PROTOCOLO AULA PRÁTICA Nº 1

PL4 - ABUNDÂNCIA E BIOMASSA DE BACTERIOPLÂNCTON HETEROTRÓFICO
OBJETIVOS
1. Aplicar a técnica de enumeração direta por microscopia de epifluorescência para
avaliação da abundância total de bacterioplâncton heterotrófico, TBN (Total Bacterial
Number; Hobbie et al. 1977) em ecossistemas costeiros protegidos e expostos.
2. Quantificar a biomassa de bacterioplâncton heterotrófico em ecossistemas costeiros
confinados e expostos.
3. Discutir os fatores reguladores da abundância e biomassa de bacterioplâncton
heterotrófico em ecossistemas marinhos confinados e protegidos.
MATERIAL E MÉTODOS
1. EXECUÇÃO DAS PREPARAÇÕES
MICROSCÓPICAS
Fixar a amostra com uma solução de formaldeído ou gluteraldeído esterilizada por
filtração (filtro com diâmetro de poro 0,2 µm) de forma a obter uma concentração
final do fixador de 2%. Armazenar a amostra fixada no escuro e no frigorífico (4 oC)
até ao seu processamento. O período de armazenamento da amostra deve ser
minimizado (ver Anexo).
Montar o funil e suporte de filtração e lavá-los com água destilada pré-filtrada por
um filtro de 0,2 µm.
Com uma pinça estéril colocar um filtro de suporte (membrana de celulose,
diâmetro de poro
0,45 µm) sobre o suporte de filtração previamente
humedecido com uma gota de água destilada pré-filtrada por um filtro de 0,2 µm.
Colocar sobre o filtro de suporte um filtro de membrana de policarbonato não
fluorescente (diâmetro de poro: 0,20 µm) previamente corado com negro de
Irgalão. Colocar a face brilhante do filtro virada para cima, evitar a formação de
rugosidades no filtro e centrar o filtro corretamente no suporte.
Colocar a chaminé de filtração e ajustá-la com a mola.
Homogeneizar a amostra fixada no agitador de vórtice durante 15 segundos. Em
amostras com elevada quantidade de matéria em suspensão (ex: sedimentos) é
necessário utilizar técnicas específicas de extração e dispersão de agregados de
------------------------------------------------------------------------------------------------------ 19
UC Microbiologia Marinha (Aulas práticas) – 2012/2013
Ana Barbosa
células ou células aderentes a partículas. Estas técnicas incluem processos
mecânicos de extração/dispersão (ex: homogeneizador de tecidos, agitador de
vórtice, ultrasonificação) ou processos químicos.
Com uma micropipeta com ponta esterilizada, transferir para o funil de filtração
um volume adequado de amostra (ex: 1 – 5 ml). O volume de amostra filtrado deve
ser ajustado de forma a obter entre 20 e 35 células por campo microscópico. Se
utilizar um volume de amostra inferior a 1 ml, diluir a amostra com água do mar
esterilizada por filtração (filtro com diâmetro de poro 0,2 µm) de modo a obter um
volume total de líquido no funil superior a 1 ml.
Ligar a bomba de vácuo e filtrar a amostra utilizando uma pressão de vácuo inferior
a 50 mm Hg.
Adicionar sobre o filtro 1 ml de solução do fluorocromo laranja de acridina
(concentração 1%) pré-filtrada por um filtro de 0,2 µm. Verificar se toda a
superfície do filtro se encontra coberta pelo corante. Proteger o funil de filtração e
amostra com papel de alumínio e esperar 3 minutos. Atenção, o corante laranja de
acridina é um composto potencialmente carcinogénico pelo que é obrigatória a
utilização de luvas.
Durante este período de espera, identificar uma lâmina com a referência da
amostra e grupo de trabalho. Colocar uma gota de óleo não fluorescente (ex:
Cargile A) sobre a lâmina e, com o auxílio de uma lamela, espalhá-la de modo a
formar uma camada fina e homogénea.
Após 3 minutos da adição da solução de laranja de acridina, ligar a bomba de vácuo
e remover o corante por filtração.
Com a bomba de vácuo ainda em funcionamento, retirar o filtro do suporte de
filtração e colocá-lo sobre a lâmina previamente coberta com óleo de imersão.
Evitar a formação de bolhas de ar.
Colocar uma gota de óleo não fluorescente sobre o filtro e uma lamela sobre este.
Com o auxílio de um fragmento de papel absorvente, comprimir a preparação de
forma a remover o excesso de óleo.
Armazenar a preparação numa caixa apropriada, no escuro e congelador (-20 oC),
até ao momento da sua análise microscópica.
Executar uma preparação controlo com base na filtração de 1 ml de água do mar
esterilizada por filtração (filtro com diâmetro de poro 0,2 µm).
-----------------------------------------------------------------------------------------------------UC Microbiologia Marinha (Aulas práticas) – 2012/2013
Ana Barbosa
20
2. ANÁLISE DAS PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS
Colocar uma gota de óleo não fluorescente sobre a lamela.
Interpor o filtro azul (excitação 450-490 nm) no microscópio de epifluorescência e
observar a preparação utilizando uma ampliação total de 1250x.
Para cada amostra, definir a área do campo de observação com o auxílio do
gratículo (New Porton G12) instalado na ocular de modo a obter entre 20 e 35
células por campo microscópico (ver Fig. 12).
Para cada amostra enumerar, no mínimo, as bactérias existentes em 20 campos de
observação selecionados aleatoriamente ou os campos necessários até perfazer
um total de 300 bactérias. Considerar bactérias os corpos com forma e dimensões
características (ex: cocóide, bastonete, vibrião, espirilo, filamento) e fluorescência
verde ou laranja. Anotar o número de células em divisão observadas.
Com o auxílio do gratículo instalado numa das oculares do microscópio,
determinar, por comparação com círculos de diâmetro conhecido (ver Fig. 12), as
dimensões (diâmetro dos cocos e largura e comprimento das restantes bactérias)
de 50 células por amostra, selecionadas ao acaso. O gratículo New Porton G12 é
constituído por duas séries de círculos, numerados de 0 a 10, cujos diâmetros
aumentam de acordo com uma progressão geométrica de razão √2.
Ø círculo 0: 0,220 µm
Ø círculo 1: 0,311 µm
Ø círculo 2: 0,440 µm
Ø círculo 3: 0,628 µm
Ø círculo 4: 0,888 µm
Ø círculo 5: 1,256 µm
Ø círculo 6: 1,776 µm
Ø círculo 7: 2,512 µm
Ø círculo 8: 3,552 µm
Ø círculo 9: 5,023 µm
Ø círculo 10: 7,104 µm
→ condições observação
sessão prática
Figura 12 - Representação do gratículo ocular
New Porton G12 (extraído de May, 1965).
-----------------------------------------------------------------------------------------------------UC Microbiologia Marinha (Aulas práticas) – 2012/2013
Ana Barbosa
21
3. CÁLCULO DA ABUNDÂNCIA TOTAL E BIOMASSA BACTERIANAS
Para cada amostra analisada, calcular a abundância total de bactérias (TBN) com
base na equação 1.
TBN (bactérias.l-1) = (X * A * d) / (a * n * V)
equação 1
onde:
X - número total de bactérias enumeradas
A - área útil de filtração do filtro de policarbonato (a definir)
d – fator de correção da diluição da amostra induzida pela adição de
gluteraldeído (relação volume amostra fixada : volume amostra)
a - área do campo de observação (a definir)
n - número total de campos observados
V - volume de amostra fixada filtrado (l)
Para cada amostra, calcular o volume celular de cada bactéria (VCi) com base na
equação 2.
VCi (µm3.célula-1) = ( /4) W2 (L - W/3)
equação 2
onde:
L - comprimento da célula (µm)
W - largura da célula (µm)
Para cada amostra, calcular o conteúdo celular em carbono de cada bactéria (CCi) e
o conteúdo celular em carbono médio (MCC) com base nas equações 3 e 4,
repetivamente (ver Norland, 1993).
CCi (fg C.célula-1) = 120 x VCi 0.7
equação 3
MCC (fg C.célula-1) =
equação 4
CCi / z
-----------------------------------------------------------------------------------------------------UC Microbiologia Marinha (Aulas práticas) – 2012/2013
Ana Barbosa
22
onde:
VC i (µm3.célula-1) – volume celular de cada célula medida
CCi – somatório do conteúdo em carbono das (z) células analisadas
z – número total de células medidas
Para cada amostra, calcular a biomassa bacteriana (BB) com base na equação 5 e
apresentar os resultados em µg C.L-1.
BB = TBN x MCC
equação 5
onde:
TBN (células.l-1) - abundância total de bactérias
MCC (fg C.célula-1) - conteúdo celular em carbono médio
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
Austin, B. (Ed.), 1988. Methods in aquatic bacteriology, John Wiley & Sons, Chichester,
254 p.
Hobbie, J.E., Daley, R.J. and Jaspar, S., 1977. Use of Nucleopore filters for counting
bacteria by epifluorescence microscopy. Appl. Environ. Microbiol., 33: 1225-1228.
Norland, S., 1993. The relationship between biomass and volume of bacteria. In:
Handbook of methods in aquatic microbial ecology, Eds.: P.F. Kemp, B.F. Sherr, E.B.
Sherr and J.J. Cole, Lewis Publishers, Boca Raton, 303-307 pp.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------UC Microbiologia Marinha (Aulas práticas) – 2012/2013
Ana Barbosa
23
ANEXO
(Turley and Hughes, 1994)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------UC Microbiologia Marinha (Aulas práticas) – 2012/2013
Ana Barbosa
24