alessandra oliveira barreto
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ALESSANDRA OLIVEIRA BARRETO EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A REABSORÇÃO ÓSSEA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE PALATO DURO E LÍNGUA NATAL-RN 2013 ALESSANDRA OLIVEIRA BARRETO EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A REABSORÇÃO ÓSSEA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE PALATO DURO E LÍNGUA NATAL-RN 2013 ALESSANDRA OLIVEIRA BARRETO EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A REABSORÇÃO ÓSSEA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE PALATO DURO E LÍNGUA Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Departamento Patologia de Oral do Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Doutora em Patologia Oral. Orientador: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa. NATAL/RN 2013 DEDICATÓRIA Dedico esta conquista. . . Aos meus queridos pais, Gilvan e Fabíola por tornar possível a realização de mais uma etapa da minha vida. Sempre acreditando e respeitando minhas decisões. A Marcus, pelo amor, incentivo e confiança em mim depositada. Além da enorme paciência. Aos meus irmãos, cunhadas e sobrinhas, por tonarem essa jornada bem mais descontraída. E a Bernardo, minha mais bela razão de e existir. AMO MUITO VOCÊS ! AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS A Deus, pelas bênçãos concedidas durante todas as fases da minha vida. Ao meu orientador Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, pela dedicação e ensinamentos proporcionados durante esses anos de tão agradável convívio. O meu muito obrigado pela sua contribuição na minha formação acadêmica. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral. À Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, pela atenção, amizade, ensinamentos e carinho a mim dispensados. À Profa. Dra Éricka Janine Dantas da Silveira, pelas enormes contribuições e disponibilidade oferecidas durante a realização desta pesquisa. Além dos sábios conselhos e experiências valiosas trocadas sobre a nossa segunda profissão: ser mãe! À Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, exemplo de dedicação e amor à profissão acadêmica. Agradeço pelos ensinamentos transmitidos. À Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas, pelo grande estimulo que desperta para a carreira cientifica. Às Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel pelas contribuições a esta pesquisa, pelos ensinamentos e amizade. Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, pela gentiliza e alegria com que trata seus alunos e colegas de trabalho. Ao Dr. Leão Pereira Pinto exemplo de mestre, obrigada pelos ensinamentos. À Profa. Dra. Ana Myriam Costa de Medeiros, pela simplicidade e amizade. Minha profunda admiração e respeito a todos. Às minhas amigas de turma, Águida e Ana Rafaela. Eu não poderia ter companheiras melhores do que vocês. Águida, faço das suas palavras a minha: ” você tem um lugar enorme no meu coração, gosto de você de graça”. E Rafa não tenho palavras para agradecer todo carinho e atenção dedicada a mim durante esses vários anos de convivência. Além das enormes contribuições para essa pesquisa, mesmo sem tempo. Muito obrigado por tudo . . . Sou muito feliz por ter vocês duas ao meu lado. À Cynthia, Keila, Joabe e Pedro pela disponibilidade nos momentos necessários e a amizade verdadeira. A Roseane pela enorme ajuda e disponibilidade para que eu finalizasse esta pesquisa. Obrigada pela amizade de vocês. Aos doutorandos: Emeline, Maiara, Felipe, Adriana, Fernando, Denise, Bárbara, Clarissa, Ana Luiza, Natália, Emília, Stefânia, Nazareno, Cida e Rodrigo. Aos já doutores Bruna Amaral, Bruna Rafaela, Marcelo, Débora Pitta, e Valéria. Pelos momentos especiais de convívio e amizade compartilhada. Ao aluno de Iniciação Científica, Gurgiane e Felipe pela ajuda e prontidão com que realizou a coleta de alguns casos. Aos funcionários Idel, Gracinha, Lourdinha, Sandrinha, Canindé, Hévil e Ricardo. Pela disponibilidade e amizade de vocês. Aos familiares e amigos que de uma forma direta ou indireta contribuíram para a finalização desta etapa. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho. RESUMO RESUMO O carcinoma epidermóide oral (CEO) apresenta uma tendência marcante de invadir o osso quando localizado em palato duro e rebordo. O mecanismo preciso desta invasão permanece incompletamente descrito, apesar de sugerirem na literatura que a destruição óssea, invasão e metástase seja mediada por osteoclastos e não diretamente por células do carcinoma. As moléculas RANK/RANKL /OPG são fundamentais na oesteoclastogênese, assim como a IL-6 que regula suas expressões. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a expressão imuno-histoquímica de fatores de reabsorção óssea (RANKL e OPG) e da citocina (IL-6) no carcinoma epidermóide de palato duro (com invasão óssea) e língua (sem invasão óssea), correlacionandoas com os parâmetros clinicopatológicos e prognósticos. A amostra foi constituída por 30 carcinomas epidermóides com invasão óssea (localizados no palato) e 31 sem invasão óssea (localizados na língua). Foram avaliados a intensidade e a média das células tumorais, estromais e inflamatórias imunomarcadas para os anticorpos anti-RANKL, anti-OPG e anti-IL-6, no front de invasão e no centro tumoral. O escore (s) da imunorreatividade das células foi estabelecido através da multiplicação do percentual de células positivas (P) pelo valor da intensidade da marcação (I) (S = P x I), em cinco campos (400×). A análise da expressão da proteína RANKL foi significativamente mais expressa (p=0,002) nas células inflamatórias, com tendência há uma maior expressão nas células dos carcinomas epidermóides do palato duro. Entre os parâmetros clinicopatológicos foi observado associação do RANKL com o pior prognóstico, com significância estatística apenas para o estágio avançado do tumor (p= 0,033). A OPG demonstrou fraca expressão tanto nos casos de língua (0,77 ±1,85) quanto de palato duro (1,32 ± 2,48), com ausência de significância estatística (p>0,05). Em relação aos parâmetros clinicopatológicos a OPG apresentou tendência de associação com o pior prognóstico, com associação estatística significante para o óbito (p=0,048) e invasão perivascular (p=0,047). A IL-6 foi significantemente mais expressa (p<0,001) em células tumorais e inflamatórias nos carcinomas epidermóides de palato duro. E dentre os parâmetros clinicopatológicos, a IL-6 apresentou tendência de associação com o bom prognóstico, com diferença estatística para a ausência de metástase e as células tumorais (p = 0,020), estromais (p = 0,027) e inflamatórias (p = 0,017). Com base nos resultados pode-se concluir que a IL-6 pode ser utilizada como um marcador do carcinoma epidermóide oral com invasão óssea, e que a relação RANKL/OPG está alterada no carcinoma epidermóide oral. Palavras-chave: Carcinoma epidermóide; invasão óssea; RANK/RNKL/OPG; IL-6; Imuno-histoquímica. ABSTRAT ABSTRAT Oral squamous cell carcinoma (CEO ) has a marked tendency to invade the bone when located in the palate and lip . The precise mechanism of this invasion is still not completely described , although the literature suggests that the bone destruction , invasion and metastasis is mediated by osteoclasts and not directly by carcinoma cells . The molecules RANK / RANKL / OPG are fundamental in oesteoclastogênese, and IL-6 that regulates its expression. The objective of this research was to evaluate the immunohistochemical expression of factors of bone resorption ( RANKL and OPG ) and cytokine ( IL - 6 ) in squamous cell carcinoma of the hard palate (with bone invasion ) and tongue (without bone invasion ) , correlating with the clinicopathological parameters and prognosis. The sample consisted of 30 squamous cell carcinoma with bone invasion (located on the palate) and 31 without bone invasion (located on the tongue). Were evaluated and the average intensity of the tumor cells , stromal and inflammatory immunostained for anti-RANKL antibodies , anti- OPG and anti -IL- 6 at the invasive front and center of the tumor. The score (s) of the immunoreactivity of cells was established by multiplying the percentage of positive cells (P) for marking intensity value (I) (S = P x I) in five fields (× 400). The analysis of the expression of RANKL protein was expressed significantly higher (p = 0.002) in inflammatory cells, there is a trend to higher expression in squamous cell carcinomas of the hard palate. Among the clinicopathologic parameters was observed association of RANKL with the worst prognosis, with statistical significance only for the advanced stage of the tumor (p = 0.033). The OPG showed weak expression both in cases of tongue (0.77 ± 1.85) and hard palate (1.32 ± 2.48), with no statistical significance (p > .05). In relation to clinicopathological parameters OPG tended association with worse prognosis, with a statistically significant association for death (p = 0.048) and perivascular invasion (p = 0.047). IL- 6 was expressed significantly more (p < 0.001) in tumor and inflammatory cells in squamous cell carcinoma of the hard palate. In addition, among the clinicopathologic parameters, IL- 6 showed a tendency of association with good prognosis, with a statistical difference for the absence of metastasis and tumor cells (p = 0.020), stromal (p = 0.027) and inflammatory (p = 0.017). Based on the results it can be concluded that IL -6 may be used as a marker of oral squamous cell carcinoma with bone invasion, and the ratio RANKL / OPG is changed in oral squamous cell carcinoma. Keywords: Squamous cell carcinoma, bone invasion; RANK / RNKL / OPG, IL-6; Immunohistochemistry LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE ILUSTRAÇÕES Página Quadro 1. Sistema de estadiamento clínico do (TNM) para o carcinoma epidermóide oral, preconizado por SOBIN, WITTEKIND, 72 2002.............................................................................. Quadro 2:. Categorias de Estadiamento clínico (TNM) para o carcinoma epidermóide oral, preconizado por SOBIN, WITTEKIND 74 (2002)............................................................................. Quadro 3. Sistema de gradação histológica de malignidade no “front” de invasão (Bryne, 1998) proposto por Bryne et al. (1992)............ 75 Quadro 4. Especificidade, recuperação antigênica, diluição, tempo de incubação e fabricante dos anticorpos primários utilizados no 78 estudo..................................................................................... Quadro 5. Variável dependente que será analisada estudo................................................................................. no 80 Quadro 6. Elenco de variáveis independentes associadas às proteínas 81 analisadas no estudo...................................................... Quadro 7. Elenco de variáveis independentes gerais.................................. Figura 1. 82 Regulação da osteoclastogênese........................................ 42 Figura 2 Mecanismo de ação do RANKL expresso por vários tipos celulares e a indução da osteoclastogênese através da sua 45 ligação com o RANK nos precursores osteoclásticos. .......... Figura 3 Abundância de OPG em relação ao RANKL, inibindo a ligação do RANKL ao RANK, resultando em redução da osteoclastogênese e promoção da apoptose de osteoclastos 45 existentes.......................................................................... Figura 4. Carcinoma epidermóidede língua de alto grau de malignidade. (H/E, 100×)................................................................. 101 Figura 5. Carcinoma epidermóide de Palato duro de alto grau de malignidade. (H/E, 400×)............................................... 101 Figura 6. Fotomicrografia demonstrando moderada marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti- RANKL, no carcinoma epidermóide de língua. Marcação 102 predominante citoplasmática. (ADVANCETM, 200×)............... Figura 7. Fotomicrografia demonstrando intensa marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo antiRANKL, no carcinoma epidermóide de palato duro. Marcação predominante citoplasmática. (ADVANCETM, 200×)........................................................................... 102 Figura 8. Fotomicrografia demonstrando ausência de marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo antiOPG no carcinoma epidermóide de língua. . (ADVANCETM, 103 400×).................................................... Figura 9. Fotomicrografia demonstrando fraca marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-OPG no carcinoma epidermóide de palato duro. (ADVANCETM, 200×)......................................................................... 103 Figura 10. Fotomicrografia demonstrando fraca marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-IL-6 no carcinoma epidermóide de língua. . (ADVANCETM, 400×)......................................................................... 104 Figura 11. Fotomicrografia demonstrando intensa marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-IL-6, no carcinoma epidermóide de palato duro. Marcação 104 citoplasmática e nuclear. (ADVANCETM, 200×)................... LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. Associação entre a localização da lesão e o sexo dos 85 pacientes...................................................................... Tabela 2 Associação entre a localização da lesão e a ausência ou 86 presença de metástase........................................................... Tabela 3. Associação entre o estágio clínico, local da lesão e o desfecho 87 da doença....................................................................... Tabela 4. Associação entre a gradação histológica de malignidade e a 88 localização da lesão........................................................ Tabela 5. Associação entre a gradação histológica de malignidade, a ausência ou presença de invasão vascular / perineural, o desfecho clínico da doença, a ausência ou presença de 89 metástase e o estadiamento clínico.................................... Tabela 6. Associação entre a localização da lesão e a intensidade da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6............................ 90 Tabela 7. Parâmetros observados de acordo com os escores da 91 imunoexpressão do RANKL............................................. Tabela 8. Parâmetros observados de acordo com os escores da 91 imunoexpressão do OPG. Natal........................................... Tabela 9. Parâmetros observados de acordo com os escores da 92 imunoexpressão da IL-6................................................... Tabela 10. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo com o 93 estadiamento clínico das lesões.......................................... Tabela 11. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo com a ausência ou presença de metástase............................................ 95 Tabela 12. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo o desfecho 97 da doença......................................................... Tabela 13. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo a gradação 98 histológica de malignidade...................................... Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo a ausência 100 ou presença de invasão vascular / perineural.............. Tabela 14. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS CEO Carcinoma epidermóide oral RANK Do inglês receptor activator of nuclear factor κB, traduzido como receptor ativador do fator nuclear κB RANKL Do inglês receptor activator of nuclear factor κB ligand, traduzido como ligante do receptor ativador do fator nuclear κB. OPG Do inglês osteoprotegerin, traduzido como osteoprotegerina TNF Do inglês tumor necrosis factor, traduzido como fator de necrose tumoral NF-kB Do inglês nuclear factor κB, traduzido como fator nuclear κB. IL Interleucina PTHrP Do inglês parathyroid hormone related protein traduzido como proteína relacionadas ao hormônio da paratireóide M-CSF Do inglês granulocyte-macrophage colony-stimulating fator traduzido como fator estimulador de colônia de granulócito macrófago OMS Organização mundial de saúde HPV Do inglês, human papiloma virus, traduzido como vírus do papiloma humano. SGHM) Sistemas de gradação histológica de malignidade TNF-α Do inglês tumor necrosis factor-α, traduzido como fator de necrose tumoral-α. NF-kβ Do inglês nuclear factor κB, traduzido como fator nuclear κB. TGF-β Do inglês transforming growth factor-β, traduzido como fator transformador de crescimento-β. IGF Do inglês insulin-like growth factor, traduzido como fator de crescimento semelhante à insulina. TRAF Do inglês TNF receptor-associated factor, traduzido como fator associado ao receptor do fator de necrose tumoral ELISA Do inglês, enzyme-linked immunoabsorbent assay, referente ao teste enzimático ELISA. RT-PCR Do inglês, reverse transcription polymerase chain reaction, traduzido como reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase. TNM Do inglês, tumor-node-metastasis, traduzido como tamanho do tumor, envolvimento do linfonodo regional e envolvimento por metástases à distância. UV Ultravioleta. SUMÁRIO SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO..................................................................................... 26 2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................... 29 2.1 CARCINOOMA EPIDERMÓIDE ORAL............................................... 29 2.1.1 Considerações epidemiológicas e etiológicas........................................ 29 Carcinoma Epidermóide Oral-Considerações clínicopatológicas..... 31 2.2. REMODELAÇÃO ÓSSEA....................................................................... 35 2.2.1 Remodelação Óssea – Considerações gerais......................................... 35 Remodelação Óssea – Sistema RANK / RANKL / OPG...................... 38 . 2.1.2 . . 2.2.2 . 2.2.3 Expressão do RANK / RANK-L / OPG no câncer................................ 46 . 2.3 PARTICIPAÇÃO DA IL-6 NA REABSORÇÃO ÓSSEA....................... 54 2.4 ESTUDOS ASSOCIANDO RANK / RANK-L / OPG e IL-6.................. 63 3. PROPOSIÇÃO......................................................................................... 66 4. MATERIAIS E METÒDOS................................................................... 68 4.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS................................................................... 68 4.2. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO....................................................... 68 4.3 POPULAÇÃO.................................................................. 68 4.4. AMOSTRA............................................................................................... 69 4.4.1 Critérios de Inclusão................................................................................ 69 . 4.4.2 Critérios de Exclusão............................................................................... 69 . 4.5. OBTENÇÃO DOS DADOS CLÍNICOS E EPIDEMIOLÓGICOS........ 70 4.5.1 Sistema de Estadiamento Clínico (TNM)............................................. 70 4.6. ESTUDO MORFOLÓGICO.................................................................... 73 4.7. ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO.................................................. 75 4.7.1 Método imuno-histoquímico................................................................ 75 Análise imuno-histoquímica............................................................... 78 4.8 CALIBRAÇÃO INTER-EXAMINADOR............................................. 79 4.9. ELENCO DE VARIÁVEIS.................................................................... 79 4.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA....................................................................... 82 5. RESULTADOS..................................................................................... 84 5.1. PERFIL DA AMOSTRA........................................................................ 84 5.2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS............................................ 86 5.3. RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS............................................ 88 6. DISCUSSÃO........................................................................................ 108 7. CONCLUSÃO....................................................................................... 131 REFERÊNCIAS........................................................................................ 133 APÊNDICES............................................................................................. 159 . 4.7.2 . . INTRODUÇÃO 1. INTRODUÇÃO O carcinoma epidermóide oral (CEO) é a neoplasia maligna mais comum da cabeça e pescoço, e uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, sendo diagnósticados em média 275 000 novos casos (JEMAL et al., 2006). Apesar dos avanços na detecção e diagnóstico precoce, a sobrevida em 5 anos para pacientes com esta doença manteve-se em 50% nos últimos 30 anos (SHINRIKI et al., 2012). Este câncer pode originar-se em qualquer parte da cavidade oral, como língua, lábio, assoalho bucal, mucosa jugal, gengiva e palato, sendo que as localizações anatômicas mais acometidas variam geograficamente, refletindo a exposição a diferentes fatores de risco de acordo com a população estudada (SCULLY e BAGAN, 2009; JOHNSON et al., 2010). Esta neoplasia apresenta comportamento agressivo e uma tendência à invassão óssea, sendo caracterizada por alto grau de invasividade local e potencial metastático. A invasão do CEO em ossos maxilar e mandibular é um problema clínico comum (TANG et al., 2008), que geralmente requer ressecção cirúrgica, levando ao comprometimento na função dos maxilares (CHUANG et al., 2009) e um pior prognóstico (ISHIKURO et al., 2008). Embora tenha havido alguns avanços nas pesquisas, o mecanismo preciso pelo qual o CEO invade o osso permanece incompletamente descrito. Acredita-se que o processo de invasão óssea ocorra por interações entre tumor-hospedeiro, por extensão direta. Apesar de algumas controvérsias que ainda existem, alguns estudos sugerem que a destruição óssea, invasão e metástase do CEO são mediadas por osteoclastos e não diretamente por células do carcinoma (TANG et al., 2008). Os osteoclastos são células multinucleadas responsáveis pela reabsorção óssea, que podem ser encontrados com mais facilidade no osso invadido por células malignas (CHUANG et al., 2009). A osteoclastogênese é regulada por um complexo sistema de sinalização que envolve três moléculas essenciais da família do fator de necrose tumoral (TNF), o ativador do receptor NF-kB (RANK), o ligante RANK (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) (ISHIKURO et al., 2008). As interações entre RANKL e RANK induzem a diferenciação dos pré-osteoclastos em osteoclastos, causando reabsorção óssea. No entanto a OPG, um receptor chamariz para RANKL, que compete com o RANK, protege contra a destruição óssea. A Osteoclastogênese é, portanto, modulada por um equilíbrio entre OPG e RANKL (CHUANG et al., 2009), sendo este equilíbrio fundamental para a regulação da diferenciação e função dos osteoclastos (ISHIKURO et al., 2008). Para explorar os fatores que contribuem para à reabsorção óssea causada pelo câncer, vários grupos de pesquisa, “in vitro” e em animais, têm investigado a expressão de moléculas liberadas por células tumorais que regulam a expressão do RANKL e OPG, como a: interleucina (IL)-1b, IL-6, IL-8 (YUVARAJ et al., 2009), fator de necrose tumoral- α, e proteína relacionadas ao hormônio da paratireóide (PTHrP), a calcitonina e estrogênio, em CEO humanos (TADA et al., 2009). Dentre estas, a IL-6 é uma citocina importante que estimula a reabsorção óssea mediada por osteoclastos por induzir a expressão de RANKL nas células osteoblásticas. Apesar disto, tem se investigado extensivamente seu papel na formação de osteoclastos associados ao CEO (KAYAMORI et al., 2010). Diante destes estudos enfatizando a importância do RANKL, OPG e IL-6 na osteoclastogênese, esta pesquisa visa comparar a expressão do RANKL, OPG, e IL-6, através da técnica imuno-histoquímica, em CEO de palato duro e língua e correlacionalas com parâmetros clinicopatológicos. Na tentativa de avaliar o papel desses marcadores e sua a associação com a reabsorção óssea. REVISÃO DA LITERATURA 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL 2.1.1. Considerações epidemiológicas e etiologicas No Brasil, excluindo-se o câncer de pele, o câncer oral e de faringe representam o quinto em incidência de câncer entre os homens e o sexto entre as mulheres. E segundo dados do INCA (2012), as estimativas deste tipo de neoplasia para este ano, correspondem a 14.170 novos casos no total geral, sendo 9.990 destes em homens e 4.180 em mulheres. Para estado do Rio Grande do Norte foram previstos 190 casos, sendo 55 destes casos na capital, a incidência prevista é de 5 a 7% de todas as neoplasias malignas. O carcinoma epidermóide oral, também denominado de carcinoma de células escamosas ou carcinoma espinocelular, representa mais de 90% de todos os tumores malignos que acometem as estruturas orais e inclui os cânceres de lábio e de cavidade oral - mucosa jugal, gengivas, palato duro, língua e assoalho de boca (JOHNSON et al., 2005; MAROCCHIO et al., 2010; MARTIN et Al.; 2012). Conforme definição da Organização Mundial de Saúde (OMS), o carcinoma epidermóide oral se caracteriza por uma neoplasia epitelial invasiva com variados graus de diferenciação escamosa e uma propensão a metástases linfonodais precoces (JOHNSON et al., 2005). Dentre os cânceres, o CEO acorre principalmente em comunidades de baixa renda e pessoas mais velhas, sendo 90% acima de 45 anos de idade (IARC, 2003). E acomete duas vezes mais homens que mulheres, na maioria países, fato este que pode ser justificado pelos homens tenderem a serem mais usuários de tabaco e álcool (MUIR E WEILAND, 1995; OTOH et al., 2005). Os fatores de risco envolvidos na etiologia do carcinoma epidermóide oral podem ser divididos em fatores extrínsecos e intrínsecos. Os fatores extrínsecos são o tabaco, álcool, vírus e a radiação ultravioleta (UV), principalmente para os carcinomas de lábio inferior. Já os fatores intrínsecos incluem alterações genéticas, hábitos alimentares, estado imunológico e saúde oral geral (McDOWELL, 2006; AMTHA et al., 2009; BAGAN; SCULLY, 2009). Contudo, para o seu desenvolvimento, se faz necessária uma associação destes fatores, tendo em vista ser o carcinoma epidermóide oral uma doença de etiologia multifatorial (CURADO; HASHIBE, 2009; SCULLY; BAGAN, 2009). Estudos epidemiológicos associando a exposição a fatores de risco e o CEO evidenciam uma maior prevalência destes tumores em homens entre a sexta e sétima décadas de vida, por ser este grupo mais exposto, com o passar dos anos, aos fatores de risco (MOORE et al., 2000; NEVILLE et al., 2009). Porém, estudos recentes têm apresentado resultados diferentes em relação à frequência de câncer oral. Uma diminuição na incidência de carcinoma epidermóide oral em homens e um aumento entre as mulheres e grupos jovens têm sido observados (DAHLSTROM et al., 2008, MAROCCHIO et al., 2010). Este fato pode ser atribuído às mudanças nos hábitos das mulheres como o consumo de álcool e tabaco, aumento na expectativa de vida e aumento de infecção pelo HPV (DURAZZO 2005, PAPAGEORGE 2007, CURADO, HASHIBE, 2009, PATEL 2011). Com relação aos sítios anatômicos, esta neoplasia acomete principalmente língua e lábios, podendo acorrer em outras localizações como assoalho, mucosa jugal, gengiva e palato (KERDPON, SRIPLUNG, 2001). No entanto, os sítios anatômicos mais acometidos variam geograficamente, refletindo a exposição a diferentes fatores de risco de acordo com a população estudada (SASAKI et al., 2005; CHOI et al., 2006; JOHNSON et al., 2010). Como destacaram Scully e Bagan (2009), houve mudança nos padrões tanto do câncer de lábio inferior como do intra-oral, pois ocorreu uma diminuição na incidência do câncer de lábio no gênero masculino, nos últimos 30 anos. Assim como, a língua tem sido o principal sítio de acometimento na Inglaterra, Estados Unidos e Coréia, provavelmente pelo consumo associado de tabaco e álcool (OLIVER; HELFRICK; GARD, 1996;). E na Ásia, a mucosa jugal é a localização mais comum, devido ao hábito de mascar betel (FRITZ et al., 2000; IAMAROON et al., 2004). Já em países tropicais como Austrália e Brasil, a alta incidência de carcinoma epidermóide de lábio inferior se deve principalmente à intensa exposição solar a que essa população está submetida (COSTA et al., 2002 2.1.2. Considerações clínicopatológicas O carcinoma epidermóide oral possui apresentação clínica variável, incluindo as formas leucoplásica, eritroplásica, eritroleucoplásica e úlceras nos padrões de crescimento exofítico e endofítico. No estágio inicial apresenta-se como uma mácula ou placa eritematosa ou leucoplásia bem delimitada. Com o passar do tempo essas placas tornam-se espessas com fissuras mais profundas, numerosas e desenvolvem irregularidades maiores na superfície. (CAMPISI et al., 2006; MCDOWELL, 2006; NEVILLE et al., 2009). Histologicamente, o carcinoma epidermóide oral caracteriza-se como uma proliferação de células epiteliais malignas que invadem o tecido conjuntivo, dispostas isoladamente ou em grupos celulares, podendo formar cordões, ninhos e lençóis por vezes crescendo como entidades independentes dentro do conjuntivo. As células neoplásicas exibem hipercromatismo, pleomorfismo nuclear e celular, aumento do número de figuras de mitose, típicas ou atípicas (JONHSON et al., 2005; NEVILLE et al., 2009; BATISTA et al., 2010). A agressividade desses tumores, de acordo com os estudos, está relacionada com diferentes fatores, incluindo tamanho e localização anatômica do tumor, grau histológico, nível de envolvimento dos tecidos vizinhos e presença de metástase no momento do diagnóstico (KADEMANI et al., 2005; MASSANO et al., 2006; SILVEIRA et al., 2007). Logo, a padronização de dados que possibilitem a classificação dos tumores de uma determinada localização anatômica e norteiem a conduta terapêutica para as diferentes apresentações dos cânceres em geral, são de grande valia para a seleção e avaliação do tratamento, bem como estabelecimento do prognóstico dos tumores. O sistema de estadiamento clínico de tumores (TNM) tem sido o padrão de classificação adotado para caracterizá-los e propor a terapia mais adequada, assim como, estimar a sobrevida dos pacientes (LOURENÇO et al., 2007). Este sistema foi desenvolvido por Pierre Denoix na França, entre os anos de 1943 e 1952 e, atualmente, encontra-se em sua sexta edição (KREPPEL, 2010). Este sistema está baseado na avaliação de três componentes para descrever a extensão anatômica da doença: T extensão do tumor primário; N - ausência ou presença e a extensão de metástase em linfonodos regionais e M - ausência ou presença de metástase à distância. A adição de números a estes três componentes indica a extensão da doença maligna. Assim temos: T0, T1, T2, T3, T4 | N0, N1, N2, N3 | M0, M1. Após definir as categorias T, N e M, elas podem ser agrupadas em estádios (SOBIN; WITTEKIND, 2002; WITTEKIND et al., 2002). Para o carcinoma epidermóide oral, o grupamento por estádios inclui os níveis I, II, III, IVa, IVb e IVc. Os estádios I e II são considerados de melhor prognóstico em comparação aos estádios III e IV que representam a doença avançada (AMAR et al., 2003). De acordo com Warnakulasuriya (2009), o carcinoma epidermóide oral permanece como uma doença letal em mais de 50% dos casos diagnosticados anualmente, principalmente pelo fato destes estarem em estadiamentos avançados no momento da detecção. Fato este que é demonstrado em estudos que relatam uma preocupante falta de conscientização sobre o câncer oral, em relação aos seus sintomas e causas e estas lacunas no conhecimento precisam ser abordados, principalmente nos grupos de alto risco (CHEN et al., 2010). O pobre prognóstico reflete uma compreensão limitada dos mecanismos de invasão local e regional e metástase presente numa porção significativa dos pacientes, em conjunto com uma resposta insatisfatória à terapia sistêmica convencional em diferentes estágios da doença (HADDAD et al., 2008; BERNIER et al., 2009) No entanto, existem casos diagnosticados em estádios iniciais, tratados corretamente, e que, contudo, evoluem rapidamente ao óbito, não condizendo com a indicação clínica do TNM. Diante destes fatos, suscitou a instituição de outros fatores prognósticos para suplementar o sistema (LOURENÇO et al., 2007; COSTA; ARAÚJO; RAMOS, 2005). Assim, os sistemas de gradação histológica de malignidade (SGHM) para o carcinoma epidermóide oral surgiram com o intuito de fornecer conhecimentos adicionais que pudessem explicar o comportamento biológico discrepante de tumores com características clínicas semelhantes (LOURENÇO et al., 2007). Esse conjunto de informações contribuiria para uma melhor previsibilidade do prognóstico e sobrevida dos pacientes, através do delineamento do tratamento adequado para cada caso (ANNEROTH; BATSAKIS; LUNA, 1987). E para Bryne (1998), as características morfológicas e moleculares na área do front de invasão do carcinoma epidérmoide oral, podem refletir melhor o prognóstico destes tumores, já que vários eventos moleculares importantes ocorrem na interface tumor-hospedeiro, citando-se aumento da proliferação celular, perdas e ganhos de moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas e angiogênese. Jimi et al. (2011) ao revisar os mecanismos moleculares e celulares de invasão óssea pelo carcinoma epidermóide oral observaram que o padrão histológico de invasão da mandíbula parecem correlacionar-se com o comportamento clínico. Entatizando que, as lesões infiltrativas são mais propensas a ter recorrência primária, regional e distante. E tem sido sugerido que o padrão erosivo no carcinoma epidermóide oral se estende de um modo mais previsível e podem ser tratados com mandibulectomias marginais, em vez de ressecção segmentar. Portanto, a identificação dos padrões histológicos distintos levantou a possibilidade de que cada padrão pode apresentar um comportamento diferente. Isihikuro et al. (2008) investigaram o padrão histológico de invasão óssea mandibular de 97 casos de carcinoma epidermoide oral da gengiva, sendo 52 casos com padrão errosivo de invasão óssea e 45 casos com padrão infiltrativo, na tentativa de encontrar correlação com os fatores clinicos (TNM) e histológicos (grau de diferenciação, fibroblastos, células inflamatórias e osteoclastos). Os resultados não demostraram correlação significativa entre o padrão de invasão óssea e os fatores clínicos, embora 89% dos casos com padrão de invasão errosiva tinham menos de 4 cm (T1 e T2) e 40% dos cados com padrão infiltrativo tinham mais de 4cm (T3 e T4), sugerindo que o padrão de invasão erosivo e infiltrativo representam fases diferentes do desenvolvimento do tumor. Na análise histológica foi encontrada correlação significativa apenas entre o padrão infiltrativo de invasão óssea e o elvado número de osteoclástos e fibroblastos na interface tumor-osso, sugerindo que a destruição óssea, pelo carcinoma epidermóide oral, com padrão de invasão infiltrativo é mais agressivo devido ao elevado número de osteoclastos. Isihikuro et al. (2008) destacam ainda, que a importante descobertas deste estudo histopatológico foi que as células tumorais não exibiram nenhum contato direto com os osteoclastos e osso adjacente, e que o estroma fibroso estava presente em todos os casos, entre as células tumorais e a reabsorção óssea. Concluíram, portanto que o contato direto das células tumorais com os osteoclastos ou superfície óssea não é necessária para promover reabsorção óssea osteoclástica no local da invasão tumoral, assim como, o estroma fibroso está envolvido na reabsorção óssea osteoclástica. Com relação a sobrevida, a pesquisa de Wong et al. (2000) obseraram que a porcentagem de pacientes livres da doença, três anos após o tratamento de carcinoma epidermoide oral, com padrão de invasão óssea infiltrativo foi de 30%, já para o padrão erosivo a sobrevida aumentou 73%, destacando que a determinação patológica pósoperatório do padrão de invasão óssea fornece informação prognóstica importante e, portanto, devem ser rotineiramente comentado por patologistas ao analisar casos com invasão mandibular. Shibahara et al (2002) realizaram uma análise histopatológica retrospectiva de pacientes com CEO na gengiva e observaram que o tumor não invadiu a mandíbula em 60% dos pacientes, apesar da estreita proximidade da lesão à mandíbula. E na pesquisa de Totsuka et al. (1991) observaram que alguns pacientes, no entanto, mostraram evidências de infiltração agressiva das células tumorais na mandíbula. Contudo, não foi possível identificar no pré-operatório, a partir dos achados clínicos, se invasão óssea estava presente e o grau de malignidade. Os pesuisadores concluíram que há necessidade de uma análise mais acurada. Como enfatiza Totsuka et al. (1991), ao identificar que o diagnóstico radiográfico é inadequado e que o desenvolvimento de uma nova técnica de diagnóstico que permite a estimativa precisa da extensão da invasão mandibular pelo tumor é necessário. A avaliação da invasão mandibular ou maxilar pelo carcinoma epidermoide oral, através da inspeção radiografica, revela que em alguns pacientes, o tumor causa reabsorção invasiva da mandíbula, em outros, está em contato com a mandíbula, mas não demonstra progressão invasiva (TOTSUKA et al., 1999). A capacidade deste tumor de invadir o osso é um evento crítico, que pode leva à metástase, afetando o prognóstico dos pacientes (FURUTA et al., 2012). Segundo JIMI etal. (2011), o desenvolvimento de uma abordagem terapeutica para evitar o desenvolviemto do processo de invasão óssea, é fundamental, pois este processo é crítico na determinação do prognóstico. Estudos clinicopatológicos têm relatado que a reabsorção óssea por osteoclastos é um procedimento importante durante o processo de invasão dos tumores, como nos carcinomas orais. As células cancerosas invadem os tecidos circundantes, a fim de ampliar a massa tumoral pela secreção de enzimas proteolíticas. Desta maneira, a reabsorção óssea osteoclástica fornece espaço e os nutrientes necessários para o desenvolvimento de células cancerígenas no osso (WANG et al., 2004; UCHIDA, 1998). O processo de invasão consiste das interações entre tumor-hospedeiro (SEMBA et al., 1996). Embora tenha havido alguns avanços, o mecanismo preciso pelo qual o carcinoma epidermóide oral invade o osso permanece incompletamente descrito (WONG et al., 2000; BROWN et al., 2002). Entretanto acredita-se que a invasão óssea ocorra por extensão direta e não por metástase (SEMBA et al., 1996). De maneira que, apesar de algumas controvérsias que ainda existam, a destruição óssea associada à invasão é mediada por osteoclastos, e não diretamente pelas células do carcinoma (GUISE e MUNDY, 1998). Estudos recentes têm demonstrado que a reabsorção óssea por osteoclastos é um passo importante no processo de invasão ossea e metástase em vários tipos de malignidade (YUVARAJ et al., 2009), indicando que um entendimento completo do regulamento de osteoclastogênese por células cancerigenas é necessário para evitar a invasão das mesmas. Desta maneira, vários experimentos em animais e in vitro utilizando células cancerigenas têm mostrado que estas produzem várias citocinas, incluindo a interleucina-6 (IL-6), IL- 11, TNFa e proteína relacionadas ao hormônio da paratireóide (PTHrP). Estas citocinas regulam a expressão do receptor ativador do fator nuclear-JB ligante (NF-JB), (RANKL) e osteoprotegerina, que estão relacionadas com a osteoclastogênese (FURUTA et al., 2012). 2.2. REMODELAÇÃO ÓSSEA 2.2.1. Considerações gerais Os ossos do esqueleto humano desempenham várias funções, incluindo o suporte, a protecção dos órgãos internos, proporcionando um reservatório de cálcio e de fosfato e serve como fonte para todas as células sanguíneas. O tecido ósseo é constituído por células vivas embebidas numa matriz orgânica mineralizada. Existem dois tipos principais de células ósseas: osteoblastos (células formadoras de osso) e os osteoclastos (células de reabsorção óssea) (KARSENTY, 2003). Componentes estruturais de osso incluem osso cortical e osso trabecular. O osso cortical, também conhecido como o osso compacto representa cerca de 80% da massa óssea total, e encontra-se em grande parte nas hastes dos ossos longos e sua função principal é mecânica. O osso trabecular, também conhecido como osso esponjoso, é composto por finas placas ósseas preenchidas com medula hematopoiética, contendo gordura e vasos sanguíneos. As superfícies de osso trabecular são importantes para a remodelação óssea local (PRICE et al., 1993; BERENSON et al., 2006). A superfície externa do osso cortical é recoberta pelo periósteo, uma fina estrutura vascular com uma camada fibrosa externa composta por fibras de colagénas e fibroblastos e uma camada interna composta por células osteoprogenitoras achatadas, que podem se diferenciar em osteoblastos (NATHER et al., 2005). O endósteo, o qual reveste a superfície interna do osso, é composto de células osteoprogenitoras e uma pequena quantidade de tecido conjuntivo. Tanto o periósteo quanto o endósteo proporcionar um fornecimento contínuo de novas células osteoprogenitoras e osteoblastos para o crescimento de osso e reparo. A matriz óssea é composta tanto da matéria orgânica e de matéria inorgânica. A matéria orgânica inclui fibras de colágeno tipo I composto por feixes de fibrilas e incorporado em uma substância fundamental contendo proteoglicanos e glicoproteínas. A matéria inorgânica é um análogo de fosfato de cálcio hidroxiapatita chamado. A dureza do osso é devido à associação da hidroxiapatite com fibras de colagénio (BERENSON et al., 2006). O osso é um tecido dinâmico que permanentemente está sendo renovado como um mecanismo intrínseco de se regenera e como um meio de integrar os vários produtos químicos, hormonais e estímulos externos biomecânicos. Em nível celular, a remodelação óssea segue uma sequência de repetidos ciclos de reabsorção pelos osteoclastos, os quais derivam da linhagem de monócitos e macrófagos, seguidos pela formação óssea pelos osteoblastos, que são provenientes de células mesenquimais pluripotentes (HOFBAUER, HEUFELDER, 2001). O processo normal pelo qual os osteoblastos e osteoclastos destroem o osso e forma novo osso existente é chamado de remodelação óssea. Os ossos são continuamente remodelados como um mecanismo para manter a força óssea e integridade. A massa óssea é mantida constante através de um equilíbrio da ação de osteoclastos e osteoblastos, em um processo multifásico, que inicialmente, os osteoclastos reabsorvem a matriz óssea, e, em seguida, os osteoblastos formam matriz óssea no mesmo local (BARON, 1999; BUIJS et al., 2009). Na fase de ativação, os osteoclastos migram para um local específico do esqueleto. Na fase de reabsorção ocorre erosão por estas células (um processo chamado também osteólise). E a fase seguinte, a inversão, é caracterizada por apoptose dos osteoclastos. Finalmente, na fase de formação, novo osso é depositado por osteoblastos (KHOSLA, 2001; BERENSON et al., 2006). A remodelação óssea normal mantém o equilíbrio adequado entre a ação dos osteoclastos (células da reabsorção óssea) e osteoblastos (células formadoras de osso). Em certas condições ósseas, como nas neoplasias ósseas, incluindo metástases ósseas, ocorre alteração neste equlíbrio, promovendo a formação elevada de osteoclastos, acelerando assim a reabsorção óssea e induzir a perda óssea (BERENSON et al., 2006; COCHRAN, 2008). O estudo realizado por Epker e Frost (1965) foi um dos pioneiros a demonstrar que interações entre osteoblastos e osteoclastos seriam essenciais à remodelação óssea. Atualmente, sabe-se que o equilíbrio entre as atividades osteoclástica e osteoblástica é regulado por fatores físicos, como a estimulação mecânica e por diversos polipeptídeos, como hormônios e citocinas (BOYCE; XING, 2008; ANANDARAJAH, 2009). A reabsorção óssea pelos osteoclastos desintegra o colágeno (que é o principal componente orgânico do tecido ósseo) e libera cálcio e fatores de crescimento a partir da matriz óssea. Noventa por cento das proteínas libertadas consiste da degradação dos produtos do colágeno, enquanto os restantes 10% são das citocinas da matriz e fatores de crescimento (MANOLAGAS e JILKA, 1995). É importante ressaltar que a matriz óssea é considerada como um armazém de fatores de crescimento e citocinas. Grande quantidade de fator de crescimento transformante-b (TGF-b) e fator de crescimento de insulina (IGF) II, juntamente com o fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGE) e outras citocinas são produzidas pelas células do estroma e imunológicas e são armazenados dentro da matriz óssea mineralizada (MUNDY 1993; MANOLAGAS e JILKA 1995; AZIM et al., 2012). Embora chamados ''fatores de crescimento'', não necessariamente induzem diretamente a proliferação de células malignas, pois podem, indiretamente, promover a angiogênese e osteoclastogênese, que por sua vez iria remodelar o osso para estimular o crescimento do tumor (ROODMAN, 1999; GUISSE et al., 2006). Os osteoclastos são células especializadas derivadas da linhagem hematopoiética de macrófagos-monócitos que se aderem, e uma vez ativadas, degradam a matriz óssea (BOYLE et al., 2003; TEITELBAUM, 2007). Reabsorvem o osso através da geração de um microambiente isolado entre as células da membrana plasmática e a superfície óssea na qual a matriz mineralizada é mobilizada por um meio ácido, e a matriz orgânica é degradada pela protease lisossomal catepsina K (TEITELBAUM, 2007). A reabsorção óssea é um processo de múltiplas etapas, iniciando-se com proliferação de precursores dos osteoclastos imaturos, seguindo com a diferenciação e maturação desse tipo celular, e finalmente a degradação das matrizes orgânicas e inorgânicas do tecido ósseo (TEITELBAUM, 2000). A osteoclastogênese é regulada por uma cascata de eventos que envolvem a participação de moléculas e citocinas próinflamatórias, que apresentam um papel crucial em lesões patológicas que envolvem inflamação crônica (COCHRAN, 2008). Jimi et al. (1996) e Takahashi et al. (1998) descreveram as primeiras evidências de que contatos célula-célula seriam necessários à indução da osteoclastogênese. Nestes estudos, constatou-se que a co-cultura de osteoblastos e precursores osteoclásticos resultava na formação de osteoclastos funcionais. Entretanto, quando estas populações celulares foram separadas por uma membrana seletiva, que permitia a passagem de fatores solúveis, mas não possibilitava a passagem de células, não houve formação de osteoclastos. Com base nessas evidências, sugeriu-se que o processo de osteoclastogênese envolvia a interação de ligantes, presentes nas membranas citoplasmáticas dos osteoblastos, com receptores existentes na membrana celular dos osteoclastos. A partir destes relatos, várias pesquisas buscaram identificar fatores envolvidos na interação osteoblasto-osteoclasto. Dessa forma, entre 1997 e 1998, foram descobertas moléculas pertencentes ao grupo de receptores e ligantes relacionados ao TNF, representadas pelo RANK, RANKL e OPG, que seriam essenciais ao processo de remodelação óssea (ANDERSON et al., 1997; SIMONET et al., 1997; TSUDA et al., 1997; LACEY et al., 1998; YASUDA et al., 1998b). 2.2.2. Participação do sistema RANK / RANKL / OPG na remodelação óssea O ciclo de remodelação óssea é regulado por uma variedade de fatores locais e sistémicos. Recentes achados sobre a via RANKL/RANK/OPG têm esclarecido o envolvimento dessas proteínas como sendo moléculas chaves na regulação do metabolismo ósseo e biologia da reabsorção óssea. A formação, diferenciação e atividade dos osteoclastos são reguladas por essas três proteínas que são membros da superfamília dos ligantes e receptores do fator de necrose tumoral (TNF) (LU et al., 2006; ANDRADE et al., 2008; COCHRAN, 2008). O RANK é um receptor transmembrana (de superfície celular) do tipo 1 pertencente a superfamília de receptores do TNF que está presente em células precursoras de osteoclastos, células dendríticas, fibroblastos e células T. Estruturalmente, é um peptídeo de 616 aminoácidos, composto por proteína que apresenta um peptídeo sinalizador (28 aminoácidos), um domínio extracelular N-terminal (184 aminoácidos), um domínio transmembrana (21 aminoácidos) e um grande domínio citoplasmático C- terminal (383 aminoácidos) ( THEOLEYRE et al., 2004; KEARNS; KHOSLA; KOSTENUIK, 2008). Encontra-se expresso e produzido pelos osteoblastos ligado à membrana ou clivado na forma solúvel, e é também produzido por outros tipos celulares incluindo fibroblastos, linfócitos T e B, células dendríticas condrócitos, células endoteliais e células epiteliais de glândulas mamárias (ANDERSON et al., 1997; NAKAGAWA et al., 1998; HSU et al.,; BUCAY et al., 1998; MIN et al., 2003; SRIVASTAVA et al., 2003; THEOLEYRE et al., 2004; ANDRADE et al., 2008; LEIBBRANDT; PENNINGER, 2008). A ativação do RANK pelo RANKL é seguida por sua interação com membros da família dos receptores associados ao TNF (TRAF), ativação do NF-кB e c-Fos que estão relacionados com o processo de maturação osteoclástica (KHOSLA, 2001). Quando ativado promove a maturação dos osteoclastos pelo aumento da expressão de genes específicos (ANDRADE et al., 2008; HOFBAUER, 2006; KHOSLA, 2001; MENEZES et al., 2006; LU et al., 2006; COCHRAN, 2008). Se destaca, portanto, como uma proteína necessária e importante na osteoclastogênese, pois se liga ao RANK presente na superfície dos pré-osteoclastos e osteoclastos, estimulando a diferenciação dos progenitores osteoclastos e a ativação dos osteoclastos maduros, além de inibir a apoptose dos osteoclasto (CROTTI et al., 2003; LU et al., 2006). O RANKL é um peptídeo de 317 aminoácidos da família do TNF expresso de forma distinta como uma citocina de membrana celular ou liberado como fator solúvel por diversos tipos celulares, como linfócitos T e osteoblastos (BOYCE; XING, 2008; HOFBAUER, 2006; TYROVOLA et al., 2008). Enquanto a forma ligada à superfície celular é mais comum e expressa por vários tipos celulares, a forma secretada é limitada às células T ativadas e linhagens celulares de carcinoma de células escamosas (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001; TYROVOLA et al., 2008; WITTRANT et al., 2004). Os efeitos biológicos do RANKL são produzidos quando ele se liga ao RANK na superfície dos pré-osteoclastos resultando na fusão, diferenciação, ativação e sobrevivência de osteoclastos (ANDRADE et al., 2008; DOUGALL; CHAISSON, 2006; MENEZES et al., 2006; TYROVOLA et al., 2008). Na presença de concentrações permissivas de M-CSF, RANKL estimula a diferenciação, proliferação, fusão e ativação de células de linhagem osteoclástica, resultando no aumento de osteoclastos ativos e em reabsorção óssea (KHOSLA, 2001; Schneeweis et al., 2005; TYROVOLA et al., 2008). O RANKL é considerado um estimulador de células dendríticas, agindo e atuando como um fator de sobrevivência para células dendríticas e modulando a ativação de células T maduras. Estas atividades são associadas com a ativação do NF-κB após a ligação do RANKL ao seu receptor de membrana RANK (BAUD’HUIN et al., 2007; HOFBAUER; HEUFELDER, 2001). Experimentos in vivo com RANKL promovem a ativação de osteoclastos, ocasionando perda óssea e causando severa hipercalcemia, enquanto a deleção de RANKL resulta na ausência de osteoclastos maduros e subsequente desenvolvimento de osteopetrose. Deleção de RANK em roedores gera um fenótipo idêntico ao dos animais deficientes em RANKL. Estes achados demonstram que o RANKL é um fator próreabsortivo (BAUD’HUIN et al., 2007; HOFBAUER, 2006). Tanto o fator estimulador de colônia de granulócito-macrófago (M-CSF) quanto o RANKL são fatores hematopoiéticos essenciais para a osteoclastogênese. Enquanto MCSF é crucial nos primeiros passos da osteoclastogênese, o RANKL é crítico para a maturação e ativação dos osteoclastos (BOYLE et al., 2003). A expressão de M-CSF por osteoblastos é requerida para que as células progenitoras se diferenciem em osteoclastos; a célula sozinha é incapaz de completar este processo. M-CSF ligado à seu receptor (rMCSF ou c-Fms) funciona como um sinal primário para o desenvolvimento de osteoclastos. A completa diferenciação dos osteoclastos requer a expressão de RANKL pelas células osteoblásticas e de RANK pelos percussores osteoclásticos (Figura 1) (BOYCE; XING, 2008; KHOSLA, 2001). Figura 1. Regulação da osteoclastogênese. Fonte: Adaptado de KHOSLA, 2001. A resposta celular do RANKL depende da presença do receptor inibitório, OPG, assim como do nível de expressão do seu receptor RANK, que é primariamente expresso em células de linhagem macrofágica/monocítica, incluindo precursores osteoclásticos, células T e B, células dendríticas e fibroblastos (ANDRADE et al., 2008). RANKL ativa seu receptor específico RANK e sinaliza uma cascata de sinais que envolvem a estimulação de c-jun, NF-kB, e quinase serina/treonina (PKB/Akt) que estão relacionados com a proliferação, diferenciação e apoptose celular (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001). O maior inibidor da osteoclastogênese foi identificado simultaneamente em 19971998 pelo grupo Tsudas e companhia Amgen (BAUD’HUIN et al., 2007; BOYCE; XING, 2008; HOFBAUER; HEUFELDER, 2001). Eles nomearam respectivamente este novo regulador negativo da diferenciação osteoclástica como fator inibitório da osteoclastogênese (OCIF) ou osteoprotegerina (OPG). A OPG é um peptídeo de 380 aminoácidos que pertence a família de receptores do TNF, e em contraste com todos os outros receptores TNF necessitam de domínios citoplasmáticos e de membrana e são secretados como proteínas solúveis (KHOSLA, 2001; TYROVOLA et al., 2008). OPG é um receptor solúvel que atua como antagonista do RANKL (KHOSLA, 2001). É produzido por numerosos tipos celulares, incluindo células imunes, osteoblásticas e endoteliais. É considerado um receptor inibitório para RANKL, pois bloqueia a interação RANK/RANKL, inibindo o estágio terminal de diferenciação osteoclástica e, assim resultando numa diminuição da reabsorção óssea (BAUD’HUIN et al., 2007; HOFBAUER, 2006). Os efeitos do RANKL são contrários aos da osteoprotegerina (OPG). RANKL e OPG são regulados por vários hormônios (glicocorticóides, vitamina D, estrógeno), citocinas (fator de necrose tumoral alfa, interleucinas 1, 4, 6, 11, e 17), e vários fatores transcripcionais mesenquimais (como cbf-a, por exemplo) (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001). Estudos in vitro demostram que os efeitos da OPG incluem inibição da diferenciação, sobrevivência e fusão osteoclástica; assim como, a estimulação da apoptose de osteoclastos, reduzindo desse modo a capacidade de reabsorção óssea (HOFBAUER, 2006; KATAGIRI; TAKAHASHI, 2002; KHOSLA, 2001; TYROVOLA et al., 2008). A super-expressão da OPG em camundongos ou administração da OPG em roedores inibe a osteoclastogênese, ativação de osteoclastos e a reabsorção óssea, resultando em um fenótipo osteopetrótico. Por outro lado, a deleção da OPG foi associada com acentuada osteoclastogênese, aumento da reabsorção óssea e osteoporose massiva (HOFBAUER, 2006; KATAGIRI; TAKAHASHI, 2002; KHOSLA, 2001). O papel da OPG foi demonstrado por intermédio de experimentos com camundongos transgênicos e knock-out. Camundongos knock-out em OPG desenvolviam uma grande diminuição da densidade e do volume ósseo e sofriam de osteoporose associado com uma alta incidência de fraturas e deformidade nas vértebras. Esta osteoporose induzida era totalmente revertida pela injeção intravenosa de OPG recombinante. Isto demonstra que a presença da OPG é essencial para a manutenção da massa óssea em situações fisiológicas funcionando como um poderoso agente osteoprotetivo (BAUD’HUIN et al., 2007; KATAGIRI; TAKAHASHI, 2002). O papel osteoprotetor da OPG também tem sido suportado pela deleção parcial da OPG em pacientes com Doença de Paget juvenil, uma doença autossômica recessiva onde os indivíduos afetados têm um aumento na remodelação óssea, osteopenia e fraturas (BOYCE; XING, 2008). Um aumento da atividade do RANKL, associado a uma diminuição da atividade regulatória da OPG, tem sido implicado em diversas doenças como osteoporose, artrite reumatóide e doença periodontal. (ANDRADE et al., 2008; SILVA et al., 2008; HOUFBAUER; HEUFELDER, 2001; MENEZES et al., 2006; VERNAL et al., 2006). A reabsorção e formação ósseas são reguladas pela relativa concentração do RANKL expresso por várias células, bem como do receptor RANK no precursor do osteoclasto e do receptor solúvel OPG. Quando a expressão de RANKL é relativamente elevada em relação ao OPG, RANKL fica disponível para ligar-se ao RANK no precursor do osteoclasto, inclinando o balanço a favor da ativação e formação dos osteoclastos e reabsorção óssea, ou seja, quando o RANK liga-se ao seu ligante específico, inicia-se a osteoclastogênese (Figura 2). A ligação do RANKL ao precursor do osteoclasto ocorre no estágio em que as células de origem hematopoiéticas se diferenciam em unidade formadora de colônia de granulócitos e macrófagos (CFU-M). Essa ligação no CFU-M na presença de fator estimulante de colônia de macrófagos induz a diferenciação de préosteoclastos em células multinucledas que se tornam osteoclastos maduros (COCHRAN, 2008). Quando a concentração da OPG é relativamente maior que a expressão do RANKL, OPG liga-se ao RANKL inibindo sua ligação ao RANK (Figura 3). Desse modo, leva a uma redução na formação de osteoclastos e a apoptose dos osteoclastos préexistentes (COCHRAN, 2008). Figura 2. Mecanismo de ação do RANKL expresso por vários tipos celulares e a indução da osteoclastogênese através da sua ligação com o RANK nos precursores osteoclásticos. Fonte: Adaptado de COCHRAN, 2008. Figura 3. Abundância de OPG em relação ao RANKL, inibindo a ligação do RANKL ao RANK, resultando em redução da osteoclastogênese e promoção da apoptose de osteoclastos existentes. Fonte: Adaptado de COCHRAN, 2008. Pesuisadores afirmam que a reabsorção patológica, pelo menos em parte, ocorre devido ao aumento do número de precursores de osteoclastos (LI et al., 2004; BOYCE; XING, 2008; KHOSLA, 2001). Essa hipótese é suportada pela evidência de que um elevado número de precursores de osteoclastos foi identificado no sangue periférico de doentes afetados por mieloma múltiplo, doença de Paget, e artrite psoriática (Ritchlin et al., 2003; Gregoretti et al., 1995; Demulder etal., 1982). E pelo conhecimento de que na fase inicial das doenças, com envolvimento ósseo, os precursores de osteoclastos expressam c-fms, que é o receptor celular para o fator estimulante de colónias dos macrófagos (M-CSF), necessários para o desenvolvimento dos osteoclastos (Arai et al., 1999). No entanto estudos relatam que a osteoclastogênese pode ser estimulada por mecanismos independentes do RANKL. Como observado no estudo de Kobayashi et al. (2005) in vitro com ratos que o TNF-α pode estimular osteoclastogénese por um mecanismo independente do RANKL em macrófagos da medula óssea dos ratos. A pesquisa de Azuma et al. (2000), em modelos humanos, identificaram que na presença de fator estimulante de colônias dos macrófagos (M-CSF), o TNF-α é suficiente para induzir a diferenciação de precursores de osteoclastos, por um processo independente de RANKL. No estudo de Sabokbar et al. (2003) sobre a reabsorção óssea em osteólise periprostética, foi demonstrado que o TNF-α pode promover osteólise induzindo diretamente macrófagos para se diferenciarem em osteoclastos. Os efeitos do RANKL são bloqueados por receptores solúveis como a OPG. Estudos in vitro e in vivo têm mostrado que a tríade RANK/RANKL/OPG são essenciais para a vida dos osteoclastos e ainda, como mediadores de doenças ósseas, sendo importantes alvos moleculares para o diagnóstico e intervenção terapêutica (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001). Acredita-se que o equilíbrio entre a expressão do RANKL e OPG seja fundamental para a regulação da diferenciação e função dos osteoclastos (Tada et al., 2009). Como suportado pelas pesquisas de Bucay et al. (1999) e kong et al. (1999) ao observarem que a disfunção destes dois genes em ratos resultou em osteopetrose grave devido à ausência de osteoclastos e osteoporose pelo aumento do número de osteoclastos, respectivamente. Em diversos modelos animais de doenças ósseas malignas e benignas, a administração da proteína OPG ou de RANK solúvel foi capaz de neutralizar o RANKL e assim, prevenir a reabsorção óssea e reduzir a perda óssea (KHOSLA, 2001). Anormalidades na razão RANKL/OPG têm sido implicadas na patogênese da osteoporose pós menopausa, artrite reumatóide, doença de Paget, doença periodontal, tumores ósseos benignos e malignos, metástases ósseas e hipercalcemia maligna. (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001). E segundo BAUD’HUIN et al. (2007) a razão RANKL / OPG pode ser usada como marcador biológico de prognóstico em patologias ósseas como a osteoporose, espondilite aquilosante, artrite reumatóide, tumores ósseos benignos e osteólise associada a perdas protéticas e fraturas ósseas. Este índice pode também ser importante para avaliação de novas drogas contra doenças ósseas e como terapia para patologias ósseas. 2.2.2.3 Expressão do RANK / RANK-L / OPG no câncer Entre as mais importantes descobertas no campo da biologia óssea, estão as relacionadas ao papel do sistema RANK / RANKL / OPG na regulação da remodelação e função óssea osteoclástica (YASUDA et al., 1998; SUDA et al., 1999; AZIM et al. 2012). Proporcionando uma melhor compreensão do processo de reabsorção óssea, que é considerada uma etapa preliminar na evolução e progressão de alguns tipos de câncer (AZIM et al. 2012). Assim, esta via foi estabelecida como reguladora do processo de invasão e metástases ósseas de vários tipos de câncer humano, tais como câncer de mama (THOMAS et al, 1999; BENDRE et al, 2003), câncer de próstata (BROWN et al, 2001), o mieloma (SEZER et al, 2003; YACCOBY et al, 2004) e carcinoma epidermóide oral (NAGAI et al, 2000). E segundo Guise e Mundy (1998) as células cancerígenas ao invadirem o osso proliferam e inibem a sua apoptose, enfatizando que o osso é um armazém de citocinas e fatores de crescimento, que proporcionam um ambiente extremamente fértil para o crescimento celular. Como destacaram Semba et al. (1996) ao observarem uma presença mais significativa de osteoclastos no osso invadido por células cancerígenas do que no sem invasão. Good et al. (2002) objetivando avaliar a expressão do RANKL em tumores que acometem o osso, realizaram uma pesquisa, imuno-histoquímica prospectiva, em 5 casos de tumor ósseo benigno primário, 3 casos de tumor ósseo maligno primário e 8 casos de tumor metastático e observaram expresão positiva do RANKL em 13 casos dos 16 analisados.Concluindo que a ativação direta dos osteoclastos pela expressão de RANKL nas células tumorais é um importante mecanismo para ocasionar a destruição óssea. Posteriormente, Grimaud et al. (2003) em sua pesquisa por PCR-RT e ELISA, destacaram que a proporção RANKL/OPG foi significativamente aumentada em pacientes que sofrem de osteólise grave associado ao tumor em comparação com tecidos saudáveis. Além disso, observaram, através da imuno-histoquímica, a expressão positiva do RANKL em tumores ósseos malignos primários (osteossarcoma e condrossarcoma) e no tumor de células gigantes. Os autores sugerem que a expressão da OPG pode refletir um mecanismo homeostático do esqueleto para contrabalançar o aumento da reabsorção óssea. E de acordo com Weber et al. (2000), a invasão do tecido ósseo por um tumor benigno ou maligno, primária ou secundária, rapidamente afeta o equilíbrio entre a reabsorção e aposição óssea. Este desequilíbrio em favor da reabsorção óssea pode resultar na aquisição de novas propriedades celulares pelas células ósseas, como: o aumento da atividade proteolítica e a alteração da expressão de fatores local ou tumoral. Uma hipótese, para este desequilíbrio é que a instabilidade genômica de células tumorais pode causar mutações que afetam as propriedades críticas celulares. Outra hipótese é a construção de um ambiente que favoreça a reabsorção óssea. Segundo Wittrant et al. (2004), a interacção entre as células tumorais, os fatores derivados do tumor e o microambiente ósseo são cruciais para a iniciação e promoção das doenças malignas no esqueleto. Ao analisar histologicamente lesões ósseas, por metástases, os pesquisadores observaram que a destruição do osso é mediada pelos osteoclastos, e não pela ação direta das células tumorais. Estas observações sugerem um ciclo vicioso para a formação de tumores ósseos osteolítios, ocasionando estímulos para a proliferação celular no tumor em paralelo com um desequilíbrio da relação formação/reabsorção óssea em favor da destruição óssea. Os autores destacam, ainda, que as células tumorais secretam fatores solúveis no osso (por exemplo, hormonio, citocinas e fatores de crescimento) que estimulam a reabsorção óssea osteoclástica, através da produção indireta do RANKL por células estromais osteoblásticas. No entanto, outros estudos demostram que as células tumorais podem produzir RANKL, atuando diretamente na diferenciação e ativação dos osteoclastos, como no relatado por Croucher, et al. (2001) em mieloma múltiplo, Zhang et al. (2001) em câncer de próstata, Nagai et al. (2000) em linhagem de células de carinoma epidermóide oral e Michigami et al. (2001) em neuroblastoma humano. Roodman et al (2004), ao analisar o mecanismo da metástase óssea, observaram que dentro do microambiente ósseo, o nível de osteoclastogênese e reabsorção óssea depende, principalmente, do equilíbrio entre RANKL/OPG, e que as células tumorais secretam fatores que podem induzir a ativação dos osteoclastos através da elevação dos níveis locais do RANKL em osteoblastos e células estromais, estimulando, portanto, a atividade osteoclástica excessiva e conseqüentemente, a degradação óssea. Concluindo, portanto, que a elevada propensão das células tumorais em metastizar o osso, indica que este fornece um meio favorável ao crescimento do tumoral; e que o tumor induz as células a expressarem RANKL e, subsequentemente, a osteólise conduz à liberação de fatores de crescimento pró-tumoral e citocinas para o microambiente do osso, resultando em um ciclo vicioso de destruição ossea e proliferação do tumoral. Destacam, ainda, que a osteólise nas metástases ósseas ocorre devido, principalmente, à ação dos osteoclastos, ao invés das células tumorais. As células tumorais, no entanto, participam de um ciclo vicioso, por induzir a atividade dos osteoclastos. Alem disso, já esta bem estabelecido que a presença do RANKL em tumores com envolvimento ósseo aumenta a osteoclastogênese e acelera a reabsorção óssea. Atualmente, já se sabe que as células malignas podem perturbar tanto o sistema esquelético quanto o imunitário. A interação entre as células do câncer e ósseas resultam em um ciclo vicioso de destruição óssea e crescimento do câncer. A remodelação óssea gera um ambiente rico em fator de crescimento que atrai as células cancerosas e promove a sua proliferação. Por sua vez, as células cancerosas, estimulam a formação e ativação de osteoclastos, resultando na reabsorção óssea adicional que estimula ainda mais o crescimento de células malignas (TERPOS et al., 2011). Estudos estão sendo realizados na tentativa de esclarecer o processo de quimiotaxia do RANKL (JONES et al., 2006; SANTINI et al., 2011; JOYCE e POLLARD, 2009). Como o realizado por JONES et al. (2006) em células do câncer de mama nos quais observaram nas amostras elevada expressão da proteína RANKL, sugerido que esta pode atuar como um fator quimiotático para estas células cancerosas. Segundo os autores o microambiente ósseo é uma fonte rica em RANKL, e atrae células tumorais que expressam RANK. Tem sido relatado que as células malignas que expressam RANKL são capazes de induzir a osteoclastogênese, mesmo na ausência de outras células estimulatórias (NAGAI et al., 2000; FARRUGIA et al., 2003; Wittrant et al. 2004; AZIM et al. 2012). Porém nem todos os tipos de câncer expressam RANKL, assim como o contato célula a célula e entre o câncer e células hospedeiras nem sempre conduzem a expressão do RANKL (GIULIANI et al., 2003; OHSHIBA et al., 2003). A revisão do papel do RANKL e algumas outras moléculas-chave na reabsorção óssea osteoclástica, relacionadas com câncer de mama, realizada por Azim et al. (2012) demonstraram que o principal mecanismo celular responsável pela metástases ósseas osteolíticas é a ativação osteoclástica. A superexpressão do RANKL tem sido considerada como um pré-requisito para praticamente todas as condições de câncer que induzem a destruição do osso. Assim, o direcionamento terapêutico para o RANKL parece ser uma abordagem racional para o tratamento ou até mesmo para evitar o processo de metástases ósseas. Ao avaliar os mecanismos da metástase óssea, Roodman (2004) observou que alterações no equilíbrio entre os níveis RANKL / OPG nos locais das metástases estão associadas com a osteoclastogênese. Assim como pesquisas com o bloqueio total da sinalização do RANKL em modelos animais demonstraram uma dependência absoluta entre a inducão da osteólise no tumor e sinalização do RANKL (MORONY et al.; 2001; JONES et al.; 2006; MARTINS et al., 2012). De acordo com Boyle et al. (2003), a osteoclastogênese e, consequentemente, a reabsorção óssea é regulada, principalmente, pelo nível de RANKL, que é expresso quase que exclusivamente dentro do osso e pelas células do estroma, que são induzidas pela maioria dos hormônios e fatores que estimulam a reabsorção óssea. Este fato confirma sua associação com a metastase óssea em vários tipos de tumor incluindo o da mama, próstata, neuroblastoma, mieloma múltiplo, tiróide, renal e pulmonar (ROODMAN, 2004) e, a proporção alterada de RANKL / OPG tem sido associada com a osteólise de pacientes com mieloma múltiplo (TERPOS et al., 2003), câncer de mama e pulmão (MOUNTZIOS et al., 2006). Canon et al (2008) sugerem que a redução na diferenciação de osteoclastos e ativação (e conseqüente redução da reabsorção óssea) pode ter um efeito positivo sobre a progressão de tumores e, consequentemente, pode melhorar a sobrevida destes pacientes. Já que a inibição do RANKL, em seu estudo in vitro com carcinoma de mama, ocasionou o aumento da apoptose das células tumorais devido à redução de fatores pró-tumorais (sobrevivência e proliferação) derivados de osso. Assim, os autores concluíram que diminuição do tumor não é exclusivamente devido à incapacidade de se expandir no osso, mas também devido a morte das células de tumorais, resultante da inibição de RANKL. Santini et al. (2011) demonstraram as primeiras evidências clínicas do papel da expressão do RANK, em tumores primários, como um marcador preditivo para metástase óssea. Em seu estudo, que incluiu 93 pacientes com câncer de mama, aqueles com tumores com expressão positiva para RANK tinham uma taxa significativamente maior de metástase óssea em comparação aos pacientes com tumores com baixa ou ausência de marcação para RANK. Os pesquisadores sugerem que a investigação do sistema RANK / RANKL pode abrir novos espaços na previsão da recorrência óssea e também pode identificar um subgrupo de pacientes que estão em maior risco de desenvolver metástase óssea. Azim et al., (2012), ao realizarem uma revisão sobre os aspectos fisiopatológicos relacionados com a evolução da metástase óssea no câncer de mama, enfatizando o papel fundamental do RANKL e algumas outras moléculas-chave da reabsorção óssea osteoclástica, observaram que o desenvolvimento da metástase óssea envolve interações complexas e recíprocas entre as células do câncer e o microambiente ósseo, gerando um ciclo vicioso que resulta no crescimento de células tumorais e destruição óssea. Assim como destacaram que a afinidade das células de câncer de mama com o osso não é definido apenas pelo microambiente favorável a sobrevivência das células, mas também pela capacidade destas, juntamente com as células estromais /osteoblástica, em recrutar osteoclastos através do sistema RANK / RANKL /OPG. Estudos realizados em câncer de mama têm revelado que o papel do RANKL vai além da reabsorção óssea. Enfatizam que a relação RANK / RANKL têm uma importância potencial na tumorigênese. Dois recentes estudos em modelos animais demonstraram que a inibição da função do RANKL pode resultar em uma acentuada diminuição da incidência do câncer de mama. O bloqueio do RANKL não só reduz a formação do tumor, como também a disseminação das células do câncer para o pulmão. Esses dados sugerem que o RANKL pode ser alvo de abordagens na prevenção e /ou tratamento do câncer (GONZALEZ-SUAREZ et al., 2010; SCHRAMEK et al., 2010). A via de sinalização RANK/RANKL/OPG, também conhecida como tríade molecular, foi identificada por Guise e Mundy (1998) como um importante processo de invasão e metástase óssea do carcinoma epidermóide oral, através da reabsorção óssea pelos osteoclastos. Posteriormente, ao explorar os fatores que contribuem para a associação do câncer à reabsorção óssea, Nagai et al. (2000) foram os primeiros a informar sobre a expressão do RANKL em células do carcinoma epidermóide oral. Em seguida, Tada et al. (2005) sugeriram que as células do CEO podem induzir a supressão da OPG, promovendo assim a osteoclastogênese. Esta pesquisa in vitro foi realizada com o objetivo de identificar os possíveis mecanismos pelos quais as células do carcinoma epidermóide oral (BHY) regulam a formação de osteoclastos e observaram que as células tumorais reduzem a expressão da OPG, ao invés de aumentar a expressão do RANKL para promover a osteoclastogenese. Para esta conclusão, os autores avaliaram o nível de expressão do RANKL e OPG, através da análise PCR-RT e imunohistoquímica, e identificaram que as células BHY co-cultivadas com células da medula óssea de camundongos formaram poucos osteoclastos, embora as células BHY expressassem RANKL. No entanto, ao adicionar a essa cultura osteoblastos primários ocorreu forte indução da osteoclastogênese na ausência de fatores osteotrópicos. A análise imuno-histoquímica mostrou uma redução da expressão de OPG nas lesões osteolíticas, em comparação aos casos com tumor que nao apresentavam lesões osteoliticas. No entanto, o papel das células do carcinoma epidermóide oral na função dos osteoclastos, assim com na sobrevivência e atividade de reabsorção óssea pelos osteoclastos não é bem compreendida. Na tentativa de esclarecer esses questionamentos Tada et al. (2009) avaliaram, in vitro, o efeito do carcinoma epidermóide oral sobre as funções dos osteoclastos, utilizando o cultivo de célula BHY, linhagem de CEO humana, em um meio condicionado (BHY-CM) que estimula a sobrevivência dos osteoclastos ao suprimir Bim, uma proteína pró-apoptótica, dependendo da quinase regulada por sinal extracelular (ERK) e multinucleação e concluiram que as células do carcinoma epidermóide oral regulam a osteoclastogênese e suas funções. Com o objetivo de elucidar os mecanismos moleculares da invasão óssea pelo CEO, Subramanya et al. (2009) realizaram PCR-TR para avaliar o nível de expressão CXCL13, CXCR5, RANKL e MMP-9 em linhagem de células malignas (SCC1, SCC12 e SCC14a) e desenvolveram um modelo in vivo de CEO por injeção subcutânea de células tumorais sobre a superfície calvária ratos, que desenvolveram os tumores em 4 a 5 semanas, para examinar a invasão óssea das células tumorais. Os autores sugeriram que aumento significativo do número de osteoclastos na interface tumor/osso e a elevada expressão imunohistoquímica da CXCL13 e RANKL, apoiam a osteoclastogênese. Chuang et al. (2009) foram os primeiros a pesquisar in vivo a imuno-expressão da tríade RANK/RANKL/OPG em 40 casos de carcinoma epidermóide oral localizados na gengiva, sendo 25 sem invasão óssea e 15 com invasão óssea, e observaram uma alta expressão do RANK e RANKL e uma baixa expressão da OPG nos casos 40 CEO, não havendo diferença significativa entre os casos com e sem invasão óssea. No entanto ao comparar com o grupo controle (5 casos de mucosa oral normal) os pesquisadores encontraram diferença significativa na marcação dos três anticorpos. Os autores sugerem que o CEO sem invasão óssea possuem potencial para induzir a osteoclastogênese através da via RANK/RANKL/OPG, se estimulada em condições adequadas (como por exemplo, na aproximação das células tumorais com o osso) e concluem que a via RANK/RANKL/OPG possuem valor como biomarcador do carcinoma epidermóide oral. No estudo, in vivo e in vitro, realizado por Shin et al. (2011), sobre a invasão óssea do carcinoma epidermoide oral, através da via RANK/RANKL/OPG, foi realizada o cultivo de linhagem de celulas B88 (células oriundas do CEO de língua moderadamente diferenciado) e posteriormente injetada na região do masseter de ratos, que foram tratados durante 3 semanas com OPG. Observaram que a inibição da ligação RANK/RANKL através da OPG impede a invasão óssea pelas células B88, por inibir a osteoclastogênese e migração de células cancerígenas e por induzir a apoptose das células malignas, através da via indireta anti-cancerígena. No entanto, a OPG não afetou a proliferação e apoptose em células B88 in vitro. Diante destes achados, os autores sugeriram que os efeitos de OPG sobre a apoptose das células B88 são restritos ao ambiente ósseo e concluíram que o RANKL promove a migração de células tumorais que expressam RANK, induzem os osteoclastos, facilitando a invasão óssea, e que OPG inibe a sinalização RANKL e suprime a invasão óssea das células carcinoma epidermóide oral. Shin et al. (2011) enfatizam, ainda, baseados nos resultados da sua pesquisa in vivo e in vitro que a OPG suprime a invasão óssea pelas células cancerígenas por três mecanismos. No primeiro, a OPG suprime a osteoclastogênese e reabsorção óssea. No segundo, a OPG pode regular o microambiente tumoral do carcinoma epidermóide oral, induzindo a apoptose das células tumorais por mecanismos indiretos (por exemplo, limitando o fornecimento de fatores de crescimento derivadas do osso, por meio da inibição da reabsorção óssea osteoclástica). E no terceiro mecanismo, a OPG suprime a migração das células do carcinoma epidermóide oral induzidas pelo RANKL. Com o objetivo de determinar se o CEO em gatos funciona como um relevante modelo de estudo para o CEO em humanos, em termos de comportamento osteolítico e expressão da reabsorção óssea, a pesquisa in vitro e in vivo de Martins et al. (2012) utilizou linhagens de células de CEO de gatos localizado na gengiva (SCCF2) e na língua (SCCF3) para obter carcinomas espontâneos e a linhagem de células já estabelecidas do CEO de gato localizado na laringe (SCCF1) e de humano localizado na laringe (UMSCC12), na glandula salivar (A253) e na língua (SCC25), com o intuito de comparar se o fenótipo da invasão óssea e da expressão do PTHrP (estimulador da reabsorção óssea osteoclástica), do RANKL (ativador da osteoclastogénese) e da OPG (inibidor de osteoclastogénese) são similares entre as duas espécies, e para avaliar se CEO de gato, com invasão óssea, pode ser utilizado como um modelo de estudo para o CEO humano. Durante as análises, utilizou-se a técnica de co-cultura in vitro para investigar a interação do CEO com o osso e com os pré-osteoblastos (MC3T3) e a técnica in vivo da imagem bioluminescente, da radiografia (Faxitron®) e da microscopia para medir o crescimento do xenoenxerto e invasão óssea em ratos. Pode-se observar no estudo, que CEO em gatos e humanos expressam altos níveis de PTHrP e que estes estão associados com a reabsorção óssea in vitro e in vivo e osteoclastogênese. E que as células MC3T3 aumentam a espressão do RANKL e reduz a expressão da OPG em meio condicionado por células com capacidade de invadir osso (SCCF2) em comparação às células SCCF3, que possuem mínima capacidade de invasão óssea, o que foi parcialmente revertido com o anticorpo neutralizante anti-PTHrP. Concluíndo, portanto, que a reabsorção óssea induzida pelo CEO de gato está associada com a secreção do PTHrP pelas células tumorais e com o aumento da expressão da relação do RANKL/OPG em pré-osteoblastos em ratos. E que os modelos pré-clínicos de CEO em gato recapitula as caracteristicas fenotipicas da invasão óssea do CEO espontâneo e será útil para futuros estudos préclínicos e mecanicistas sobre o comportamento da invasão óssea. Zhang et al. (2013) ao investigarem o papel do RANKL na destruição óssea mediada pelas células do CEO, através da pesquisa in vitro (linhagem de células/camundongos) e in vivo (50 casos de CEO) utilizando metódos de PCR, citometria de fluxo, ELISA e imunohistoquímica. Os autores observaram que CEO expressa níveis variados de RANKL, tanto ligado à menbrana quanto solúvel, e demonstram a capacidade do CEO de produzir RANKL, alterando diretamente o microambiente do tumor para aumentar a osteoclastogênese (in vitro) e de mediar invasão óssea local (in vivo). 2.3. PARTICIPAÇÃO DA IL-6 NA REABSORÇÃO ÓSSEA As citocinas são proteínas solúveis, que desempenham importante papel na iniciação e manutenção de doenças inflamatórias e nas respostas imunes, bem como estímulos intercelulares. A Interleucina-6 (IL-6) caracteriza-se como uma citocina próinflamatória multifuncional que ordena a transição da inflamação aguda para crônica, a partir da modificação do infiltrado leucocitário inato, atua tanto na imunidade inata quanto na adquirida. Ela é sintetizada por fagócitos mononucleares, células do endotélio vascular, fibroblastos e outras células como células T ativadas, em resposta a microrganismos e a outras citocinas, especialmente IL-1 e TNF-α. Sua forma funcional se caracteriza por um homodímero com cada subunidade formando um domínio globular com quatro α-hélices. Os sinais celulares da IL-6 são transmitidos através de receptor expresso em uma variedade de tipos de células-alvo. O receptor solúvel da IL-6 (sIL-6R) permite aumentar o repertório de células responsivas à IL-6 (Jones et al, 2001) e consiste em uma proteína de ligação à citocina e uma subunidade transdutora de sinal e, ambas pertencem à família dos receptores de citocina do tipo I. A subunidade transdutora de sinal de 130 kD é chamada gp130, que é também componente de sinalização de outros receptores de citocina. (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008). A IL-6 foi originalmente identificada como uma citocina derivada das células T que induz a maturação final das células B em células produtoras de anticorpos e apresenta várias atividades biológicas que diferem amplamente entre vários tipos de tecidos e células. Sua atividade na inflamação é considerada uma faca de dois gumes, pois atua tanto como anti-inflamatório (por exemplo, na baixa regulação de recrutamento de neutrófilos e expressão das citocinas pró-inflamatórias) (SCHINDLER et al, 1990; XING et al, 1998), como também na pró-inflamação (por exemplo, indução de reagentes de fase aguda no fígado) em doenças crônicas (JONES et al, 2001). Além de estimular a síntese de proteínas e contribuir com a resposta inflamatória na fase aguda, já que estimulam a produção de neutrófilos por progenitores da medula óssea, podem atuar de comum acordo com os fatores estimuladores de colônias, assim como na imunidade adquirida induzindo o crescimento e diferenciação de linfócitos B e na produção de imunoglobulinas, estimulando da proliferação de linfócitos T e ativação da cascata do complemento (HIRANO et al, 1988; RIDKER et al, 1997; KARIN et al., 2006; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008; LITTMAN; RUDENSKY, 2010). Destaca-se ainda, dentre as funções da IL-6, sua capacidade de sinalização que pode direcionar carcinógenos para o desenvolvimento e progressão de diversos tipos de câncer (PARK et al., 2010; GRIVENNIKOV; KARIN, 2008; BARTON, 2005; NISHIMOTO, 2010). E sua atuação na osteoclastogênese pela estimulação de células progenitoras ou por um sistema parácrino, essencial para o metabolismo ósseo, onde os osteoblastos e células progenitoras desempenham um papel central por meio de mediadores como RANK, RANKL e OPG (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; AESCHLIMANN; EVANS, 2004). Segundo Terpos et al. (2011) em sua revisão dos efeitos da osteoclastogênese sobre o crescimento e metástases do câncer, a osteólise mediada por osteoclastos resulta na liberação de fatores de crescimento, como a IL-6, no microambiente ósseo que facilitam o crescimento e metástases do câncer, e que as citocinas derivadas do osso fornecem estímulos quimiotáticos para direcionar a migração celular. Jimi et al. (2011) relatam que o osso é um armazém com vários fatores de crescimento, incluindo a IL-6 que é produzida por células do estroma, e induzem os fibroblastos/osteoblastos a sintetizarem RANKL e, subsequentemente, induzirem a formação dos osteoclastos. Estes fatores de crescimento são liberados no microambiente ósseo na forma ativa, e como consequência da reabsorção óssea osteoclástica estimulam a proliferação das células cancerosas e inibem a apoptose. Os fatores osteolíticos (PTHrP, IL-1b, IL-6, IL-8 e IL-11) secretados a partir das células tumorais aumentam a reabsorção óssea através da promoção da osteoclastogênese, pois induzem a expressão do RANKL em osteoblastos, e este ao se ligarem ao RANK aumentam a proliferação e a fusão dos precursores de osteoclastos na presença de M-CSF (PICKERING et al., 2002). E dentre estes fatores osteolíticos, Ishimi et al. (1990) destacam que a IL-6, sintetizada no ósso pelos osteoblastos, apresenta-se como um importante regulador do desenvolvimento osteoclástico, pois fisiologicamente, regula o metabolismo ósseo. Assim, esta citocina demonstra efeitos únicos e importantes sobre a célula óssea (ROODMAN, 1992), como, por exemplo, a elevada formação de células com características osteoclásticas que têm a capacidade de reabsorver o osso (MANOLAGAS, 1995; KURIHARA et al., 1990). Nibali et al., (2012) enfatizam que a IL-6 parece contribuir para patogênese do câncer oral através de diferentes mecanismos e processos biológicos, ao avaliarem a associação entre IL-6 e uma série de doenças bucais, incluindo o carcinoma epidermóide oral, por meio de uma revisão das evidências disponíveis na literatura. Com o intuito de avaliar o mecanismo de invasão óssea, Shibahara et al. (2005) realizaram testes imuno-histoquímico em 38 casos de carcinoma epidermoide oral da gengiva mandibular, sendo 23 com invasão óssea e 15 sem invasão óssea, utilizando os anticorpos: PTHrP,TNF-α, IL -1A, IL-1B, IL-6, IL-11, IL-18 e TGF-β. Observaram que os carcinomas com invasão óssea expressaram elevada quantidade de células positivas para o PTHrP, TNF-a, IL-6 e IL-11, com diferença estatística em relação aos casos sem invasão óssea (P <0,01) e nenhuma diferença significativa foi encontrada para os parâmetros clínicos ou achados histopatológicos entre os dois grupos. Os pesquisadores concluiram que estas citocinas: PTHrP, TNF-α, IL-6 e IL-11 derivam do câncer e desempenham um importante papel no mecanismo de invasão óssea nesta doença. Tem sido relatado que a IL-6 pode promover ou inibir a proliferação de células carcinogênicas e que uma variedade de tumores malignos apresentam ou sintetizam a IL6, sugerindo assim um possível mecanismo de ação sobre o câncer (SHIBAHARA et al. 2005). No Carcinoma epidermóide oral, vários experimentos, in vitro e in vivo, têm demonstrado que as células tumorais produzem diferentes citocinas que regulam a expressão de RANKL e OPG, dentre estas se encontra a IL-6, enfatizando, portanto a capacidade desta de induzir a formação de osteoclasto e reabsorção óssea (JABLONSKA et al., 1997; CHEN et al., 1999; OKAMOTO et al., 2000; ST JOHN et al., 2004; TERPOS et al., 2011). Deyanam et al. (2008) ao investigarem o mecanismo pelo qual, por via oral, a linhagem de celulas carcinogênicas estimulam a osteoclastogênese, observaram que estas células induzem a ativação dos osteoclastos, pois, estas podem ser estimuladas indiretamente por citocinas, como a IL-6. No entato, não ficou totalmente esclarecido se estas citocinas são ativadas por células cancerosas e se estão diretamente envolvidas na invasão óssea e metástases de tumores malignos. A produção e secreção da IL-6 em carcinoma epidermóide oral e sua influência sobre a destruição óssea, foram investigadas por Hwang et al. (2012) através do cultivo de células (YD-10B e HSC-3). Os autores puderam observar uma elevada secreção da IL6, pelas células cultivadas, assim como identificaram que em estados patológicos, como na metástase óssea, a elevada concentração da IL-6 estimula ainda mais as células tumorais a ativarem os osteoclastos, proporcionando o aumento da reabsorção óssea osteolítica. Concluíndo, portanto que a IL-6 está diretamente associada com a progressão do câncer e ativação dos mecanismos da osteoclastogênese. Algumas pesquisas têm demonstrado a presença de níveis elevados da IL-6 no soro de pacientes com carcinoma epidermóide oral (JABLOSNSKA et al., 1997; CHEN et al., 1999; TRIKHA et al., 2003), e correlacionam estes altos níveis com um pobre prognóstico clínico (HONG et al., 2007). De acordo com Duffy et al. (2008) estes elevados níveis de Il-6 podem servir como marcador para predizer recorrência do tumor, metástase tumoral e baixa sobrevida dos pacientes com carcinoma epidermóide oral, embora, de acordo com os autores, o aumento da IL-6 sintetizada pelas células do tumor não esteja bem elucidado e poucos estudos tenham investigado extensivamente este mecanismo. Assim como, para John et al. (2004), a Il-6 também pode ser indicada como um potencial biomarcador para o CEO e orofaríngeo. Segundo Tang et al. (2008), o potecial agressivo das células do CEO, de invasão e metástase óssea, pode ser associado à esta super expressão da IL-6, pois sua pesquisa demostra claramente que o mecanismo de invasão óssea da células cancerígenas é influenciado pela super expressão desta, que ativa a produção e promoção da osteoclastogênese. Portanto, dada a importância da IL-6 com relação a invasão e proliferação das células cancerígenas, no qual ambos os eventos contribuem para a progressão do CEO, pode-se destacar que qualquer perturbação na secreção da mesmas ocasiona uma estratégia atrativa de tratamento no carcinoma epidermoide oral (TUBERGEN et al., 2011). O aumento da reabsorção óssea osteoclástica fornece espaço para as células cancerosas pode crescer e induzir novas interações moleculares com as diferentes citocinas dentro do microambiente ósseo. As maiorias das evidências indicam que as células do câncer podem induzir a ativação osteoclástica através da liberação de mediadores solúveis tais como IL-1, IL-6, 1L-8, E2, TNF e PTHrP (ROODMAN, 2004; KOHNOET Al., 1994). Nomura et al. (2007) ao analisarem a invasão óssea mandibular pelo CEO, através de modelos murine, observaram que a expreesão da IL-6, TNF-α e PTHrP está associada com a ativação dos osteoclastos presentes no tecido tumoral. Adicionalmente, estudos com linhagem de células de CEO demonstraram que estas expressam fatores osteolíticos, como IL-6, TNF-α, PTHrP, e IL-11, que estimulam a produção do RANKL em células estromais, tais como osteoblastos, para mediar indiretamente a diferenciação de osteoclastos e permitir a invasão tumoral (SHIBAHARA et al.; 2005; DEYAMA et al.; 2008; KAYAMORI et al.; 2010; MARTINS et al., 2012). Apesar da interleucina-6 acelerar a reabsorção óssea osteoclástica, não está estabelecido, na literatura, se esta citocina esta diretamente envolvida na invasão óssea do câncer oral. Diante deste questionamento, Okamoto et al. (2000) realizaram uma pesquisa in vitro com duas linhagem de células do carcinoma epidermóide oral de humanos, sendo uma linhagem altamente invasiva e a outra linhagem não-invasiva, que foram cultivadas e injetadas no masseter de ratos tratados com estimulos e bloqueio da IL-6. Observaram que o cultivo das células com capacidade de reabsorver o osso (BHY) e células ricas em osteoclasto, demonstraram um efeito estimulatório significativo sobre a atividade de reabsorção óssea osteoclástica e quimiotaxia de osteoclastos, no entanto este efeito foi drasticamente inibido quando adicionado o anticorpo anti-IL-6. Os pesquisadores sugerem o importante papel da IL-6 sobre as células tumorais na reabsorção óssea osteoclástica. Como objetivo de determinar o papel da IL-6 no carcinoma epidermoide oral, Chang et al. (2013) avaliaram através do método ELISA a concentração sorológica da IL6, a partir de amostras de sangue, de 237 pacientes com CEO, 104 com lesões prémalignas orais (85 leucoplasias, 5 eritroplasias e 104 eritroleucoplasias) e 125 saudáveis. Oa resultados mostraram concentrações sigificativamente mais elevadas da IL-6 nos pacientes com CEO em comparação aos pacientes com lesões pré-malignas orais e saudáveis, no entanto, não houve diferença significante entre os pacientes com lesão prémaligna e saudável. Ao avaliar a concentração da IL-6 como um potencial marcador para distinguir pacientes com CEO dos saudáveis, através da curva de ROC, observaram que, provavelmente, não pode ser utilizado eficazmente como um marcador de diagnóstico, apesar dos níveis séricos da IL-6 estar significativamente mais elevados nos pacientes com CEO, em comparação com os outros dois grupos. Entre os pacientes com CEO, houve associação significativa da concentração da IL-6 com o estadiamento (TNM) e presença de invasão óssea, sendo a concentração da IL-6 superior nos pacientes com maior estadiamento e com presença de invasão óssea. Não houve diferença significativa para a gradação histológica, invasão perineural e hábitos (álcool e fumo). Houve associação signficativa com a sobrevida (5 anos), indicando que as concentrações de IL6 no soro pode desempenhar um papel na predição de sobrevida global em pacientes com CEO. Os pesquisadores concluíram que a concentração da IL-6 no soro esta associada com o tamanho e agressividade do CEO e que pode ser útil como um indicador de prognóstico após tratamento. Cheng et al. (2013) na tentativa de encontrar um valor prognóstico para a IL6 em pacientes com CEO, investigaram associação entre as características clinico-patológicas e expressão imuno-histoquímica da IL-6 em 337 casos de CEO, sendo 74 do gênero feminino e 263 do gênero masculino. Os resultados revelaram um forte a moderada expressão da IL-6 em 116 tumores (34,4%) e uma fraca ou negativa expressão em 221 tumores (65,6%). Ao associar esses resultados com os dados clinico-patológicos, a alta expressão da IL-6 foi significamente associada com alta taxa de metastáse nos linfonodos (P =0.007, baixa diferenciação histológica (P= 0.008), feminino (P= 0.008) e inversamente associada com o hábito de mascar betel (P=0.028). Não houve associação significativa com a idade, fumo, consumo de álcool, tamanho do tumor, metástase distante e estadiamento. Análise multivariada revelou que somente gênero masculino (P= 0.002), estagio clínico avançado (P= 0.001), alta taxa de metastáse nos linfonodos (P =0.007) e baixa diferenciação histológica (P= 0.010) foram correlacionados com pobre prognóstico. Os pesquisadores concluíram que a elevada expressão da IL-6 em células tumorais pode ser associada com manifestações clínicas agressivas e a sugere como um preditor de sobrevivência, particularmente em pacientes do gênero masculino. Que et al. (2012) com intuito de investigar os fatores derivados do câncer que regulam a reabsorção óssea osteoclástica, através da estimulação da expressão de RANKL em células estromais, identificaram duas linhagem de células tumorais clonais HSC3-C17 e HSC3-C13 que foram isoladas a partir de células do CEO maternal (HSC3) que apresentaram altas (HSC3-C13) e baixa (HSC3-C17) capacidade de induzir a expressão do RANKL em células estromais, quando comparadas com às células maternas. Ao cultivar em meio condicionado, as células HSC3-C13 aumentaram significativamente o número de osteoclastos em co-cultura com células óssea de rato quando comparadas com as células HSC3-C17 e HSC3. Os tumores gerados a partir de xenoenxerto da linhagem de células clonais HSC3-C13 para a região do periósteo do osso parietal de ratos, apresentaram grande destruição óssea e um aumento significativo no número de osteoclastos, em comparação com as células HSC3-C17. Expressão gênica foi comparada entre HSC3-C13 e C17-HSC3 células por meio de análise de microarray, e foram idendificados 11 genes que apresentavam o nível 5 vezes mais elevado em células HSC3-C13 do que nas HSC3-C17 . Dentre estes, o gene da IL-6 foi o que mostrou maior expressão em células HSC3- C13, em comparação com células HSC3-C17. Esses resultados indicam que a IL-6 está envolvida na destruição óssea induzida pelo cancer oral. Um número crescente de estudos foram recentemente realizados reforçando o papel das citocinas, incluindo IL-6, na patogênese e progressão de doenças malignas orais (CUI et al 2010; KAYAMORI et al 2010; GASCHE et al 2011; GAUR et al 2011; SHINRIKI et al 2011; LÓPEZ et al 2011; MARTIN et al 2011; CHEN et al 2012; GASCHE et al 2011; HWANG et al 2012; NIBALI et al 2012; CHANG et al 2013). Em particular, estudos clínicos relataram o aumento de níveis da IL-6 no soro e saliva de pacientes com câncer oral e outros da cabeça e pescoço, em comparação com os controles pareados por idade e localização e demonstraram sua relação significativa com o estadiamento e resposta à terapia (CHEN et al, 1999; BIGBEE et al, 2007). A IL-6 parece contribuir para patogênese do câncer oral através de diferentes mecanismos e processos biológicos. Um estudo in vitro mostraram que a IL-6 pode estimular as células tumorais a secretar maior quantidade de metaloproteinases 1 e 9de matriz, os quais desempenham um papel importante na crescimento infiltrativa, metástases e neo-angiogênese (SUNDELIN et al, 2005). A IL-6 pode também modular uma variedade de vias, incluindo queratinócitos crescimento celular, sobrevivência, diferenciação e função. Em particular, a IL-6 tem sido mostrado para estimular a proliferação de culto humano queratinócitos em pele psoriática (GROSSMAN et al, 1989). Além disso, a IL-6 pode ativar fatores de transcrição tais como transdutor de sinal e ativador da transcrição (STAT) -1 e STAT-3, que por sua vez foram observada em vários tumores (HIRANO et al, 2000). O estudo recente de Gasche et al. (2010) identificou que a IL-6 também pode promover tumorigênese, ao provocar hipometilação, bem aberrantes, no DNA e alterações de hipermetilação no promotor, que pode levar a mudanças epigenéticas na expressão gênica das células do carcinoma epidermóide oral. Além disso, no estudo in vitro de Jeng et al. (2003) observou-se que os queratinócitos orais podem produzir IL-6 em resposta a fatores ambientais bem conhecidos, como a areca e o tabagismo, elevando o risco ao desenvolvimento do carcinoma epidermóide oral. 2.4 ESTUDOS ASSOCIANDO RANK / RANK-L / OPG e IL-6 A destruição óssea associada ao câncer é criticamente regulada por vários fatores sintetizados por células tumorais, tais como PTHrP, IL-6, IL-11, TNF-a e prostaglandina E (OKAMOTO et al., 2000; BROWN et al., 2002; ONO et al., 2003; TADA et al., 2005; SHIBAHARA et al., 2005; JIMI et al., 2011; QUE et al., 2012), que também são sintetizadas pelas células do carcinoma epidermóide oral (QUE et al 2012). Dentre estes fatores, destaca-se a IL-6 produzida pelas células estromais no carcinoma epidermóide oral que induzem as células fibroblásticas a produzirem RANKL no estroma (KAYAMORI et al. 2010). Esta cascata forneçe um novo mecanismo de reabsorção óssea osteoclástica induzida pelo carcinoma epidermóide oral, no entanto a indução da síntese do fator RANKL pelo câncer derivados das células do estroma não é bem compreendida (QUE et al., 2012). Sabe-se que a IL-6 é uma citocina que estimula a expressão do RANKL em células osteoblásticas, e é provável que esta citocina esteja envolvida também na indução da expressão RANKL pelas células tumorais (TEITELBAUM, 2003). Segundo Hofbauer et al. (2004), ao investigar a patogênese e tratamento de doenças ósseas, observaram que o RANKL é um fator essencial para a osteoclastogênese e que sua expressão pode ser regulada por vários fatores de reabsorção óssea, dentre eles a IL-6. Terpos et al. (2011) destacam que a IL-6, apresenta-se como um potente indutor da expressão de RANKL em osteoblastos e fibroblastos sinoviais, estimulando a sinalização RANK/RANKL. De acordo ainda com sua revisão, a remodelação óssea gera um ambiente rico em fatores de crescimento que atrai as células cancerosas e promovea sua proliferação. Por sua vez, estas células estimulam a formação e ativação dos osteoclastos, resultando, consequentemente, na reabsorção óssea adicional que estimula ainda mais o crescimento das células cancerosas. Os autores concluíram, portanto, que as citocinas derivadas do osso fornecem estímulos quimiotáticos para direcionar a migração das celulas tumorais e facilitar o crescimento e metástase do cancer. Embasado no importante papel que os osteoclastos desempenham sobre a invasão óssea, Matsubara et al. (2013) investigaram a expressão das citocinas relacionadas com o osteoclastos em carcinoma epidermóide oral localizados na gengiva. A amostra (n=23) foi dividida em dois grupos, sendo 13 casos com invasão óssea e 10 casos sem invasão óssea. Dentre as citocinas, foram utilizadas a IL-1, Il-6, TNF-α, PTHrP, RANKL, RANK e OPG. Neste estudo prospectivo, as expressões dessas citocinas foram analisadas pela PCR e imunohistoquimica. Os autores constataram que a as citocinas IL-1, IL-6, TNF-α, PTHrP e RANKL apresentaram elevada expresão no grupo com invasão óssea, e que a IL-6 é uma citocina não específica que responde a varias alterações inflamatórias, por estimulação do tumor ou não. Sugerindo, portanto que IL-1, IL-6, TNF-α, PTHrP e RANKL desempenham um importante papel nos mecanismos subjacentes da invasão mandíbula e que a expressão do sistema RANK / RANKL /OPG podem contribuir, no futuro, para o tratamento e prevenção do carcinoma epidermóide oral. Jimi et al. (2011) analisaram a relação entre os osteoclastos e as células do carcinoma epidermóide oral, em lesões ósseas mandibulares de cinco pacientes, observaram uma redução da expressão de OPG em células estromais, quando comparado com as lesões normais. Destacando que a indução da expressão RANKL ou redução da expressão da OPG em células cancerígenas do estroma é mais importante para a formação de osteoclastos que a expressão de RANKL em células CEO. Os autores destacam ainda que a inibição da diferenciação e função de osteoclastos através do bloqueio da via RANK/ RANKL constitui em uma abordagem potencialmente nova para a manutenção da integridade do esqueleto. Afinal, o sucesso do bloqueio desta via irá impedir o desenvolvimento de invasão óssea através das células do carcinoma epidermóide oral. Ishikuro et al. (2008) destacam que o estroma está envolvido na reabsorção óssea osteoclástica. Para melhor avaliar o papel deste estroma realizou estudo imunohistoquímico com vários marcadores envolvidos na função e diferenciação dos osteoclastos e obseravarm que as células fibroblásticas, e possivelmente as células osteoblásticas, ao lado dos osteoclastos na área de reabsorção óssea apresentam marcação positiva para RANKL e negativa para OPG, sugerindo fortemente que as células do CEO em torno da área óssea secretam alguns fatores da reabsorção óssea que induzem a expressão do RANKL em células fibroblásticas e osteoblástica. Para confirmar esta hipótese, realizaram um estudo in vitro com células osteoblásticas de ratos (MC3T3-E1) e células do carcinoma epidermóide oral de humano (células BHY), por meio de RTPCR, e este experimento demonstrou claramente que as células BHY expressam TNF-α, IL-1β, PTHrP e IL-6 regulam a expressão de RANKL e OPG. No entanto, a capacidade de induzir a expressão de RANKL podem ser diferente em cada caso do CEO, pois a freqüência de células fibroblásticas positivos para RANKL associandas ao osteoclasto variou nos casos examinados. De acordo com os pesquisadores esses experimentos in vitro e em animais sugerem que diversas citocinas liberadas pelas células tumorais regulam o sistema RANK / RANKL / OPG no câncer oral. Kobayashi et al. (2009) revisaram o desenvolvimento a partir de células hematopoiéticas da linhagem de monócitos e macrófagos dos sistemas de co-cultura de osteoblastos e células hematopoéticas com o objetivo de examinar a osteoclastogênese in vitro. Os autores observaram que os osteoblastos são fundamentais para a osteoclastogênese e que expressão RANKL em resposta aos fatores de reabsorção óssea. Assim como observaram que o RANKL é uma citocina essencial para a osteoclastogênese e que os osteoblastos produzem também osteoprotegerina (OPG), que inibe a diferenciação dos osteoclastos e funciona interrompendo a interacção entre RANK e RANKL. Destacando diante dos resultados que o eixo RANK / RANKL / OPG é regulador central de diferenciação e função dos osteoclastos. Cui et al. (2010) investigaram sete proteínas relacionadas com os osteoclastos (IL1α, RANK, RANKL, PTHrP, OPG, IL -6, e TNF-α), com objetivo de preve, em biópsias, a invasão óssea pelas células do carcinoma epidermóide oral. Ao realizarem a análise imuno-histoquímica, retrospectiva, de 30 casos com diagnóstico histipatológico de carcinoma epidermóide oral com invasão óssea observaram expressão positiva para todas as 7 proteínas investigadas, no entanto ao analisaream a acurácia da marcação através dos testes de especificidade e sensibilidade identificaram o valor preditivo positivo de IL-1α, IL-6, RANK, PTHrP foi maior do que o das outras citoquinas, e o valor preditivo negativo da IL-1α, OPG, RANK, RANKL, PTHrP foi superior que as outras proteínas, concluindo assim que IL-1α, RANK e PTHrP demostram ter uma melhor uniformidade do que as outras proteínas e podem ser utilizadas para prever a invasão mandibular em biopsia. PROPOSIÇÃO 3. PROPOSIÇÃO O propósito deste experimento é comparar a expressão imuno-histoquímica de fatores de reabsorção óssea (RANKL e OPG) e uma citocina anti-inflamatória (IL-6) no carcinoma epidermóide de palato duro (com reabsorção óssea) e língua (sem reabsorção óssea), com o intuito de verificar se existe associação na expressão destas moléculas entres estas neoplasias e o processo da reabsorção óssea. Assim como avaliar a correlação dos parâmetros clinicopatológicos e prognósticos com a expressão destas moléculas entre as neoplasias. MATERIAIS E MÉTODOS 4. MATERIAS E MÉTODOS 4.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS A presente pesquisa foi apreciada e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte Rio-Grandense Contra o Câncer (LNRCC) sob o parecer número 91.627 (APÊNDECE A). 4.2. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO O estudo caracteriza-se como uma pesquisa descritiva observacional baseada na observação, análise, registro e quantificação da expressão das proteínas RANKL, OPG e IL-6, por meio de imuno-histoquímica, em espécimes de carcinomas epidermóides de palato duro e língua. 4.3. POPULAÇÃO Constituiu-se população deste estudo, todos os casos de carcinomas epidermóides de palato e língua registrados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal, RN, no período de 2004-2010. 4.4. AMOSTRA A amostra do estudo foi intencional, constituída por 61 casos, a fim de obter uma boa dispersão dos dados em torno da média (SIEW, 2000), de carcinomas epidermóides de palato duro e língua, registrados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN, no período de 2004 a 2010. Deste total, 30 lesões foram oriundas do palato e 31 foram provenientes da língua. Os dados clínicos foram obtidos dos prontuários médicos que continham todas as informações necessárias à realização da pesquisa. Os prontuários médicos permaneceram no referido Serviço, assim como, o material biológico resultante da terapêutica cirúrgica instituída, após a obtenção dos espécimes para o estudo. 4.4.1. Critérios de Inclusão Foram incluídos na amostra, apenas os casos de carcinomas epidermóides de palato duro e língua tratados por excisão cirúrgica, que possibilitaram a avaliação do front de invasão tumoral e cujas fichas clínicas dos pacientes continham informações relativas ao estadiamento clínico (TNM) das lesões, desfecho, recidiva e metástase. Foram incluídos os casos com reabsorção óssea de palato que apresentavam comprovação histopatologicamente e/ou exames de imagens, através da tomografia da cabeça e pescoço. 4.4.2. Critérios de Exclusão Foram excluídos da amostra lesões de pacientes que foram submetidos previamente à radioterapia ou quimioterapia, os casos que não possuíram quantidades suficientes de material biológico para realização da gradação histológica de malignidade e do estudo imuno-histoquímico; e que não possuíam acompanhamento clínico de pelo menos 24 meses para definir o desfecho. 4.5. OBTENÇÃO DOS DADOS CLÍNICOS E EPIDEMIOLÓGICOS As informações clínicopatológicas obtidas foram: idade, sexo, localização anatômica da lesão, sistema de estadiamento clínico (TNM), metástase, reabsorção óssea e desfecho. Todas essas informações foram obtidas dos prontuários médicos. Para a análise do desfecho, informações atualizadas presentes no prontuário médico como: estado clínico do paciente, data e causa do óbito foram consideradas. 4.5.1 Sistema de Estadiamento Clínico (TNM) Para o estadiamento clínico dos carcinomas epidermóides de palato duro e língua, coletados nos prontuários médicos dos pacientes tratados no Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN, foram utilizados os parâmetros por eles adotados que são os elencados na sexta edição da Classificação TNM dos Tumores Malignos (SOBIN; WITTEKIND et al., 2002), os quais são apresentados nos Quadros 1 e 2. Estes foram anotados em fichas apropriadas Quadro 1: Sistema de estadiamento clínico do (TNM) para o carcinoma epidermóide oral, preconizado por SOBIN, WITTEKIND, 2002. TAMANHO DO TUMOR PRIMÁRIO (T) TX Nenhuma informação disponível sobre o tumor primário T0 Nenhuma evidência de tumor primário T1S Apenas carcinoma in situ em estágio primário T1 Tumor com menos de 2 cm em seu diâmetro maior T2 Tumor com 2 a 4 cm em seu diâmetro maior T3 Tumor com mais de 4 cm em seu diâmetro maior T4a T4b Tumor que invade estruturas adjacentes: cortical óssea, nervo alveolar inferior, assoalho da boca, ou pele da face (queixo ou nariz) Tumor que invade o espaço mastigador, lâminas pterigóides ou base do crânio ou envolve artéria carótida interna ENVOLVIMENTO DE LINFONODO REGIONAL (N) NNX Os linfonodos regionais não podem ser avaliados NN0 Ausência de metástase em linfonodos regionais Metástase em um único linfonodo homolateral, com 3 cm ou menos N1 em sua maior dimensão N2a – Metástase em um único linfonodo homolateral com mais de 3 cm e até 6 cm em sua maior dimensão NN2 N2b – Metástase em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão N2c - Metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão NN3 Metástase em linfonodo com mais de 6 cm em sua maior dimensão ENVOLVIMENTO POR METÁSTASES DISTANTES (M) MX A presença de metástase à distância não pode ser avaliada M0 Ausência de metástase à distância M1 Metástase à distância Quadro 2: Categorias de Estadiamento clínico (TNM) para o carcinoma epidermóide oral, preconizado por SOBIN, WITTEKIND (2002). ESTÁGIO CLASSIFICAÇÃO TNM 0 Tis N0 M0 I T1 N0 M0 II T2 N0 M0 III T3 N0 M0 ou T1, T2 ou T3, N1 M0 IVA - T1, T2, T3 N2 M0 ou T4a N0, N1, N2 M0 IV IVB – Qualquer T N3 M0 ou T4b com qualquer N M0 IVC - Qualquer T com qualquer N M1 4.6. ANÁLISE MORFOLÓGICO A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina, foi submetida a cortes com 5µm de espessura, os quais, por sua vez, foram estendidos em lâminas de vidro e submetidos à coloração de rotina da hematoxilina e eosina. Sob microscopia de luz (Olympus CX31, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN), os espécimes foram analisados em aumentos de 100× e 400×. Foi realizada então a análise da gradação histológica de malignidade dos espécimes, no front de invasão tumoral (Bryne 1998), de acordo com o sistema proposto por Bryne et al.(1992) (Quadro 3). Quadro 3: Sistema de gradação histológica de malignidade no “front” de invasão (Bryne, 1998) proposto por Bryne et al. (1992). Escore de Malignidade Aspectos Morfológicos 1 Alto Grau de (> 50% Ceratinização das células) Pouco Pleomorfismo (> 75% Nuclear das células maduras) 2 Moderado (20 a 50% das células) Moderado (50 a 75% das 3 4 Baixo (5 a 20% das células) Intenso (25 a 50% das células maduras) células maduras) Ausênte (0 a 5% das células) Extremo (0 a 25% das células maduras) Dissociação Bordas Padrão de Invasão infiltrativa s bem delimitada s Cordões, bandas e/ ou trabéculas sólidas infiltrativas. Pequenos grupos celular difusa e ou cordões de pronunciada, células em pequenos infiltrativas grupos (N>15) células e/ou individuais (N<15). Infiltrado Inflamatório Intenso Moderado Escasso Ausente Para a gradação de Bryne et al. (1992), os escores obtidos em cada um dos parâmetros foram somados, obtendo-se, dessa forma, o escore final de malignidade do caso. As lesões que apresentaram escores finais entre 4 e 8, foram classificadas como de baixo grau de malignidade. Por sua vez, os tumores com escore final igual ou superior a 9, foram classificados como de alto grau de malignidade (Silveira et al., 2007). Destacase que a gradação histológica de malignidade foi realizada por dois examinadores, previamente calibrados. Os casos cujas classificações de malignidade, determinadas pelos examinadores, consistiram em discordância. Os dados referentes aos dados clínicos e gradação histológica de malignidade foram anotados em fichas apropriadas. Além da gradação foi avaliado a invasão vascular ou perivascular, nas áreas centrais e periféricas. 4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO 4.7.1 Método imuno-histoquímico Os espécimes selecionados, fixados em formol a 10% e emblocados em parafina, foram submetidos a cortes com 3µm de espessura, os quais, por sua vez, foram estendidos em lâminas de vidro devidamente preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropiltrietoxisilano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Após esse processo, o material foi submetido ao método da imunoperoxidase pela técnica baseada em polímeros de dextrano (ADVANCETM HRP, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), utilizando anticorpos primários anti-RANKL, anti -OPG e anti-IL-6 (Quadro 4). Como controle positivo para os anticorpos anti-RANKL e anti-OPG, foram utilizados os cortes histológicos de lesão central de células gigantes. O controle positivo para o anticorpo anti-IL-6 foi utilizado as células da amostra deste estudo, cujos citoplasma estava corados. O controle negativo consistiu na substituição dos anticorpos primários por albumina de soro bovino a 1% (BSA) em solução tampão. A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito abaixo. Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos cada); Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis: Álcool etílico absoluto I (5 minutos); Álcool etílico absoluto II (5 minutos); Álcool etílico absoluto III (5 minutos); Álcool etílico 95°GL (5 minutos); Álcool etílico 80°GL (5 minutos); Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°, à temperatura ambiente (10 minutos); Lavagem em água corrente (10 minutos) Duas passagens em água destilada (5 minutos cada); Recuperação dos sítios antigênicos (Quadro 3); Lavagem em água corrente (10 minutos); Duas passagens em água destilada (5 minutos cada); Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10 volumes, em proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (10 minutos cada); Lavagem em água corrente (10 minutos); Duas passagens em água destilada (5 minutos cada); Duas passagens em solução tampão TRIS-HCL (tris-hidroximetil-aminometano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) pH 7,4 (5 minutos cada); Incubação dos cortes com anticorpos primários (Quadro 3), em solução diluente (Antibody diluent with background reducing components, Dako North America Inc., Carpinteria, CA,USA); Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada); Incubação com o anticorpo secundário (Biotinylated link universal, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), em diluição 1:200, à temperatura ambiente (30 minutos); Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada); Incubação com o complexo estreptoavidina-biotina HRP (Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos); Duas passagens em solução tampão TRIS-HCL pH 7,4 (5 minutos cada); Revelação da reação com solução cromógena constituída por 25mg a 30mg de diaminobenzidina (3,3-diaminobenzidina, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), diluída em 100ml de TRIS-HCl pH 7,4, ativada por 1,2ml de peróxido de hidrogênio 10 volumes, em câmara escura (3 minutos); Lavagem em água corrente (10 minutos); Passagens rápidas em água destilada (2 trocas); Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (10 minutos); Desidratação em cadeia ascendente de etanóis: Álcool etílico 80°GL (2 minutos); Álcool etílico 95°GL (2 minutos); Álcool etílico absoluto I (5 minutos); Álcool etílico absoluto II (5 minutos); Álcool etílico absoluto III (5 minutos); Duas passagens em xilol (2 minutos cada); Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA). Quadro 4: Especificidade, recuperação antigênica, diluição, tempo de incubação e fabricante dos anticorpos primários utilizados no estudo. Anticorpo Recuperação Antigênica Anti- Citrato pH6.0 RANKL Pascal Diluição Tempo de incubação 1:200 Overnight 1:200 Overnight 1:100 Overnight Citrato pH6. 0 Anti-OPG Pascal Anti-IL-6 ______ Fabricante Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology R&D Systems 4.7.2. Análise imuno-histoquímica Após o processamento dos cortes histológicos e tratamento imuno-histoquímico, cada espécime foi analisado à microscopia de luz (Olympus CX41, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN), por dois examinadores previamente treinados. Destaca-se que a análise imuno-histoquímica foi realizada sem que os examinadores tivessem conhecimento da localização do caso, em questão. A avaliação quantitativa da marcação imuno-histoquímica dos antígenos foi realizada em todos os espécimes incluídos na amostra. O parâmetro consistiu na positividade da marcação, sendo consideradas positivas as células do tecido conjuntivo e no parênquima que exibiram coloração acastanhada, quer seja no núcleo ou seu citoplasma, independente da intensidade da marcação. Em aumento de 100x os campos foram escolhidos e, com aumento final de 400x, foram contadas as células positivas. Dessa forma, calculou-se os índices de marcação dos anticorpos do estudo em porcentagem de células positivas no total de cada caso. A avaliação das imunoexpressões de RANKL, OPG e IL-6, foi realizada de forma quantitativa, utilizando adaptação da metodologia descrita na pesquisa de Chuang et. al. (2009). No front de invasão tumoral e no centro tumoral, sob aumento de 100x, foram selecionados cinco campos de maior imunorreatividade para as células tumorais, células estromais (fibroblastos) e células inflamatórias. Sob aumento de 400x em cada um destes campos foi estabelecido o percentual de células positivas (P) atribuindo o valor: 0 (<1% das células positivas), 1 (1% - 24% das células positivas), 2 (25% - 49% das células positivas), 3 (50% - 74% das células positivas) e 4 (≥ 75% das células positivas) e classificado a intensidade (I) da marcação: 0 (sem reatividade), 1 (fraca reatividade), 2 (moderada reatividade) e 3 (forte reatividade). Os escores totais (S) foram obtidos pela multiplicação da porcentagem de células positivas (P) pela intensidade (I), em cada campo (S = P x I). 4.8. CALIBRAÇÃO INTER-EXAMINADOR A padronização na análise de dados é de extrema importância na realização da pesquisa. Um dos requisitos para se assegurar a fidedignidade dos achados é a minimização de variação e erros. Portanto, fez-se necessária a realização de um processo de calibração com o objetivo de obter a confiabilidade do estudo e verificar a reprodutibilidade inter-examinador. Para tanto, foi realizada a calibração inter-examinador para o estudo imunohistoquímico, em que cada examinador avaliou 10 casos iguais e a partir dos dados obtidos foi calculado o coeficiente Kappa. O valor obtido para o estudo morfológico foi de 0,889, sendo considerado excelente. Para as análises imuno-histoquímicas foram obtidos valores de 0,851 para o anticorpo anti-IL-6, considerado bom; 0,905 e 0,927 para os anticorpos anti-RANK-L e anti-OPG, respectivamente, considerados excelente. Dessa forma ficou comprovada a reprodutibilidade entre os examinadores. 4.9. ELENCO DE VARIÁVEIS As variáveis dependentes estão apresentadas no quadro 5 e as variáveis independentes são apresentadas no quadro 6 e 7. Quadro 5: Variável dependente que será analisada no estudo. Tipo da Variável Carcinoma epidermóide oral Definição Categoria Tumor maligno de células Localizado no palato duro escamosas Localizado na língua Quadro 6: Elenco de variáveis independentes associadas às proteínas analisadas no estudo. Tipo de variável Definição Categoria Imunomarcação Intensidade e % de células do RANKL neoplásicas positivas para o anticorpo anti-RANK-L Marcação das células neoplásicas estromais e inflamatórias no front de invasão e centro tumoral pelo anticorpo anti- RANK-L . Marcação das células neoplásicas Imunomarcação do OPG estromais e inflamatórias no front de invasão e centro tumoral pelo anticorpo anti- OPG Marcação das células neoplásicas Imunomarcação do IL-6 estromais e inflamatórias no front de invasão e centro tumoral pelo anticorpo anti- IL-6 Intensidade e % de células neoplásicas positivas para o anticorpo anti-OPG Intensidade e % de células neoplásicas positivas para o anticorpo anti-IL-6 Quadro 7: Elenco de variáveis independentes gerais. Tipo de variável Definição Categoria Idade Duração ordinária da vida. Média dos anos Classificação do tumor considerando Estádio 0 as características de tamanho do tumor Estádio I Estadiamento (T), metástase regional (N) e Estádio II clínico TNM metástase à distância (M) Estádio III Estádio IVa, IVb ou IVc Desfecho da Estado do paciente após período Remissão da lesão doença mínimo de 24 meses posterior ao Óbito do paciente diagnóstico da lesão primária Metástase Formação de uma nova lesão tumoral Presença a partir do tumor primário, mas sem Ausência continuidade entre as dois. Localização Palato duro (com invasão anatômica da Local anatômico de onde foi removido óssea) lesão o tumor. Língua (sem invasão óssea) Gradação Classificação histopatológica do tumor histológica de considerando os parâmetros: grau de ≤ 8- baixo grau de malignidade ceratinização, pleomorfismo nuclear, malignidade Bryne et al. padrão de invasão e infiltrado ≥ 9- alto grau de (1992) inflamatório malignidade Invasão de células neoplásicas em vasos sanguíneos / perivascular Sim Presença de pelo menos um grupo de células tumorais no interior dos vasos Não 4.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados obtidos foram digitados em planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2010®), exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 20.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) e submetidos à estatística descritiva e inferencial, com intuito de testar as hipóteses levantadas na presente pesquisa. Para avaliar o estadiamento clínico TNM com as demais variáveis estudadas, os estádios I e II foram combinados em um único grupo e os estádios III e IV em outro grupo. De maneira semelhante, ao associar os parâmetros clínicos com os dados referentes à gradação histológica de malignidade proposta proposto por Bryne et al. (1992), os dados também foram agrupados, sendo o primeiro grupo constituído pelas lesões bem diferenciadas e o segundo grupo pelas lesões moderadamente/pobremente diferenciadas. A análise dos aspectos clínicos e morfológicos foi realizada através da estatística descritiva e do teste do Qui-quadrado de Pearson. A análise da intensidade da imunoexpressão dos marcadores nas diferentes localizações das lesões também foi feita através do teste do Qui-quadrado de Pearson. Para o estudo do percentual de células positivas em relação aos aspectos clinicopatológicos, foi utilizado o teste t de Student. Para todos os testes utilizados, o nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05). RESULTADOS 5. RESULTADOS 5.1. PERFIL DA AMOSTRA A amostra deste estudo foi composta por 61 casos de carcinoma epidermóide oral, sendo 30 (49,2%) casos de língua e 31 (50,8%) de palato. A média de idade dos indivíduos foi de 70,87 ± 12,77. A menor idade foi de 39 anos e a maior de 99 anos (intervalo = 60 anos). Quanto ao sexo, 31 (50,8%) pacientes foram mulheres e 30 (49,2%) homens. A média de idade para as mulheres foi de 73,06 ± 12,66 (intervalo = 54 anos), já para os homens essa média foi de 68,6 ± 12,69 (intervalo = 52 anos). As lesões de língua foram mais comuns nos homens (n = 16 / 53,3% ), já as lesões de palato foram mais comuns nas mulheres (n = 17 / 54,8%) (Tabela 1). Tabela 1. Associação entre a localização da lesão e o sexo dos pacientes. Natal, RN – 2013. Local da lesão Sexo Valor de p* Feminino Masculino CEO de língua 14 - 45,2% 16 - 53,3% CEO de palato 17 - 54,8% 14 - 46,7% 0,527 Fonte: Hospital Dr. Luiz Antônio *Teste do Qui-quadrado de Pearson Com relação ao estadiamento clínico, de acordo com o sistema tumor-nodometástase (TNM), os casos foram agrupados em Estágios I e II e Estágios III e IV. Foram observados 26 (42,6%) casos nos Estágios I e II e 35 (57,4 %) casos nos Estágios III e IV. Dos casos de língua, 10 (33,3%) exibiram Estágios I e II e 20 (66,7%) casos exibiram Estágios III e IV. Dos casos de palato, 16 (51,6% ) exibiram Estágios I e II e 15 (48,4%) exibiram Estágios III e IV. Não houve diferença estatística entre as diferentes localizações e os estágios clínicos (p = 0,152). Quanto à presença ou não de metástase, a maioria dos casos exibiu ausência (n = 51, 83,6%) estando a metástase presente em apenas 10 (16,4%) casos. A maior parte dos casos metastáticos ocorreu em lesões de língua (n = 8 / 80,0%) enquanto aquelas com ausência de metástase foram mais frequentes nas lesões do palato (n = 29 / 56,9%). Esse último resultado foi estatisticamente significativo (p = 0,034). Quanto ao estágio clínico, a maioria dos casos com Estágio I e II (n = 23 / 45,1%) e com Estágios III e IV (n = 28 / 54,9%) exibiu ausência de metástase (p = 0,381) (Tabela 2). Tabela 2. Associação entre a localização da lesão e a ausência ou presença de metástase. Natal, RN – 2013. Local da lesão Metástase Valor de p* Ausente Presente CEO de língua 22 - 43,1% 8 - 80,0% CEO de palato 29 - 56,9% 2 - 20,0% I e II 23 - 45,1% 3 - 30,0% III e IV 28 - 54,9% 7 - 70,0% 0,034 Estágio 0,381 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste do Qui-quadrado de Pearson Quanto ao desfecho clínico da doença, 39 (63,9%) casos exibiram remissão da doença, enquanto 22 (36,1%) indivíduos morreram da doença. A maioria dos casos com remissão exibiu Estágio T1 e T2 (n = 20 / 51,3%), já a maior parte dos casos com óbito exibiu Estágio T3 e T4 (n = 16 / 72,7%). Essa associação exibiu leve tendência à correlação estatística (p = 0,071). Com relação ao local da lesão, a maioria dos casos de língua (n = 19 / 48,7%) e dos casos de palato (n = 20 / 51,3%) exibiu remissão da doença (p = 0,924) (Tabela 3). Tabela 3. Associação entre o estágio clínico, local da lesão e o desfecho da doença. Natal, RN – 2013. Estágio Desfecho Valor de p* Remissão Óbito T1 e T2 20 - 51,3% 6 - 27,3% T3 e T4 19 - 48,7% 16 - 72,7% CEO língua 19 - 48,7% 11 - 50,0% CEO palato 20 - 51,3% 11 - 50,0% 0,071 Local da lesão 0,924 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste do Qui-quadrado de Pearson 5.2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS De forma geral, as lesões exibiram proliferação de células epiteliais malignas, que invadiam o tecido conjuntivo subjacente sob a forma de lençóis, ninhos e cordões. As células tumorais exibiram citoplasma eosinofílico abundante, com limites celulares bem definidos, pontes intercelulares e núcleo hipercromático. Vários graus de pleomorfismo celular e nuclear foram visualizados. Observou-se também a presença de ninhos celulares arredondados com a porção central ceratinizada, formando pérolas de ceratina. De acordo com as características histológicas, todos os casos foram graduados em graus histológicos distintos, de acordo com o sistema de gradação histológica de malignidade de Bryne (1998). Foram observados grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltrado inflamatório. As lesões foram então agrupadas em baixo grau (escore ≤ 8) e alto grau (escore > 8). De acordo com esta gradação histológica de malignidade, 17 (27,9%) casos foram classificados como lesões de baixo grau e 44 (72,1%) como lesões de alto grau. A maioria das lesões de língua (n = 22 / 73,3%) e de palato (n = 22 / 71,0%) foi de alto grau (p = 0,838; Tabela 4). Tabela 4. Associação entre a gradação histológica de malignidade e a localização da lesão. Natal, RN – 2013. Gradação Local da lesão Valor de p* CEO língua CEO palato Baixo grau 8 - 26,7% 9 - 29,0% Alto grau 22 - 73,3% 22 - 71,0% 0,838 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste do Qui-quadrado de Pearson Avaliou-se também a presença ou ausência de invasão vascular e perineural. Houve presença de invasão em 38 (62,3%) dos casos e ausência em 23 (37,%) dos casos. Observou-se correlação entre o alto grau histológico de malignidade e a presença de invasão vascular e perineural (p = 0,007). Quanto ao desfecho da doença, a maioria das lesões de baixo (n = 11 / 28,2%) e de alto grau (n = 28 / 71,8%) exibiu remissão da doença (p = 0,938). Com relação à presença ou não de metástase, a maior parte dos casos de baixo (n = 14 / 27,5%) e de alto grau (n = 37 - 72,5%) exibiu ausência de metástase (p = 0,870). Quanto ao estadiamento clínico, observou-se que a maioria dos casos de baixo grau (n = 10 / 38,5%) exibiu Estágios I e II. Dos casos de alto grau, a maior parte (n = 28 / 80,0%) exibiu Estágios III e IV (p = 0,115; Tabela 5). Tabela 5. Associação entre a gradação histológica de malignidade, a ausência ou presença de invasão vascular / perineural, o desfecho clínico da doença, a ausência ou presença de metástase e o estadiamento clínico. Natal, RN – v2013. Gradação Invasão vascular / perivasculaar Ausente Presente Baixo grau 11 - 47,8% 6 - 15,8% Alto grau 12 - 52,2% 32 - 84,2% Gradação Valor de p* 0,007 Desfecho Remissão Óbito Baixo grau 11 - 28,2% 6 - 27,3% Alto grau 28 - 71,8% 16 - 72,7% Gradação 0,938 Metástase Ausente Presente Baixo grau 14 - 27,5% 3 - 30,0% Alto grau 37 - 72,5% 7 - 70,0% Gradação 0,870 Estágio T1 e T2 T3 e T4 Baixo grau 10 - 38,5% 7 - 20,0% Alto grau 16 - 61,5% 28 - 80,0% 0,115 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste do Qui-quadrado de Pearson 5.3. RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS Para a análise da intensidade de expressão, os escores ≤ 2 foram agrupados em casos com fraca imunoexpressão e os > 2 em casos com forte imunoexpressão. Nos casos de língua, a imunoexpressão do RANKL foi predominantemente forte (60%), nos casos de palato a distribuição foi similar (p > 0,05). Para a OPG, todos os casos de língua e de palato exibiram fraca imunoexpressão (p > 0,05). Para a IL-6, a maior parte dos casos de língua exibiu fraca imunoexpressão (96,7%), enquanto dos casos de palato, a maior parte exibiu forte imunoexpressão (54,8%). Esse último resultado revelou diferença estatisticamente significativa (p < 0,001) (Tabela 6). Tabela 6. Associação entre a localização da lesão e a intensidade da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6. Natal, RN – 2013. Local da Intensidade de marcação RANKL Valor de p* lesão Fraca Forte Língua 12 - 40,0% 18 - 60,0% Palato 15 - 48,4% 16 - 51,6% 0,513 Intensidade de marcação OPG Fraca Forte Língua 30 - 100% 0 Palato 30 - 96,8% 1 - 3,2% 0,325 Intensidade de marcação IL-6 Fraca Forte Língua 29 - 96,7% 1 - 3,3% Palato 14 - 45,2% 17 - 54,8% <0,001 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste do Qui-quadrado de Pearson Foi observada também a imunoexpressão dos marcadores entre as diferentes localizações das lesões e tipos celulares. A normalidade da distribuição dos dados foi verificada através do teste de Kolmogorov-Smirnov, portanto, apenas testes paramétricos foram utilizados. Para o RANKL, a média de células positivas tumorais, estromais e inflamatórias foi maior nos casos de palato que nos de língua. Todavia, apenas a análise das células inflamatórias exibiu diferença estatística significativa (p = 0,002; Tabela 7). Para o OPG, houve maior imunoexpressão de células tumorais nos casos do palato (1,32 ± 2,48) em comparação aos de língua (0,77 ±1,85). As células estromais e inflamatórias exibiram uma média discretamente maior também nas lesões de palato em comparação às de língua. Não houve significância estatística em nenhuma dessas correlações anteriores (p > 0,05; Tabela 8). Tabela 7. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL. Natal, RN – 2013. Intervalo de confiança Valor Tipo Local da Desvio(95%) de p* Média celular lesão padrão Mínimo Máximo Células Língua 4,53 3,471 3,24 5,83 tumorais Palato 6,06 3,614 4,74 7,39 Células Língua 5,07 3,542 3,74 6,39 estromais Palato 6,68 4,061 5,19 8,17 Células Língua 3,93 2,572 2,97 4,89 infamatórias Palato 6,77 4,185 5,24 8,31 0,097 0,104 0,002 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste t de Student Tabela 8. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do OPG. Natal, RN – 2013. Intervalo de confiança Valor Local da Desvio(95%) de p* Tipo celular Média lesão padrão Mínimo Máximo Células Língua 0,77 1,851 0,08 1,46 tumorais Palato 1,32 2,482 0,41 2,23 Células Língua 0,77 1,851 0,08 1,46 estromais Palato 0,87 1,962 0,15 1,59 Células Língua 0,77 1,851 0,08 1,46 infamatórias Palato 0,87 1,962 0,15 1,59 0,325 0,832 0,832 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste t de Student Para a IL-6, houve maior imunoexpressão de células tumorais, estromais e inflamatórias em lesões do palato em comparação às de língua. Todas as correlações para a IL-6 exibiram resultados estatisticamente significantes (p < 0,001; Tabela 9). Tabela 9. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão da IL-6. Natal, RN – 2013. Intervalo de confiança Valor Local da Desvio(95%) de p* Tipo celular Média lesão padrão Mínimo Máximo Células Língua 3,97 2,498 3,03 4,90 tumorais Palato 9,52 3,254 8,32 10,71 Células Língua 3,83 2,479 2,91 4,76 estromais Palato 7,81 3,280 6,60 9,01 Células Língua 3,90 2,398 3,00 4,80 infamatórias Palato 8,00 3,347 6,77 9,23 <0,001 <0,001 <0,001 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste t de Student Observou-se a imunoexpressão dos marcadores de acordo com o estadiamento clínico das lesões. Para o RANKL, a média de células positivas tumorais, estromais e inflamatórias foi maior nos Estágios III e IV que nos Estágios I e II. Todavia, apenas a análise das células tumorais exibiu diferença estatística significativa (p = 0,033). Para a OPG e para a IL-6, a média de células positivas tumorais, estromais e inflamatórias foi maior nos Estágios I e II em comparação aos Estágios III e IV, todavia sem diferença estatística (p<0,05; Tabela 10). Tabela 10. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo com o estadiamento clínico das lesões. Natal, RN – 2013. Valor Intervalo de confiança Tipo Desvio(95%) de p* Estágio Média celular padrão Mínimo Máximo RANKL Células T1 e T2 4,23 2,747 -3,699 -0,068 tumorais T3 e T4 6,11 3,969 -3,605 -0,162 Células T1 e T2 5,31 3,575 -3,011 0,998 estromais T3 e T4 6,31 4,071 -2,974 0,960 Células T1 e T2 5,08 3,610 -2,474 1,427 infamatórias T3 e T4 5,60 3,875 OPG -2,455 1,409 Células T1 e T2 1,12 2,455 -1,031 1,261 tumorais T3 e T4 1,00 2,015 -1,071 1,301 Células T1 e T2 1,00 2,098 -0,671 1,300 estromais T3 e T4 0,69 1,745 -0,704 1,332 Células T1 e T2 1,00 2,098 -0,671 1,300 infamatórias T3 e T4 0,69 1,745 IL-6 -0,704 1,332 Células T1 e T2 7,77 4,033 -0,339 3,763 tumorais T3 e T4 6,06 3,903 -0,354 3,778 Células T1 e T2 6,69 3,519 -0,333 3,261 estromais T3 e T4 5,23 3,431 -0,344 3,271 Células T1 e T2 6,69 3,519 -0,595 3,065 infamatórias T3 e T4 5,46 3,543 -0,596 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste t de Student 3,067 0,033 0,310 0,590 0,846 0,538 0,538 0,102 0,110 0,182 A imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 foi também correlacionada com a ausência ou presença de metástase. Para os três marcadores, as células tumorais, estromais e inflamatórias exibiram maiores médias em lesões com ausência de metástase em comparação àquelas com presença de metástase. Houve significância estatística para as células tumorais (p = 0,020), estromais (p = 0,027) e inflamatórias (p = 0,017) marcadas com a IL-6 (Tabela 11). Tabela 11. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo com a ausência ou presença de metástase. Natal, RN – 2013. Intervalo de confiança Valor Tipo Desvio(95%) de p* Metástase Média celular padrão Mínimo Máximo RANKL Células tumorais Células estromais Células infamatórias Ausente 5,47 3,630 -1,528 3,469 Presente 4,50 3,504 -1,661 3,603 Ausente 6,00 3,950 -1,994 3,394 Presente 5,30 3,561 -1,996 3,396 Ausente 5,41 3,753 -2,399 2,823 Presente 5,20 3,882 -2,684 3,108 0,440 0,586 0,877 OPG Células tumorais Células estromais Células infamatórias Ausente 1,14 2,254 -0,988 2,062 Presente 0,60 1,897 -0,912 1,987 Ausente 0,86 1,908 -1,057 1,582 Presente 0,60 1,897 -1,158 1,684 Ausente 0,86 1,908 -1,057 1,582 Presente 0,60 1,897 -1,158 1,684 0,441 0,696 0,696 IL-6 Ausente 7,29 3,971 0,409 5,779 Presente 4,20 3,327 0,551 5,638 Ausente 6,24 3,564 -0,042 4,712 Presente 3,90 2,601 0,300 4,371 Ausente 6,41 3,573 0,225 4,999 3,80 2,658 0,539 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste t de Student 4,684 Células tumorais Células estromais Células infamatórias Presente 0,020 0,027 0,017 A média da imunoexpressão dos marcadores foi correlacionada com o desfecho da doença. De acordo com os marcadores RANKL e OPG, as células tumorais, estromais e inflamatórias foram mais frequentes em indivíduos que exibiram óbito. Para a IL-6, as células tumorais e estromais foram sensivelmente mais frequentes nos casos com remissão, enquanto as inflamatórias exibiram maior média nos casos de óbito. Observouse significância estatística apenas para as células estromais e inflamatórias imunomarcadas com a OPG (p = 0,048, em ambas; Tabela 12). Tabela 12. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo o desfecho da doença. Natal, RN – 2013. A imunomarcação foi correlacionada também com a gradação histológica de malignidade. Para o RANKL e a OPG, as células tumorais, estromais e inflamatórias Tipo celular Desfecho Média Desviopadrão Intervalo de confiança (95%) Mínimo Máximo Valor de p* RANKL Células Remissão 4,97 3,535 -2,856 0,986 tumorais Óbito 5,91 3,715 -2,900 1,030 Células estromais Remissão 5,69 3,894 -2,612 1,542 Óbito 6,23 3,891 -2,627 1,557 Células infamatórias Remissão 5,28 3,755 -2,276 1,749 Óbito 5,55 3,801 -2,298 1,771 0,343 0,609 0,795 OPG Células Remissão 0,64 1,530 -2,275 0,011 tumorais Óbito 1,77 2,943 -2,512 0,249 Células estromais Remissão 0,38 1,206 -2,175 -0,237 Óbito 1,59 2,576 -2,402 -0,010 Células infamatórias Remissão 0,38 1,206 -2,175 -0,237 Óbito 1,59 2,576 -2,402 -0,010 Células Remissão 6,79 3,901 -2,139 2,184 tumorais Óbito 6,77 4,309 -2,223 2,267 Células estromais Remissão 5,87 3,172 -1,838 1,945 Óbito 5,82 4,136 -2,012 2,119 Células infamatórias Remissão 5,87 3,172 -2,222 1,602 6,18 4,227 -2,411 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste t de Student 1,791 0,104 0,048 0,048 IL-6 Óbito 0,984 0,958 0,766 exibiram maiores médias nas lesões de alto grau. Para a IL-6, as células tumorais foram sensivelmente mais frequentes nas lesões de baixo grau, enquanto as células estromais e inflamatórias exibiram discreta maior frequência nas lesões de alto grau. Nenhuma dessas associações exibiu diferença estatisticamente significativa (p>0,05; Tabela 13). Tabela 13. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo a gradação histológica de malignidade. Natal, RN – 2013. Tipo Gradação Média celular Desviopadrão Intervalo de confiança (95%) Mínimo Máximo Valor de p* RANKL Células tumorais Baixo grau 5,00 3,373 -2,503 1,639 Alto grau 5,43 3,713 -2,451 1,587 Células estromais Baixo grau 4,82 3,395 -3,668 0,724 Alto grau 6,30 3,998 -3,546 0,602 Células infamatórias Baixo grau 5,12 3,887 -2,514 1,795 Alto grau 5,48 3,726 -2,607 1,888 0,666 0,158 0,746 OPG Células tumorais Baixo grau 0,76 2,333 -1,655 0,866 Alto grau 1,16 2,156 -1,733 0,944 Células estromais Baixo grau 0,59 1,698 -1,409 0,767 Alto grau 0,91 1,974 -1,354 0,712 Células infamatórias Baixo grau 0,59 1,698 -1,409 0,767 Alto grau 0,91 1,974 IL-6 -1,354 0,712 Células tumorais Baixo grau 6,82 4,142 -2,264 2,366 Alto grau 6,77 4,017 -2,350 2,452 Células estromais Baixo grau 5,76 3,649 -2,147 1,904 Alto grau 5,89 3,506 -2,233 1,990 Células infamatórias Baixo grau 5,88 3,480 -2,190 1,909 0,551 0,532 0,532 0,966 0,907 0,890 Alto grau 6,02 3,625 -2,193 1,912 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste t de Student Foi realizada também a correlação entre a imunomarcação e a ausência ou presença de invasão vascular / perineural. Para o RANKL, as células tumorais e estromais exibiram maiores médias naquelas lesões com presença de invasão vascular / perineural, enquanto as células inflamatórias foram mais frequentes nas lesões sem invasão. Para a OPG, as células tumorais, estromais e inflamatórias foram mais frequentes nas lesões com presença de invasão vascular / perineural. Para a IL-6, as células tumorais e estromais foram mais imunomarcadas nas lesões com ausência de invasão vascular / perineural. Já a média das células inflamatórias foi praticamente semelhante entre os casos com ausência e com presença de invasão. Apenas a média das células tumorais imunomarcadas com OPG exibiram diferença estatística significativa (p = 0,047; Tabela 14). Tabela 14. Parâmetros observados de acordo com os escores da imunoexpressão do RANKL, OPG e IL-6 de acordo a ausência ou presença de invasão vascular / perineural. Natal, RN – 2013. Tipo celular Invasão vascular / perineural Média Desviopadrão Intervalo de confiança (95%) Mínimo Máximo Valor de p* RANKL Células tumorais Células estromais Células infamatórias Células tumorais Células estromais Células infamatórias Ausente 5,00 3,177 -2,414 1,414 Presente 5,50 3,861 -2,328 1,328 Ausente 5,57 3,847 -2,572 1,545 Presente 6,08 3,921 -2,573 1,546 Ausente 5,61 4,053 -1,621 2,365 Presente 5,24 3,590 OPG -1,699 2,443 Ausente 0,43 1,199 -2,127 0,155 Presente 1,42 2,564 -1,958 -0,014 Ausente 0,43 1,199 -1,614 0,378 Presente 1,05 2,193 -1,488 0,252 Ausente 0,43 1,199 -1,614 0,378 Presente 1,05 2,193 -1,488 0,252 0,586 0,618 0,719 0,047 0,161 0,161 IL-6 Ausente 7,17 3,798 -1,514 2,757 Presente 6,55 4,176 -1,472 2,714 Ausente 6,00 3,233 -1,636 2,110 Presente 5,76 3,716 -1,578 2,052 Ausente 5,96 3,282 -1,939 1,853 6,00 3,756 -1,883 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN *Teste t de Student 1,796 Células tumorais Células estromais Células infamatórias Presente 0,554 0,794 0,962 Figura 4. Carcinoma epidermóide de Palato duro de alto grau de malignidade. (H/E, 400x) Figura 5. Carcinoma epidermóidede língua de alto grau de malignidade. (H/E, 100x) Figura 6. Fotomicrografia demonstrando intensa marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo antiRANKL, no carcinoma epidermóide de palato duro. Marcação predominante citoplasmática. (ADVANCETM, 200x). Figura 7. Fotomicrografia demonstrando moderada marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-RANKL, no carcinoma epidermóide de língua. Marcação predominante citoplasmática. (ADVANCETM, 200x) Figura 8. Fotomicrografia demonstrando fraca marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-OPG no carcinoma epidermóide de palato duro. (ADVANCETM, 200x). Figura 9. Fotomicrografia demonstrando ausência de marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-OPG no carcinoma epidermóide de língua. (ADVANCETM, 400x). Figura 4. Carcinoma epidermóide de Palato duro de alto grau de malignidade. (H/E, 400x) Figura 5. Carcinoma epidermóidede língua de alto grau de malignidade. (H/E, 100x) Figura 6. Fotomicrografia demonstrando intensa marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo antiRANKL, no carcinoma epidermóide de palato duro. Marcação predominante citoplasmática. (ADVANCETM, 200x). Figura 7. Fotomicrografia demonstrando moderada marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-RANKL, no carcinoma epidermóide de língua. Marcação predominante citoplasmática. (ADVANCETM, 200x) Figura 8. Fotomicrografia demonstrando fraca marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-OPG no carcinoma epidermóide de palato duro. (ADVANCETM, 200x). Figura 9. Fotomicrografia demonstrando ausência de marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo anti-OPG no carcinoma epidermóide de língua. . (ADVANCETM, 400x). Figura 10. Fotomicrografia demonstrando intensa marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo antiIL-6, no carcinoma epidermóide de palato duro. Marcação citoplasmática e nuclear. (ADVANCETM, 200x). Figura 11. Fotomicrografia demonstrando fraca marcação das células tumorais, estromais e inflamatórias com anticorpo antiIL-6 no carcinoma epidermóide de língua. (ADVANCETM, 400x). DISCUSSÃO 6. DISCUSSÃO O câncer oral é o sexto câncer mais comum em todo o mundo e a oitava causa de mortes relacionadas às neoplasias malignas (PARKIN et al., 2005; JOHNSON et al., 2011). O carcinoma epidermóide oral é a neoplasia maligna oral mais comum, sendo responsável por quase 3% de todos os casos de câncer no mundo, com incidência estimada em 275 mil casos / ano (JEMAL et al., 2011; YANAMOTO et al., 2012), e respondendo por mais de 95% de todos os cânceres orais, associado a uma alta morbidade e mortalidade (BATISTA et al., 2010; PONTES et al., 2011). Sendo caracteriza por ser uma neoplasia epitelial invasiva, com variados graus de diferenciação (JOHNSON et al., 2005). Com relação aos sítios anatômicos, esta neoplasia acomete com maior frequência a língua e lábios e com menor frequência assoalho, mucosa jugal, gengiva e palato (KERDPON, SRIPLUNG, 2001), de acordo com a variação geográfica, refletindo a exposição a diferentes fatores de risco para cada população estudada (SASAKI et al., 2005; CHOI et al., 2006; JOHNSON et al., 2010). Na Inglaterra, Estados Unidos e Coréia, provavelmente pelo consumo associado de tabaco e álcool a língua tem sido o principal sítio de acometimento (OLIVER; HELFRICK; GARD, 1996). E na Ásia, a mucosa jugal é a localização mais comum, devido ao hábito de mascar betel (FRITZ et al., 2000; IAMAROON et al., 2004; SHARMA et al., 2010). Já em países tropicais como Austrália e Brasil, a alta incidência de carcinoma epidermóide de lábio inferior se deve principalmente à intensa exposição solar a que essa população está submetida (COSTA et al., 2002). Corroborando com os dados da literatura a pesquisa realizada por Radoi et al. (2013) em 689 casos de carcinoma epidermóide oral, na França, observaram que a localização anatômica mais comum foi a língua (42,4%), seguido pelo assoalho da boca (27,3%), lábio (11,7%), palato mole (10,7%), gengiva (5,4%) e palato duro (2,5%). O carcinoma epidermóide oral é a sexta doença maligna mais comum no sexo masculino e a oitava mais comum no feminino (JOHNSON et al., 2011). Na maioria dos países acomete duas vezes mais homens do que mulheres (MUIR E WEILAND, 1995; UCHIDA, 1998; OTOH et al., 2005). Com relação à idade, acomete pessoas mais velhas, sendo 90% acima de 45 anos de idade (IARC, 2003). Estudos epidemiológicos evidenciam uma maior prevalência destes tumores em homens entre a sexta e sétima décadas de vida, por ser este grupo mais exposto, com o passar dos anos, aos fatores de risco (MOORE et al., 2000; NEVILLE et al., 2009). Porém, estudos recentes têm apresentado resultados diferentes com relação à frequência do câncer oral. Uma diminuição na incidência de carcinoma epidermóide oral em homens e um aumento entre as mulheres, assim como o acometimento em grupos jovens (DAHLSTROM et al., 2008; CURADO, HASHIBE, 2009; MAROCCHIO et al., 2010; ZINI et al., 2010; JOHNSON et al., 2011 PATEL 2011GANLY et al., 2012; YANAMOTO et al., 2012; LING et al., 2013; RADOI et al., 2013). Como observaram Ling et al., (2013), ao analisarem a incidência de 210 casos carcinoma epidermóide oral, que 113 (53,8%) homens e 97 (46,2%) mulheres, com uma relação homem / mulher de 1,16:1, com média de idade de 55 anos , faixa de 22 anos a 88 anos. E a meta-análise de Brandizzi et al. (2005) em Buenos Aires mostrou a relação homem / mulher para ser 1.24:1 para o período 1992 - 2000, comparado a 7.1:1 para o período 1950-1970. No presente estudo, a média de idade da amostra foi de 70,87 ± 12,77. A menor idade foi de 39 anos e a maior de 99 anos (intervalo = 60 anos). A incidência dos casos quanto ao sexo foi de 31 (50,8%) do gênero feminino e 30 (49,2%) do masculino. Estes resultados corroboram os relatos da literatura que trazem estes parâmetros atuais em relação à elevação da prevalência do carcinoma epidermóide oral entre as mulheres. Este fato pode ser atribuído às mudanças nos hábitos das mulheres como o consumo de álcool e tabaco, aumento na expectativa de vida e a diferença geográfica. Apesar do sucesso no desenvolvimento de diagnósticos e terapias o prognóstico para o câncer oral continua desconhecido (KADEMANI et al., 2005; YANAMOTO et al. 2012). De acordo com Johnson et al. (2011), a taxa de sobrevida dos pacientes com carcinoma oral, em todo o mundo, demonstra poucas evidências de melhoria ao longo das últimas décadas, apesar de grandes avanços nas pesquisas. Atualmente, os estudos destacam que a sobrevida de 5 anos para os pacientes com carcinoma epidermóide oral varia entre 50% a 60% (ARDUINO et al., 2008; YANAMOTO et al. 2012). Com o intuito de propor terapias mais adequadas, bem como, estimar a sobrevida dos pacientes o sistema de estadiamento clínico de tumores (TNM), o qual tem sido considerado como padrão mundialmente aceito de classificação, tem sido adotado para classificar os tumores, possibilitando uma linguagem comum entre os centros de oncologia. No entanto as pesquisas referentes ao TNM como indicador de prognóstico para o carcinoma epidermóide oral são controversas (LOURENÇO et al., 2007). Estudos realizados ao longo das últimas décadas têm demonstrado que o sistema de estadiamento clínico de tumores (TNM) do carcinoma de células escamosas oral é o fator prognóstico clínico mais importante na determinação do plano de tratamento e fornece uma confiável base para a sobrevida (KADEMANI et al., 2005; ARDUINO et al., 2008; GONZALEZ-GARCIA et al., 2009; KALAVREZOS et al., 2010; KERNOHAN et al., 2010; HUANG et al., 2010; YANAMOTO et al., 2012). Resultados semelhantes foram observados na pesquisa de Yanamoto et al. (2012). Os autores destacaram que, dentre os 187 casos de carcinoma epidermoide oral, os tumores diagnósticados nos estágios I e II obtiveram melhor prognóstico do que aqueles com estágio III e IV, pois estes na fase I e II obtiveram significativamente maior taxa de sobrevida em 5 anos (73,3%) em comparação aos pacientes nos estágios III e IV (41,8%). Segundo Radoi et al. (2013) o prognóstico é melhor em pacientes com estágios iniciais do carcinoma epidermóide oral de língua do que naqueles em que o tumor se espalhou para os linfonodos regionais ou locais mais distantes no momento do diagnóstico. Para Dantas et al. (2003), o estadiamento clínico TNM é um importante indicador de prognóstico para o carcinoma epidemóide de língua. Os autores observaram associação estatisticamente significativa entre o TNM e o prognóstico da lesão, considerado como a presença de recidiva ou a remissão do tumor. Resultados semelhantes foram encontrados por Choi et al. (2006) após realização de análise multivariada para analisar fatores indicadores de prognóstico para o carcinoma epidermóide oral, encontraram que o TNM foi o fator mais importante na sobrevida dos pacientes, reforçando a ideia de que o TNM é um método muito útil na previsão de prognóstico. E o estudo de Silveira et al. (2007) também encontrou associação significativa entre o TNM e o prognóstico dos tumores (óbito do paciente ou remissão do tumor), com 86,7% dos casos agrupados nos estágios I e II exibindo remissão do tumor e 77,77% dos pacientes incluídos nos estágios III e IV, apresentando óbito, em uma amostra de 30 pacientes com carcinoma epidermóide língua. O estudo de Ling et al. (2013) com objetivo de analisar os fatores prognósticos que podem influenciar na sobrevida, avaliou retrospectivamente 210 casos de carcinoma epidermóide oral de língua. Destes, 39 casos (18,6%) foram classificados no estágio I, 44 casos (21,0%) no estágio II, 61 casos (29,0%) no estágio III e 66 casos (31,4%) no estágio IV. Durante acompanhamento, as estimativas da sobrevida de 5 anos de acordo com a fase clínica, foram 75,7%, 54,4%, 45,0% e 34,1% para as fases I a IV, respectivamente (P <0,001). Os autores destacaram que conforme observado na literatura os casos classificados nos estágios III e IV tiveram uma sobrevida mais curta do que os calssificados nos estágios I e II, com associação estatisticamente significante (P = 0,001). No entanto o estudo de Pontes et al. (2011) analisou a taxa de sobrevida e fatores prognósticos independentes em 85 casos de carcinoma epidermóide de língua e assoalho de boca, ao realizar a análise multivariada, o estadiamento clínico TNM não se mostrou como fator de prognóstico (sobrevida de 5 anos) para estes carcinomas. Resultados semelhantes foram encontrados nos estudos de Costa; Araújo; Ramos, (2005) e Isihikuro et al. (2008). Assim como o estudo retrospectivo de Meng et al. (2012) realizado em 68 casos de carcinoma epidermóide localizados no palato duro, observaram que 46 casos (59%) classificados nos estágios I e II e 32 casos nos estágios III e IV e a taxa de sobrevida e livre da doença em 5 anos foram de 49,8% e 49,7%, respectivamente. Os autores não encontraram associação estatisticamente entre o TNM e o prognóstico da lesão, considerado a sobrevida e o tempo de 5 anos livre do tumor. Nesta pesquisa, foi encontrada uma leve tendência à correlação estatística entre os casos classificados nos estágios III e IV e o óbito dos pacientes (p = 0,071). Estes resultados estão em concordância com os estudos citados acima (DANTAS et al., 2003; VARTANIAN et al., 2004; CHOI et al., 2006; SILVEIRA et al., 2007), revelando que de fato, o estadiamento clínico TNM é um fator indicativo de prognóstico também para os carcinomas epidermóides de língua e palato duro. Além disso, apesar de nossa amostra ser intencional, houve predomínio do estágio III e IV (n = 35, 57,4%), resultado semelhante ao estudo de Ling et al. (2013) e Radoi et al. (2013), mas este fato é contrário ao normalmente observado em estudos com amostra aleatória de carcinoma epidermóide oral, em que a maioria dos casos encontra-se nos estágios I e II (COSTA et al., 2002; BATISTA et al., 2010; PONTES et al. 2011; MENG et al., 2012; YANAMOTO et al., 2012). Somando-se aos resultados contraditórios das pesquisas referentes ao TNM, a existência de casos diagnosticados em estágios iniciais, tratados de forma correta, mas que evoluíam rapidamente ao óbito, não condizendo com a indicação clínica do TNM, gerou a necessidade de instituição de outros fatores prognósticos para suplementar o sistema (LOURENÇO et al., 2007). Dessa forma, surgiram os sistemas de gradação histológica de malignidade para o carcinoma epidermóide oral, com o intuito de fornecer conhecimentos complementares que favorecessem explicações relativas ao comportamento biológico discrepante de tumores com características clínicas semelhantes (LOURENÇO et al., 2007). Em virtude da alta morbidade e mortalidade do carcinoma epidermóide oral, parâmetros clínicos e histopatológicos têm sido utilizados para padronizar e classificar os tumores, e assim estabelecer o tratamento e o prognóstico dos mesmos. Para o carcinoma epidermóide oral, o tamanho do tumor, gradação histológica de malignidade, metástase em linfonodo regional e recidiva da lesão são os principais fatores relacionados à sobrevida dos pacientes (SOUZA et al., 2011). Outro parâmetro clínico analisado na presente pesquisa foi à presença de metástase. E de acordo com a pesquisa de Lim et al. (2004) a presença de metástase linfonodal regional é considerada um dos principais indicadores de prognóstico para o carcinoma epidermóide oral. Para Radoi et al. (2013) a taxa de sobrevivência para pacientes com carcinoma epidermóide de língua está intimamente relacionado ao local, tamanho e profundidade da invasão da lesão primária. Os estudos têm buscado estabelecer associação entre as características clínicas e histopatológicas do carcinoma epidermóide oral com o prognóstico desses tumores (ZITSCH et al., 1999; KUROKAWA et al., 2005; BATISTA et al., 2010; PONTES et al., 2011). Kurokawa et al. (2005), ao analisarem o valor prognóstico de parâmetros clínicos e histopatológicos tais como espessura do tumor, tamanho do tumor, TNM, metástase linfonodal, gradação histológica de malignidade no front de invasão e no centro tumoral e invasão microvascular em carcinomas epidermóides orais, encontraram que a presença de metástase linfonodal reduziu significativamente a taxa de sobrevida de 5 anos dos pacientes. Beltramini et al. (2011) ao revisarem 65 casos de carcinoma epidermóide de palato duro e palato duro com envolvimento do palato mole, demonstraram que a taxa de metástases foi de 37,5% nos carcinomas de palato duro com envolvimento do palato mole, no entanto a taxa de metástases para os casos localizados exclusivamente em palato duro foi de 10%. Resultados semelhantes foram encontrados por Meng et al. (2012), que destacaram que a invasão do palato mole por carcinoma epidermóide oral primário de palato duro é um fator de risco considerando o prognóstico. Yanamoto et al. (2012) sugerem em sua pesquisa que o carcinoma epidermóide de língua apresenta um pior prognóstico (para taxa de sobrevida de 5 anos - 34,1%) quando comparado aos carcinomas epidermóides da cavidade oral em outras localizações (taxa de sobrevida de 5 anos - 65,9%). Os autores justificam esse resultado devido, principalmente, à maior incidência de micrometástases ocultas nos casos localizados na língua. Este fato também foi observado no estudo de Fan et al. (2010) que identificaram a presença de metástase como um fator de risco para a recorrência do carcinoma epidermóide oral, sugerindo, consequentemente, pior prognóstico. Meng et al. (2012) encontraram associação estatisticamente significante entre a taxa de metástase nodal positiva com os tumores em estágios mais avançados III e IV (44% dos casos analisados), sugerem que os carcinomas epidermóide oral em estágios mais avançados devem ser tratados de forma mais radical, pois apresentam elevado potencial para metástase e consequentemente pior prognóstico. No presente estudo, a presença de metástase linfonodal regional esteve significativamente associada ao local do tumor, com predomínio dos casos com presença de metástase linfonodal nos carcinomas epidermóides de língua (p = 0,034). Estes resultados corroboram os relatos da literatura que destacam que dentre os carcinomas epidermóides orais os localizados nas regiões com maior vascularização, no caso da amostra do nosso estudo os casos de língua são considerados de pior prognóstico devido ao maior risco da ocorrência de metástase (YANAMOTO et al., 2012; FAN et al., 2010). Além disso, dentre os casos com metástase houve predomínio do estágio III e IV (n = 70%), resultado semelhante ao estudo de Meng et al. (2012), Fan et al. (2010), Yanamoto et al. (2012) e Radoi et al. (2013). Estes resultados justificam a utilização destes parâmentos clínicos (metástase e TNM) na determinação do prognóstico e o planejamento do tratamento do carcinoma epidermóide oral. Com relação ao desfecho clínico da doença o nosso estudo revelou uma leve tendência à correlação estatística com o estadiamento clínico (p = 0,071). Dos casos analisados, 39 casos (63,9%) exibiram remissão da doença, enquanto que 22 (36,1%) indivíduos morreram da doença. A maioria dos casos com remissão exibiu o estágio I e II (n = 20 / 51,3%), já a maior parte dos casos com óbito apresentaram estágio III e IV (n = 16 / 72,7%). No nosso estudo, o tempo de acompanhamento foi de 24 meses, o qual é considerado um tempo satisfatório para esta análise (GUTIÉRREZ-PASCUAL et al., 2011). Estes resultados corroboram os relatos da literatura que trazem este parâmetro como indicador de pior prognóstico para os carcinomas epidermóides orais, (KADEMANI et al., 2009; VARTANIAN et al., 2004; SALGARELLI et al., 2009). Além disso, enfatiza o fato de que apesar do carcinoma epidermóide oral ser considerado um tumor de bom prognóstico, quando estes se apresentam em estágios avançados e com metástase o desfecho destes casos é mais sombrio. Diversos sistemas de gradação histológica foram propostos (BRODERS, 1920; WAHI, 1971; FISHER, 1975; LUND et al., 1975; CRISSMAN et al., 1984; ANNEROTH; BATSAKIS; LUNA, 1987). Todos esses sistemas geraram resultados controversos em diferentes pesquisas. Em 1992, Bryne et al. propuseram um novo sistema de gradação, baseado em modificação por eles proposta (1989) do sistema recomendado por Anneroth; Batsakis; Luna (1987). Nesse estudo, os autores utilizaram amostra de 61 casos de carcinoma epidermóide oral e compararam o valor prognóstico do sistema com e sem a contagem mitótica no front de invasão tumoral. Os resultados evidenciaram o sistema como de alto valor prognóstico e com boa reprodutibilidade Inter examinador. Apesar da remoção de um parâmetro do sistema, os autores não alteraram o escore final de malignidade. Bryne (1998) sugere que o front de invasão tumoral reflete melhor o prognóstico dos tumores pelo fato de vários eventos moleculares importantes, como aumento de proliferação celular, perdas e ganhos de moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas e angiogênese, ocorrerem principalmente na interface tumor-hospedeiro. A literatura mostra divergência em relação aos resultados do SGHM proposto por Bryne et al. (1992). Silveira et al. (2007), ao analisarem 30 casos de carcinoma epidermóide de língua utilizando o sistema de gradação proposto por Bryne et al. (1992), recomendaram modificação na pontuação do escore final de malignidade, uma vez que o parâmetro contagem de mitose havia sido suprimido. Os autores consideraram os escores entre 4 a 8 pontos como de baixo grau de mailignidade e acima de 8 pontos, de alto grau de malignidade. Contudo, os resultados da pesquisa não demonstraram associação siginificativa entre a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne et al. (1992) e o desfecho da doença, metástase linfonodal e TNM. O estudo de Kurokawa et al. (2005) analisou 124 casos de carcinoma epidermóide de língua, buscando fatores preditivos de prognóstico e metástase linfonodal. Após a realização da análise multivariada, os pacientes cujos tumores exibiram espessura ≥ 4mm, metástase linfonodal e o índice de gradação no front de invasão ≥ 8 pontos tiveram significativa redução da taxa de sobrevida de 5 anos. Além disso, o índice de gradação no front de invasão ≥ 11 foi um valor preditivo de metástase linfonodal. Dessa forma, os autores concluíram que o alto escore de malignidade no front de invasão tem alto valor prognóstico para o carcinoma epidermóide de língua. Tendo em vista a forte associação entre a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne et al. (1992) com a presença de metástase linfonodal, estadiamento clínico TNM e o desfecho dos tumores, bem como fraca associação da classificação proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005). Baseado nos relatos acima descrito, a presente pesquisa adotou o sistema de gradação preconizado por Bryne et al. (1992), pois se revela como melhor indicador de prognóstico para o carcinoma epidermóide oral. E nossos resultados exibiram predominância de casos classificados como alto grau de malignidade (n = 72,1), tanto para os casos localização de língua (n = 22 / 73,3%) quanto os de palato duro (n = 22 / 71,0). Isto provavelmente se deve ao fato da utilização de amostra intencional, com 50% dos casos apresentando sendo de língua. Pois estes são descritos por serem mais invasivos e indiferenciados (ABREU et al., 2004). Os nossos resultados estão de acordo com os achados de Choi et al. (2006); Silveira et al. (2007); Pontes et al. (2011); Ling et al. (2013) e Yanamoto et al. (2012). A invasão perineural é observada em pequenos subgrupos de pacientes com carcinoma epidermóide oral. E este padrão de propagação é geralmente considerado como fator de risco para a sobrevivência de pacientes com câncer primário de cabeça e pescoço e é considerado um indicador de tratamento coadjuvante (BERNIER et al., 2004; COOPER et al., 2004). Os resultados do presente estudo ao associarmos os parâmetros de prognóstico (metástase, estadiamento clínico, invasão vascular e perineural e desfecho) com a gradação histológica proposta por Bryne et al. (1992), demonstraram associação estatisticamente siginificativa entre o alto grau de malignidade e a presença de invasão vascular e perineural (p = 0,007) e uma forte tendência à significância estatística com os estágios avançados do carcinoma (III e IV) (p = 0,115). Como referido anteriormente, a metástase e o desfecho não estiveram associados à gradação histológica de malignidade. Tendo em vista está forte associação entre os dois parâmetros de prognóstico: estadiamento clínico e invasão vascular e perineural e a gradação histológica proposta por Bryne et al. (1992), os nossos resultados sugerem que estes podem ser uma ferramenta útil na predição do prognóstico de carcinomas epidermóides de língua e palato. Nossos achados estão de acordo com o estudo de Meng et al. (2012) que ao avaliarem nos carcinomas epidermóides de palato a relação entre os parâmetros de prognóstico (invasão perineural, metástase e estadiamento clínico) com o desfecho (taxa de sobrevida de 5 anos), os autores acima referidos observaram correlação estatisticamente significativa entre a taxa de sobrevida de 5 anos livre da doença com a presença de invasão perineural (10,4%) e com a ausência de invasão perineural (52,8%). A correlação com a metástase e com o estadiamento clínico não exibiram diferença estatística, mas demonstrou uma tendência de correlação entre a presença de metástase e tumores em estágios mais avançados com um pior desfecho (menor taxa de sobrevida de 5 anos). Concluíram, diante destes resultados, que a presença da invasão perineural, metástase e recorrência regional podem ser indicativo para um comportamento tumoral mais agressivo nos carcinomas epidermoides de palato, necessitando de um protocolo de tratamento mais invasivo. Com relação à intensidade do infiltrado inflamatório, nossos resultados não exibiram correlação estatística com a localização da lesão, as lesões de língua exibiram a mesma quantidade de casos (n = 15 / 50,0%) com intensidade ausente / fraca e moderada / forte, enquanto a maioria das lesões de palato (n = 21 / 67,7%) exibiu intensidade moderada / forte (p = 0,162). Ao correlacionar a intensidade do infiltrado inflamatório com a metástase e o estadiamento clínico, não houve associação significativa. Este último resultado exibiu forte tendência à significância estatística (p = 0,056). A presente pesquisa avaliou ainda fatores relacionados a reabsorção óssea, utilizando os marcadores RANKL, OPG e IL-6. Pois sabe-se que a remodelação óssea é regulada por uma variedade de fatores sistêmicos e locais. E os estudo atuais sobre a via RANKL/RANK/OPG têm esclarecido o envolvimento dessas proteínas como sendo moléculas chaves na regulação do metabolismo ósseo e biologia da reabsorção óssea, através da formação, diferenciação e ativação dos osteoclastos (LU et al., 2006; ANDRADE et al., 2008; COCHRAN, 2008; KHOSLA, 2001; SCHNEEWEIS et al., 2005; TYROVOLA et al., 2008; BOYLE et al., 2003; CUI, 2010; SHIN et al., 2011; AZIM et al. 2012; MARTINS et al., 2012). A reabsorção e formação ósseas são reguladas pelo equilíbrio entre a relativa concentração do RANKL expresso por várias células, bem como do receptor RANK no precursor do osteoclasto e do receptor solúvel OPG. Quando a expressão de RANKL é relativamente elevada em relação ao OPG, RANKL fica disponível para ligar-se ao RANK no precursor do osteoclasto, inclinando o balanço a favor da ativação e formação dos osteoclastos e reabsorção óssea, ou seja, quando o RANK liga-se ao seu ligante específico, inicia-se a osteoclastogênese. Portanto as anormalidades na razão RANKL / OPG têm sido implicadas na patogênese da várias doenças, como a osteoporose pósmenopausa, artrite reumatóide, doença de Paget, doença periodontal, tumores ósseos benignos e malignos, metástases ósseas, hipercalcemia maligna e o carcinoma epidermóide oral. (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001). E mais recentemente, Sood et al. (2011) observaram em seu estudo com carcinoma epidermóide de tireóide uma super expressão de RANKL. Resultados estes semelhantes a vários estudos, nos quais foram evidenciados um nível aumentado do RANKL em tumores sólidos em desenvolvimento nos sítios ósseos, destacando que parece ser um mecanismo fundamental para estas patologias (TADA et al., 2005; TADA et al., 2009; JONES et al., 2006; ARMSTRONG et al., 2008; SABBOTA et al., 2010). E esta razão RANKL / OPG tem sido utilizada como um marcador biológico de prognóstico em patologias ósseas como a osteoporose, espondilite aquilosante, artrite reumatóide, tumores ósseos benignos e osteólise associada a perdas protéticas, fraturas ósseas e atualmente no carcinoma epidermóide oral (BAUD’HUIN et al., 2007; SEMBA et. al., 1995; BROWN et. al., 2002; SHAW et. al., 2004). No entanto, estudos relatam que a osteoclastogênese pode ser estimulada por mecanismos independentes do RANKL. Como observado pelo estudo in vitro com ratos realizado por Kobayashi et al. (2005) que o TNF-α pode estimular osteoclastogénese por um mecanismo independente do RANKL em macrófagos da medula óssea dos ratos. A pesquisa de Azuma et al. (2000), em modelos humanos, identificaram que na presença de fator estimulante de colónias dos macrófagos (M-CSF), o TNF-α é suficiente para induzir a diferenciação de precursores de osteoclastos, por um processo independente de RANKL. Atualmente é bem compreendido que a citocina pró-inflamatória, interleucina 6 (IL-6), está superexpressa em tecidos cronicamente inflamados, como no câncer (COUSSENS e WERB, 2002). Baseado neste fato, as presquisas vêm ressaltando sua atuação na carcinogênese, apesar, do seu exato papel neste mecanismo ser ainda pouco conhecido. Na tentativa de esclarecer os mecanismos da osteoclastogênse e consequantemente compreender melhor a carcinogênse, pesquisas recentes tem sido realizadas in vitro e em animais, com células do carcinoma epidermóde oral e têm mostrado que estas células tumorais produzem várias citocinas, entre elas a interleucina6 (IL-6), IL-11, TNFα e PTHrP (KAWAMATA et. al., 1997; OKAMOTO et. al., 2000; SHIBAHARA et. al., 2005; TADA et. al., 2005; NOMURA et. al., 2007; HENSON et. al., 2007; ERDEM et. al., 2007), que regulam a expressão de RANKL e OPG. No entanto os perfis de expressão destas moléculas no carcinoma epidermóide oral são pouco investigados. Os resultados de diversos estudos sobre esta tríade vêm proporcionando conhecimento para uma melhor compreensão do processo de reabsorção óssea, que é considerada uma etapa preliminar na evolução e progressão de alguns tipos de câncer, incluindo o carcinoma epidermóide oral (THOMAS et al, 1999; BENDRE et al, 2003; BROWN et al, 2001; SEZER et al, 2003; YACCOBY et al, 2004; NAGAI et al, 2000; ISHIKURO et al. (2008) AZIM et al. 2012). Mas, ainda não são bem compreendidos e permanecem controverso os mecanismos moleculares pelos quais estas vias podem ativamente induzir o processo de invasão óssea, se esta via pode servir como um indicador de prognóstico para carcinoma epidermóide oral (QUE et al 2012). Com base nestas observações, a atenção desta pesquisa foi voltada para os fatores relacionados à reabsorção óssea (RANKL, OPG e IL-6) que têm sido alvo de intensas investigações relacionadas com o câncer. Partindo do pressuposto de que estas citocinas estão relacionadas com os osteoclastos, desempenhando papéis importantes, analisamos a expressão imuno-histoquímica do RANKL, OPG e IL-6 em carcinoma epidermóide oral com invasão óssea (localizados no palato duro) e em carcinoma epidermóide oral sem invasão óssea (casos de língua), avaliando suas expressões tanto em células tumorais quanto em células estromais e inflamatórias, com a finalidade de fornecer subsídios para melhor compreensão da função dessas moléculas na patogênese e progressão desta doença, assim como verificar uma possível associação destes com a perda óssea. Destaca-se que não existem na literatura estudos in vivo avaliando estes três marcadores em carcinoma epidermóide oral. Estudos iniciais sobre a ação da tríade RANK/RANKL/ OPG em neoplasias malignas demonstram que as células tumorais podem produzir RANKL, atuando diretamente na diferenciação e ativação dos osteoclastos, como relatado por Croucher, et al. (2001) em mieloma múltiplo, Zhang et al. (2001) em câncer de próstata, Nagai et al. (2000) em linhagem de células de carcinoma epidermóide oral e Michigami et al. (2001) em neuroblastoma humano. No entanto, estudos posteriores destacaram que a interação entre as células tumorais, os fatores derivados do tumor e o microambiente ósseo são cruciais para a iniciação e promoção das doenças malignas no esqueleto (FARRUGIA et al., 2003; CUI et al., 2010; SHIN et al., 2011; MATSUBARA, et al., 2013). E que a destruição do osso é mediada pelos osteoclastos, e não pela ação direta das células tumorais, sugerindo, portanto, que as células tumorais secretam fatores solúveis (por exemplo, hormonio, citocinas e fatores de crescimento) que estimulam a reabsorção óssea osteoclástica, através da produção indireta do RANKL por células estromais osteoblásticas (WITTRANT et al., 2004). Resultados semelhantes foram observados por Roodman et al (2004), ao analisarem que o tumor induz as células a expressarem RANKL e, subsequentemente, a osteólise conduz à liberação de fatores de crescimento pró-tumoral e citocinas para o microambiente do osso, resultando em um ciclo vicioso de destruição ossea e proliferação tumoral, destacando, portanto que a osteólise ocorre por ação dos osteoclastos, ao invés da atuação direta das células tumorais. Assim, tem sido aceito que a destruição do osso associada com a invasão de carcinoma parece ser mediada por osteoclastos, em vez de diretamente pelo carcinoma (GUISE, MUNDY, 1998). Esses achados foram suportados por linhas de pesquisa in vitro na qual utilizaram células tumorais para induzir, direta ou indiretamente, a osteoclastogénese usando sistemas de cultura de osteoclastos (OKAMOTO et al., 2000; TADA et al., 2005; TADA et al., 2009). As alterações no equilíbrio entre os níveis RANKL / OPG estão associadas com a osteoclastogênese (ROODMAN, 2004), e o bloqueio total da sinalização do RANKL em modelos animais demonstraram uma dependência absoluta entre a inducão da osteólise no tumor e sinalização do RANKL (MORONY et al.; 2001; JONES et al.; 2006; MARTINS et al., 2012). E os estudos atuais destacam que a superexpressão do RANKL tem sido considerada como um pré-requisito para praticamente todas as condições de câncer que induzem a destruição osso (CUI, 2010; SHIN et al., 2011; AZIM et al. 2012; MARTINS et al., 2012; AZIM et al., 2012). Esses achados estão de acordo com os resultados do estudo imuno-histoquímico de Good et al. (2002) que observaram uma super expressão do RANKL em tumores ósseos benigno, maligno e metastático. Assim como, a pesquisa de Grimaud et al. (2003) encontram expressão positiva do RANKL em tumores ósseos malignos primários e no tumor de células gigantes. Os pesquisadores destes estudos enfatizam que OPG foi imunosuprimida e sugerem que a sua expressão reflete um mecanismo homeostático do esqueleto para contrabalançar o aumento da reabsorção óssea. E na presente pesquisa encontrou-se também uma elevada imunoexpressão da proteína RANKL, assim como uma supressão da expressão da OPG tanto nas lesões com reabsorção quanto nas sem reabsorção óssea. No carcinoma epidermóide oral estes achados foram confirmados por Tada et al. (2005) ao observarem in vitro que as células tumorais induzem fortemente a osteoclastogênese na ausência de fatores osteotrópicos e que para promover a osteoclastogenese reduzem a expressão da OPG, ao invés de aumentar a expressão do RANKL. Destacam ainda a partir destes resultados que a modulação da taxa de expressão do RANKL / OPG pelo microambiente contribui para formação dos osteoclastos, ao invés de apenas modular a expressão RANKL pelas células tumorais. Entretanto o papel das células do carcinoma epidermóide oral na função dos osteoclastos, assim como na sobrevivência e atividade de reabsorção óssea pelos osteoclastos não foram bem compreendida. E na tentativa de escalrecer esses questionamentos, Tada et al. (2009) realizaram, uma nova pesquisa com células do carcinoma epidermóide oral e concluiram que as células regulam a osteoclastogênese e suas funções. Resultados semelhantes foram encontrados por Subramanya et al. (2009), ao investigarem os mecanismos moleculares da invasão óssea pelo carcinoma epidermóide oral e observarem que o aumento significativo do número de osteoclastos na interface tumor - osso e a elevada expressão imuno-histoquímica de RANKL, apoiam a osteoclastogênese. Este resultado é condizente ao da presente pesquisa que observou a elevada expressão imuno-histoquímica de RANKL tanto nos diferentes tipos de lesão (carcinoma epidermoíde oral com e sem reabsorção óssea) quanto nos diferentes tipod de célula (células tumorais, estromais e inflamatórias) e demonstra associação desta elevada expressão do RANKL com a osteoclastogênese. O primeiro estudo in vivo que analisou a via RANK / RANKL / OPG em carcinoma epidermóide oral foi realizado por chuang et. al. (2009). Neste estudo os autores, observaram uma elevada expressão de RANK e RANKL tanto nos casos com invasão óssea, como nos casos sem invasão óssea. Assim como a marcação da OPG, foi fraca tanto nos casos com invasão óssea como nos casos sem invasão, indicando uma baixa concentração de OPG. Esses resultados demonstram que a elevada taxa de ligação entre RANK/RANKL é permitida pela baixa expressão da OPG, sendo estes achados essenciais para a reabsorção óssea, e são compatíveis com os estudos in vitro anteriores (NAGAI et. al., 2000; TADA et. al., 2005; TADA et al., 2009). Esses achados in vivo e in vitro, de que as células do carcinoma epidermóide oral atuam na expressão das proteínas RANK, RANKL e OPG estão de acordo com estudos em outros tipos de carcinoma humano, como câncer de mama (THOMAS et al., 2001), o câncer de próstata (BROWN et al.,2002), e mieloma múltiplo (SEZER et. al., 2003). Em nosso estudo, foi encontrada uma forte expressão do anticorpo anti-RANKL na maioria das células neoplásicas tanto nos casos de carcinoma epidermóide sem invasão óssea (localizados na língua) como nos casos de carcinomas epidermóides com invasão óssea (localizados no palato duro). As médias das células tumorais, estromais e inflamatórias marcadas positivamente para RANKL foram maiores nos casos de carcinoma epidermóide com invasão óssea do que nos casos sem invasão óssea. Todavia, apenas a média das células inflamatórias exibiu diferença estatística significativa. Com relação ao anticorpo anti-OPG foi encontrada um predomínio da fraca expressão nas células neoplásicas em ambos os casos de carcinoma epidermóide oral com e sem invasão óssea. As médias das células tumorais, estromais e inflamatórias marcadas positivamente, para o anticorpo anti-OPG, foram poucas ou ausentes em ambos os casos de carcinoma epidermóide oral com e sem invasão óssea. Estes resultados sugerem um aumento da taxa de ligação a RANK / RANKL, devido a supressão da expressão da OPG. Estes são compatíveis com os estudos de Nagai et. al. (2000), Tada et. al. (2005), chuang et. al. (2009); Tada et al. (2009) e Shin et al. (2011). No presente estudo, a ausência de diferença na expressão do RANKL e OPG entre os casos de carcinoma epidermóide oral com e sem reabsorção óssea sugere que os casos sem invasão óssea, possuem realmente potencial para induzir osteoclastogênese através da via RANK / RANKL / OPG e este poderão ser desencadeados em condições adequadas. Alem disso, a possível aproximação das células neoplásicas com o osso pode ser um pré-requisito para a ativação desta via (BROWN et. al., 2002; WONG et al., 2000; CHUANG et al., 2009). Estes achados são condizentes com estudos em outros tipos de cânceres humanos, como de mama (THOMAS et al. 1999), de próstata (BROWN et al. 2001), e mieloma múltiplo (SEZER et al. 2003), que também destacam o papel da via de sinalização RANKL / RANK na osteoclastogênese. Nossos resultados sugerem, também, que a ausência de expressão da OPG nas células neoplásicas e, nas células estromais e inflamatórias são induzidas pela atuação autócrina e parácrina das células tumorais, com o intuito de promover a osteoclastogênese e consequentemente a invasão óssea. Pois, sabe-se que a OPG produzida por osteoblastos / células estromais são um importante regulador negativo da diferenciação e função dos osteoclastos. Esses resultados corroboram com o observado nas pesquisas de Tada et. al. (2005), Chuang et. al. (2009); Tada et al. (2009) e Shin et al. (2011). As pesquisas de Martins et al. (2012) e de Jimi et al. (2011) observaram que a ausência de associação da expressão do RANKL no carcinoma epidermóide oral em relação à formação de osteoclastos ou invasão óssea pode ser justificada pela capacidade das células neoplásicas de estimular a expressão no estroma de RANKL, ou de inibir a expressão da OPG no estroma ser mais importante do que a própria expressão do RANKL nas células tumorais. Sugerindo, portanto, que o papel chave das células neoplásicas na osteoclastogênese é pela via indireta, estimulando as células estromais. Esses achados reforçam os resultados do nosso estudo e está em acordo com as pesquisas de Udagawa et al. (1990), Giuliani et al. (2001) e Zhang et al. (2013) ao enfatizarem que o tecido estromal é o regulador chave da relação RANKL/OPG, que rege a osteoclastogênese tanto em condições fisiológicas quanto patológicas, ao demonstrarem que os osteoblastos respondem aos estímulos osteopróticos (elevação da expressão de RANKL e diminuição da expressão da OPG), oriundos das células estromais. No entanto em nossa pesquisa não encontramos diferenças da imunoexpressão nas células estromais em relação às demais células analisadas e proteínas, relacionadas com a reabsorção óssea, utilizada por esta pesquisa. Contrariando os achados das pesquisas acima citados e da pesquisa de Ishikuro et. al. (2008) que enfatiza que dentre os resultados do seu estudo as mais importantes descobertas histopatológicas foram que as células tumorais não exibiram nenhum contato direto com os osteoclastos e o osso adjacente, e que o estroma fibroso interveio entre as células do tumor e das áreas de reabsorção óssea em todos os casos. Estes resultados indicam que o contato direto das células tumorais com osteoclastos ou com a superfície de reabsorção óssea não é necessária para promover reabsorção óssea osteoclástica no local da invasão tumoral. Sezer et. al. (2003) observaram em sua pesquisa que a expressão do RANKL e o nível da sua superexpressão é variável entre as células neoplásicas, e o contato célulacélula e entre as células neoplásicas e as células do hospedeiro nem sempre ocasionam a expressão do RANKL. Estes achados estão de acordo com nosso estudo e com a pesquisa de Zhang et al. (2013) que demonstraram que as células neoplásicas do carcinoma epidermóide oral expressam níveis variados de RANKL, tanto ligado à membrana quanto solúvel, e que sua capacidade de produzir RANKL, pode ser alteranda diretamente pelo microambiente tumoral para estimular ainda mais a osteoclastogênese e têm a capacidade de mediar invasão óssea local. Pesquisas recentes demonstram que o equilíbrio entre RANKL e OPG é fundamental para a regulação da diferenciação e função dos osteoclastos (ISHIKURO et al. 2008; JIMI et al., 2011; SHIN et al., 2011; MARTINS et al., 2012; ZHANG et al., 2013). Assim como, experimentos in vitro e em animais com células neoplásicas do carcinoma epidermóide oral têm mostrado que as células tumorais produzem várias citocinas como a interleucina-6 (IL-6), IL-11, TNFa e PTHrP (KAWAMATA et. al., 1997; OKAMOTO et. al., 2000; SHIBAHARA et. al., 2005; TADA et. al., 2005; CUI et al., 2005; NOMURA et. al., 2007; HENSON et. al., 2007; ERDEM et. al., 2007), que regulam a expressão de RANKL e OPG. No entanto, apesar destes experimentos destacarem que diversas citocinas liberadas pelas células tumorais regulam o sistema RANK / RANKL / OPG no câncer oral, Ishikuro et. al. (2008) enfatizam que poucos relatórios investigaram o perfil de expressão destas moléculas em carcinoma epidermóide oral. No presente estudo, os resultados para a intensidade de expressão do anticorpo anti-IL-6 nas células neoplásicas exibiram forte imunoexpressão nos carcinomas epidermóides com invasão óssea (localizados no palato duro) e fraca imunoexpressão no carcinoma sem invasão óssea, sendo esta diferença estatisticamente significante. Os resultados para as médias das células tumorais, estromais e inflamatórias marcadas positivamente foram em maior quantidade nos casos de carcinoma epidermoide com invasão óssea do que nos carcinomas sem invasão óssea, sendo esta diferença estatisticamente significante. Nossos resultados corroboram com as pesquisas de Que et. al. (2012), Kayamori et. al. (2010), Jimi et. al.(2011); Shibahara et. al. (2005) e Okamoto et. al. (2000). E sugere que a interleucina-6 se destaca como um importante fator derivado das células neoplásicas que está associada com a formação dos osteoclastos e com os mecanismos da invasão óssea (HWANG et al. 2012; MARTINS et al. 2011). De acordo com a revisão realizada por Nibali et al., (2012), a IL-6 contribui para patogênese do câncer oral através de diferentes mecanismos e processos biológicos. Dentre suas funções Matsubara, et al. (2013) destaca a capacidade destas em ativar os osteoclastos através da atuação indireta na via RANK/RANKL /OPG, com o intuito de aumentar o processo de reabsorção óssea, estando sua expressãoin dependente do RANKL. Terpos et al. (2011) destacam em relação à função do RANKL, que seus efeitos de sinalização não são limitados ao sistema esquelético, pois podem também serem expressos em outros sistemas reguladores incluindo a sobrevivência de célular, o sistema imunitário, o cardiovascular, o endócrino e o nervoso. Os autores concluem que as células neoplásicas podem pertubar ambos os sistema esqueletico e imunitário. Diante destas observações, acreditamos que a elevada expressão de RANKL nas células inflamatória esteja associada com a elevada expressão da IL-6, que como destacado é uma citocina pró-inflamatória que está diretamente associada ao sistema imune e indiretamente associada como a reabsorção óssea, através da atuação na via RANK/RANKL/OPG. Apesar de o seu mecanismo ser ainda controvérso (WATSON et al, 1990; HEFLER et al, 2003). Ao contrário dos nossos resultados a pesquisa de Matsubara et al. (2013) não encontrou diferença significativa entre os níveis de expressão da IL-6 nos casos de carcinoma epidermoide oral com invasão óssea, e observaram que estes níveis de expressão foram bastante variáveis entre os casos. Segundo os autores estes resultados podem ser esclarecidos pelo fato da IL-6 ser uma citocina multifuncional, e esta associada a diferentes processos inflamatórios não específicos, podendo, portanto ser fortemente afetada por vários mecanismos, ao contrário das outras citocinas. Resultados semelhantes foram observados por Yoneda et al. 1993 e Farrugia et al. (2003) e Cui et al. (2010). E segundo Tang et al. (2008) o potencial agressivo das céluas do carcinoma epidermóide oral para a invasão e metástase óssea, pode ser associado a esta super expressão da IL-6, pois sua pesquisa demostra claramente que o mecanismo de invasão óssea das células cancerígenas é influenciado pela super expressão da IL-6, que ativa a osteoclastogênese. Portanto IL-6 demonstra ser um fator essencial para a osteoclastogênese, pois é responsável pela indução da expressão do RANKL em células do estroma, incluindo osteoblastos (ZHANG, 2013). Esses achados corroboram com nossos resultados que exibiram elevada expressão da IL-6 nas células estromais em conjunto com a expressão do RANKL e supressão da OPG, esses dados reforçam a importância funcional do RANKL sinalização na fisiopatologia da invasão óssea do carcinoma epidermóide oral com invasão óssea. Com relação aos nossos resultados a forte expressão, nos três tipos de células analisadas, da IL-6 no carcinoma epidermóide com invasão óssea (localizados no palato duro) sugerimos que estas células e seus produtos desempenham um papel crucial no estabelecimento de um microambiente tumoral propício para a regulação da proliferação, sobrevivência e invasão óssea das células neoplásicas. Estes resultados são apoiados pela pesquisa de Kayamori et at. (2010) que demonstraram forte associação entre a expressão de proteínas relacionadas com a reabsorção óssea com as células estromais, que regulam a formação de osteoclasto induzida pelas células neoplasicas do carcinoma epidermóide oral. Assim como pela revisão de Jimi et al. (2011) que observaram a indução da osteoclastogênese através da expressão do RANKL em células estromais. Assim de acordo com Matsubara et al. (2013) a expressão elevada de RANKL pode ser o ponto de partida para ativação da via RANK / RANKL /OPG em favor da reabsorção óssea. E a elevada expressão da IL-6 reforçar a ativação dos osteoclastos, estimulando esta via. Portanto Shibahara et. al. (2005) destaca que a IL-6 é um marcador altamente confiável para o câncer oral com invasão óssea, apresentando sensibilidade de 95,5-100%. Em contraste com o intervalo de sensibilidade para os casos sem invasão óssea de apenas 35,7-53,8%. Os autores concluíram que esta citocina é um bom preditor da invasão óssea por células do câncer oral. Nossos achados sustentam tais descobertas e sugerem ainda que mais estudos são necessários para estabelecer outras citocinas, que não estas utilizadas por este estudo. O aumento da expressão de IL-6 na saliva ou no soro tem sido observado em pacientes com câncer colorretal, de mama cancro, linfoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma pancreático, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, e mieloma múltiplo e tem sido implicada no desenvolvimento de tumores (LIN et al., 2007; SCHAFER; BRUGGE, 2007, WONG et al., 2009; KNUPFE; PREISS, 2010; BAYLISS et al., 2011; RAVISHANKARAN; KARUNANITHI, 2011). Assim como a pesquisa de Chen et al. (2013) destacam que a elevada expressão da IL-6 é proposto como um fator clinicamente relevantes de mau prognóstico em pacientes com uma série de tipos de câncer, como colorectal, pulmão, renais e linfoma de Hodgkin (THIOUNN et al., 1997; KNUPFE; PREISS, 2010; BAYLISS et al., 2011; RAVISHANKARAN; KARUNANITHI, 2011). Em sua pesquisa com carcinoma epidermoide oral, chen et. al. (2013), verificou que a alta expressão da IL6 em células tumorais está relacionada com o sexo feminino, com a alta alta taxa de metástases em linfonodos e pouca diferenciação histológica. Portanto, os autores sugerem que esta pode ser um fator prognóstico independente para pacientes com tumores, especialmente em pacientes do sexo masculino. Resultados semelhantes foram encontrados por Wang et. al. (2002), Sahebjamee et. al. (2008), Nibali et. al. (2012). Assim como o estudo de Van tubergen, (2011), em um pequeno grupo de pacientes com carcinoma epidermóide oral, observaram que os casos de carcinoma com alta expressão da IL-6 exibiu pobre prognóstico quando compaarado com os casos com de baixa expressão da IL-6. Esses resultados apoiam a teoria de outros estudos de que a IL-6 quando superexpressa no carcinoma epidermóide oral têm piores resultados, incluindo pobre prognóstico, recorrência tumoral, bem como o desenvolvimento de tumor primário. De acordo com estas observações, elevados nível de IL-6 no soro de pacientes portadores de carcinoma epidermóide está correlacionada com baixa sobrevida e um aumento na produção de IL-6 durante o tratamento está associado com tumor recorrentes (DRUZGAL et al., 2005; DUFFY et.al., 2008). Além disso, níveis séricos elevados de IL-6 estão associados com a resistência à radioterapia (DE SCHUTTER et al., 2005). Chang et al. (2013) avaliaram a concentração sorológica da IL-6 em 237 pacientes com CEO, 104 com lesões pré-malignas orais e 125 saudáveis e observaram concentrações sigificativamente mais elevada da IL-6 nos pacientes com carcinoma epidermóide oral em comparação aos pacientes com lesões pré-malignas orais e saudáveis, No entanto a concentração da IL-6 não pode ser utilizada como um potencial marcador para distinguir pacientes com carcinoma dos saudáveis, não demonstrou eficácia como um marcador de diagnóstico. Entre os pacientes com carcinoma epidermóide oral, os autores encontraram associação significativa entre a concentração da IL-6 e o estadiamento clínico e sobrevida e ausencia de associação com a gradação histológica, invasão perineural e hábitos (alcool e fumo). Os pesquisadores concluíram que a concentração da IL-6 no soro está associada com o tamanho e agressividade do carcinoma epidermóde oral e que pode ser útil como um indicador de prognóstico após tratamento. Nossos resultados demonstraram associação positiva entre a média de expressão do IL-6 com maioria dos casos apresentavam lesões em estágios iniciais, ausência de metástase, presença de invasão vascular / perineural, alto grau histológico de malignidade e remissão, nos três tipos de células analisadas. Foi encontrada associação estatística apenas entre a ausência de metástase. Nossos resultados demostram uma tendência de associação da IL-6 com o melhor prognóstico dos pacientes, tendo em vista que o desenvolvimento de metástase linfonodal diminui sobremaneira o prognóstico. Nossos achados discordam da maioria dos trabalhos presentes na literatura que enfatizam a associação desta citocina com pior prognóstico (THIOUNN et al., 1997; LIN et al., 2007; SCHAFER; BRUGGE, 2007, WONG et al., 2009; KNUPFE; PREISS, 2010; BAYLISS et al., 2011; RAVISHANKARAN; KARUNANITHI, 2011; VAN TUBERGEN, 2011; CHEN et al. 2013). Esta discrepância em nossos resultados e entre os demais estudos, pode ser justificado pela utilização de amostras com tamanho e populações diferentes e/ou metodologias diferentes. Nosso achados também não corroboram com a pesquisa de Shibahara et al. (2005) que avaliam a expressão das citocinas osteoclásticas, dentre estas a IL-6 em carcinoma epidermóide oral com e sem invasão óssea, e nenhuma diferença significativa foi encontrada para os parâmetros clínicos ou achados histopatológicos entre os dois grupos, apesar da elevada expressão destas citocinas nos carcinomas com invasão óssea com diferença estatística em relação aos casos sem invasão. Para esses pesquisadores as citocinas osteoclásticas, entre elas a IL-6 derivam do câncer e desempenham importantes papéis relacionados, principalmente, os mecanismos de invasão óssea do carcinoma epidermoide oral. Nossos resultados demonstraram associação positiva entre a média de expressão do RANKL com o pior prognóstico dos pacientes, tendo em vista que a maioria dos casos apresentavam lesões em estágios avançado do tumor, ausência de metástase, presença de invasão vascular / perineural, alto grau histológico de malignidade e óbito, nos três tipos de células analisadas. Entretanto foi encontrada significância estatística apenas entre as células tumorais e o estágio avançado do tumor. Assim como, observamos associação positiva entre a média de expressão da OPG com o pior prognóstico dos pacientes, tendo em vista que a maiorias dos casos apresentavam lesões em estágios iniciais, ausência de metástase, presença invasão vascular / perineural, alto grau histológico de malignidade e óbito, nos três tipos de células analisadas. Foi encontrada associação estatística apenas entre as células estromais e inflamatórias com o óbito e das células tumorais com a invasão vascular / perineural. Esses resultados sugerem que a expressão elevada de RANKL e baixa da OPG estão associadas com a agressividade do tumor, pois estas moléculas estão diretamente ligadas com a reabsorção óssea, que é conhecido como indicador de pior prognóstico. Entretanto mais pesquisas devem ser realizadas para elucidar estes resultados. CONCLUSÃO 7. Conclusões De acordo com os resultados obtidos na presente pesquisa, pode-se concluir que: 1. A relação RANKL/OPG está alterada no carcinoma epidermóide oral com e sem invasão óssea. Demonstrando que mesmo os carcinomas epidermóides orais sem invasão óssea apresentam potencial para induzir osteoclastogênese através da via RANK / RANKL / OPG, condições adequadas. 2. A proteína IL-6 está diretamente envolvida na reabsorção óssea ocasionada pelos carcinomas epidermóides e pode ser utilizada como um indicador de diferenciação da presença ou ausência de invasão óssea pelo carcioma epidermóide oral. 3. A IL-6 demonstrou uma tendência de associação com o melhor prognóstico dos pacientes. 4. A proteína RANKL apresentou uma tendência de associação com o pior prognóstico dos pacientes com carcinoma epidermóide oral. 5. A proteína OPG demonstrou uma tendência de associação com o pior prognóstico dos pacientes. 6. Os parâmetros clinicopatológicos (desfecho clínico, grau de malignidade e invasão vascular e perineural e TNM) não são úteis para diferenciar os carcinomas com e sem invasão óssea, no entanto são ferramentas úteis na predição do prognóstico de carcinoma epidermóide de língua e palato. REFERÊNCIAS REFERÊNCIAS ABBAS, A.K.; Lichtman, A.h.; Pillai, S. Imunologia Celular e Molecular. 6° Edição/2008. ABREU, M.A.M.M. et al. Carcinoma espinocelular de lábio: avaliação de fatores prognósticos. Rev Bras Otorrinolaringol. v. 70, p. 765-70, 2004. AESCHLIMANN, D.; EVANS, B.A. The vital osteoclast: how is it regulated? Cell Death Differ. v.1, p.5-7, 2004. AMTHA, R. et al. Dietary patterns and risk of oral cancer: a factor analysis study of a population in Jakarta, Indonesia. Oral Oncol. v.45, p.49-53, 2009. ANANDARAJAH, A.P. Role of RANKL in bone diseases. Trends Endocrinol Metab. v.20, p.88-94, 2009. ANDERSON, D.M. et al. 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