Influência da Artrite Encefalite Caprina (CAE)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
ROSIVALDO QUIRINO BEZERRA JÚNIOR
INFLUÊNCIA DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE) NAS
CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA
DO LEITE E ANÁLISE HISTOLÓGICA DA GLÂNDULA
MAMÁRIA
FORTALEZA
2011
1
ROSIVALDO QUIRINO BEZERRA JÚNIOR
INFLUÊNCIA DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA
(CAE) NAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICA E
MICROBIOLÓGICA DO LEITE E ANÁLISE
HISTOLÓGICA DA GLÂNDULA MAMÁRIA
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias. Área de Concentração:
Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa:
Sanidade de pequenos ruminantes. Orientador (a):
Profa./Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira.
FORTALEZA
2011
2
FICHA CATALOGRÁFICA
A ficha catalográfica deve ser digitada no verso da folha de rosto.
(Consulte a bibliotecária da UECE)
3
ROSIVALDO QUIRINO BEZERRA JÚNIOR
INFLUÊNCIA DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE) NAS
CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO LEITE E
ANÁLISE HISTOLÓGICA DA GLÂNDULA MAMÁRIA
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Aprovada em _____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
_____________________________
Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira
Universidade Estadual do Ceará
Orientador (a)
_____________________________
_____________________________
Prof. Dr. Jean Berg Alves da Silva
Universidade Federal Rural do Semiárido
Examinador
Profa. Dra. Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista
Universidade Estadual do Ceará
Examinadora
_____________________________________
Dra. Maria Gorete Flores Salles
Médica Veterinária
Examinadora
4
A MILTON JOSÉ DOS RAMOS, meu
avô e grande amigo, que sempre amou
cada planta, grão de areia, animal, cada
beleza deste mundo em uma
intensidade imensurável, única. (...)
Que me mostrou o quanto os animais
têm a dizer.
Aos meus pais Rosivaldo Quirino
Bezerra e Antonieta Guilherme dos
Ramos Bezerra que com amor, carinho
e dedicação me apoiaram em todas as
etapas de minha vida. A minha família
e amigos pelo carinho, apoio na minha
formação
acadêmica
e
pela
credibilidade a mim dada.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, eterno e todo poderoso pelo seu imenso amor por nós e sua
infinita misericórdia.
Aos meus pais, Rosivaldo e Antonieta, e irmãos, pelo amor, pela minha
formação pessoal, e por sempre me ensinarem que o mais importante valor que se tem
na vida é a família.
A Teresa D’ávila, minha melhor amiga nesses dois anos em Fortaleza, que me
ajudou a passar pelos problemas difíceis dando apoio, dividindo alegrias e tristeza, e o
mais importante, sempre mudando os meus dias com um simples sorriso.
Aos meus amigos Carlos Alberto, Luís Antônio, Gabrielle e Igor, pela amizade e
confiança dadas a mim.
Ao meu amigo Ronaldo, parceria no violão, sempre disponível a conversar e
discutir sobre as coisas da vida e sobre Deus.
Aos demais amigos de laboratório de virologia pela colaboração, amizade e
convívio.
A todos os meus colegas de pós-graduação pelos momentos de descontração e
amizade.
A Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira por ter me orientado e me
mostrado a importância que devemos dar na buscar de nossos sonhos e objetivos,
agindo sempre de forma concisa e ética... E por também mostrar que todos nós podemos
fazer parte de uma família onde quer que estejamos.
Ao Prof. Dr. Jean Berg Alves Silva, pela orientação na dissertação e por mostrar
que há sempre possibilidades, soluções diante dos momentos difíceis na vida.
A Profa. Dra. Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista pela orientação na
dissertação e pela amizade, sempre mostrando que podemos ver a vida de uma forma
mais positiva e divertida.
A Dra. Maria Gorete Flores Salles, Médica Veterinária do Lar Antônio de
Pádua, sempre prestativa e disposta a nos ajudar com seu jeito calmo e acolhedor.
A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP) pelo apoio financeiro.
A UECE e UFERSA, por terem disponibilizado as condições técnica e pessoal.
Aos funcionários e professores do Programa de Pós-graduação em Ciências
Veterinárias pelo incentivo, convívio e opiniões compartilhadas.
6
RESUMO
A artrite encefalite caprina (CAE) é uma doença de caráter crônico e debilitante,
ocasionada
por
um
vírus
pertencente
à
família
Retroviridae,
subfamília
Orthoretrovirinae e gênero lentivirus. Na transmissão, observa-se o leite e colostro de
cabras infectadas como importante material de veiculação do vírus da artrite encefalite
caprina (CAEV), porém trabalhos referentes às alterações no leite de cabras infectadas
são escassos. Com o objetivo de avaliar a influência do vírus da CAE na produção
leiteira foram coletadas amostras da glândula mamária de cabras soropositivas e
soronegativas
para
a
CAE,
sendo
realizados
exame
histopatológico
e
imunohistoquímica; os parâmetros físico-químicos do leite (gordura, extrato seco,
proteínas, lactose e densidade) foram obtidos pela análise ultrassônica de amostras de
leite de 54 cabras, sem predileção racial, sendo estas divididas em dois grupos: cabras
positivas e negativas para o teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA). Destes
animais, 30 amostras de leite foram utilizadas para contagem padrão em placa (CCP)
para presença de mesófilas (UFC/mL). Nas amostras de leite avaliadas para a análise
físico-química não houve diferença significativa dos parâmetros avaliados entre os dois
grupos; no microbiológico, não houve relação direta da presença de mesófilas associada
à infecção pelo CAEV. No histopatológico, observaram-se áreas com infiltrado celular
de monócitos, polimorfonucleares, plasmócitos, fibrose, ausência de morfologia normal
do parênquima mamário, denotando processo inflamatório crônico; sendo confirmada a
presença do vírus na glândula pela imunohistoquímica. Concluiu-se que no
histopatológico a glândula mamária apresentou lesões características da doença,
processo inflamatório crônico, tendo sua presença confirmada pela imunohistoquímica,
porém não houve relação direta da incidência da CAE no rebanho como fator negativo
nas características do leite. Há então a necessidade de maiores estudos voltados a avaliar
as alterações da glândula mamária em cabras naturalmente infectadas com CAEV, e
trabalhos mais aprofundados quanto às alterações na produção leiteira como do leite
propriamente dito, tomando-se intervalo maior de tempo e avaliando em diferentes
estágios da doença.
PALAVRAS-CHAVES:
Histopatológico.
CAE.
Lentivírus.
Leite.
Análise
físico-química.
7
ABSTRACT
The caprine arthritis encephalitis (CAE) is a disease of chronic and debilitating
condition caused by a virus belonging to the family Retroviridae, subfamily lentivirus
and Orthoretrovirinae gender. In transmission, the milk and colostrum from goats
infected serving as an important means of virus carrier, but work on the changes in the
milk of infected goats are scarce. In order to evaluate the influence of CAE virus in
dairy production, samples of the mammary gland of goats seropositive and seronegative
for the CAE, and performed histopathology and immunohistochemistry, the physicochemical composition (fat, dry matter, protein, lactose and density) were obtained by
analyzing ultrasonic milk samples from 54 goats, no racial predilection, which are
divided into two groups: positive and negative goats to the test in agarose gel
immunodiffusion (AGID); and 30 samples of milk were used for standard plate count
(SPC) for the presence of mesophilic (CFU / mL). The results of physical-chemical
analysis showed no significant difference between the milk samples of two groups. In
the microbiological analysis showed the presence of aerobic mesophilic bacteria, but
this change is not associated with the presence of CAEV infection. On histopathology,
there were areas with infiltration of mononuclear-leukocyte and polymorph nuclear,
plasma cells, fibrosis and absence of normal morphology of the mammary tissue,
indicating a chronic inflammatory process; and confirmed the presence of virus, in the
gland, by immunohistochemistry. It has the necessity of bigger directed studies to
evaluate the changes of the mammary gland in goats naturally infected with CAEV and
further work on the changes in milk production as milk itself, taking longer interval of
time and at different stages of evaluating disease.
KEYWORDS: CAE. Lentivirus. Milk. Physical-chemical analysis. Histopathology.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fotomicrografia de glândula mamária. Presença agregado de plasmócitos (A,
400X; H.E.); área de fibrose (B, 100X; H.E.); epitélio transformado, ausência de
morfologia normal dos alvéolos mamários (C, 40X; H.E.); parênquima mamário normal
(D, 100X; H.E.); marcação multifocal do citoplasma da célula em marrom
caracterizando reação positiva na imunohistoquímica (E, 400X; F, 200X).
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Média dos valores físico-químicos encontrados na analise do leite de animais
soropositivos e soronegativos para CAE.........................................................................40
Tabela 2. Contagem padrão em placas para mesófilos aeróbios.....................................41
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% - Percentagem
AIEV – Vírus da Anemia Infecciosa Equina
BIV – Vírus da Imunodeficiência Bovina
CA - Capsídeo
CAE – Artrite Encefalite Caprina
CAEV – Vírus da Artrite Encefalite Caprina
DNA – Ácido desoxirribonucleico
ELISA – Ensaio Imunoenzimático
env – Gene que codifica as proteínas do envelope viral
FAO – Food and Agriculture Organization of United Nations
FIV – Vírus da Imunodeficiência Felina
G – Unidade da força centrífuga relativa
g - gramas
gag – gene viral que codifica as proteínas internas do vírus
gp – Glicoproteína
H° – Graus Hortvet
HIS – Hibridização in situ
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IDGA – Imunodifusão em Gel de Agarose
IN – Integrase
LVPR – Lentivírus de Pequenos Ruminantes
m/m – massa por massa
MA – Matriz
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Mg²+ - Íon Magnésio
11
MVV – Maedi-Visna Vírus
nM –Nanômetro
OIE - Organização Internacional das Epizootias
p - Proteína
PCR – Reação em cadeia polimerase
pol – Gene que codifica as enzimas virais
PR - Protease
rev – Gene de regulação viral
RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta
RIPA - Radioimunoprecipitação
RNA – Ácido ribonucleico
RT – Transcriptase reversa
SNC – Sistema Nervoso Central
SIV - Vírus da Imunodeficiência Símia
SU - superfície
tat – Gene de regulação viral
TM – Transmembranar
UHT – Ultra-high temperature
vif – Gene de regulação viral
12
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 14
2.
REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 16
2.1.
ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE) ............................................................ 16
2.1.1.
Histórico .............................................................................................................. 16
2.1.2
Agente Etiológico, Estrutura e Genoma do vírus. ............................................... 16
2.1.3
Epidemiologia ..................................................................................................... 17
2.1.4
Patogenia ............................................................................................................. 18
2.1.5
Resposta Imunológica ......................................................................................... 19
2.1.6
Sinais Clínicos ..................................................................................................... 19
2.1.7
Diagnóstico.......................................................................................................... 20
2.1.8
Prevenção e Controle .......................................................................................... 22
2.2
CAPRINOCULTURA E PRODUÇÃO LEITEIRA................................................... 23
2.2.1
Importância da Caprinocultura na produção leiteira ................................... 23
2.2.2
Caracterização do leite caprino........................................................................ 25
3.
HIPÓTESE CIENTÍFICA ................................................................................................... 28
4.
OBJETIVOS ....................................................................................................................... 29
4.1.
OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 29
4.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 29
5.
CAPÍTULO 1 ..................................................................................................................... 30
6.
CONCLUSÕES ................................................................................................................. 43
7.
PERSPECTIVAS .............................................................................................................. 44
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 45
13
1. INTRODUÇÃO
A caprinocultura no Brasil, principalmente na região nordeste, tem se
caracterizado como uma atividade empreendedora, em ascensão, responsável por gerar
renda fixa e empregos. Com isso temos uma mudança no quadro nacional, onde, antes
um cenário marcado pelo êxodo rural, agora apresenta um contexto de fixação do
pequeno criador nessas áreas. Com o desenvolvimento do setor há a necessidade por
mudanças visando melhoria das condições de criação, como: estrutura, mão-de-obra
especializada, melhoramento genético dos animais, nutrição animal de boa qualidade,
dentre outros. Porém, todo esse crescimento não tem valia sem a realização de manejo
sanitário adequado, ou seja, práticas adequadas de prevenção e controle.
A Artrite Encefalite Caprina conhecida como “CAE”, abreviação do nome inglês
“caprine arthritis-encephalitis”, foi descrita pela primeira vez pela pesquisadora Linda
Cork (1974) e somente alguns anos depois foi identificado o seu agente etiológico. A
CAE é uma doença de caráter crônico que ocasiona prejuízos econômicos na
ovinocaprinocultura. Uma vez presente no rebanho haverá queda da produção
principalmente quando associamos às infecções secundárias como o aparecimento de
mastite.
A falta de uma vacina eficaz contra o vírus faz com que se adote um conjunto de
medidas preventivas para controlar a disseminação da desta enfermidade, instituindo-se
um Plano de Saneamento da CAE o qual tem como meta a formação de rebanhos livres
da doença. Esse Plano é baseado em exames sorológicos de todos os caprinos da
propriedade, realizados a cada seis meses sob o acompanhamento de um médico
veterinário.
A transmissão pode ocorrer de forma direta, através da ingestão de colostro e
leite da própria mãe ou do leite misturado de várias cabras, do contato direto entre
animais através dos líquidos corporais (aerossóis, saliva, etc.); e indireta, por meio de
objetos contaminados (fômites), pelo homem (iatrogênica). Cabras naturalmente
infectadas com o vírus expressam o DNA proviral em diversos tecidos do seu trato
genital, tais como útero, ovidutos, além da glândula mamária. A presença dos lentivírus
nestes tecidos pode contribuir para a transmissão vertical da enfermidade (Fieni et al.,
2002).
14
A glândula mamária e seu produto, o leite, têm importante participação no
processo de disseminação do patógeno, porém trabalhos relacionados às características
físico-químicas e microbiologia do leite de cabras infectadas pelo CAEV e a realização
de exame histopatológico e imunohistoquímica são escassos havendo a necessidade de
maiores pesquisas nesta área.
15
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE)
2.1.1. Histórico
A artrite-encefalite caprina é conhecida internacionalmente como CAE que é a
abreviação do termo em inglês: caprine arthritis-encephalitis (Franke, 1998).
Caracteriza-se como uma enfermidade infecciosa, multissistêmica, incurável e de
caráter crônico que afeta caprinos em várias fases do desenvolvimento etário,
independente do sexo, raça e produção (Cork et al., 1974; Klevjer-Anderson et al.,
1984; Lara et al., 2005).
O vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) foi descrito clinicamente pela
primeira vez em 1959 na Suíça, quando caprinos adultos apresentaram artrite crônica
(Stünzi et al., 1964), sendo isolado posteriormente de amostras oriundas de caprinos
(Cork et al.,1974). Em 1980 essa enfermidade, artrite encefalite caprina, foi reconhecida
como virose e, seu agente foi incluso na família Retroviridae (Crawford et al.,1980).
2.1.2
Agente Etiológico, Estrutura e Genoma do vírus.
O vírus da CAE é um RNA vírus, não oncogênico, que pertence à família
Retroviridae e subfamília Orthoretrovirinae, gênero Lentivirus. No gênero Lentivírus
estão inclusos, além do CAEV o Maedi-Visna vírus (MVV), os vírus das
imunodeficiências felina (FIV), bovina (BIV), símia (SIV) e humana (HIV-1, HIV-2).
Neste gênero, encontramos também os vírus da anemia infecciosa equina (AIEV) e
Lentivirus puma (ICTV, 2011).
Os lentivírus são partículas esféricas, envelopadas com aproximadamente 100
nm de diâmetro com núcleo cônico e denso, no qual estão inseridas moléculas idênticas
de RNA fita simples, uma molécula de transcriptase reversa dependente de Mg2+ e
proteínas do nucleocapsídeo (Gonda et al., 1986). O envelope está associado
covalentemente com as glicoproteínas transmembranárias e de superfície. Outra
estrutura presente na partícula viral é a matriz que está situada entre o capsídeo e o
envelope (Pepin et al., 1998). O genoma viral do CAEV e formado por duas fitas
simples de RNA sentido + (Cheevers et al., 1981), contendo os genes gag, env e pol,
16
típicos da família Retroviridae, e os genes regulatórios tat, rev e vif. O gene gag codifica
as proteínas estruturais que constituem o vírion (MA-matriz e CA-capsídeo), o gene pol
codifica as varias enzimas responsáveis pelo processo de transcrição reversa e
integração proviral (RT-transcriptase reversa, PR-protease e IN-integrase) e o gene env
codifica glicoproteínas presentes na superfície do vírion (SU-superfície e TMtransmembranar) com a capacidade de se ligar e fundir com as células alvo. A proteína
vif esta associada com a infectividade viral e com o controle da produção das partículas
virais infecciosas, enquanto que as proteínas tat e env estão envolvidas com a regulação
da expressão viral (Clements & Payne, 1994; Joag, 1996).
2.1.3
Epidemiologia
No Brasil, a primeira descrição de lentivírus de pequenos ruminantes em
caprinos ocorreu no Rio Grande do Sul (Moojen et al., 1986).
Estudos realizados na região Nordeste, no Ceará, mostram que a ocorrência de
caprinos soropositivos para o CAEV era de 40,73% (Melo & Franke, 1997). Nesse
mesmo Estado, foi de 9,2% com 66,7% das propriedades localizadas na região
metropolitana de Fortaleza apresentando animais positivos para CAE. Esses mesmos
autores verificaram que o regime de criação intensivo foi estatisticamente mais
acometido pela doença e deduziram que práticas tais como confinamento e mamadeira
coletiva, muito usadas no regime intensivo facilitam a transmissão da CAE. Do mesmo
modo, propriedades que criam animais de raças puras leiteiras foram mais afetadas
(Pinheiro et al., 2004). Em 2008, um levantamento sorológico para CAEV na região
metropolitana do Ceará apresentou 12,8% de soroprevalência dos 125 caprinos testados
(Caminha et al, 2008).
Nos outros estados da região Nordeste, a prevalência encontrada foi de 13,40%;
0,73% e 26,1% na Bahia (Almeida et al., 2001; Oliveira et al., 2006; Tigre et al., 2006),
de 4,4% e 2,5% no Piauí (Pinheiro et al., 1996; Batista et al., 2004), de 2,2% e 8,2% na
Paraíba (Castro et al., 2002; Bandeira et al., 2009), de 11,0% no Rio Grande do Norte
(Silva et al., 2005), de 50,6% no Maranhão (Alves & Pinheiro, 1997), de 17,7% e 3,9%
em Pernambuco (Castro et al., 1994; Castro et al., 2002) e de 4,25% em Sergipe (Melo
et al., 2003).
17
2.1.4
Patogenia
A principal via de infecção das lentiviroses é a digestiva, através da ingestão de
colostro ou leite pelas crias de mães infectadas (Adams et al., 1983, Rowe et al., 1992),
porém a transmissão pode ocorrer, também, por outras vias onde há contato direto entre
os animais, ou indiretamente por materiais contaminados com sangue ou leite de
animais infectados (Al-Ani & Vestweber, 1984). A idade, raça e o sexo dos animais
parecem não intervir na sua suscetibilidade frente ao CAEV (Rowe & East, 1997),
porém outros fatores como estresse, infecções bacterianas e virais concomitantes podem
aumentar o risco da infecção (Zink et al., 1987), existindo a possibilidade de alguns
animais infectados poderem expressar mais o vírus do que outros (Adams et al., 1983).
O agente etiológico da CAE tem tropismo por monócitos e macrófagos, que
funcionam como replicação viral e meio de distribuição. A “replicação restrita” permite
que o vírus permaneça latente nos monócitos do hospedeiro e não seja detectável pelo
sistema imune (Pugh, 2004). Os mecanismos desenvolvidos pelos lentivírus para
persistência da infecção frente a resposta imune incluem: capacidade dos monócitos de
conter provírus integrado em seu genoma sem ser detectado pelo sistema imune, pois a
expressão do gene viral só é ativada quando os monócitos maturam para macrófagos
(Brodie et al., 1995); capacidade de infectar persistentemente macrófagos, sem causar
lise celular, podendo disseminar o vírus no próprio hospedeiro, sem a produção de
partículas virais, através do contato com outras células (Narayan et al., 1984);
interrupção do ciclo viral pelo processamento incompleto da SU (Chebloune et
al.,1996); replicação de variantes antigênicos na presença de anticorpos neutralizantes e
produção de interferon, que diminui o índice de replicação e favorece a persistência do
estímulo antigênico (Klevjer-Anderson & McGuire 1982; Narayan et al., 1984; Zink et
al., 1987; Bertoni et al., 1994; Cheevers et al., 1993). A alta mutabilidade do agente que
pode resultar em variantes antigênicas funciona como mecanismo de escape da resposta
celular e humoral (Knowles et al., 1990; Cheevers et al., 1993; Lichtensteiger et al.,
1993).
O vírus, quando presente no hospedeiro, consegue chegar ao cérebro, pulmões,
articulações e outros órgãos através dos monócitos, onde ocorre posteriormente a
maturação destes em macrófagos. A diferenciação em macrófagos ativa a expressão do
gene viral e os vírus são então produzidos nestes órgãos (Clements & Payne, 1994).
As principais alterações patológicas causadas pelo CAEV encontram-se no
sistema nervoso central (SNC), articulações, pulmão e glândula mamaria (Al-Ani &
18
Vestweber, 1984 ; Haase, 1986). Cabras naturalmente infectadas com o vírus CAE
expressam o DNA proviral em diversos tecidos do seu trato genital, tais como útero,
ovidutos, além da glândula mamária. A presença dos lentivírus nestes tecidos pode
contribuir para a transmissão vertical da enfermidade (Fieni et al., 2002).
2.1.5
Resposta Imunológica
A capacidade de estimular dado organismo a produzir uma resposta imune
consiste em imunogenicidade (Tizard, 2002). Os LVPR induzem tanto a resposta
humoral quanto celular, de diferentes intensidades, mas não protegem contra a infecção
(Bertoni et al.,1994; Cheevers et al., 1993). A primeira resposta imunológica dirigida
para a proteína do capsídeo (CA), a qual é detectada por volta da 1° semana pósinfecção e por volta da 3° semana pós-infecção; na 5° semana são elaborados anticorpos
contra as demais proteínas do nucleocapsídeo (NC), matriz (MA), glicoproteínas
transmembranária (TM) e de superfície (SU) (Concha-Bermejillo, 1997), para está
última produzidos tardiamente, apresentando baixa afinidade por seu antígeno
homólogo e presentes em quantidade insuficiente de forma que não interrompem o ciclo
de replicação viral (Bertoni et al.,1994; Cheevers et al., 1993; Kennedy-Stoskopf &
Narayan, 1986; Narayan et al., 1984). Em infecções pelo CAEV a indução a produção
imediata de anticorpos não ocorre como acontece com o Vírus Maedi-Visna (MVV)
(Narayan et al., 1997).
2.1.6
Sinais Clínicos
A manifestação clínica, segundo Franke (1998), pode ocorrer por meio de cinco
quadros clínicos, sendo eles: a artrite, encefalite, mamite, pneumonia e emagrecimento
crônico.
Geralmente, temos as articulações acometidas, sendo a forma clínica mais
observada, manifestando-se em animais com mais de oito meses de idade (Crawford &
Adams, 1981; Gonzalez et al., 1987). A articulação do carpo é a mais afetada, aonde se
observa aumento na consistência e no volume, sendo o 1° sinal clínico a poliartrite
crônica com sinovite e bursite (Crawford & Adams, 1981; Cutlip et al., 1988; Gonzalez
et al., 1987; Oliver et al., 1981), porém todas as articulações têm evidência
microscópica de infecção. No estado do Ceará, animais soropositivos para a CAE
19
apresentavam aumento significativo das articulações carpometacarpianas (Pinheiro et
al., 2001, 2005).
A forma mamária é frequente, e com grande significado econômico em face do
comprometimento da produção leiteira e predisposição a infecções secundárias da
glândula mamária (Lerondelle, 1988; Simard & Briscoe, 1990). Na glândula mamária
de cabras infectadas, observa-se endurecimento gradativo com a presença de vários
nódulos de consistência dura, que confluem para determinar um endurecimento difuso
do parênquima mamário, resultando em assimetria das metades do úbere (Gonzalez et
al., 1987; Kennedy-Stoskopf et al., 1985; Cheevers & McGuire 1988; Perk,1988).
A leucoencefalomielite constitui a forma clínica nervosa da CAE, e sua
ocorrência é predominante em cabritos com idades que variam de um a quatro meses de
idade. Os sintomas da leucoencefalomielite são: fraqueza muscular, paresia ou ataxia
dos membros posteriores, andar em círculo, cegueira, nistagmo, tremores e inclinação
da cabeça (Cork et al., 1974; Lara et al., 2005).
2.1.7
Diagnóstico
O diagnóstico clínico não é suficiente para determinar a doença, pois os sinais
clínicos da CAE podem ser confundidos com os de outras enfermidades (Oliveira,
2006). No diagnóstico da CAE existe uma série de técnicas empregadas (Franke, 1998),
estando divididas em técnicas imunológicas, análises indiretas, e de detecção do vírus
ou seu isolamento, análises diretas.
Para o diagnóstico sorológico, o teste de Imunodifusão em Gel de Agarose
(IDGA) é o recomendado pela OIE (2004), por ser de fácil aplicabilidade e não exigir
equipamentos nem instalações sofisticadas. Este método é a forma diagnóstica mais
utilizada em todo mundo, principalmente em programas de controle da doença que já
são empregados em vários países (Moojen, 2001). Além da fácil aplicabilidade, o IDGA
tem alta especificidade o que acaba credenciando-o para a realização dos diagnósticos
de triagem nos programas de controle da enfermidade (Varea et al., 2001). Outros
métodos podem ser utilizados para diagnose, sendo eles: Ensaio Imunoenzimático
(ELISA), Reação em cadeia da polimerase (PCR), Reação de Imunofluorescência
Indireta (RIFI), Hibridização in situ (HIS), Radioimunoprecipitação (RIPA), Western
Blot (WB) e Isolamento Viral.
20
O IDGA utiliza a partícula viral íntegra concentrada a partir de sobrenadantes de
cultura ou parte do vírion (proteínas virais) adquiridas pela ação de detergentes ou
outros tratamentos. O IDGA detecta anticorpos contra a proteína p25 do capsídeo do
MVV (p28 em CAEV) e contra a glicoproteína de superfície gp135. Um estudo relatou
ao testar 218 amostras de campo, uma sensibilidade e especificidade diagnóstica de
91% e 100%, respectivamente, obtidas por IDGA confrontadas com o RIPA (Knowles
et al., 1994); outro trabalho mais recente examinou 1.941 soros de 693 ovelhas em
sequência, no período de 3-4 anos e encontraram sensibilidade e especificidade para
76,3% e 98,3%, respectivamente, em relação aos escores consenso obtido pelo Teste
Imunoenzimático (ELISA) e Western Blot (WB) (Varea et al. 2001). Apesar de
apresentar alta especificidade, o IDGA não é um teste recomendado para diagnóstico
precoce da doença devido a sua baixa sensibilidade, despertando, assim, o interesse pelo
desenvolvimento dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA), mais sensíveis. Nesse teste as
reações antígeno-anticorpo são detectadas por meio da conjugação de um destes
componentes com uma enzima, que posteriormente age sobre o substrato, produzindo
uma
coloração,
que
pode
ser
detectada
visualmente
ou
mensurada
por
espectrofotometria (Madruga et al., 2001).
Em condições experimentais, a imunofluorescência indireta (IFI) tem
apresentando um potencial como teste alternativo e complementar para o diagnóstico
dos LVPR. Esse ensaio consiste em tornar visível a reação antígeno-anticorpo por meio
de uma anti-imunoglobulina marcada com fluorocromos. Estes são substâncias que têm
a capacidade de absorver energia luminosa, tornando-se excitadas por um curto espaço
de tempo (10-9 a 10-7 segundos), para em seguida emiti-la em forma de fluorescência ao
retornarem ao seu estado normal. Os fluorocromos mais comumente empregados são
derivados da rodamina, que emitem fluorescência vermelha, e o isotiocionato de
fluoresceína que emite fluorescência verde (Madruga et al., 2001). A IFI é recomendada
pela OIE, e tem sido utilizada no diagnóstico de infecção em ovinos e caprinos,
utilizando-se como antígeno os isolados brasileiros de lentivírus, porém neste exame a
exposição à fonte de luz ultravioleta é desgastante, tornando o técnico mais susceptível
a erros e, consequentemente na precisão do teste, assim o IDGA permanece como teste
de escolha para o diagnóstico da CAE, devido à maior facilidade de execução e leitura
e, por requerer infraestrutura laboratorial mínima (Reischak, 2000).
21
O isolamento e identificação do vírus por meio do cultivo de tecido, incluindo a
explantação de tecidos articulares, pulmonares, do sistema nervoso e de glândula
mamária; e o co-cultivo em células de membrana sinovial de cultivo primário caprino
com células sanguíneas, colostro, leite, lavado brônquio-alveolar e líquido cerebrospinal
representa um diagnóstico determinante (Cork & Narayan, 1980; Hötzel et al., 1993;
Callado, 1999), sendo as culturas primárias de células de membrana sinovial as mais
usadas para o isolamento e caracterização biológica do CAEV (Crawford et al., 1980;
Narayan et al., 1980). Porém, por ser uma técnica demorada, dispendiosa, e que requer a
implantação e manutenção de cultivos celulares especiais não é utilizada rotineiramente
para o diagnóstico dessa doença (Knowles, 1997).
Outra técnica utilizada é a imunohistoquímica, voltando-se para a identificação
de partículas virais em tecidos infectados, podendo esta ser utilizada tanto para testes de
susceptibilidade in vitro quanto para identificação do vírus em tecidos de animais
naturalmente infectados. Carroza et al. (2003) utilizando o PCR in situ associado à
imunohistoquímica em células de tecido pulmonar e glândulas mamárias, identificaram
vários tipos celulares carreando o ácido nucléico viral.
2.1.8
Prevenção e Controle
Entre os grandes problemas no controle e prevenção da CAE está o diagnóstico
realizado de forma tardia, principalmente por não ser uma medida comum ao programa
sanitário das propriedades, seja decorrente de desconhecimento, questão cultural ou
mesmo por falta de condição do produtor.
As medidas sanitárias adotadas para o controle e a erradicação da infecção pelo
CAEV estão diretamente relacionadas com o tamanho, o tipo de exploração, o manejo e
o grau de infecção dos rebanhos. Estas incluem medidas como a aplicação de testes
sorológicos sensíveis e específicos a serem realizados semestralmente em todos os
caprinos. Não há tratamento especifico para a CAE (East, 1993). A maioria dos animais
que apresentam sintomatologia clínica são descartados ou sacrificados devido à
claudicação, decúbito, perda de peso e redução da produção (Reilly et al., 2002), sendo
que a única forma de evitar sua transmissão é estabelecer medidas de controle e
22
prevenção da doença. A maneira mais efetiva de controlar a infecção consiste em se
proceder à remoção dos animais infectados e interromper a difusão do agente.
2.2 CAPRINOCULTURA E PRODUÇÃO LEITEIRA
2.2.1
Importância da Caprinocultura na produção leiteira
A cabra foi o primeiro animal a ser domesticado para subsistência, desde a
produção de leite assim como a produção da carne e obtenção da pele. A cabra
doméstica de hoje é a Capra hircus. Provavelmente os ancestrais mais antigos dessa
cabra sejam dois: a Capra sivalencis e Capra perimensis, conhecidos apenas em forma
de fósseis. Os ancestrais que ainda são encontrados vivos e que formaram as nossas
cabras são: a Capra aegagrus, da qual descende a maioria das raças (Alpina, Angorá,
etc.), da região da Pérsia e da Ásia Menor; e a Capra falconezi que resultou nas cabras
de cachemira, da região do Egito. No Brasil os caprinos foram introduzidos com os
colonizadores portugueses, franceses e holandeses. Porém, somente em 1910 é que
figuram importações de animais com maior potencial de produção (Cria & Plantar,
2008).
No Brasil a Região Nordeste é detentora de grande parte do rebanho caprino do
país, aproximadamente 91,4% dos 9,164 milhões de caprinos existentes segundo dados
do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2009), correspondente a 1,1 %
do rebanho mundial (FAO, 2008). Em 2007 o Brasil ocupou a 19º posição na produção
de leite de cabra mundial, segundo a FAO (Food and Agriculture Organization of
United Nations). A Bahia é o grande estado produtor de caprinos no Brasil, detendo
33,7% do efetivo nacional. Não por coincidência, dos dez principais municípios
produtores, sete são da Bahia. A criação deste rebanho é direcionada economicamente
para a produção de pele e carne, mas a produção de leite tem sua taxa de participação
neste processo, mesmo que ínfima (apenas 1,3% da produção total de leite produzida no
mundo, aproximadamente 141 toneladas). Muito dos produtores têm a produção de leite
como uma atividade secundária, mas que de certa forma tem alcançado uma
23
participação importante na economia do país, sendo considerada em algumas áreas a
atividade principal.
A criação de caprinos na Região Nordeste visando à produção leiteira tem
gerado emprego e renda no setor rural, com alto impacto social e econômico para o
crescimento da região. Explica Costa (2005) que a produção nacional diária de leite de
cabra é de 22.000 litros, sendo a produção mensal de 660.000 litros e a produção anual
de 7.920.000 litros. O potencial de demanda, mesmo se considerando que a clientela
para o leite de cabra é formada por um público diferenciado é, com certeza, o dobro
destes valores de produção, havendo, portanto, um déficit de oferta de 22.000 litros de
leite por dia e 660.000 litros de leite por mês. A região Nordeste produz diariamente
10.000 litros de leite de cabra, 45.4% da produção nacional. O Estado do Rio Grande do
Norte é o principal produtor, com 8.500 litros/dia. No Estado do Ceará, a produção de
leite diária chega aos 1.000 litros, sendo que a região Norte do Estado apresenta um
potencial de produção de 400 litros de leite por dia. A produção do Sudeste é de 12.000
litros, 54.6% de todo o leite de cabra que é produzido no País, e por apresentar uma
cadeia produtiva organizada, com processamento industrial e a garantia de
comercialização do leite e de seus derivados, o que assegura a evolução do setor. O
mercado está subdividido em venda de leite fluído (93%), venda de leite em pó (4%) e
venda de queijos, doces e iogurtes (3%). O preço médio do leite in natura adquirido aos
produtores é de R$ 0,70 e o leite pasteurizado chega aos varejistas com o preço médio
de R$ 1,30 e estes repassam aos consumidores a um preço médio de R$ 1,80.
O leite de cabra apresenta em média na sua composição físico-química (em 100
mL): 86,6g de água; 4,7g de carboidratos (lactose); 3,3g de proteínas (caseína,
Lactoalbumina, β-Lactoglobulina, etc.); 4,1g lipídeos (vários ácidos graxos,
fosfolipídeos, etc.); 130mg de Cálcio; 159mg de Cloro; 16mg de Magnésio; 106mg de
Fósforo; 181mg de Potássio; 41mg de Sódio; 16mg de Enxofre; 0,27μg de Ácido fólico;
134UI de vitamina A; 48μg de vitamina B1; 114μg de vitamina B2; 0,02μg de vitamina
B12; 1,4mg de vitamina C e 273μg de ácido nicotínico (HAFEZ, 1988; BACILA,
2003). O leite trata-se de um alimento de grande importância no contexto mundial por
conter elementos necessários a nutrição humana, como o açúcar (lactose), Proteínas,
Gorduras, Vitaminas, Minerais (ferro, cálcio, fósforo etc.). As partículas de gordura do
leite de cabra são de tamanho reduzido em relação ao leite de vaca. Com isso, o leite é
24
rapidamente absorvido, em cerca de 40 minutos, enquanto o leite de vaca demora, em
média, de 2 horas, deixando menos resíduos no intestino, evitando assim fermentação,
formação de gases, má digestão, constipação, etc. Também possui capacidade
tamponante; é uma excelente fonte de cálcio e vitaminas, possuindo 130 mg de cálcio
para cada 100 mL de leite, ou seja, 20% mais que o leite de vaca, sendo muito utilizado
na ação preventiva e curativa de osteoporose. Para quem precisa de uma rápida
reposição e aquisição de nutrientes, o leite de cabra é uma ótima alternativa (Revista o
Berro, 2004). É importante que esse leite tenha boa precedência, ou seja, proveniente de
um rebanho livre de doenças, entre elas principalmente a CAE (Brasil, 2000).
A CAE quando presente no rebanho se deve a não realização de medidas de
prevenção e controle. Em algumas propriedades chega a atingir mais de 60% das cabras,
provocando uma grave perda econômica pela redução ou mesmo supressão da produção
de leite (Franke, 1998).
2.2.2
Caracterização do leite caprino
O leite de cabra pode ser classificado, quanto ao teor de gordura em: leite de
cabra integral: quando não houver qualquer alteração do teor de gordura contido na
matéria-prima; leite de cabra padronizado: quando o teor de gordura, expresso em %
m/m, for acertado para 3%; leite de cabra semidesnatado: quando o teor de gordura,
expresso em % m/m, for acertado para o intervalo entre 0,6 e 2,9 %; leite de cabra
desnatado: quando o teor de gordura, expresso em % m/m, não superar o limite máximo
de 0,5%. É importante salientar que esta classificação deverá ser seguida para o leite
beneficiado e comercializado sob as formas fluída e congelada, independentemente do
tipo de processamento térmico. Com relação à denominação de venda este é classificado
em: leite de Cabra Pasteurizado Integral, ou Padronizado, ou Semidesnatado ou
Desnatado devendo ser adicionada a expressão "Congelado" no final da denominação
de venda descrita acima, quando for o caso; leite de Cabra Esterilizado, seguindo-se a
classificação quanto ao teor de gordura; e leite de Cabra UHT (UAT), seguindo-se a
classificação quanto ao teor de gordura (Brasil, 2000).
25
Quantos as características físico-químicas, o leite caprino foi avaliado por
diversos pesquisadores no intuito de entender sua normalidade (Barros & Leitão, 1992;
Prata et al., 1998; Queiroga et al., 1998; Tonin & Nader Filho, 2002; Gomes et al.,
2004; Pereira et al., 2005; Fonseca et al., 2006; Queiroga et al., 2007; Silva, 2007;
Andrade et al., 2008; Silva, 2010). A composição pode variar conforme a raça, idade,
ciclo estral, estágio da lactação, alimentação, condições ambientais, manejo, estado de
saúde, quantidade de leite produzido e a fisiologia individual do animal (Furtado &
Wolfschoon-Pombo, 1978; Guimarães, 1989; Alves & Pinheiro, 2004). O Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA, pela Instrução Normativa N° 37 de 31
de Outubro de 2000 (Brasil, 2000), estabeleceu requisitos mínimos de qualidade do leite
destinado ao consumo humano, fixados no Regulamento Técnico de Produção,
Identidade e Qualidade do Leite de Cabra: 13 a 18 °D para acidez; 2,9%, gordura; 4,3%,
lactose; 8,2%, de sólidos não gordurosos e 1.028,0 a 1.034,0 para densidade a 15°C;
índice crioscópico, ° H, -0,550 0H a -0,585 para todas as variedades.
Os elementos nutricionais, sobretudo proteínas, carboidratos, vitaminas e
minerais contidos no leite, transformam-no em um excelente substrato para o
crescimento de microrganismos. Por este motivo, o leite deve ser obtido com máxima
higiene e mantido em baixa temperatura, desde a ordenha até a ocasião de seu
beneficiamento, visando garantir as características físicas, químicas e nutricionais do
produto final (Oliveira, 2008).
Os principais microrganismos envolvidos com a contaminação do leite são as
bactérias, visto que os vírus, fungos e leveduras têm participação reduzida em termos de
contaminação. Com relação à faixa de temperatura ótima para multiplicação, as
bactérias podem ser classificadas em três categorias distintas: psicrófilas, mesófilas e
termófilas. A faixa ótima de crescimento da microbiota psicrófila encontra-se entre 0ºC
e 15º C; a das mesófilas, entre 20ºC e 40ºC; e das termófilas entre, 44ºC e 55ºC. Além
dessas, duas outras categorias de microrganismos são importantes: as bactérias
psicrotróficas e as termodúricas (Fonseca & Santos, 2007). De acordo com a Instrução
normativa n° 37 do MAPA o leite de cabra, quando cru, deverá apresentar Contagem
Padrão em Placas (CPP) de, no máximo, 500.000 UFC/mL (quinhentas mil Unidades
Formadoras de Colônias por mililitro) (Brasil, 2000).
26
2.2.3. Glândula Mamária
As glândulas mamárias, explica Dellmann & Brown (1982), são órgãos
especializados da pele originados embriologicamente pela invaginação de brotos
ectodérmicos para o interior do mesoderma subjacente. Seu desenvolvimento começa
no embrião e continua de modo muito lento, durante o período pré-puberal. Na fêmea, o
seu crescimento aumenta, após a puberdade, como resultado da estimulação hormonal
cíclica.
A glândula mamária consiste em glândula túbulo-alveolar composta. A unidade
secretora consiste em um alvéolo e um ducto, ambos com estrutura semelhante
(Dellmann & Brown, 1982). As porções secretoras túbulos-alveolares da glândula
mamária são constituídas por um epitélio glandular que varia de cúbico a cilíndrico, e
células mioepiteliais. O lúmen apresenta até 1 mm de largura. As células epiteliais
apresentam um abaulamento apical que se projeta para dentro da luz, qual se dispõem
gotículas lipídicas de até 5 µm de diâmetro, secretadas de modo apócrino. No lúmen
encontram-se frequentemente glóbulos de gordura de leite e material basófilo finamente
floculado (proteínas do leite). O citoplasma é basófilo (rico em RE granular, onde são
produzidas a proteínas do leite) (Welsch, 2003).
Na glândula mamária de cabras infectadas, observa-se endurecimento gradativo
com a presença de vários nódulos de consistência dura, que confluem para determinar
um endurecimento difuso do parênquima mamário, resultando em assimetria das
metades do úbere (Gonzalez et al., 1987; Kennedy-Stoskopf et al., 1985; Cheevers &
McGuire 1988; Perk,1988). As lesões histológicas observadas na glândula mamária dos
animais clinicamente afetados pela CAE consistem em extensiva infiltração intralobular
de linfócitos e marcada hiperplasia linfóide adjacente aos ductos lactíferos (Al-Ani E
Vestweber, 1984). Lerondelle et al. (1989) em seus resultados encontrou infiltrado
moderado de linfócitos e macrófagos, abundância de tecido conjuntivo e
linfoadenopatia subaguda ou crônica.
27
3.
HIPÓTESE CIENTÍFICA
O CAEV é responsável por causar alterações na glândula mamária em cabras
naturalmente infectadas que podem levar a alterações na composição do leite.
28
4.
OBJETIVOS
4.2. OBJETIVO GERAL

Avaliar a influência do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) na glândula
mamária de cabras naturalmente infectadas e possível alteração nas
características do leite.
4.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realização de triagem sorológica do rebanho visando a aplicação de medidas de
controle e prevenção na propriedade;

Realizar exame histopatológico e Imunohistoquímica da glândula mamária de
animais soropositivos e soronegativos para CAE;

Executar análises físico-química (temperatura, pH, gordura, extrato seco
desengordurado, densidade, proteína, lactose, ponto de congelação, teor de água,
condutibilidade) e microbiológica das amostras de leite de cabras positivas para
CAE em comparação a amostras de leite de cabras soronegativas para CAE.
29
5.
CAPÍTULO 1
ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS DA GLÂNDULA MAMÁRIA E
QUALIDADE DO LEITE DE CABRAS NATURALMENTE INFECTADAS
COM O CAEV
(Histopathological changes in the mammary gland and quality milk goats naturally
infected with CAEV)
Periódico: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (submetido em
junho de 2011).
30
Alterações histopatológicas da glândula mamária e qualidade do leite de cabras
naturalmente infectadas com o CAEV
R. Q. Bezerra Júnior¹,², M. F. S. Teixeira2,3, G. R. Martins², M. R. Abrantes4, R. P.
Dias², T. D. F. Aguiar2, L. A. O. Alves², C. A. F. Lopes Júnior², J. B. A. Silva4, J. S.
A. M. Evangelista², M. G. F. Salles5.
¹. Aluno de pós-graduação - UECE - Bolsista FUNCAP – Fortaleza, CE
². Programa de pós-graduação em ciências veterinárias – UECE
Av. Paranjana, 1700 – Itaperi – CEP 60740-000 – Fortaleza, CE.
3
4
. Bolsista de produtividade em pesquisa do CNPq nível 2
. Laboratório de Inspeção de Produtos de origem animal da UFERSA – Mossoró,
RN.
5
. Médica veterinária do Lar Antônio de Pádua.
Resumo
Com o objetivo de avaliar a influência do vírus da CAE nas características físicoquímicas do leite foram coletadas amostras de leite de 54 cabras, sem predileção racial,
sendo estas divididas em dois grupos: cabras positivas e negativas para o teste de
Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA). As amostras de leite foram submetidas à
análise ultrassônica para obtenção de parâmetros físico-químicos (gordura, extrato seco,
proteínas, lactose e densidade); realização de microbiologia (bactérias mesófilas –
UCF/mL); e das cabras em estudo foram coletadas amostras de tecido mamário para
exame histopatológico e imunohistoquímica. Nas amostras de leite avaliadas para a
análise físico-química não houve diferença significativa dos parâmetros avaliados entre
os dois grupos; no microbiológico, não houve relação direta da presença de mesófilas
associada a infecção pelo CAEV. No histopatológico, observaram-se áreas com
infiltração celular de monócitos, polimorfonucleares, plasmócitos, fibrose, ausência de
morfologia normal do parênquima mamário, denotando processo inflamatório crônico;
sendo confirmada a presença do vírus na glândula pela imunohistoquímica. Os
resultados apresentados não mostraram relação direta da incidência da CAE no rebanho
como fator negativo no desenvolvimento deste, porém é de conhecimento que a
enfermidade, em sua cronicidade, ocasiona redução das características produtivas do
rebanho.
Palavras-chaves: CAE, Lentivírus, Análise físico-química, Leite.
31
Abstract
Aiming to evaluate the influence of CAE viruses in the chemical and physical
characteristics of milk, the samples were collected from 54 goats, without racial
predilection, these were divided into two groups: goats positive and negative according
results of test Agarose Gel Immunodiffusion (AGID). Milk samples were ultrasonic
analyzed to obtain physicochemical parameters (fat, solids, protein, lactose and
density); performance microbiology (mesophilic bacteria – UFC/ mL) and mammary
gland samples were collected for evaluation histopathology and immunohistochemistry.
The results of physical-chemical analysis showed no significant difference between the
milk samples of two groups. In the microbiological analysis showed the presence of
aerobic mesophilic bacteria, but this change is not associated with the presence of
CAEV infection. On histopathology, there were areas with infiltration of mononuclearleukocyte and polymorph nuclear, plasma cells, fibrosis and absence of normal
morphology of the mammary tissue, indicating a chronic inflammatory process; and
confirmed the presence of virus, in the gland, by immunohistochemistry. The results
showed no direct relationship between incidence of CAE in the herd as a negative factor
for its development, however it is known that the disease in its chronic nature, causes
reduction in the productivity of the herd.
Keywords: CAE, lentiviruses, Physical-chemical analysis, Milk.
INTRODUÇÃO
A Artrite Encefalite Caprina (CAE) é uma enfermidade multissistêmica, de
caráter crônico e debilitante, apresentando como principais formas clínicas: artrite,
pneumonia e mastite, observadas em animais adultos e mais raramente a
leucoencefalomielite em caprinos jovens (Pugh, 2004). É ocasionada pelo Vírus da
Artrite Encefalite Caprina – CAEV, pertencente à família Retroviridae, subfamília
Orthoretrovirinae e gênero Lentivirus (ICTV, 2009).
A transmissão pode ocorrer de forma direta, através da ingestão de colostro e
leite da própria mãe ou do leite misturado de várias cabras, do contato direto entre
32
animais através dos líquidos corporais (aerossóis, saliva, etc.); e indireta, por meio de
objetos contaminados (fômites), pelo homem (iatrogênica). A idade, raça e o sexo dos
animais parecem não intervir na sua suscetibilidade frente ao CAEV (Rowe e East,
1997), porém outros fatores como estresse, infecções bacterianas e virais concomitantes
podem aumentar o risco da infecção (Zink et al., 1987), existindo a possibilidade de
alguns animais infectados poderem expressar mais o vírus do que outros (Adams et al.,
1983). Cabras naturalmente infectadas com o vírus CAE expressam o DNA proviral em
diversos tecidos do seu trato genital, tais como útero, ovidutos, além da glândula
mamária. A presença dos lentivírus nestes tecidos pode contribuir para a transmissão
vertical da enfermidade (Fieni et al., 2002).
A influência da infecção pelo vírus da CAE na constituição físico-química do
leite de caprinos foi estudada por pesquisadores como Nord e Adnoy (1997), os quais
observaram que os valores de lactose, gordura e proteína não sofreram variações
significativas que pudessem ser creditadas à infecção pelo vírus; Birgel Júnior et al.
(2007), através da análise do leite de cabras das raças Saanen e Pardo Alpina frente ao
CAEV, confirmou ser evidente e significativa a influência da
enfermidade na
composição físico-química e celular do leite, observada, por exemplo, em valores de
eletrocondutividade, teores de cloretos e a contagem de células somáticas que foram
maiores nas cabras infectadas pelo CAEV com ou sem sinais de endurecimento difuso
da mama.
O leite atua como importante veiculador e disseminador da enfermidade quando
existente a presença do patógeno, e, consequentemente, espera-se que haja alguma
alteração evidente no mesmo quanto as suas características organolépticas e físicoquímicas. Porém, a falta de trabalhos referentes, bem como a ausência de informações
sobre a influência da doença nos valores físico-químicos, faz com que seja necessária a
realização de pesquisas neste sentido. Assim, o presente trabalho objetivou avaliar a
influência da CAE nas características físico-químicas e microbiológicas do leite de
cabras naturalmente infectadas e estudar histopatologicamente a glândula mamária.
MATERIAL E MÉTODOS
As coletas foram realizadas em um capril situado na zona metropolitana de
Fortaleza/CE (Pacatuba). O experimento foi realizado no período de novembro a
dezembro de 2010. Esse projeto de pesquisa foi avaliado pela Comissão de Ética para o
33
Uso de Animais em Pesquisa da Universidade Estadual do Ceará (CEUA – UECE),
sendo aprovado sob o número de protocolo 10130900-7/32.
Animais
A escolha dos animais foi independente de raça, sendo selecionadas cabras com
idade entre 2-3 anos. Foram coletadas amostras de sangue de 62 animais para sorologia,
porém para a análise físico-química e microbiológica, realizou-se escolha aleatória de
54 cabras dentro do grupo de animais considerado soropositivos (28 animais) e
soronegativos (26 animais) para o IDGA. Esse “n” amostral para a análise físicoquímica foi estabelecido adotando-se um nível de confiança de 95%, com erro amostral
de 5%.
Coleta das amostras (sangue e leite)
As coletas foram divididas em duas etapas distintas: na primeira, a coleta de
sangue dos caprinos por venopunção da jugular para posterior realização de exame
sorológico, IDGA; e na segunda, a coleta de amostras de leite de cabras soropositivas e
soronegativas no IDGA para realização de análises físico-química e microbiológica.
A sorologia foi realizada no Laboratório de Virologia (LABOVIR), Universidade
Estadual do Ceará (UECE); as análises físico-química e microbiológica no Laboratório
de Inspeção de Produtos de Origem Animal (LIPOA), Universidade Federal do
Semiárido (UFERSA).
Imunodifusão em gel de agarose
Na coleta foram obtidas amostras de 10 mL de sangue, acondicionadas em
recipiente refrigerado e levadas ao laboratório para processamento. As amostras foram
centrifugadas a 3000 rpm durante 10 minutos para obtenção do soro e posterior
realização do IDGA. O kit diagnóstico utilizado foi o BIOVETECH®, sendo realizada a
análise conforme instruções do fabricante.
34
A primeira leitura foi realizada com 24 horas após incubação e a leitura
definitiva ocorreu após 48 horas de incubação. As reações foram avaliadas pela
presença de linhas identidade com a linha de precipitação, obtidas entre antígeno e soro
dos animais e soro controle.
Análise físico-química das amostras do leite
Durante a ordenha, depois de desprezado os primeiros jatos de leite, amostras
foram coletadas em tubos Falcon estéreis de 50 ml, acondicionadas em recipiente
refrigerado e levadas ao LIPOA para posterior análise ultrassônica. As amostras foram
avaliadas em duplicata, realizando-se em seguida cálculo da média dos resultados.
A avaliação das características físico–químicas do leite foi realizada através do
analisador de leite ultrassônico (Ekomilk Total, CAP-LAB®), sendo avaliados os
seguintes parâmetros: densidade, temperatura, proteína, lactose, gordura, extrato seco
desengordurado, pH e condutividade. Através dos valores da gordura e ESD pode-se
calcular o EST, e com os valores da temperatura e densidade, pode-se obter o resultado
da densidade a 15°C. Seguiram-se as normas estabelecidas pelo Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), segundo a Instrução Normativa N° 37
de 31 de Outubro de 2000 (Brasil, 2000).
Exame microbiológico (contagem padrão em placas - CPP)
De cada amostra de leite (n=29) preparou-se diluições sucessivas 10-¹, 10-², 10-³
e 10-⁴, sendo utilizada a partir da 10-². Foi transferido 1 mL de cada diluição para placas
de Petri, esterilizadas, em duplicata. Adicionou-se 20 mL de ágar padrão para contagem.
As placas foram homogeneizadas através de realização de movimentos circulares e
deixadas em repouso até a solidificação do ágar. Após a solidificação as placas foram
incubadas em estufa a 37ºC por 48 horas. Procedeu-se então a contagem, cujo resultado
foi expresso em unidade formadora de colônia por mL (UFC/mL). O exame
microbiológico seguiu protocolo estabelecido pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento - MAPA, segundo a Instrução Normativa N° 62 de 26 de Agosto de
2003 (Brasil, 2003).
35
Exame histopatológico
Após o abate das cabras, amostras de tecido mamário de animais soropositivos e
soronegativos para CAE foram coletadas. Realizaram-se cortes histológicos de tecido
mamário, 5µm cada, para posterior preparação das lâminas histológicas. Os fragmentos
foram fixados em formol e corados por hematoxilina-eosina.
Imunohistoquímica
A análise imunohistoquímica seguiu metodologia descrita por Ricarte (2009),
objetivando a localização topográfica da proteína p28 do CAEV no tecido mamário.
Foram realizados cortes histológicos de tecido mamário, 5µm cada, para posterior
recuperação de antígenos. Para isto, as lâminas foram incubadas em tampão citrato 10
mM (pH 6,0) com o auxílio de um forno microondas em potência máxima (700 watts).
A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando-se 3% de peróxido de
hidrogênio (H2O2) em água, com duas trocas de cinco minutos cada. Para bloquear as
ligações inespecíficas, as amostras foram incubadas em soro contendo anticorpos
específicos de espécie diferente dos anticorpos primário (soro positivo para CAE) e
secundário (coelho anti-caprino) durante o período de cinco minutos. Em seguida, após
lavagem em PBS, foi colocado o anticorpo primário, diluído em PBS, por um período
de 10’ a temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas em PBS e incubadas com
IgG anti-caprino conjugada a peroxidase por 30 minutos a 37 °C a uma diluição de
1:1000. A reação foi revelada pela adição da diaminobenzidina tetrahidroclorídeo por 810’ minutos. As lâminas foram contracoradas com hematoxilina de Mayer por 1 minuto,
montadas e analisadas em um microscópio óptico.
Estatística
Os dados das amostras foram organizados em tabela do Excel, sendo calculadas
médias aritméticas, desvios padrão das médias e coeficiente de variação dos resultados
obtidos para físico-química. Os resultados foram submetidos a teste estatístico t de
Student.
36
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análise físico-química e microbiológica do leite
A tabela 1 apresenta os valores médios obtidos da análise físico-química das 55
amostras coletadas de cabras soropositivas e soronegativas para CAE. Todas as
amostras apresentaram valores médios (parâmetros) acima do padrão estabelecido pelo
MAPA (2000), e comparando-se os parâmetros dos dois grupos não foi observada
diferença significativa entre as amostras. Esses valores acima do padrão podem ser
decorrentes do tipo de manejo alimentar aplicado, conforme explica Linn (1989), a
alimentação é o fator que mais influencia a composição do leite, onde dietas com
poucas fibras resultam em uma produção de leite com baixa porcentagem de gordura.
Esses dados corroboram com os achados de Nord e Adnoy (1997), Martínez Navalón et
al. (2002) quando avaliados os valores de extrato seco desengordurado, lactose e
proteína, e diferem dos encontrados por Birgel Júnior (2007), onde em seus resultados
evidenciou a significativa influência da infecção pelo CAEV na composição físicoquímica e celular do leite caprino, e Brito (2009) a qual concluiu que o CAEV
contribuiu para um comprometimento na produção leiteira e na qualidade do leite,
principalmente nos níveis de gordura do leite, sólidos totais do mesmo e aumento da
contagem de células somáticas.
Tabela 1 – Média dos valores físico-químicos encontrados na analise do leite de
animais soropositivos e soronegativos para CAE.
BRASIL
PARÂMETROS
SOROPOSITIVOS
SORONEGATIVOS
GORDURA
3,8
3,7
2,9
ESD*
9,4
9,2
8,2
PROTEÍNA
3,3
3,2
2,8
LACTOSE
5,4
5,2
4,3
(2000)
Estrato Seco Desengordurado*
37
Na tabela 2, observam-se os resultados referentes a contagem padrão em placas
para mesófilos aeróbios, onde do total de amostras analisadas, 27 (93,1%), amostras de
leite encontraram-se em conformidade com o limite estabelecido pela IN37 até o ano de
2010, que é de 1,0 x 106 UFC/mL e que 6,9% destas amostras encontram-se fora do
critério estabelecido pela IN37. A incidência da CAE não teve relação direta com a
presença de bactérias mesófilas uma vez que dentro deste grupo de 27 animais o número
de animais positivos e negativos foi aproximado, sem diferença significativa.
Tabela 2. Contagem padrão de placas para mesófilos aeróbios.
Mesófilos aeróbios (UFC/mL)
Níveis de contaminação
N
%
> 0 - 10²
17
58,6
> 10² - 10³
6
20,7
> 10³ - 104
2
6,9
> 104 - 105
2
6,9
> 105 - 106
2
6,9
> 106 - 107
-
-
Total
29
100
A baixa contaminação presente no leite para mesófilas aeróbias, não significa
dizer que o CAEV não tem relação com a presença de patógenos alterando a
microbiologia normal do leite, como também a ocorrência de mastite nos animais; como
foi mostrado por Birgel Júnior et al. (2005), sobre a ocorrência de mastite indurativa,
sendo que das 97 glândulas avaliadas por palpação, endurecimento difuso foi
diagnosticado em 19,68% dos animais infectados pelo CAEV. Lara et al. (2005),
estudando as formas clínicas da CAE, encontrou a mastite indurativa presente em 6,6%
dos caprinos sororreagentes. Os animais aqui trabalhados não apresentaram evidências
ao exame clínico de mastite, porém alguns deles apresentavam-se com artrite.
38
Exame histopatológico e Imunohistoquímica
No tecido mamário de cabras que foram submetidas a exame histológico
constatou-se mastite subclínica, caracterizada por infusão linfocitária, denotando a
ocorrência de processo inflamatório, sendo as principais mudanças observadas:
ácinos mononucleares com fibrose e atrofia; mastite difusa com presença de
monócitos e plasmócitos (indicativo de inflamação crônica), infusão monoleucocítica; por todo parênquima mamário extensas áreas com fibrocolágeno (Fig.
1). Achados similares foram encontrados por Gregory et al. (2009).
As lesões histológicas observadas na glândula mamária dos animais
clinicamente afetados pela CAE consistem em extensiva infiltração intralobular de
linfócitos e marcada hiperplasia linfóide adjacente aos ductos lactíferos (Al-Ani E
Vestweber, 1984). Lerondelle et al. (1989) em seus resultados encontrou infiltrado
moderado de linfócitos e macrófagos, abundância de tecido conjuntivo e
linfoadenopatia subaguda ou crônica.
Figura 1. Fotomicrografia
de
glândula
Presença
mamária.
agregado
plasmócitos
(A,
de
400X;
H.E.); área de fibrose (B,
100X;
H.E.);
epitélio
transformado, ausência de
morfologia
alvéolos
normal
dos
mamários
(C,
40X; H.E.); parênquima
mamário normal (D, 100X;
H.E.); marcação multifocal
do citoplasma da célula em
marrom
caracterizando
reação
positiva
(imunohistoquímica;
E,
400X, F, 200X).
39
Nos tecidos imunohistoquímicamente corados para a proteína p28 do CAEV, foi
observada a presença focal de plasmócitos e monócitos com intensa marcação
multifocal do citoplasma em marrom caracterizando imunohistoquímica positiva (Fig.
1).
CONCLUSÃO
Os resultados apresentados não mostraram relação direta da incidência da CAE
no rebanho como fator negativo no desenvolvimento deste, porém é de conhecimento
que a enfermidade, em sua cronicidade, ocasiona redução das características produtivas
do rebanho, sendo refletida na queda de produção e qualidade do leite, bem como das
condições fisiológicas dos animais acometidos.
Agradecimentos
A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo apoio financeiro. A Universidade Estadual do Ceará (UECE) e Universidade
Federal do Semiárido (UFERSA) por disponibilizarem condições técnica e pessoal.
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42
6.
CONCLUSÕES
1. A artrite encefalite caprina não modificou os parâmetros físico-químicos e
microbiológicos do leite, mas outros trabalhos mostraram que a enfermidade, em
sua cronicidade, ocasiona redução das características produtivas do rebanho,
sendo refletida na queda de produção e qualidade do leite, bem como das
condições fisiológicas dos animais acometidos;
2. A glândula mamária apresentou lesões características da presença do CAEV no
tecido mamário;
3. No histopatológico, a marcação multifocal nas células para a p28 é indicativo da
presença do vírus no tecido mamário.
43
7.
PERSPECTIVAS
1. Maiores estudos das alterações da glândula mamária em cabras naturalmente
infectadas com CAEV, e trabalhos mais aprofundados quanto às alterações na
produção leiteira como do leite propriamente dito, tomando-se intervalo maior de
tempo e avaliando em diferentes estágios da doença;
2. Existências de mais pesquisas voltadas a estudar o leite dentro da cadeia de
transmissão da CAE;
3. Conduzir a maiores práticas de controle e prevenção, como também trabalhar
políticas educativas dentro das propriedades visando maior entendimento sobre a
enfermidade.
44
8.
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