análises microbiológicas de amostras de leite

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INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO
EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI
FACULDADES IDEAU
ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS DE AMOSTRAS DE LEITE DE
INDÚSTRIAS DO NORTE DO RIO GRANDE DO SUL
GARDA, Kelen¹
[email protected]
KOLCENTY, Luana¹
[email protected]
TAGLIARI, Luis Henrique¹
[email protected]
BENETTI, Fabricio Lucas¹
[email protected]
PAULA, Paulo de¹
[email protected]
OLIVEIRA, Franciele de²
[email protected]
ALMEIDA, Mauro Antonio de²
[email protected]
ARRUDA, Tiago Zart²
[email protected]
FACCIN, Angela²
[email protected]
GOTTLIEB, Juilana²
[email protected]
GUIMARÃES, Tarcisio Guerra²
[email protected]
OLIVEIRA, Daniela Dos Santos de²
[email protected]
RITTER, Filipe²
[email protected]
¹ Discentes do Curso Medicina Veterinária, Nível 7 2016/1- Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS.
² Docentes do Curso Medicina Veterinária, Nível 7 2016/1 - Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS.
RESUMO: O sistema agro-industrial do leite é um dos mais importantes da agropecuária brasileira, estando à
frente de produtos como café beneficiado e o arroz. Dentre os alimentos de origem animal, o leite, pela grande
quantidade de nutrientes que possui em sua composição, constitui um importante meio de cultura para o
desenvolvimento de micro-organismos, tais como os aeróbios mesófilos, capazes de se multiplicarem numa faixa
de 20ºC a 45ºC e também psicrotróficos capazes de se desenvolver a temperaturas inferiores a 7ºC causando
alterações de sabor e odor, perda de consistência e gelatinização ao longo da vida comercial do leite. O objetivo
do presente trabalho foi realizar análises microbiológicas de bactérias psicotróficas e unidades formadoras de
colônia de bactérias mesófilas em amostras de leite cru oriundas de indústrias do norte do RS. Para o
desenvolvimento da pesquisa, foram colhidas cinco mil quinhentos e quarenta e uma análises de leite cru, com
intuito de observar, possíveis alterações de CBT (Contagem Bacteriana Total) secundárias a ação de microorganismos deteriorantes do produto (bactérias mesófilas e/ou psicotróficas). Após coleta das amostras, as
mesmas foram sendo enviadas para o laboratório credenciado ao MAPA da RBQL localizado na cidade de Passo
Fundo/RS, para determinação de CBT (Contagem Bacteriana Total) e UFCs (Unidaes Formadoras de Colônia)
através da técnica denominada Citometria de Fluxo. Esta por sua vez, é uma tecnologia, baseada no emprego de
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radiação laser, fluxo hidrodinâmico, óptica, substâncias fluorescentes (fluorocromos) e recursos de informática,
utilizados para determinar algumas características estruturais e funcionais de partículas biológicas como
protozoários, bactérias, e outros. Contudo, pode-se concluir a partir das análises realizadas, que as amostras
continham uma alta taxa de bactérias tanto psicotróficas quanto mesófilas de acordo com os padrões previstos
pela instrução normativa 62/dezembro de 2011 do MAPA, o que reflete um mau condicionamento térmico e
técnicas de manejo inadequadas do produto desde a ordenha, até a chegada do mesmo às indústrias.
Palavras-chave: lacticínios, bactérias, mesófilas, psicotróficas.
ABSTRACT: The agro-industrial system of milk is one of the most important of Brazilian agriculture, ahead of
products such as processed coffee and rice. Among the animal foods, milk, by the large amount of nutrients that
has in its composition, is an important breeding ground for the development of micro-organisms such as
mesophilic aerobic, able to multiply in a 20 ° C range to 45C and psychrotrophic also able to grow at
temperatures below 7 ° C causing odor and flavor changes, loss of firmness and gelation during the commercial
life of milk. The objective of this study was to conduct microbiological testing of psicotrophic bacteria and
colony-forming units of mesophilic bacteria in raw milk samples coming from the northern RS industries. For
the development of the research were collected five thousand five hundred forty-one analysis of raw milk, in
order to observe possible changes in CBT (Total Bacterial Count) secondary action of spoilage micro-organisms
in the product (mesophilic bacteria and / or psicotrophic). After collecting the samples, they were being sent to
the laboratory accredited to RBQL ABPM located in Passo Fundo / RS, to determine CBT (Total Bacterial
Count) and CFUs (Unidaes Forming Colony) through the technique called Cytometry Flow. This in turn is a
technology based on laser radiation jobs, hydrodynamic flow, optical, fluorescent substance (fluorochrome) and
computer resources used to determine some structural and functional characteristics of biological particles such
as protozoa, bacteria, and others. However, it can be concluded from these analyzes that the samples contained a
high rate of bacteria both psicotrophic as mesophilic according to the standards set by the Normative Instruction
62 / December 2011 MAPA, reflecting a poor thermal conditioning and inadequate product management
techniques since the milking until the arrival of the same industries.
Keywords: dairy, bacteria, mesophilic, psicotrophic.
1 INTRODUÇÃO
O sistema agro-industrial do leite é um dos mais importantes da agropecuária
brasileira, estando à frente de produtos como café beneficiado e o arroz. A atividade é
praticada em todo o território nacional em mais de 1,3 milhões de propriedades rurais e, gera
acima de cinco milhões de empregos (PICOLI, 2013).
A produção de leite bovino no Brasil vem aumentando constantemente desde o ano de
1974 até os dias atuais. Segundo dados da Pesquisa Pecuária Municipal (IBGE), o país
produziu 7,1 bilhões de litros de leite em 1974, chegando a 32,1 bilhões de litros de leite em
2011, caracterizando um crescimento superior a 350% no período correspondente (MAIA et
al., 2011). Além disso, o potencial de evolução da cadeia produtiva do leite é corroborado
pelos dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), os quais
demonstram que este setor tem grandes possibilidades de desenvolvimento, podendo crescer a
uma taxa de 1,9% até 2021, o que corresponde a 38,2 bilhões de litros de leite cru (PICOLI,
2013).
A qualidade do leite é definida por parâmetros de composição química, características
físico-químicas e higiênicas (BRITO & BRITO, 2015), uma vez que, alimentos de origem
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animal ou vegetal podem veicular micro-organismos patogênicos causadores de intoxicações
alimentares. Dentre os alimentos de origem animal, o leite, pela grande quantidade de
nutrientes que possui em sua composição, constitui um importante meio de cultura para o
desenvolvimento de micro-organismos, sendo o principal parâmetro utilizado para verificar a
viabilidade desse produto, o perfil microbiológico. Este, por sua vez, é determinado
principalmente pela forma de obtenção, armazenamento e transporte do produto (SAEKI et
al., 2010).
Alguns grupos específicos de micro-organismos são frequentemente pesquisados no
perfil microbiológico, como os aeróbios mesófilos – sendo de importante relevância, o gênero
Staphylococcus sp.: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus e S. haemolyticus, capazes de
se multiplicarem numa faixa de 20º a 45ºC- e também psicrotróficos (SAEKI et al., 2010) de
grande relevância os gêneros Micrococcus sp., Bacillus, Arthrobacter sp. e Pseudomonas sp.
(OLIVEIRA, 2005) capazes de se desenvolver a temperaturas inferiores a 7ºC e produzir
enzimas lipolíticas e proteolíticas termorresistentes, que mantêm sua atividade após a
pasteurização ou mesmo após o tratamento por UAT (Ultra-Alta Temperatura) estando
intimamente relacionados à qualidade dos produtos lácteos, como alteração de sabor e odor,
perda de consistência e gelatinização ao longo da vida comercial do leite UAT (NÖRNBERG
et al., 2009).
A qualidade microbiológica do leite está envolvida com diversos fatores como a saúde
e higiene do animal, higiene durante o processo de ordenha e dos equipamentos de ordenha,
além do tempo e da temperatura adequados de armazenamento (SANTOS et al., 2010) por
isso, a análise de leite e produtos lácteos, para se verificar quais e quantos micro-organismos
estão presentes, é fundamental para que se conheça as condições de higiene do alimento, e,
consequentemente, os riscos que podem oferecer ao consumidor (OLIVEIRA, 2005).
O objetivo do presente trabalho foi realizar análises microbiológicas de bactérias
psicotróficas e unidades formadoras de colônia de bactérias mesófilas em amostras de leite
cru, oriundas de indústrias do norte do Rio Grande do Sul.
2 MATERIAL E MÉTODOS
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Para o desenvolvimento da pesquisa, no período que compreendeu os meses de
fevereiro a abril de 2016, foram colhidas cinco mil quinhentos e quarenta e uma amostras de
leite cru oriundas de indústrias localizadas no norte do Rio Grande do Sul, com intuito de
observar, possíveis alterações de Contagem Bacteriana Total (CBT) secundárias a ação de
micro-organismos deteriorantes do produto, tais como bactérias, sejam elas unidades
formadoras de colônia de bactérias mesófilas (UFCs de bactérias mesófilas) ou bactérias
psicotróficas.
Após coleta das amostras, as mesmas, ao passo que, íam sendo recolhidas nas
indústrias fornecedoras, eram enviadas ao laboratório credenciado ao MAPA (Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento) da RBQL (Rede Brasileira de Qualidade do Leite)
localizado na cidade de Passo Fundo/RS, para determinação de CBT (Contagem Bacteriana
Total) e UFC (Unidade Formadora de Colônia) através da técnica denominada Citometria de
Fluxo.
A Citometria de Fluxo é uma tecnologia, baseada no emprego de radiação laser, fluxo
hidrodinâmico, óptica, substâncias fluorescentes (fluorocromos) e recursos de informática,
utilizados para determinar algumas características estruturais e funcionais de partículas
biológicas. Essas partículas biológicas entendem-se como vários tipos de células,
protozoários, bactérias, entre outros. Esta tecnologia é usada para determinar componentes e
propriedades de células e organelas celulares que fluem em uma suspensão celular (MIOTTO,
2009). Possui vantagens como, análise multiparamétrica, grande número de células analisadas
em curto espaço de tempo e análise de célula a célula (SILVA et al., 2010).
Ainda, Silva et al. (2010), citam que a técnica consiste primeiramente na adição de
brometo de etídio ao leite, para que o DNA e RNA das bactérias sejam corados. Logo após, o
leite com o corante é injetado num capilar acoplado a um sistema óptico que recebe,
constantemente, um feixe de laser. Ao passar pelo feixe, cada bactéria emite fluorescência, a
qual é captada pelo sistema óptico e, com isso, o número de bactérias é determinado em
CIB/mL (Contagem Individual Bacteriana por mililitro de leite) pelo citômetro, conforme
Figura 1.
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Figura 1: Processo de análise de amostras de leite através do aparelho citômetro de fluxo.
FLUIDO DO
INVÓLUCRO
AMOSTRA
CÉLULA DE FLUXO
FOCAGEM HIDRODINÂMICA
EMISSÃO DA FLUORESCÊNCIA
DISPERSÃO DE LUZ
FRONTAL E LATERAL
LASER
Figura 1: Demonstração de técnica de Citometria de Fluxo a partir do aparelho citômetro de fluxo
– Fonte: SILVA et al., 2010.
Segundo metodologia descrita por Silva et al. (2004), a técnica consiste na utilização
de corantes lipofílicos de distribuição/partição que devido à sua natureza lipofílica,
conseguem atravessar facilmente a membrana e ali se acumulam de acordo com sua carga.
Assim, o gradiente de concentração de um cátion lipofílico através de uma membrana
citoplasmática intacta é determinado pela diferença de potencial “transmembranar”. Uma vez
atingido o equilíbrio entre as células e o cátion do corante, este irá se acumular no interior da
membrana se esta estiver polarizada ou hiperpolarizada, pois nessa situação, o interior
daquela encontra-se carregado negativamente, favorecendo a interação eletrostática entre
essas cargas negativas e as cargas positivas do corante. Quando a célula se encontra
despolarizada, ocorre precisamente o mecanismo inverso: o potencial de membrana diminui
(deslocando-se para valores menos negativos), resultando em uma menor distribuição de
cargas negativas no interior da membrana e, nestas condições, o corante terá tendência para se
acumular no exterior da membrana, onde haverá uma menor distribuição de cargas positivas.
A emissão de fluorescência só ocorre significativamente quando o corante se encontra
acumulado no interior da membrana. Os resultados desta técnica podem ser obtidos em até 15
minutos do inicio do teste (SILVA et al., 2004).
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3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Com base nos parâmetros impostos pela Instrução Normativa 62/dezembro de 2011 do
MAPA, que delimita os padrões em 300.000.00 Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) de
bactérias mesófilas por mililitros (mL) de leite crú refrigerado, e 1.000.000.00 de UFCs de
bactérias psicotróficas por mililitros de leite crú refrigerado, foi possível observar oscilações
nos valores finas das amostras verificadas, bem como, delimitar fatores e/ou possíveis causas
que resultaram na alteração desses valores considerados padrões.
As unidades formadoras de colônia de bactérias mesófilas foram observadas em cinco
mil duzentos e sessenta e oito amostras de leite dentre o total de cinco mil quinhentos e
quarenta e uma análises realizadas. As amostras foram acumuladas durante três meses, sendo
que, no mês de fevereiro foram 1.735 amostras, no mês de março 1.746 e no mês de abril,
1.787 amostras com a presença do micro-organismo. Contudo, é possível observar a variação
de valores referentes à quantidade de UFCs (Unidades Formadoras de Colônias) de bactérias
mesófilas por mL (mililitro) de leite cru refrigerado, que variaram de 1.000 a 6.228.000.00,
com valores absolutos de 2.380 análises com CBT de até 300.000.00 UFC/mL – o que é
aceitável segundo legislação proposta pela Instrução Normativa 62/dezembro de 2011 do
MAPA -, 2.720 análises com resultado de CBT de até 3.000.000.00 UFC/mL e 168 análises
com CBT acima de 3.000.000.00 UFC/mL de leite conforme demonstrado na Figura 2.
3%
45%
52%
CBT até
300,000,00
UFC/mL
CBT até
3,000,000,00
UFC/mL
CBT acima de
3,000,000,00
UFC/mL
Figura 2: Contagem de micro-organismos mesófilos aeróbios em amostras de leite
oriundas de indústrias do norte do Rio Grande do Sul - Fonte: BENETTI, F.L., 2016.
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Nero et al. (2000), sugerem que micro-organismos aeróbios mesófilos indicam
qualidade sanitária com que o alimento foi obtido ou processado. Um número elevado destes
microorganismos indica que o alimento é insalubre, mesmo que patógenos estejam ausentes.
No entanto, deve-se considerar que todas as bactérias patogênicas de origem alimentar são
mesófilas e, portanto, uma alta contagem destes pode significar que houve condições para o
crescimento de patógenos.
Este grupo de micro-organismos (mesofílicos) inclui a maioria das bactérias
acidificantes do leite e os patógenos (SILVA et al., 2011), ou seja, grande parte desta
categoria, fermentam a lactose produzindo ácido láctico, que causa acidificação do leite
comprometendo sua utilização na indústria (SANTANA et al., 2001).
A refrigeração do leite tem como objetivo controlar a multiplicação de aeróbios
mesófilos (SANTANA et al., 2001) tanto que, a partir do mês de julho de 2002, no Brasil, a
refrigeração do leite na fazenda e a coleta por meio de caminhões isotérmicos (coleta a granel)
foi regulamentada pela Portaria nº 56 para as Regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste (BRITO &
BRITO, 2015).
Ainda, Nornberg et al. (2009), sugerem que o armazenamento do leite cru sob
refrigeração possibilita a redução de custos operacionais de produção e evita perdas dessa
matéria-prima pela atividade acidificante de bactérias mesofílicas. Entretanto, o
armazenamento por períodos prolongados pode resultar em queda de qualidade dos produtos
lácteos, devido ao crescimento e a atividade enzimática de bactérias psicrotróficas.
É notável, que em comparação as bactérias mesófilas, um número significativamente
menor em relação a presença de
bactérias psicotróficas, foi encontrado nas análises
realizadas, onde as mesmas foram identificadas em apenas 273 amostras de leite. Com a
presença dos micro-organismos, foi relatado um número de 87 amostras no mês de fevereiro,
100 amostras em março e 86 amostras no mês de abril.
Os resultados de CBT para as análises de bactérias psicotróficas, alternaram entre
10.000.00 e 8.200.000.00 UFC/mL de leite cru refrigerado, com valores absolutos de 228
análises com CBT de até 1.000.000.00 UFC/mL – o que se encontra dentro dos padrões,
segundo a Instrução Normativa 62/dezembro de 2011 do MAPA -, 32 análises com CBT de
até 3.000.000.00 UFC/mL e 13 análises com CBT acima de 3.000.000.00 UFC/mL de leite,
conforme gráfico a seguir, Figura 4.
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Figura 4: Contagem de micro-organismos psicotróficos em amostras de leite oriundas de
indústrias do norte do Rio Grande do Sul - Fonte: BENETTI, F.L., 2016.
Em condições adequadas de manipulação, este grupo de microrganismos representa
geralmente 10% da microbiota do leite cru, ao passo que, quando ordenhado em condições
precárias de higiene, as contagens de psicrotróficos podem atingir mais de 75% da microbiota
total do leite (OLIVEIRA et al., 2012).
Algumas espécies dos gêneros Micrococcus sp. e Pseudomonas sp., além de muitos
outros, são amplamente distribuídos na natureza, sendo encontrados na pele do homem, pelos
de animais, sujidades, solo, água e em muitos alimentos, inclusive no leite e seus derivados.
São psicotróficas (ou seja, crescem a temperaturas inferiores a 7ºC) e estão intimamente
associadas à deterioração de produtos lácteos, como por exemplo, limosidade superficial e
odores desagradáveis devido à atividade proteolítica e lipolítica (CARVALHO, 2010).
Segundo Oliveira et al. (2012), a contaminação do leite por micro-organismos
psicrotróficos é o ponto mais importante na determinação da qualidade do leite. No Brasil,
estudos evidenciaram altas contagens de bactérias psicrotróficas em leite cru refrigerado, mas
pouco se conhece sobre a composição desta microbiota e suas propriedades hidrolíticas.
Porém, sabe-se que os pontos de maior contaminação de psicrotróficos são os latões, tanques
de expansão, água residual de equipamentos, utensílios de ordenha e tetos higienizados
inadequadamente.
Para Maieski (2011), o tempo de estocagem do leite cru influencia na concentração de
psicotróficos, sendo que períodos inferiores há 24 horas devem ser respeitados. Também,
ocorre uma relação direta entre contagem de células somáticas no leite (CCS) e a contagem de
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bactérias psicotróficas no mesmo, devido que a principal fonte desses microrganismos é a
superfície externa dos tetos. Assim, quanto melhor a desinfeção dos tetos, mais baixa a CCS e
menor a concentração de psicotróficos no alimento. Ainda, Simões & Oliveira (2012),
asseguram que a contagem de células somáticas do tanque de leite (CCSTL) tem relação
direta e indicativa da prevalência de mastite, na composição do leite, riscos de contaminação
do leite com antibióticos e probabilidade da presença de bactérias zoonóticas patogênicas.
Contudo,
é
praticamente
impossível
obter
leite
livre
de
microrganismos
contaminantes. Por isso são definidos números aceitáveis, com base nas alterações que
causam no leite e derivados. Este requerimento é muito importante para a avaliação da
qualidade do leite cru, pois será indicador das condições de higiene em que o leite foi obtido e
armazenado, desde o processo de ordenha até o consumo (BRITO & BRITO, 2015). Por isso,
a pasteurização, do leite é feita, permitindo assim, a destruição de todos os micro-organismos
causadores de doença e não esporulados e, destruição e/ou redução do número de microorganismos deteriorantes (CARVALHO, 2010).
De maneira geral, a baixa qualidade do produto pode ser atribuída a deficiências no
manejo, higiene de ordenha, sanidade da glândula mamária, manutenção e desinfecção
inadequada dos equipamentos e refrigeração ineficiente ou até mesmo inexistente. Assim,
cuidados higiênicos para evitar a contaminação do leite devem ter início na ordenha e seguir
até o seu beneficiamento, por meio das boas práticas de produção e fabricação. As boas
práticas de produção (BP) devem ser aplicadas desde a obtenção e durante o armazenamento e
transporte da matéria-prima, que no caso da produção leiteira pode-se traduzir em higiene de
ordenha, resfriamento e granelização. A implantação desta BP resulta na redução do número
de microrganismos da matéria prima, melhoria da sanidade da glândula mamária dos animais,
que associadas às boas práticas no beneficiamento, levam a uma maior vida de prateleira do
produto (MATSUBARA et al., 2011).
4 CONCLUSÃO
Concluímos, a partir das análises realizadas, que as amostras de leite cru
obtidas nas indústrias fornecedoras dos dados, continham alta taxa de bactérias, tanto
psicotróficas quanto mesófilas de acordo com os padrões previstos pela Instrução Normativa
62/dezembro de 2011 do MAPA, evidenciando técnicas de manejo inadequadas do produto
desde o momento da ordenha, até a chegada do mesmo às indústrias, tais como: má
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higienização dos tetos e úbere das vacas, mau condicionamento térmico após a coleta do leite
em temperaturas errôneas, ou ainda, extrapolamento do tempo máximo de 24 horas de
resfriamento até o processo de pasteurização.
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