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MESTRADO
ZOOTECNIA
OTIMIZAÇÃO DE PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA DE MICRORGANISMOS RUMINAIS
JAQUELINE DE OLIVEIRA FERRO GOMES ROCHA
A comunidade microbiana ruminal é altamente complexa e com variadas espécies e gêneros de
bactérias, Archea, fungo, protozoário ciliado e vírus. Uma análise molecular do rumem permitem que
microrganismos ainda não cultivados possam ser detectados, e tornaram-se ferramentas essenciais para
determinar as mudanças que ocorrem dentro das comunidades microbianas, por exemplo, durante as
mudanças na dieta. A microbiota do rúmen é muito diversa e nem todos os métodos de extração de
DNA trabalham eficientemente para diferentes grupos microbianos, portanto um DNA de rendimento e
qualidade suficientes é considerado o ponto de partida crucial para essas análises. Portanto, objetiva-se
aperfeiçoar um protocolo de extração de DNA de microrganismo ruminal. Neste experimento serão
utilizados dois bovinos machos castrados, mestiços Holandês x Zebu, com peso corporal de 250 kg,
fistulados no rúmen dois ovinos da raça Santa Inês. A comparação entre os métodos de extração de
DNA de microrganismos será realizada utilizando amostras líquida de rúmen coletadas via fístula de dois
bovinos e dois ovinos. Estes animais serão submetidos ao sistema de pastejo durante uma semana para
adaptação, tendo acesso a água livremente. Para reduzir possíveis interferências de função ruminal,
apenas uma amostra de 20mL de líquido serão removidas manualmente do rúmen por dia. O conteúdo
ruminal será passado por um filtro de nylon 800-µm para separar uma fase líquida e uma fase sólida. A
fase líquida será subsequentemente analisado sendo o material armazenado em recipiente fechado e
refrigerado a -80ºC até o momento da utilização. Serão comparados um total de sete protocolos de
extração de DNA. Após a extração o DNA será mensurado por espectrofotometria (A 260nm/A230nm) e
A260nm/280nm) indicando a taxa de contaminação do mesmo. A qualidade, portanto a integridade do
material genômico será analisado através de gel de agarose a 0,8% por sistema de eletroforese e
submetido a luz UV com brometo de etídio para visualização do DNA.O material genético de cada
microrganismo será analisado por PCR convencional a fim de se avaliar os iniciadores e as condições da
reação. A reprodutibilidade do ensaio será avaliada por determinação de variações inter e intra-ensaio
com quatro repetições, desta forma cada reação de PCR em Tempo Real será feita em quadruplicata.
Com estes processos espera-se desenvolver um protocolo de extração de DNA de microrganismos
ruminais que seja menos oneroso, rápido e principalmente eficiente. Através da otimização de
protocolos já existentes possibilita-se um maior conhecimento do ambiente ruminal e suas
peculiaridades.
PRÓ-REITORIA DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO
VI MOSTRA DA PÓS-GRADUAÇÃO/2014