INTERAÇÕES DE COBRE E FÓSFORO EM ACESSOS DE
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROBIOLOGIA INTERAÇÕES DE COBRE E FÓSFORO EM ACESSOS DE Pfaffia glomerata (SPRENG.) PEDERSEN: EFEITO NO CRESCIMENTO E RENDIMENTO DE β-ECDISONA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Franciele Antonia Neis Santa Maria, RS, Brasil 2013 2 INTERAÇÕES DE COBRE E FÓSFORO EM ACESSOS DE Pfaffia glomerata (SPRENG.) PEDERSEN: EFEITO NO CRESCIMENTO E RENDIMENTO DE β-ECDISONA Franciele Antonia Neis Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agrobiologia, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agrobiologia Orientador: Prof. Fernando Teixeira Nicoloso Santa Maria, RS, Brasil 2013 3 Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências Naturais e Exatas Programa de Pós-Graduação em Agrobiologia A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado INTERAÇÕES DE COBRE E FÓSFORO EM ACESSOS DE Pfaffia glomerata (SPRENG.) PEDERSEN: EFEITO NO CRESCIMENTO E RENDIMENTO DE β-ECDISONA Elaborada por Franciele Antonia Neis como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agrobiologia Comissão Examinadora: __________________________________________ Fernando Teixeira Nicoloso, Dr. (Presidente/Orientador) ___________________________________________ Arthur Germano Fett-Neto, PhD. (UFRGS) ____________________________________________ Eduardo Girotto, Dr. (IFRS) Santa Maria, 14 de março de 2013 4 DEDICATÓRIA A Miguel e Maria Gessi, meus pais queridos, em gratidão à dádiva da vida, exemplos de força e dedicação. À Andressa e Andrei, meus irmãos, motivos de orgulho e alegria. Ao meu noivo Neimar, parte de mim, pelo apoio, companheirismo e amor... Sem vocês eu não conseguiria ter dado tantos passos importantes em minha vida. 5 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por estar sempre guiando meu caminho. Aos meus pais, Miguel Neis e Maria Gessi Neis, pela educação, amor, esforço e dedicação, Amo vocês! Em especial a meu noivo Neimar F. da Rosa pela compreensão, amor, carinho, incentivo e confiança nos momentos de ausência, que foram essenciais para vencer todos os obstáculos. Para todo sempre! Ao professor Fernando T. Nicoloso, exemplo de profissional, agradeço pela oportunidade que me foi confiada, pela amizade, pelos ensinamentos oferecidos e por toda a atenção dispensada. Aos meus irmãos, Andressa Neis e Andrei Neis por todo nosso amor, a meus cunhados (as) Suzana F. da Rosa, Marcos P. Ludwig, Denise F. Da Rosa e Tiago Cassol, pela presença agradável, pelo apoio e incentivo. A minha amiga e muitas vezes mãe Hilda H. Soriane (Pós- doutoranda), obrigada pelo carinho, ensinamentos e conselhos, sem você não teria conseguido suportar tantas coisas. Obrigada minha querida! Ao Pós-doutorando Paulo Ferreira Avelar pela ajuda na execução deste trabalho, pelos conhecimentos compartilhados e principalmente por uma amizade que vou levar para vida toda. Ao professor Sidinei J. Lopes, pela amizade, pelas sugestões, pelos conselhos, pelos constantes incentivos e pela colaboração fundamental na realização deste trabalho. A professora Denise Cargnelutti, por ter acreditado em mim. A professora Luciane A. Tabaldi, incentivo e ensinamentos que contribuíram para a realização deste trabalho. As minhas amigas e companheiras de mestrado Suzi C. Uliana e Darlene Sausen as ―mosqueteiras‖ inseparáveis. A doutora Júlia G. Farias, pelo apoio, carinho e ensinamentos, nunca vou esquecer o quanto você fez por mim. Às doutorandas Liana V. Rossato e Bibiana S. Morais pelo convívio, auxílio e conhecimento compartilhado ao longo desse período. 6 Ao mestrando Gabriel Schaich pela amizade, apoio e incentivo. Aos bolsistas de iniciação científica Marcos, Leonardo, Pedro, Sibila, Victória, Gessieli, Andrieli, Jover, Heloisa, Raíssa, Bianca e Jussiane pelo auxílio na execução deste trabalho. Aos colegas de pós-graduação pela amizade, companheirismo e apoio prestados ao longo deste curso. As minhas amigas Raquel Binotto, Mariana Durigon, Tatiane Bertuzzi, Daniele Grigoletto e Ana Paula Cassol, pela força e companheirismo. Aos amigos que de uma forma ou outra contribuíram para esta conquista. Ao laboratório de química da UFSM, em especial ao Matheus e ao professor Valderi, pela ajuda nas análises de tecido. Ao laboratório de fertilidade do solo da UFSM, em especial ao Tadeu L. Tiecher pela atenção, ensinamentos, paciência e compreensão de minhas dificuldades. A Universidade Federal de Santa Maria e ao Programa de Pós-Graduação em Agrobiologia, pela oportunidade de realização do curso de mestrado. À PIONEER pela concessão da bolsa de mestrado, a qual torna possível a realização de projetos como este aqui apresentado. E a todos aqueles que torceram, incentivaram e contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho. 7 EPIGRAFE Apesar dos nossos defeitos, precisamos enxergar que somos pérolas únicas no teatro da vida e entender que não existem pessoas de sucesso ou pessoas fracassadas o que existe são pessoas que lutam pelos seus sonhos ou desistem deles.” Por isso... Nunca desista dos seus sonhos! Augusto Cury 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Aspectos visuais de plantas de dois acessos de Pfaffia glomerata (acesso BRA e JB), cultivados em Argissolo Vermelho distrófico típico com doses de 80 mg kg-1 de Cu na presença de 10 (A e B) e 120 mg kg-1 de P (C e D). (NEIS, F.A)......................... Figura 2 – Produção de matéria seca das folhas e hastes de plantas de Pfaffia glomerata (acesso JB e BRA) submetidas ao cultivo em Argissolo Vermelho distrófico típico com concentrações crescentes de Cu e P (mg kg-1)........................................................ Figura 3 – Produção de matéria seca de raiz e matéria seca total de plantas de Pfaffia glomerata (acesso JB e BRA) submetidas ao cultivo em Argissolo Vermelho distrófico típico com concentrações crescentes de Cu e P (mg kg-1)........................................................ Figura 4 – Aspectos visuais de raízes do acesso BRA, cultivado em Argissolo vermelho distrófico típico com concentrações crescentes de Cu e P (mg kg-1). Barra correspondente a 10 cm. (NEIS, F.A)....................................................................................... Figura 5 – Aspectos visuais de raízes do acesso JB cultivado em Argissolo vermelho distrófico típico com concentrações crescentes de Cu e P (mg kg-1). Barra correspondente a 10 cm. (NEIS, F.A)................. 29 30 31 33 34 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Propriedades químicas e físicas do solo Argissolo vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo........................................................................................... Tabela 2 – Concentração de Cu (mg kg-1) na parte aérea e raízes de Pfaffia glomerata cultivadas em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo........................................................................................... Tabela 3 – Concentração de P (g kg-1) na parte aérea e raízes de Pfaffia glomerata cultivada em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo........................................................................................... Tabela 4 – Índice de translocação de Cu para parte aérea de dois acessos de Pfaffia glomerata (JB e BRA) cultivados em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo (mg kg-1)............................................................... Tabela 5 – Índice de acumulação nas raízes dois acessos de Pfaffia glomerata (JB e BRA) cultivados em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo (mg kg-1)............................................................................ Tabela 6 – Coeficiente de correlação de Pearson (ρ) entre Cu dosado nos tecidos (folhas, hastes e raízes) e os nutrientes P, Ca, Mg, Fe, K, Mn e Zn, presentes nos respectivos tecidos de dois acessos Pfaffia glomerata (JB e BRA) cultivados em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo........................................................................................... Tabela 7 – Teor de β-ecdisona (µg g-1 de matéria seca) em raízes de dois acessos de P. glomerata (JB e BRA) cultivada em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo.............................................................................. Tabela 8 – Conteúdo de β-ecdisona (g raiz-1) em raízes de dois acessos de P. glomerata (JB e BRA) cultivada em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo........................................................................................... 24 36 38 40 41 42 43 44 10 LISTA DE APÊNDICES Apêndice A – Curva analítica do padrão de β-ecdisona................................. Apêndice B –Propriedades químicas e físicas do solo Argissolo vermelho distrófico típico ao final do experimento........................................ Apêndice C – Concentração de Fe (mg kg-1) na parte aérea e raízes de Pfaffia glomerata cultivada em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo...... 64 65 66 11 SUMÁRIO INTRODUÇÃO................................................................................................. 1 INTERAÇÕES DE COBRE E FÓSFORO EM ACESSOS DE Pfaffia Glomerata (SPRENG.) PEDERSEN: EFEITO NO CRESCIMENTO E RENDIMENTO DE Β-ECDISONA.................... Resumo………………………………………………………………………………... Abstract………………………………………………………………………………... Introdução........................................................................................................... Material e Métodos............................................................................................. Resultados.......................................................................................................... Discussão............................................................................................................ Conclusão........................................................................................................... Referências......................................................................................................... REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... APÊNDICES..................................................................................................... 11 17 17 18 19 21 28 44 49 50 58 64 12 INTRODUÇÃO GERAL O uso de plantas medicinais na terapêutica ou como suplementos dietéticos remota além da história gravada, mas tem aumentado substancialmente nas últimas décadas (KHAN et al., 2001). Exemplos do uso destes recursos naturais são encontrados intensamente na história do desenvolvimento das civilizações Oriental e Ocidental, merecendo destaque a medicina tradicional Chinesa, a qual se desenvolveu com tal eficiência, que ainda hoje muitas espécies de plantas medicinais são estudadas em busca do entendimento de seu mecanismo de ação e isolamento dos princípios ativos (SCHENKEL et al., 2002; SIANI, 2003; VIEGAS JÚNIOR et al., 2006). A terapêutica moderna não teria atingido o grau de desenvolvimento atual sem ajuda dos produtos naturais, especialmente dos vegetais superiores (SIANI, 2003). Esse fato se explica em razão das plantas se constituírem em fontes importantes de metabólitos secundários biologicamente ativos, sendo estes muito utilizados na indústria farmacêutica na produção de medicamentos fitoterápicos, além de servirem de modelos para a síntese de um grande número de fármacos (GUERRA; NODARI, 2002; SIANI, 2003). No Brasil, várias espécies do gênero Pfaffia são utilizadas em substituição ao ginseng coreano (Panax ginseng C. A. Meyer – Araliaceae) como uma panacéia. Entre estas espécies pode-se citar a Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, a Pfaffia iresinoides Sprengel e a Pfaffia paniculata (Mart.) Kuntze (OLIVEIRA, 1986; SHIOBARA et al., 1992). Estas plantas são popularmente conhecidas como ginseng brasileiro por apresentarem efeitos adaptógenos ou antiestresse semelhantes à espécie típica de ginseng, sendo o termo adaptógeno usado para descrever a ação de substâncias no aumento da resistência não específica do organismo às influências externas (MAGALHÃES, 2000; SCHENKEL et al., 2002). A P. glomerata caracteriza-se por ser uma erva perene relativamente alta, apresenta caules retos, delgados e ocos, raiz fusiforme e inflorescência muito ramificada composta por flores polígamo-monóicas (VIGO et al., 2004b); sendo as raízes de formas variadas, destacando-se as típicas formas humanóides, das quais deriva o nome ―ginseng‖ que significa ―imagem do homem‖, em chinês (SCHENKEL 13 et al., 2002). Ocorre normalmente em locais de clima tropical ou subtropical úmido. É comum encontrar Pfaffia em beira de rios e nas orlas das matas de galerias, onde pode receber bastante luz (MAGALHÃES, 2000). A P. glomerata destaca-se como uma espécie de grande importância medicinal e comercial (VIGO et al., 2004a; ZIMMER et al., 2006), em razão de apresentar efeitos como tônico e afrodisíaco, além de serem utilizadas para o tratamento do diabetes, reumatismo (MAGALHÃES, 2000), esgotamento físico e mental, falta de memória, irregularidades circulatórias e estresse (RATES; GOSMANN, 2002). Em extratos de P. glomerata, estudados por Shiobara et al. (1993), foram identificadas várias substâncias, tais como: β-ecdisona, rubrosterona, ácido oleanólico, β-glucopiranosil oleanolato, ácido glomérico e ácido pfamérico (dois nortriterpenóides). A ação adaptógena desta espécie está relacionada, principalmente, à presença do ecdisteróide β-ecdisona (VIGO et al., 2003), que é utilizado como marcador químico da qualidade dessa planta, que é usada como matéria-prima para produção de fitoterápicos e suplementos alimentares (MAGALHÃES, 2000; ZIMMER et al., 2006). Os metabólitos secundários são derivados biossinteticamente de intermediários do metabolismo primário, portanto estas rotas apresentam uma estreita relação. A produção desses compostos é, em geral, baixa (menos que 1% da biomassa seca) (OKSMAN-CALDENTE; INZÉ, 2004), sendo resultado dos processos de biossíntese, transporte, degradação e armazenamento, os quais são afetados pelo genótipo, estádio ontogenético e por fatores ambientais (TAIZ; ZEIGER, 2012). A maioria dos compostos é armazenada nos vacúolos de células que fazem parte de tecidos específicos da planta (OKSMAN-CALDENTEY; INZÉ, 2004). Atualmente, as técnicas cromatográficas e espectroscópicas têm permitido um avanço na separação e elucidação estrutural de diferentes compostos nos mais diversos grupos de plantas (GIL et al., 2005). Dentre os compostos químicos presentes nas raízes de diferentes espécies de Pfaffia destacam-se as saponinas triterpênicas e os ecdisteróides (SHIOBARA et al., 1992). As saponinas são glicosídeos de esteróides ou de terpenos policíclicos. Esse tipo de estrutura, que possui uma parte com característica lipofílica (triterpeno ou esteróide) e outra parte hidrofílica (açúcares), determina a propriedade de 14 redução da tensão superficial da água e suas ações detergente e emulsificante (SIMÕES et al, 2002). As saponinas são substâncias de elevada massa molecular (600 a 2000 Da) e, de modo geral, ocorrem em misturas complexas devido à presença concomitante de estruturas com um número variado de açúcares ou ainda devido à presença de diversas agliconas. Por essas razões, o isolamento e elucidação estrutural de saponinas podem se tornar muito difíceis. É por isso, também, que o conhecimento sobre a química e propriedades biológicas das saponinas desenvolveu-se somente nas últimas décadas, paralelamente à evolução das técnicas cromatográficas e espectroscópicas. As saponinas possuem várias propriedades físico-químicas e biológicas, podendo-se citar: a elevada solubilidade em água e outros solventes polares, a ação sobre membranas das células sanguíneas (ação hemolítica) ou das células das brânquias de peixes (ação ictiotóxica) e a complexação com esteróides; sendo esta última, a razão pela qual apresentam ação antifúngica e hipocolesterolemiante (SCHENKEL et al., 2002). As saponinas triterpênicas e os ecdisteróides presentes no sistema radicular da P. glomerata são considerados os responsáveis pela sua ação farmacológica (VIGO et al., 2004b), porém poucos estudos têm explorado sua atividade biológica (NETO et al., 2004). Pesquisas mostraram que os extratos de P. glomerata têm propriedades tranquilizantes; anti-reumáticas; antidiarréicas; antiinflamatórias; febrífugas; cicatrizantes internas e externas; anti-hemorróidicas; melhoradoras da visão e da memória e para o tratamento de distúrbios gástricos, artrite, artrose, anemia, astenia e dores (SILVA JÚNIOR; OSAIDA, 2005). No entanto, como acontece com outras plantas medicinais (SARASAN et al., 2011), a sobreexploração e insustentável colheita tem causado uma diminuição drástica nas populações naturais e está levando à erosão genética da espécie. Além destas propriedades, todas as espécies de Pfaffia já estudadas forneceram quantidades relativas de ecdisona e seus análogos (ecdisteróides). A ecdisterona é um hormônio esteroidal precursor da β-ecdisona, hormônio indutor das mudas nos insetos (ecdises) (DINAN, 2001). Rações compostas à base de P. glomerata foram administradas em criações de bichos-da-seda, no Japão, prolongando seu estágio larval, a fim de obter maior rendimento na sericultura (NINAGI; MARUYAMA, 1996). Também é atribuído a esse fitoecdisteróide, um 15 papel importante na defesa da planta contra insetos não adaptados e aos nematóides (SAVCHENKO et al., 1998; DINAN, 2001). Estudos realizados com raízes de P. glomerata de diferentes acessos mostraram teores de β-ecdisona variando de 0,15 a 0,75%, indicando que a espécie apresenta grande variação em relação ao acúmulo deste composto (MONTANARI JÚNIOR et al., 1999; FIGUEIREDO et al., 2004; FREITAS et al., 2004; ZIMMER et al., 2006). De acordo com Figueiredo et al. (2004), estas variações no conteúdo de β-ecdisona podem ser devido à variabilidade genética existente entre os acessos, a fatores ambientais e condições de cultivo, além de diferenças na metodologia de extração e doseamento do metabólito. Muitas plantas sofrem com as adaptações a estresses hídricos, temperatura, radiação ultravioleta, a salinidade, a deficiência nutricional, exposição aos metais pesados, ataques de insetos e patógenos, os quais podem envolver mudanças bioquímicas e fisiológicas tanto no metabolismo primário quanto no secundário, o que pode acarretar maior produção de metabólitos secundários (MARCHESE, 1999). O modo como o teor dos metabólitos secundários é alterado devido ao estresse causado pelos metais pesados no solo é bem caracterizado em muitas espécies de plantas (FACCHINI, 2001; MEMELINKET et al., 2001; SHÜTZENDÜBEL; POLLE, 2002). O efeito varia com a espécie, o tempo e a intensidade da condição estressante. Os metais pesados são encontrados naturalmente no solo, em baixas concentrações, como resultado do intemperismo e de outros processos pedogenéticos. Entretanto, as concentrações naturais podem ser modificadas por processos biogeoquímicos e, principalmente, pela ação antrópica. Alguns desses elementos são essenciais para várias funções fisiológicas nos seres vivos, como Fe, Zn, Cu e Mn, enquanto outros, como Cd, Pb e Hg, não tem funções biológicas conhecidas. Quando em excesso no solo, esses elementos podem inibir o crescimento das plantas e causar alterações fisiológicas nos vegetais (BAKER et al., 1994), alterando também sua produção de metabólitos secundários (FACCHINI, 2001; MEMELINKET et al., 2001; SHÜTZENDÜBEL; POLLE, 2002 ). O cobre é um micronutriente para as plantas, desempenhando um papel insubstituível em função de um grande número de enzimas que catalisam as reações de oxidação em uma variedade de vias metabólicas (LOLKEMA; VOOIJS, 16 1986; QUARTACCI et al., 2000; MARSCHNER, 2011). É um metal de transição que tem dois estados de oxidação sob condições fisiológicas. Como resultado, o Cu é o cofator de enzimas envolvidas em numerosas reações de transferência de elétrons. Encontra-se envolvido em processos biológicos essenciais, tais como a fotossíntese, respiração, dismutação do superóxido, detecção de etileno, metabolismo da parede celular e lignificação (BURKHEAD et al., 2009; MARSCHNER, 2011). Em nível celular, o Cu exerce papel essencial de sinalizador de transcrição, transportes de proteínas, fosforilação oxidativa e na mobilização do ferro (YRUELA, 2005). O excesso de Cu é altamente tóxico porque catalisa reações de Fenton, que geram radicais hidroxil que causam danos aos lipídios, proteínas e ácidos nucléicos (DRAZKIEWICZ et al., 2007). Este aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) conduz a alterações na atividade de muitas enzimas envolvidas nas vias antioxidantes (MOCQUOT et al., 1996; CHAOUI et al., 1997; ZHANG et al., 2010). Uma redução de biomassa de plantas, inibição do crescimento da raiz, clorose e necrose são normalmente relatadas como sintomas de excesso de Cu (MENCH; BES, 2009; MARSCHNER, 2011). Uma das estratégias que vem sendo utilizadas, para atenuar os efeitos causados pelo excesso de metais como Cu, consiste em alterações nos teores de fosfato no solo (MA et al., 1994; COTTER-HOWELLS; CAPORN, 1996; LAPERCHE et al., 1997; HETTIARACHCHI et al., 2000). Cao et al. (2003) demonstraram que a adição de fosfato em solos com excesso de Cu, além de aumentar a disponibilidade de fósforo também pode precipitar o Cu, tornando-o menos disponível às plantas e a outros organismos do solo, diminuindo consideravelmente a fitointoxicação. Estudos anteriores demonstraram que a adição de fosfato em vários solos contaminados podem reduzir a mobilidade e fitodisponibilidade de Cd, Zn, Pb, e Cu, promovendo o crescimento de plantas (MENCH et al., 1987; MENCH; BES, 2009), pois diminui o transporte de metais pesados para parte aérea de plantas (LEE; GEORGE, 2005), devido à formação de compostos menos solúveis (BROWN et al., 1995). O fosfato atua também na biossíntese dos fitoecdisteróides formando compostos para atuar na síntese dos terpenóides (CROTEAU et al., 2000; KLEIN, 2004; TAIZ; ZEIGER, 2012). Além disso, aparece conjugado a ecdiesteróides como componente endógeno de muitas espécies de plantas (LAFONT; HORN, 1989). Este intermediário endógeno conhecido como ecdisona-P, em Spinacea oleracea inibiu a 17 biossíntese dos fitoesteróis e dos fitoecdisteróides (GREBENOK et. al., 1994). Enquanto em Zea mays (DEVARENNE et al., 1995) o fosfato conjugado com a ecdisona, parece ter sido importante no transporte dos ecdisteróides, bem como na regulação do metabolismo destes compostos. Diante do exposto, pode-se notar que o estresse causado sobre as plantas ou uma nutrição adequada de fósforo pode alterar a produção de metabólitos secundários. No entanto, é vago o conhecimento sobre os efeitos estressantes dos metais pesados sobre a produção de β-ecdisona. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do cobre e do fósforo sobre a produção de β-ecdisona em P. glomerata. 18 INTERAÇÕES DE COBRE E FÓSFORO EM ACESSOS DE Pfaffia glomerata (SPRENG.) PEDERSEN: EFEITO NO CRESCIMENTO E RENDIMENTO DE β-ECDISONA RESUMO A Pfaffia glomerata (Spregen.) Pedersen destaca-se como uma espécie de grande importância medicinal e comercial devido a seu principal metabólito secundário, a β-ecdisona, que pode sofrer variações em seus teores nas raízes por condições adversas, dentre elas o estresse nutricional. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos das concentrações crescentes de Cu e P no solo sobre a produção de β-ecdisona de dois acessos de P. glomerata (JB e BRA). As plantas utilizadas foram obtidas através de micropropagação in vitro e posteriormente foram aclimatizadas em hidroponia, sendo então transplantadas e cultivadas em vasos contendo 4 kg de um Argissolo Vermelho distrófico típico em casa de vegetação. Foram avaliados 12 tratamentos em um esquema bifatorial completo (4x3), representados pela combinação de quatro níveis de Cu (0, 20, 40 e 80 mg kg-1) e três níveis de P (10, 60 e 120 mg kg -1). Após 100 dias, a plantas foram colhidas e avaliou-se o crescimento, os teores de nutrientes e a produção de β-ecdisona nas raízes. A máxima produção de massa seca de plantas para ambos os acessos (JB e BRA) ocorreu nas doses de 40 mg kg-1 de Cu e 10 mg kg-1 de P, sendo que a massa seca do sistema radicular do acesso JB foi significativamente maior quando comparada ao acesso BRA. A dose de 60 mg kg-1 de P influenciou o crescimento do sistema radicular das plantas do acesso JB na maior dose de Cu, além disso, as raízes deste acesso atuaram como uma barreira reduzindo a transferência do metal para a parte aérea. As plantas de ambos os acessos na dose elevada de Cu e na presença de 10 e 120 mg kg-1 de P apresentaram acentuada inibição do crescimento, no entanto a dose de 60 mg kg-1 de P favoreceu o crescimento das plantas em condições de excesso de metal na solução do solo. As concentrações de β-ecdisona detectadas nas raízes de P. glomerata do acesso JB foram maiores quando comparadas ao acesso BRA. Altos teores de Cu no solo não afetaram a produção de β-ecdisona. No entanto, a adição de P (120 mg kg-1) ao solo reduziu a produção de β-ecdisona. Palavras-chave: Pfaffia glomerata, fosfato, metais pesados, β-ecdisona, cobre. 19 ABSTRACT Pfaffia glomerata (Spregen.) Pedersen stands out as a species of great medical and commercial importance due to its major secondary metabolite β-ecdysone, which content can vary in roots under adverse conditions as nutritional stress. The aim of this study was to evaluate the effects of increasing concentrations of Cu and P in soil on the production of β-ecdysone of two accessions of P. glomerata (JB and BRA). The plants used were obtained through in vitro micropropagation and were subsequently acclimatized in hydroponics and then transplanted and grown in pots containing 4 kg of a Paleudalf soil, under glasshouse conditions. Twelve treatments were evaluated in a full factorial scheme (4x3), represented by the combination of four Cu levels (0, 20, 40 and 80 mg kg-1) and three P levels (10, 60 and 120 mg kg-1). After 100 days, the plants were harvested for evaluation of growth, nutrient content and root production of β-ecdysone. The maximum dry matter production of plants for both accesses (JB and BRA) occurred at doses of 40 mg kg-1 Cu and 10 mg kg-1 of P, and root dry matter of JB access was significantly higher when compared to BRA access. The dose of 60 mg kg-1 P influenced root growth of JB accessions at higher Cu, moreover, access roots acted as a barrier reducing the transference of the metal to the shoot. Plants of both accesses in high dose of Cu and in the presence of 10 and 120 mg kg-1 P exhibited marked growth inhibition, however the dose of 60 mg kg1 P favored the growth of plants under conditions of metal excess in soil solution.The concentrations of β-ecdysone detected in roots of P. glomerata JB access were higher when compared to BRA access. High levels of Cu in the soil did not affect the production of β-ecdysone. However, the addition of P (120 mg kg-1) to soil reduced production of β-ecdysone. Keywords: Pfaffia glomerata, phosphate, heavy metals, β-ecdisona, copper. 20 1 INTRODUÇÃO A utilização de plantas como fonte de medicamento, na terapêutica ou como suplementos dietéticos remonta além da história registrada, mas tem aumentado substancialmente nas últimas décadas (KHAN et al., 2001). Exemplos do uso destes recursos naturais são encontrados intensamente na história do desenvolvimento das civilizações Oriental e Ocidental, merecendo destaque a medicina tradicional Chinesa, a qual se desenvolveu com tal eficiência que ainda hoje muitas espécies de plantas medicinais são estudadas em busca do entendimento de seu mecanismo de ação e isolamento dos princípios ativos (SCHENKEL et al., 2002; SIANI, 2003; VIEGAS JÚNIOR et al., 2006). Entre as plantas medicinais brasileiras de relevância comercial estabelecida encontra-se a Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen pertencente à família Amaranthaceae, sendo conhecida como ginseng brasileiro ou ginseng do pantanal, podendo substituir o ginseng verdadeiro (Panax ginseng C.A. Meyer) (NASCIMENTO et al., 2007). A sua importância medicinal e comercial (VIGO et al., 2004a; ZIMMER et al., 2006) se deve ao fato de apresentar efeitos adaptógeno, tônico e afrodisíaco (MAGALHÃES, 2000). As suas raízes e folhas têm propriedades tranquilizantes; anti-reumáticas; antidiarréicas; antiinflamatórias; febrífugas; cicatrizantes internas e externas; anti-hemorróidicas; melhoradoras da visão e da memória e para o tratamento de distúrbios gástricos, artrite, artrose, anemia, astenia e dores (SILVA JÚNIOR; OSAIDA, 2005). A ação adaptógena da Pfaffia está relacionada, principalmente, à presença do ecdisteróide β-ecdisona (VIGO et al., 2003), que é utilizado como marcador químico da qualidade da planta, as quais são usadas como matéria-prima para produção de fitoterápicos (MAGALHÃES, 2000; ZIMMER et al., 2006). Esta espécie é conhecida por acumular o fitoecdisteróide 20-hidroxiecdisona (20E), um composto que foi incluído em muitas preparações comerciais de anabólicos para atletas (LAFONT; DINAN, 2003). O fitoecdisteróide é o principal grupo isolado de Pfaffia e 20E é o mais frequente e amplamente distribuído fitoecdisteróide neste gênero (BAKRIM et al., 2008). É possível que o 20-hidroxiecdisona atue como um mecanismo de defesa para proteger as plantas contra insetos fitófagos (DINAN et al., 2009). Além disso, é 21 atribuído um efeito antioxidante, o qual confere mais este uso medicinal para espécies de ginseng brasileiro (DANIEL et al., 2006). Muitas plantas sofrem com as adaptações a estresses hídricos, temperatura, radiação ultravioleta, a salinidade, a deficiência nutricional, a exposição aos metais pesados, ataques de insetos e patógenos, os quais podem envolver mudanças bioquímicas e fisiológicas tanto no metabolismo primário quanto no secundário, o que pode acarretar maior produção de metabólitos secundários (MARCHESE, 1999). O modo como o teor dos metabólitos secundários é alterado devido ao estresse causado pelos metais pesados no solo é bem caracterizado em muitas espécies de plantas (FACCHINI, 2001; MEMELINK et al., 2001; SHÜTZENDÜBEL; POLLE, 2002). O efeito varia com a espécie, o tempo e a intensidade da condição estressante. Os metais pesados são encontrados naturalmente no solo, em baixas concentrações, como resultado do intemperismo e de outros processos pedogenéticos. Entretanto, as concentrações naturais podem ser modificadas por processos biogeoquímicos e, principalmente, pela ação antrópica. Alguns desses elementos são essenciais para varias funções fisiológicas nos seres vivos, como Fe, Zn, Cu e Mn, enquanto outros, como Cd, Pb e Hg, não tem funções biológicas conhecidas. Quando em excesso no solo, esses elementos podem inibir o crescimento das plantas e causar alterações fisiológicas nos vegetais (BAKER et al., 1994), alterando também sua produção de metabólitos secundários (FACCHINI, 2001; MEMELINK et al., 2001; SHÜTZENDÜBEL; POLLE, 2002). Pesquisas realizadas em nosso grupo de pesquisa sugerem que plantas de P. glomerata apresentam tolerância intermediária a alta concentração de Al, Hg, Cd, Pb (MALDANER, 2008; SKREBSKY et al., 2008; CALGAROTO, 2009). Algumas medidas utilizadas para diminuir a solubilidade e a biodisponibilidade de metais pesados no solo têm sido propostas como forma de diminuir os impactos desta contaminação sobre o desenvolvimento das plantas. Alguns autores (CHEN et al., 1997; MA; RAO, 1997; CAO et al.; 2003) têm mostrado que a remediação de solos contaminados por metais através da adição de fosfatos é eficiente em função dos metais pesados adquirirem formas químicas menos solúveis. O fosfato atua também na biossíntese dos fitoecdisteróides, formando compostos para atuar na síntese dos terpenóides (CROTEAU et al., 2000; KLEIN, 22 2004; TAIZ ZEIGER, 2012). Além disso, aparece conjugado a ecdiesteróides como componente endógeno de muitas espécies de plantas (LAFONT; HORN, 1989). Este intermediário endógeno conhecido como ecdisona-P, em Spinacea oleracea inibiu a biossíntese dos fitoesteróis e dos fitoecdisteróides (GREBENOK, et. al., 1994). Em Zea mays (DEVARENNE et al., 1995) o fosfato conjugado com a ecdisona parece ter sido importante no transporte dos ecdisteróides, bem como na regulação do metabolismo destes compostos. Diante do exposto, pode-se notar que o estresse causado sobre as plantas ou uma nutrição adequada de fósforo pode alterar a produção de metabolitos secundários. Além disso, detalhes significativos das respostas fisiológicas e metabólicas das plantas em ambientes contaminados com metais pesados são conhecidos, mas o efeito estressante dos metais pesados sobre a produção de β-ecdisona não é relatado na literatura. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do cobre e do fósforo sobre a produção de β-ecdisona em dois acessos de P. glomerata. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material vegetal e condições de crescimento O experimento foi desenvolvido junto ao grupo de pesquisa Fisiologia de Plantas de Interesse Agrobiológico da Universidade Federal de Santa Maria, no período de março a junho de 2012. A planta estudada foi Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, oriunda de dois locais e identificada como BRA e JB, sendo que cada acesso constituiu um experimento. O acesso BRA foi coletado no município de Querência do Norte (PR) e faz parte do Banco de Germoplasma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen), Brasília, DF. O acesso JB faz parte do acervo do Jardim Botânico da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS. O solo foi coletado na camada de 0-20 cm de profundidade na 23 cidade de Santa Maria, classificado como Argissolo Vermelho distrófico típico (EMBRAPA, 2006). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 3, com seis repetições. Os tratamentos foram constituídos de quatro níveis de Cu (0, 20, 40 e 80 mg Cu kg-1) adicionados no solo na forma de sulfato de Cu, sendo a dose zero constituída pelo teor natural (3,2 mg kg-1). Dentro de cada nível de Cu foram ainda adicionados níveis de P na forma de superfosfato triplo, resultando em: 10, 60 e 120 mg P kg-1 de solo, o que resultou na combinação de doze tratamentos, com quatro doses de cobre e três doses de fósforo respectivamente na ordem 0-10; 20-10; 40-10; 80-10; 0-60; 20-60; 40-60; 80-60; 0120; 20-120; 40-120; 80-120. Fez-se adição de sulfato de potássio (K) na dose de 40 mg kg-1 com base nos resultados da análise do solo e de acordo com CQFS -RS/SC. Aos 30 dias adicionou-se nitrogênio (N) na concentração de 60 mg kg-1 na forma de nitrato de amônio. As plantas utilizadas foram obtidas de segmentos nodais com 1,0 cm de comprimento e sem folhas, os quais foram retirados da porção mediana de plantas matrizes micropagadas in vitro em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com 30 g L-1 de sacarose, 6 g L-1 de agar, 0,1 g L-1 de mio-inositol e na ausência de fitorreguladores (NICOLOSO et al., 2001). Os tubos de ensaio contendo os explantes foram mantidos em sala de crescimento durante 20 dias, sob temperatura de 25 2C, fotoperíodo de 16h com densidade luminosa de 35 µmol m-2 s-1 fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas frias, e umidade relativa do ar entre 50 e 60%. As plantas foram então selecionadas a fim de compor uma população homogênea e aclimatizadas em bandejas plásticas contendo 20 kg de areia. As plantas foram crescidas em casa de vegetação parcialmente climatizada sob condições de cultivo em hidroponia com solução nutritiva completa de acordo com ANDRIOLO (2006) através de três irrigações diárias pelo período de 14 dias. A fim de minimizar o estresse causado pela radiação solar, as bandejas foram protegidas sob uma tela de sombreamento com 50% de interferência na radiação nos cinco primeiros dias. Com o término da aclimatização os acessos foram transplantados para os vasos com 4 kg de solo (capacidade de 5 kg), sendo plantada uma muda por vaso. Os vasos foram forrados internamente com plásticos para evitar a perda de água e 24 de nutrientes pela drenagem. Ao longo do cultivo, conduzido em estufa, a reposição da água evapotranspirada foi realizada através de irrigação, com água deionizada, sobre a superfície ou através de canos de PVC perfurados e introduzidos no solo entre 60 e 80% da capacidade de campo, sempre por meio de aferições diárias por pesagem. Após o período de três meses depois do transplantio as plantas foram coletadas e separadas em folhas, hastes e raízes para as posteriores análises. 2.2 Análise do solo A distribuição do tamanho de partículas dos constituintes do solo foi analisada de acordo com o método de pipeta (EMBRAPA, 1997). A determinação do pH foi realizada com água em uma proporção de 1:1 de acordo com a metodologia proposta por Tedesco et al. (1995). O teor de matéria orgânica do solo (MO) foi analisado mediante oxidação úmida usando dicromato de potássio em meio de ácido sulfúrico (0,4 N), e a determinação de MO foi feita por titulação com 0,1 N de sulfato de amônio ferroso de acordo com a Embrapa (EMBRAPA, 1997). Para a extração do Cu disponível para as plantas, foi utilizada a metodologia descrita por Chaignon e Hinsinger (2003), onde amostras de 0,25g de solo seco foram adicionadas em tubos de Falcon de 15 mL de capacidade e agitadas por 2 h com 10 mL da solução contendo EDTA dissódico 0,01 mol L -1 e NH4CH3COO 1,0 mol L-1, com pH ajustado para 7,0. Após a agitação a suspensão foi centrifugada e o teor de Cu determinado em Espectrometria de Absorção Atômica (EAA). No procedimento para extração do P e do K disponível às plantas, foi pesado 1 g de solo seco, adicionado a tubos falcon com capacidade de 15 mL, agitado por 5 minutos com 10 mL do extrator Mehlich-1 e repouso de 16 h depois da agitação (TEDESCO et al., 1995). Após a extração o P foi determinado por análise colorimétrica (MURPHY; RILEY 1962). A concentração de K trocável foi determinada por espectroscopia de emissão de chama. Os cátions permutáveis (Ca 2+, Mg2+ e Al3+) foram extraídos com uma solução de KCl (1,0 mol L-1) (EMBRAPA, 1997). A concentração de Al3+ foi determinada por uma titulação ácido-base com uma solução 25 NaOH (0,0125 mol L-1), e as concentrações de Ca e de Mg foram determinadas por espectroscopia de absorção atômica (AAS) (TEDESCO et al., 1995). As características químicas iniciais de cada tratamento encontram-se na tabela 1, e os atributos químicos finais do solo para cada acesso encontram-se no apêndice-A. Tabela 1. Atributos químicos e físicos do solo Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo. Cu (mg kg-1) - P (mg kg-1) Cu (mg kg-1) -1 P (mg kg ) 0-10 20-10 40-10 80-10 0-60 20-60 40-60 80-60 0-120 20-120 40-120 80-120 3,6 21,8 42,7 82,4 2,89 21,9 41,2 83,5 3,1 23,8 42,2 87,1 7,1 5,9 6,7 6,7 59,0 58,4 60,0 57,5 111 117 114 115 -1 3,9 4,2 3,7 3,9 3,7 3,2 3,0 3,0 3,2 3,1 3,0 3,2 -1 Mg (cmolc kg ) 2,1 2,0 2,3 2,,3 2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 2,7 2,1 2,3 Al 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 K (mg kg-1) 78,2 78,6 81,8 83,4 74,0 73,0 46,2 76,2 72,8 80,6 74,2 74,0 % MO 1,5 1,4 1,3 1,3 1,6 1,4 1,5 1,3 1,5 1,4 1,4 1,4 pH 5,7 5,5 5,6 5,6 5,7 5,7 5,6 5,6 5,7 5,6 5,7 5,7 Ca (cmolc kg ) 2.3 Biomassa, determinação da concentração de Cu e de nutrientes minerais Ao fim do experimento, as plantas foram coletadas e separadas em folhas, hastes e raízes. Posteriormente, as plantas foram lavadas suavemente com água destilada, seguindo-se sua secagem em estufa com sistema de ar forçado de circulação a 65°C, até atingir massa constante para a determinação da massa seca dos órgãos, bem como para concentração de macronutrientes e micronutrientes. As amostras foram submetidas a um procedimento de digestão ácida em sistema aberto com bloco digestor Modelo DK (Velp Scientifica, Itália). As amostras foram previamente pesadas e transferidas para os frascos de decomposição (tubo de vidro). A cada tubo de vidro contendo amostra foram adicionados 5 mL de HNO 3 14 mol L-1. Os tubos foram tampados com tampas de polipropileno e mantidos a 140°C durante 2 h. Após a etapa de digestão, as amostras foram transferidas para 26 frascos de polipropileno e volume foi completado até 25 mL com água destilada. A determinações de Cu, bem como o Ca, K, Mg, P, Fe, Mn e Zn foram feitas por espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP OES) num espectrômetro da Perkin Elmer 4300 DV (Optima, EUA) equipado com nebulizador Gencone®, câmara de nebulização do tipo ciclônica e tocha de quartzo com injetor de alumina de 2,0 mm de diâmetro interno. 2.4 Índice de translocação A translocação de Cu pelas plantas foi mensurada pelo índice de translocação (IT), que é definido pela concentração do elemento na parte aérea em relação à concentração total do elemento nas raízes. IT = [Metal] parte aérea / [Metal] raízes 2.5 Índice de acumulação nas raízes O Índice de acumulação (IAR) nas raízes para o Cu foi definido pelo conteúdo do elemento nas raízes em relação ao conteúdo total da planta. IAR = [Conteúdo] raízes / [Conteúdo] total 2.6 Análise do conteúdo de β-ecdisona 2.6.1 Preparo das amostras 27 As raízes das plantas de P. glomerata de ambos os acessos (BRA e JB) foram separadas, cortadas em pequenos pedaços e secas em estufa a 45°C durante o período de uma semana (FIGUEIREDO et. al., 2004). Posteriormente, as raízes foram moídas em um moinho de forma a obter uma amostra com tamanho de partículas inferior a 300 µm. 2.6.2 Extração das amostras As amostras (1,0 g) foram submetidas ao processo de extração com 125 mL de metanol, grau HPLC, em soxhlet, durante o período de 4 horas (MAGALHÃES, 2000). Os extratos foram concentrados até 100 ml e uma alíquota (10 ml) de cada amostra foi tratada com carvão ativo (20 mg) durante cerca de três horas e depois filtrada duas vezes em holder com membrana de 14 µm. Posteriormente, as soluções foram novamente filtradas empregando-se uma membrana de 0,45 µm (Milipore, Bedford, USA) e injetadas no sistema cromatográfico. 2.6.3 Reagente e solvente utilizados no sistema cromatográfico O padrão de β-ecdisona e o metanol, grau HPLC, foi obtido da Sigma-Aldrich (São Paulo, Brasil). O metanol foi degaseificado em banho de ultra-som antes de ser utilizado no sistema cromatográfico. 2.6.4 Condições cromatográficas As condições cromatográficas utilizadas neste estudo foram adaptadas da metodologia proposta por Magalhães (2000) e Figueiredo et al. (2004). As análises foram realizadas em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-DAP) (Shimadzu, 28 Kyoto, Japão), com auto amostrador Prominence (SIL-20A), equipado com bombas alternadas Shimadzu LC-20 AT, conectadas a um desgaseificador DGU 20A5, integrador CBM 20A, detector UV–VIS, DAD SPD-M20A, Software LC solution 1,22 SP1 e coluna Phenomenex C-18 (250 mm x 4,6 mm), empacotada com partículas de 5 μm de diâmetro. A fase móvel utilizada foi metanol (100%), grau HPLC, com eluição isocrática, fluxo de 1,0 mL min e volume de injeção de 20 μL. O tempo de retenção do padrão foi 2,7 minutos. Os picos da amostra foram identificados em comparação com o tempo de retenção e o espectro de absorção da solução do padrão, no comprimento de onda de 245 nm. 2.6.5 Preparo do padrão de β-ecdisona Soluções do padrão de β-ecdisona foram preparadas a partir da diluição da amostra original (1,0 mg em 10 mL de metanol, grau HPLC), obtendo-se uma solução estoque com concentração inicial de 100 µg mL -1. A partir desta solução foram realizadas diluições sucessivas para a obtenção de soluções de trabalho contendo 20, 40, 60, 80 e 100 µg mL-1 de β-ecdisona, conforme proposto por Ribani et al. (2004) e Zimmer et al. (2006). 2.6.6 Curva analítica e quantificação A curva analítica foi construída através de um gráfico de regressão que relaciona a área dos picos com as concentrações do padrão de β-ecdisona (Magalhães, 2000; Figueiredo et al., 2004; Ribani et al., 2004; Zimmer et al., 2006). A linearidade do método foi verificada através do coeficiente de determinação (R²) da curva obtida na análise de regressão (Ribani et al., 2004) (Apêndice-B). Considerou-se a média de três injeções em cada concentração (Zimmer et al., 2006). A quantificação foi realizada pelo método do padrão externo, onde a área do 29 pico correspondente à β-ecdisona presente na amostra é calculada a partir da equação da reta da curva analítica construída com concentrações conhecidas do padrão (Ribani et al., 2004). A identificação do analito nas amostras foi baseada no tempo de retenção e na co-cromatografia das amostras com padrão de β-ecdisona e espectro UV. 2.7 Análise estatística dos dados Os dados foram testados quanto à normalidade dos erros através do teste de Anderson-Darling e homogeneidade das variâncias através dos testes de Levene e Bartlet (ESTATCAMP, 2012). Quando atendidos a estes pressupostos, procedeu-se a análise de variância com base apropriada do teste-F. As equações de regressão foram determinadas por meio do uso do programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2000). As correlações de Pearson entre o Cu e os nutrientes foram realizadas por meio do software SigmaPlot versão 12.3 (teste F; P≤0,05). Quando os dados não atenderam aos pressupostos, foram transformados pelo procedimento Box-Cox, sendo novamente testados os pressupostos (ESTATCAMP, 2012). 3 RESULTADOS 3.1 Produção de Biomassa Quanto à produção de matéria seca da parte aérea e de raízes, os acessos de Pfaffia glomerata avaliados diferiram entre si após 100 dias de plantio (Figura 2 e 3). Para os dois acessos estudados as doses de 10 mg kg-1 de P e 40 mg kg-1 de Cu aumentaram a produção de matéria seca de folhas, com incrementos médios que atingiram 57 e 49%, respectivamente para os acessos BRA e JB, em relação aos tratamentos com 120 mg kg-1 de P. Ambos os acessos apresentaram uma 30 diminuição na produção de matéria seca de folhas na dose de 80 mg kg-1 de Cu, e na presença de 10 mg kg-1 de P (Figura 1 e 2). Para o acesso JB, na dose de 120 mg kg-1 de P, a produção de matéria seca de folhas não diferiu entre as doses de cobre, sendo a média de produção de 2,6 g planta -1. Na dose de 120 mg kg-1 de P a produção de matéria seca de folhas do acesso BRA foi maior na dose de 0 mg kg-1 de Cu, aproximadamente 3,9 g planta-1, enquanto que para as demais doses de Cu não houve diferença significativa (p>0.05) (Figura 2). A B C D Figura 1. Aspectos visuais de plantas de dois acessos de Pfaffia glomerata (acesso BRA e JB), cultivados em Argissolo Vermelho distrófico típico com doses de 80 mg kg-1 de Cu na presença de 10 (A e B) e 120 mg kg-1 de P (C e D). (NEIS, F.A). Os resultados evidenciaram que também ocorreu efeitos dos tratamentos na produção de matéria seca de hastes entre os acessos, sendo que a produção de 31 matéria seca para o acesso BRA foi 65% maior em relação ao acesso JB. Nas doses de 40 mg kg-1 de Cu e 10 mg kg-1 de P, a produção de matéria seca de hastes para as plantas do acesso BRA foi de 7,17 g planta -1, enquanto que para o acesso JB as plantas apresentaram menores incrementos de matéria seca de hastes, 5,19 g planta-1 nestas mesmas doses. O incremento na produção de matéria seca de hastes, para ambos os acessos, na presença de 10 mg kg-1 de P ocorreu até a dose de 40 mg kg-1 de Cu, seguido de uma redução na dose de 80 mg kg-1 de Cu. Os acessos BRA e JB na presença de 60 mg kg-1 de P, não apresentaram diferenças significativas entre as doses de Cu, obtendo uma produção de matéria seca de hastes estimada em torno de 5,08 e 4,25 g planta-1, respectivamente (Figura 2). 8 JB BRA y= 3.34 + 0.07x -0.001x² R² =0.95 y=4.43 +0.05x -0.0006x² R²=0.81 8 Matéria seca de folhas (g planta ) Não significativo -1 Não significativo -1 Matéria seca de folhas (g planta ) Não significativo 6 4 2 0 20 40 6 5 4 3 2 1 0 80 y= 4 + 0.04x -0.001x² R² =0.80 y=4.71 + 0.03x R²=0.81 7 y=4.40 + 0.06x - 0.001x² R²=0.99 5 4 3 2 1 0 40 80 Não significativo Não significativo -1 6 20 y=5.89 +0.06x -0.001x² R²=0.88 10 Matéria seca de haste (g planta ) -1 y=3.72 -0.04x -0.0002x² R²=0.52 0 0 Matéria seca de haste (g planta ) 7 8 6 4 2 0 0 20 40 80 0 20 40 80 Doses de Cu (mg kg-1) 10 mg kg-1 P 60 mg kg-1 P 120 mg kg-1 P Figura 2. Produção de matéria seca das folhas e hastes de plantas de Pfaffia glomerata (acesso JB e BRA) submetidas ao cultivo em Argissolo Vermelho distrófico típico com concentrações crescentes de Cu e P (mg kg-1). 32 A produção de matéria seca de raízes foi significativamente diferente entre os acessos BRA e JB, com este último apresentando um incremento de 45% em relação ao acesso BRA (Figuras 3, 4 e 5). A maior produção de matéria seca de raízes evidenciada no acesso JB ocorreu na dose de 80 mg kg -1 de Cu, na presença de 60 mg kg-1 de P, sendo em média 7,40 g planta-1. As plantas do acesso BRA tiveram sua maior produção de matéria seca de raízes (2,32 g planta-1) na presença de 10 mg kg-1 de P e 40 mg kg-1 de Cu. Já na dose de 80 mg kg-1 de Cu com 10 mg kg-1 de P, ocorreu uma redução de 23,3% em relação às doses que favoreceram a máxima produção. Para o acesso JB, a dose de 120 mg kg-1 de P proporcionou maior produção de matéria seca de raiz na dose de 0 mg kg-1 de Cu, em média 5,03 g planta-1, enquanto que na dose de 80 mg kg-1 de Cu e 120 mg kg-1 de P houve uma redução de 85% em relação a mesma dose de Cu, na presença de 60 mg kg -1 de P (Figura 3). JB y= 4.11 + 0.05x -0.001x² R² =0.83 8 -1 Matéria seca de raiz (g planta ) Não significativo y=4.22 - 0.04x R²=0.90 -1 Matéria seca de raiz (g planta ) 10 BRA 6 4 2 0 20 40 Não significativo Não significativo 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 80 0 22,5 y= 11.46 + 0.17x -0.003x² R² =0.86 20 20,0 Não significativo y= 10.22 + 0.07x -0.002x² R² =0.98 18 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 20 40 80 y=12.77 +0.11x -0.001x² R²=0.88 Não significativo Não significativo -1 Matéria seca total (g vaso ) -1 y=2.13 +0.01x -0.0002x² R²=0.99 2,6 1,0 0 Matéria seca total (g vaso ) 2,8 16 14 12 10 8 6 0 20 40 80 0 20 40 80 Doses de Cu (mg kg -1) 10 mg kg-1 P 60 mg kg-1 P 120 mg kg-1 P Figura 3. Produção de matéria seca de raiz e matéria seca total de plantas de Pfaffia glomerata (acesso JB e BRA) submetidas ao cultivo em Argissolo Vermelho distrófico típico com concentrações crescentes de Cu e P (mg kg-1). 33 A produção de massa seca total das plantas do acesso JB, na dose de 40 mg -1 kg de Cu e de 10 mg kg-1 de P, foi de 14,9 g planta-1, seguida de uma redução na dose 80 mg kg-1 de Cu. Não houve diferenças significativas entre as doses de Cu estudadas na presença de 60 mg kg-1 de P, as quais apresentaram produção média de 12,73 g planta-1. As doses de 80 mg kg-1 de Cu e 60 mg kg-1 de P, proporcionaram um incremento de 82% na matéria seca total em relação as doses de 10 e 120 mg kg-1 de P na presença de 80 mg kg-1 de Cu. Em relação à produção de matéria seca total na presença de 120 mg kg-1 de P, as plantas do acesso JB não apresentaram diferenças significativas até a dose de 40 mg kg-1 de Cu, em média 10,32 g planta-1, por outro lado a dose de 80 mg kg-1 de Cu apresentou uma redução de 77% em relação a dose inicial de Cu, com produção de matéria seca de 2,44 g planta-1 (Figura 3). Quanto à produção de massa seca total das plantas do acesso BRA, também se observou resposta de máxima produção na dose de 40 mg kg -1 de Cu associada a 10 mg kg-1 de P, em média 15,09 g planta-1. Já na dose combinada de 80 mg kg-1 de Cu e 10 mg kg-1 de P houve uma redução de 30% em relação às doses que proporcionaram a máxima produção. Com o aumento na dose de P (60 mg kg-1), nas diferentes doses de Cu, não houve diferenças na produção de matéria seca total (média de 11,71 g planta-1). Já na presença de 120 mg kg-1 de P, ocorreram diferenças entre as doses de Cu, sendo que a máxima produção ocorreu na menor dose de Cu e a mínima em 20 mg kg-1 de Cu. No entanto não houve diferenças em relação às doses citadas e as maiores doses de Cu (40 e 80 mg kg-1 de Cu) (Figura 3). 34 Figura 4. Aspectos visuais de raízes do acesso BRA, cultivado em Argissolo Vermelho distrófico típico com concentrações crescentes de Cu e P (mg kg-1). Barra correspondente a 10 cm. (NEIS, F.A). 35 Figura 5. Aspectos visuais de raízes do acesso JB, cultivado em Argissolo Vermelho distrófico típico com concentrações crescentes de Cu e P (mg kg-1). Barra correspondente a 10 cm. (NEIS, F.A). 36 3.1.2 Concentração de Cu e P nos tecidos Os teores de Cu e P nas folhas, hastes e raízes variaram nos dois acessos com a adição das diferentes quantidades de Cu e P adicionados ao solo (Tabela 2). Os teores de Cu nas folhas do acesso JB, expostos a 10 mg kg-1 de P nas diferentes doses de Cu, apresentaram uma relação quadrática. A concentração máxima de Cu nestes tecidos foi em média 32,5 mg kg-1 sob a exposição de 40 e 80 mg kg-1 de Cu, diferindo das doses de 0 e 20 mg kg-1 de Cu, as quais ocasionaram menor concentração de Cu nos tecidos, em média 19,52 mg kg -1 de Cu. O acesso BRA nestas mesmas condições descritas apresentou resposta linear à adição de Cu. As concentrações de Cu variaram em média de 18,77 mg kg-1 nas doses de 0 e 20 mg kg-1 de Cu a 28,20 mg kg-1 nas doses de 40 e 80 mg kg-1 de Cu. O maior teor de Cu encontrado nas folhas do acesso JB foi de 42,1 mg kg-1, na dose de 0 mg kg-1 de Cu e na presença de 60 mg kg-1 de P no acesso JB. Enquanto que para o acesso BRA, a presença de 60 mg kg-1 de P junto as diferentes doses de Cu não afetou às concentrações de Cu nos tecidos foliares, ficando em torno de 23,50 mg kg-1. Em contrapartida, este último acesso respondeu quadraticamente às doses de Cu associadas a 120 mg kg-1 de P, alcançando a sua máxima concentração (28,5 mg kg-1) na dose de 40 mg kg-1 de Cu (Tabela 2). O teor de Cu nas hastes do acesso BRA foi 9% maior em relação ao acesso JB, na média de todos os tratamentos. O acesso BRA, nas doses de 80 mg kg -1 de Cu associadas a 10 e 120 mg kg-1 de P, apresentaram teores de Cu na faixa de 24,15 e 23,55 mg kg-1, respectivamente. Na presença de 60 mg kg-1 de P, as doses 40 e 80 mg kg-1 de Cu, não diferiram no teor de Cu, sendo a média de concentração de ambas as doses em torno de 20,6 mg kg-1. No acesso JB, as maiores concentrações de Cu nas hastes foram observadas na presença de 0 mg kg-1 de Cu e 60 mg kg-1 de P, cerca de 27,7 mg kg-1, com o aumento do P (120 mg kg-1) e do Cu (80 mg kg-1) houve um aumento linear na concentração de Cu neste tecido, atingindo 26,6 mg kg-1. Já na presença de 10 mg kg-1 de P a maior concentração de Cu foi verificada na dose de 80 mg kg-1 de Cu (20,9 mg kg-1) (Tabela 2). 37 Tabela 2. Concentração de Cu (mg kg-1) na parte aérea e raízes de Pfaffia glomerata cultivadas em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo. Doses de Cu mg kg -1 Acesso JB – Folhas Doses de P mg kg -1 2 0 20 40 80 Regressão R 10 18,00 21,00 35,00 29,95 Y=16,24+0,547x-0,004x² 0,79* 60 42,10 31,70 36,65 22,40 Y=40,79-0,21x 0,79* 120 31,85 26,60 31,80 29,70 Não significativo Acesso JB – Haste 10 10,60 13,80 18,90 20,90 Y=10,22+0,26x-0,001x² 0,98* 60 27,70 18,00 15,40 16,80 Y=27,34+0,50x +0,004 x² 0,98* 120 12,65 12,20 22,05 26,60 Y=11,56+0,19x 0,89* Acesso JB – Raiz 10 17,95 27,60 54,30 56,15 Y=15,14+1,15x-0,007x² 0,87* 60 50,20 29,65 37,95 29,50 Y=43,7-0,19x 0,49* 120 28,80 23,00 46,85 60,35 Y=23,78+0,45x 0,84* 0,54* Acesso BRA – Folhas 10 20,35 17,20 28,70 27,65 Y=19,30+0,11x 60 24,50 22,25 25,00 22,40 Não significativo 120 18,50 17,25 28,25 24,20 Y=16,83-0,29x-0,002x² 0,55* Acesso BRA – Haste 10 10,20 17,15 22,15 24,15 Y=16,78+0,09x 0,87* 60 15,75 18,00 21,50 19,70 Y=15,41+0,21x-0,002x² 0,93* 120 15,25 18,40 21,90 23,55 Y=16,18+0,10x 0,90* Acesso BRA – Raiz 10 8,75 13,25 13,70 14,55 Não significativo 60 19,0 11,90 17,05 30,10 Y=18,07-0,29x+0,005x² 0,95* 120 7,80 10,00 21,80 40,50 Y=4,93+0,43x 0,97* * Significativo a 5% de acordo com o teste F (P≤0,05), A maior concentração de Cu nas raízes ocorreu no acesso JB, o qual foi 55% maior em relação ao acesso BRA, na média de todos os tratamentos, As raízes do acesso JB na presença de 80 mg kg-1 de Cu e 120 mg kg-1 de P atingiram uma concentração de 60,35 mg kg-1 de Cu. Nestas mesmas condições, o acesso BRA concentrou 33% menos de Cu nos tecidos. As diferentes doses de Cu, na presença de 10 mg kg-1 de P, não provocaram alterações nas concentrações de Cu nas raízes 38 do acesso BRA. Por outro lado, as raízes das plantas do acesso JB cultivado nas doses de 40 e 80 mg kg-1 de Cu na presença de 10 mg kg-1 de P apresentaram em média 55,25 mg kg-1 de Cu nas raízes, valor este 58% maior do que encontrado nas doses de 0 e 20 mg kg-1 de Cu. Além disso, ao considerarmos apenas a concentração de Cu das raízes do acesso JB cultivado nas doses de 80 mg kg-1 de Cu na presença de 10 mg kg-1 de P, em relação à concentração das raízes do acesso BRA, nestas mesmas condições de cultivo, a concentração de Cu das raízes deste último acesso foi 75% menor em relação às raízes do acesso JB. No entanto, na presença de 60 mg kg-1 de P, as raízes das plantas do acesso JB apresentaram teores de Cu em torno de 50,2 mg kg-1 na dose de 0 mg kg-1 de Cu, diferenciando-se das demais doses de Cu, que proporcionaram concentrações de Cu nos tecidos na faixa de 32,3 mg kg-1. O acesso BRA, neste mesmo nível de P, apresentou 30,1 mg kg-1 de Cu nas raízes na dose de 80 mg kg-1 de Cu, valor este 47% maior se comparado com a média das concentrações de Cu das demais doses (Tabela 2). Em relação ao teor de fósforo nas folhas, a média do acesso JB foi 15% maior em relação ao acesso BRA, considerando todos os tratamentos. O acesso JB em todas as doses de Cu e na presença de 10 mg kg-1 de P não apresentou diferença nas concentrações de Cu nos tecidos das folhas. Por outro lado o acesso BRA, nestas condições apresentou maior concentração de P na dose 0 de mg kg-1 de Cu (5,19 g kg-1). O maior teor de P nas folhas das plantas do acesso JB, na presença de 60 mg kg-1 de P, ocorreu na dose de 40 mg kg-1 de Cu, cerca de 9,33 g kg-1de P. Já a menor concentração de P nestes tecidos ocorreu quando houve o aumento da dose de Cu para 80 mg kg-1. Nesta mesma condição de P e independente das doses de Cu, as folhas das plantas do acesso BRA não apresentaram diferenças nas concentrações de P, em média 6,34 g kg-1. Com o aumento da dose de P de 60 mg kg-1 para 120 mg kg-1 de P, as folhas de ambos os acessos responderam diferentemente para o teor de P. Os teores de P no acesso JB mostrou-se maior na dose de 40 mg kg-1 de Cu (10,2 g kg-1) na presença de 120 mg kg-1 de P e menor nas doses de 0 e 80 mg kg-1 de Cu. Em contrapartida, as concentrações de P das folhas do acesso BRA responderam linearmente, com o maior teor de P (9,64 g kg-1) na menor dose de Cu e maior dose de P (120 mg kg-1) (Tabela 3). 39 Tabela 3. Concentração de P (g kg-1) na parte aérea e raízes de Pfaffia glomerata cultivada em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo. Doses de Cu mg kg -1 Acesso JB – Folhas Doses de P mg kg -1 2 0 20 40 80 Regressão R 10 1,81 1,86 2,05 2,11 Não significativo 60 9,13 7,97 9,33 6,81 Y=9,17-0,024x 0,86* 120 6,84 8,34 10,21 6,25 Y=6,59+0,16x -0,02x² 0,93* Acesso JB – Haste 10 2,00 2,36 1,63 1,44 Não significativo 60 7,12 7,67 7,89 6,11 Y=7,09+0,04x + 0,0007 x² 120 8,15 6,86 7,70 7,62 Não significativo 0,99* Acesso JB – Raiz 10 1,04 1,08 1,13 1,53 Y=0,98 + 0,006x 60 3,01 2,71 4,35 2,82 Não significativo 0,88* 120 3,43 3,48 2,68 2,85 Y=3,41+0,008x 0,79* 0,99* Acesso BRA - Folhas 10 5,19 2,51 1,63 2,14 Y=5,10-0,14x+0,001x² 60 5,63 6,18 6,78 6,77 Não significativo 120 9,64 4,38 7,07 3,53 Y=8,23+0,05x 0,55* Acesso BRA – Haste 10 1,46 1,95 1,50 1,50 Não significativo 60 5,01 4,00 4,53 4,26 Y=5,04-0,01x+0,00001x² 120 4,25 4,10 4,51 4,32 Não significativo 0,51 Y=0,75+0,002x 0,96* Acesso BRA – Raiz 10 0,75 0,69 0,67 0,95* 2 60 2,24 1,72 1,85 1,88 Y=-2,18-0,019+0,0001x 120 1,67 1,52 1,68 1,85 Não significativo 0,70* * Significativo a 5% de acordo com o teste F (P≤0,05). As concentrações de P nos tecidos das hastes dos acessos JB e BRA não variaram na presença de 10 mg kg-1 de P e com as diferentes doses de Cu, sendo que em média variaram de 1,86 g kg-1 para o acesso JB a 1,60 g kg-1 para o acesso BRA. Já na dose 120 mg kg-1 de P, que também não apresentou diferenças entre as doses de Cu para a concentração de P no tecido, foi em média 43% maior no 40 acesso JB comparado ao acesso BRA (Tabela 3). No entanto, quando as doses de Cu foram associadas a 60 mg kg-1 de P, ambos os acessos apresentaram respostas quadráticas na concentração de P nas hastes (Tabela 3). Quanto às concentrações de P nas raízes, o acesso JB concentrou em média 44% mais P do que o acesso BRA. O máximo teor de P encontrado nas raízes do acesso JB, na presença de 10 mg kg-1 de P, foi observado na dose de 80 mg kg-1 de Cu, cerca de 1,53 g kg-1 de P. Nesta mesma dose de P, as raízes do acesso BRA responderam de forma linear, de modo que o aumento na concentração de Cu reduziu a concentração de P na raízes. As doses de Cu no solo, na presença de 60 mg kg-1 de P para o acesso JB e 120 mg kg-1 de P para o acesso BRA, não acarretaram diferenças nas concentrações de P nas raízes. No entanto, a menor dose de Cu associada a 60 mg kg-1 de P proporcionou às raízes do acesso BRA um incremento no teor de P em relação às demais doses de Cu. Já para o acesso JB, na dose 120 mg kg-1 de P, houve um decréscimo na concentração desse elemento nas raízes com o aumento na dose de Cu (Tabela 3). 3.1.3 Índice de translocação O índice de translocação (IT) para Cu é apresentando na tabela 4. O IT mede a capacidade da planta em translocar os metais das raízes para a parte aérea (YOON et al., 2006; MELO et al., 2009). Os índices de translocação de Cu no acesso BRA foram maiores do que no acesso JB. A translocação de Cu tanto para as folhas como para as hastes do acesso JB, na presença de 10, 60 e 120 mg kg-1 de P foram maiores nas doses de 0 mg kg-1 de Cu, enquanto que os menores índices de translocação foram encontrados na dose de 80 mg kg-1 de Cu. Em relação à translocação de Cu para a parte aérea no acesso BRA, as respostas foram similares às do acesso JB, sendo que as folhas e hastes apresentaram a maior translocação de Cu na dose de 0 mg kg-1 de Cu e na presença de 10 e 120 mg kg-1 de P. Já na presença de 60 mg kg-1 de P, os maiores índices ocorreram tanto na dose de 0 mg kg-1 de Cu como na dose de 20 mg kg-1 de Cu (em média 1,87). No entanto, com exceção da dose 10 mg kg -1 de P que 41 apresentou menor IT tanto para folhas como para as hastes na presença de 20 mg kg-1 de Cu, nas duas outras doses de P, o menor IT, tanto para as folhas como para as hastes, ocorreu na maior dose de Cu (80 mg kg-1). Tabela 4. Índice de translocação de Cu para parte aérea de dois acessos de Pfaffia glomerata (JB e BRA) cultivados em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo (mg kg-1). Cu 0 20 40 80 0 20 40 80 0 20 40 80 Tratamentos P 10 10 10 10 60 60 60 60 120 120 120 120 Acesso JB IT- Folhas IT- Hastes 1,05 ± 0,24 0,61 ± 0,13 0,76 ± 0,01 0,49 ± 0,05 0,69 ± 0,24 0,37 ± 0,11 0,53 ± 0,02 0,37 ± 0,03 1,07 ± 0,03 0,55 ± 0,01 0,83 ± 0,29 0,60 ± 0,07 0,98 ± 0,11 0,59 ± 0,13 0,78 ± 0,15 0,43 ± 0,14 1,97 ± 1,63 0,59 ± 0,30 1,16 ± 0,09 0,54 ± 0,17 0,67 ± 0,01 0,47 ± 0,04 0,50 ± 0,09 0,45 ± 0,12 Acesso BRA IT- Folhas IT- Hastes 2,32 ± 0,21 1,96 ± 0,11 1,29 ± 0,09 1,29 ± 0,04 2,08 ± 0,14 1,63 ± 0,33 1,88 ± 0,25 1,64 ± 0,10 1,86 ± 0,27 1,29 ± 0,78 1,88 ± 0,05 1,64 ± 0,53 1,48 ± 0,26 1,27 ± 0,13 0,77 ± 0,16 0,66 ± 0,08 2,37 ± 0,13 1,95 ± 0,34 1,75 ± 0,44 1,84 ± 0,03 1,29 ± 0,08 1,00 ± 0,05 0,65 ± 0,21 0,62 ± 0,16 3.1.4 Índice de acumulação nas raízes O Índice de acumulação nas raízes (IAR) para o Cu é apresentado na tabela 5. O IAR mede o quanto do Cu que foi absorvido ficou acumulado nas raízes, verificando-se que este índice variou com o acesso, onde os maiores índices foram observados no acesso JB, em todos os tratamentos, variando de 1,6 a 2,8. 42 Tabela 5. Índice de acumulação nas raízes dois acessos de Pfaffia glomerata (JB e BRA) cultivados em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo (mg kg-1). Cu 0 20 40 80 0 20 40 80 0 20 40 80 Tratamentos P 10 10 10 10 60 60 60 60 120 120 120 120 Acesso JB Acesso BRA 2,21 ± 0,02 2,39 ± 0,09 2,38 ± 0,01 1,66 ± 0,11 2,22 ± 0,09 1,75 ± 0,10 1,91 ± 0,08 1,56 ± 0,11 2,84 ± 0,10 1,79 ± 0,11 1,68 ± 0,10 2,23 ± 0,09 0,09 ± 0,05 0,14 ± 0,01 0,09 ± 0,02 0,11 ± 0,02 0,18 ± 0,01 0,10 ± 0,03 0,12 ± 0,01 0,21 ± 0,02 0,09 ± 0,04 0,14 ± 0,01 0,17 ± 0,02 0,28 ± 0,02 3.1.5 Concentrações de nutrientes As concentrações dos nutrientes nas plantas do acesso BRA foi mais afetada pelo Cu do que o acesso JB (Tabela 6). A análise das correlações entre o Cu e os nutrientes nas raízes do acesso JB foi positiva e forte (ρ acima de 0,70) para o Mn, enquanto que para o Zn e o Fe se manteve moderada, com ρ = 0,44 e ρ = 0,68, respectivamente. Nas hastes do acesso JB, os teores de Cu também se correlacionaram positivamente com o Mn e com o K, os quais apresentaram coeficientes de correlação de 0,59 e 0,48, respectivamente. No entanto, para as folhas do acesso JB, a correlação apesar de positiva para Mn e Zn, apresentou-se pequena ρ = 0,35 e ρ = 0,28, respectivamente (Tabela 6). Para o acesso BRA, ocorreu correlação positiva forte com o Mn nas hastes, a qual apresentou coeficiente de 0,72. Já nas raízes, ocorreram correlações moderadas com o Ca, o Fe e o Mn, enquanto nas folhas estas correlações foram observadas com o Zn e o P (Tabela 6). Para o Fe não houve correlação significativa com o Cu nas folhas, no entanto as plantas de ambos os acessos apresentaram 43 deficiência induzida de Fe (Figura 3) (Apêndice – C). Para os demais nutrientes não foi observado teores abaixo da faixa nutricional adequada, para ambos os acessos. Tabela 6. Coeficiente de correlação de Pearson (ρ) entre Cu dosado nos tecidos (folhas, hastes e raízes) e os nutrientes P, Ca, Mg, Fe, K, Mn e Zn, presentes nos respectivos tecidos de dois acessos Pfaffia glomerata (JB e BRA) cultivados em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo. -1 Elementos P Ca Mg Fe K Mn Zn Doses de Cu (mg kg ) Folhas NS -0,18 NS -0,06 NS -0,02 NS 0,20 NS 0,18 0,35* 0,28* Acesso JB Haste NS -0,25 0,26* 0,26* NS -0,13 0,48* 0,59* NS 0,20 Raiz 0,38* 0,28* 0,25* 0,68* NS 0,20 0,84* 0,44* Folhas 0,48* 0,32* NS - 0,03 NS 0,002 NS 0,082 0,33* 0,66* Acesso BRA Haste 0,26* 0,35* 0,26* NS 0,09 0,49* 0,72* NS -0,16 Raiz NS 0,01 0,58* 0,52* NS 0,04 0,29* 0,53* 0,27* Significativo ao nível de * P <0,05 nível NS Não significativo 3.1.6 Produção de β-ecdisona Os acessos de P. glomerata diferiram entre si em relação à concentração de β-ecdisona nas raízes, sendo que o acesso JB apresentou um maior teor desse metabólito quando comparado ao acesso BRA. O maior teor de β-ecdisona nas raízes do acesso JB ocorreu nas doses de 0 mg kg-1 de Cu e 10 mg kg-1 de P, enquanto que nas plantas do acesso BRA a maior concentração foi encontrada no tratamento com 40 mg kg-1 de Cu e 10 mg kg-1 de P. Houve uma diminuição significativa no teor de β-ecdisona nas raízes das plantas do acesso JB nos tratamentos que continham 120 mg kg-1 de P, enquanto que as plantas do acesso BRA, apresentaram esta mesma diminuição significativa apenas na dose de 80 mg kg-1 de Cu com 120 mg kg-1 de P (Tabela 7). 44 Tabela 7. Teor de β-ecdisona (µg g-1 de matéria seca) em raízes de dois acessos de P. glomerata (JB e BRA) cultivada em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo. Doses de Cu mg kg -1 Acesso JB Doses de P mg kg 10 60 120 10 60 120 -1 0 20 40 66 ± 0,18 Aa* 56 ± 0,95 Ba 46 ± 0,38 Cb 62 ± 4,51 Ab 63 ± 0,17 Ab 54 ± 0,13 Bb 60 ± 0,35 Ab 51 ± 0,63 Ca 51 ± 0,15 Ba Acesso BRA 52 ± 3,45 Ab 51 ± 3,35 Aab 51 ± 1,32 Ab 50 ± 4,20 Ab 49 ± 0,22 Ab 47 ± 0,11 Ab 60 ± 0,40 Aa 59 ± 0,13 Aa 55 ± 3,45 Aa 80 52 ± 0,15 Ac 51 ± 0,45 Ab 46 ± 0,45 Bb 50 ± 2,65 ABb 56 ± 3,01 Aa 48 ± 0,56 Bb * Médias seguidas de letras minúsculas na linha diferem significativamente entre as doses de Cu ao nível 5% de probabilidade pelo teste F (P≤0,05). Médias seguidas de letras maiúsculas na coluna diferem significativamente entre as doses de P ao nível 5% de probabilidade pelo teste F (P≤0,05). Diferenças na massa seca das raízes de ambos os acessos de P. glomerata influenciaram na quantidade total do princípio ativo. Os resultados obtidos em relação ao conteúdo de β-ecdisona nas raízes demonstram que, para ambos os acessos, a maior produção de β-ecdisona ocorreu na dose de 40 mg kg-1 de Cu e na presença de 10 e 120 mg kg-1 de P. Já na presença de 60 mg kg-1 de P, o conteúdo de β-ecdisona foi maior na dose de 80 mg kg-1 de Cu, para ambos os acessos (tabela 8). 45 Tabela 8. Conteúdo de β-ecdisona (g raiz-1) em raízes de dois acessos de P. glomerata (JB e BRA) cultivada em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo. Doses de Cu mg kg -1 Acesso JB Doses de P mg kg 10 60 120 10 60 120 -1 0 0,29 ± 0,06 Ab* 0,24 ± 0,12 Ac 0,20 ± 0,04 Ab 0,11 ± 0,01 Ab 0,09 ± 0,06 Bab 0,10 ± 0,01 ABb 20 40 80 0,19 ± 0,11 Bab 0,32 ± 0,04 Aa 0,29 ± 0,06 Aab 0,31 ± 0,07 Aab 0,28 ± 0,05 Aab 0,29 ± 0,04 Aa Acesso BRA 0,06 ± 0,05 Bc 0,38 ± 0,13 Aa 0,03 ± 0,02 Bc 0,11 ± 0,01 Ab 0,08 ± 0,02 Bc 0,09 ± 0,01 Bb 0,09 ± 0,01 Bc 0,11 ± 0,04 Aa 0,09 ± 0,02 Bb 0,14 ± 0,04 Aa 0,10 ± 0,03 Ba 0,11 ± 0,01 Ba * Médias seguidas de letras minúsculas na linha diferem significativamente entre as doses de Cu ao nível 5% de probabilidade pelo teste F (P≤0,05). Médias seguidas de letras maiúsculas na coluna diferem significativamente entre as doses de P ao nível 5% de probabilidade pelo teste F (P≤0,05). 4 DISCUSSÃO No presente estudo observou-se que a produção de matéria seca das plantas variou entre os dois acessos, em função da quantidade de cobre e fósforo disponível no solo. As plantas de ambos os acessos, JB e BRA, exposto aos tratamentos de Cu e P no solo apresentaram aumento na produção de matéria seca de folhas, de hastes e de raízes nas doses de 40 mg kg-1 de Cu e 10 mg kg-1 de P, enquanto que quando expostas à dose mais elevada de Cu, junto à menor e maior dose de fósforo, mostraram acentuada redução no crescimento da parte aérea e raízes, com o aparecimento de necrose nas folhas (Figura 3). Apesar do Cu ser um elemento essencial para o crescimento das plantas e ter funções importantes em muitos processos fisiológicos, como a fotossíntese, a respiração, a distribuição de carboidratos, a redução do N, e o metabolismo de proteínas (YRUELA, 2005), o excesso desse nutriente pode se tornar tóxico para as plantas (MICHAUD et al., 2007; MICHAUD et al., 2008; BRAVIN et al., 2010). Entretanto, o aumento da concentração da dose P para 60 mg kg-1 no solo, retardou visualmente o aparecimento desses sintomas, indicando um possível efeito protetor do P sobre a toxidez de Cu nas plantas, favorecendo seu desenvolvimento. O P aumenta a 46 adsorção do cobre no solo (SARIOGLU et al., 2005) diminuindo, assim, a disponibilidade de cobre na solução do solo (LIU et al., 2007). Para Girotto et al. (2010) a biodisponibilidade e a mobilidade de elementos químicos, como o cobre e o fósforo, são dependentes da sua concentração na solução, da natureza da associação com outras espécies iônicas solúveis e da habilidade do solo em fornecê-los para a solução. A interação entre P e Cu, nos solos onde foram cultivadas as plantas de P. glomerata, pode ter diminuído a toxicidade de Cu, tal como observado para Cd (NAIDU et al., 1994; BOLAN et al., 1999) e para o Cu (PÉREZ-NOVO et al., 2009), em estudos sobre solos onde a adição de fosfato aumentou a adsorção desses metais. Após a adição de 120 mg kg-1 de P no solo, na menor concentração de Cu, houve um aumento na quantidade de P disponível, o que promoveu incrementos na produção de matéria seca para ambos os acessos, evidenciando uma resposta positiva da aplicação desse nutriente no crescimento dessa espécie. Além disso, na dose de 80 mg kg-1 de Cu e 120 mg kg-1 de P houve uma redução nos teores de P na parte aérea das plantas, o qual manteve-se acima do limite estabelecido como concentração ideal de 2,0 g kg-1 de P (0,2%) na matéria seca (NOVAIS et al., 2007). Este comportamento pode estar relacionado com o efeito de concentração do nutriente, uma vez que houve redução no crescimento das plantas com o aumento das doses de Cu no solo. Em adição, o Cu interage com muitos nutrientes no solo alterando sua disponibilidade na solução do solo, sendo com o fósforo uma das mais importantes (ABREU et al., 2001). A interação do íon fosfato pode interferir na solubilidade dos elementos metálicos, formando precipitados pouco solúveis e diminuindo a concentração do íon em solução (CAMARGO et al., 2001). A maior produção de matéria seca das raízes do acesso JB, em relação à baixa aplicação de P está em concordância com as observações de SKREBSKY et al. (2008), que verificaram que no baixo teor de fósforo no solo houve pouca redução na biomassa radicular de P. glomerata. Esses autores sugerem que na baixa disponibilidade de P, esta espécie redireciona a distribuição de fotoassimilados. Uma das explicações para isto é que as raízes, estando mais próximas da fonte de suprimento, usam do limitado influxo destes nutrientes para as próprias necessidades de manutenção e crescimento (FERNANDES, 2007). 47 As concentrações de P encontradas nos tecidos das plantas do acesso JB, quando comparadas ao acesso BRA foram significativamente maiores. Verificou-se, de maneira geral, que o aumento das doses de Cu reduziu os teores de P na matéria seca da parte aérea. Alguns autores (MA; RAO, 1997; CHEN et al., 1997; CAO et al.; 2003) têm mostrado que a remediação de solos contaminados por metais, através da adição de fosfatos é eficiente em função dos metais pesados adquirirem formas químicas menos solúveis, e, como consequência uma menor absorção de fósforo pelo sistema radicular. Os teores de P na parte aérea do acesso JB, aumentaram de acordo com o aumento de P no solo, enquanto que os teores de Cu na parte aérea diminuíram significativamente. Possivelmente o fósforo esteja limitando a translocação de Cu das raízes para a parte aérea, pela formação de compostos insolúveis capazes de reduzir o transporte do Cu (SOARES et al., 2006). A maior concentração de Cu nas raízes em relação às folhas e às hastes no acesso JB não resultaram num alto grau de toxicidade, ao contrário do que foi visto por outros autores quando estudaram os efeitos de outros metais (CARNEIRO et al., 2002; LIMA et al., 2006;. MISHRA et al., 2006). O suprimento adequado de P possibilita também o aumento da retenção de metais pesados nas raízes das plantas por meio da formação de compostos insolúveis, restringindo, assim, o transporte desses elementos para a parte aérea (VAN STEVENINCK et al., 1994; BROWN et al., 1995; SOARES et al., 2006). A retenção de Cu nos tecidos das raízes pode ser devido à imobilização do Cu na parede celular, exclusão ou restrição da absorção, compartimentalização no vacúolo com complexos solúveis, formação de quelatos na interface parede celularmembrana e fitoquelatinas, que quelatam metais pesados nas células, evitando danos intracelulares (MARSCHNER, 2011). Além disso, o maior teor de Cu nas raízes do acesso JB pode estar relacionado com a baixa translocação do Cu das raízes para parte aérea. Isto pode ser observado em resultados de muitos estudos em que a concentração de Cu nas raízes é maior que na parte aérea (CHAIGNON e Hinsiger, 2003; KOPITTKE; MENZIES, 2006; MICHAUD et al., 2007; MICHAUD et al., 2008). A retenção de Cu nas raízes é um mecanismo de tolerância ao excesso do metal, ocorrendo, por exemplo, a imobilização do metal na parede celular por carboidratos extracelulares, e consequentemente, a reduzida presença de íons livres para transporte até a parte aérea (LASAT, 2002). 48 As raízes do acesso JB atuaram como uma barreira natural ao excesso de Cu reduzindo a transferência do metal para o restante da planta. Por outro lado, quando esses índices de translocação apresentaram valores maiores que 1, há uma indicação da elevada taxa de absorção do elemento e sua translocação e acúmulo na parte aérea (BAKER; WHITING, 2002; MCGRATH; ZHAO, 2003). Os resultados encontrados por meio do índice de translocação para o acesso BRA revelam que este acesso tem uma elevada concentração de Cu na parte aérea, sugerindo a existência de mecanismos específicos relacionados à absorção, transporte e acúmulo, que permitem e facilitam a permanência de valores altos de Cu nos tecidos foliares. Os teores de Cu nas raízes do acesso BRA foram menores e foram influenciadas pelo aumento das doses de Cu no solo, além disso, verificou-se uma redução acentuada na produção de matéria seca das raízes, quando comparado ao acesso JB. Este fato também foi visto em estudo com Arabidopsis thaliana a qual mostrou uma evidente redução no peso de raízes sob altos níveis de Cu em solução hidropônica (LEQUEUX et al., 2010). Os resultados das correlações entre as concentrações dos nutrientes e do Cu nos tecidos apresentaram correlações fracas, moderadas e fortes para os dois acessos estudados. A correlação positiva nas raízes do acesso JB na absorção do Ca e do P são relatadas na literatura por desempenhar um papel importante na integridade das membranas celulares e um desequilíbrio destes nutrientes pode afetar o processo de absorção, e, por conseguinte, a concentração destes elementos nas raízes (KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2011). A absorção de Mg2+, principalmente nas raízes do acesso BRA, as quais acumularam menos Cu, está de acordo com os resultados obtidos no estudo de Chen et al. (2013) sobre o modelo de ligante biótico onde a competição entre Mg2+ e Cu2+ sobre os sítios de ligação da membrana plasmática (isto é, os ligantes bióticos) podem resultar na diminuição da toxicidade do Cu e na acumulação nas raízes. As interações entre o Cu-Mn na nutrição das plantas são relatadas na literatura como sendo tanto sinérgica como antagonista (ADHIKARY; KARKI, 2006). O Mn atua como cofator de várias enzimas tais como a superóxido-dismutase, Mncatalase, piruvato carboxilase e fosfoenolpiruvato carboxiquinase. A correlação positiva entre o Cu e o Mn para os orgãos de ambos os acessos, sugerem um 49 possível papel do Mn como um agente antioxidante capaz de atuar na desintoxicação de espécies reativas de oxigênio (TANAKA et al., 1995; YU et al., 1998; YU; RENGEL, 1999). A concentração de Zn na parte aérea no acesso BRA pode estar relacionada com a maior translocação do Cu para as folhas. Soares et al. (2001) observaram em Myroxylon peruiferum e Piptadenia gonoacantha que houve uma maior quantidade de Zn e Cd nas folhas, quando cultivadas em solos contaminados por rejeitos de indústria de zinco, sugerindo que a maior concentração presente na parte aérea pode ser devido a eficientes mecanismos de translocação. A correlação positiva entre o Cu e o Fe nos tecidos das raízes do acesso JB, pode estar sendo desencadeada pela complexação do Fe com o P presente nas raízes, deixando o mesmo numa forma indisponível para translocação raiz/parte aérea (VAN STEVENINCK et al., 1994; BROWN., 1995). Jouvin et al. (2012) relataram um aumento da concentração de Cu nas raízes das plantas de tomate com um incremento de Fe, sem incremento na parte aérea, e a resposta oposta em plantas de trigo em condições idênticas, que foram correlacionadas com a formação dos fitosideróforos. As concentrações de β-ecdisona encontradas nas raízes de P. glomerata diferiram em relação aos acessos e aos tratamentos. Já o conteúdo de β-ecdisona sofreu influência dos tratamentos e também da massa seca de raízes, variando entre 0,03 a 0,38 g raiz-1 para o acesso JB e de 0,08 a 0,14 g raiz-1 para o acesso BRA. Variações no teor de β-ecdisona são frequentemente observadas entre diferentes acessos de P. glomerata (FIGUEIREDO et al., 2004), o que segundo Magalhães (2000) e Figueiredo et al. (2004), são decorrentes, principalmente de fatores genéticos. Estudos conduzidos com P. glomerata demonstraram variações em relação ao conteúdo de β-ecdisona presente nas raízes da planta (0,15 a 0,75%) e em amostras comerciais (0,3 a 0,5%) (MAGALHÃES, 2000; FIGUEIREDO et al., 2004). A presença de vários compostos ecdiesteróides conjugados em plantas, por exemplo, fosfatos, sulfatos, acetatos e benzoatos podem ser essenciais para a regulação da via biossintética nessas espécies (SAATOV et al., 1984; SAATOV et al., 1987). Neste estudo, as concentrações de Cu não afetaram a produção de βecdisona. Quanto às doses de P, verificou-se diminuição na produção de β- 50 ecdisona. Os menores teores de ecdisterona foram detectados nas amostras oriundas das doses de 120 mg kg-1 de P. Uma vez que as plantas produzem principalmente ecdisteróides polifosforilados pode-se esperar que a biossíntese dos ecdisteróides seja afetada negativamente apresentando baixos níveis destes produtos, corroborando nossos resultados. Grebenok et al. (1994) observaram que a formação de intermediários de ecdisona-P em espinafre inibiram a biossíntese dos fitoesteróis e dos fitoecdisteróides. Estes conjugados de polifosfato parecem atuar como um feedback negativo nos compostos regulatórios sobre a biossíntese endógena dos ecdiesteróides. Alternativamente, estes conjugados de fosfato em outras espécies podem ser produtos essenciais para o transporte de ecdisteróides dentro da planta, ou como um meio de evitar os mecanismos de desintoxicação causados por insetos específicos que se alimentam destas espécies particulares (GREBENOK et al., 1994; DEVARENNE et al., 1995). Além disso, a presença dos ecdiesteróides fosfatos é aparentemente importante para o controle geral do fluxo de carbono para a via dos ecdisteróides. Neste caso, os nossos resultados sugerem que os baixos níveis de fósforo no solo resultaram numa adequada concentração de P nas raízes, as quais foram importantes para regulação da biossíntese dos fitoesteróis e fitoecdisteróides nestas plantas, resultando numa maior produção de β-ecdisona. Estudos como estes são essênciais quando se trata de plantas de uso medicinal, já que as mesmas podem vir acumular metais pesados, aumentando o potencial desses elementos tóxicos na cadeia alimentar. 4 CONCLUSÕES 1. A máxima produção de massa seca de plantas ocorreu para ambos os acessos (JB e BRA) de Pfaffia glomerata nas doses de 40 mg kg-1 de Cu e 10 mg kg1 de P. 2. O excesso de Cu (80 mg kg-1) reduziu o crescimento das plantas de ambos os acessos, quando na presença das doses de 10 e 120 mg kg-1 de P. 51 3. A adição de 60 mg kg-1 de P exerceu efeito protetor na toxidez de Cu para ambos os acessos de Pfaffia glomerata, favorecendo seu desenvolvimento. 4. Alta disponibilidade de P no solo aumentou a fitoxidez causada por excesso de Cu em P. glomerata. 5. As concentrações de β-ecdisona detectadas nas raízes de P. glomerata do acesso JB foram maiores quando comparadas ao acesso BRA. As doses de Cu parecem não ter afetado o metabolismo secundário desta planta para a produção de β-ecdisona. No entanto, a adição de P (120 mg kg-1) no solo reduziu o teor de βecdisona. AGRADECIMENTOS Os autores gostariam de agradecer a PIONEER, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), a Coordenação e Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Fundação de Amparo à Pesquisa de Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pelo apoio financeiro. Referências ABREU, C. A.; FERREIRA, M. E.; BORKERT, J. C. Disponibilidade e avaliação de elementos catiônicos: zinco e cobre. In: FERREIRA, M. E. et al. Micronutrientes e elementos tóxicos na agricultura. Jaboticabal: CNPq/FAPESP/POTATOS, p. 125150, 2001. ADHIKARY, B. H.; KARKI, K. B. Effect of potassium on potato tuber production in acid soils of Malepatan, Pokhara. Nepal Agriculture Research Journal, v. 7, p. 4248, 2006. ANDRIOLO, J. L. Sistema hidropônico fechado com subirrigação para produção de minitubérculos de batata. In: SIMPÓSIO DE MELHORAMENTO GENÉTICO E PREVISÃO DE EPIFITIAS EM BATATA, 2006. Anais. Santa Maria: UFSM, CCR, Departamento de Fitotecnia, p. 26-40, 2006. 52 BAKER, A. 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Acesso JB Cu (mg kg-1) - P (mg kg-1) Parâmetros Cu (mg kg-1) -1 P (mg kg ) 0-10 20-10 40-10 80-10 0-60 20-60 40-60 80-60 0-120 20-120 40-120 80-120 3,2 15,2 32,9 69,5 4,5 16,7 32,7 58,6 15,3 15,8 30,8 71,6 5,1 6,0 7,1 7,4 30,8 32,8 33,3 34,5 71,2 82,4 67,6 82,0 -1 2,1 2,2 2,3 2,9 2,7 2,2 2,0 2,7 1,9 2,1 2,3 2,2 -1 Mg (cmolc kg ) 1,1 1,0 1,3 1,3 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,7 1,1 1,3 Al 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 K (mg kg-1) 38,2 38,6 41,8 43,4 34,0 32,0 36,2 33,2 32,8 40,6 15,2 34,0 % MO 1,5 1,4 1,3 1,3 1,6 1,4 1,5 1,3 1,5 1,4 1,4 1,4 pH 5,7 5,5 5,6 5,7 5,5 5,5 5,6 5,6 5,7 5,7 5,6 5,7 Ca (cmolc kg ) Acesso BRA Cu (mg kg-1) -1 P (mg kg ) 3,2 14,3 33,0 68,4 4,2 15,2 34,7 66,4 5,2 15,3 34,7 74,3 5,5 10,8 5,8 6,1 30,8 31,7 35,3 32,4 72,6 84,0 75,3 80,2 -1 2,4 2,8 3,0 2,6 2,8 3,2 2,5 2,8 3,2 3,1 2,8 2,8 -1 Mg (cmolc kg ) 0,9 1,0 1,0 1,1 0,9 1,0 1,0 1,0 1,1 1,7 1,0 1,0 Al 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 K (mg kg ) 34,4 39,2 38,6 40,6 41,6 45,6 34,2 42,2 32,8 34,6 33,2 34,2 % MO 1,4 1,4 1,5 1,4 1,4 1,3 1,5 1,2 1,5 1,4 1,5 1,5 pH 5,6 5,7 5,6 5,6 5,6 5,5 5,5 5,5 5,5 5,6 5,7 5,6 Ca (cmolc kg ) -1 67 APÊNDICE-C Concentração de Fe (mg kg-1) na parte aérea e raízes de Pfaffia glomerata cultivada em Argissolo Vermelho distrófico típico com aplicação de diferentes doses de cobre e fósforo. Doses de Cu mg kg -1 Acesso JB – Raiz Doses de P mg kg -1 0 20 40 80 10 2200 Aa 1650 Ba 1930 Bb 780 Ca 60 1700 Ab 1580 Aa 1420 Aa 1040 Aa 120 710 Ac 970 Ab 1006 Ab 970 Ba Acesso JB – Haste 10 40 Aa 30 Ab 40 Aa 50 Aa 60 40 Ba 70 Aa 30 Ba 30 Ba 120 40 Aa 30 Ab 40 Aa 60 Aa Acesso JB – Folhas 10 230 Aa 170 Ba 160 Bb 24,5 Cb 60 160 Bb 200 Ba 250 Aa 190 Ba 120 190 Ab 190 Aa 110 Bb 10,6 Cb Acesso BRA – Raiz 10 620 Aa 360 Ba 350 Ba 190 Bc 60 420 Ab 380 Aa 440 Ab 590 Ab 120 300 Cb 530 Ba 500 Bb 880 Aa Acesso BRA – Haste 10 14,55 Aa 15,95 Aa 14,20 Aa 9,05 Bb 60 12,84 Ba 17,35 Ba 16,05 Ba 21,20 Aa 120 15,60 Aa 12,00 Aa 17,10 Aa 12,55 Ab Acesso BRA – Folhas 10 190 Aa 150 Ab 145 Aa 60 190 Ba 520 Aa 260 Ba 120 220 Aa 290 Ab 190 Aa 38,5 Bb 390 Ba 40,7 Bb * Médias seguidas de letras minúsculas na linha diferem significativamente entre as doses de Cu ao nível 5% de probabilidade pelo teste F (P≤0,05). Médias seguidas de letras maiúsculas na coluna diferem significativamente entre as doses de P ao nível 5% de probabilidade pelo teste F (P≤0,05).
