tcc - deisiane aparecida da silva

UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE QUÍMICA
CURSO DE LICENCIATURA EM QUÍMICA
DEISIANE APARECIDA DA SILVA
SCREENING DE PRODUTOS NATURAIS COM POTENCIALIDADE
PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS OCASIONADAS POR
HELICOBACTER PYLORI: UM ESTUDO IN VITRO E IN SILICO.
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
CAMPO MOURÃO
2015
DEISIANE APARECIDA DA SILVA
SCREENING DE PRODUTOS NATURAIS COM POTENCIALIDADE
PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS OCASIONADAS POR
HELICOBACTER PYLORI: UM ESTUDO IN VITRO E IN SILICO.
Trabalho de conclusão de curso apresentado à disciplina de Trabalho
de Conclusão de Curso 2 (TCC2), do Curso de Licenciatura em
Química do Departamento Acadêmico de Química – DAQUI – da
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, como
requisito para obtenção do título de Licenciada em Química.
Orientador: Prof. Msc. Adriano Lopes Romero
CAMPO MOURÃO
2015
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, pelo apoio durante essa trajetória,
acreditando em mim sempre e ao incentivo à nunca
desistir quando os obstáculos apareceram. Aos
poucos amigos, mas eternos, que durante essa
jornada tornaram-se família e deixaram esses anos
de luta mais alegres. A Deus, por fazer possível essa
conquista, e estar comigo presente sempre.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Tecnológica Federal do Paraná, pela oportunidade.
Ao orientador professor Msc Adriano Lopes Romero, pela dedicação à faculdade e aos alunos
e especialmente por aceitar fazer parte desse trabalho, me auxiliando sempre ao decorrer do
projeto.
A professora Doutora Rúbia e a Flavianny, laboratorista da Universidade Tecnológica Federal
do Paraná campus Apucarana, pela dedicação e ajuda com as análises espectroscópicas.
A todos os Professores com quem tive o privilégio de tanto aprender ao longo do meu
percurso acadêmico.
Aos meus pais, pela dedicação, exigência e apoio ao longo desses anos, me incentivando a
nunca desistir de meus sonhos.
Aos meus amigos, que ao longo dessa jornada, se fizeram presentes e deixaram essa trajetória
mais feliz, fazendo parte da minha vida.
À Deus, por proporcionar que essa vitória tenha sido alcançada.
RESUMO
O Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa que coloniza a mucosa gástrica,
onde está relacionada com alguns processos patogênicos, sejam inflamatórios (gastrite crônica
e doença ulcerosa péptica) ou neoplásicos (adenocarcinoma e linfoma gástrico do tipo MALT
- Mucosa Associated Lynphoid Tissue. A infecção gástrica causada por esta bactéria é,
atualmente, considerada a segunda infecção mais prevalecente do homem, estando
intimamente associada a uma variedade de desordens clínicas gastrintestinais, sendo este
microrganismo o principal agente etiológico de mais de 95% das gastrites crônicas e úlceras
duodenais. Caracterizando-se pelo alto índice de infecções registradas, a busca constante por
potenciais fármacos para erradicação desta bactéria tem se apresentado imprescindível. Desta
forma, avaliou-se in vitro a atividade inibidora de urease, estudos de composição química e in
silico dos óleos essenciais de Rosmarinus officinalis (Alecrim), Illicium verum (Anis
estrelado), Cymbopogon citratus (Capim limão), Cymbopogon winterianius (Citronela),
Syzygium aromaticum (Cravo-da-Índia), Corymbia citriodora (Eucalipto), Eucalyptus
globulus (Eucalipto globulus), Citrus sinensis (Laranja doce), Citrus latifolia (Lima tahiti) e
Citrus limon (Limão siciliano). Os resultados apresentados neste trabalho indicam que óleos
essenciais podem ser considerados fontes promissoras de substâncias bioativas inibidoras de
urease. Dentre as dez amostras avaliadas determinou-se que os óleos essenciais de
Rosmarinus officinalis, Cymbopogon citratus, Cymbopogon winterianius e Citrus sinensis são
promissores inibidores de urease. Os estudos in vitro e in silico convergem para justificar a
atividade inibidora de urease através de um mecanismo de inibição baseado na interação de
determinados constituintes dos óleos essencias no sítio ativo da enzima. Sendo assim, estudos
posteriores são necessários para verificar se in vivo estes óleos apresentarão efeito sobre a
bactéria H. pylori.
ABSTRACT
Helicobacter pylori is a gram-negative bacterium that colonizes the gastric mucosa,
which is associated with some pathogenic processes are inflammatory (chronic gastritis and
peptic ulcer disease) or neoplastic (adenocarcinoma, and gastric lymphoma). The gastric
infection with this bacterium is now considered the second most prevalent infections of man,
is closely associated with a variety of clinical gastrointestinal disorders, this microorganism is
the main etiological agent of more than 95% of chronic gastritis and duodenal ulcers.
Characterized by the high rate of infections recorded, the constant search for potential drugs
to eradicate this bacterium has performed essential. Thus, we evaluated the in vitro inhibitory
activity of urease, chemical compositions and in silico studies of essential oils Rosmarinus
officinalis (Rosemary), Illicium verum (Star anise), Cymbopogon citratus (Lemon grass),
Cymbopogon winteranius (Citronella), Syzygium aromaticum (Clove), Eucalyptus globulus
(Eucalyptus globulus), Citrus sinensis (Sweet orange), Citrus latifolia (Lima tahiti) and
Citrus limon (Lemon). The results presented here indicate that essencial oils can be
considered promising sources of bioactive substances inhibiting urease. Of the ten samples
evaluated was determined that the essential oils of Rosmarinus officinalis,
Cymbopogon citratus, Cymbopogon winteranius and Citrus sinensis urease inhibitors are
promising. Studies in vitro and in silico converge to justify the inhibiting activity of urease
inhibition by a mechanism based on the interaction of certain constituents of the essential oils
in the active site of the enzyme.Thus, further studies are needed to see if these oils in vivo
showed effect on H. pylori.
LISTA DE FIGURAS
......................................................................................................................................................
FIGURA 1 - MICROGRAFIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DA BACTÉRIA
HELICOBACTER PYLORI....................................................................................................... 19
FIGURA 2 - SÍTIO ATIVO DA ENZIMA UREASE ILUSTRANDO OS RESÍDUOS DE
AMINOÁCIDOS ENVOLVIDOS NA HIDRÓLISE DA URÉIA .......................................... 27
FIGURA 3 - (A) ESTRUTURA DA UREASE ISOLADA DE CANAVALIA ENSIFORMIS
INIBIDA COM FLUORETO (PDB 4GOA) E (B) SEU RESPECTIVO SÍTIO ATIVO ....... 28
FIGURA 4 - REPRESENTAÇÃO DO MECANISMO COMPETITIVO DE INIBIÇÃO DE
ENZIMAS ................................................................................................................................ 30
FIGURA 5 – REPRESENTAÇÃO DO MECANISMO INCOMPETITIVO DE INIBIÇÃO
DE ENZIMAS .......................................................................................................................... 31
FIGURA 6 - REPRESENTAÇÃO DO MECANISMO DE INIBIÇÃO MISTA DE ENZIMAS
.................................................................................................................................................. 32
FIGURA 7 - REPRESENTAÇÃO DO MECANISMO DE INIBIÇÃO ALOSTÉRICA DE
ENZIMAS. ............................................................................................................................... 33
FIGURA 8 - TESTE IN VITRO DE INIBIÇÃO DE UREASE PELO USO DE TIOURÉIA
NAS CONCENTRAÇÕES DE: (A) 6,25; (B) 25; (C) 50 E (D) 100 PPM E SEUS
RESPECTIVOS ESPECTROS NA REGIÃO DO VISÍVEL .................................................. 40
FIGURA 9 - COMPORTAMENTO GRÁFICO DO TESTE DE INIBIÇÃO DE UREASE
PELA TIOURÉIA .................................................................................................................... 41
FIGURA 10 - TESTE IN VITRO DE INIBIÇÃO DE UREASE PELO USO DE: A)
ROSMARINUS OFFICINALIS; B) CYMBOPOGON CITRATUS; C) CYMBOPOGON
WINTERIANIUS; D) CITRUS SINENSIS; E) SYZYGIUM AROMATICUM; F) EUCALIPTUS
GLOBULUS; G) CITRUS LATOFOLIA; H) CITRUS LIMON; I) ILLICIUM VERUM EM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES ...................................................................................... 42
FIGURA 11 - COMPORTAMENTOS GRÁFICO DO TESTE DE INIBIÇÃO DE UREASE
PELOS
ÓLEOS
ESSENCIAIS
DE
(A)
ROSMARINUS
OFFICINALIS;
(B)
CYMBOPONGON CITRATUS; (C) CYMBOPONGON WINTERIANIUS; (D) CITRUS
SINENSIS .................................................................................................................................. 43
FIGURA 12 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ROSMARINUS OFFICINALIS. ... 45
FIGURA 13 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ILLICIUM VERUM ..................... 46
FIGURA 14 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CYMBOPOGON CITRATUS ...... 48
FIGURA 15 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CYMBOPOGON WINTERIANUS
.................................................................................................................................................. 50
FIGURA 16 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE SYZYGIUM AROMATICUM ....... 51
FIGURA 17 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE EUCALYPTUS GLOBULUS ....... 53
FIGURA 18 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CITRUS SINENSIS ...................... 54
FIGURA 19 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CITRUS LATIFOLIA ................... 55
FIGURA 20 - CROMATOGRAMA OBTIDO POR CG-EM PARA ANÁLISE DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CITRUS LIMON .......................... 57
FIGURA 21 - (A) ESTRUTURA DA ENZIMA UREASE (PDB 1E9Z); (B)
LOCALIZAÇÃO DOS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
ROSMARINUS OFFICINALIS APÓS O ESTUDO DE DOCAGEM MOLECULAR; (C) DLIMONENO INTERAGINDO NO SÍTIO ATIVO DA ENZIMA UREASE. ........................ 70
FIGURA 22 - (A) ESTRUTURA DA ENZIMA UREASE (PDB 1E9Z); (B)
LOCALIZAÇÃO DOS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CYMBOPOGON CITRATUS APÓS O ESTUDO DE DOCAGEM MOLECULAR; (C)
GERANIAL INTERAGINDO NO SÍTIO ATIVO DA ENZIMA UREASE. ......................... 70
FIGURA 23 - (A) ESTRUTURA DA ENZIMA UREASE (PDB 1E9Z); (B)
LOCALIZAÇÃO DOS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CYMBOPOGON WINTERIANIUS APÓS O ESTUDO DE DOCAGEM MOLECULAR; (C)
GERANIOL E D-LIMONENO INTERAGINDO NO SÍTIO ATIVO DA ENZIMA
UREASE................................................................................................................................... 71
FIGURA 24 - (A) ESTRUTURA DA ENZIMA UREASE (PDB 1E9Z); (B)
LOCALIZAÇÃO DOS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CITRUS SINENSIS APÓS O ESTUDO DE DOCAGEM MOLECULAR; (C) D-LIMONENO
INTERAGINDO NO SÍTIO ATIVO DA ENZIMA UREASE. .............................................. 71
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - VALORES DE IC50 PARA OS ÓLEOS ESSENCIAIS DE ROSMARINUS
OFFICINALIS, CYMBOPOGON CITRATUS, CYMBOPOGON WINTERIANIUS E CITRUS
SINENSIS. ................................................................................................................................. 44
TABELA 2 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ROSMARINUS
OFFICINALIS. ......................................................................................................................... 46
TABELA 3 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ILLICIUM VERUM.
.................................................................................................................................................. 47
TABELA 4 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CYMBOPOGON
CITRATUS. ............................................................................................................................... 49
TABELA 5 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CYMBOPOGON
WINTERIANUS. ....................................................................................................................... 51
TABELA 6 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE SYZYGIUM
AROMATICUM. ....................................................................................................................... 52
TABELA 7 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE EUCALYPTUS
GLOBULUS. ............................................................................................................................. 54
TABELA 8 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CITRUS SINENSIS.
.................................................................................................................................................. 55
TABELA 9 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CITRUS LATIFOLIA.
.................................................................................................................................................. 56
TABELA 10 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE CITRUS LIMON. . 58
TABELA 11 - PROPRIEDADES MOLECULARES DOS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS
DO ÓLEO DE ROSMARINUS OFFICINALIS CALCULADAS NO SOFTWARE
MOLINSPIRATION. ............................................................................................................... 59
TABELA 12 - PROPRIEDADES MOLECULARES DOS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS
DO
ÓLEO
DE
CYMBOPOGON
CITRATUS
CALCULADAS
NO
SOFTWARE
MOLINSPIRATION. ............................................................................................................... 59
TABELA 13 - PROPRIEDADES MOLECULARES DOS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS
DO ÓLEO DE CYMBOPOGON WINTERIANIUS CALCULADAS NO SOFTWARE
MOLINSPIRATION. ............................................................................................................... 59
TABELA 14 - PROPRIEDADES MOLECULARES DOS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS
DO ÓLEO DE CITRUS SINENSIS CALCULADAS NO SOFTWARE MOLINSPIRATION.
.................................................................................................................................................. 59
TABELA 15 - PREDIÇÃO DE BIOATIVIDADES, CALCULADAS NO SOFTWARE
MOLINSPIRATION, PARA OS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL
DE ROSMARINUS OFFICINALIS........................................................................................... 60
TABELA 16 - PREDIÇÃO DE BIOATIVIDADES, CALCULADAS NO SOFTWARE
MOLINSPIRATION, PARA OS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL
DE CYMBOPOGON CITRATUS. ............................................................................................ 60
TABELA 17 - PREDIÇÃO DE BIOATIVIDADES, CALCULADAS NO SOFTWARE
MOLINSPIRATION, PARA OS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL
DE CYMBOPOGON WINTERIANIUS. ................................................................................... 61
TABELA 18 - PREDIÇÃO DE BIOATIVIDADES, CALCULADAS NO SOFTWARE
MOLINSPIRATION, PARA OS COMPOSTOS MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL
DE CITRUS SINENSIS. ............................................................................................................ 61
TABELA 19 - PREDIÇÃO DE TOXICIDADE, DETERMINADAS NO SOFTWARE
OSIRIS, PARA OS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
ROSMARINUS OFFICINALIS. ................................................................................................ 62
TABELA 20 - PREDIÇÃO DE TOXICIDADE, DETERMINADAS NO SOFTWARE
OSIRIS, PARA OS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CYMBOPOGON CITRATUS.................................................................................................... 62
TABELA 21. PREDIÇÃO DE TOXICIDADE, DETERMINADAS NO SOFTWARE
OSIRIS, PARA OS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CYMBOPOGON WINTERIANIUS. .......................................................................................... 63
TABELA 22 - PREDIÇÃO DE TOXICIDADE, DETERMINADAS NO SOFTWARE
OSIRIS, PARA OS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CITRUS SINENSIS. .................................................................................................................. 63
TABELA
23
-
PROPRIEDADES
ADMET,
CALCULADAS
NO
SOFTWARE
ADMETSAR, PARA OS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
ROSMARINUS OFFICINALIS. ................................................................................................ 64
TABELA
24
-
PROPRIEDADES
ADMET,
CALCULADAS
NO
SOFTWARE
ADMETSAR, PARA OS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CYMBOPOGON CITRATUS.................................................................................................... 65
TABELA
25
-
PROPRIEDADES
ADMET,
CALCULADAS
NO
SOFTWARE
ADMETSAR, PARA OS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CYMBOPOGON WINTERIANIUS. .......................................................................................... 66
TABELA
26
-
PROPRIEDADES
ADMET,
CALCULADAS
NO
SOFTWARE
ADMETSAR, PARA OS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE
CITRUS SINENSIS. .................................................................................................................. 66
TABELA
27
-
ENVOLVIDAS
ENERGIAS,
NA
CALCULADAS
INTERAÇÃO
UREASE
NO
(PDB
PROGRAMA
1E9Z)
-
IGEMDOCK,
COMPOSTOS
MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE ROSMARINUS OFFICINALIS. .................. 72
TABELA
28
-
ENVOLVIDAS
ENERGIAS,
NA
CALCULADAS
INTERAÇÃO
UREASE
NO
(PDB
PROGRAMA
1E9Z)
-
IGEMDOCK,
COMPOSTOS
MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE CYMBOPOGON CITRATUS. ..................... 72
TABELA
29
-
ENVOLVIDAS
ENERGIAS,
NA
CALCULADAS
INTERAÇÃO
UREASE
NO
(PDB
PROGRAMA
1E9Z)
-
IGEMDOCK,
COMPOSTOS
MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE CYMBOPOGON WINTERIANIUS. ............ 72
TABELA
30
ENVOLVIDAS
-
ENERGIAS,
NA
CALCULADAS
INTERAÇÃO
UREASE
NO
(PDB
PROGRAMA
1E9Z)
-
IGEMDOCK,
COMPOSTOS
MAJORITÁRIOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE CITRUS SINENSIS...................................... 73
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16
2 REVISÃO TEÓRICA ......................................................................................................... 19
2.1 HELICOBACTER PYLORI ................................................................................................ 19
2.1.1 Mecanismo de sobrevivência........................................................................................... 20
2.2 EPIDEMIOLOGIA............................................................................................................. 21
2.2.1 Transmissão ..................................................................................................................... 22
2.3 TRATAMENTO................................................................................................................. 22
2.4 NOVAS ALTERNATIVAS NATURAIS .......................................................................... 23
2.5 ESTUDOS IN SILICO ........................................................................................................ 24
2.6 UREASE............................................................................................................................. 26
2.6.1 Urease da Helicobacter pylori ......................................................................................... 26
2.6.2 Urease da soja .................................................................................................................. 28
2.7 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA ................................................................................................ 29
2.7.1 Inibição reversível ........................................................................................................... 30
2.7.2 Inibição irreversível ......................................................................................................... 32
2.7.3 Inibição alostérica ............................................................................................................ 32
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 34
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 34
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 34
4 METODOLOGIA................................................................................................................ 35
4.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INIBIDORA DE UREASE .......................................... 35
4.1.1 Obtenção da urease .......................................................................................................... 35
4.1.2 Preparação das amostras .................................................................................................. 35
4.1.3 Testes in vitro .................................................................................................................. 36
4.2 CROMATOGRAFIA GASOSA ........................................................................................ 37
4.3 ESTUDOS IN SILICO ........................................................................................................ 37
4.3.1 Molinspiration ................................................................................................................. 37
4.3.2 Osiris................................................................................................................................ 38
4.3.3 admetSAR........................................................................................................................ 38
4.3.4 Estudos de docking molecular ......................................................................................... 39
5 RESULTADOS .................................................................................................................... 40
5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INIBIDORA DE URESE ............................................. 40
5.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS ................................................. 44
5.3 ESTUDOS IN SILICO ........................................................................................................ 53
5.3.1 Molinspiration ................................................................................................................. 58
5.3.2 Osiris................................................................................................................................ 62
5.3.3 admetSAR........................................................................................................................ 64
5.3.4 Docking molecular .......................................................................................................... 70
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 74
7 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 75
16
1 INTRODUÇÃO
Desde sua identificação por Marshall e Warren, em 1982, o Helicobacter pylori
rapidamente se tornou alvo de incontáveis estudos microbiológicos, histológicos,
epidemiológicos, imunológicos, ecológicos e clínicos. Consequentemente, em curto período
de tempo, os avanços do conhecimento na área puderam ser utilizados, de forma
revolucionária, na prática médica diária de clínicos e gastroenterologistas (COELHO &
ZATERKA, 2005, p. 61).
O H. pylori é uma bactéria Gram-negativa que coloniza a mucosa gástrica, onde está
relacionada com alguns processos patogênicos, sejam inflamatórios (gastrite crônica e doença
ulcerosa péptica) ou neoplásicos (adenocarcinoma e linfoma gástrico do tipo MALT - Mucosa
Associated Lynphoid Tissue (PARENTE & PARENTE, 2010, p. 86)).
A infecção gástrica causada por esta bactéria é, atualmente, considerada a segunda
infecção mais prevalecente do homem, estando intimamente associada a uma variedade de
desordens clínicas gastrintestinais, sendo este microrganismo o principal agente etiológico de
mais de 95% das gastrites crônicas e úlceras duodenais (SILVA et al., 2004, p. 72).
Caracterizando-se pelo alto índice de infecções registradas, a constante busca por fármacos
potenciais para erradicação desta bactéria tem se apresentado imprescindível. A forma
espiralada e os flagelos da H. pylori possibilitam uma locomoção aprimorada pelo muco,
impossível para outros tipos de bactérias que ficam aprisionadas no mesmo (SOUSA, 2013, p.
12).
Segundo Silva et al. (2004, p. 74) os primeiros tratamentos anti-H. pylori foram
descritos, em 1983, e constam de um esquema tríplice “clássico”, onde se associa um sal de
bismuto, tetraciclina (ou amoxicilina) e metronidazol. O esquema tríplice “moderno” que vem
sendo utilizado, em todo o mundo, consiste na associação de um inibidor de bomba protônica
(podenso ser omeprazol 20 mg, lansoprazol 30 mg, pantoprazol 40 mg ou rabeprazol 20 mg)
+ amoxicilina 1000 mg + claritromicina 500 mg, administrados, antes do café da manhã e do
jantar, por um período de sete a catorze dias. Diante da sua grande incidência, a infecção pelo
H. pylori é considerada um problema de saúde pública, sendo mais relevante nos países
latino-americanos de baixo poder aquisitivo e consequente dificuldade de acesso à
terapêutica. Essa situação leva a comunidade científica a se manter em constante alerta na
busca de novos potenciais fármacos que possam ser utilizados no combate a esta bactéria,
17
uma vez que as bactérias têm alta capacidade de adquirir resistência à antibióticos. Assim o
maior problema da resistência mediada por mutação é a sua transmissão às gerações
seguintes, o que torna a bactéria resistente predominante (BAPTISTA, 2013, p. 15).
A H. pylori é capaz de facilitar a fixação no estômago, induzir uma lesão mucosa e
evitar a defesa do hospedeiro, sendo assim, considerada uma das bactérias mais prejudiciais
ao organismo. Juntamente com seus componentes bacterianos, esta bactéria pode causar dano
ao muco. A urease, por exemplo, responsável por tornar possível a fixação da H. pylori no
estômago, gera amônia (NH₃), que pode danificar as células epiteliais (SOUSA, 2013, p. 12).
A urease pode ser considerada o atributo biológico de maior importância para a H.
pylori, uma vez que sem esta enzima, a bactéria não teria condições de colonizar a mucosa
gástrica. Assim, ressalta-se o fato de que, a bactéria em questão desenvolveu estratégias que
lhe permitem sobreviver e persistir na mucosa gástrica, regulando negativamente a resposta
imune do hospedeiro através dos seus fatores de virulência (COELHO, 2013, p. 128;
LADEIRA, 2003, p. 336).
Perante tal problemática, muitas razões movem os prescritores a recomendar
abusivamente o uso de antibióticos. A grande disponibilidade desses medicamentos,
acompanhada de publicidade pouco judiciosa, finda por acentuar o seu uso abusivo. Com isso
se mantêm ou agravam as doenças infecciosas, aparecem mais reações adversas, usam-se
alternativas antimicrobianas mais onerosas e se produzem mais hospitalizações. Com uso
irracional de antibióticos, o desenvolvimento de futura resistência é fácil de prever por ser
inevitável (WANNMACHER, 2004, p. 2). Portanto, torna-se imprescindível a necessidade de
encontrar, desenvolver, e introduzir no arsenal médico, modalidades terapêuticas mais
eficientes que possam oferecer aos pacientes com doenças distintas, novas oportunidades de
tratamento que visem melhorias na erradicação de bactérias. Nesta modalidade, os produtos
naturais surgem como fortes contribuintes no tratamento de enfermidades.
Harvey (2008, p. 894) reporta os produtos naturais como a fonte da maioria dos
ingredientes ativos de medicamentos, sendo amplamente aceitos desde a descoberta de
drogas, antes do advento da seleção de alto rendimento e da era pós-genômica, onde mais de
80% dos fármacos eram produtos naturais ou inspirados por um composto natural. Ao
estabelecer comparações das informações apresentadas sobre as fontes de novos
medicamentos entre 1981-2007, os autores observaram que aproximadamente metade dos
medicamentos aprovados desde 1994 eram baseadas em produtos naturais.
Diante deste cenário, torna-se fundamental o conhecimento sobre a eficácia das
diferentes terapêuticas para a erradicação da H. pylori. Neste contexto, este projeto teve como
18
finalidade a busca e o estudo de produtos naturais com potencialidade para tratamento de
doenças ocasionadas por H. pylori, apresentando-se como uma alternativa ao uso de
antibióticos convencionais. Para realização deste trabalho, com base na literatura e nas
semelhanças das ureases encontradas na bactéria H. pylori e na soja (Glycine max), definiu-se
esta como modelo para realização dos testes experimentais, uma vez que os resultados de
diversos trabalhos desenvolvidos em sementes demonstram que ureases compostas por um
monômero de cadeia única têm estrutura tridimensional semelhante às enzimas multiméricas
de bactérias (LAPROTOX, 2014).
19
2 REVISÃO TEÓRICA
2.1 HELICOBACTER PYLORI
A descoberta do H. pylori revolucionou os conceitos fisiopatológicos das patologias
gastroduodenais, como a gastrite, a doença ulcerosa péptica, a neoplasia gástrica e o linfoma
MALT (PINTO, 2007, p. 12). A partir da década de 80, a bactéria H. pylori tornou-se alvo de
incontáveis e extensos estudos, tornando a sua redescoberta pelos cientistas australianos
Marshall e Warren um dos mais importantes avanços na área da gastroenterologia (COELHO
2013, p. 19).
Segundo Siqueira et al. (2007, p. 9), o H. pylori (Figura 1) pode ser descrito como uma
bactéria Gram-negativa, microaerófila e espiralada, em forma de S ou em bastonete curvo,
que mede cerca de 3 a 5 μm de comprimento por 0,5 μm de largura, tem parede celular
externa lisa e possui de quatro a seis flagelos unipolares embainhados e com bulbo terminal.
Figura 1 - Micrografia eletrônica de varredura da bactéria Helicobacter pylori
Fonte: Bonocorsi (2009).
O gênero Helicobacter é composto atualmente de, no mínimo, 27 espécies que
compartilham propriedades comuns. O H. pylori pode distribuir-se de maneira focal,
segmentar ou difusa ao longo da mucosa gástrica, localizando-se no interior ou sob a camada
de muco que recobre o epitélio da superfície ou das fovéolas, em íntimo contato com a
20
membrana luminal das células epiteliais que revestem a mucosa gástrica (LADEIRA, 2003, p.
337).
2.1.2 Mecanismo de sobrevivência
O H. pylori desenvolveu estratégias que lhe permitem sobreviver e persistir na mucosa
gástrica, regulando negativamente a resposta imune do hospedeiro através dos seus fatores de
virulência (COELHO, 2013, p. 24). A resistência ao ácido clorídrico presente no estômago é
de vital importância na patogênese do H. pylori, visto que, sem este atributo biológico, a
bactéria não teria condições de colonizar a mucosa gástrica (LADEIRA, 2003, p. 337). Este
mecanismo de sobrevivência é atribuído a potente atividade da enzima urease (SIQUEIRA,
2007, p. 10). Esta enzima, que é uma proteína de alto peso molecular (500 a 600 kDa), atua
promovendo a hidrólise da uréia, presente em condições fisiológicas no suco gástrico, levando
à produção de amônia e dióxido de carbono (Equações 1 e 2). A amônia produzida atua como
receptor de íons H+, tornando o pH neutro no interior da bactéria, o que confere ao H. pylori
resistência à acidez gástrica. Desta maneira, a bactéria fica protegida dos efeitos deletérios do
pH ácido do estômago.
H2N–C(O)–NH2 + H2O → NH3 + H2N–COOH
(1)
H2N–COOH + H2O → NH3 + H2CO3
(2)
Segundo Coelho (2013, p. 20), uma vez protegida do pH ácido do estômago, a
colonização da bactéria apresenta-se de maneira facilitada devido as suas características
estruturais, como a forma espiral com os flagelos, que consistem em fator determinante que
promove sua mobilidade e penetração na mucosa, conseguindo assim colonizar a superfície
do epitélio celular de onde retira micronutrientes importantes.
Por outro lado, diferentemente do que ocorre na mucosa gástrica, onde a proteção se
deve à barreira mucosa, os íons hidrônio (H+) penetram facilmente nas células da mucosa
duodenal, levando à diminuição transitória do pH. Essa alteração ativa os co-transportadores
basolaterais de íons sódio (Na+), com consequente migração exagerada de íons bicarbonato
21
(HCO3-) do espaço extra para o intracelular, ativando a troca entre os íons bicarbonato/cloreto
(HCO3-/Cl-) na porção apical da membrana celular. Esses eventos culminam com o aumento
da secreção de HCO3-, que, juntamente com a camada de muco, é capaz de neutralizar os íons
H+ que chegam ao duodeno, assegurando a neutralidade e a integridade da mucosa
(BITTENCOURT, 2006, p. 327).
A determinação da amônia produzida na hidrólise da uréia tem sido utilizada como
princípio da reação de Berthelot para determinação de nitrogênio em matrizes biológicas
produtoras de urease (ROCHA et al., 1989). Esse mesmo princípio tem sido utilizado para
determinação da atividade inibidora de urease de produtos naturais e/ou derivados sintéticos
(BIGLAR et al., 2012, p. 833)
2.2 EPIDEMIOLOGIA
A gastrite induzida pelo H. pylori é uma das infecções mais comuns na espécie
humana, comprometendo cerca de metade da população mundial (BRUSCKY et al., 2013;
LADEIRA, 2003, p. 336). Com relação aos dados de prevalência, o H. pylori é uma bactéria
de distribuição universal e em razão da impossibilidade de se detectar o início da infecção,
sua incidência é determinada de forma indireta, com base nos dados de prevalência (PINTO,
2007, p. 35).
A prevalência da infecção varia com a idade e o nível socioeconômico. Em países
desenvolvidos, a infecção em crianças é menos frequente. Estudos sorológicos demonstraram
que a prevalência de infecção por H. pylori aumenta com a idade e é maior nos países em
desenvolvimento, sendo influenciada por fatores como renda, nível de instrução e condições
de moradia (SIQUEIRA et al., 2007, p. 9; LADEIRA et al., 2003, p. 336).
Em seus estudos Bittencourt et al. (2006, p. 326) tem apontado fatores como baixo
nível socioeconômico e suas consequências naturais, como condições de higiene precárias,
aglomeração nas moradias e ausência ou deficiência de saneamento básico, como fatores que
favorecem a aquisição da bactéria, sendo considerados atualmente os principais marcadores
da presença de infecção pelo H. pylori.
22
2.2.1 Transmissão
O homem é considerado o principal hospedeiro desse agente, sendo a infecção
adquirida predominantemente na infância. A via de transmissão do H. pylori tem sido um dos
assuntos mais estudados e discutidos desde a redescoberta desta bactéria (PINTO, 2007, p.
37). Embora até o momento não tenha sido totalmente estabelecida à via de transmissão da
bactéria, as vias de infecção mais aceitas atualmente incluem a fecal-oral e a oral-oral. Não há
possibilidade de transmissão através do ato sexual comum, e a infecção por insetos vetores é
praticamente nula (SIQUEIRA et al., 2007, p. 10).
Segundo Ladeira et al. (2003, p. 337) existem diversas formas de transmissão
encontradas de H. pylori, sendo as principais fontes de infecção o uso de água contaminada
por matéria fecal, ato sexual por via oral-anal e aglomeração intrafamilial. Os autores
relataram ainda, sorologia positiva em mais de 80% de irmãos colonizados com a bactéria,
maior incidência em filhos de pais infectados com H. pylori e possível risco de transmissão da
bactéria através da endoscopia.
2.3 TRATAMENTO
Com o papel do H. pylori no antro-gástrico estruturado na sociedade, muitos fatores
sofreram e ainda sofrem mudanças, como a estratégia de tratamento e o procedimento
cirúrgico para os casos mais graves (PINTO, 2007, p. 17).
Ainda não existe um esquema terapêutico ideal. São vários os antimicrobianos usados
no tratamento da infecção por H. pylori, em várias associações e tempos diversos. Segundo
Cândido (2008, p. 24) os modernos esquemas terapêuticos combinam potentes drogas antisecretoras da família dos inibidores de bomba de próton com antibióticos. O tratamento não é
imediato, porém não chega a ser considerado de longo prazo, podendo sua duração variar de
7-14 dias.
Desde 1989, tem-se utilizado uma associação de amoxicilina (50 mg/kg/dia),
metronidazol (20 a 30 mg/kg/dia) e furazolidona (6 a 8 mg/kg/dia), em três doses diárias, por
sete dias, com erradicação de 84% da bactéria H. pylori (SIQUEIRA et al., 2007, p. 12).
23
Todavia, o percentual de efeitos colaterais é significativo, mas na maioria dos pacientes não
impede a continuidade da terapia. Conforme relata o autor, atualmente, vem sendo utilizado a
associação de um inibidor da bomba protônica (omeprazol 20 mg, lansoprazol 30 mg,
pantobrazol 40 mg, rabeprazol 20 mg) + amoxicilina 1000 mg + claritromicina 500 mg. Este
esquema tem se mostrado mais eficaz quando comparado ao anterior, no entanto, como a
sensibilidade microbiana varia com a localidade, raça e uso prévio desses medicamentos, a
eficácia de um esquema de tratamento em uma comunidade não permite a generalização dos
resultados.
Cândido (2008, p. 24) ressalva que embora existam diversos medicamentos para a
eliminação do H. pylori nem sempre as terapias são bem sucedidas. Os esquemas de
tratamento, apesar de serem eficazes, têm apresentado falhas, pois um pequeno número de
pacientes não respondem ao tratamento.
Diante dessa problemática, é imprescindível lembrar que o aumento da resistência aos
antimicrobianos também tem proporcionado o surgimento de novas linhas de pesquisa que
buscam novas alternativas para o tratamento de doenças ocasionadas por H. pylori,
particularmente as não-tóxicas, naturais e menos dispendiosas.
2.4 NOVAS ALTERNATIVAS NATURAIS
Quimicamente, os óleos essenciais são produtos naturais voláteis constituídos,
geralmente, por misturas complexas de terpenos e fenilpropanóides (SIMÕES, 2000).
Biologicamente são produzidos como mecanismo de defesa ou para atração de polinizadores
(SIANI et al., 2000, p. 39). Várias atividades biológicas/farmacológicas foram comprovadas
para diferentes óleos essenciais (CARDOSO et al., 1999, p. 209; KALEMBA, 2003, p. 818),
tais
como
anti-inflamatória,
inseticida,
antimicrobiana,
antitumoral,
antiviral,
imunomoduladora, anticonvulsivante, antiespamódica, ansiolítica, entre outras. A maioria
dessas atividades biológicas/farmacológicas são atribuídas aos terpenóides constituintes dos
óleos essenciais. Por possuírem substâncias lipofílicas, os óleos essenciais agem atravessando
a membrana plasmática das células, causando dano na mesma, sendo esta uma característica
da ação citotóxica desses produtos naturais (COSTA, 2009, p. 64).
Recentemente, Biglar et al. (2012, p. 833) reportaram um screening com 21 extratos
metanólicos de plantas medicinais, utilizando como modelo o método de inibição da atividade
24
da urease isolada de soja. Os autores relataram que os extratos que apresentaram melhores
resultados foram das plantas Matricaria disciforme (IC50: 35 µg/mL), Nasturtium officinale
(IC50: 18 µg/mL), Punica granatum (IC50: 30 µg/mL), Camelia sinensis (IC50: 35 µg/mL),
Citrus aurantifolia (IC50: 28 µg/mL).
2.5 ESTUDOS IN SILICO
Nos últimos anos as ferramentas computacionais (in silico) têm ganhado importante
espaço no cenário da Química, principalmente na área da Química Medicinal. A expressão in
silico foi utilizada pela primeira vez em 1989 e tem sido usada para significar "realizada no
computador ou através de simulação em computador". Na área da Química Medicinal os in
silico constituem um importante meio para auxiliar em projetos de pesquisa e
desenvolvimento de fármacos. A aplicação de ferramentas computacionais, por exemplo, no
estudo de Toxicologia Preditiva já é realizada por diversas agências e órgãos no mundo, como
no contexto regulatório; em criação de bases de dados e programas de apoio à avaliação da
toxicidade e de risco (SANTOS, 2007). Os estudos in silico têm como vantagem a rapidez na
sua execução, o baixo custo e a capacidade de reduzir o uso de animais em ensaios de
toxicidade.
Rodrigues et al. (2012) afirma que as técnicas computacionais aplicadas ao estudo de
sistemas biológicos tem se mostrado eficazes no manejo de dados e mapeamento da estrutura
3D de alvos moleculares e ligantes, guiando a identificação e otimização de novos candidatos
a fármacos. Além disso, a determinação das propriedades farmacocinéticas de absorção,
distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET), essenciais no estudo de
candidatos a fármacos (TONIN, 2009; LIPINSKI et al., 1997), tem sido amplamente
estudadas por técnicas computacionais como Molinspiration, ALOGPS 2.1, ToxPredict e
OSIRIS Property Explorer. As informações obtidas por estas ferramentas podem ser utilizadas
para avaliar o potencial de novos derivados sintéticos candidatos à fármacos.
A forma de predição do potencial a fármaco é dependente do programa ao qual os
estudos são submetidos. A “regra do cinco de Lipinski”, por exemplo, fornece parâmetros
relacionados à biodisponibilidade oral e topologia das novas moléculas (LIPINSKI et al.,
1997).
25
A ação de um fármaco, quando administrado a humanos ou animais, pode ser dividida
em três fases: fase farmacêutica, fase farmacocinética e fase farmacodinâmica. Tonin (2009)
descreve estas fases.
Na fase farmacêutica, ocorre a desintegração da forma de dosagem, seguida
da dissolução da substância ativa (liberação do fármaco). A fase
farmacocinética
abrange
os
processos
de
absorção,
distribuição,
metabolismo e excreção (ADME), ou seja, “o que o organismo faz com o
fármaco”. A fase farmacodinâmica está relacionada com a interação do
fármaco com seu alvo (receptor, enzimas etc) e a consequente produção do
efeito terapêutico, podendo ser entendida como “o que o fármaco faz no
organismo”.
O mecanismo de ação dos fármacos tem suas fases representadas por Pereira (2006)
no esquema abaixo (Esquema 1).
Esquema 1 - Fases importantes da ação dos fármacos
Fonte: PEREIRA (2006).
Para que um fármaco seja administrado por via oral – objetivo fundamental da
indústria farmacêutica – a fase farmacocinética precisa ser profundamente estudada.
Eventualmente, uma molécula pode ter excelentes características farmacodinâmicas, mas
pode não ser solúvel em água, por exemplo, o que inviabiliza um projeto de medicamento
com administração oral (TONIN, 2009).
Nota-se que a fase farmacocinética pode ter profundo impacto sobre o efeito
farmacológico, uma vez que os processos de ADME determinam a concentração e o tempo
despendido das moléculas do fármaco no seu local de ação (PEREIRA, 2006). Em virtude
disso, os estudos in silico estão sendo realizados em etapas preliminares do processo de
26
desenvolvimento de fármacos, com o intuito de economizar tempo e direcionar o estudo de
novos compostos.
Outro fator importante que tem impulsionado o desenvolvimento de novos fármacos
têm sido o metabolismo, responsável por desempenhar importante papel na eliminação de
fármacos e impedir que estes compostos permaneçam por tempo indefinido no nosso
organismo. Há muito tempo, o planejamento racional de fármacos baseado no estudo de seu
metabolismo foi consolidado, sendo desenvolvidos a partir de estudos do metabolismo de seu
precursor (JUNIOR E BOLZANI, 2006).
Devido ao grande número de novas entidades químicas, de origem sintética, lançadas
no mercado farmacêutico, bem como a busca por compostos com potencial farmacêutico, os
estudos in silico tem dado grande contribuição para o estudo de mecanismos de atuação das
substâncias bioativas e eventuais melhoras das propriedades ADMET (TONIN, 2009;
PEREIRA, 2006).
2.6 UREASE
Ureases são enzimas dependentes de níquel, que catalisam a reação de hidrólise da
uréia em duas moléculas de amônia e uma de dióxido de carbono. Apresentam ampla
distribuição em plantas, fungos e bactérias, mas não são sintetizadas por animais (POSTAL,
2012, p. 14).
Independente de sua origem e de sua organização estrutural, as ureases caracterizamse como proteínas homólogas compartilhando de 50 a 60% de identidade de sequência,
sugerindo divergência a partir de uma enzima ancestral comum. A grande maioria das
bactérias e dos fungos é produtora de urease, porém em algumas de forma constitutiva, e em
outras, de forma induzida (LAPROTOX, 2014).
2.6.1 Urease da Helicobacter pylori
As ureases bacterianas são multímeros de duas ou três subunidades, que correspondem
a "domínios" da cadeia única de ureases vegetais e fúngicas (LAPROTOX, 2014). A urease
27
de H. pylori é considerada um fator de virulência, visto que sua atividade catalítica cria um
microambiente, de pH mais elevado, possibilitando a sobrevivência do patógeno no estômago
(GUERRA, 2013, p. 6).
Assim como as ureases de plantas e de bactérias, a urease de H. pylori também é um
potente ativador de plaquetas, induzindo, em concentrações nanomolares, exocitose e
agregação plaquetária.
Contudo, a ativação de plaquetas induzida por H. pylori não depende
da atividade enzimática da proteína (LAPROTOX, 2014).
O teste rápido da urease é considerado um dos métodos mais difundidos no
diagnóstico da H. pylori, sendo realizado por meios invasivos, através de endoscopia
digestiva, obtendo-se amostras da mucosa gástrica (SILVA, 2009, p. 20). Diante da
dificuldade em se obter a urease diretamente da bactéria, tornam-se necessárias metodologias
que utilizem modelos alternativos e de fácil acesso para a busca de potenciais inibidores de
urease.
Segundo Labgne et al. (1991) para a enzima urease isolada de H. pylori os resíduos
His136, His138, Lys219, His248, His274 e Asp362 interagem diretamente com os dois íons
níquel, uréia e com uma molécula de água no interior do sítio ativo. Além disso, o resíduo
His322, localizado próximo ao sítio ativo, atua com uma base na catálise. Carter et al. (2009)
apresenta uma visualização tridimensional dos resíduos de aminoácidos envolvidos na
hidrólise da uréia realizada pela urease produzida pela bactéria Klebsiella aerogenes (Figura
2).
Figura 2 - Sítio ativo da enzima urease ilustrando os resíduos de
aminoácidos envolvidos na hidrólise da uréia
Fonte: Carter et al. (2009).
28
Segundo Mobley (2001) o mecanismo pelo qual a uréia é hidrolisada segue o esquema
descrito por Dixon et al. (1980) para a urease isolada de feijão-de-porco (Canavalia
ensiformis). Segundo estes autores, a uréia se liga em O-coordenação à um íon níquel pelo
auxílio do resíduo His221. Paralelamente, o resíduo His322 ativa uma molécula de água
ligada a outro íon níquel. O ataque da hidroxila, coordenada ao níquel, ao átomo de carbono
do substrato resulta em um intermediário tetraédrico ligado em ponte aos dois íons níquel. Na
sequência, um próton é transferido para o intermediário resultando na liberação de amônia e
carbamato (Equação 1, pág. 20). O último composto, na presença de água, decompõe-se
espontaneamente em amônia e ácido carbônico (Equação 2, pág. 20).
2.6.2 Urease da soja
As plantas, particularmente leguminosas e curcubitáceas, encontram-se entre as fontes
mais ricas em urease. Esta proteína pode estar presente em diferentes tecidos vegetais,
concentrando-se especialmente em sementes e raízes. Apesar de apresentarem-se em
abundância, ureases de poucas plantas foram isoladas e caracterizadas bioquimicamente e/ou
enzimaticamente (LAPROTOX, 2014). A urease presente na Glycine max (soja), por
exemplo, encontra-se entre as ureases mais estudadas até o momento. Esses estudos tem
mostrado que as ureases são compostas por um monômero de cadeia única têm estrutura
tridimensional semelhante às enzimas multiméricas de bactérias (LAPROTOX, 2014).
Figura 3 - (a) Estrutura da urease isolada de Canavalia ensiformis inibida com fluoreto
(PDB 4GOA) e (b) seu respectivo sítio ativo.
Fonte: Autoria própria.
29
Apesar de existir trabalhos sobre enzimas urease produzidas por Glycine max não há
nenhum registro no Protein Data Bank1 destes trabalhos. Este fato impede realizar uma
comparação das características estruturas e de sítio ativo das enzimas urease produzidas por
Glycine max e H. pylori. No entanto, como há relatos de que as ureases produzidas por
Glycine max e Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) possuem semelhanças estruturais
(BENINI et al., 2014) é possível verificar que a região ao redor do sítio ativo da urease
produzida por C. ensiformis possui os mesmos resíduos de aminoácidos presentes na urease
produzida por H. pylori apresentados na figura 3.
Com base na literatura e nas semelhanças das ureases produzidas por H. pylori e
Glycine max, definiu-se esta como modelo para realização dos testes experimentais que
constituem este projeto.
2.7 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
A inibição de enzimas tem atraído grande atenção na área da Química Medicinal já há
algumas décadas, especialmente após uma variedade de inibidores começarem a ser utilizados
no controle de várias doenças.
Uma das principais características da enzima é sua seletividade para determinados
inibidores, sendo a especificidade do inibidor dependente do tamanho, da forma e das forças
interativas que resultam na correspondência exata do inibidor e da enzima (SOOMRO e
SHAH, 2012).
O conceito biológico de inibidor enzimático diz respeito à substância que é capaz de
interferir, de maneira específica, na taxa de uma reação de catálise enzimática, retardando ou
reduzindo o processo ou a especificidade biológica da reação (MARQUES e YAMANAKA,
2008).
O mecanismo de inibição é baseado principalmente na ligação do substrato e da
enzima. Este mecanismo pode ser classificado com base em seu inibidor, em dois grupos,
inibição irreversível ou inibição reversível (SOOMRO e SHAH, 2012). A diferença básica
1
O PDB (Protein Data Bank; em português: Banco de Dados de Proteínas) é um banco de
dados em 3D de proteínas e ácidos nucléicos. Esses dados, geralmente obtidos através da difração de raios X ou
da ressonância magnética nuclear, são enviados por pesquisadores de todo o mundo. Disponíveis em domínio
público (http://www.rcsb.org/pdb), os arquivos constantes neste banco de dados podem ser usados livremente.
30
está na formação do complexo enzima-inibidor, que pode ou não ser desfeito por etapas de
diluição ou diálise, dependo do processo.
2.7.1 Inibição reversível
Os inibidores reversíveis levam à formação de um complexo em um sistema em
equilíbrio, no qual a enzima apresenta um grau definido de inibição, que é dependente das
concentrações dos reagentes no meio (enzima, inibidor e substrato), permanecendo constante
a partir de um tempo determinado. O processo de inibição reversível pode ser dividido em três
tipos básicos, competitivo, incompetitivo e misto (MARQUES e YAMANAKA, 2008).
Competitivo
Lehninger (2003) define o grupo competitivo como um grupo que apresenta um tipo
comum de inibidor reversível, sendo o inibidor (I) competitivo aquele que compete com o
substrato (S) pelo sítio ativo da enzima (Figura 4).
Figura 4 - Representação do mecanismo competitivo de inibição de enzimas
Fonte: Lehninger (2003, p. 205).
O processo envolvido na atuação de inibidores reversíveis ocorre principalmente
através de interações não covalentes, como ligação de hidrogênio, interação hidrofóbica e
orientação de inibidor e enzima de uma forma organizada (SOOMRO e SHAH, 2012). Uma
vez que este inibidor consegue se ligar à enzima, esta não o converte em produto (P), levando
31
à formação de um complexo inativo (EI). Como o processo é reversível, a simples adição de
uma maior quantidade de substrato pode deslocar o equilíbrio de modo a favorecer a
formação do complexo enzima-substrato (ES), minimizando a probabilidade de uma molécula
de inibidor se ligar à enzima (MARQUES e YAMANAKA, 2008).
Incompetitivo
Os inibidores incompetitivos são aqueles que se ligam em regiões diferentes do sítio
ativo, mas se ligam apenas ao complexo ES. Segundo Marques e Yamanaka (2008), a ligação
entre o inibidor e o complexo é efetuada por um sítio de ligação diferente do sítio em que o
substrato se encontra ligado à enzima (Figura 5).
Figura 5 - Representação do mecanismo de inibição incompetitivo de
enzimas
Fonte: Lehninger (2003, p. 205).
Misto
Neste processo, o inibidor liga-se a um sítio diferente do sítio ativo, o que indica que a
inibição não pode ser revertida pela adição de quantidades de substrato. Ocorre a formação de
complexos, tanto na ligação com a enzima quanto com o complexo ES. A figura 6 demonstra
o processo de inibição mista.
32
Figura 6 - Representação do mecanismo de inibição misto de enzimas
Fonte: Lehninger (2003, p. 205).
2.7.2 Inibição irreversível
Inibidores irreversíveis são aqueles que se combinam com um grupo funcional na
molécula da enzima ou destroem ou ainda formam uma associação covalente bastante estável,
sendo a formação de uma ligação covalente entre o inibidor e a enzima muito comum
(LEHNINGER, 2003). Neste processo, o inibidor liga-se ao sítio ativo da enzima de maneira
irreversível. Segundo Marques e Yamanaka (2008), a inibição irreversível é progressiva,
aumentando com o tempo, até atingir máxima inibição. Os inibidores irreversíveis são muito
úteis em estudos de mecanismo de reação.
2.7.3 Inibição alostérica
Os inibidores classificados como não competitivos sofrem uma segunda classificação
que divide os modificadores (inibidores ou ativadores) em isostéticos ou alostéricos. Estes
inibidores, de maneira geral, não são influenciados pela concentração do substrato, inibindo
por ligação irreversível as enzimas, mas, não ao sítio ativo (SOOMRO e SHAH, 2012). O
inibidor não concorrente segue os locais alostéricos da enzima para a ligação, como pode ser
observado na figura 7.
33
Figura 7 - Representação do mecanismo de inibição alostérica de enzimas
Fonte: Adaptado de Khandelwal e Uthaman (2014).
Quando um ligante alostérico liga-se à enzima num sítio diferente do sítio ativo (um
sítio alostérico) é provocada uma alteração conformacional na enzima. Com base nesta
alteração é possível prever se haverá ou não ativação alostérica na enzima (SOOMRO e
SHAH, 2012). Se a alteração conformacional diminuir a atividade da enzima dizemos que há
inibição alostérica. Se a alteração conformacional aumentar a atividade da enzima dizemos
que há ativação alostérica.
34
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Realizar estudos in vitro e in silico com óleos essenciais visando à busca de
substâncias bioativas inibidoras de urease com potencial atividade anti-H. pylori.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar in vitro a atividade de óleos essenciais sobre a enzima urease, utilizada no
mecanismo de sobrevivência de Helicobacter pylori.
Identificar via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas os
compostos presentes nos óleos essenciais de Rosmarinus officinalis (Alecrim), Illicium verum
(Anis estrelado), Cymbopogon citratus (Capim limão), Cymbopogon winterianius (Citronela),
Syzygium aromaticum (Cravo-da-Índia), Eucalyptus globulus (Eucalipto globulus), Citrus
sinensis (Laranja doce), Citrus latifolia (Lima tahiti) e Citrus limon (Limão siciliano).
Investigar in silico a interação dos componentes presentes nos óleos essenciais
avaliados com a enzima urease.
Identificar as substâncias bioativas presentes em óleos essenciais com potencialidade
para aplicação no combate de doenças causadas por H. pylori.
35
4 METODOLOGIA
Os óleos de Rosmarinus officinalis (Alecrim), Illicium verum (Anis estrelado),
Cymbopogon citratus (Capim limão), Cymbopogon winterianius (Citronela), Syzygium
aromaticum (Cravo-da-Índia), Eucalyptus globulus (Eucalipto globulus), Citrus sinensis
(Laranja doce), Citrus latifolia (Lima tahiti) e Citrus limon (Limão siciliano) utilizados neste
trabalho foram adquiridos da empresa Laszlo Aromaterapia & Aromatologia. Todos os
reagentes utilizados eram de pureza analítica e foram utilizados sem tratamentos prévios.
4.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INIBIDORA DE UREASE
4.1.1 Obtenção da urease
Baseando-se no trabalho reportado por Biglar et al. (2010, p. 832), a urease de soja foi
escolhida como um sistema modelo para estudar o efeito de potenciais inibidores de urease. A
urease foi obtida triturando, em um liquidificador, 10 g de soja (fornecida pela empresa
COAMO em janeiro de 2015) em 100 mL de água destilada por aproximadamente 5 minutos.
Em seguida, utilizando o método tradicional de filtração o extrato foi filtrado. Na sequência a
solução obtida foi diluída em um fator de 200. O filtrado obtido foi utilizado, sem
purificações adicionais, como fonte de urease nos testes de inibição enzimática.
4.1.2 Preparação das amostras
Foram preparadas soluções acetônicas de nove óleos essenciais: Rosmarinus
officinalis (Alecrim), Illicium verum (Anis estrelado), Cymbopogon citratus (Capim limão),
Cymbopogon winterianius (Citronela), Syzygium aromaticum (Cravo-da-Índia), Eucalyptus
globulus (Eucalipto globulus), Citrus sinensis (Laranja doce), Citrus latifolia (Lima tahiti) e
Citrus limon (Limão siciliano), em sete concentrações distintas 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 150 e
36
250 ppm. Todo o procedimento experimental foi realizado em banho-maria a temperatura de
37 °C, visando simular a temperatura do corpo humano. Como controle optou-se pelo uso de
solução acetônica de tiouréia, também em sete concentrações 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 150 e
250 ppm, por esta ser considerada um inibidor de urease.
4.1.3 Testes in vitro
O procedimento experimental para determinação da atividade inibidora de urease
seguiu o procedimento proposto por Weatherburn (1967, p. 972). O reagente A foi preparado
dissolvendo 5 gramas de fenol e 25 mg de nitroprussiato de sódio em água destilada (q.s.p.
500 mL). O reagente B foi preparado dissolvendo 2,5 gramas de hidróxido de sódio e 4,2 mL
hipoclorito de sódio em água destilada (q.s.p. 500 mL). Os dois reagentes foram armazenados
em refrigerador.
Em cada tubo de ensaio foram colocados 100 µL de solução urease, 100 µL da solução
do óleo essencial a ser testado e 100 µL de solução de uréia 6 g/L. O tubo foi mantido em
banho-maria na temperatura de 37 ºC por trinta minutos. Em seguida acrescentou-se 500 µL
dos reagentes A e B. O tubo foi novamente mantido na mesma temperatura por mais trinta
minutos. Após o tempo indicado realizou-se leituras em um espectrofotômetro UV-VIS (PG
Instruments, modelo T80+) no comprimento de onda de 630 nm. Todas as determinações
foram realizadas em triplicata. Os valores de absorbância foram convertidos em porcentagem
de inibição de urease utilizando a equação 3:
I(%) = 100 – [(Ainibidor/Apadrão) × 100], onde:
(3)
Ainibidor: Valor da absorção apresentado no teste com óleo essencial;
Apadrão: Valor da absorção apresentado no teste com o padrão (tiouréia).
Os valores de concentração inibitória média (IC50) foram calculados utilizando o
programa Microsoft Excel.
37
4.2 CROMATOGRAFIA GASOSA
A composição química dos óleos essenciais foi estudada utilizando cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). As análises de CG-EM foram
realizadas empregando-se um cromatógrafo Hewlett Packard 6890, acoplado a um detector
seletivo de massas, operando com uma fonte de elétrons com energia de ionização de 70 eV.
O cromatógrafo operava com coluna capilar de sílica fundida do tipo HP-5 (30 m x 0,25 mm
x 0,25 μm). Empregou-se hélio de alta pureza como gás de arraste, com fluxo de 1 mL/min.
As análises foram realizadas com injetor operando a 250 ºC e interface a 280 ºC. Os volumes
injetados foram de 1 μL de solução, sem divisão de fluxo. A identificação dos constituintes
químicos dos óleos essenciais estudados foi realizada comparando-se o espectro de massas de
cada componente com espectros de massas armazenados nos bancos de dados digitais "NIST
Mass Spectrometry Data Center" e "Spectral Database for Organic Compounds".
4.3 ESTUDOS IN SILICO
4.3.1 Molinspiration
As propriedades moleculares dos constituintes majoritários dos óleos essenciais
bioativos foram calculadas, com base em descritores moleculares, utilizando a regra dos cinco
de
Lipinski,
no
software
Molinspiration
Online
Property
Calculation
Toolkit
(http://www.molinspiration.com/). Segundo Lipinski et al. (1997) é possível, a partir de
alguns parâmetros estruturais, realizar predição teórica para biodisponibilidade oral de
substâncias bioativas. Esta biodisponibilidade esta associada à absorção e a permeabilidade de
possíveis fármacos e depende de cinco parâmetros: (a) número de grupos aceptores de ligação
hidrogênio (nALH) menor ou igual a 10; (b) número de grupos doadores de ligação
hidrogênio (nDLH) menor ou igual a 5; (c) massa molecular (MM) menor ou igual a 500
g/mol; (d) coeficiente de partição octanol-água (milog P) menor ou igual a 5; (e) área de
superfície polar (PSA) menor ou igual a 140 Å2. Moléculas que violam mais do que uma
destas regras podem ter problemas com a biodisponibilidade oral.
38
As predições de bioatividade (ligante GPCR, modulador de canal de íon, inibidor de
quinase, ligante de receptor nuclear, inibidor de protease e inibidor de enzima) para os
constituintes majoritários dos óleos essenciais bioativos foram determinadas no software
Molinspiration Online Property Calculation Toolkit (http://www.molinspiration.com/).
4.3.2 Osiris
O software Osiris Property Explorer (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/)
avalia, a partir da estrutura molecular de uma substância química e com base em algoritmos
preditivos, o potencial risco toxicológico da entidade química. Essa predição baseia-se na
comparação do conjunto de fragmentos estruturais que a estrutura possui com o conjunto de
fragmentos do “Registo de Efeitos Tóxicos de Substâncias Químicas” (Registry of Toxic
Effects of Chemical Substances, RTECS) do Centro de Controle e Prevenção de Doenças
(Center for Disease Control and Prevention, CDC), órgão norte-americano, e com mais de 3
mil fármacos comerciais (BRITO, 2010). Os potenciais riscos toxicológicos avaliados foram
mutagenicidade, tumorogenicidade, efeitos irritantes e na reprodução humana por meio de
cores (vermelho = alto risco, amarelo = risco moderado e verde = sem risco).
Neste software avaliou-se também as propriedades drug-likeness e drug-Score. O
potencial drug-likeness de um composto está relacionado à semelhança com fármacos
comerciais, sendo baseado em descritores topológicos, dados estruturais ou outras
propriedades como cLogP e massa molecular. O potencial drug-score combina o potencial de
drug-likeness, cLogP, LogS (solubilidade em água), massa molecular e risco de toxicidade em
um valor que é utilizado para inferir o potencial de um composto se tornar um fármaco
(TONIN, 2009).
4.3.3 admetSAR (CHENG et al., 2012)
Os estudos de propriedades ADMET, que se referem aos processos farmacocinéticos
de absorção (A), distribuição (D), metabolismo (M), excreção (E) e toxicidade (T) foram
realizados utilizando o programa admetSAR (http://lmmd.ecust.edu.cn:8000/). Para o
39
processo de absorção foram avaliados os modelos de permeação da barreira sangue-cérebro,
absorção no intestino humano, permeabilidade em Caco-2, substrato e inibidor de
glicoproteína-P e transporte renal de cátions orgânicos. Para o processo de metabolização
foram avaliados os modelos de substrato e inibidor de enzimas do complexo citocromo P450
(CYP). Para o processo de toxicidade foram avaliados os modelos de toxicidade AMES,
carcinogenicidade e toxicidade oral aguda.
4.3.4 Estudos de docking molecular
A estrutua da enzima urease, código PDB 1E9Z (HA et al., 2001), foi obtida do banco
de dados Protein Data Bank (PDB) (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do).
A enzima foi carregada no software iGEMDOCK 2.1 (HSU et al. 2011), utilizando na
seção "Prepare Binding Site" a opção "by current file". Os arquivos dos produtos naturais
(ligantes) foram carregados em formato ".mol", as estruturas dos ligantes foram previamente
otimizadas utilizando o software ACD ChemSketch. Os parâmetros foram ajustados para
"Standard Docking", em que a população foi definida como 200, as gerações como 70 e o
número de soluções como 2. As configurações padrão foram mantidas na seção "Scoring
function".
Para visualização e tratamento dos docking utilizou-se o programa UCSF Chimera
1.10.1.
40
5 RESULTADOS
Os resultados obtidos neste trabalho estão divididos em três seções. A seção 5.1 versa
sobre a avaliação dos óleos essenciais no modelo de inibição da urease isolada de soja. A
seção 5.2 versa sobre a determinação da composição química dos óleos essenciais estudados.
A seção 5.3 apresenta os resultados dos estudos in silico com os constiuintes majoritários dos
óleos essenciais que apresentaram bioatividade sobre a enzima urease.
5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INIBIDORA DE URESE
A avaliação da atividade inibidora de urease dos óleos essenciais foi realizada
utilizando a tiouréia como padrão, por esta ser considerada um inibidor de urease. Os testes
realizados foram baseados no trabalho reportado por Biglaret et al. (2010, p. 832).
A coloração azul observada nos testes (Figura 8) é resultado da reação da amônia,
produzida pela hidrólise da uréia, com fenol e hipoclorito de sódio alcalino resultando na
produção de indofenol, um corante azul que pode ser facilmente determinado por análise
colorimétrica. A reação foi catalisada pelo uso de nitroprussiato de sódio, e ao final realizouse a leitura de absorção dos testes no espectrofotômetro no comprimento de onda de 630 nm.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 8 - Teste in vitro de inibição de urease pelo uso de tiouréia nas concentrações de: (a) 6,25; (b) 25;
(c) 50 e (d) 100 ppm e seus respectivos espectros na região do visível
Fonte: Autoria própria.
41
Observa-se que a avaliação inibidora da urease pode ser verificada visualmente ou a
partir da comparação dos espectros obtidos pela espectroscopia UV-Vis (Figura 8),
permitindo neste caso uma análise quantitativa. Com base neste teste observa-se que a
atividade inibitória de urease é dependente da concentração de tiouréia. O estudo da relação
concentração de tiouréia e porcentagem de inibição revela um comportamento logarítmico
para a linha de tendência (Figura 9), tal como relatado na literatura (BIGLAR et al., 2012).
Estes comportamentos são esperados para os óleos essenciais com potencialidade para
inibição da enzima urease.
Figura 9 - Comportamento gráfico do teste de inibição de urease pela tiouréia
Fonte: Autoria própria.
Seguindo os critérios estabelecidos, quatro das nove amostras de óleos essenciais
estudados apresentaram ser possíveis candidatos à inibidores de urease (Figura 10), sendo
eles: Citrus sinensis (Laranja doce), Cymbopogon winterianus (Citronela), Cymbopogon
citratus (Capim limão) e Rosmarinus officinalis (Alecrim). Observa-se neste caso, assim
como para o padrão, que os óleos essenciais bioativos apresentam efeito dependente da
concentração.
42
Óleos essenciais que apresentaram bioatividade
Óleos essenciais que não apresentaram bioatividade
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
Figura 10 - Teste in vitro de inibição de urease pelo uso de: a) Rosmarinus officinalis; b) Cymbopogon
citratus; c) Cymbopogon winterianius; d) Citrus sinensis; e) Syzygium aromaticum; f) Eucaliptus globulus;
g) Citrus latofolia; h) Citrus limon; i) Illicium verum em diferentes concentrações
Fonte: Autoria própria.
43
Para fins de estudo da relação da concentração dos óleos essenciais bioativos e
porcentagem de inibição de urease utilizou-se apenas as quatro concentrações que melhor se
ajustam ao comportamento logarítmico. Este desempenho gráfico de inibição da enzima
urease pelos óleos essenciais de Rosmarinus officinalis, Cymbopogon citratus, Cymbopogon
winterianius e Citrus sinensis são apresentados na figura 11.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 11 - Comportamento gráfico do teste de inibição de urease pelos óleos essenciais de (a) Rosmarinus
officinalis; (b) Cymbopongon citratus; (c) Cymbopongon winterianius; (d) Citrus sinensis
Fonte: Autoria própria.
O perfil da relação concentração e inibição enzimática dos quatro óleos essenciais
bioativos mostrou-se semelhante ao perfil encontrado para o inibidor padrão. Utilizando a
equação da linha de tendência obtida em cada um dos estudos calculou-se a concentração
inibitória média (IC50) para os óleos essenciais bioativos, cujos valores são apresentados na
tabela 1.
Pode-se observar que os óleos essenciais de Rosmarinus officinalis, Cymbopogon
citratus, Cymbopogon winterianius e Citrus sinensis foram capazes de inibir a atividade da
enzima urease, embora tenham apresentado grande variação de IC50 (60,7 - 789,7 ppm). Como
esperado, a tiouréia foi quem apresentou melhor resultado, isso por necessitar de uma
concentração extremamente pequena para IC50.
44
Tabela 1 - Valores de IC50 para os óleos essenciais de
Rosmarinus
officinalis,
Cymbopogon
citratus,
Cymbopogon winterianius e Citrus sinensis.
Óleo essencial/padrão
IC50 (ppm)
Rosmarinus officinalis
789,7
Cymbopogon citratus
167,5
Cymbopogon winterianius
67,6
Citrus sinensis
60,7
Tiouréia
7,85
Fonte: Autoria própria.
Embora tenham apresentado valor de IC50 menor do que o padrão tiouréia observa-se
claramente, ainda na avaliação qualitativa (Figura 10), que os óleos essenciais de Rosmarinus
officinalis, Cymbopogon citratus, Cymbopogon winterianius e Citrus sinensis apresentam
potencial inibição da enzima urease. Para os demais óleos essenciais, mesmo para os testes
com maior concentração (250 ppm), não observou-se inibição da enzima urease.
Após o screening in vitro apresentado nesta seção realizou-se o estudo da composição
química, via análise de CG-EM, de cada óleo essencial avaliado visando correlacionar a
bioativade, ou ausência desta, com os constituintes químicos.
5.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
A composição química dos óleos essenciais Rosmarinus officinalis (Alecrim), Illicium
verum (Anis estrelado), Cymbopogon citratus (Capim limão), Cymbopogon winterianius
(Citronela), Syzygium aromaticum (Cravo-da-Índia), Eucalyptus globulus (Eucalipto
globulus), Citrus sinensis (Laranja doce), Citrus latifolia (Lima tahiti) e Citrus limon (Limão
siciliano) foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
(CG-EM). Embora a CG-EM seja amplamente utilizada para o estudo da composição química
de amostras complexas, para os óleos essenciais a identificação dos constituintes químicos
nem sempre é precisa. Essa limitação é devido a semelhança espectral observada para vários
constituintes químicos presentes em óleos essenciais (ZELLNER et al., 2009, p. 159),
resultando em erros caso a identificação seja realizada apenas pelo banco de dados do
espectrômetro de massas.
45
Para os óleos essenciais estudados foram identificados entre 77,78 a 97,38% dos
constituintes (Tabelas 2 - 10). Os compostos foram identificados com base no tempo de
retenção e comparando-se o espectro de massas de cada componente com espectros de massas
armazenados nos bancos de dados digitais "NIST Mass Spectrometry Data Center" e
"Spectral Database for Organic Compounds".
A figura 12 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Rosmarinus officinalis
(Alecrim).
Figura 12 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Rosmarinus officinalis.
Fonte: Autoria própria.
No óleo essencial de Rosmarinus officinalis foram identificados quinze compostos
totalizando 97,38% da composição (Tabela 2), sendo os constituintes majoritários2 os
monoterpenos eucaliptol (32,23%), cânfora (26,26%), sabineno (8,52%), canfeno (5,86%) e
D-limoneno (3,58%).
H3C
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
O
CH3
H3C
CH3
Eucaliptol
2
H3C
O
Cânfora
H2C
Sabineno
CH2
Canfeno
H3C
CH2
D-limoneno
As estruturas moleculares apresentadas neste trabalho levam em consideração aspectos estereoquímicos
(quando presente) reportados nos artigos de referência.
46
Os constituintes químicos encontrados no óleo estudado estão de acordo com os
resultados obtidos por outros autores (MELO et al., 2011; CLEFF et al. 2012; MILADI et al.,
2013).
Tabela 2 - Composição química do óleo essencial de Rosmarinus officinalis.
Composto3
Sabineno
Tempo de retenção (min.)
Percentual
6,408
8,52
Canfeno
6,896
5,86
α-Pineno
7,841
3,22
β-Pineno
8,327
1,10
p-Cimeno
9,654
1,80
D-limoneno
9,789
3,58
Eucaliptol
9,985
32,23
Linalool
12,848
1,52
Cânfora
14,971
26,26
Isoborneol
15,436
2,11
Borneol
15,855
3,04
α-Terpineol
16,962
1,83
Acetato de bornila
21,373
3,00
β-Cariofileno
27,280
2,89
Humuleno
28,729
0,42
Total
97,38
Fonte: Autoria própria.
A figura 13 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Illicium verum (Anis
estrelado).
Figura 13 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Illicium verum
Fonte: Autoria própria.
3
Os espectros de massas dos compostos identificados são apresentados na seção Anexos.
47
No óleo essencial de Illicium verum foram identificados quinze compostos totalizando
86,14% da composição (Tabela 3), sendo os constituintes majoritários os fenilpropanóides
trans-anetol (64,75%), estragol (6,75%), linalol (2,58%), p-anisaldeído (2,53%) e anisil
acetona (2,12%).
H3C
H3C
O
H3C
O
H3C
O
H3C
OH
O
CH2
O
CH3
trans-anetol
H3C
CH2
estragol
CH3
O
p-anisaldeído
linalol
CH3
anisil acetona
O perfil químico apresentado pelo óleo essencial de Illicium verum é semelhante ao
relatado por outros autores (WEY et al., 2014; WONG et al., 2014; DZAMIC et al., 2009;
CHEMPAKAM e BALAJI, 2008). Segundo Chempakam e Balaji (2008) o trans-anetol é,
geralmente, encontrado na proporção de 80-90% no óleo essencial obtido de Illicium verum.
Tabela 3 - Composição química do óleo essencial de Illicium verum.
Composto
Tempo de retenção
Percentual
α-Felandreno
8,823
0,15
D-Limoneno
9,782
2,04
Linalool
12,848
2,58
δ-Terpineol
16,328
0,48
α-Terpineol
16,970
0,43
Estragol
17,361
6,75
p-Anisaldeído
19,955
2,53
cis-Anetol
20,428
1,90
trans-Anetol
22,315
64,75
Cetona anísica
25,581
0,14
Anisil acetona
25,844
2,12
β-Cariofileno
27,334
0,84
α-Bergamoteno
27,984
0,88
γ-Muruleno
31,672
0,26
Nerolidol
33,238
0,29
Total
86,14
Fonte: Autoria própria.
48
A figura 14 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Cymbopogon citratus
(Capim limão).
Figura 14 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Cymbopogon citratus
Fonte: Autoria própria.
No óleo essencial de Cymbopogon citratus foram identificados dezessete compostos
totalizando 77,78% da composição (Tabela 4), sendo os constituintes majoritários os
monoterpenos geranial (27,93%), neral (21,51%), geraniol (8,05%), nerol (4,71%) e
esqualeno (2,90%).
CH3
CH3
H3C
O
CH3
O
H3C
CH3
geranial
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
neral
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
H3C
CH3
geraniol
OH
H3C
nerol
CH3
esqualeno
49
O perfil químico apresentado pelo óleo essencial de Cymbopogon citratus é
semelhante ao relatado por outros autores (MOHAMED et al., 2014; HANAA et al., 2012;
MATASYOH et al., 2011; BARBOSA et al., 2008). Nos trabalhos consultados, os aldeídos
monoterpênicos neral e geranial são reportados como constituintes majoritários. Barbosa et al.
(2008), por exemplo, - após estudar óleos essenciais obtidos de doze amostras de
Cymbopogon citratus adquiridas em Minas Gerais e no Paraná - reportaram que a
porcentagem total dos isômeros neral e geranial variou de 40,7% a 75,4% nos óleos essenciais
obtidos. No presente trabalho, a somatoria das porcentagens dos isômeros geranial e neral está
de acordo com os dados reportados por Barbosa et al. (2008).
Tabela 4 - Composição química do óleo essencial de Cymbopogon citratus.
Composto
Tempo de retenção
Percentual
6-metil-5-Hepten-2-ona
8,217
1,34
4-Nonanona
11,591
0,29
cis-Verbenol
11,935
1,94
Linalol
12,835
1,35
Neral
19,728
21,51
Geraniol
20,451
8,05
Geranial
21,253
27,93
Nerol
25,808
4,71
β-Cariofileno
27,336
2,54
m-Eugenol
28,569
0,37
Humuleno
28,747
0,29
δ-Cadineno
31,328
1,64
γ-Muruleno
31,676
0,55
Óxido de cariofileno
34,133
0,46
Miristato de isopropila
43,025
1,00
Nonadecanol
44,927
0,91
Esqualeno
68,752
2,90
Total
77,78
Fonte: Autoria própria.
A figura 15 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Cymbopogon winterianus
(Citronela).
50
Figura 15 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Cymbopogon winterianus
Fonte: Autoria própria.
No óleo essencial de Cymbopogon winterianus foram identificados dezoito compostos
totalizando 79,60% da composição (Tabela 5), sendo os constituintes majoritários os
compostos citronelal (21,10%), geraniol (20,94%), citronelol (12,84%), nerol (5,58%) e αelemol (4,06%).
OH
nerol
O
citronelal
OH
geraniol
OH
OH
citronelol
α-elemol
A composição química reportada na tabela 5 está de acordo com os valores
referenciais descritos na literatura para óleos essencias de Cymbopogon winterianus
(KUMAR e SHUKLA, 2014; BLANK et al., 2007).
51
Tabela 5 - Composição química do óleo essencial de Cymbopogon winterianus.
Composto
Tempo de retenção
Percentual
D-Limoneno
9,743
4,11
Linalol
12,823
1,12
Isopulegol
14,871
1,97
Citronelal
15,558
21,10
Decanal
17,592
0,16
Citronelol
18,926
12,84
Neral
19,314
0,42
Geraniol
20,306
20,94
m-Eugenol
24,651
1,33
Nerol
25,788
5,58
metil-Eugenol
26,640
0,12
Metil m-Eugenol
30,606
0,48
γ-Muruleno
31,716
2,50
α-Elemol
32,809
4,06
Nerolidol
33,106
0,37
t-Cadinol
36,436
1,01
Eudesmol
36,767
0,31
α-Cadinol
36,935
1,18
Total
79,60
Fonte: Autoria própria.
A figura 16 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Syzygium aromaticum
(Cravo botões).
Figura 16 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Syzygium aromaticum
Fonte: Autoria própria.
52
No óleo essencial de Syzygium aromaticum foram identificados oito compostos
totalizando 97,13% da composição (Tabela 6), sendo os constituintes majoritários os
fenilpropanóides eugenol (58,85%), acetato de eugenila (14,86%) e m-eugenol (6,57%) e o
sesquiterpeno β-Cariofileno (11,09%).
OH
O
CH3
O
H3C
O
CH3
CH3
OH
O
O
CH3
H2C
H
CH2
eugenol
CH2
CH2
acetato de eugenila
m-eugenol
H
CH3
CH3
β-cariofileno
A composição química reportada na tabela 6 está de acordo com os valores
referenciais descritos na literatura para óleos essencias obtidos de botões florais de carvo-daÍndia (COSTA et al., 2011; RANASINGHE et al., 2002; PEREIRA et al., 2008).
Tabela 6 - Composição química do óleo essencial de Syzygium aromaticum.
Composto
Tempo de retenção
Percentual
Acetato de isobornila
14,729
2,37
m-Eugenol
24,615
6,57
Eugenol
25,657
58,85
β-Cariofileno
27,544
11,09
Humuleno
28,852
2,23
Guaiol
31,692
0,52
Acetato de eugenila
32,199
14,86
Óxido de cariofileno
34,204
0,64
Total
97,13
Fonte: Autoria própria.
A figura 17 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Eucalyptus globulus
(Eucalipto globulus).
53
Figura 17 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Eucalyptus globulus
Fonte: Autoria própria.
No óleo essencial de Eucalyptus globulus foram identificados cinco compostos
totalizando 97,13% da composição (Tabela 7), sendo os constituintes majoritários o eucaliptol
(78,07%), γ-terpineno (9,48%), p-cimeno (6,50%), α-felandreno (1,04%) e estragol (0,23%).
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
O
O
H3C
CH3
eucaliptol
H3C
CH3
γ-terpineno
H3C
CH3
p-cimeno
H3C
CH3
estragol
CH2
α-felandreno
Baseado em dados da literatura (MACEDO et al., 2009; MIYAMOTO et al., 2009),
observa-se que o teor de eucaliptol nos óleos essenciais de Eucalyptus globulus cultivados no
Brasil apresentam valores bastante variável. Macedo et al. (2009), por exemplo, reportou que
o óleo essencial de Eucalyptus globulus possui 83,89% de eucaliptol. No estudo de Miyamoto
et al. (2009) o teor de eucaliptol era de apenas 49%.
54
Tabela 7 - Composição química do óleo essencial de Eucalyptus globulus.
Composto
Tempo de retenção
Percentual
8,827
1,04
α-Felandreno
p-Cimeno
9,787
6,50
Eucaliptol
10,280
78,07
γ-Terpineno
11,111
9,48
Estragol
21,271
0,23
Total
95,32
Fonte: Autoria própria.
A figura 18 apresenta o cromatograma do óleo essencial de C. sinensis (Laranja doce).
Figura 18 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Citrus sinensis
Fonte: Autoria própria.
No óleo essencial de Citrus sinensis foram identificados seis compostos totalizando
89,87% da composição (Tabela 8), sendo o monoterpeno D-limoneno (75,68%) e seus óxidos
os constituintes majoritários.
CH3
CH3
H3C
CH2
D-limoneno
H3C
CH2
cis-
CH3
O
H3C
O
CH2
trans-óxido de limoneno
55
Estudos realizados recentemente por Bonaccorsi et al. (2011), sobre distribuição
enantiomérica dos componentes de óleos essenciais obtidos de frutas do gênero Citrus,
indicam que em óleos essenciais de laranja a forma dextrorrotatória do limoneno está presente
em 99,5%, enquanto seu antípoda está presente em 0,5%. Desta forma, adotou-se neste
trabalho a configuração absoluta do D-limoneno para o óleo essencial de Citrus sinensis,
assim como para os demais óleos essenciais.
Tabela 8 - Composição química do óleo essencial de Citrus sinensis.
Composto
D-Limoneno
Tempo de retenção
Percentual
9,955
75,68
Linalol
12,811
0,73
cis-Óxido de limoneno
14,293
2,74
trans-Óxido de limoneno
14,504
3,05
trans-Carveol
18,276
3,85
Carvona
19,403
3,82
Total
89,87
Fonte: Autoria própria.
A figura 19 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Citrus latifólia (Lima
tahiti).
Figura 19 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Citrus latifolia
Fonte: Autoria própria.
56
No óleo essencial de Citrus latifolia foram identificados vinte e um compostos
totalizando 78,23% da composição (Tabela 9), sendo os hidrocarbonetos monoterpênicos Dlimoneno (28,52%), γ-terpineno (11,13%), α-pineno (7,51%), β-bisaboleno (7,10%) e transα-bergamoteno (4,84%) os constituintes majoritários.
CH2
CH3
CH3
H3C
CH3
β-bisaboleno
CH3
H3C
CH2
D-limoneno
H3C
CH3
α-pineno
γ-terpineno
trans-α-bergamoteno
Tabela 9 - Composição química do óleo essencial de Citrus latifolia.
Composto
Tempo de retenção
Percentual
3-Careno
7,730
0,41
α-Pineno
7,854
7,51
β-Pineno
8,327
2,51
p-Cimeno
9,684
0,56
D-Limoneno
9,978
28,52
γ-Terpineno
11,110
11,13
Linalool
12,830
0,55
δ-Terpineol
16,328
0,56
α-Terpineol
16,970
1,35
Decanal
17,598
0,20
Neral
18,902
0,20
Lemonol
19,320
3,04
Geranial
19,889
0,26
Geraniol
24,900
3,99
Nerol
25,699
1,42
β-Cariofileno
27,303
1,93
trans-α-Bergamoteno
28,021
4,84
α-Bisaboleno
30,804
0,79
β-Bisaboleno
31,154
7,10
Óxido de cariofileno
34,127
0,24
Cumarina
48,585
1,12
Total
78,23
Fonte: Autoria própria.
57
A figura 20 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Citrus limon (Limão
siciliano).
Figura 20 - Cromatograma obtido por CG-EM para análise da composição química do óleo essencial de
Citrus limon
Fonte: Autoria própria.
No óleo essencial de Citrus limon foram identificados 15 compostos totalizando
94,11% da composição (Tabela 10), sendo os hidrocarbonetos monoterpênicos D-limoneno
(49,66%), γ-terpineno (14,84%) e α-pineno (11,42%) os constituintes majoritários.
CH3
CH3
H3C
CH2
D-limoneno
H3C
CH3
α-pineno
γ-terpineno
Guerra et al. (2013) reportaram que o óleo essencial de Citrus limon, adquirido da
empresa Ferquima, possui como constituintes majoritários os compostos neral (29,4%),
limoneno (21,5 %), geranial (19,9%), trans-nerolidol (7,7%) e citral (6,4%). No entanto,
Moufida e Marzouk (2003), em um estudo abrangente, reportaram que a concentração de
limoneno em óleos essenciais de Citrus varia entre 45 - 75%. Segundo informações da
58
literatura (GUERRA et al., 2013; CASTRO, 2006) estas variações na composição dos óleos
essenciais podem ser influenciadas pelas condições climáticas, posição geográfica, forma de
cultivo e colheita, estágio de maturidade da planta na colheita e fatores genéticos.
Tabela 10 - Composição química do óleo essencial de Citrus limon.
Composto
Tempo de retenção
Percentual
3-Careno
7,725
1,36
α-Pineno
7,862
11,42
β-Pineno
8,319
1,65
D-Limoneno
10,098
49,66
γ-Terpineno
11,153
14,84
δ-Terpineol
16,316
0,40
γ-Terpineol
16,939
0,62
Neral
19,271
2,52
Geranial
20,664
3,89
Geraniol
24,833
1,96
Nerol
25,663
0,51
β-Cariofileno
27,270
0,87
cis-α-Bisaboleno
30,773
0,29
β-Bisaboleno
31,058
3,52
Cumarina
48,519
0,60
Total
94,11
Fonte: Autoria própria.
5.3 ESTUDOS IN SILICO
Devido ao grande número de compostos presentes nos óleos essenciais estudados e a
complexidade dos resultados, optou-se por avaliar in silico os cinco constituintes majoritários
de cada óleo essencial que apresentaram resultados de inibição de urease.
5.3.1 Molinspiration
As propriedades moleculares, calculadas no programa Molinspiration, dos
constituintes majoritários dos óleos essenciais bioativos são apresentadas nas tabelas 11 - 14.
59
Tabela 11 - Propriedades moleculares dos compostos majoritários do óleo de Rosmarinus officinalis
calculadas no software Molinspiration.
Composto
miLogP
TPSA
MM
nALH
nDLH
nviolações
Eucaliptol
2,716
9,234
154,253
1
0
0
Cânfora
2,160
17,071
152,237
1
0
0
Sabineno
3,102
0,0
136,238
0
0
0
Canfeno
3,329
0,0
136,238
0
0
0
D-Limoneno
3,615
0,0
136,238
0
0
0
Fonte: Autoria própria.
Tabela 12 - Propriedades moleculares dos compostos majoritários do óleo de Cymbopogon citratus
calculadas no software Molinspiration.
Composto
miLogP
TPSA
MM
nALH
nDLH
Nviolações
Geranial
3,654
17,071
152,237
1
0
0
Neral
3,604
17,071
154,253
1
0
0
Lemonol
3,202
20,228
154,253
1
1
0
Nerol
3,202
20,228
154,253
1
1
0
Esqualeno
9,622
0,0
410,73
0
0
1
Fonte: Autoria própria.
Tabela 13 - Propriedades moleculares dos compostos majoritários do óleo de Cymbopogon winterianius
calculadas no software Molinspiration.
Composto
miLogP
TPSA
MM
nALH
nDLH
Nviolações
Citronelal
3,604
17,071
154,253
1
0
0
Guaniol
3,202
20,228
154,253
1
1
0
Citronelol
2,892
20,228
140,226
1
1
0
Nerol
3,202
20,228
154,253
1
1
0
D-Limoneno
3,615
0,0
136,238
0
0
0
Fonte: Autoria própria.
Tabela 14 - Propriedades moleculares dos compostos majoritários do óleo de Citrus sinensis calculadas no
software Molinspiration.
Composto
miLogP
TPSA
MM
nALH
nDLH
Nviolações
D-Limoneno
3,615
0,0
136,238
0
0
0
trans-Carveol
2,699
20,228
152,237
1
1
0
Carvona
2,513
17,071
150,221
1
0
0
3,500
12,528
154,253
1
0
0
3,500
12,528
154,253
1
0
0
trans-Óxido de
limoneno
cis-Óxido de
limoneno
Fonte: Autoria própria.
60
A partir da análise dos dados de propriedades moleculares calculados (Tabelas 11 a
14) observa-se que os constituintes químicos presentes nos óleos essenciais estão de acordo
com a regra dos cinco de Lipinski, indicando assim, possuir potencial de biodisponibilidade
oral (LIPINSKI et al., 1997). Esses resultados indicam que os óleos essenciais, assim como já
vêm sendo realizado pela população, são potenciais para serem administrados de forma oral.
É válido lembrar que, embora outras vias de administração de fármacos tenham sido
estudadas, a via oral ainda continua sendo preferencial. Isto ocorre devido à sua conveniência,
baixo custo e maior aderência ao tratamento pelo paciente (SOUZA et al., 2007).
No mesmo software realizou-se predições de bioatividade (ligante GPCR, modulador
de canal de íon, inibidor de quinase, ligante de receptor nuclear, inibidor de protease e
inibidor de enzima) para os constituintes majoritários dos óleos essenciais bioativos (Tabelas
15 a 18). Entre as bioativadades mencionadas, a inibição enzimática é a que mais interessa
para este trabalho, uma vez que pode ser um parâmetro para selecionar potenciais inibidores
de urease. As demais bioatividades podem indicar outras formas de ação da substância em
análise no organismo humano.
Tabela 15 - Predição de bioatividades, calculadas no software Molinspiration, para os compostos
majoritários do óleo essencial de Rosmarinus officinalis.
Ligante
Modulador de
Inibidor de
Liagante de
Inibidor de
Inibidor de
GPCR
canal de íon
quinase
receptor nuclear
protease
enzima
Eucaliptol
-0,86
-0,36
-1,14
-0,78
-1,29
-0,41
Cânfora
-0,79
-0,56
-2,11
-1,21
-0,95
-0,52
Sabineno
-1,14
-0,33
-1,79
-0,69
-0,78
-0,60
Composto
Canfeno
-1,02
-0,55
-1,85
-1,14
-1,39
-0,82
D-Limoneno
-0,91
-0,27
-2,01
-0,34
-1,38
-0,21
Fonte: Autoria própria.
Tabela 16 - Predição de bioatividades, calculadas no software Molinspiration, para os compostos
majoritários do óleo essencial de Cymbopogon citratus.
Ligante
Modulador de
Inibidor de
Liagante de
Inibidor de
Inibidor de
GPCR
canal de íon
quinase
receptor nuclear
protease
enzima
Geranial
-0,86
-0,25
-1,29
-0,42
-0,57
0,02
Neral
-0,86
-0,25
-1,29
-0,42
-0,57
0,02
Lemonol
-0,60
0,07
-1,32
-0,20
-1,03
0,28
Nerol
-0,60
0,07
-1,32
-0,20
-1,03
0,28
Esqualeno
0,04
0,01
-0,10
0,19
-0,03
0,16
Composto
Fonte: Autoria própria.
61
Tabela 17 - Predição de bioatividades, calculadas no software Molinspiration, para os compostos
majoritários do óleo essencial de Cymbopogon winterianius.
Ligante
Modulador de
Inibidor de
Liagante de
Inibidor de
Inibidor de
GPCR
canal de íon
quinase
receptor nuclear
protease
enzima
Citronelal
-0,83
-0,08
-1,30
-0,61
-0,50
-0,03
Geraniol
-0,60
0,07
-1,32
-0,20
-1,03
0,28
Citronelol
-0,81
-0,24
-1,16
-0,61
-0,83
-0,12
Nerol
-0,60
0,07
-1,32
-0,20
-1,03
0,28
D-Limoneno
-0,91
-0,27
-2,01
-0,34
-1,38
-0,21
Composto
Fonte: Autoria própria.
Tabela 18 - Predição de bioatividades, calculadas no software Molinspiration, para os compostos
majoritários do óleo essencial de Citrus sinensis.
Composto
Ligante
Modulador de
Inibidor de
Liagante de
Inibidor de
Inibidor de
GPCR
canal de íon
quinase
receptor nuclear
protease
enzima
D-Limoneno
-0,91
-0,27
-2,01
-0,34
-1,38
-0,21
trans-Carveol
-0,55
0,14
-1,40
0,25
-0,89
0,23
Carvona
-1,23
-0,30
-2,51
-0,54
-1,21
-0,45
-0,56
-0,46
-1,64
-0,19
-0,30
0,29
-0,56
-0,46
-1,64
-0,19
-0,30
0,29
trans-Óxido de
limoneno
cis-Óxido de
limoneno
Fonte: Autoria própria.
Segundo Singh, Gupta e Verma (2013) para moléculas orgânicas existe a
probabilidade de bioatividade se o escore for maior do que zero; se o escore for entre -5,00 e
0,0 existe a probabilidade da substância ser moderadamente bioativa; se o escore for menor do
que -5,00 a substância é considerada inativa. A partir destes critérios observa-se que existe a
probabilidade de todos os constituintes majoritários dos óleos essenciais estudados serem
moderamente ativos frente a enzimas proteases. Com relação à inibição de enzimas observase que os constituintes majoritários de Rosmarinus officinalis podem ser moderamente ativos
e para os demais óleos um ou mais compostos apresentam probabilidade de bioativade.
62
5.3.2 Osiris
O software Osiris Property Explorer utiliza uma lista de 5300 fragmentos moleculares,
onde a freqüência de ocorrência de cada fragmento é determinada com base em uma coleção
de 3300 fármacos comerciais e 15000 compostos da coleção Fluka que não são fármacos
comerciais. As análises demonstram que 80% dos fármacos comerciais têm um valor de druglikeness positivo, enquanto a grande maioria dos compostos Fluka apresenta valores negativos
(TONIN, 2009).
Os resultados obtidos através do software Osiris para os constituintes majoritários dos
óleos essenciais bioativos são apresentados nas tabelas 19 a 22. Nesta ferramenta avaliou-se
quatro potenciais riscos toxicológicos: mutagenicidade, tumorigênico, irritante e sobre a
reprodução humana.
Tabela 19 - Predição de toxicidade, determinadas no software Osiris, para os constituintes majoritários do
óleo essencial de Rosmarinus officinalis.
Toxicidade
Composto
Reprodução
Drug-likeness
Drug-score
Mutagênico
Tumorigênico
Irritante
Eucaliptol
alto risco
sem risco
sem risco
alto risco
-3,21
0,17
Cânfora
alto risco
alto risco
alto risco
alto risco
-3,71
0,06
Sabineno
sem risco
sem risco
sem risco
sem risco
- 6,78
0,45
Canfeno
sem risco
sem risco
sem risco
sem risco
- 5,86
0,45
D-Limoneno
sem risco
sem risco
Moderado
sem risco
-21,80
0,35
Fonte: Autoria própria.
Tabela 20 - Predição de toxicidade, determinadas no software Osiris, para os constituintes majoritários do
óleo essencial de Cymbopogon citratus.
Toxicidade
Composto
Drug-likeness
Drug-score
alto risco
-7,31
0,10
0,10
Mutagênico
Tumorigênico
Irritante
Reprodução
Geranial
Moderado
alto risco
Moderado
Neral
Moderado
alto risco
Moderado
alto risco
-7,31
Lemonol
sem risco
sem risco
alto risco
sem risco
-3,57
0,27
Nerol
sem risco
sem risco
alto risco
sem risco
-3,57
0,27
Esqualeno
sem risco
sem risco
sem risco
sem risco
-3,52
0,14
Fonte: Autoria própria.
63
Tabela 21 - Predição de toxicidade, determinadas no software Osiris, para os constituintes majoritários do
óleo essencial de Cymbopogon winterianius.
Toxicidade
Composto
Mutagênico
Tumorigênico
Irritante
Reprodução
Drug-likeness
Drug-score
Citronelal
sem risco
sem risco
alto risco
sem risco
-6,98
0,27
Geraniol
sem risco
sem risco
alto risco
sem risco
-3,57
0,27
Citronelol
sem risco
sem risco
alto risco
alto risco
-8,68
0,16
Nerol
sem risco
sem risco
alto risco
sem risco
-3,57
0,27
D-Limoneno
sem risco
sem risco
moderado
sem risco
-21,80
0,35
Fonte: Autoria própria.
Tabela 22 - Predição de toxicidade, determinadas no software Osiris, para os constituintes majoritários do
óleo essencial de Citrus sinensis.
Toxicidade
Composto
Drug-likeness
Mutagênico
Tumorigênico
Irritante
Drug-score
Reprodução
D-Limoneno
sem risco
sem risco
moderado
sem risco
-21,80
0,35
trans-Carveol
sem risco
sem risco
alto risco
sem risco
-18,48
0,28
Carvona
alto risco
alto risco
alto risco
sem risco
-18,98
0,10
trans-Óxido de
sem risco
sem risco
sem risco
sem risco
-5,60
0,47
sem risco
sem risco
sem risco
sem risco
-5,60
0,47
limoneno
cis-Óxido de
limoneno
Fonte: Autoria própria.
No estudo utilizando o software Osiris (Tabelas 19 a 22) observou-se para o óleo
essencial de R. officinalis que dois dos constituintes majoritários (eucaliptol e cânfora)
apresentam alto risco toxicológico para diferentes parâmetros avaliados. Resultado
semelhante é observado para o óleo essencial de C. citratus, no qual os dois constituintes
majoritários (geranial e neral) apresentam alto risco toxicológico tumorigênico e sobre a
reprodução humana. Para o óleo essencial de C. winterianius observou-se alto risco de
irritância para quatro dos constituintes majoritários. Já o óleo essencial de C. sinensis seria o
mais seguro do ponto de vista toxicológico, uma vez que apenas a carvona e o trans-carveol
(presente em 3,82 e 3,85%, respectivamente) apresentam efeitos indesejados.
O potencial tumorigênico apresentado pelos compotos geranial e neral foi avaliado,
utilizando ratos e camundongos, pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos
Estados Unidos. Os pesquisadores colaboradores nesse estudo concluiram que o citral
(mistura dos isômeros geranial e neral) não causam câncer em ratos machos ou fêmeas. No
64
entanto, observaram um aumenta de linfomas em ratos fêmeas que pode estar associado ao
consumo de citral (U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, 2003).
Ressalta-se que a predição de potencial toxicológico observada para os quatro óleos
essenciais bioativos são consideravelmente satisfatórios para potenciais fármacos inibidores
de urease.
Com relação a propriedade drug-likeness um valor positivo indica que a molécula
avaliada contém grupos frequentes em fármacos comerciais. Já para a propriedade drug-score
valores entre 0,1 e 1,0 indicam que a substância avaliada possui propriedades desejadas para
candidatos a fármacos. De acordo com estes parâmetros observa-se que todos oscompostos
avaliados não possuem semelhança estrutural com fármacos comerciais. No entanto, a maioria
dos compostos avaliados possuem potencial para se tornar um fármaco.
5.3.3 admetSAR
O programa caracteriza-se como uma moderna ferramenta de modelagem in silico de
propriedades farmacocinéticas, estando estas integradas ao processo de planejamento de
fármacos e sendo utilizado como complemento aos estudos in vitro e in vivo.
Outras propriedades ADMET dos constituintes majoritários dos óleos essenciais
bioativos foram estudadas no software admetSAR (Tabelas 22 a 26). Este software tem sido
amplamente utilizado para estudar algumas propriedades de candidatos à fármacos e
substâncias químicas utilizadas no meio ambiente.
Tabela 23 - Propriedades ADMET, calculadas no software admetSAR, para os constituintes majoritários
do óleo essencial de Rosmarinus officinalis.
(continua)
Absorção e distribuição
Modelo
Eucaliptol
Cânfora
Sabineno
Canfeno
d-Limoneno
Barreirasangue-cérebro
BBB+
BBB+
BBB+
BBB+
BBB+
Absorção no intestino humano
HIA+
HIA+
HIA+
HIA+
HIA+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Substrato de glicoproteína P
S
NS
S
NS
NS
Inibidor de glicoproteína P
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
Permeabilidade Caco-2
Transporte renal de cátions
orgânicos
65
Tabela 23 - Propriedades ADMET, calculadas no software admetSAR, para os constituintes majoritários
do óleo essencial de Rosmarinus officinalis.
(conclusão)
Metabolismo
CYP450 2C9 Substrato
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 2D6 Substrato
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 3A4 Substrato
S
S
S
S
NS
CYP450 1A2 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2C9 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2D6 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2C19 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 3A4 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
Low
Low
Low
Low
CYP Promiscuidade inibitória
Low
Toxicidade
Toxicidade AMES
NT
NT
NT
NT
NT
Carcinogênico
NC
NC
NC
NC
NC
Toxicidade oral aguda
III
III
III
III
III
Fonte: Autoria própria.
Tabela 24 - Propriedades ADMET, calculadas no software admetSAR, para os constituintes majoritários
do óleo essencial de Cymbopogon citratus.
Absorção e distribuição
Modelo
Barreirasangue-cérebro
Absorção no intestino humano
Permeabilidade Caco-2
Substrato de glicoproteína P
Inibidor de glicoproteína P
Transporte renal de cátions
Geranial
Neral
Lemonol
Nerol
Esqualeno
BBB+
BBB+
BBB+
BBB+
BBB+
HIA+
HIA+
HIA+
HIA+
HIA+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
NS
NS
NS
NS
NS
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
I
NI
NI
NI
NI
NI
orgânicos
Metabolismo
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 2D6 Substrato
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 3A4 Substrato
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 2C9 Substrato
CYP450 1A2 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2C9 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2D6 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2C19 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 3A4 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
Low
Low
Low
Low
CYP Promiscuidade inibitória
Low
Toxicidade
NT
NT
NT
NT
NT
Carcinogênico
C
C
NC
NC
C
Toxicidade oral aguda
III
III
III
III
III
Toxicidade AMES
Fonte: Autoria própria.
66
Tabela 25 - Propriedades ADMET, calculadas no software admetSAR, para os constituintes majoritários
do óleo essencial de Cymbopogon winterianius.
Absorção e distribuição
Modelo
Citronelal
Geraniol
Citronelol
Nerol
D-Limoneno
Barreirasangue-cérebro
BBB+
BBB+
BBB+
BBB+
BBB+
Absorção no intestino humano
HIA+
HIA+
HIA+
HIA+
HIA+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Substrato de glicoproteína P
NS
NS
NS
NS
NS
Inibidor de glicoproteína P
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
Permeabilidade Caco-2
Transporte renal de cátions
orgânicos
Metabolismo
CYP450 2C9 Substrato
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 2D6 Substrato
NS
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 3A4 Substrato
NS
NS
NS
NS
CYP450 1A2 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2C9 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2D6 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2C19 Inibidor
NI
I
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
CYP Promiscuidade inibitória
Low
Low
Low
Low
Low
Toxicidade AMES
NT
NT
NT
NT
NT
Carcinogênico
C
NC
NC
NC
NC
Toxicidade oral aguda
III
III
III
III
III
CYP450 3A4 Inibidor
Toxicidade
Fonte: Autoria própria.
Tabela 26 - Propriedades ADMET, calculadas no software admetSAR, para os constituintes majoritários
do óleo essencial de Citrus sinensis.
(continua)
Absorção e distribuição
Modelo
D-Limoneno
trans-
Carvona
Carveol
Barreira sangue-cérebro
BBB+
BBB+
BBB+
trans-Óxido de
cis-Óxido de
limoneno
limoneno
BBB+
BBB+
HIA+
HIA+
HIA+
HIA+
HIA+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Caco2+
Substrato de glicoproteína P
NS
NS
NS
S
S
Inibidor de glicoproteína P
NI
NI
I
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
Absorção no intestino humano
Permeabilidade Caco-2
Transporte renal de cátions
orgânicos
Metabolismo
CYP450 2C9 Substrato
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 2D6 Substrato
NS
NS
NS
NS
NS
CYP450 3A4 Substrato
NS
NS
NS
S
S
CYP450 1A2 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
67
Tabela 26 - Propriedades ADMET, calculadas no software admetSAR, para os constituintes majoritários
do óleo essencial de Citrus sinensis.
(conclusão)
CYP450 2C9 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2D6 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 2C19 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
CYP450 3A4 Inibidor
NI
NI
NI
NI
NI
Low
Low
Low
Low
CYP Promiscuidade inibitória
Low
Toxicidade
Toxicidade AMES
NT
NT
NT
NT
NT
Carcinogênico
NC
NC
NC
NC
NC
Toxicidade oral aguda
III
III
III
III
III
Fonte: Autoria própria.
Os modelos selecionados para o estudo da propriedade de absorção estão relacionados
ao fato de que a maioria dos fármacos precisam atingir a corrente sanguínea para ser
distribuído até seu local de ação. Além disso, sabe-se que a mera presença do fármaco na
corrente sanguínea não provoca uma resposta farmacológica; para que seja eficaz, o fármaco
deve deixar o espaço vascular e penetrar nos espaços intracelulares e/ou extracelulares. Desta
forma, estudos in silico de parâmetros moleculares que podem interferir na taxa de absorção
são essenciais para a seleção de novos candidatos a fármacos.
Segundo Romero e Romero (2014) o efeito farmacológico de uma substância bioativa
está associado a sua capacidade de atingir a circulação sanguínea e chegar a tecidos ou órgãos
específicos. Para isto, após a administração, a substância bioativa é dissolvida e solubilizada
no trato gastrintestinal para que possa ser absorvida no estômago ou através do intestino. A
absorção intestinal humana é a primeira barreira que a substância bioativa deve transpor até
chegar ao sítio de ação farmacológica. Para esta propriedade todos os compostos também
apresentaram absorção positiva, assim como para a permeabilidade em Caco-2, uma
importante célula de carcinoma do cólo humano associada ao transporte intestinal.
O coeficiente de partição sangue-cérebro é um parâmetro que avalia a penetração na
barreira hematoencefálica. A barreira hematoencefálica é, em essência, um mecanismo que
impede a entrada de moléculas de sangue desnecessárias ou substâncias tóxicas no sistema
nervoso central, ao mesmo tempo em que permite a circulação de quantidades adequadas de
sangue arterial através do tecido cerebral (ROMERO e ROMERO, 2014). Observou-se que
todos os compostos estudados apresentaram probabilidade de permeabilidade para a barreira
barreira hematoencefálica (BBB+).
68
A glicoproteína P é um produto do gene de multirresistência à fármacos que age como
uma bomba de efluxo ATP-dependente que transporta fármacos e xenobióticos para a parte
externa das células do fígado, rins, cérebro e trato gastrintestinal, das células tumorais e das
células das berreiras hemato-teciduais. A expressão diferenciada da glicoproteína P indica que
a mesma apresenta um papel de proteção do organismo contra agentes xenobióticos,
excretando estes componentes na bile, urina e no lúmen intestinal, e também prevenindo, sua
acumulação no cérebro (AZEREDO et al., 2009).
Embora seja relatado na literatura que a glicoproteína P reconhece e transporta uma
variedade de compostos, hidrofóbicos neutros ou carregados positivamente, a maioria dos
compostos avaliados foram classificados como não substratos.
Quanto à inibição da glicoproteína P, observou-se que, com execessão da carvona, os
compostos majoritários dos óleos essenciais estudados foram classificados como inibidores. A
ação inibitória desta proteína pode ser por competição com os sítios de ligação de fármacos
(inibidores competitivos) ou por bloqueio do processo de hidrólise do ATP (inibidores nãocompetitivos). Os inibidores da glicoproteína P aumentam a acumulação intracelular de seus
substratos através da diminuição do transporte de efluxo desses da porção basal para a apical
das células (AZEREDO et al., 2009).
Outro parâmetro avaliado em relação a distribuição está relacionado ao sistema de
transporte para cátions orgânicos que é realizado nos rins. O rim é o principal órgão excretor
de fármacos e seus metabólitos, possuindo sistemas de transporte de alta capacidade para
eliminar rapidamente grandes quantidades de compostos exógenos. Os mecanismos celulares
de transporte renal envolvem um sistema de transporte para ânions orgânicos, um sistema de
transporte para cátions orgânicos e um transportador de múltiplas drogas ou glicoproteína P.
Para este parâmetro, todos os compostos avaliados foram classificados como não substratos.
O processo de metabolismo de fármacos, pode ser entendido, segundo Pereira (1997),
como o conjunto de reações enzimáticas que biotransformam fármacos e outros compostos
estranhos (xenobióticos) em metabólitos de polaridade crescente, para que sejam excretados
pela urina, impedindo que estes compostos permaneçam por tempo indefinido no nosso
organismo.
O órgão onde ocorre a maioria das reações de biotransformação é o fígado, por
apresentar vários complexos enzimáticos especializados. Dentre elas, destacam-se as monooxigenases do complexo enzimático citocromo P450 (CYP), as redutases, as esterases e as
transferases (COSTA & STRECK, 1999). O CYP é o principal responsável pela
biotransformação de fármacos no organismo humano, estando presente principalmente no
69
retículo plasmático liso (fração microssômica) dos hepatócitos, podendo também ser
encontrado em outros órgãos, como pulmões e rins. O CYP é uma proteína com um grupo
prostético heme, que catalisam reações nas quais um átomo de oxigênio da molécula de O2 é
incorporado na molécula do substrato orgânico, o outro átomo é reduzido a H2O. As monooxigenases requerem dois substratos que funcionam como redutores dos dois átomos de
oxigênio do O2. O substrato principal (no caso o fármaco) recebe um dos dois átomos de
oxigênio e o co-substrato (no caso do CYP é a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato)
fornece átomos de hidrogênio para reduzir o segundo átomo de oxigênio a água
(LEHNINGER, 1986).
O processo de metabolização foi avaliado utilizando como modelo oito enzimas do
citocromo P450 (CYP 450 2C9, CYP 450 2D6 e CYP 450 3A4). Segundo as tabelas 33 a 42,
para as duas primeiras enzimas observou-se que todos os compostos avaliados foram
classificados como não substrato. Para a enzima CYP 4503A4 observou-se que alguns
compostos - tal como os compostos eucaliptol, cânfora, sabineno e canfeno - foram
classificados como substratos. Observou-se também que nenhum dos compostos avaliados
foram classificados como inibidores de enzimas do complexo citocromo P450, assim como
apresentaram baixa promiscuidade inibitória. Esses resultaram sugerem que os compostos
presentes nos óleos essenciais estudados possuem pequena probabilidade de metabolização no
organismo.
Por fim, foram realizadas três análises em relação à toxicidade dos compostos
majoritários dos óleos essenciais bioativos, levando em consideração os modelos de
toxicidade AMES, carcinogenicidade e toxicidade oral aguda. Em relação ao primeiro
modelo, nenhum dos compostos avaliados foi classificado como tóxico. Para o modelo de
carcinogenicidade, observou-se que alguns compostos (geranial, neral, esqualeno e citronelal)
foram classificados como carcinogênicos.
No modelo de toxicidade oral aguda os resultados são expressos em quatro categorias,
com base em critérios da Agência de Proteção Ambiental do Estados Unidos. Compostos da
categoria I possuem dose letal mediana (LD50) menor ou igual a 50mg/kg; compostos da
categoria II possuem LD50 maior que 50mg/kg, mas menor que 500mg/kg; compostos da
categoria III possuem LD50 entre 500mg/kg a 5000mg/kg; compostos da categoria IV
possuem LD50 maior que 5000mg/kg. De forma geral, a maioria dos compostos foram
classificados na categoria III, desempenhando resultados satisfatórios e indicando que os
candidatos a inibidores de urease apresentam baixa toxicidade oral aguda.
70
5.3.4 Docking molecular
O estudo de docking molecular foi realizado utilizando o software iGEMDOCK. A
localização dos constituintes majoritários na enzima urease (PDB 1E9Z) é apresentada nas
figuras 21 - 24.
(a)
(b)
(c)
Figura 21 - (a) Estrutura da enzima urease (PDB 1E9Z); (b) localização dos compostos majoritários do
óleo essencial de Rosmarinus officinalis após o estudo de docagem molecular; (c) Eucaliptol e D-limoneno
interagindo no sítio ativo da enzima urease.
Fonte: Autoria própria.
(a)
(b)
(c)
Figura 22 - (a) Estrutura da enzima urease (PDB 1E9Z); (b) localização dos compostos majoritários do
óleo essencial de Cymbopogon citratus após o estudo de docagem molecular; (c) geranial interagindo no
sítio ativo da enzima urease.
Fonte: Autoria própria.
71
(a)
(b)
(c)
Figura 23 - (a) Estrutura da enzima urease (PDB 1E9Z); (b) localização dos compostos majoritários do
óleo essencial de Cymbopogon winterianius após o estudo de docagem molecular; (c) D-limoneno
interagindo no sítio ativo da enzima urease.
Fonte: Autoria própria.
(a)
(b)
(c)
Figura 24 - (a) Estrutura da enzima urease (PDB 1E9Z); (b) localização dos compostos majoritários do
óleo essencial de Citrus sinensis após o estudo de docagem molecular; (c) D-limoneno interagindo no sítio
ativo da enzima urease.
Fonte: Autoria própria.
Estes resultados sugerem que os compostos eucaliptol, geranial e D-limomeno podem
atuar como inibidores da enzima urease por interagir no sítio ativo, tal como relatado para a
tiouréia e outros inibidores reconhecidos para esta enzima. Observa-se que os três
monoterpenos mencionados interagem, através de interações de van der Waals, com o resíduo
His221, apontado na literatura como importante para a ancoração da uréia no sítio ativo da
urease. Estes resultados sugerem que a atividade inibidora de urease apresentada pelos óleos
essenciais estudados pode ocorrer por um mecanismo de inibição reversível competitivo.
Além da inibição enzimática através da interação de ligantes no sítio ativo é possível
que os constituintes dos óleos essenciais realizem a inibição da urease por outros mecanismos.
No entanto, para definir as contribuições dos diferentes tipos de mecanismos de inibição que
podem ocorrer para estes óleos essenciais estudos adicionais serão necessários.
72
Na sequência as energias associadas à interação dos constituintes majoritários dos
óleos essenciais com a enzima 1E9Z foram estudadas e organizadas nas tabelas 27 - 30.
Tabela 27 - Energias, calculadas no programa iGEMDOCK, envolvidas na interação urease (PDB 1E9Z) compostos majoritários do óleo essencial de Rosmarinus officinalis.
Tipos de Energia (kcal/mol)
Composto
Total
Interações de van der Waals
Interações de hidrogênio
Eletrostática
D-Limoneno
-57,39
-57,39
0,00
0,00
Canfeno
-50,05
-50,05
0,00
0,00
Cânfora
-56,93
-52,83
-4,10
0,00
Eucaliptol
-73,78
-68,76
-5,02
0,00
Sabineno
-55,34
-55,34
0,00
0,00
Fonte: Autoria própria.
Tabela 28 - Energias, calculadas no programa iGEMDOCK, envolvidas na interação urease (PDB 1E9Z) compostos majoritários do óleo essencial de Cymbopogon citratus.
Tipos de Energia (kcal/mol)
Composto
Total
Interações de van der Waals
Interações de hidrogênio
Eletrostática
Esqualeno
-83,79
-83,79
0,00
0,00
Geranial
-71,79
-69,29
-2,50
0,00
Lemonol
-63,13
-53,57
-9,55
0,00
Neral
-59,68
-56,25
-3,43
0,00
Nerol
-61,64
-55,85
-5,79
0,00
Fonte: Autoria própria.
Tabela 29 - Energias, calculadas no programa iGEMDOCK, envolvidas na interação urease (PDB 1E9Z) compostos majoritários do óleo essencial de Cymbopogon winterianius.
Tipos de Energia (kcal/mol)
Composto
Total
Interações de van der Waals
Interações de hidrogênio
Eletrostática
Citronelal
-62,27
-56,33
-5,94
0,00
Citronelol
-60,66
-50,50
-10,16
0,00
D-Limoneno
-57,39
-57,39
0,00
0,00
Geraniol
-62,80
-49,92
-12,88
0,00
Nerol
-64,33
-56,20
-8,13
0,00
Fonte: Autoria própria.
73
Tabela 30 - Energias, calculadas no programa iGEMDOCK, envolvidas na interação urease (PDB 1E9Z) compostos majoritários do óleo essencial de Citrus sinensis.
Tipos de Energia (kcal/mol)
Composto
Total
Interações de van der Waals
Interações de hidrogênio
Eletrostática
-59,48
-53,35
-6,12
0,00
-67,27
-61,35
-5,91
0,00
D-Limoneno
-57,39
-57,39
0,00
0,00
trans-Carveol
-67,78
-57,16
-10,62
0,00
-64,96
-64,96
0,00
0,00
Carvona
cis-Óxido de
limoneno
trans-Óxido de
limoneno
Fonte: Autoria própria.
Observa-se, de modo geral, que os valores de energia associados à interação enzima ligante são relativemente próximos. Este fato pode ser explicado pela semelhança estrutural
dos compostos avaliados (massa molar, cadeia carbônica, ausência de grupos funcionais
polares ou presença de um único grupo funcional polar), tornando os valores de interações
intermoleculares muito próximos.
74
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados apresentados neste trabalho indicam que óleos essenciais podem ser
considerados fontes promissoras de substâncias bioativas inibidoras de urease. Dentre as nove
amostras avaliadas determinou-se que os óleos essenciais de Rosmarinus officinalis,
Cymbopogon citratus, Cymbopogon winterianius e Citrus sinensis são promissores inibidores
de urease. Sendo assim, estudos posteriores são necessários para verificar se in vivo estes
óleos apresentaram efeito sobre a bactéria H. pylori.
A partir de estudos in silico com os constituintes majoritários dos óleos essenciais
bioativos, determinou-se que os compostos D-limoneno, eucaliptol e geranial interagem com
resíduos de aminoácidos localizados no sítio ativo da enzima urease. O resultado apresentado
pelo D-limoneno, por exemplo, é concordante com os dados de Rozza et al. (2011) que
reportaram que este monoterpeno apresentou, in vitro, atividade inibidora de H. pylori. A
partir dos resultados apresentandos verifica-se que o D-limoneno e os outros dois
monoterpenos citados podem inibir a enzima urease, podendo ser considerados substâncias
bioativas passíveis de controlar doenças ocasionadas por H. pylori.
Além disso, verificou-se que os constituintes majoritários dos óleos de Rosmarinus
officinalis, Cymbopogon citratus, Cymbopogon winterianius e Citrus sinensis possuem
propriedades farmacocinéticas desejadas para fármacos, além de apresentarem baixo ou nulo
potencial toxicológico.
Os estudos in vitro e in silico convergem para justificar a atividade inibidora de urease
através de um mecanismo de inibição reversível competitivo, baseado na interação de
determinados constituintes dos óleos essencias no sítio ativo da enzima.
Do ponto de vista da Química Medicinal os monoterpenos D-limoneno, eucaliptol e
geranial podem ser considerados protótipos de fármacos, uma vez que modificações
moleculares destes compostos podem otimizar atividades biológicas/farmacológicas e
minimizar efeitos indesejados.
75
7 REFERÊNCIAS
AZEREDO, Francine J.; UCHÔA, Flávia De Toni; COSTA, Teresa Dalla. Papel da
Glicoproteína-P na Farmacocinética e nas Interações Medicamentosas. Rev. Bras. Farm.,
v.90, n.4, p.321-326, 2009
BAPTISTA, Maria G. de F. M. Mecanismos de Resistência aos Antibióticos. 2013. 51 f.
Dissertação (Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas), Universidade Lusófona de
Humanidades e Tecnologia, 2013.
BARBOSA, Luiz C. A., et al. Evaluation of the Chemical Composition of Brazilian
Commercial Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf Samples. Molecules, v.13, p.1864-1874,
2008.
BIGLAR, Mahmood, et al. A Preliminary Investigation of the Jack-Bean Urease Inhibition by
Randomly Selected Traditionally Used Herbal Medicine. Iranian Journal of
Pharmaceutical Research, v.11, n.3, p.831-837, 2012.
BITTENCOURT, Paulo F. S., et al. Gastroduodenal peptic ulcer and Helicobacter pylori
infection in children and adolescentes. Jornal de Pediatria; Sociedade Brasileira de
Pediatria, v.82, n.5, p.325-334. 2006.
BONOCORSI, Cibele. Atividade anti-Helicobacter pylori e potencial antioxidante de
espécies vegetais do Cerrado brasileiro. 2009. 217 f. Tese (Doutorado em Microbiologia),
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita
Filho”, 2009.
76
BOUKHATEM, Mohamed N., et al. Lemon grass (Cymbopogon citratus) essential oil as a
potent anti-inflammatory and antifungal drugs. Libyan J. Med., v.9, n.25, p.431, 2014.
BRITO, M. A. Avaliação de propriedades toxicológicas de fármacos in silico no curso
experimental de química medicinal. Revista Eletrônica de Farmácia, v.l 7, n.4, p.22 -29,
2010.
BRUSCKY, Dayanne Mota V.; ROCHA, Luiz Alexandre R. da; COSTA, Aldo José F..
Recidiva de urticária crônica decorrente de reinfecção por Helicobacter pylori. Rev. paul.
pediatr., São Paulo, v.31, n.2, jun. 2013. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010305822013000200021&lng=en&nrm=iso>. Acesso em 01 fev. 2015.
CÂNDIDO, Cinthya S. Estudo da atividade in vitro de componentes da dieta e de plantas
medicinais do nordeste brasileiro sobre Helicobacter pylori. 2008. 86 f. Dissertação
(Mestrado em Microbiologia Médica), Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, 2008.
CHENG, Feixiong, et al. admetSAR: a comprehensive source and free tool for evaluating
chemical ADMET properties. J. Chem. Inf. Model., v.52, n.11, p. 3099-3105, 2012.
CHEMPAKAM, B.; BALAJI, S. Star Anise. In Chemistry of spices. United Kingdom: CAB
International, p. 319-330, 2008.
CLEFF, M. B., et al. Perfil de suscetibilidade de leveduras do gênero Candida isoladas de
animais ao óleo essencial de Rosmarinus officinalis L. Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.14,
n.1, p.43-49, 2012.
77
COELHO, Filipa M. M. C. Helicobacter pylori Eficácia da terapêutica. 2013. 60 f.
Dissertação (Mestrado em Medicina) - Ciências da saúde, Universidade da Beira Interior,
2013. Disponível em: <https://ubithesis.ubi.pt/handle/10400.6/1412 >. Acesso em: 5 maio
2014, 23:26.
COELHO, Luiz G. V.; ZATERKA, S. (Org.). II Consenso brasileiro sobre Helicobacter
pylori. Arq. Gastroenterol, São Paulo, v.42, n.2, p.128-132, abr. 2005. Disponível em: <
http://www.scielo.br/pdf/ag/v42n2/a12v42n2.pdf>. Acesso em: 30 abr. 2014.
COSTA, A. R. T., et al. Ação do óleo essencial de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M.
Perry sobre as hifas de alguns fungos fitopatogênicos. Rev. Bras. plantas med., v.13, n.2, p.
240-245, 2011.
COSTA, T. D.; STRECK, E. L. Isoformas do citocromo P450 e outros fatores que alteram a
biotransformação de fármacos Infarma, v.11, n.11/12, p.36-41, nov./dez. 1999.
COSTA, Adalberto C. Atividade antibacteriana dos óleos essenciais de Origanum vulgare
L. e Cinnamomum zeylanicum B. contra bactérias multirresistentes. 2009. 98 f. Tese
(Doutorado em produtos naturais e sintéticos bioativos), Universidade Federal da Paraíba.
João Pessoa, 2009.
DZAMIC, Ana, et al. Chemical composition and antifungal activity of Illicium
verum and Eugenia caryophyllata essential oils. Chemistry of Natural Compounds,
v.45, n.2, p.259-261, 2009.
GUERRA, Adriele S. Uso do Helicobacter pylori e suas subunidades: papel na ativação e
agregação plaquetária. 2013. 66 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular),
Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, 2013.
78
Guerra, Felipe Queiroga Sarmento; Mendes, Juliana Moura; Oliveira, Wylly Araújo de;
Souza, Fábio Santos de; Trajano, Vinicius Nogueira; Coutinho, Henrique Douglas Melo;
Lima, Edeltrudes de Oliveira. Antibacterial activity of the essential oil of Citrus limon against
multidrug resistant Acinetobacter strains. Rev. Bras. Farm., v.94, n.2, p.142-147, 2013.
HA, N.C.; OH, S.T.; SUNG, J.Y.; CHA, K.A.; LEE, M.H.; OH, B.H. Supramolecular
assembly and acid resistance of Helicobacter pylori urease. Nat. Struct. Biol., v.8, n.6,
p.505-509, jun. 2001.
HANAA, Mohamed A. R., et al. Lemongrass (Cymbopogon citratus) essential oil as affected
by drying methods. Annals of Agricultural Sciences, v.57, n.2, p.113-116, dec. 2012.
HARVEY, Alan L. Natural products in drug discovery. Drug Discovery Today, v.13, n.19,
p.894-897, oct. 2008.
HSU, Kai-Cheng; CHEN Yen-Fu; LIN, Shen-Rong; YANG, Jinn-Moon. iGEMDOCK: a
graphical environment of enhancing GEMDOCK using pharmacological interactions and
post-screening analysis. BMC Bioinformatics, 12(Suppl 1):S33, 2011.
JUNIOR, Cláudio V.; BOLZANI, Vanderlan S. Os produtos naturais e a química medicinal
moderna. Quim. Nova, v.29, n.2, p.326-337, 2007.
KALEMBA D, Kunicka A. Antibacterial and antifungal properties of essential oils. Curr.
Med. Chem., v.10, n.10, p.813-829, 2003.
LADEIRA, Marcelo S. P., et al. Biopatologia do Helicobacter pylori. Jornal Brasileiro de
Patologia e Medicina Laboratorial. Rio de Janeiro, v.39, n.4, p.335-342, 2003.
79
LAPROTOX (Laboratório de Proteínas Tóxicas). Helicobacter pylori. Disponível em
<http://www.ufrgs.br/laprotox/linhas-de-pesquisa/ureases-como-fator-devirulencia/helicobacter-pylori>. Acesso em: 01 jul. 2014, 15:32.
LAPROTOX (Laboratório de Proteínas Tóxicas). Ureases - Aspectos Estruturais.
Disponível em <http://www.ufrgs.br/laprotox/o-que-fazemos/linhas-de-pesquisa/ureasesaspectos-estruturais>. Acesso em: 01 jul. 2014, 14:37.
LAPROTOX (Laboratório de Proteínas Tóxicas). Ureases como fator de virulência.
Disponível em <http://www.ufrgs.br/laprotox/o-que-fazemos/linhas-de-pesquisa/ureasescomo-fator-de-virulencia>. Acesso em: 01 jul. 2014, 15:03.
LAPROTOX (Laboratório de Proteínas Tóxicas). Ureases de Plantas. Disponível em
<http://www.ufrgs.br/laprotox/o-q.ue-fazemos/linhas-de-pesquisa/ureases-de-plantas>.
Acesso em: 01 jul. 2014, 14:43.
LEAL-Cardoso, J.H.; Fonteles, M.C. Pharmacological effects of essential oils of plants of the
northeast of Brazil. An. Acad. Bras. Ci., v.71, n.2, p.207-213, 1999.
LEHNINGER, A., et al. Princípios de bioquímica, 3a ed. Sarvier: São Paulo, 2003.
LEHNINGER, A. L. Princípios de Bioquímica. Sarvier: São Paulo, 1986.
MACEDO, Iara T. F., et al. Atividade ovicida e larvicida in vitro do óleo essencial de
Eucalyptus globulus sobre Haemonchus contortus. Rev. Bras. Parasitol. Vet., Jaboticabal,
v.18, n.3, p.62-66, jul.-set. 2009.
80
MARQUES, Paulo R. B. O; Yamanaka, Hideko. Biossensores baseados no processo de
inibição enzimática. Quim. Nova, v.31, n.7, p.1791-1799, 2008.
MATASYOH, Josphat C., et al. Chemical composition of Cymbopogon citratus essential oil
and its effect on mycotoxigenic Aspergillus species. African Journal of Food Science, v.5,
n.3, p. 138-142, march 2011.
MELO, Gessilda A., et al. Rosmarinus officinalis L. essential oil inhibits in vivo and in vitro
leukocyte migration. J Med Food, v.14, n.9, p.944-946, 2011.
MILADI, Hanene, et al. Essential oil of Thymus vulgaris L. and Rosmarinus officinalis L.:
Gas chromatography-mass spectrometry analysis, cytotoxicity and antioxidant properties and
antibacterial activities against foodborne pathogens. Natural Science, v.l5, n.6, p.29-739,
2013.
MIYAMOTO, C. T., et al. Genotoxic activity of Eucalyptus globulus essential oil in
Aspergillus nidulans diploid cells. Folia Microbiol (Praha), v.54, n.6, p.493-498, nov. 2009.
MOUFIDA, S.; MARZOUK, B. Biochemical characterization of blood orange, sweet orange,
lemon, bergamot and bitter orange. Phytochemistry, v.62, p.1283-1289, 2003.
PARENTE, José M. L.; PARENTE, Mírian P. P. D. Contexto epidemiológico atual da
infecção por Helicobacter pylori. GED Gastroenterologia e endoscopia digestiva, v.29, n.3,
p.86-89, jul. 2010.
81
PEREIRA, A.A., et al. Caracterização química e efeito inibitório de óleos essenciais sobre o
crescimento de Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Ciência e Agrotecnologia, v.32,
n.3, p. 887-93, 2008.
PEREIRA, Dárcio G. Importância do metabolismo no planejamento de fármacos. Quim.
Nova, v.30, n.1, p.171-177, 2007.
PINTO, Alinne C. R.; Helicobacter pylori: uma revisão. 2007. 62 f. Monografia (Trabalho
de Conclusão de Curso). Centro Universitário das Faculdades Metropolitanas Unidas, São
Paulo, 2007. Disponível em: < http://arquivo.fmu.br/prodisc/farmacia/acrp.pdf > Acesso em:
5 maio 2014, 23:18.
POSTAL, Melissa. Propriedades antifúngicas da urease de Canavalia ensiformis. 2012.
111 f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular), Universidade Federal do Rio
Grande do Sul. Porto Alegre, 2012.
RANASINGHE, L. et al. Fungicidal activity off essential oil os Cinnamomum zeynalicium
(L.) and Syzygium aromaticum (L.) L.M. Perry against crown rot and anthracnose pathogens
isolated from banana. Letters in Applied Microbiology, v.35, p. 208-211, 2002.
RODRIGUES, R. P. et al. Estratégias de triagem virtual no planejamento de fármacos. Rev.
Virtual Quim., v.4, n.6, p.739-776, 2012.
Romero, Rafaelle Bonzanini; Romero, Adriano Lopes. Inibição de ciclooxigenases 1 (COX-1)
e 2 (COX-2) por monoterpenos: um estudo in silico. UNOPAR Cient. Ciênc. Biol. Saúde,
v.16, n.4, p.307-16, 2014.
82
ROZZA, Ariane L; et al. Gastroprotective mechanisms of Citrus lemon (Rutaceae) essential
oil and its majority compounds limonene and pinene: Involvement of heat-shock protein-70,
vasoactive intestinal peptide, glutathione, sulfhydryl compounds, nitric oxide and
prostaglandin E2. Chemico-Biological Interactions, v.189, n.1-2, p.82-89, jan. 2011.
SANTOS, Carlos Eduardo M. Toxicologia in silico: uma nova abordagem para análise do
risco químico. RevInter Revista Intertox de Toxicologia, Risco Ambiental e Sociedade,
v.4, n.1, p.47-63, fev. 2011.
SHAH, Muhammad. R.; SOOMRO, Zahid. H. Urease Inhibition, Enzyme Inhibition and
Bioapplications, (Ed.), ISBN: 978-953-51-0585-5, InTech, 2012.
SIANI A. C.; Sampaio A.L.F.; de Souza, M.C.; Henriques, M.G.M.L.; Ramos, M.F.S. Óleos
essencias. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v.3, n.16, p.38-43, 2000.
SILVA, Fernando M. Reinfecção pelo Helicobacter pylori em pacientes brasileiros com
úlcera péptica, em seguimento de 5 anos. 2009. 73 f. Tese (Doutorado em Medicina),
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, 2009.
SILVA, Leila B. L., et al. Atenção farmacêutica a pacientes com gastrite Helicobacter pylori
positivo. Infarma, v.16, n.7-8, 2004.
SIMÕES, C. M.; SPITZER, S. V. Óleos Essenciais. In: Simões C. M. O, et al.
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5a edição, Porto Alegre/Florianópolis: Ed.
UFRGS/UFSC; 2000.
83
SIQUEIRA, Jullyana S., et al. Aspectos gerais nas infecções por Helicobacter pylori revisão. Revista Brasileira de Análises Clínicas, v.39, n.1, p.9-13, 2007.
SOUSA, F. R. C. Infeção por Helicobacter pylori – da epidemiologia ao tratamento. 2013.
50 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biomédicas). Universidade do Porto, 2013.
SOUZA, Jacqueline de; FREITAS, Zaida Maria F.; STORPIRTIS, Sílvia. Modelos in vitro
para determinação da absorção de fármacos e previsão da relação dissolução/absorção. Rev.
Bras. Cienc. Farm., São Paulo, v.43, n.4, dez. 2007. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S151693322007000400004&lng=en&nrm=iso>. Acesso em: 26 fev. 2015.
TONIN, Lilian T. D. “Síntese e avaliação da atividade antiprotozoário, antitumoral e
antimicrobiana de 1-fenilssubstituído-β-carbolinas contendo os grupos n-alquilcarboxamida, 1,2,4-triazol e 1,3,4-tiadiazol na posição-3”. 2009. 323 f. Tese (Doutorado
em Química), Universidade Estadual de Maringá, 2009.
WANNMACHER, Lenita. Uso indiscriminado de antibióticos e resistência microbiana: Uma
guerra perdida? Cederj, Brasília, v.1, n.4. p.1-6, mar. 2004.
WEATHERBURN, M. W. Phenol - Hypoclorite Reaction for Determination of Ammonia.
Analitical Chem. v.39, n.8, p.971–974, jul. 1967.
WEI, Linlin, et al. Chemical Composition and Biological Activity of Star Anise Illicium
verum Extracts Against Maize Weevil, Sitophilus zeamais Adults. Journal of Insect Science,
v.14, n.80, p.1-13.
84
WONG, Y.C.; LEE, P.P.; NURDIYANA, W.A.W. Extraction and Antioxidative Activity of
Essential Oil From Star Anise (Illicium verum). Orient. J. Chem, v.30, n.3, p.1159-1171,
2014.
ZELLNER, Barbara D´Acampora, et al. Analysis of essential oils. In: Handbook of Essential
Oils: Science, Technology, and Applications. Editores K. Husnu Can Baser, Gerhard
Buchbauer, 2009.
85
ANEXOS
86
Anexo 1. Espectro de massas do composto sabineno.
Anexo 2. Espectro de massas do composto canfeno.
Anexo 3. Espectro de massas do composto α-pineno.
87
Anexo 4. Espectro de massas do composto β-pineno.
Anexo 5. Espectro de massas do composto p-cimeno.
Anexo 6. Espectro de massas do composto D-limoneno.
88
Anexo 7. Espectro de massas do composto eucaliptol.
Anexo 8. Espectro de massas do composto linalool.
Anexo 9. Espectro de massas do composto cânfora.
89
Anexo 10. Espectro de massas do composto isoborneol.
Anexo 11. Espectro de massas do composto borneol.
Anexo 12. Espectro de massas do composto α-terpineol.
90
Anexo 13. Espectro de massas do composto acetato de bornila.
Anexo 14. Espectro de massas do composto β-cariofileno.
Anexo 15. Espectro de massas do composto humuleno.
91
Anexo 16. Espectro de massas do composto α-felandreno.
Anexo 17. Espectro de massas do composto δ-terpineol.
Anexo 18. Espectro de massas do composto estragol.
92
Anexo 19. Espectro de massas do composto p-anisaldeído.
Anexo 20. Espectro de massas do composto cis-anetol.
Anexo 21. Espectro de massas do composto trans-anetol.
93
Anexo 22. Espectro de massas do composto cetona anísica.
Anexo 23. Espectro de massas do composto anisil acetona.
Anexo 24. Espectro de massas do composto α-bergamoteno.
94
Anexo 25. Espectro de massas do composto γ-muruleno.
Anexo 26. Espectro de massas do composto nerolidol.
Anexo 27. Espectro de massas do composto 6-metil-5-hepten-2-ona.
95
Anexo 28. Espectro de massas do composto 4-nonanona.
Anexo 29. Espectro de massas do composto cis-verbenol.
Anexo 30. Espectro de massas do composto neral.
96
Anexo 31. Espectro de massas do composto lemonol.
Anexo 32. Espectro de massas do composto geranial.
Anexo 33. Espectro de massas do composto nerol.
97
Anexo 34. Espectro de massas do composto m-eugenol.
Anexo 35. Espectro de massas do composto δ-cadineno.
Anexo 36. Espectro de massas do composto γ-muruleno.
98
Anexo 37. Espectro de massas do composto óxido de cariofileno.
Anexo 38. Espectro de massas do composto miristato de isopropila.
Anexo 39. Espectro de massas do composto nonadecanol.
99
Anexo 40. Espectro de massas do composto esqualeno.
Anexo 41. Espectro de massas do composto isopulegol.
Anexo 42. Espectro de massas do composto citronelal.
100
Anexo 43. Espectro de massas do composto decanal.
Anexo 44. Espectro de massas do composto citronelol.
Anexo 45. Espectro de massas do composto guaniol.
101
Anexo 46. Espectro de massas do composto metil-eugenol.
Anexo 47. Espectro de massas do composto metil m-eugenol.
Anexo 48. Espectro de massas do composto α-elemol.
102
Anexo 49. Espectro de massas do composto nerolidol.
Anexo 50. Espectro de massas do composto t-cadinol.
Anexo 51. Espectro de massas do composto eudesmol.
103
Anexo 52. Espectro de massas do composto α-cadinol.
Anexo 53. Espectro de massas do composto acetato de isobornila.
Anexo 54. Espectro de massas do composto eugenol.
104
Anexo 55. Espectro de massas do composto guaiol.
Anexo 56. Espectro de massas do composto acetato de eugenila.
Anexo 57. Espectro de massas do composto γ-terpineno.
105
Anexo 58. Espectro de massas do composto cis-óxido de limoneno.
Anexo 59. Espectro de massas do composto trans-óxido de limoneno.
Anexo 60. Espectro de massas do composto trans-carveol.
106
Anexo 61. Espectro de massas do composto carvona.
Anexo 62. Espectro de massas do composto 3-careno.
Anexo 63. Espectro de massas do composto geraniol.
107
Anexo 64. Espectro de massas do composto trans-α-bergamoteno.
Anexo 65. Espectro de massas do composto α-bisaboleno.
Anexo 66. Espectro de massas do composto β-bisaboleno.
108
Anexo 67. Espectro de massas do composto cumarina.