosídeos relacionados (92). Os mutantes mais comuns resistentes à lamivudina têm uma alteração no codon 552 de M (metionina) para V (valina) (M552V) ou de M (metiolina) para I (isoleucina) (M552I) e são frequentemente acompanhados por uma alteração adicional no códon 528 de L (leucina) para M (metionina) (L528M) (89). As mutações no gene X têm uma prevalência e significado clínico incertos (57). 1.4.4 Replicação do VHB Embora não se conheça com exatidão os mecanismos deste processo, a replicação começa com a união do vírus a membrana do hepatócito através da proteína Pré-S1. O Envelope da partícula viral se funde com a membrana celular e é liberado no citoplasma o nucleocapsídeo (core), que se dirige ao núcleo (Figura 7). Dentro do núcleo da célula se completa a síntese da cadeia positiva (incompleta) do DNA viral, de tal forma que o genoma do VHB se converte em uma cadeia fechada 17 de DNA com ligações covalentes superespiraladas (cccDNA). Este cccDNA serve como base para transcrição do RNA viral (54). O RNA viral (pré-genômico), por sua vez, constitui o molde para a síntese de uma das cadeias da molécula de DNA (cadeia -) pela atividade enzimática da transcriptase reversa (polimerase do vírus), a qual ao mesmo tempo em que copia o RNA em DNA, o vai removendo através da atividade RNAse H que também possui. A digestão do RNA não é completa e o oligoribonucleotideo terminal, que inclui a seqüência repetida DR1 é translocado e emparelhado com a região DH2 perto do terminal 5’ da mesma cadeia negativa (-) onde atua como iniciador da síntese da cadeia positiva (+) (54, 89). Posteriormente, as progênies virais adquirem o envoltório, a partir das membranas intracelulares (retículo endoplasmático e o complexo de Golgi), quando então os virions podem retornar ao núcleo celular para continuar o processo de replicação genômica ou podem ser secretados (94). Figura 7: Esquema do ciclo replicação do vírus da hepatite B no hepatócito. Fonte: Liang, 2009 (5) 18 1.5 A Carga viral A quantidade do DNA-VHB no soro é proporcional à carga viral presente, estando, por tanto, associada à replicação viral. A pesquisa e a quantificação destas partículas são úteis para diagnosticar a replicação (infectividade), resposta a terapêutica específica e para detectar o DNA do VHB nos casos de hepatites crônicas anti-HBe reagentes (95). De forma geral, os portadores do VHB podem ser divididos em dois grupos: os HBeAg positivos (replicadores) ou os HBeAg negativos (não replicadores ou indivíduos que normalmente apresentam mutações no promotor pré-core ou core que não produzem HBeAg apesar da replicação viral). Os pacientes HBeAg positivos normalmente apresentam níveis de carga viral superiores àqueles HBeAg negativos. Entretanto, indivíduos HBeAg negativos mutantes com carga viral mais elevada tendem a apresentar doença e lesão hepática mais grave (87, 96, 97). O DNA do VHB pode ser detectado precocemente na fase aguda da hepatite viral B, persistindo no soro em altos níveis nas hepatites crônicas acompanhado do HBsAg, e em casos de hepatites fulminantes, quando o HBsAg estiver ausente (98). Os testes para ácido nucléico utilizam diferentes técnicas de quantificação da carga viral, seja pela técnica da captura híbrida, PCR ou PCR em Tempo Real (99). A metodologia se baseia na técnica da PCR: emprego de oligonucleotídeos, DNA molde, polimerase e nucleotídeo, no entanto, utiliza equipamento e corantes especiais, e procedimentos de otimização e adequações para um nível de sensiblidade muito maior. Trata-se de uma técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do número de moléculas produzidas ciclo a ciclo, então recebeu a denominação PCR em tempo real A metodologia se baseia na técnica da PCR: emprego de oligonucleotídeos, DNA molde, polimerase e nucleotídeo, no entanto, utiliza equipamento e corantes especiais, e procedimentos de otimização e adequações para um nível de sensiblidade muito maior (100). Comercialmente, estão disponíveis uma variedade de diferentes métodos que quantificam a carga viral do VHB, incluindo amplificação de sinal (Versant HBV 19 bDNA; Siemens Healthcare Diagnostics), PCR convencional (Amplicor HBV teste Monitor; Roche Diagnostics), e PCR em tempo real (Cobas AmpliPrep / Cobas TaqMan HBV teste [Roche Diagnostics] e RealTime HBV test Abbott RealTime: HBV IUO [Abbott Molecular] e Qiagen artus HBV TM ASR (101). Embora sejam rotineiramente utilizados no diagnóstico laboratorial, eles possuem algumas limitações na sensibilidade, na taxa linear, no volume das amostras e limite de detecção alto, como aqueles encontrados em pacientes em terapia antiviral ou com infecção oculta (102). Mais recentemente, uma nova metodologia conhecida como PCR em Tempo Real (Real Time PCR) foi desenvolvida. Trata-se de uma PCR cuja detecção dos amplicons (produtos da amplificação) é simultânea à amplificação. O DNA viral pode ser detectado em pequenos níveis, abaixo de 500 cópias/mL (103) ou < 50UI/mL (104) . A cinética de amplificação é dividida em três fases: Geométrica, Linear e de Platô. E para se detectar o produto de uma PCR ao longo do ciclo é preciso marcar o produto com um tipo de fluorescência, como por exemplo, o SYBR Green ou TaqManTM (105). Apresenta como vantagem a alta sensibilidade, alta capacidade de amplificar grande número de amostras simultaneamente, baixo risco de contaminação por produtos da PCR, larga faixa dinâmica de amplificação, alta precisão e reprodutibilidade, além de baixos custos. Na atualidade, este teste é de desenvolvimento próprio ou fornecido por algumas empresas, sendo o grande desafio para os laboratórios que utilizam metodologias de desenvolvimento próprio para PCR em tempo real, além da padronização são também a construção de um controle interno e a padronização de uma curva externa padrão. Os testes de carga viral para o VHB podem ter o resultado relatado em números absolutos ou logaritmo (log10). O resultado do exame também pode ser relatado em cópias por mL de amostra ou em unidades internacionais (UI) por mL de amostra, sendo que esta última é preferível. As UI surgiram a partir da necessidade de padronização da quantificação, já que uma amostra apresentava resultados consistentemente diferentes, quando se usavam metodologias diferentes. Foram então introduzidos padrões de DNA-VHB da Organização Mundial de Saúde. Desta forma são produzidos pelo National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) 20 controles feitos a partir de amostras positivas para o DNA-VHB com títulos altos de vírus (106). Pela sua importância, muitos esforços têm sido realizados para obtenção de melhores desempenhos destes testes, principalmente em relação à sensibilidade. Sabe-se que os níveis do DNA-VHB durante a fase de replicação viral intensa do vírus em geral estão acima de 10 4 cópias/mL. Níveis abaixo de 104 cópias/mL podem ser detectados em qualquer fase da doença, mesmo na convalescença (107). A determinação da carga viral é muito útil em acompanhar a progressão da doença, conhecer os níveis do DNA-VHB no pré-tratamento, em monitorar a resposta dos antivirais e indicação de falha terapêutica – resistência às drogas (103, 108, 109). 1.6 Infecção oculta pelo VHB Com o desenvolvimento das técnicas da biologia molecular, estudos foram conduzidos e contribuíram para o melhor conhecimento do VHB, bem como a sua variabilidade genética, o que também conduziram à revisão dos padrões sorológicos desta doença. Baseado em achados sorológicos e biomoleculares são classificados em três, os estados de persistência viral (110): hepatite B crônica - persistência do HBsAg no soro por mais de seis meses, associado com a presença do HBeAg e do DNA-VHB, carga viral e aminotransferases elevadas; portador assintomático – presença do HBsAg no soro por mais de seis meses, HBeAg negativo, presença do DNA-VHB e baixos níveis da carga viral e aminotransfeases; hepatite B oculta – presença do DNA-VHB no soro e/ou fígado, com HBsAg não detectáveis no soro (111). A infecção oculta pelo VHB é definida como a detecção do DNA-VHB no soro e/ou no tecido hepático de indivíduos negativos para o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) (107, 111). O diagnóstico dessa nova entidade clínica dá-se pela sorológica e o baixo nível do DNA-VHB (carga viral) no soro, média de 102-3 cópias/mL, comparado com níveis de 104, em portadores assintomáticos 21 (HBsAg reativo/HBeAg negativo) e 108 cópias/mL, nos pacientes com hepatite crônica (HBsAg positivo/HBeAg positivo) (112-114). A hepatite B oculta, frequentemente é mais evidenciada em pacientes com o anti-HBc total como único marcador sorológico (107, 115, 116). Entretanto, também foi observada em pacientes com o anti-HBs, ou até sem qualquer marcador sorológico de infecção pelo VHB (115, 117, 118). É importante ressaltar que a presença do anti-HBc total isolado pode ocorrer em outras situações que não caracteriza a hepatite B oculta: reação sorológica falso-positiva, e o período não detectáveis, compreendido entre o início da soroconversão do HBsAg para o antiHBs (119-121). Considerando que a região Amazônica, de longa data, é uma das mais importantes áreas de elevada endemicidade do vírus da hepatite B no mundo, onde esta infecção constitui grave problema de saúde pública e assume características epidemiológicas e clínicas peculiares. Relatos de surtos familiares de uma forma grave de hepatite fulminante, chamada popularmente de “Febre Negra de Lábrea”, motivaram o início dos estudos das hepatites na Amazônia ocidental, a partir do final da década de 50. Com isso, medidas de controle e prevenção como a vacinação em massa contra a hepatite B, foram adotadas na região, desde o início na década de 90, em crianças menores de dez anos de idade. Investimentos financeiros do governo estadual e federal, por meio de projetos de pesquisa possibilitaram investigações, 14 anos após a introdução da vacina contra hepatite B, por meio de inquéritos soroepidemológicos para os vírus das hepatites A, B, C e Delta no município de Lábrea, em populações das zonas urbana e rural, e áreas indígenas, bem como estudos sobre a biologia molecular, na caracterização dos genótipos do vírus da hepatite B mais prevalentes, demonstrando que os genótipos A e F são os mais prevalentes e, o menos frequente, o genótipo D. No entanto, estes estudos ainda são escassos, por isso da necessidade de se ampliar o conhecimento da diversidade genética, através das análises filogenéticas, e da epidemiologia molecular de cepas do vírus da hepatite B. 22 Neste cenário, a proposta deste estudo foi realizar um estudo pioneiro na região, que tem o objetivo de caracterizar os aspectos biomoleculares do vírus da hepatite B, através da determinação dos genótipos circulantes e mutações no genoma, infectividade/progressão da doença, pela determinação da carga viral e, finalmente, para que se possa traçar um perfil epidemiológico e avaliar o impacto desta infecção, entre as populações localizadas na área rural de Lábrea. (comunidades) isoladas (ribeirinhos), 23 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Determinar os aspectos da epidemiologia molecular da infecção pelo vírus da hepatite B em população ribeirinha da calha do rio Purus, no Município de Lábrea, Amazonas, Brasil. 2.2 Específicos Determinar a prevalência de marcadores sorológicos de infecção pelo VHB na população do estudo; Determinar a prevalência da infecção oculta pelo VHB, em amostras de soro de indivíduos que apresentam padrão sorológico HBsAg negativo e anti-HBc positivo co-infectados ou não pelo VHC e/ou VHD; Identificar os genótipos do VHB na população de estudo; Avaliar a freqüência de mutações no gene de superfície (S) e os genótipos do VHB identificados; Quantificar o DNA viral sérico nas amostras da população do estudo; Correlacionar os dados epidemiológicos e da biologia molecular do VHB. 24 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Modelo de estudo Estudo descritivo com a determinação da prevalência de infecção e caracterização molecular do vírus da hepatite B (VHB), utilizando técnicas moleculares para a detecção do DNA-VHB, em amostras procedentes de três comunidades ribeirinhas de alta prevalência do VHB, no município de Lábrea, Amazonas. 3.2 Local de estudo e descrição da área O município de Lábrea (Figura 8) está localizado na região sul do estado do Amazonas (7º15´35,99”S/ 64º48´36,28” W), no vale do rio Purus, afluente da margem direita do rio Solimões. Distante da capital do Estado, Manaus, a 783 km em linha reta e 1.926 km por via fluvial, está localizado a 75 m acima do nível do mar, e compreende uma área de 68.234 Km2. Segundo o Censo Demográfico Brasileiro de 2010, a população é de 37.701 habitantes (13.494 habitantes na zona rural e 24.207 na urbana). É uma região pouco habitada com uma densidade demográfica de 0,55 habitantes por quilômetro quadrado (122). Nos últimos anos a região sul do estado do Amazonas vem ganhando notoriedade na mídia local e internacional, devido à grande parte do desmatamento recente está concentrado em áreas localizadas em alguns municípios da região. Dados mostram que essa área concentrou até 2004 aproximadamente 30% do total no Estado. O processo de expansão da fronteira agropecuária corresponde aos processos migratórios oriundos dos estados vizinhos ao longo das BR-364 e BR317, impulsionado pela expansão da pecuária e pela extração predatória de madeira, bem como a implantação de culturas de grãos, com alta tecnologia e investimentos empresariais (123). No Município de Lábrea foram estimados, pelo IBGE, para o ano de 2009, indicadores sociais e de morbimortalidade nada animadores, como: o número de óbitos em menores de 1 ano é o dobro em relação a média do Estado (1,5%); tem alta taxa de analfabetismo (15 anos ou mais) de 41% e uma altíssima taxa de mortalidade materna (141 óbitos maternos por 100.000 nascidos vivos). Na 25 população urbana, menos da metade (48%) tem cobertura de rede de abastecimento de água, e menos de 30% tem sistema de esgotamento sanitário e coleta de lixo. No entanto 4,35% das mortes estariam associadas às doenças infecciosas e parasitárias, índice abaixo da média nacional (5,15) e do Estado (7,88). (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2000) Figura 8: Localização do município de Lábrea, no mapa do Estado do Amazonas. Fonte: http://www.manausonline.com/municípios_detalha. asp?id_mun=35 3.3 Definição dos sujeitos da investigação 3.3.1 População de estudo A população alvo deste estudo consiste na população das comunidades ribeirinhas: Madeirinho, Sumaúma e Praia do Buraco, município de Lábrea, Estado do Amazonas, Amazônia ocidental, Brasil. 3.3.2 Tamanho da amostra Nestas populações ribeirinhas foi identificado, através de um inquérito soroepidemiológico anterior, realizado entre os anos de 2005 a 2008, padrões de alta e média endemicidade (37 a 6,5%) de infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) (124). Pelo fato dessas populações reconhecerem o problema, comumente são receptivas à pesquisa. Foram coletadas amostras de todos os indivíduos presentes, optou-se 26 por trabalhar com toda a população das comunidades, inclusive aqueles que haviam participado do inquérito soro-epidemiológico anterior. 3.3.3 Critérios de inclusão Amostras procedentes da população ribeirinha da calha do rio Purus, de todas as faixas etárias, ambos os gêneros, residentes nas comunidades Madeirinho, Sumaúma e Praia do Buraco, no município de Lábrea, Amazonas. Amostra que apresentar o marcador sorológico HBsAg-reativo e/ou anti-HBc-reativo isolado. Detecção do DNA-VHB no sangue, pela técnica da PCR, independentemente de sua concentração no soro. 3.3.4. Critérios de exclusão Não concordância em participar do estudo; Pessoas que utilizam ou utilizaram qualquer tipo de tratamento antiviral nos últimos seis meses. 3.4 Procedimentos 3.4.1. Coleta de informação e consentimento Após esclarecimentos sobre os objetivos da pesquisa e obtenção do consentimento formal de inclusão na pesquisa (Anexo 6.1), foi realizada uma entrevista e utilizou-se como instrumento de investigação um questionário individual estruturado (Anexo 6.2), onde foram anotados os dados sociodemográficos, epidemiológicos, história pregressa de hepatite e na família, outras infecções atuais e passadas e imunização contra hepatite B. 3.4.2. Coleta, procedimento e armazenamento das amostras biológicas Amostra do sangue venoso de cada participante foi coletada, no mesmo momento, em dois tubos a vácuo identificados por ordem numeral crescente: um sem conservantes e aditivos, para obtenção do soro e outro contendo EDTA k 3, para 27 o plasma e células mononucleadas de sangue periférico, com 5 mL cada. Após a retração do coagulo em temperatura ambiente, os tubos são centrifugados a 3000 rpm, por 05 minutos, para separação do soro e do plasma. As amostras foram divididas em duas alíquotas cada, sendo a de soro utilizada para as determinações sorológicas, e a de plasma para os ensaios das técnicas de biologia molecular prevista no estudo. Imediatamente após o processo de separação e alíquotas, estas foram mantidas a -20ºC, tanto no campo como no Laboratório de Lábrea. Para a coleta, processamento e transporte das amostras do campo, até Manaus, foram adotados medidas de biossegurança e conservação. Estas amostras encontram-se estocadas a -80ºC, na Gerência de Virologia da Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD). 3.5 Diagnóstico laboratorial 3.5.1 Determinação e classificação sorológica dos participantes A determinação dos marcadores sorológicos para a pesquisa de infecção dos vírus da hepatite B (Anti-HBs quantitativo, anti-HBc total, HBsAg, anti-HBc total, HBeAg, anti-HBe), e anticorpos contra o vírus da hepatite A (anti-HAV, total), da hepatite C (anti-HCV) e da hepatite Delta (anti-HD total) foram realizados por meio de conjunto de reagentes (kits) comerciais, do tipo imunoenzimático em fase sólida (ELISA) (DiaSorin, S.p.A. – Saluggia, Itália), de acordo com o manual do fabricante. Estes exames são realizados de rotina no Laboratório de Análises Biológicas da Secretaria Municipal de Saúde de Lábrea, e classificados como mostra a Tabela 3. Considerando que o presente estudo tem com base o inquérito soroepidemiológico, os resultados da sorologia foram entregues aos respectivos participantes, em forma de laudos, que constava o nome, localidade e listagem dos marcadores sorológicos para hepatites A, B, C e D testados. Os resultados foram qualificados como positivo (soro reagente) e negativo (soro não reagente). Sendo o anti-HBs possível a quantificação, este foi anotado e interpretado como reativo, títulos >10 UI/mL, seguindo a recomendação da OMS (125). Consequentemente este tipo de estudo identifica inicialmente, pelo diagnóstico sorológico, a presença de infecção nos indivíduos participantes. Naqueles em que se identificou a presença de infecção, o laudo expedido aconselhava a necessidade do participante, procurar os 28 colaboradores do projeto, na Unidade Hospitalar de Lábrea na sede do município. Estes eram encaminhados para consulta médica e avaliação clínica, laboratorial, confirmação sorológica e condutas. Para aqueles identificados como susceptível a infecção pelo VHB, isto é não reagente para o anti-HBs, foi indicado à vacinação contra hepatite B. Tabela 3 – Modelo classificatório, adotado pelo estudo, para as amostras dos indivíduos submetidas aos testes sorológicos Marcador (+) Significado Anti-HAV total Infecção passada pelo VHA HBsAg Infecção presente pelo VHB HBsAg e anti-HBc total Hepatite B crônica HBeAg Replicação viral Anti-HBe Fim da fase replicativa Anti-HBc total isolado Infecção passada pelo VHB Anti-HBs isolado Imunidade por vacina Anti-HBc total e anti-HBs Imunidade por contato com o VHB Anti-HCV total Infecção pelo VHC Anti-HD total Infecção pelo VHD 3.5.2 Detecção do DNA-VHB Os ensaios foram realizados no Laboratório da Gerência de Virologia e Laboratório de Pesquisa em Doenças Endêmicas da FMT-HVD empregando-se a técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR), pela estratégia semi-nested, segundo (83). As características gerais do ensaio são descritas a seguir: 3.5.2.1 Extração do DNA-VHB a partir do plasma sanguíneo Para a extração do DNA-VHB, 200 μL de plasma foram adicionados 30 μL contendo 2 mg/mL de Proteinase K e solução de lise (AL). A mistura será incubada por 24 horas a 56°C, em termobloco. O DNA viral foi purificado utilizando-se o conjunto de reagentes Qiamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA). Após a incubação, foram realizados de acordo com as instruções do 29 fabricante, salvo que o DNA total foi eluído em 50 μL em água pura livre de DNAse/RNAse, e mantidos a -80ºC. Posteriormente, realizou-se a leitura espectrofotométrica das soluções nos comprimentos de onda 260 e 280 nm (nanômetros) para a determinação da concentração de DNA total em cada amostra extraída e de uma estimativa do seu grau de pureza, a partir da relação A260/A280, em espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc. USA ). 3.5.2.2 Seleção de Oligonucleotídeos para a PCR e PCR em tempo real Os oligonucleotídeos foram desenhados para a região do Gene S do VHB, pelo programa PRIMER 3, desenvolvido pelo Whitehead Institute e Howard Hughes Medical Institute, EUA, e considerados os seguintes parâmetros: tamanho dos oligonucleotídeos, conteúdo de G/C, temperatura de hibridização e tamanho do amplicon. Utilizou-se também, o programa de comparação de seqüências BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, para determinar a combinação de oligonucleotídeos mais específica. A sequencia do protótipo foi HVHEPB genoma completo do VHB, de acesso nº X51970.1 do GenBank. Selecionou-se oligos aplicados em estudos, e que foram divulgados na literatura científica. Os oligonucleotídeos utilizados no estudo foram sintetizados por empresas especializadas. Os oligonucleotídeos sintetizados foram inicialmente testados na temperatura de hibridização desejada, pelo método da PCR convencional. A confirmação do produto da amplificação foi verificada em gel de agarose corado com brometo de etídeo. 30 Tabela 4 - Seqüências dos oligonucleotídeos pré-selecionados Nome do Oligo Sequência α-tubulina L 5’-CAC CCG TCT TCA GGG CTT CTT GGT TT-3’ α-tubulina R Fragmento (pb) 400 (126) 5’-CAT TTC ACC ATC TGG TTG GCT GGC TC-3’ S56 Referência 5’-CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA-3’ 208 S264 5’-GTC CAC CAC GAG TCT AGA CTC T-3’ 783 5’-CTC ACG ATG CTG TAC AGA CTT-3’ 2821 5’-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’ P1 5’- GCC TCT CAC ATC TCG TCA AT -3’ Não publicado 1200 (83) 680 3.5.3 Reação da polimerase em cadeia Foram tomadas as precauções para evitar a contaminação cruzada durante o isolamento do DNA, preparação das misturas da PCR e eletroforese em gel. Os controles negativos foram incluídos desde a extração para cada ensaio. A amplificação do HBV-DNA para cada isolado foi realizada pelo menos duas vezes, por meio da escolha de diferentes regiões para se excluir resultados falso-positivos e falso-negativos. Como controle externo de validação do DNA extraído utilizou-se marcadores moleculares de cromossomos humano, descritos na literatura, que amplificam uma região da α-tubulina, de acesso nº X01703 do GenBank (126) (Tabela 4). Os ensaios da PCR foram processados em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient, às seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos, seguido de 35 ciclos compostos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, hibridização a 60°C por 40 segundos e extensão a 72°C por 50 segundos, e extensão final a 72°C por 10 minutos. O tamanho esperado do fragmento amplificado é de aproximadamente 400 pb. Inicialmente, para a detecção da presença do DNA-VHB, optou-se em amplificar um fragmento pequeno (208 pb), a fim de se aumentar sensibilidade, que 31 corresponderá ao gene Pré-S, com os oligonucleotídeos S56 e S264 (Tabela 4). Os ensaios da PCR foram processados em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient às seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido de 40 ciclos compostos de desnaturação a 95°C por 30 segundos, hibridização a 60°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 30 segundos, e extensão final a 72°C por 5 minutos. Para a classificação do genótipo (genotipagem) do VHB, o DNA viral foi amplificado pela estratégia “semi-nested” PCR, sendo a primeira reação realizada com 5 μl do DNA eluído, utilizando os oligonucleotídeos 783-2821, e a segunda da PCR, com 1L do produto da primeira reação, utilizando os oligonucleotídeos P1783 (Tabela 4). O fragmento resultante da amplificação com 783-2821, de aproximadamente 680 pb (pares de bases), corresponde ao gene S, região pré-S1 e pré-S2. Os ensaios da PCR com os oligonucleotídeos externos 783-2821 e internos P1-783 foram processados em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient às seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos compostos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, hibridização a 57,1°C por 2 minutos e extensão a 72°C por 30 segundos, e extensão final a 72°C por 7 minutos. Os ensaios de PCR com os oligonucleotídeos internos 783-2821 foram realizados nas mesmas condições. Todos os ensaios da PCR foram realizados em um volume final de 25 μl de solução de amplificação (25 mM de MgCl2, 10 mM de dNTPs, 10 pmol de cada oligonucleotídeo) e 1U de Taq DNA polimerase. Para estes ensaios também foram utilizados misturas do tipo PCR Master Mix (TopTaq PCR Master Mix – Qiagen Sciences, Maryland, USA), comercializadas para tal fim. Os produtos da PCR das regiões do VHB (Pré-S e S) foram estocados a 20°C, até o seqüenciamento dos nucleotídeos dos fragmentos amplificados. 3.5.3.1 Avaliação eletroforética dos produtos de amplificação A partir da obtenção dos produtos da reação da PCR, alíquotas de 5 µL foram adicionados a 2 µL do tampão de amostra (0,25% azul de bromofenol, 25% xileno cianol e 30% glicerol em H2O) 6X (seis vezes concentrado), e utilizados marcadores de peso molecular "Ladder 100pb” (Invitrogen Carlsbad, CA, USA), que foram 32 analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose, adicionado o brometo de etídeo (10mg/ml), submerso em cuba horizontal com tampão TBE 1X (estoque 10X Tris (1,0M), ácido bórico (0,9M) e EDTA (0,01M) pH 8,4) (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) , aplicado uma corrente elétrica (100V), para migração, até aproximadamente, 2/3 da área do gel. As bandas foram visualizadas por meio da incidência de radiação ultravioleta em uma câmara escura, equipada com um transluminador e uma câmera fotográfica digital para aquisição das imagens, e arquivadas em um Os produtos da PCR amplificados foram quantificados (ng/µL) em microcomputador. 3.5.4 Seqüenciamento direto espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc. USA). Definido as concentrações para cada amostra, estas foram amplificadas utilizando-se os reagentes e protocolo “Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), no termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient. ), e posteriormente purificados, por kits de purificação comercial BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), a fim de se eliminar bases não incorporadas e reagentes excedentes. O seqüenciamento e a leitura automática das seqüências serão feitos no analizador genético, modelo DNA analyzer 3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), em placas ópticas de 96 amostras. Em cada orifício da placa foram adicionados entre 30 a 100ng/µL de DNA. Para melhor análise e consistência dos resultados, ambas as fitas de DNA foram seqüenciadas, utilizando-se um único oligonucleotídeo por reação (senso ou antisenso) que foram empregados no presente estudo para genotipagem do VHB. 3.5.4.1 Análise das seqüencias A análise das seqüências obtidas neste estudo foram feitas por meio dos algoritmos do programa BioEdit Sequence Alignment Edit, versão 7.0.9.0 (Hall 1999), para edição manual, alinhamento dos nucleotídeos e tradução das seqüências de aminoácidos, convertido em um arquivo FASTA. Cada amostra seqüenciada foi alinhada com outras seqüências obtidas neste estudo, e outras 33 conhecidas e disponíveis no GenBank, utilizando a página na internet Genotyping do National Institute of Health (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi), onde há ferramentas específicas para genotipagem viral do VHB. Para o alinhamento múltiplo dos nucleotídeos e construção da árvore filogenética para as regiões do VHB (Pré-S e S), utilizou-se o programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versão 5.0 (127), e as sequencias depositadas no GenBank. Para a caracterização de variações no genoma do VHB, as sequencias nucleotídicas foram analisadas em dois algorítimos internacionais de repositório de estirpes do VHB: HepSEQ - (http://www.hepseq.org/Public/Web_Front/main.php) e HBVseq - (http://hivdb.stanford.edu/HBV/HBVseq/development/HBVseq.html), que caracterizam mutações no gene da polimerase (transcriptase resversa). Para a caracterização das variações no gene S, as sequencias foram alinhadas çom sequencias de referencia do GenBank. 3.5.5 Reação da polimerase em cadeia em tempo real O sistema de escolha para a detecção foi o Maxima® SYBR Green qPCR Master Mix (2X) (Fermentas - Thermo Fisher Scientific Inc. USA), agente fluorescente que se intercala em fitas duplas de DNA. A reação (25 µL) consistiu na mistura de 12,5 µL SYBR Green qPCR Master Mix (2X), 10 pmol de cada primer S56/S264 e 5 µL do DNA purificado. A reação da PCR consistiu na desnaturação inicial em dis passos de 50°C por 2 min e 95°C, por for 10 min, seguido de 45 ciclos de 95°C por 30 seg, 60°C por 1min, e 72°C por 30 seg. Os dados foram coletados usando ABI Prism 7500 Fast sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Para o controle negativo de amplificação, adotou-se uma mesma mistura de reagentes das amostras experimentais, sem o DNA, na mesma placa óptica, a fim da possibilidade da exclusão de contaminação. 34 4.5.5.1 Curvas de dissociação A curva de dissociação foi programada para ser realizado após a reação de qRT-PCR, para que se possa determinar a especificidade dos produtos de PCR formados. Reações que apresentarem curvas de dissociação com picos de Tm menores que o produto de PCR específico (formação de dímeros de oligonucleotideos). Os gráficos da curva de dissociação foram fornecidos pelo programa Dissociation Curve 2.0 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). 4.5.5.2 Detecção quantitativa do DNA-VHB Nas amostras HBsAg-positiva, os níveis do DNA do VHB foram quantificados, utilizando-se o teste comercial COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B virus (HBV) (CAP/CTM 48; Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), sistema de plataforma totalmente automatizado para quantificação do DNA-VHB DNA em amostras de plasma, que assegura ter um limite inferior de detecção de 12 UI/mL e um limite superior de quantificação do 1,10×108 UI/mL, e fator de conversão igual a 5,82 cópias/UI. 35 Figura 9 – Fluxograma para os testes laboratoriais 36 3.6 Análise dos dados Os dados serão registrados em planilha do programa Microsoft Office Excel 2007. Análises estatísticas serão conduzidas utilizando-se softwares, incluindo o Epi-Info e SPSS. A análise dos dados se dará com descrição estatística simples: cálculo de razões e prevalência, e respectivos intervalos de confiança ao nível de 95% para validar essas proporções encontradas. O efeito da exposição ao fator de risco de interesse, por níveis crescentes de exposição, será avaliado pelo teste do Qui-quadrado (X2) de tendência. Associações entre a exposição a um fator e a presença de marcador sorológico foram avaliadas por razões de prevalência (RP). O controle de possíveis variáveis de confusão durante a análise dos resultados é feito por estratificação, avaliando a associação para cada categoria ou estrato da variável de confusão, bem como estimativas gerais após ter sido considerado o efeito do fator. Possíveis modificadores de efeito podem ser identificados e relatados durante análises estratificadas e avaliadas por testes de Qui-quadrado (X2) de homogeneidade. Todos os cálculos serão considerados como tendo significado estatístico quando a probabilidade - o valor de p<0,05 ou o valor nulo - estiver fora do intervalo de confiança. 3.7 Instituições participantes Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Fundação Nacional de Saúde (FUNASA), Secretaria de Saúde do Estado do Amazonas (SUSAM), Secretaria de Saúde do Município de Lábrea (SEMSA). 3.8 Certificado de aprovação no Comitê de Ética e Pesquisa O presente projeto está associado a dois projetos de maior amplitude designados: “Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na saúde pública”, (aprovado pelo Comitê de Ética da FMTAM – processo Nº 2957/2003-FMTAM) (Anexo 6.3a), que tem como objetivo geral, determinar a prevalência de marcadores sorológicos de infecção presente e passada do vírus da hepatite B (VHB), vírus da hepatite C (VHC), vírus da hepatite Delta (VHD) e vírus da hepatite A, na zona rural do município de Lábrea (rio Purus), quatorze anos após a introdução da vacina contra hepatite B na região; “Febre Negra de Lábrea: O papel das populações 37 indígenas na epidemiologia da hepatite B e Delta” (aprovado pelo Comitê de Ética da FMTAM – processo Nº 2090/2005-FMTAM) (Anexo 6.3b), que tem como objetivo geral estudar a biologia molecular dos vírus das hepatites B e Delta, em populações indígenas do município de Lábrea, Amazônia Ocidental brasileira. 38 4 RESULTADOS 39 40 41 42 43 44 Errata, Anexo 93 45 SHORT COMMUNICATION Pouca evidência da ocorrência de infecção B oculta em população geral de área endêmica do vírus da hepatite B, na Amazônia Ocidental brasileira Márcia da Costa Castilho1,2, Cintia Mara Costa de Oliveira1,2, João Bosco de Lima Gimaque1,2, Heline Lira Vasconcelos1, Wornei Silva Miranda Braga1,2 1. Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Gerência de Virologia, Manaus, Amazonas, Brasil 2. Universidade do Estado do Amazonas, Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, Manaus, Amazonas, Brasil RESUMO A Amazônia Ocidental brasileira é uma região endêmica para a infecção pelo vírus da hepatite B (VHB). Este estudo propõe-se a identificar a ocorrência de infecção B oculta, em populações isoladas da Amazônia Ocidental brasileira. Tratase de um estudo de base populacional, de inquérito sorológico realizado em 2008. A técnica empregada para detecção do DNA-VHB foi a PCR em tempo real, contudo o DNA-VHB foi detectado apenas nos isolados com infecção presente (HBsAgreativas), e em nenhuma amostra de indivíduos com infecção passada, o que mostra a baixa prevalência de infecção B oculta na população estudada. INTRODUÇÃO A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 2 bilhões de pessoas estão infectadas com o vírus da hepatite B (VHB), destas 400 milhões são portadoras crônicas da hepatite B. 1 A Amazônia brasileira é descrita como uma das regiões, no mundo, mais prevalentes da infecção pelo VHB. 2-5 46 A infecção B oculta (IBO) é definida como a detecção do DNA-VHB no tecido hepático, ou no soro em baixos títulos, de pacientes negativos para o HBsAg, 6,7 e é comumente relatado a ocorrência e a elevada prevalência, entre populações de risco específicos, tais como: usuários de drogas injetáveis, 8,9 doenças e/ou tratamentos que causam imunossupressão hemodialisados,10,11 12,13 e hepatopatias crônicos sem etiologia definida14 . Esta forma de IBO é, também relatado nas coinfecções com outros vírus VHC,15 HDV,16 HIV.17,18 No entanto, em população geral é pouco estudado. O objetivo do presente estudo foi descrever a ocorrência da IBO, em três comunidades isoladas procedentes da Amazônia Ocidental brasileira, caracterizada como área de alta prevalência de infecção pelo VHB (79,1%) e de portadores crônicos (10,2%).19 Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus, Amazonas, Brasil (No.:1775/2006/FMT). MATERIAIS E MÉTODOS Este estudou avaliou 57 amostras de sangue coletadas no inquérito soroepidemiológico realizado em junho de 2008, em três comunidades ribeirinhas, (Madeirinho, Sumaúma e Praia do Buraco), no Município de Lábrea, Estado do Amazonas. Todas as amostras reativas para o anti-HBc total, negativas e/ou positivas com títulos < 10UI/mL do anti-HBs foram extraídos o DNA-VHB, a partir de uma amostra de 200 uL de plasma, utilizando-se o QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN, AG, Basel, Switzerland), modificado aumentando-se o tempo de incubação com Proteinase K para, no mínimo 6 horas. O DNA-VHB foi detectado, inicialmente, pelo 47 sistema de detecção da PCR em tempo real (RT-PCR) ABI 7500 Fast (Applied Biosystems). Na reação foi adicionada uma mistura de SYBR-Green (Qiagen, Hilden, Alemanha) e as sequencias iniciadoras S56 [senso] (5’-CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA-3’) e S264 [anti-senso] (5’-GTC CAC CAC GAG TCT AGA CTC T-3’), desenhadas para a região do gene S ( pré-S2/S) do genoma do VHB, e amplificar um produto de 208 pares de base (pb), nas seguintes condições temperatura, tempo e ciclos: 50 ° C, por 2 minutos e 95 ° C, durante 10 minutos; seguidos por 45 ciclos de 95 ° C, durante 30 segundos, 60 ° C, durante 1 minuto e 72 ° C, durante 30 segundos. Posteriormente, as amostras positivas no sistema RT-PCR desenvolvido, o DNA-VHB foi quantificado em sistema comercial totalmente automatizado COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B virus (HBV) em se utilizou o teste (CAP/CTM 48; Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), que apresenta um limite inferior de 12 UI / mL (fator de conversão = 5,82 cópias / UI). RESULTADOS Do total de amostras avaliadas em 47,4% (27/57) dos isolados foi identificado a presença do VHB-DNA, pela técnica da PCR em tempo real desenvolvida, e em 23/57 (40,3%) confirmadas pela qRT-PCR comercial, sendo todas estas amostras dos isolados reativas, também para o HBsAg, em que não foi identificado a infecção oculta pelo VHB, nesta população de estudo. 48 DISCUSSÃO CONCLUSÃO Apesar de a Amazônia ocidental ser considerada uma das regiões do mundo de maior prevalência de infecção pelo VHB, ainda pouco se sabe sobre a infecção B oculta. Com o desenvolvimento das técnicas empregadas no estudo da biologia molecular possibilitou a identificação do VHB-DNA, o que permite compreender melhor a epidemiologia da infecção. No presente estudo a técnica da RT-PCR utilizada na detecção do VHB, com sistema SYBR-Green, mostrou-se sensível, porém pouca específica, uma vez que 4 amostras foram consideradas positivas. Este resultado é esperado devido o sistema apresentar sinais falso-positivos, pois os fluoróforos ligam-se a qualquer dupla-fita de DNA, além da sequência alvo, principalmente após vários ciclos. 20 Este trabalho pode ser considerado pioneiro na busca de evidencias da infecção B oculta, em populações remotas da Amazônia Ocidental brasileira. Nos grupos populacionais, em geral, é descrito a IBO de forma heterogênea na sua prevalência, o que se observa é que não obrigatoriamente, esta forma de infecção segue os mesmos padrões de prevalência infecção do VHB pelo mundo, como no continente Asiático como a Indonésia (12,5%), 21 Hong Kong (0,13%) doadores de sangue na Coréia (0,7%); 23 22 e pré- na Europa, entre os imigrantes na Itália (3,2%);24 países do Continente Americano: México (14,2%), 25 nos Estados Unidos da América, naqueles com evidencia de infecção prévia (18%) e sem evidencia (8,1%)26 e entre os Ameríndios na Argentina.27 No Brasil é relatado a IBO em comunidades afrodescendentes (1,7%) rural (6,5%) 29 28 e no estado da Bahia, e 0% em pré-doadores de sangue em Porto 49 Alegre.30 Na região Amazônica, no estado do Amazonas, foi detectado a presença do DNA-VHB (17%), em portadores de hepatopatia crônica de etiologia desconhecida, com associação positiva a presença de icterícia e a coinfecção com o HIV.31 Conclui-se que a prevalência da IBO é baixa na população de estudo. Embora, o estudo tenha sido realizado em área considerada de alta prevalência de infecção pelo VHB, em que não foi identificado a infecção B oculta, entre os participantes, com evidencias sorológicas de contato prévio com VHB (anti-HBcreativo). REFERÊNCIAS 1.World Health Organization, 2002. Hepatitis B. http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/HepatitisB_whocdscsrlyo2002_2.pdf 2. Braga WSM, Brasil LM, Souza RAB, Melo MS, Rosas MDG, Castilho MC, Fonseca JCF, 2004. Prevalência da infecção pelos vírus da hepatite B (VHB) e da hepatite D (VHD) em Lábrea, Rio Purus, Estado do Amazonas. Epidemiologia e Serviços de Saúde 13: 35-46. 3.Braga WSM, Castilho MC, Borges, FG, Martinho ACS, Rodrigues IS, Azevedo EP, Scazufca M, Menezes PR, 2012. Prevalence of hepatitis B virus infection and carriage after nineteen years of vaccination program in the Western Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop 45: 13-17. 4. Parana R, Almeida D, 2005. HBV epidemiology in Latin America. 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Barros Júnior GM, Braga WS, Oliveira CM, Castilho MC, Araújo JR Hepatite crônica B oculta: prevalência e aspectos clínicos em população de elevada endemicidade de infecção pelo vírus da hepatite B na Amazônia ocidental brasileira. Rev Soc Bras Med Trop. 41: 596-601, 2008. 53 ORIGINAL PAPER Filogenia e caracterização do genótipo F do vírus da hepatite B (F/VHB) em comunidades remotas da Amazônia ocidental brasileira Márcia da Costa Castilho1,2, Cintia Mara Costa de Oliveira1,2, Rajendranath Kamasawmy1, Wornei Silva Miranda Braga1,2 1. Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Gerência de Virologia, Manaus, Amazonas, Brasil 2. Universidade do Estado do Amazonas, Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, Manaus, Amazonas, Brasil RESUMO Com base nas características moleculares do VHB, este estudo propõe-se em classificá-lo filogenéticamente, bem como descrever as variações no seu gene de Superfície (S), nas sequências nucleotidicas procedentes de área endêmica de infecção, da Amazonia Ocidental Brasileira. Materiais e Métodos: Foram estudas 13 sequências parciais do DNA-VHB, previamente classificadas como genótipo VHB/F, isoladas de portadores crônicos do VHB (HBsAg-reativo), de um inquérito soroepidemiológico, em três comunidades ribeirinhas remotas, do estado do Amazonas, Brasil. As sequências foram alinhadas com as de referência depositadas no GenBank. Utilizou-se os programas BioEdit para alinhamento, Mega 5 para a análise filogenética, além dos algoritmos HepSEQ e HBVSeq para caracterização de mutações. Resultados: Todos as sequencias foram classificadas como genótipo F/F2a. Foram detectadas variações polimórficas no gene S/VHB, no dominio da transcriptase reversa (rt), em 11 dos isolados, foi observado um padrão de mutações (rtE11Q + rtsH13Y + rtM129L + rt137TS). Destas, 10 com presença de viremia (HBeAg-reativo e carga viral elevada). Um isolado apresentou a mutação na posição 184 (rtA184V). No gene do envelope foram encontradas mutações, porém não associado à expressão do HBsAg (determinante “a”). Conclusão: Este estudo descreve a predominância do subgenótipo VHB/F2a, e pela primeira vez as variantes polimórficas naturais, numa população de elevada endemicidade, da Amazônia Ocidental brasileira. 54 INTRODUÇÃO A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 2 bilhões de pessoas estão infectadas com o vírus da hepatite B (VHB), destas 400 milhões são portadoras crônicas da hepatite B. 1 A região Amazônica é descrita como uma das regiões, no mundo, mais prevalentes da infecção pelo VHB. 2-5 O VHB é um vírus DNA da família Hepdanaviridae, o genoma é dupla fitaparcialmente circular, composto de aproximadamente 3.200 nucleotídeos (nt), com 4 aberturas de leitura (ORF) que codificam os genes P, préC/C, préS1/préS2/S e X. 6 Com base nas diferenças genéticas (> 8%), entre as sequencias completas, e do antígeno de superfície ( > 4%) entre os grupos, 7 o VHB, atualmente, é classificado em 10 genótipos (A-J), na sua maioria, com distribuição geográfica restrita. 8 O genótipo A é de distribuição global, principalmente descrito na Europa, América do Norte, África e Índia. Os genótipos B e C são característicos da Ásia, enquanto o genótipo D tem distribuição mundial, e predomina nas regiões do Mediterrâneo. Os genótipos E é encontrado no continente Africano e o F nas populações indígenas da América do Sul. O genótipo G nos Estados Unidos, México e França, o genótipo H, nos países da América Central, 9 e recentemente, dois novos genótipos foi proposto: o genótipo I descrito no Vietnam 10 e o J no Japão.11 No entanto, a origem e a história evolutiva do VHB e, em particular, do genótipo F, típico do continente americano, ainda são incertas, 12 e o conhecimento da disseminação do HBV/F na América permanece indescritível. 13 O que se conhece da literatura é a distribuição geográfica do genótipo F, que ocorre desde o Alaska até a Argentina, relatado de forma quase exclusiva, como característico das populações indígenas. É classificado em 4 subgenótipos (F1 a F4). 14 O F1 é encontrado no Alaska, Argentina e Brasil; O F2 é prevalente na Venezuela e Brasil, 55 e o F3 na Venezuela, Colômbia e Panamá, e o genótipo F4 é referido na Argentina e Bolívia.14 Os genótipos F2 e F3 estão associados às formas fulminantes de hepatite, na coinfeccão com o vírus da hepatite D (VHD). 15-17 Na Amazônia brasileira, em estudos anteriores, as análises filogenéticas indicaram a ocorrência18-23 e, em algumas localidades a predominância do genótipo F na região ocidental. 24 Ainda, com correlação a variabilidade genética do VHB, a seleção de mutações pontuais, nos diferentes genes virais é influenciada, seja sob a pressão da imunidade do hospedeiro ou tratamento antiviral. A proteína do envelope do VHB (HBsAg) é composto por 226 aminoácidos (aa) e contém uma região central chamada de Região Hidrofílica Maior (MHR), que compreende os aminoácidos da posição 99 a 169. Esta região é altamente imunogênica e sofre pressão selectiva do sistema imunitário.25,26 Nesta mesma região está localizado um agrupamento de epítopos, entre os aminoácidos 124 e 147, denominado determinante “a”. As mutações que ocorrem na região MHR têm influenciado importantes questões médicas e de saúde pública, tais como: falha na resposta da vacina contra hepatite B, má resposta às terapias antivirais e fallha na detecção sorológica da infecção, por alguns reagentes (kits) comerciais. 27 Entretanto, mutações podem também surgir naturalmente em portadores crônicos do HBV, e está associado à persistência viral e gravidade da doença. 28 Os objetivos do presente estudo foram avaliar as características filogenéticas, e relatar a ocorrência de variações no gene S do genoma VHB, de sequências nucleotídicas obtidas de amostras de portadores crônicos do VHB, procedentes de comunidades isoladas da Amazônia Ocidental brasileira, considerada área de alta prevalência da infecção. 56 Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus, Amazonas, Brasil (No.:1775/2006/FMT). MATERIAIS E MÉTODOS Foram incluídas neste estudo 13 sequências nucleotídicas parciais do DNAVHB, isolados de amostras de portadores crônicos do VHB (HBsAg-reativo) coletadas durante um inquérito soroepidemiológico de base populacional, realizado em junho de 2008, em três comunidades ribeirinhas (Madeirinho, Praia do Buraco e Samúma), no Município de Lábrea, Estado do Amazonas, conforme descrito em estudo anterior. 24 As sequências dos isolados, aqui analisadas, estão depositadas no GenBank sob os número de acesso: 17 LBra (JQ246014); 26 LBra (JQ246015), 36 LBra (JQ246016); 38 LBra (JQ246017), 44 LBra (JQ246018), 45 LBra (JQ246019), 46 LBra (JQ246020), 68 LBra (JQ246021), 70 LBra (JQ246022), 74 LBra (JQ246023), 75 LBra (JQ246024), 78 LBra (JQ246025), 138 LBra (JQ246027). Todas classificadas previamente como genótipo F/VHB. O percentual similaridade entre as sequências do estudo, e as depositadas no GenBank, foi obtido usando o algoritmo BLASTN 29 2.2.27+ (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Posteriormente, estas foram alinhadas com as sequências que não apresentavam descrição de variações em seu genoma (Wild Type - WT) obtidas, também no GenBank, utilizando-se o programa BioEdit Sequence Alignment Editor 30 versão 7.0.9.0.18. A análise filogenética foi realizada com o programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 5) 31 versão 5.19 (REF), utilizou-se o modelo de substituiçao de nucleotideos Kimura 2 parâmetros 57 (G=1,98). O intervalo de confiança para inferência dos grupos filogenéticos, foi obtido pelo método não-paramétrico de bootstrap baseado em 1000 replicações. Para a caracterização das mutações no gene S do VHB, as sequências nucleotídicas foram analisadas em dois algoritmos internacionais de repositório de estirpes do VHB: HepSEQ32 - (http://www.hepseq.org/Public/Web_Front/main.php) e HBVseq33 - (http://hivdb.stanford.edu/HBV/HBVseq/development/HBVseq.html), que caracterizam mutações na regiao/domínio da transcriptase resversa A tradução da sequência em aminoácidos, bem como a localização dos códons, junto as sequencias de referencias foi realizado com o programa BioEdit. RESULTADOS A análise filogenética agrupou as 13 sequências do genótipo F/VHB, com as sequências de referência dos subgenótipos F/F2a (Figura 1), com intervalo de confiança de 65% comparada às sequencias (WT) VHB/F2a, e divergência de 59%, em relação outros subgenótipos. A análise realizada no BLASTN demonstrou que essas sequências apresentam similaridade de 99% (e-value=0,0), comparadas às sequências (WT) VHB/F2a (AY311369 e AY090455), em que foram demonstradas variações polimórficas (Figura 2). A análise de mutações em 11 sequências do estudo, demonstrou que 5 apresentaram polimorfismo no gene S do VHB/F, na Região Hidrofílica Maior (MHR), sendo em 3, identificada no domínio do determinante “a”: sQ129M, sL127P, sG130E, sF134V, sC137V e sC138R (Figura 2). Detectou-se, também polimorfismos na região da rt, sendo as mais frequentes: H13Y (92,7%); E11Q (85,7%); M129L (78,6%) e S137T (78,6%), destre outras variações encontradas isoladamente. Em 10/11 sequencias com viremia presente (HBeAg-reativo), foi observado o padrão 58 polimórfico (rtE11Q + rtH13Y + rtM129L + rtI137T). A sequencia do isolado LBra 138 apresentou a mutação na posição 184 (A184V) (Tabela 1). DISCUSSÃO Embora a Amazônia ocidental seja considerada uma das regiões do mundo de maior prevalência de infecçao pelo VHB, pouco se sabe sobre as características moleculares das cepas circulantes. De acordo com as análises das variações polimórficas do gene S, entre os códons Região Hidrofílica Maior (MHR), que contem o determinante “a”, (posição aa 124-147), que codifica o antígeno de superfície (HBsAg), não foram encontrados mutações associadas à expressão do HBsAg, nas posições 145 , 131 e 141, que pudessem ter causado efeito na resposta vacinal. 34 A caracterização molecular de Seqüências de HBV é importante para estabelecer a evolução origens e padrões para a dispersão viral. A Análise filogenética mostrou que o genótipo VHB F/F2a foi o predominante na área de estudo. O subtipo F2 é descrito circulando em tribos indígenas localizadas no oeste das Américas . 14,35 Com relação à predominância do genótipo F e o surgimento dos subgenótipos, alguns estudos tentam explicar essas particularidades e peculiaridades na sua manutenção e dispersão pelo continente Américano. Uma hipótese estaria realacionado as características genéticas da população, favoráveis à interação vírus e hospedeiro, e as circunstâncias, também favoráveis de transmissão, sejam pelo próprio crescimento da população, processos migratórios, 59 mudanças no padrão de comportamento, conflitos ou guerras civil, em que teriam essas variantes do VHB/F se estabelecido em uma região. 12,13 No Brasil o genótipo F tem uma baixa prevalência, em comparação ao genótipo A, que é pertinente à intensa imigração africana para o país. 36 Estudos realizados na Amazônia ocidental brasileira, o genótipo F é frequentemente descrito em diferentes localidades, no Amazonas, 19-21,23.24 Acre 18 e Rondônia,22 sugerindo a influência indígenas nesta população específica.14 Todas as sequências descritas no estudo foram caracterizadas como subgenótipo F2a, e que também foi encontrado em Rondônia, 22 Os sequências do gene S, neste estudo são semelhantes às procedentes da Venezuela, 37 Nicarágua 38 e, no Brasil de Santa Catarina.39 Em relação à análise de mutações da sequencia referente à amostra 138 LBra, destacamos a presença da mutação na posição 184 (rtA184V), no gene S dentro do domínio da transcriptase reversa (rt), associado a resistência ao análogo de nucleosídeo (Entecavir). Esta mutação é descrita quando associadas às mutações de resistência ao antiviral (Lamivudina). Ressaltamos que a amostra é proveniente de estudo em população geral, considerada assintomática, sem história ou uso de antivirais, portanto não foi identificado suas correspondentes nas posições sM204V/I e sL180M que pudesse conferir resistência antiviral. 40 Finalmente, apesar das sequências do estudo apresentaram semelhanças com o subgenótipo VHB/F2a, é descrito pela primeira vez um padrão de variantes polimórficas, naturalmente encontradas, numa população de elevada endemicidade para o VHB, da Amazônia Ocidental brasileira. 60 Figura 1. Árvore filogenética em que demonstra a classificaçao dos genótipos e subgenótipos do VHB, nos 13 isolados identificados como LBra. A topologia foi obtida com 46 sequencias parciais do gene S do VHB (33 de diferentes subgenótipos obtidas do GenBank que são apresentadas com número de acesso, seguido pelo genótipo e pais de origem). A análise filogenética foi realizada pelo programa Mega 5, com método Neibor-Joining e o modelo de substituiçao de nucleotideos Kimura 2 parâmetros (G = 1,98). Os valores de bootstrap obtidos com 1000 replicações. 61 Figura 2. Sequências parcial de aminoácidos do gene S região que codifica o HBsAg do VHB, dos isolados (LBra), em que todas foram caracterizadas no genótipo HBV/F2a, alinhados com as sequências consenso obtidas no GenBank. A caixa indica o domínio determinante “a", e as substituiçoes de aminoácidos. 62 63 ID/(FN): Amostra/(Família número); M: Masculino; F: Feminino; Gene S , inclui a região Hidrofílica Maior (MHR); Carga viral no plasma (DNA-HBV): IU/mL; *> acima do limite de detecção do teste; <** abaixo do limite de detecção do teste; N: Negativo; P: Positivo; ND: Não determinado. ∆ mutação identificada apenas pelo programa HepSEQ. 64 REFERÊNCIAS 1.World Health Organization, 2002. Hepatitis B. http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/HepatitisB_whocdscsrlyo2002_2.pdf 2. 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Epub 2001/12/26. 86 7 ANEXOS 7.1 Termo de Consentimento 87 88 7.2 Questionário FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS GERÊNCIA DE VIROLOGIA Questionário Projeto: Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na Saúde Pública Nº da Amostra: ____________ Família: ____________________ IDENTIFICAÇÃO 1 – Nome:_____________________________________________________________________ 2 – Parentesco com o responsável pela família: [ ]Esposa(o) [ ]Filho(a) [ ]Pai/Mãe [ ]Irmão(ã) [ ]Enteado(a) [ ]Sobrinho(a) [ ]Neto(a) [ ]Agregado [ ] outro: ____________________ 2 – Endereço: _______________________ Localidade: _________________________________ 3 – Idade: __________________ anos 4 – Data do nascimento:______/_____ /______ 5 – Sexo: [ ] Masculino [ ] Feminino 6 – Procedência:_________________________ 7 – Tempo em que vive neste local:_____________________________________ 8- Razões para mudança:_________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ASPECTOS SOCIO-ECONÔMICOS 1 – Já freqüentou ou freqüenta escola? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, quantos anos? _____________ 2 – Ocupação principal: _______________________ 3 – No momento você está: [ ] Casado [ ] Junto [ ] Separado/divorciado [ ] Viúvo [ ] Solteiro 4– Com que idade você se casou pela primeira vez? ________ anos. 5- Quantas vezes? _________ 6 – Renda familiar: R$ ________________________ 7 – Quantos cômodos tem a sua casa? _______ cômodos. 8 - Quantos quartos? ____________quartos. 9 - Quantas pessoas vivem na casa?_______ pessoas. 10 - Qual o número de pessoas por quarto?________ pessoas. ______________________________________________________________________________ FATORES DE RISCO ABASTECIMENTO DE ÁGUA [ ] Rio [ ] Poço [ ] Chuva [ ] Serv. Público [ ] Outros____________ TRATAMENTO DA ÁGUA [ ] Filtrada [ ] Fervida [ ] Clorada [ ] Não tratada [ ] Outros____________ DESTINO DO LIXO [ ] Coleta Pública [ ] Queimado [ ] Enterrado [ ] Mata [ ] Rio [ ] Outros__________ DESTINO DOS DEJETOS [ ] Fossa negra [ ] Mata [ ] Rio [ ] Esgoto público [ ] Outros____________ INSTALAÇÃO DO SANITÁRIO [ ] Dentro da casa [ ] Fora da casa [ ] Outros____________ 89 1-Fez cirurgia? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, que tipo?____________________________ Onde?____________________ Por quê? _____________________Quando?_____/_____/_____ 2- Recebeu transfusão de sangue? [ ]SIM [ ]NÃO Se, sim, onde?___________________ Quando? _____/_____/_____ 3-Compartilha escova de dente com outras pessoas? [ ] SIM [ ] NÃO 4- Compartilha lâmina de barbear? [ ] SIM [ ] NÃO 5-Tem tatuagem? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, há quanto tempo ?__________ anos. 6-Tem orelha furada? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, há quanto tempo ?__________ anos. 7-Quantos anos você tinha quando manteve a sua primeira relação sexual? ________ anos. [ ]Criança [ ]Não quis responder 8- Você teve alguma doença abaixo: [ ]Gonorréia [ ]Sífilis [ ]Verrugas genitais [ ]Corrimento genital [ ]Bolhas genitais [ ]Câncro [ ]Outras, Especificar__________________________________________ 9- Você trabalha em serviço de saúde? [ ] SIM [ ] NÃO 10- Bebe bebida alcoólica? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim: [ ] Todos os dias [ ] Fins de semana [ ] Eventualmente 11- Você fuma? [ ] SIM [ ] NÃO Se, sim. Fuma, por dia: [ ] de 1 a 10 [ ] de 11 a 20 [ ] mais de 20 cigarros 12- Uso de drogas injetáveis? [ ] SIM [ ] NÃO 13- Uso de drogas fumadas? [ ] SIM [ ] NÃO 14- Uso de drogas cheiradas? [ ] SIM [ ] NÃO 15- Alguém na sua casa teve: Hepatite? [ ] SIM [ ] NÃO Icterícia (olho amarelado)? [ ] SIM [ ] NÃO Colúria (urina cor de guaraná)? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, quem? [ ]Mãe [ ]Pai [ ]Irmão(ã) [ ]Companheiro(a) [ ]Filho(a) [ ]Outros: _________________ Passado de icterícia (olho amarelado)? [ ] SIM [ ] NÃO 16-Passado de colúria (urina cor de guaraná)? [ ] SIM [ ] NÃO 17-Você já teve hepatite? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, quando? ____/_____/_____ 18- História de vacina contra hepatite B ? [ ] SIM [ ] NÃO 19-Número de doses: [ ] UMA Data da 1ª DOSE : ____/____/____ [ ] DUAS Data da 2ª DOSE : ____/____/____ [ ] TRÊS Data da 3ª DOSE : ____/____/____ 20-Passado de malária? [ ] SIM DATA: ____/_____/_____ [ ] NÃO _____________________________ ENTREVISTADOR 90 7.3 Certificados de Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa 91 92 93 7.4 Errata do Artigo 1 Am. J. Trop. Med. Hyg, 2012 doi:10.4269/ajtmh.2012.12-0083 Copyright © 2012 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene Epidemiology and Molecular Characterization of Hepatitis B Virus Infection in Isolated Villages in the Western Brazilian Amazon A data de acesso dos endereços eletrônicos referenciados: 16 de novembro de 2011. Temos sublinhados: 1) Na página 3 da Discussion: 2º’ parágrafo, linha3: onde se lê 20,27 considerar as reas referências 26,27; 2) Na página 4, Table 3. Onde se lê Lbrea, o correto é a palavra Lábrea; 3) Página 5, Figure 2. Onde se lê Lbrea, o correto é a palavra Lábrea; 4) Página 6. Acknowledgments. Por favor, remova e na linha 6 e adicionar na linha 7 Professores Kátia .... 5) Página 6, References 22. A palavra correta é Austrália; 6) Página 7 References 38 e 56, onde se lê Paran, a palavra correta é Paraná. 94 7.5 Depósito das sequencias nucleotídicas no GenBank 1.Hepatitis B virus isolate 74_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,056 bp linear DNA Accession: JQ246023.1 GI: 385153554 GenBank FASTA Graphics PopSet 2.Hepatitis B virus isolate 78_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,056 bp linear DNA Accession: JQ246025.1 GI: 384597974 GenBank FASTA Graphics PopSet 3.Hepatitis B virus isolate 70_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,043 bp linear DNA Accession: JQ246022.1 GI: 384597969 GenBank FASTA Graphics PopSet 4. Hepatitis B virus isolate 46_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,034 bp linear DNA Accession: JQ246020.1 GI: 384597965 GenBank FASTA Graphics PopSet 5. Hepatitis B virus isolate 44_LBra large S protein (S) gene, partial cds 610 bp linear DNA Accession: JQ246018.1 GI: 384597961 95 GenBank FASTA Graphics PopSet 6. Hepatitis B virus isolate 36_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,033 bp linear DNA Accession: JQ246016.1 GI: 384597957 GenBank FASTA Graphics PopSet 7. Hepatitis B virus isolate 138_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,056 bp linear DNA Accession: JQ246027.1 GI: 385153556 GenBank FASTA Graphics PopSet 8.UNVERIFIED: Hepatitis B virus isolate 26_LBra large S protein-like (S) gene, partial sequence 1,001 bp linear DNA Accession: JQ246015.1 GI: 385153553 GenBank FASTA Graphics PopSet 9. Hepatitis B virus isolate 124_LBra large S protein (S) gene, partial cds 990 bp linear DNA Accession: JQ246026.1 GI: 384597976 GenBank FASTA Graphics PopSet 10. Hepatitis B virus isolate 75_LBra large S protein (S) gene, partial cds 210 bp linear DNA Accession: JQ246024.1 GI: 384597972 GenBank FASTA Graphics PopSet 96 11. Hepatitis B virus isolate 68_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,056 bp linear DNA Accession: JQ246021.1 GI: 384597967 GenBank FASTA Graphics PopSet 12. Hepatitis B virus isolate 45_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,056 bp linear DNA Accession: JQ246019.1 GI: 384597963 GenBank FASTA Graphics PopSet 13. Hepatitis B virus isolate 38_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,056 bp linear DNA Accession: JQ246017.1 GI: 384597959 GenBank FASTA Graphics PopSet 14. Hepatitis B virus isolate 17_LBra large S protein (S) gene, partial cds 1,056 bp linear DNA Accession: JQ246014.1 GI: 384597954 GenBank FASTA Graphics PopSet 97 7.6 Análises pelos algoritmos HBVSeq e HepSEQ HBVseq SeqID: 74 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + Pos NA AA 439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 13 TAC Y H R N H H H H H H H H H H Y1.3 H4.9 H23.9 N0.6 Y1.4 Y18.7 N N N N 0.3 3.7 4.1 0.4 N L S Y R R R R L0.3 S0.6 R1.6 R0.1 S1.2 S0.8 S6.2 S0.8 0.3 0.8 0.1 1.2 0.8 2.1 C Y L Y L L C0.8 0.3 0.5 0.7 0.4 N L L D L0.8 0.0 0.4 C Y 129 CTG L M M M M L M L L M M M M M L44.1 L1.1 L8.4 L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 L25.8 L L L L V1.4 V0.4 V0.3 H0.4 V0.4 V0.5 P0.5 I0.1 P0.1 0.2 K H0.0 I0.0 K0.0 137 ACA T S S S S S S S S S S S S S 1.2 0.4 0.4 24.4 1.1 0.7 T T T T T T Q0.5 0.1 0.0 0.2 Y Y Q T0.5 98 Genotype Analysis 74 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1056 99.82 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ 99 Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. 100 --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680------ 101 230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- HBVseq SeqID: 78 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. Pos NA AA NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons 102 A 439 13 TAC Y H Y1.3 N0.3 L0.3 B 535 R H4.9 L3.7 S0.6 C0.3 N0.3 C 707 D 758 E 227 G 23 129 CTG L M M L44.1 L1.1 V1.4 V0.4 P0.5 K0.2 M L8.4 M L M L L L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 V0.3 H0.4 I0.1 M L25.8 137 ACA T S T1.2 S T0.4 Y0.1 S T0.4 S S S 24.4 T H I pooled L-Nucl. 32 2806 465 H N0.6 Y0.4 R0.1 L0.1 S H H 18.7 Y H 23 N H23.9 S4.1 R1.6 Y0.8 L0.5 S H Y1.4 F 82 S H H N R S1.2 Y1.2 L0.7 C0.0 M L V0.4 P0.1 H0.0 I0.0 K0.0 S T1.1 Y0.0 Acyclic PO4 93 L-Nucl. + Acyclic PO4 191 H N R S0.8 C0.8 L0.8 H N R S0.8 L0.8 D0.4 Y0.4 M L V0.5 H N R S6.2 L2.1 M L M L S T0.7 Q0.2 S S Q0.5 T0.5 Genotype Analysis 78 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1056 99.82 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here 103 Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ 104 Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ............................................................ 105 --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- 106 HBVseq SeqID: 70 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.7%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + Pos NA AA 439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 13 TAC Y H R N H H H H H H H H H H Y1.3 H4.9 H23.9 N0.6 Y1.4 Y18.7 N N N N 0.3 3.7 4.1 0.4 N L S Y R R R R L0.3 S0.6 R1.6 R0.1 S1.2 S0.8 S6.2 S0.8 C0.3 Y0.8 L0.1 Y1.2 L0.8 L2.1 C0.8 0.3 0.5 0.7 0.4 N L L D L0.8 0.0 0.4 C Y 129 CTG L M M M M L M L L M M M M M L44.1 L1.1 L8.4 L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 L25.8 L L L L V1.4 V0.4 V0.3 H0.4 V0.4 V0.5 P0.5 I0.1 P0.1 0.2 K H0.0 I0.0 K0.0 137 ACA T S S S S S S S S S S S S S T1.2 T0.4 T0.4 T24.4 T1.1 T0.7 Q0.5 0.1 0.0 0.2 Y Y Q T0.5 107 Genotype Analysis 70 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1043 99.64 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 108 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ 109 Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .................c...a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input ------------------------------------------------------------ 110 --|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- 111 HBVseq SeqID: 46 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.7%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. A Pos NA AA 439 13 TAC Y H Y1.3 N0.3 L0.3 B 535 R H4.9 L3.7 S0.6 C0.3 N0.3 C 707 NRTI Naive Persons D E F G 758 227 82 23 N H23.9 S4.1 R1.6 Y0.8 L0.5 H N0.6 Y0.4 R0.1 L0.1 H Y1.4 H H Y18.7 18 AAG K R R K2.7 K1.7 S0.3 R K0.8 S0.2 R K0.9 G0.5 R 129 CTG L M M 44.1 L L1.1 V1.4 V0.4 P0.5 K0.2 M L8.4 R G1.0 S0.7 T0.1 K0.1 M L10.0 V0.3 I0.1 137 ACA T S T1.2 S T0.4 Y0.1 S T0.4 S S R L M L 0.9 22.0 M L M4.3 H0.4 S S T24.4 NRTI Treated Persons H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 H H H H H H N N N N R R R R S1.2 S0.8 S6.2 S0.8 1.2 0.8 2.1 Y L L C0.8 0.7 0.4 L D L0.8 0.0 0.4 C Y R R R R R R K4.3 K1.0 S1.1 S2.0 S1.6 0.3 0.7 2.0 S K K T0.8 0.3 0.4 G T K0.8 T0.0 L M M M M M 25.8 L L L L L V0.4 V0.5 P0.1 H0.0 I0.0 K0.0 S S S S S S T1.1 T0.7 Q0.5 0.0 0.2 Y Q T0.5 112 Genotype Analysis 46 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1034 99.64 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, R18K, M129L, S137T Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__K__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ 113 Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t...............a.................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. 114 --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680------ 115 230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- 116 HBVseq SeqID: 44 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 The following warning messages have been generated. Please take corrective action and try again. 1. Too small RT amino acid positions found: position 1 to 45 Genotype Analysis 44 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 610 68.12 Predicted genotype E No confidence prediction - Max sequence %ID < intra-genotype E lower boundary The query sequence is not similar enough to any reference sequence to allow genotype prediction. Intra-genotype E mean %ID: 98.98 Intra-genotype E st dev.: 0.37 Genotype E lower boundary: 98.25 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence H06_042_0358 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: K11Q, H13Y, I16T, A38T 117 Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype E consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__K__H__H__I__R__I__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggaaagcatcacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttctt Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__-__-__-__-_ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__A__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ---------------....gc.gg.....a...---.....-.-cc.a.c....gg.... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__R__G__S__S__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggagctcccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactc Input ..c..acca..a...tc.a.-..aga.-.-...............t.-..t.-.a...a--|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcttgtcctccaatttgtcctggctatcgctggatgtgtctgcggcgttttat Input .a...g.ag...---g..-.a------....a.a.aag.t.g.a..gg.a.....cc.-. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ 118 Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ..-.a-..c.ca..cggg.....--..-----------g.g...g..c..a--.gc.-.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__N__S__R__I__I__N__H__Q__Y__G__T__L_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcatcaaccaccagtacgggaccctg Input ....g....c..a..cc.-.....gc..-.-----..c...t.gg.g..c.....------|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _P__N__L__H__D__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__M__L__L__F__K_ Consensus ccgaacctgcacgactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgttcaaa Input --.....aa.-.--.cag.-..--------...c.cc--.--..-.------a.---... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _T__F__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__M__G__F__R__K__I_ Consensus accttcggacggaaattgcacttgtattcccatcccatcatcatgggctttcggaaaatt Input ...a..-c....c..-....-g..g.a-.t..a....c..c..g.ct....--.g--.-. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttca Input ..c.-...taa......g.c...--.g..gg........-..--c..g.a..------.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__V__V__L_ Consensus gtggttcgccgggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggtattg Input .aac.g.t-.c.a....g..t.t..ca.a-t.-a...a.ct.c.c..a..-c.-.----. --|---------|---------|---------|---------|---------|------- 119 -570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__S__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttatacctctgttaccaattttcttttg Input ...c....--...a........ag..c...tagg..--..........gg.g.gt..c.--|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__L__G__I__H__L__N__P__N__K__T__K__R__W__G__Y__S__L__N__F_ Consensus tctttgggtatacatttaaatcccaacaaaacaaaaagatggggatattccctaaatttc Input .-g..--.---...--a.........t.cc...g.g.........c---------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgtaattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- HBVseq SeqID: 36 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; 120 Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + Pos NA AA 439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 13 TAC Y H R N H H H H H H H H H H Y1.3 H4.9 H23.9 N0.6 Y1.4 Y18.7 N N N N N0.3 L3.7 S4.1 Y0.4 R R R R 0.3 0.6 1.6 0.1 1.2 0.8 6.2 L S R R S S S S0.8 0.3 0.8 0.1 1.2 0.8 2.1 C Y L Y L L C0.8 N0.3 L0.5 L0.7 D0.4 L0.8 0.0 0.4 C Y 129 CTG L M M M M L M L L M M M M M L44.1 L1.1 L8.4 L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 L25.8 L L L L V1.4 V0.4 V0.3 H0.4 V0.4 V0.5 P0.5 I0.1 P0.1 0.2 K H0.0 I0.0 K0.0 137 ACA T S S S S S S S S S S S S S T1.2 T0.4 T0.4 T24.4 T1.1 T0.7 Q0.5 0.1 0.0 0.2 Y Y Q T0.5 Genotype Analysis 36 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1033 99.82 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 121 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ 122 Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|------- 123 -450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- 124 HBVseq SeqID: 138 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.3%) Mutations at established drug resistance positions: 181V Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + Pos NA AA 439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 13 TAC Y H R N H H H H H H H H H H Y1.3 H4.9 H23.9 N0.6 Y1.4 Y18.7 N N N N 0.3 3.7 4.1 0.4 N L S Y R R R R L0.3 S0.6 R1.6 R0.1 S1.2 S0.8 S6.2 S0.8 C0.3 Y0.8 L0.1 Y1.2 L0.8 L2.1 C0.8 0.3 0.5 0.7 0.4 N L L D L0.8 0.0 0.4 C Y 129 CTG L M M M M L M L L M M M M M L44.1 L1.1 L8.4 L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 L25.8 L L L L V1.4 V0.4 V0.3 H0.4 V0.4 V0.5 P0.5 I0.1 P0.1 0.2 K H0.0 I0.0 K0.0 137 ACA T S S S S S S S S S S S S S T1.2 T0.4 T0.4 T24.4 T1.1 T0.7 Q0.5 0.1 0.0 0.2 Y Y Q T0.5 181 GTT V A A A A A A A A A A A A A S0.2 T0.2 S0.1 S0.3 S1.2 S0.2 T1.7 V11.8 V5.3 0.2 0.1 0.3 0.1 0.7 5.4 G G T T V T T2.1 0.1 0.4 2.2 G S S S1.1 185 AGG R S S S S S S S S S S S S S G0.5 R0.2 G0.3 G0.4 G0.2 C0.2 T0.1 T0.0 G0.2 0.0 R 125 188 GGT G C R0.2 C G0.2 C Y0.1 C C C C C C C R0.0 G0.0 Y0.0 C C C Genotype Analysis 138 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1056 99.28 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: Mutation A181V Drug(s) Affected Comments Reference Lamivudine, Adefovir A181V/T is associated with resistance to Adefovir and/or Lamivudine Yeh et al., Hepatology 2000;31:1318-1326, Angus et al., Gastroenterol 126 2003;125:292-297 Resistance Pathway: Pathway Inhibitor Interactions Reference A181V The A181T/V mutation has been associated with resistance to Lamivudine (3TC) in the absence of M204V/I. The A181T/V mutation is associated with resistance to Adefovir (ADV). The A181T/V mutation is associated with cross resistance to Adefovir (ADV) and Lamivudine (3TC). al., Hepatology 2000;31:1318-1326; Angus et al., Gastroenterol 2003;125:292-297 Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T, S185R, C188G Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------- 127 Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata 128 Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__V__.__.__.__R__.__.__G__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ..................................t............g......g..... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ----------------- 129 HBVseq SeqID: 26 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 166 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.6%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: RT Unusual Residues: 165 Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + Pos NA AA 439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 13 TAC Y H R N H H H H H H H H H H Y1.3 H4.9 H23.9 N0.6 Y1.4 Y18.7 N N N N 0.3 3.7 4.1 0.4 N L S Y R R R R L0.3 S0.6 R1.6 R0.1 S1.2 S0.8 S6.2 S0.8 C0.3 Y0.8 L0.1 Y1.2 L0.8 L2.1 C0.8 0.3 0.5 0.7 0.4 N L L D L0.8 0.0 0.4 C Y 129 CTG L M M M M L M L L M M M M M L44.1 L1.1 L8.4 L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 L25.8 L L L L V1.4 V0.4 V0.3 H0.4 V0.4 V0.5 P0.5 I0.1 P0.1 0.2 K H0.0 I0.0 K0.0 137 ACA T S S S S S S S S S S S S S T1.2 T0.4 T0.4 T24.4 T1.1 T0.7 Q0.5 0.1 0.0 0.2 Y Y Q T0.5 165 TGC C G G G G G G G G G G G G G D0.2 A0.1 A0.0 D0.0 130 Genotype Analysis 26 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1001 Predicted genotype 98.00 F Low confidence prediction - Max sequence %ID > genotype F lower boundary Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T, G165C, K168N, P170L Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20---------------------------- 131 -|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ 132 Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__C__.__.__N__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t.......................t......c..t.... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _L__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input t...g.a..a.at-.....------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|------- 133 -630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- HBVseq SeqID: 124 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: D (99.1%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype D sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. 134 A Pos NA AA 439 B 535 C 707 NRTI Naive Persons D E F G 758 227 82 23 H 23 21 TCT S A S0.5 T0.5 A S0.3 G0.3 A S0.2 A A S13.8 T1.2 A A S 57 CCT P S P0.3 S P0.3 S F0.3 Y0.2 S P0.1 S S F1.3 S S 122 CTC L N H35.6 Y0.7 K0.5 Q0.5 P0.2 D0.2 I0.2 L0.2 I N0.9 F0.6 V0.6 S0.4 L0.4 T0.2 I F3.4 N1.6 L1.4 V1.1 T0.3 H0.1 del0.1 F L14.8 I6.5 V4.0 S0.4 N0.3 C0.1 D0.1 I F0.9 L0.9 S0.4 T0.4 N0.4 H L Y15.9 N1.2 Y N13.0 F4.3 130 CCG P Q P0.2 Q Q P P12.1 Q2.2 S0.4 H0.1 E0.1 Q Q Q A0.7 S0.2 K0.2 P0.2 Q NRTI Treated Persons I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 A A A A A S S S S T0.4 T2.0 G0.0 S S S S S F0.1 F0.3 P0.6 0.1 0.3 P C 0.0 Y L I I I I N6.7 L L L L F3.3 H H H H F F F F N N N N Y Y Y Y V1.5 V1.8 V1.2 V1.1 0.2 0.3 S S T0.1 D0.3 0.1 K R0.3 0.1 Q D0.1 P0.0 del0.0 C0.0 Q Q Q Q Q P P P P A0.1 S0.7 S0.1 H0.2 0.0 H K0.2 0.0 K R0.2 E0.0 Genotype Analysis 124 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction 135 Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 990 99.46 Predicted genotype D High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype D mean %ID Intra-genotype D mean %ID: 98.00 Intra-genotype D st dev.: 0.80 Genotype D lower boundary: 96.40 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X65257 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: A21S, S57P, F122L, Q130P Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype D consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__S__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__I__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttctt Input .................................t.......................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__A__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaagaatcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt 136 Input ........................................................g... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__P__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__N__Y__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggaactaccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactc Input .................c...c...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__N__S__R__I__F__N__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcttcaaccaccagcacgggaccatg Input ....................................c....................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _P__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__D__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__Y__Q_ Consensus cagaacctgcacgactcctgctcaaggaacctctatgtatccctcctgttgctgtaccaa Input .c.......................................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440------ 137 150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__F__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accttcggacggaaattgcacctgtattcccatcccatcatcctgggctttcggaaaatt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__V__V__L_ Consensus gtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattg Input ..............-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__F__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaagtctgtacagcatcttgagtccctttttaccgctgttaccaattttcttttg Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__L__G__I__H__L__N__P__N__K__T__K__R__W__G__Y__S__L__H__F_ Consensus tctttgggtatacatttaaaccctaacaaaacaaaaagatggggttactctttacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------- 138 Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggctatgtcattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- HBVseq SeqID: 75 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 The following warning messages have been generated. Please take corrective action and try again. 1. Too small RT amino acid positions found: position 1 to 45 Genotype Analysis 75 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 210 100.00 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here 139 The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__-__-__-__-_ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ................................................-------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80---------------------------- 140 -|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ 141 Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- HBVseq 142 SeqID: 45 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.0%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + Pos NA AA 439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 13 TAC Y H R N H H H H H H H H H H Y1.3 H4.9 H23.9 N0.6 Y1.4 Y18.7 N N N N 0.3 3.7 4.1 0.4 N L S Y R R R R L0.3 S0.6 R1.6 R0.1 S1.2 S0.8 S6.2 S0.8 C0.3 Y0.8 L0.1 Y1.2 L0.8 L2.1 C0.8 0.3 0.5 0.7 0.4 N L L D L0.8 0.0 0.4 C Y 129 CTG L M M M M L M L L M M M M M L44.1 L1.1 L8.4 L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 L25.8 L L L L V1.4 V0.4 V0.3 H0.4 V0.4 V0.5 P0.5 I0.1 P0.1 0.2 K H0.0 I0.0 K0.0 137 ACA T S S S S S S S S S S S S S T1.2 T0.4 T0.4 T24.4 T1.1 T0.7 Q0.5 0.1 0.0 0.2 Y Y Q T0.5 145 TGT C M M L L M L M L M M M M M L0.9 L1.9 M4.4 M5.2 L1.8 L10.0 L L L L V0.2 V0.6 V0.2 F0.1 F0.0 146 GCG A L L L L L L L L L L L L L V0.1 M0.1 V0.1 V0.2 S0.5 0.1 0.0 V M M0.5 143 Genotype Analysis 45 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1055 99.64 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T, L145C, L146A Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ 144 Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. 145 --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__C__A__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a......................-....c.......... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c...------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680------ 146 230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- HBVseq SeqID: 68 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons Pos NA AA A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + 147 439 13 TAC Y H Y1.3 N0.3 L0.3 535 R H4.9 L3.7 S0.6 C0.3 N0.3 707 758 227 23 129 CTG L M M L44.1 L1.1 V1.4 V0.4 P0.5 K0.2 M L8.4 M L M L L L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 V0.3 H0.4 I0.1 M L25.8 137 ACA T S T1.2 S T0.4 Y0.1 S T0.4 S S S T24.4 H 32 H N0.6 Y0.4 R0.1 L0.1 S H H Y18.7 23 N H23.9 S4.1 R1.6 Y0.8 L0.5 S H Y1.4 82 S H 2806 H N R S1.2 Y1.2 L0.7 C0.0 M L V0.4 P0.1 H0.0 I0.0 K0.0 S T1.1 Y0.0 465 PO4 93 Acyclic PO4 191 H N R S0.8 L0.8 D0.4 Y0.4 M L V0.5 H N R S6.2 L2.1 H N R S0.8 C0.8 L0.8 M L M L S T0.7 Q0.2 S S Q0.5 T0.5 Genotype Analysis 68 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1056 99.82 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference 148 sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200------ 149 70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------- 150 Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- 151 HBVseq SeqID: 38 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (97.1%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame RT 138 Shifts: None RT B,D,H,V,N: RT Unusual Residues: 92, 104 Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + Pos NA AA 439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 13 TAC Y H R N H H H H H H H H H H Y1.3 H4.9 H23.9 N0.6 Y1.4 Y18.7 N N N N 0.3 3.7 4.1 0.4 N L S Y R R R R L0.3 S0.6 R1.6 R0.1 S1.2 S0.8 S6.2 S0.8 C0.3 Y0.8 L0.1 Y1.2 L0.8 L2.1 C0.8 0.3 0.5 0.7 0.4 N L L D L0.8 0.0 0.4 C Y 92 TCT S P P P P P P P P P P P P P 93 CAT H L L L L L L L L L L L L L M0.6 R0.1 M0.1 F0.3 H0.6 0.0 0.3 R H 104 GTC V G G G G G G G G G G G G G C0.1 C0.0 123 GAA E N N N N N D D N D N N N N H0.2 D2.8 H3.4 D3.1 D1.3 N12.2 D4.3 N13.3 D D D D Y0.2 H0.6 D0.4 K0.8 K0.9 H1.2 H1.1 H1.7 H1.2 K0.5 0.2 0.1 0.3 0.3 0.7 S del E K K K0.2 Y0.1 H0.1 S0.1 I0.2 0.1 0.1 S E Y0.1 del0.0 128 CCC P T T T T T T T T T T T T T N2.5 N1.9 A7.4 N2.0 P0.4 S2.4 S4.3 A2.4 N2.5 I7.0 N3.7 A0.9 I1.9 N0.4 I1.2 N1.4 I2.2 N5.8 A1.6 0.5 1.7 0.3 0.4 0.8 1.2 1.2 I A P P I A A I1.1 152 P0.5 H0.2 S0.2 129 TTG L M L44.1 V1.4 P0.5 K0.2 S0.4 P0.4 I0.1 S0.3 A0.1 M L1.1 V0.4 M L8.4 M L M L L L10.0 M0.9 L22.0 M4.3 V0.3 H0.4 I0.1 M L25.8 137 ACA T S T1.2 S S T0.4 Y0.1 R K2.1 E0.1 S T0.4 S S S T24.4 S S R K1.3 S0.1 R R T1.2 R R R 138 TGA * R R K2.3 K1.1 G0.2 142 GGT G V A0.2 I0.2 G0.2 V I1.1 D0.4 A0.2 G0.2 V D0.6 I0.3 A0.1 N0.1 E0.1 V E1.5 A0.9 I0.4 D0.1 G0.1 V I0.4 V V V V 187 ATG M I L2.7 I V9.6 L2.3 I L0.3 I L2.4 V0.1 I V0.9 I L1.2 I I I P0.4 S0.3 H0.0 M L V0.4 P0.1 H0.0 I0.0 K0.0 S T1.1 Y0.0 R K1.5 S0.0 T0.0 G0.0 E0.0 V I0.5 A0.4 E0.4 D0.2 G0.1 N0.0 I V1.9 L1.6 S0.5 P0.5 M L V0.5 M L M L S T0.7 Q0.2 R K0.9 S0.2 Q0.2 W0.2 I0.2 V I1.8 D0.9 E0.9 A0.7 G0.4 N0.2 I V3.5 L1.1 S R S Q0.5 T0.5 R K1.1 Q0.5 G0.5 V D1.2 V E1.1 I V4.5 I V2.6 Genotype Analysis 38 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length 1056 Max Sequence %ID 97.48 Predicted genotype F Low confidence prediction - Max sequence %ID > genotype F lower boundary 153 Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, P92S, L93H, G104V, H122N, D123E, T128P, M129L, S137T, R138*, V142G, I187M Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------- 154 Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__S__H__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__V__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input .....ct...a.............................-................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__N__E__.__.__.__.__P__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input ..........................c.........a....a...........ac..t.. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__*__.__.__.__G__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a..t.a..........g...................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata 155 Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__M__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input .....................................................g...... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680-----230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|---- 156 -750-------760--- HBVseq SeqID: 17 LBra_1 Date: 26-Aug-2012 Summary Data Sequence includes RT: codons: 1 - 193 Genotype and % similarity to closest reference isolate: F (99.8%) Mutations at established drug resistance positions: None Sequence Quality Assessment Gene QA Problem Codons Stop Codons, Frame None RT Shifts: None RT B,D,H,V,N: None RT Unusual Residues: Red lines indicate QA problems; Blue lines indicate differences from consensus genotype F sequence; Tall blue lines indicate sites associated with drug resistance. Mutation Prevalence According to Genotype and Treatment (a) Column headers contain the number of persons with isolates according to genotype and drug class exposure. (b) Table entries list the amino acid differences from genotype consensus and their frequency (%). (c) Detailed information on isolates containing a specific mutation can be obtained by clicking the mutation. (d) The table containing the rates of mutation at positions 1-344 in RT can be obtained by clicking here. NRTI Naive Persons NRTI Treated Persons A B C D E F G H I pooled L-Nucl. Acyclic L-Nucl. + Pos NA AA 439 535 707 758 227 82 23 23 32 2806 465 PO4 Acyclic 93 PO4 191 13 TAC Y H R N H H H H H H H H H H Y1.3 H4.9 H23.9 N0.6 Y1.4 Y18.7 N N N N N0.3 L3.7 S4.1 Y0.4 R R R R L0.3 S0.6 R1.6 R0.1 S1.2 S0.8 S6.2 S0.8 0.3 0.8 0.1 1.2 0.8 2.1 C Y L Y L L C0.8 N0.3 L0.5 L0.7 D0.4 L0.8 0.0 0.4 C Y 129 CTG L M M M M L M L L M M M M M 44.1 1.1 8.4 10.0 0.9 22.0 4.3 25.8 L L L L M L M L L L L L V1.4 V0.4 V0.3 H0.4 V0.4 V0.5 P0.5 I0.1 P0.1 0.2 K H0.0 I0.0 K0.0 137 ACA T S S S S S S S S S S S S S T1.2 T0.4 T0.4 T24.4 T1.1 T0.7 Q0.5 0.1 0.0 0.2 Y Y Q T0.5 157 Genotype Analysis 17 LBra: This tool attempts to predict a genotype to your query sequence by comparing it to a range of HBV reference sequences. Each genotype prediction is colour coded to give an indication of statistical certainty: Green - High confidence prediction Amber - Low confidence prediction Red - No confidence prediction Result Query Sequence Length Max Sequence %ID 1056 99.82 Predicted genotype F High confidence prediction - Max sequence %ID > intra-genotype F mean %ID Intra-genotype F mean %ID: 98.04 Intra-genotype F st dev.: 0.65 Genotype F lower boundary: 96.74 The alignment between the query sequence and the closest matching reference sequence X69798 can be viewed here The alignment between the query sequence and the reference consensus sequence can be checked here Resistance Mutations: No resistance mutations detected in this sequence! Genotype Variants: E11Q, H13Y, M129L, S137T Sequence Alignment Alignment between input query sequence and genotype F consensus reference sequence. Amino acid and nucleotide sequence numbers refer to HBV polymerase numbering. 10----------------------------20----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__Q__.__Y__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ 158 Consensus _G__E__H__H__I__R__T__P__R__T__P__A__R__V__T__G__G__V__F__L_ Consensus ggagaacatcacatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggtgtgtttctt Input ...c.....t.................................................. --|---------|---------|---------|---------|---------|-------30--------40--------50--------60--------70--------80------30----------------------------40----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _V__D__K__N__P__H__N__T__T__E__S__R__L__V__V__D__F__S__Q__F_ Consensus gttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------90--------100-------110-------120-------130-------140-----50----------------------------60----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _S__R__G__T__T__R__V__S__W__P__K__F__A__V__P__N__L__Q__S__L_ Consensus tctagggggactacccgggtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactt Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------150-------160-------170-------180-------190-------200-----70----------------------------80----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__N__L__L__S__S__N__L__S__W__L__S__L__D__V__S__A__A__F__Y_ Consensus accaacctcctgtcctccaacttgtcctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttat Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------210-------220-------230-------240-------250-------260-----90----------------------------100----------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _H__L__P__L__H__P__A__A__M__P__H__L__L__V__G__S__S__G__L__S_ Consensus catcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------270-------280-------290-------300-------310-------320-----110---------------------------120---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__L_ Consensus _R__Y__V__A__R__L__S__S__T__S__R__I__H__D__H__Q__H__G__T__M_ Consensus aggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggatccacgaccaccagcacgggaccatg Input .........................................................c.. 159 --|---------|---------|---------|---------|---------|-------330-------340-------350-------360-------370-------380-----130---------------------------140---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__T__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _Q__N__L__H__N__S__C__S__R__N__L__Y__V__S__L__L__L__L__F__Q_ Consensus caaaacctgcacaactcttgctcaaggaacctctatgtttccctcctgttgctgttccaa Input .....................a...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------390-------400-------410-------420-------430-------440-----150---------------------------160---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _T__L__G__R__K__L__H__L__Y__S__H__P__I__I__L__G__F__R__K__I_ Consensus accctcggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttaggaaaata Input .....................t...................................... --|---------|---------|---------|---------|---------|-------450-------460-------470-------480-------490-------500-----170---------------------------180---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__.__._ Consensus _P__M__G__V__G__L__S__P__F__L__L__A__Q__F__T__S__A__I__C__S_ Consensus cctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgcaatttgttca Input ............................................................ --|---------|---------|---------|---------|---------|-------510-------520-------530-------540-------550-------560-----190---------------------------200---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _.__.__.__.__.__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _V__V__R__R__A__F__P__H__C__L__A__F__S__Y__M__D__D__L__V__L_ Consensus gtggtgcgtagggctttcccccactgtctggcttttagttatatggatgatctggtattg Input .........c....-----------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------570-------580-------590-------600-------610-------620-----210---------------------------220---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _G__A__K__S__V__Q__H__L__E__S__L__Y__T__A__V__T__N__F__L__L_ Consensus ggggccaaatctgtgcagcatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttctgtta Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------630-------640-------650-------660-------670-------680------ 160 230---------------------------240---------------------------|-----------------------------|---------------------------Input _-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-__-_ Consensus _S__V__G__I__H__L__N__T__S__K__T__K__R__W__G__Y__N__L__H__F_ Consensus tctgtgggtatccatttaaatacttctaaaacaaaaagatggggttacaacctacatttc Input -------------------------------------------------------------|---------|---------|---------|---------|---------|-------690-------700-------710-------720-------730-------740-----250---------------|---------------Input _-__-__-__-__-__Consensus _M__G__Y__V__I__G Consensus atgggttatgttattgg Input ------------------|---------|----750-------760--- 161 7.7 Genotipagem do VHB pelo NCBI Descrição: A parte superior do gráfico mostra, para cada janela do código de cores, a sequência de referência, com a maior pontuação. Se existirem dois pontos idênticos para uma janela com diferentes subtipos específicos, a barra da janela é dividida diagonalmente. 74 LBra 162 78 LBra 70 LBra 163 46 LBra 44 LBra 164 36 LBra 138 LBra 165 26 LBra 124 LBra 166 75 LBra 68 LBra 167 45 LBra 38 LBra 168 17 LBra
