Estudo de genes da família MtN3/saliva expressos no pistilo de
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56º Congresso Brasileiro de Genética Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010 Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2 274 Estudo de genes da família MtN3/saliva expressos no pistilo de Nicotiana tabacum L Amorim, MFA1,2; Del Bem, LEV3; Quiapim, AC2; Brito, MS2; daSilva, LLP4; Goldman, GH5; Goldman, MHS2 Depto de Genética, Fac. Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP) Depto de Biologia, Fac. Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP 3 Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – UNICAMP 4 Depto de Biol. Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Fac. Medicina de Ribeirão Preto – USP 5 Depto de Ciências Farmacêuticas, Fac. Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP [email protected] 1 2 Palavras-chave: MtN3, pistilo, Nicotiana tabacum, reprodução. O pistilo (estigma/estilete e ovário) tem importância central na reprodução de plantas e genes expressos exclusiva/ preferencialmente nesse órgão podem estar associados à função reprodutiva. Análise por macroarray, com clones de uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de Nicotiana tabacum (TOBEST), revelou o contig TOBC23B06. Experimentos de RT-PCR em tempo real, com RNAs de raiz, caule, folha, sépala, pétala, estame, estigma/estilete e ovário, confirmaram uma expressão exclusiva no estigma/estilete. Experimentos adicionais mostraram que a expressão ocorre nos últimos estádios do desenvolvimento floral, próximos à antese. Seqüenciamento do cDNA 23B06 e a análise pelo Blast mostraram que a proteína codificada tem similaridade com proteínas MtN3/saliva. Algumas proteínas MtN3 já descritas (RPG-1, Os8N3 e NEC1) estão envolvidas na reprodução, mostrandose importantes para o desenvolvimento do pólen, deiscência da antera e desenvolvimento da inflorescência. Entretanto, pouco se conhece sobre como atuam as MtN3. Uma busca por MtN3s na biblioteca do TOBEST evidenciou a existência de 6 contigs/genes adicionais. Uma busca (Blast) nos genomas já seqüenciados de Arabidopsis thaliana e Populus trichocarpa revelou as sequências de maior similaridade, nestas espécies, às MtN3 do pistilo, cujas proteínas foram alinhadas pelo MAFFT. Uma árvore filogenética foi construída pelo PhyML3(aLTR), o que permitiu determinar 5 possíveis grupos de ortólogos nessas três espécies. Também foi possível definir genes homeólogos em N. tabacum: TOBC023B06 e TOBC047C06; e TOBC48E05 e TOBC17D07. Os 6 genes de Arabidopsis, revelados como ortólogos das MtN3 do pistilo de N. tabacum, possuem expressões elevadas em estruturas relacionadas à reprodução: estames, pólen, pistilo e sementes/embrião, como verificado nos dados de microarray disponíveis em Bio-Array Resource. Em Populus, foi possível encontrar os dados de alguns ortólogos, os quais revelaram elevadas expressões em inflorescências. Para entender o papel que as MtN3 desempenham no pistilo, o cDNA 023B06 foi usado para a construção de genes quiméricos, os quais foram introduzidos em N. tabacum via Agrobacterium. Foram obtidas 16 plantas transgênicas independentes de superexpressão e 19 de silenciamento (RNAi), as quais serão analisadas quanto ao fenótipo. Análises in silico indicam que a proteína 023B06 é localizada em membrana, possuindo 7 porções hidrofóbicas intramembranares e uma porção C-terminal intracelular. Experimentos iniciais de expressão transiente, com a fusão prom35S::023B06-GFP em folhas e protoplastos, sugerem uma localização subcelular em vesículas. Uma busca no banco de sequências de Solanaceae revelou uma sequência genômica parcial do gene TOBC023B06. A análise do promotor pelo PlantCARE evidenciou a presença de elementos cis-regulatórios envolvidos na resposta ao ABA e expressão no endosperma. Esses mesmos elementos foram encontrados no promotor do seu ortólogo At5g13170, que apresenta expressão elevada em sementes e responde ao tratamento com ABA. O padrão de expressão de TOBC023B06 e dos ortólogos das MtN3 do pistilo de N. tabacum evidencia a importância dessas proteínas em estruturas reprodutivas. Apoio financeiro: FAPESP, CAPES e CNPq.
