INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS DE AMOSTRAS DE LEITE DE INDÚSTRIAS DO NORTE DO RIO GRANDE DO SUL GARDA, Kelen¹ [email protected] KOLCENTY, Luana¹ [email protected] TAGLIARI, Luis Henrique¹ [email protected] BENETTI, Fabricio Lucas¹ [email protected] PAULA, Paulo de¹ [email protected] OLIVEIRA, Franciele de² [email protected] ALMEIDA, Mauro Antonio de² [email protected] ARRUDA, Tiago Zart² [email protected] FACCIN, Angela² [email protected] GOTTLIEB, Juilana² [email protected] GUIMARÃES, Tarcisio Guerra² [email protected] OLIVEIRA, Daniela Dos Santos de² [email protected] RITTER, Filipe² [email protected] ¹ Discentes do Curso Medicina Veterinária, Nível 7 2016/1- Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS. ² Docentes do Curso Medicina Veterinária, Nível 7 2016/1 - Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS. RESUMO: O sistema agro-industrial do leite é um dos mais importantes da agropecuária brasileira, estando à frente de produtos como café beneficiado e o arroz. Dentre os alimentos de origem animal, o leite, pela grande quantidade de nutrientes que possui em sua composição, constitui um importante meio de cultura para o desenvolvimento de micro-organismos, tais como os aeróbios mesófilos, capazes de se multiplicarem numa faixa de 20ºC a 45ºC e também psicrotróficos capazes de se desenvolver a temperaturas inferiores a 7ºC causando alterações de sabor e odor, perda de consistência e gelatinização ao longo da vida comercial do leite. O objetivo do presente trabalho foi realizar análises microbiológicas de bactérias psicotróficas e unidades formadoras de colônia de bactérias mesófilas em amostras de leite cru oriundas de indústrias do norte do RS. Para o desenvolvimento da pesquisa, foram colhidas cinco mil quinhentos e quarenta e uma análises de leite cru, com intuito de observar, possíveis alterações de CBT (Contagem Bacteriana Total) secundárias a ação de microorganismos deteriorantes do produto (bactérias mesófilas e/ou psicotróficas). Após coleta das amostras, as mesmas foram sendo enviadas para o laboratório credenciado ao MAPA da RBQL localizado na cidade de Passo Fundo/RS, para determinação de CBT (Contagem Bacteriana Total) e UFCs (Unidaes Formadoras de Colônia) através da técnica denominada Citometria de Fluxo. Esta por sua vez, é uma tecnologia, baseada no emprego de __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 1 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU radiação laser, fluxo hidrodinâmico, óptica, substâncias fluorescentes (fluorocromos) e recursos de informática, utilizados para determinar algumas características estruturais e funcionais de partículas biológicas como protozoários, bactérias, e outros. Contudo, pode-se concluir a partir das análises realizadas, que as amostras continham uma alta taxa de bactérias tanto psicotróficas quanto mesófilas de acordo com os padrões previstos pela instrução normativa 62/dezembro de 2011 do MAPA, o que reflete um mau condicionamento térmico e técnicas de manejo inadequadas do produto desde a ordenha, até a chegada do mesmo às indústrias. Palavras-chave: lacticínios, bactérias, mesófilas, psicotróficas. ABSTRACT: The agro-industrial system of milk is one of the most important of Brazilian agriculture, ahead of products such as processed coffee and rice. Among the animal foods, milk, by the large amount of nutrients that has in its composition, is an important breeding ground for the development of micro-organisms such as mesophilic aerobic, able to multiply in a 20 ° C range to 45C and psychrotrophic also able to grow at temperatures below 7 ° C causing odor and flavor changes, loss of firmness and gelation during the commercial life of milk. The objective of this study was to conduct microbiological testing of psicotrophic bacteria and colony-forming units of mesophilic bacteria in raw milk samples coming from the northern RS industries. For the development of the research were collected five thousand five hundred forty-one analysis of raw milk, in order to observe possible changes in CBT (Total Bacterial Count) secondary action of spoilage micro-organisms in the product (mesophilic bacteria and / or psicotrophic). After collecting the samples, they were being sent to the laboratory accredited to RBQL ABPM located in Passo Fundo / RS, to determine CBT (Total Bacterial Count) and CFUs (Unidaes Forming Colony) through the technique called Cytometry Flow. This in turn is a technology based on laser radiation jobs, hydrodynamic flow, optical, fluorescent substance (fluorochrome) and computer resources used to determine some structural and functional characteristics of biological particles such as protozoa, bacteria, and others. However, it can be concluded from these analyzes that the samples contained a high rate of bacteria both psicotrophic as mesophilic according to the standards set by the Normative Instruction 62 / December 2011 MAPA, reflecting a poor thermal conditioning and inadequate product management techniques since the milking until the arrival of the same industries. Keywords: dairy, bacteria, mesophilic, psicotrophic. 1 INTRODUÇÃO O sistema agro-industrial do leite é um dos mais importantes da agropecuária brasileira, estando à frente de produtos como café beneficiado e o arroz. A atividade é praticada em todo o território nacional em mais de 1,3 milhões de propriedades rurais e, gera acima de cinco milhões de empregos (PICOLI, 2013). A produção de leite bovino no Brasil vem aumentando constantemente desde o ano de 1974 até os dias atuais. Segundo dados da Pesquisa Pecuária Municipal (IBGE), o país produziu 7,1 bilhões de litros de leite em 1974, chegando a 32,1 bilhões de litros de leite em 2011, caracterizando um crescimento superior a 350% no período correspondente (MAIA et al., 2011). Além disso, o potencial de evolução da cadeia produtiva do leite é corroborado pelos dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), os quais demonstram que este setor tem grandes possibilidades de desenvolvimento, podendo crescer a uma taxa de 1,9% até 2021, o que corresponde a 38,2 bilhões de litros de leite cru (PICOLI, 2013). A qualidade do leite é definida por parâmetros de composição química, características físico-químicas e higiênicas (BRITO & BRITO, 2015), uma vez que, alimentos de origem __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 2 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU animal ou vegetal podem veicular micro-organismos patogênicos causadores de intoxicações alimentares. Dentre os alimentos de origem animal, o leite, pela grande quantidade de nutrientes que possui em sua composição, constitui um importante meio de cultura para o desenvolvimento de micro-organismos, sendo o principal parâmetro utilizado para verificar a viabilidade desse produto, o perfil microbiológico. Este, por sua vez, é determinado principalmente pela forma de obtenção, armazenamento e transporte do produto (SAEKI et al., 2010). Alguns grupos específicos de micro-organismos são frequentemente pesquisados no perfil microbiológico, como os aeróbios mesófilos – sendo de importante relevância, o gênero Staphylococcus sp.: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus e S. haemolyticus, capazes de se multiplicarem numa faixa de 20º a 45ºC- e também psicrotróficos (SAEKI et al., 2010) de grande relevância os gêneros Micrococcus sp., Bacillus, Arthrobacter sp. e Pseudomonas sp. (OLIVEIRA, 2005) capazes de se desenvolver a temperaturas inferiores a 7ºC e produzir enzimas lipolíticas e proteolíticas termorresistentes, que mantêm sua atividade após a pasteurização ou mesmo após o tratamento por UAT (Ultra-Alta Temperatura) estando intimamente relacionados à qualidade dos produtos lácteos, como alteração de sabor e odor, perda de consistência e gelatinização ao longo da vida comercial do leite UAT (NÖRNBERG et al., 2009). A qualidade microbiológica do leite está envolvida com diversos fatores como a saúde e higiene do animal, higiene durante o processo de ordenha e dos equipamentos de ordenha, além do tempo e da temperatura adequados de armazenamento (SANTOS et al., 2010) por isso, a análise de leite e produtos lácteos, para se verificar quais e quantos micro-organismos estão presentes, é fundamental para que se conheça as condições de higiene do alimento, e, consequentemente, os riscos que podem oferecer ao consumidor (OLIVEIRA, 2005). O objetivo do presente trabalho foi realizar análises microbiológicas de bactérias psicotróficas e unidades formadoras de colônia de bactérias mesófilas em amostras de leite cru, oriundas de indústrias do norte do Rio Grande do Sul. 2 MATERIAL E MÉTODOS __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 3 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU Para o desenvolvimento da pesquisa, no período que compreendeu os meses de fevereiro a abril de 2016, foram colhidas cinco mil quinhentos e quarenta e uma amostras de leite cru oriundas de indústrias localizadas no norte do Rio Grande do Sul, com intuito de observar, possíveis alterações de Contagem Bacteriana Total (CBT) secundárias a ação de micro-organismos deteriorantes do produto, tais como bactérias, sejam elas unidades formadoras de colônia de bactérias mesófilas (UFCs de bactérias mesófilas) ou bactérias psicotróficas. Após coleta das amostras, as mesmas, ao passo que, íam sendo recolhidas nas indústrias fornecedoras, eram enviadas ao laboratório credenciado ao MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) da RBQL (Rede Brasileira de Qualidade do Leite) localizado na cidade de Passo Fundo/RS, para determinação de CBT (Contagem Bacteriana Total) e UFC (Unidade Formadora de Colônia) através da técnica denominada Citometria de Fluxo. A Citometria de Fluxo é uma tecnologia, baseada no emprego de radiação laser, fluxo hidrodinâmico, óptica, substâncias fluorescentes (fluorocromos) e recursos de informática, utilizados para determinar algumas características estruturais e funcionais de partículas biológicas. Essas partículas biológicas entendem-se como vários tipos de células, protozoários, bactérias, entre outros. Esta tecnologia é usada para determinar componentes e propriedades de células e organelas celulares que fluem em uma suspensão celular (MIOTTO, 2009). Possui vantagens como, análise multiparamétrica, grande número de células analisadas em curto espaço de tempo e análise de célula a célula (SILVA et al., 2010). Ainda, Silva et al. (2010), citam que a técnica consiste primeiramente na adição de brometo de etídio ao leite, para que o DNA e RNA das bactérias sejam corados. Logo após, o leite com o corante é injetado num capilar acoplado a um sistema óptico que recebe, constantemente, um feixe de laser. Ao passar pelo feixe, cada bactéria emite fluorescência, a qual é captada pelo sistema óptico e, com isso, o número de bactérias é determinado em CIB/mL (Contagem Individual Bacteriana por mililitro de leite) pelo citômetro, conforme Figura 1. __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 4 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU Figura 1: Processo de análise de amostras de leite através do aparelho citômetro de fluxo. FLUIDO DO INVÓLUCRO AMOSTRA CÉLULA DE FLUXO FOCAGEM HIDRODINÂMICA EMISSÃO DA FLUORESCÊNCIA DISPERSÃO DE LUZ FRONTAL E LATERAL LASER Figura 1: Demonstração de técnica de Citometria de Fluxo a partir do aparelho citômetro de fluxo – Fonte: SILVA et al., 2010. Segundo metodologia descrita por Silva et al. (2004), a técnica consiste na utilização de corantes lipofílicos de distribuição/partição que devido à sua natureza lipofílica, conseguem atravessar facilmente a membrana e ali se acumulam de acordo com sua carga. Assim, o gradiente de concentração de um cátion lipofílico através de uma membrana citoplasmática intacta é determinado pela diferença de potencial “transmembranar”. Uma vez atingido o equilíbrio entre as células e o cátion do corante, este irá se acumular no interior da membrana se esta estiver polarizada ou hiperpolarizada, pois nessa situação, o interior daquela encontra-se carregado negativamente, favorecendo a interação eletrostática entre essas cargas negativas e as cargas positivas do corante. Quando a célula se encontra despolarizada, ocorre precisamente o mecanismo inverso: o potencial de membrana diminui (deslocando-se para valores menos negativos), resultando em uma menor distribuição de cargas negativas no interior da membrana e, nestas condições, o corante terá tendência para se acumular no exterior da membrana, onde haverá uma menor distribuição de cargas positivas. A emissão de fluorescência só ocorre significativamente quando o corante se encontra acumulado no interior da membrana. Os resultados desta técnica podem ser obtidos em até 15 minutos do inicio do teste (SILVA et al., 2004). __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 5 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES Com base nos parâmetros impostos pela Instrução Normativa 62/dezembro de 2011 do MAPA, que delimita os padrões em 300.000.00 Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) de bactérias mesófilas por mililitros (mL) de leite crú refrigerado, e 1.000.000.00 de UFCs de bactérias psicotróficas por mililitros de leite crú refrigerado, foi possível observar oscilações nos valores finas das amostras verificadas, bem como, delimitar fatores e/ou possíveis causas que resultaram na alteração desses valores considerados padrões. As unidades formadoras de colônia de bactérias mesófilas foram observadas em cinco mil duzentos e sessenta e oito amostras de leite dentre o total de cinco mil quinhentos e quarenta e uma análises realizadas. As amostras foram acumuladas durante três meses, sendo que, no mês de fevereiro foram 1.735 amostras, no mês de março 1.746 e no mês de abril, 1.787 amostras com a presença do micro-organismo. Contudo, é possível observar a variação de valores referentes à quantidade de UFCs (Unidades Formadoras de Colônias) de bactérias mesófilas por mL (mililitro) de leite cru refrigerado, que variaram de 1.000 a 6.228.000.00, com valores absolutos de 2.380 análises com CBT de até 300.000.00 UFC/mL – o que é aceitável segundo legislação proposta pela Instrução Normativa 62/dezembro de 2011 do MAPA -, 2.720 análises com resultado de CBT de até 3.000.000.00 UFC/mL e 168 análises com CBT acima de 3.000.000.00 UFC/mL de leite conforme demonstrado na Figura 2. 3% 45% 52% CBT até 300,000,00 UFC/mL CBT até 3,000,000,00 UFC/mL CBT acima de 3,000,000,00 UFC/mL Figura 2: Contagem de micro-organismos mesófilos aeróbios em amostras de leite oriundas de indústrias do norte do Rio Grande do Sul - Fonte: BENETTI, F.L., 2016. __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 6 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU Nero et al. (2000), sugerem que micro-organismos aeróbios mesófilos indicam qualidade sanitária com que o alimento foi obtido ou processado. Um número elevado destes microorganismos indica que o alimento é insalubre, mesmo que patógenos estejam ausentes. No entanto, deve-se considerar que todas as bactérias patogênicas de origem alimentar são mesófilas e, portanto, uma alta contagem destes pode significar que houve condições para o crescimento de patógenos. Este grupo de micro-organismos (mesofílicos) inclui a maioria das bactérias acidificantes do leite e os patógenos (SILVA et al., 2011), ou seja, grande parte desta categoria, fermentam a lactose produzindo ácido láctico, que causa acidificação do leite comprometendo sua utilização na indústria (SANTANA et al., 2001). A refrigeração do leite tem como objetivo controlar a multiplicação de aeróbios mesófilos (SANTANA et al., 2001) tanto que, a partir do mês de julho de 2002, no Brasil, a refrigeração do leite na fazenda e a coleta por meio de caminhões isotérmicos (coleta a granel) foi regulamentada pela Portaria nº 56 para as Regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste (BRITO & BRITO, 2015). Ainda, Nornberg et al. (2009), sugerem que o armazenamento do leite cru sob refrigeração possibilita a redução de custos operacionais de produção e evita perdas dessa matéria-prima pela atividade acidificante de bactérias mesofílicas. Entretanto, o armazenamento por períodos prolongados pode resultar em queda de qualidade dos produtos lácteos, devido ao crescimento e a atividade enzimática de bactérias psicrotróficas. É notável, que em comparação as bactérias mesófilas, um número significativamente menor em relação a presença de bactérias psicotróficas, foi encontrado nas análises realizadas, onde as mesmas foram identificadas em apenas 273 amostras de leite. Com a presença dos micro-organismos, foi relatado um número de 87 amostras no mês de fevereiro, 100 amostras em março e 86 amostras no mês de abril. Os resultados de CBT para as análises de bactérias psicotróficas, alternaram entre 10.000.00 e 8.200.000.00 UFC/mL de leite cru refrigerado, com valores absolutos de 228 análises com CBT de até 1.000.000.00 UFC/mL – o que se encontra dentro dos padrões, segundo a Instrução Normativa 62/dezembro de 2011 do MAPA -, 32 análises com CBT de até 3.000.000.00 UFC/mL e 13 análises com CBT acima de 3.000.000.00 UFC/mL de leite, conforme gráfico a seguir, Figura 4. __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 7 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU Figura 4: Contagem de micro-organismos psicotróficos em amostras de leite oriundas de indústrias do norte do Rio Grande do Sul - Fonte: BENETTI, F.L., 2016. Em condições adequadas de manipulação, este grupo de microrganismos representa geralmente 10% da microbiota do leite cru, ao passo que, quando ordenhado em condições precárias de higiene, as contagens de psicrotróficos podem atingir mais de 75% da microbiota total do leite (OLIVEIRA et al., 2012). Algumas espécies dos gêneros Micrococcus sp. e Pseudomonas sp., além de muitos outros, são amplamente distribuídos na natureza, sendo encontrados na pele do homem, pelos de animais, sujidades, solo, água e em muitos alimentos, inclusive no leite e seus derivados. São psicotróficas (ou seja, crescem a temperaturas inferiores a 7ºC) e estão intimamente associadas à deterioração de produtos lácteos, como por exemplo, limosidade superficial e odores desagradáveis devido à atividade proteolítica e lipolítica (CARVALHO, 2010). Segundo Oliveira et al. (2012), a contaminação do leite por micro-organismos psicrotróficos é o ponto mais importante na determinação da qualidade do leite. No Brasil, estudos evidenciaram altas contagens de bactérias psicrotróficas em leite cru refrigerado, mas pouco se conhece sobre a composição desta microbiota e suas propriedades hidrolíticas. Porém, sabe-se que os pontos de maior contaminação de psicrotróficos são os latões, tanques de expansão, água residual de equipamentos, utensílios de ordenha e tetos higienizados inadequadamente. Para Maieski (2011), o tempo de estocagem do leite cru influencia na concentração de psicotróficos, sendo que períodos inferiores há 24 horas devem ser respeitados. Também, ocorre uma relação direta entre contagem de células somáticas no leite (CCS) e a contagem de __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 8 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU bactérias psicotróficas no mesmo, devido que a principal fonte desses microrganismos é a superfície externa dos tetos. Assim, quanto melhor a desinfeção dos tetos, mais baixa a CCS e menor a concentração de psicotróficos no alimento. Ainda, Simões & Oliveira (2012), asseguram que a contagem de células somáticas do tanque de leite (CCSTL) tem relação direta e indicativa da prevalência de mastite, na composição do leite, riscos de contaminação do leite com antibióticos e probabilidade da presença de bactérias zoonóticas patogênicas. Contudo, é praticamente impossível obter leite livre de microrganismos contaminantes. Por isso são definidos números aceitáveis, com base nas alterações que causam no leite e derivados. Este requerimento é muito importante para a avaliação da qualidade do leite cru, pois será indicador das condições de higiene em que o leite foi obtido e armazenado, desde o processo de ordenha até o consumo (BRITO & BRITO, 2015). Por isso, a pasteurização, do leite é feita, permitindo assim, a destruição de todos os micro-organismos causadores de doença e não esporulados e, destruição e/ou redução do número de microorganismos deteriorantes (CARVALHO, 2010). De maneira geral, a baixa qualidade do produto pode ser atribuída a deficiências no manejo, higiene de ordenha, sanidade da glândula mamária, manutenção e desinfecção inadequada dos equipamentos e refrigeração ineficiente ou até mesmo inexistente. Assim, cuidados higiênicos para evitar a contaminação do leite devem ter início na ordenha e seguir até o seu beneficiamento, por meio das boas práticas de produção e fabricação. As boas práticas de produção (BP) devem ser aplicadas desde a obtenção e durante o armazenamento e transporte da matéria-prima, que no caso da produção leiteira pode-se traduzir em higiene de ordenha, resfriamento e granelização. A implantação desta BP resulta na redução do número de microrganismos da matéria prima, melhoria da sanidade da glândula mamária dos animais, que associadas às boas práticas no beneficiamento, levam a uma maior vida de prateleira do produto (MATSUBARA et al., 2011). 4 CONCLUSÃO Concluímos, a partir das análises realizadas, que as amostras de leite cru obtidas nas indústrias fornecedoras dos dados, continham alta taxa de bactérias, tanto psicotróficas quanto mesófilas de acordo com os padrões previstos pela Instrução Normativa 62/dezembro de 2011 do MAPA, evidenciando técnicas de manejo inadequadas do produto desde o momento da ordenha, até a chegada do mesmo às indústrias, tais como: má __________________________________________________________________________________________ Mostra de Iniciação Científica e Mostra de Criação e Inovação – ISSN: 2316-1566 – Getúlio Vargas – RS – Brasil 9 INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI FACULDADES IDEAU higienização dos tetos e úbere das vacas, mau condicionamento térmico após a coleta do leite em temperaturas errôneas, ou ainda, extrapolamento do tempo máximo de 24 horas de resfriamento até o processo de pasteurização. 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