Apresentação de Karen - Mario A. Lira Junior

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
SEMINÁRIO II
Atividade biológica associada à Atriplex nummularia em solo
salino-sódico no Agreste de Pernambuco
Discente: Karen Cristina Fialho dos Santos
Orientadora: Maria Betânia Galvão dos Santos Freire
Co-orientadores: Júlia Kuklinsky Sobral
Mario de Andrade Lira Junior
Novembro, 2009
Introdução
A salinidade em solos
• Acúmulo
de sais
•
Lençol freático
•
CE ≥ 4 dS/m
(Oliveira et al., 1992; Ribeiro et al., 2009)
Introdução
A salinidade em solos
•
Fator limitante para agricultura
• Aumento
•
considerado nas últimas décadas
Fatores:
•
Material de origem (gênese do solo)
•
Uso indiscriminado de água
•
Qualidade da água
(Liang et al., 2005)
Introdução
A salinidade em solos
No Brasil, acontece principalmente em regiões de clima árido e
semi-árido
•
Teor de sais que permite apenas o desenvolvimento de plantas
halófitas
•
•
Utilização para fitoextração
(Oliveira et al., 1992; Leal et al., 2008; Ribeiro et al., 2009)
Introdução
A cultura da Atriplex e sua utilização na recuperação de solos
salinos
•
Família Chenopodiacea (Austrália)
• Abundante
fitomassa
•
Precipitação de 100 a 250 mm/ano
•
Planta arbustiva, perene
• Altura
•
1,5 – 3,0 m e raízes de até 3,5 m
Toleram solos pouco profundos, secos e pobres em nutrientes
Precisam de sais para completar seu ciclo de vida (Halófilas
autênticas)
•
(Flower et al., 1977; Kelley et al., 1982; O’Leary, 1990; Porto et al, 2000; )
Introdução
A cultura da Atriplex e sua utilização na recuperação de solos
salinos
•
Folhas verde acinzentadas
Vesículas esbranquiçadas acumuladoras de sais – mecanismo de
tolerância
•
•
Por isso, usadas na fitoextração
(Kelley et al., 1982; Porto et al., 2000, Santana & Silva, 2000; Zhu, 2001).
Introdução
Microorganismos em ambientes salinos
•
Maioria presentes no Domínio Archea - halófilas
•
Cocos e bacilos
Requerem no mínimo 9% de NaCl no solo chegando a até 23%
(4mol/L)
•
•
Halotolerantes 2 a 5% de salinidade
•Para
adaptação – principalmente acúmulo de íons orgânicos para
equilibrar a tensão osmótica
(Santos et al., 2001, Kyaw, 2009; Oetterer, 2009).
http://www.scielo.br/img/revistas/qn/v30n1/24f1.gif
Introdução
Microorganismos em associação à Atriplex
• Adubação
•
nitrogenada para desenvolvimento da cultura
Conhecimento e isolamento de bactérias nativas que fixem N2
Aumento da capacidade do desenvolvimento em solos pobres –
promoção da fitorremediação
•
•
Produção do AIA
•
Estudos escassos sobre o tema
(Silva et al., 2008).
Objetivos
Geral
Avaliar o desenvolvimento de mudas de Atriplex nummularia sob
associação com microorganismos em condições de salinidade.
•
Objetivos
Específicos
Avaliar a comunidade bacteriana associada a plantas de Atriplex por
meio de isolamento em meio de cultura com alta concentração de sal
•
Identificar e analisar filogeneticamente os isolados bacterianos pelo
estudo do gene 16S rRNA;
•
Identificar e analisar a variabilidade genética de populações bacterianas
não-cultiváveis por meio da técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis).
•
Selecionar bactérias fixadoras de N2 e produtoras de ácido indol acético
(auxina), um regulador de crescimento vegetal;
•
Avaliar isolados bacterianos quanto
concentrações de salinidade in vitro;
•
a
tolerância
a
diferentes
Avaliar, em casa de vegetação, os efeitos da reinoculação de bactérias
selecionadas sobre o desenvolvimento inicial de plantas de Atriplex.
•
Material e Métodos
Material de estudo e amostragem
Bactérias associadas à ambientes com e sem plantas de Atriplex
nummularia
•
Experimento de campo, 2008, Neossolo Flúvico salino-sódico no
Município de Pesqueira (PE).
•
•
Período seco (dezembro) e chuvoso (agosto)
O solo - textura média, pH 9,1, CE de 21,49 dS/m e Na+ solúvel 29,8
cmolc/dm3
•
O experimento foi montado em delineamento experimental em blocos
casualizados
•
•
Três tratamentos: planta sem poda, planta com poda e a testemunha
Material e Métodos
Material de estudo e amostragem
• Serão coletadas amostras de solo na profundidade de 0-20 cm
• Três locais distintos por bloco: 1) na rizosfera, 2) no ponto
intermediário entre plantas e na área sem interferência das plantas
(tratamento testemunha).
•Ramos terminais contendo folhas
• As amostras de solo serão coletadas em duplicata para a identificação
biológica e atividade biológica.
Material e Métodos
Isolamento de bactérias
• Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana, UAG-UFRPE, para
procedimento das análises.
• Para separação das bactérias do solo e rizosfera serão feitos os
procedimentos iniciais de desagregação do solo, em Erlenmeryers com
pérolas de vidro.
• Diluições seriadas para inoculação em meio de cultura TSA 10% + 5%
de NaCl, juntamente com o fungicida Cercobyn
• Serão avaliadas após 3, 8 e 14 dias através da contagem das UFCs
• Posteriormente serão isoladas e purificadas
http://www.uspinc.com/MCtubes.htm
http://www.cerveceroscaseros.com.ar/levaansa.jpg
Material e Métodos
Isolamento de bactérias
• Para o rizoplano, as raízes serão lavadas para retirada do solo
• Depois será seguido o mesmo procedimento para rizosfera e solo
•Para isolamento das bactérias endofíticas de folhas e raízes será feita a
desinfecção, que seguirá as etapas:
Etanol
70%
1 min
NaOCl
2%
3 min
Etanol
70%
Água
1
Água
2
30 seg
•Depois será seguido o mesmo procedimento para rizosfera, solo e rizoplano
Material e Métodos
Seleção de bactérias
• Fixação de N2 – meio de cultura sem fonte de N (NFb) – confirmação
(presença de halo), após 7 dias a 28ºC
• Produção de AIA – meio de TSA + L-triptofano + membrana de
nitrocelulose, por 1 dia a 28ºC
• Após este tempo, membrana removida e tratada com reagente de
Salkowski- confirmação por um halo rosa em torno da colônia
• Tolerância a salinidade- inoculação em placas de petri com
concentrações de NaCl de 0g/l; 15 g/l; 30 g/l; 45 g/l; 60 g/l e 75 g/l, por 7
dias a 28ºC
•Avaliações de acordo com nível do crescimento
Material e Métodos
Identificação de bactérias
• Análise parcial do 16S rDNA
•Posteriormente analisadas pelo BLAST
• Posteriormente o DNA será analisado através de kits (EMBRAPA Meio
Ambiente)
• Só então serão realizadas análises de PCR e DGGE
Material e Métodos
Atividade Biológica
• Laboratório de Química do Solo – UFRPE
• Respiração basal (incubação – reação do CO2 da respiração com NaOH)
•C e N (fumigação-extração)
Material e Métodos
Ensaio em casa de vegetação
• Após avaliação e identificação dos isolados bacterianos
• Montagem de experimento em casa de vegetação
• Envolvendo: mudas de Atriplex (c/ e s/ inoculação), Fertilizantes orgânico
e mineral, além de irrigação com águas de diferentes salinidades
• Mudas – micropropagação – CETENE – sacos de polietileno
• Escolha dos inóculos – N2, AIA e tolerância a salinidade
Material e Métodos
Tratamento
Identificação
1
Fertilizante químico
2
Fertilizante orgânico
3
Inóculo 1
4
Inóculo 2
5
Inóculo 3
6
Inóculo 4
7
Inóculo 5
8
Combinação de bactérias 1
9
Combinação de bactérias 2
10
Combinação de bactérias 3
11
Testemunha
Esquema fatorial: 11 x 2 (tratamentos x águas de irrigação 1 e 5 dS/m),
com 5 repetições – 110 unidades experimentais
Material e Métodos
Ensaio em casa de vegetação
• A cada 15 dias, medições de planta
• Após 90 dias, coleta das plantas e solo
• Da planta, raízes separadas da parte aérea para determinação do N total e
matéria seca
• Serão realizadas também análises da atividade microbiana do solo
Material e Métodos
Análise estatística
• Para a densidade populacional bacteriana - programa SAS
• Os valores de UFC/g serão transformados em log10 antes da análise de
variância.
• A ANOVA será utilizada para testes a 1% de significância, no
delineamento experimental inteiramente casualizado.
•Teste de Tukey - comparação entre as médias.
• Experimento casa de vegetação - Contrastes ortogonais (comparação
entre grupos)
Cronograma
Ano
Atividades/mês
2009
A
S
Elaboração e defesa
do projeto
Coleta das amostras
x
Análises
microbiológicas
x
O
2010
N
D
x
x
J
F
M
A
x
x
x
x
J
x
x
x
x
Análise do material
coletado
x
Redação de artigos e
da dissertação
Defesa da
dissertação
S
O
x
x
N
D
J
x
x
x
F
x
x
Avaliação dos
resultados
A
x
Coleta das amostras
Análise estatística
J
x
Análises de DGGE
Implementação do
experimento da
casa-devegetação
M
2011
x
x
x
x
x
x
Obrigada.