biotecnologias da reproduao humana e animal no ensino

EXPRESSÃO TRANSIENTE DA PROTEÍNA EspA DE Escherichia coli
ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) EM Vigna unguiculata (L.) Walp VIA
INFECÇÃO COM O VÍRUS DO MOSAICO DO FEIJÃO DE CORDA
(CPMV)
ENDERSON TADEU DE ASSIS DOS ANJOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
AGOSTO DE 2007
EXPRESSÃO TRANSIENTE DA PROTEÍNA EspA DE Escherichia coli
ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) EM Vigna unguiculata (L.) Walp VIA
INFECÇÃO COM O VÍRUS DO MOSAICO DO FEIJÃO DE CORDA
(CPMV)
ENDERSON TADEU DE ASSIS DOS ANJOS
Tese apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Biociências e Biotecnologia.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
AGOSTO DE 2007
ii
EXPRESSÃO TRANSIENTE DA PROTEÍNA EspA DE Escherichia coli
ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) EM Vigna unguiculata (L.) Walp VIA
INFECÇÃO COM O VÍRUS DO MOSAICO DO FEIJÃO DE CORDA
(CPMV)
ENDERSON TADEU DE ASSIS DOS ANJOS
Tese apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em: ___/___/_____.
Comissão Examinadora:
_______________________________________________
Dr. Victor Martin Quintana Flores (Doutor em Biotecnologia) – UENF
_______________________________________________
Dra. Ana Beatriz Garcia (Doutora em Biologia Molecular) – UENF
_______________________________________________
Dr. Alexandre Ribeiro Bello (Doutor em Microbiologia) – UERJ
_______________________________________________
Dr. Enrique Medina-Acosta (Doutor em Parasitologia Médica e Molecular) – UENF
Orientador
iii
“Aquele que procura a felicidade se ilude e cai em mil armadilhas, mas aquele
que procura a DEUS será encontrado pela felicidade.”
(Márcio Mendes, 2006)
iv
“Sou um homem de causas. Vivi sempre pregando, lutando, como um cruzado,
pelas causas que comovem. Elas são muitas, demais: a salvação dos índios, a
escolarização das crianças, a reforma agrária, o socialismo em liberdade, a
universidade necessária. Na verdade, somei mais fracassos que vitórias em minhas
lutas, mas isso não importa. Horrível seria ter ficado ao lado dos que venceram
nessas batalhas.”
(Darcy Ribeiro)
v
Dedico a Deus, por todas as bênçãos recebidas todos os dias da minha
vida.
Aos meus pais, Maria da Penha e Enes José, por terem me proporcionado
tal oportunidade, por todo amor, todo carinho, paciência e por terem acreditado,
pois sem eles nada seria feito na minha vida.
A minha irmã Lúcia Helena e o meu cunhado Marcelo, que mesmo nos
piores momentos sempre estiveram do meu lado ajudando e encorajando-me.
A Andréia dos Santos, por toda dedicação, compreensão, carinho e amor
em todos os momentos.
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus por ter me tornado forte o bastante para chegar até aqui e por
todas as bênçãos recebidas.
À Universidade Estadual do Norte Fluminense - Darcy Ribeiro e ao Centro
de Biociências e Biotecnologias, pelo curso oferecido.
Ao Laboratório de Biotecnologia (LBT/CBB/UENF) pela oportunidade
oferecida.
Ao Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta pelo trabalho, carinho, dedicação,
orientação e pela incansável paciência durante todo o curso.
À técnica do LBT, Zila de Macedo, por todo apoio, carinho e trabalho.
Aos alunos de Pós-graduação, Lívia Gomes, Gabriela Mesquita, Anna
Rosa
Barreto,
Marcele
Ulh
e
Fabiano
Santiliano
pelo
carinho
e
companheirismo.
Ao Prof. Dr. Victor Martin Quintana Flores, pela seriedade no trabalho e
pela orientação.
A todos os professores, técnicos e alunos do LBT, por toda a colaboração
durante a pesquisa.
Aos meus pais, pela compreensão, amor e confiança durante toda a minha
vida.
A todos os meus grandes amigos, que fazem parte da melhor fase da
minha vida.
vii
SUMÁRIO
Lista de figuras ............................................................................................................... XI
Lista de tabelas ............................................................................................................ XIII
Resumo ........................................................................................................................ XIV
Abstract ......................................................................................................................... XV
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................1
1.1. Produção de proteínas recombinantes em plantas ...................................................1
1.2. Vírus do Mosaico do Feijão de Corda .......................................................................6
1.3. Feijão de Corda (V. unguiculata) ............................................................................10
1.4. Escherichia coli enteropatogênica...........................................................................11
1.5. A Proteína EspA......................................................................................................15
2. OBJETIVO DO TRABALHO .......................................................................................17
3. ESTRATÉGIA GERAL ...............................................................................................18
4. MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................................19
4.1. Desenho dos encenadores......................................................................................19
4.2. Amplificação de espA pela técnica da PCR ............................................................19
4.3. Purificação de espA ...............................................................................................20
4.4. Clonagens ...............................................................................................................20
4.5. Preparo de células DH5-α competentes..................................................................21
4.6. Digestão das construções pGem-T easy/espA e pBinPS2NT2AGFP com as
enzimas de restrição Apa I e Stu I..................................................................................21
4.7. Clonagem no vetor pBINPS2NT2A .........................................................................22
4.8. Conjugação triparental ............................................................................................23
4.9. Infiltração de folhas de Vignia unguiculata e Nicotiana benthamiana......................24
4.10. Agroinfecção de folhas de Vignia unguiculata e Nicotiana benthamiana ..............25
4.11. Análise da expressão de proteína EspA recombinante .........................................26
viii
4.12. Extração de RNA total ...........................................................................................27
4.13. RT PCR .................................................................................................................28
4.14. Purificação de vírus quiméricos.............................................................................28
5. RESULTADOS ...........................................................................................................30
6. DISCUSSÃO ..............................................................................................................59
7. CONCLUSÕES ..........................................................................................................64
8. BIBLIOGRAFIA ..........................................................................................................65
9. ANEXOS ....................................................................................................................76
9.1. Códon de uso ..........................................................................................................76
9.1.1. Códon de uso de EPEC .......................................................................................76
9.1.2. Códon de uso de CPMV.......................................................................................78
ix
Lista de Figuras
Figura 1: Infecção para expressão não transgênica.........................................................4
Figura 2: Capsídeo viral de CPMV quiméricos.................................................................6
Figura 3: Esquema demonstrativo do genoma do CPMV ................................................7
Figura 4: Sintomas de Feijão de Corda infectado com CMPV .........................................8
Figura 5: Esquema demonstrativo da construção pBinPS2NT2AGFP.............................9
Figura 6: Aderência Íntima e Difusa de EPEC................................................................12
Figura 7: Esquema demonstrativo da infecção por EPEC .............................................13
Figura 8: Esquema demonstrativo do TTSS de EPEC...................................................15
Figura 9: Esquema demonstrativo do dessecador .........................................................25
Figura 10: Folhas de Feijão de Corda agroinfiltradas.....................................................25
Figura 11: Amplificação por PCR ...................................................................................31
Figura 12: EspA purificada .............................................................................................32
Figura 13: Construção recombinante pGem-T-easy/EspA .............................................33
Figura 14: Digestão da construção pGem-T-easy/EspA ................................................34
Figura 15: Digestão da construção pBinPS2NT2AGFP .................................................35
Figura 16: EspA e pBinPS2NT2A purificadas ................................................................36
Figura 17: Construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA (E. coli)...............................37
Figura 18: PCR para confirmar a construção pBinPS2NT2A/EspA................................38
Figura 19: Construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA (A. tumefacines).................39
Figura 20: PCR para confirmar a construção pBinPS2NT2A/EspA................................40
Figura 21: Seqüência de EspA de rEPEC ......................................................................41
Figura 22: Estratégia de seqüenciamento purificados....................................................41
Figura 23: Seqüenciamento utilizado o iniciador 1 .........................................................43
Figura 24: Sequenciamento utilizado o iniciador 2 .........................................................44
Figura 25: Imunobloting de extratos de folhas agroinfectadas .......................................47
x
Figura 26: Folhas de Feijão de Corda infiltradas com o clone pTU13B .........................48
Figura 27: Feijão de Corda após 20 dias da agroinfecção com pTU13B .......................49
Figura 28: Folhas de Feijão de Corda infectado com os clones SINT e NSI/GFP .........50
Figura 29: Imunobloting de extratos de folhas agroinfiltradas e agroinfectadas.............51
Figura 30: Imunobloting de extratos de folhas agroinfectadas .......................................52
Figura 31: Imunobloting de extratos de folhas agroinfectadas .......................................53
Figura 32: Ensaio de ELISA utilizando soros de coelho imune anti CPMV e EspA........54
Figura 33: RNA total de folhas de Feijão de Corda Agroinfectado .................................55
Figura 34: RT PCR.........................................................................................................56
Figura 35: RT PCR.........................................................................................................57
Figura 36: Imunobloting de vírus quiméricos purificados ...............................................58
xi
Lista de Tabelas
Tabela 1: Vantagens da produção de vacinas em plantas transgênicas..........................3
Tabela 2: Vantagens de diferentes sistemas de expressão em plantas...........................5
Tabela 3: Vantagens de diferentes sistemas de expressão em plantas.........................45
xii
RESUMO
A metodologia de produção de proteínas recombinantes em plantas oferece
muitas vantagens em comparação a outros sistemas de expressão. A expressão não
transgênica, utilizando vetores virais, é ainda mais vantajosa devido à praticidade e
aos baixos custos de produção em comparação à transgênese. O Vírus do Mosaico
do Feijão de Corda (CPMV), com um genoma RNA bipartido (RNA-1, RNA-2), tem
sido modificado para ser utilizado como uma eficiente alternativa de expressão não
transgênica em plantas. A expressão de proteína heteróloga em plantas infectadas é
transiente, porém a acumulação de vírus no citoplasma da célula hospedeira resulta
em altos níveis de produção. A infecção com CPMV engenheirados é também um
bom modelo de trabalho para o desenvolvimento de vacinas, pois o vírus é um
adjuvante da resposta imune contra o antígeno de interesse. A proteína EspA é um
importante fator de virulência de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC),
constituindo a subunidade principal da agulha do sistema de secreção do tipo III.
Acredita-se que um imunoprofilático focado em EspA seria capaz de interferir no
processo de infecção por EPEC. No presente trabalho, a seqüência de DNA para a
proteína EspA foi clonada no vetor de expressão pBinPSNT2A (baseado no RNA-2
do CPMV). As construções recombinantes pBinPSNT2A/ESPA e pBINPSINT
(baseada no RNA-1) foram utilizadas para transformar Agrobacterium tumefaciens e
essa para infectar plantas de Feijão de Corda. A expressão de EspA e de proteínas
virais foi monitorada por ELISA e Western Blotting, utilizando soros anti-EspA e antiCPMV produzidos em coelhos e um soro de paciente pediátrico. Plantas de Feijão
de Corda agroinfectadas com as construções recombinantes desenvolveram os
sintomas característicos da infecção por CPMV, produziram vírus quiméricos e
produziram a proteína EspA recombinante, embora em baixos níveis. A proteína
EspA recombinante foi também detectada em extratos de partículas virais
quiméricas purificadas. Análises comparativas de RT-PCR utilizando RNA total
extraído de folhas de plantas infectadas e não infectadas permitiram concluir que os
baixos níveis de expressão podem ser devido ao silenciamento pós-transcricional.
Palavras chave: Agrobacterium tumefaciens, CPMV, EspA, expressão transiente;
expressão não transgênica, Feijão de Corda, partículas virais quiméricas.
xiii
ABSTRACT
The methodology of production of recombinant proteins in plants offers many
advantages as compared with to other expression systems. The non-transgenic
expression, using viral vectors, is even more advantageous due to practicality and
lower production costs as compared with transgenesis. The cowpea mosaic virus
(CPMV), with a bipartite RNA genome (RNA-1 and RNA-2), has been modified to be
used as an efficient alternative of non-transgenic expression in plants. The
expression of heterologous protein in infected plants is transient, yet the
accumulation of virus in the cytoplasm of the host cell results in high levels of
production. The infection of plants with engineered CPMV is also a good working
model for the development of vaccines, given the fact that the virus is an adjuvant of
the immune response against the antigen of interest. The EspA protein is an
important virulence factor of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), constituting
the main protein subunit of the needle of the type III secretion system. It is expected
that an immunoprophylactic centered at EspA would be capable of interfering with the
infection process of EPEC. In the present work, the DNA sequence for the EspA
protein was cloned in the expression vector pBinPSNT2A (based on the CPMV RNA2). The recombinant constructs pBinPSNT2A/ESPA and pBINPSINT (based on the
CPMV RNA-1) were used to transform Agrobacterium tumefaciens and this used to
infect cowpea plants. The expression of EspA and viral proteins was monitored by
ELISA ad western blotting using anti-EspA and anti-CPMV sera produced in rabbits
and a serum from a pediatric patient. Cowpea plants agroinfected developed
symptoms characteristics of CPMV infection, produced chimeric virus and
recombinant EspA protein, albeit at low levels. The recombinant EspA protein was
also detected in extracts of purified virus particles. Comparative RT-PCR analyses
using total RNA extracted from leaves of infected and non-infected cowpea plants
allowed the conclusion that that the lower levels of expression may be due to posttranscriptional silencing.
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, CPMV, EspA, transient expression, nontransgenic expression, cowpea, chimeric virus particles.
xiv
1
1.
Introdução
1.1.
Produção de proteínas recombinantes em plantas
O uso de plantas como biofábricas de proteínas com utilidade farmacêutica ou
industrial tem crescido muito nos últimos anos (Gleba et al, 2007); isso por que a
produção de proteínas recombinantes em plantas possui muitas vantagens e pode
ser uma alternativa mais viável do que sistemas de fermentação microbiana. As
principais vantagens da produção de proteínas recombinantes em plantas são: a
possibilidade de produção em larga escala; facilidade de armazenamento da
proteína produzida (ex: produção em sementes); o tecido vegetal pode ser
comestível, o que pode dispensar purificação da proteína recombinante; dispensa ou
diminui o uso de fermentadores, de laboratórios de produção e meios de cultura.
Todas estas vantagens diminuem os custos de produção fazendo com que os
sistemas
de
produção
de
proteínas
recombinantes
em
plantas
sejam
financeiramente mais vantajosos se comparados os sistemas de fermentação
(Warzecha e Mason, 2003; Tacket, 2005).
A utilização de plantas como biorreatores favorece o desenvolvimento e
produção de vacinas (Wakmsley et al, 2003); alem disso, muitas proteínas de
mamíferos que não podem ser produzidas em bactérias, devido às modificações pós
transcricionais requeridas por estas proteínas para serem biologicamente ativas,
podem ser produzidas em plantas, pois os mecanismos de modificação pós
transcricionais de mamíferos e plantas são semelhantes (Mason, 2002; Wagner et
al, 2004; Cañizares et al, 2005). Estas vantagens tornam a expressão de proteínas
recombinantes em plantas muito atrativa (Warzecha e Mason, 2003).
Atualmente existem basicamente dois sistemas de expressão de proteínas
recombinantes em plantas: a transgênese e a expressão por transformação não
estável (Lomonossoff, 2001). A transgênese consiste na introdução de uma
seqüência gênica exógena de maneira estável no genoma (nuclear ou organelar) da
planta. No caso de uma transformação nuclear a seqüência gênica exógena pode
ser herdada pela prole. A transformação pode ser feita utilizando vetores virais,
bacterianos
ou
através
da
tecnologia
de
bombardeamento
de
partículas
2
(biobalística) (Paul, 1998). A maioria das proteínas recombinantes produzidas em
plantas até o momento foi produzida por transgênese (Gleba et al, 2007).
A tabela 1 sumariza as vantagens e desvantagens de alguns sistemas de
expressão transgênicos visando à produção de vacinas (Warzecha e Mason, 2003).
A expressão por transformação não estável pode ser uma alternativa mais
eficiente do que a transgênese (Gleba et al, 2007). A expressão por transformação
não estável é a introdução de uma seqüência gênica na célula vegetal de maneira
não permanente utilizando vetores virais ou bacterianos; a expressão utilizando
vetores virais atinge elevados níveis de proteína heteróloga (Kapila et al, 1997;
Lomonossoff, 2001; Gleba et al, 2007). A seqüência gênica exógena não é inserida
no genoma da planta e por isso não é herdado pela prole, o que pode constituir uma
vantagem em relação à transgênese, considerando o interesse ambiental (Warzecha
e Mason, 2003; Wagner et al, 2004; Gleba, 2007).
A expressão por transformação não estável pode ser obtida por meio da
infecção de folhas da plantas utilizando DNA nu (DNA infeccioso) ou Agrobacterium
tumefaciens transconjugante. A utilização de A. tumefaciens produz melhores
resultados que a infecção utilizando DNA nu (Gleba, et al, 2007) (figura 1).
A agroinfecção baseada em vetores virais para a expressão transiente de proteína
heterólogas é muito eficiente; a expressão da proteína recombinante pode alcançar
até 90% da área foliar do vegetal (Figura 1) (Kapila et al, 1997; Gleba et al, 2007).
3
Tabela 1: Vantagens e desvantagens da produção de vacinas em plantas
transgênicas (Adaptado de Warzecha e Mason, 2003).
Planta
Tabaco
Vantagens
Eficiente sistema de transformação.
Material abundante para caracterização
da proteína.
Desvantagens
Alcalóides tóxicos que não permite a
administração oral.
Potencial de cruzamento no campo.
Batata
Eficiente sistema de transformação.
Podem ser consumidos crus.
Disponibilidade de promotores
específicos.
Produção de microtubérculo para rápido
ensaio.
Propagação clonal e baixo potencial e
cruzamento no campo.
Processamento industrial do tubérculo
bem estabelecido.
Não palatável na forma crua; o cozimento
causa a desnaturação das proteínas
(indesejável para vacinas).
Tomate
Sistema de transformação relativamente
eficiente.
O fruto pode ser consumido cru.
Disponibilidade de promotores
específicos.
Possibilidade de cruzamento para juntar
genes antigênicos.
Cultura em grande escala bem
estabelecida.
Processamento industrial do fruto bem
estabelecido.
Eficiente sistema de transformação.
Alto conteúdo de proteínas nas folhas.
As folhas são consumidas cruas.
Sistema ideal para produção de vacinas
animais.
Baixo conteúdo de proteína.
A acidez do fruto pode ser incompatível com
alguns antígenos.
Não há sistema de expressão “in vitro”.
Tecnologia de produção bem
estabelecida.
Alto conteúdo de proteínas nas
sementes.
Facilidade de estocagem.
Apropriado para vacina animal.
Processamento industrial das sementes
bem estabelecido.
Sistemas de transformação ineficientes.
O uso humano requer cozimento;
indesejável para vacinas.
Possibilidade de cruzamento no campo.
Amplamente cultivada em paises
subdesenvolvidos, onde as vacinas são
necessárias.
Consumido na forma crua.
Propagação clonal; baixa possibilidade
de cruzamento no campo.
Facilidade de cultivo e abundância de
frutos.
Ineficiente sistema de transformação.
Expressão gênica e promotores específicos
pouco conhecidos.
Requer grandes áreas para o cultivo.
Alfafa
Legumes
Cereais
Banana
e
Possibilidade de cruzamento no campo.
Sistema radicular profundo; problemático
para limpeza do campo.
4
A
B
C
D
Figura 1. Ilustração representativa do processo de infecção para
expressão transiente. A: Inoculação da suspensão de A.
tumefaciens ou DNA infeccioso em uma ou mais folhas da planta.
B, C e D: Os vírus quiméricos (representados em verde)
produzidos se espalham pelo tecido vegetal levando a produção
da proteína recombinante. A utilização de A. tumefaciens produz
melhores resultados que a utilização de DNA infeccioso
(adaptado de Gleba, Y. et al, 2007).
A utilização de vetores virais para a produção de proteínas recombinantes em
sistemas de expressão não transgênica é uma tecnologia que permite a análise da
produção da proteína recombinante em um curto espaço de tempo, se comparado a
transgênese. Isso é possível por que na transgênese os passos iniciais de
transformação, cultivo celular, produção dos calos, regeneração das plantas,
obtenção de prole de cruzamentos para identificar as amostras positivas e
interessantes na transgênese são muito demorados e dispendiosos em relação à
expressão transiente (Gopinath, 2000; Mechtcheriakova, 2005).
Na expressão transiente a planta adulta é infectada e passa a produzir a
proteína de interesse, sendo que o nível de expressão da proteína recombinante
é elevado se comparada a outras tecnologias de expressão de proteínas
heterólogas em plantas (Warzecha e Mason, 2003).
A tabela 2 sumariza as principais vantagens e desvantagens da expressão
estável e não estável.
5
Tabela 2: Comparação entre diferentes sistemas de expressão em plantas
(Warzecha e Mason, 2003).
Transformação
Nuclear
Transformação
Organelar
Expressão
Transiente
Muitas espécies
Muito limitada
Muitas
espécies
Tipo de herança
Mendeliana
Materna
Não
Tempo de
desenvolvimento
Alta
Muito alto
Baixo
Baixo/moderado
Alta
Alta
Realizável
Pouco
realizável
Não
Alta
Alta
Moderada
Eucariótico
Procariótico
-
Sim
Não conhecido
Não
Médio
Baixo
Alto
Possível
Possível
Pouco
possível
Aplicabilidade
Nível de
Expressão
Expressão
direcionada (ex:
frutos, raízes).
Produção em
Larga Escala
Processamento da
proteína
Silenciamento do
Transgene
Interesse
ambiental
Expressão de
múltiplos
transgenes
6
Dois sistemas de expressão de proteínas em plantas utilizando vetores virais
têm sido descritos. O primeiro sistema, chamado de sistema de primeira geração,
utiliza vetores virais para a expressão de peptídeos no capsídeo viral; neste caso
a seqüência gênica que codifica o peptídeo é inserida dentro da seqüência que
codifica as proteínas do capsídeo viral. Devido a limitações do sistema é possível
apenas a clonagem de pequenas seqüências gênicas. O segundo sistema,
chamado de sistema de segunda geração, utiliza vetores virais para expressão de
polipeptídeos; neste caso o polipeptídeo heterólogo não faz parte do capsídeo
viral, mas se acumula no tecido vegetal (Figura 2) (Bunbenhein, 1990; Porta,
1996; Gopinath, 2000; Lomonossoff, 2001; Liu e Lomonossoff, 2002; Gleba, Y. et
al 2007).
A
B
Figura 2. Ilustração representativa do capsídeo viral de CPMV
quiméricos. A: CPMV quimérico para a expressão de peptídeos.
O peptídeo heterólogo é expresso no capsídeo viral (representado
em amarelo). B: CPMV quimérico para a expressão de
polipeptídeos. O polipeptídeo heterólogo não faz parte do
capsídeo viral.
1.2.
Vírus do Mosaico do Feijão de Corda
O Vírus do Mosaico do Feijão-de-Corda (CPMV) é um membro da Família dos
Comovirus; possui um genoma bipartido formado por dois RNA fita simples, RNA-1 e
RNA-2, que são encapsulados separadamente. O RNA-1 (5889 nu), com tamanho
de 5,9 Kb, codifica as proteínas necessárias para a replicação do genoma viral; o
RNA-2 (3481 nu), com tamanho de 3,6 Kb, codifica as proteínas do capsídeo e as
7
proteínas de movimento (Figura 3). O CPMV possui o caprídeo icosaédrico, com 2024 nm de diâmetro, formado por 60 cópias de cada proteína grande (L; 42 kDa) e de
cada proteína pequena (S; 24 kDa) (Gopinath, 2000; Manchester e Singh, 2006).
Figura 3. Esquema demonstrativo do genoma do CPMV. O RNA1 codifica 5 proteínas (32 kDa, 54 kDa, 24 kDa, 87 kDa) e a
proteína VpG. O RNA-2 codifica uma proteína de fusão (58 kDa /
48 kDa) e duas proteínas L (“large”) e S (“small”) que formam o
capsídio viral clivagem (Modificado de Gopinath et al., 2000).
Vigna
unguiculata
(Feijão
de
Corda),
Nicotiana
tabacum,
Nicotiana
benthamiana, dentre outras espécies vegetais, são sucessíveis a infecção por
CPMV. Contudo os sintomas da infecção variam entre espécies. Os principais
sintomas da infecção por CPMV em Feijão de Corda (V. unguiculata) são: manchas
amareladas nas folhas do vegetal, formando um padrão de mosaico; e má formação
foliar (Lomonossoff, 2001) (Figura 4).
8
Figura 4. Sintomas de Feijão de Corda infectado com CMPV. A:
Má formação foliar observado nas folhas superiores. B: Padrão de
mosaico característico de infecção por CMPV (A: Environmental
Research Institute, USA; B: Mesquita et al, 2006).
Os vetores naturais de CPMV são insetos (Ootheca mutabilis, Paraluperodes
quaternus, Nematocerus acerbus, Ceratoma variegata, C. ruficornis, C. trifurcata,
Diabrotica balteata, D. undecimpunctata howardi, D. virgifera, Acalymma vittatum;
Coleóptera). CPMV também pode ser transmitido por inoculação mecânica, ou
raramente através de sementes (apenas 1-5%).
CPMV tem alta habilidade para infectar plantas e o processo de infecção tem
alto rendimento de proteínas virais (1-2gr/ Kg de folha); o vírus é termoestável e a
purificação viral é simples (Gopinath et al, 2000).
O CPMV tem sido muito usado como plataforma de nanopartículas
multivalentes
de
peptídeos
e
pode
ser
utilizado
como
suporte
para
o
desenvolvimento de vacinas e terapias antivirais (Lewis, et al, 2006). A estabilidade
em pH ácido e temperatura de até 60º C, a resistência a solventes orgânicos, o
tamanho e a facilidade de manipulação genética faz com que o CPMV tenha grande
potencial para o desenvolvimento de vacinas orais. Quando plantas infectadas ou
vírus purificados são administrados oralmente em camundongos, estes são
absorvidos e podem ser encontrados no sangue e em vários tecidos. As placas de
Peyer têm um papel ativo na internalização e apresentação de CPMV ao sistema
imunológico (Rae et al, 2005).
9
Lewis e colaboradores (2006) demonstraram que CMPV fluorescente pode ser
usado como sonda para a visualização “in vivo” da vascularização e do fluxo
sanguíneo em camundongos e aves; também demonstraram que CPMV podem ser
utilizados no monitoramento da vascularização de tumores humanos mediados por
fibrosarcomas, sugerindo um enorme potencial de utilização em sistemas in vivo.
O uso do CPMV como sistema de expressão de proteínas heterólogas foi
possível a partir do desenvolvimento de vetores de cDNAs (DNA complementar)
infecciosos baseados no genoma deste vírus. A construção utilizada para esse fim,
pBinPS2NT2AGFP (Figura 5) (Gopinath, 2000; Liu e Lomonossoff, 2002) foi obtida a
partir do plasmídeo vetor pBINplus de Agrobacterium tumefaciens, que é derivado
do vetor binário pBIN19 (van Engelen, 1995). O plasmídeo pBinPS2NT2AGFP
possui o cDNA do RNA-2 de CPMV após a extremidade 3’ do promotor 35S do vírus
do mosaico da couve-flor (CaMV - cauliflower mosaic vírus), e é seguido da
seqüência para o peptídeo catalítico 2A do vírus da febre aftosa (FMDV - foot-andmouth disease vírus), pela região que codifica para a proteína GFP (Green
Fluorescent Protein) e pelo terminador Nos (A. tumefaciens).
Apa I
Pac I
35s
RNA-2
2A
Stu I
Asc I
GFP Nos
PBINPS2NT2AGFP
Figura
5.
Esquema
demonstrativo
da
construção
pBinPS2NT2AGFP. 35S: promotor de CaMV; RNA2: cDNA do
RNA2 do CPMV; 2 A: peptídeo catalítico do FMDV; GFP: região
que codifica a proteína verde florescente; NOS: terminador.
A região de clonagem é flanqueada pelos sítios de restrição para as enzimas
Apa I e Stu I o que possibilita a clonagem dirigida de outras seqüências heterólogas
por substituição da seqüência GFP.
10
Após infecção com dois clones transformados de Agrobacterium tumefaciens
transconjugante com as construções pBINPS2NT2AGFP e pBINPS1NT (cDNA do
RNA-2 e cDNA do RNA-1, respectivamente) o genoma viral passa a ser transcrito,
traduzido e replicado, formando partículas virais quiméricas viáveis e também a
proteína recombinante GFP. A proteína recombinante é produzida como uma
proteína de fusão que é posteriormente clivada e liberada pelo peptídeo catalítico
2A. A proteína recombinante resultante possui um resíduo de prolina a mais como
produto de clivagem de 2A. A migração célula – célula do vírus ocorre por meio de
plasmodesmas (Gopinath et al, 2000).
A clivagem ineficiente de 2A leva a produção de proteína uma de fusão,
conformada pelas proteínas S e GFP (S-2A-GFP). Assim, as partículas virais
quiméricas produzidas possuem cerca de 1/6 da proteína S na forma de proteína de
fusão, ou seja, cada partícula viral possui cerca de 10 cópias da proteína
recombinante produzida (Gopinath et al, 2000).
Após sete passagens tem sido observado que o vírus tem sua habilidade de
infecção diminuída ou retorna o seu genótipo selvagem devido à ocorrência de
recombinação homóloga (Gopinath et al, 2000). Esta habilidade de retornar ao
genótipo selvagem pode ser considerado uma vantagem em relação ao risco de
dispersão do vírus quimérico para o meio ambiente, ou pode ser considerado uma
desvantagem, devido ao fato de haver necessidade de constante produção de vírus
quiméricos.
1.3.
Feijão de Corda (V. unguiculata)
O Feijão de Corda (Vigna unguiculata) é originário da África, mas é
amplamente distribuído na América Latina, sudeste da Ásia e sul dos Estados
Unidos, sendo largamente utilizado como ração animal e para alimentação humana;
as sementes e as folhas podem ser consumidas como alimento (Kabas, 2007). O
cultivo de feijão de corda aumentou muito nos últimos 25 anos; apenas a produção
norte americana chegou a ser de aproximadamente 1,5 milhão de hectares (Kabas,
2007).
11
O Feijão de Corda possui tecidos ricos em proteínas e sais minerais (Giami,
2005; Iqbal, 2006; Kabas et al, 2007), mas carece de alguns aminoácidos
essenciais, tais como a metionina (Rivas-Veja et al 2, 006). As sementes e as folhas
constituem parte do cardápio alimentar de muitos povos do continente africano e
asiático (Langyintuo, 2004).
Extratos de Feijão de Corda têm alta ação antioxidante (74,3%-84,6%); esta
ação antioxidante é devido à presença de ácidos fenólicos presentes no tecido
vegetal (Siddhuraju e Becker, 2007).
Por ter seus tecidos ricos em proteínas o Feijão de Corda torna-se um bom
modelo de expressão de proteínas recombinantes em plantas. O fato de servir
extensivamente com base alimentar torna o Feijão de Corda atrativo para a
produção de vacinas orais, pois permite o consumo do vegetal integral, não havendo
necessidade de purificação da proteína (Bunbenhein, 1990; Barrett, 1990).
1.4.
Escherichia coli enteropatogênica
As Escherichia coli enteropatogênicas colonizam o epitélio intestinal e
representam um importante grupo de microrganismos patogênicos entéricos, sendo
a maior causa de doenças diarréicas de origem bacteriana em crianças em países
subdesenvolvidos (Nataro, 1998; Fagundes-Neto, 2004; Zhu, 2005).
E. coli patogênicas são classificadas de acordo com a histopatologia e os
sintomas
que
causam
no
paciente
em:
enterohemorrágicas
(EHEC);
enteroagregativas (EAEC); enteropatogênica (EPEC); enterotoxigênica (ETEC);
enteroinvasiva (EIEC). As E. coli patogênicas podem ainda serem agrupadas em
sorotipos devido à presença de antígenos marcadores. Assim, existem 13 sorotipos
de ETEC, 9 sorotipos de EPEC, 6 sorotipos de EHEC, 8 sorotipos de EAEC e 11
sorotipos de EIEC (Nataro, 1998).
EPEC podem ainda serem agrupadas em típicas e atípicas. EPEC típicas
possuem todos os genes necessários para o estabelecimento de lesões A/E
(attaching and effacing), produzem aderência localizada e são associadas a casos
12
de doenças diarréicas em crianças. EPEC atípicas não possuem o operon BFP; a
ausência do operon BFP impossibilita estas cepas a produzirem aderência
localizada sendo, portanto, menos associadas a doenças diarréicas (figura 6)
(Rodrigues, 1996; Ritchie et al, 2003).
A
B
Figura 6. Microscopia eletrônica de varredura. A: Aderência
difusa produzida por EPEC atípica. B: Aderência localizada
produzida por EPEC típica. Reproduzido com permissão do Dr.
Brett Finlay, University of British Columbia, Canadá e do Dr.
Michael
Donnenberg,
Universidade
de
Maryland,
EUA
(http://www.finlaylab.msl.ubc.ca/research_projects/E.coli.html).
A transmissão de EPEC é oral fecal, com a contaminação ocorrendo por meio
de mãos sujas, alimentos e água contaminada. Alguns estudos sugerem que a
contaminação pode ser por aerossol (Rogers, 1951).
A infecção por EPEC é caracterizada pela a formação de lesão A/E e
ocorrência de diarréia aquosa; as proteínas BfpA, EspB, EspD, EspA, intimina e Tir
(receptor de intimina), são os principais fatores de virulência (Kapper, 1998).
Estudos realizados no Brasil indicam que a maior freqüência de EPEC atípica
está associada à diminuição dos casos de doenças diarréicas, enquanto que a maior
freqüência de EPEC típica está associada ao aumento dos casos de doenças
diarréicas (Trabulsi, 2002).
13
EPEC colonizam o epitélio intestinal formando microcolônias levando a perda
das microvilosidades intestinais e a ocorrência de diarréia aquosa (Savkovic et al,
1996; Ramirez, 2005), vômito e febre (Rothbaum, 1982). Constituem uma das
principais causas de mortalidade infantil em países subdesenvolvidos (Chen, 2004;
Kühne, 2004; Barreto, 2006). Os principais fatores de risco são idade abaixo 2 anos
de idade, saneamento básico precário e sistema imune comprometido (Fernandes,
2002; Kühne, 2004; Franzolin, 2005).
O processo infeccioso por EPEC pode ser dividido em três estágios funcionais:
aderência localizada, translocação de sinais e aderência íntima (Figura 7) (Nataro,
1998). No início do processo infeccioso ocorre aderência localizada mediada por
uma estrutura chamada feixe de pili; o feixe de pili é uma estrutura bacteriana, cuja
principal unidade formadora é a proteína BfpA. O feixe de pili está envolvido na
interação bactéria-bactéria, na interação não íntima entre bactéria e enterócito, na
formação de microcolônias e na adesão celular (Cleary, 2004).
(b) Sinalização independente
de intimina
(a) Aderência inicial
(c) Sinalização dependente
de intimina
Células
epiteliais
Epiteliais
Figura 7. Esquema demonstrativo da infecção por EPEC. (a)
Aderência inicial, mediada pelo feixe de pili. (b) Translocação de
fatores de virulência (EspB, EspD e Tir), mediado pelos filamentos
de EspA. (c) Ligação íntima, dependente da ligação Tir-Intimina;
recrutamento
do
citoesqueleto
(modificado de DeVinney, 1999).
e
formação
de
pedestal
14
A formação de pedestal e a perda das microvilosidades intestinais caracterizam
as lesões A/E; estas lesões são características, mas não exclusivas, de infecções
por EPEC. A infecção por EPEC também é caracterizada pela formação de
microcolônias (Clarke, 2002; Campellone e Leong, 2003).
EPEC possuem ainda uma sofisticada estrutura multiprotêica chamada de
Sistema de Secreção Tipo III (TTSS), que é comum às bactérias gram negativas
(Hueck, 1998; Elliot et al, 1998; Frankel, et al, 1998; Daniell, 2003).
O TTSS, localizado na membrana da bactéria, é responsável pela translocação
de proteínas bacterianas, fundamentais para o processo de colonização, para o
citoplasma da célula hospedeira e para o ambiente (Rosenshine et al, 1992;
Vallance, 2000). A aderência localizada possibilita a translocação de diversos fatores
de virulência (proteínas EspB, EspD e Tir) para o citoplasma da células hospedeira
A translocação dos fatores de virulência ocorre por meio dos filamentos de EspA
(Cleary, 2004).
Os filamentos de EspA, formados pela proteína EspA, se projetam da
membrana bacteriana, formando um prolongamento do TTSS (figura 8) (Daniell,
2003).
15
Citosol bacteriano
Membrana interna
“Complexo
agulha”
Membrana externa
“agulha” EscF
Filamento de EspA
Translocação
de proteínas.
Poro de
translocação.
Membrana celular
Tir translocado
Citoplasma da célula
Proteínas
translocadas
Figura 8. Esquema demonstrativo do TTSS de EPEC. O TTSS
compreende a estrutura chamada “Needle complex” e os
filamentos de EspA (adaptado de Chen and Frankel, 2004).
1.5.
A Proteína EspA
EspA é uma proteína de 25 kDa que é secretada pelo TTSS formando os
filamentos de EspA. Os filamentos de EspA possuem comprimento variado
dependendo da espécie da bactéria, e mesmo em uma mesma bactéria apresentam
tamanhos variados, e possuem um diâmetro de 120 Ǻ (Daniell, 2003).
A função primária dos filamentos de EspA é formar um “canal” de comunicação
entre o citosol da bactéria e o citoplasma da célula hospedeira, mas tem sido
proposta atualmente a função de adesina para estes filamentos devido ao fato de
interagirem com a célula hospedeira nos estágios iniciais de formação de A/E (Abe
et al, 1998; Cleary, 2004).
16
A proteína EspA possui as regiões C-terminal e N-terminal conservadas em
diferentes sorotipos de EPEC e EHEC, mas possuem uma região central
hipervariável. EspA de EPEC de coelho possui 88.5% de similaridade com EspA
EPEC O127 (Abe et al, 1997). A região central hipervariável é uma região
dominante, antigênica, e é uma região exposta da proteína; esta região tem a
capacidade de receber pequenos peptídeos sem alterar a capacidade de formar
homopolímeros de EspA (Crepin, 2005).
Anticorpos produzidos em coelhos contra EspA de O157: H7 recombinante
reconhecem EspA dos sorotipos O157 (mutante para o gene eae) e O111, sugerindo
a possibilidade de desenvolvimento de Kits de diagnósticos (Kühne et al, 2004).
La Ragione e colaboradores (2006) demonstraram pela primeira vez que
anticorpos anti-EspA recombinantes são capazes de bloquear a formação de lesões
A/E de E. coli O157: H7 in vitro.
Os estudos que utilizam EspA como alvo de uma possível imunoterapia contra
EPEC se baseiam na produção de EPEC mutante para espA. EPEC mutante para
espA são utilizadas com o objetivo de desenvolver uma resposta imune protetora
contra EPEC. Zhu e colaboradores (2005) produziram EPEC mutantes para ler
(regulador global do lócus de subversão do enterócito) e constataram que estes
mutantes têm a capacidade de infecção diminuída.
Amaral e colaboradores (2007) demonstraram que a imunização de coelhos
com EspA recombinante induz a produção de anticorpos anti EspA, e que soros
policlonais pediátricos reconhecem EspA recombinante.
Sendo
a
proteína
EspA
um
importante
fator
de
virulência
para
o
estabelecimento do fenótipo A/E tanto para EPEC como para EHEC, a proteína
EspA é um indicador de virulência e pode ser utilizada como alvo para estratégias de
combate a infecção (Kühner, 2004). Anticorpos policlonais contra EspA são capazes
de diminuir significantemente a interação entre a bactéria e o enterócito, o que pode
tornar viável o desenvolvimento de uma vacina contra EPEC (Kühner, 2004).
17
2. Objetivo
Expressão transiente da proteína EspA de EPEC em plantas de Feijão de
Corda, utilizando como vetor o Vírus do Mosaico do Feijão de Corda (CPMV).
3.
Estratégia Geral
A seqüência espA que codifica para a proteína EspA foi amplificada pela
técnica da PCR utilizando iniciadores específicos. O produto da amplificação foi
clonado no vetor pGem-T easy (Promega®). Após a clonagem, espA com as
extremidades coesivas necessárias para a clonagem no vetor pBinPS2NT2A, foi
obtida pela digestão da construção pGem-T/EspA com as enzimas de restrição Apa I
e Stu I. pBinPS2NT2A, com as extremidades coesivas para a clonagem de espA, foi
obtida pela digestão da construção pBinPS2NT2AGFP com as enzimas de
construção Apa I e Stu I.
O produto da ligação de espA e do vetor pBinPS2NT2A foi usado para
transformar células de E. coli DH5α competentes. Agrobacterium tumefaciens foram
transformadas utilizando a técnica de transformação triparental. Os clones de A.
tumefaciens transconjugante foram utilizados para infiltrar folhas de Vigna
unguiculata e Nicotiana benthamiana a fim de se avaliar a expressão de espA.
Plantas de V. unguiculata e N. benthamiana foram agroinfectadas com as
construções recombinantes pBinPS2NT2A/EspA e pBinPSINT para avaliação da
expressão transiente de EspA e produção de partículas virais quiméricas. Folhas de
plantas agroinfectadas foram coletadas para a análise da produção da proteína
EspA recombinante e para a produção de CPMV quiméricos. Análise da produção
de EspA e CPMV quiméricos foi feita por meio das técnicas de ELISA e Western
Blotting utilizando extrato total de folhas de plantas infectadas e o soro de coelho
anti CPMV selvagem, soro de coelho anti EspA; e soro de um paciente pediátrico.
18
4.
Material e métodos
4.1.
Desenho dos Iniciadores
Iniciadores específicos foram desenhados para a seqüência gênica que codifica
a proteína EspA. As informações sobre a seqüência de espA de EPEC foram obtidas
no GenBank (numero de acesso AF 200363). Os iniciadores foram desenhados de
modo que a seqüência amplificada possuísse sítios de restrição para as enzimas
Apa I e Stu I, fundamentais para a clonagem na construção pBinPS2NT2AGFP
(esquema abaixo).
Iniciador 1. Apa I/EspA.
-------------------EspA-------------5’- AACCTTgggCCCATggATACATCAACTgCAACA-3’
Apa I
Iniciador 2. Stu I/EspA.
-------------------EspA----------------5’- AAA Agg CCT Tgg gTT ATT TAC CAA ggg ATA TTg C 3’
Stu I
4.2.
Amplificação de espA pela técnica da PCR
A seqüência espA que codifica a proteína EspA foi amplificada a partir DNA
genômico extraído de E. coli enteropatogênica (cepa B171) sorotipo O111:NM (Riley
et al, 1990). As condições de PCR utilizadas para uma reação final de 25 µL foram:
50 ng de DNA alvo; 1X tampão de reação (Biotools®); 1 mM dNTP (Biotools®); 50
pmoles de cada iniciador; 2 mM MgCl2; 1 µL Taq DNA polimerase (Biotools®).
Para o ensaio de PCR, foi utilizado o seguinte programa: no primeiro estágio foi
realizado 1 ciclo com temperatura 95 oC por 5 minutos; no segundo estágio foram
realizados 30 ciclos com temperaturas 94 oC por 1 minuto, 49 oC 2,5 minutos, 72 oC
19
2,5 minutos, e no terceiro estágio foi realizado 1 ciclo com temperatura 72 oC 15
minutos.
A visualização do produto de amplificação de espA foi realizada utilizando gel
de agarose 0,8% com brometo de etídio (Sambrook, 1989).
4.3.
Purificação de espA
A região amplificada (espA) foi purificada do gel de agarose 0,8% com brometo
de etídio utilizando o Kit de extração de DNA Concert Rapid Gel Extraction System,
GIBCO BRL®, Life Technologies, conforme as especificações do fabricante.
4.4.
Clonagens
A região amplificada foi clonada no vetor de clonagem pGem-T easy
(Promega®), conforme as especificações do fabricante.
Para a reação de ligação em um volume final de 10 µL foi utilizado: 50 ng de
vetor; 8,4 ng de espA; 3 unidades de T4 DNA ligase (Promega®); 1X tampão de
reação.
O vetor pGem-T easy (3015 pb) possui extremidades coesivas com apenas um
resíduo de Timina em cada extremidade; esta característica permite a ligação do
produto de PCR, pois a enzima Taq DNA polimerase introduz de maneira não
específica um resíduo de Adenina nas extremidades de todos os fragmentos
amplificados. Portanto, é possível clonar a seqüência amplificada no vetor. Além
disso, o sítio de clonagem deste vetor se encontra inserido dentro de uma seqüência
que codifica para a enzima β-galactosidase. Esta enzima é capaz de hidrolisar a
ligação glicosídica da galactose. Por tanto, se houver a ligação da região amplificada
no sítio de clonagem, a seqüência que codifica para a enzima β-galactosidase ser
interrompida e a bactéria transformada com essa construção não é capaz de
degradar a galactose. Usando X-Gal, um análogo da galactose, é possível identificar
os clones que estão produzindo, ou não, a enzima β-galactosidase; isso porque o
produto da hidrolise do X-Gal gera uma coloração azul. Assim colônias de bactérias
20
que produzem a enzima β-galactosidase adquirem a coloração azul, ao passo que
colônias que não produzem a enzima (portanto transformadas com a construção
recombinante pGem-T/EspA) não adquirem a coloração azul.
O produto da ligação foi utilizado para transformar células de E. coli DH5α
(Invitrogen®) competentes (cessão 4.6) utilizando o método de choque térmico
(Sambrook, 1989). As células transformadas foram cultivadas em 5 mL de meio LB
sólido (10 g/L triptona; 10 g/L NaCl; 5 g/L extrato de levedura; 15 g/L agar; 8 mg/L XGal; 20 µM IPTG) contendo 50 µg/mL de Ampicilina e cultivadas por 12 horas a 370
em estufa (Sambrook, 1989).
A confirmação dos clones foi feita através de digestão do DNA plasmidial com
as enzimas de restrição Apa I e Stu I (Promega®) e pela técnica da PCR (cessão
4.3).
4.5.
Preparo de células DH5-α competentes
E. coli DH5-α foram cultivadas a 37º C em Erlenmeyer contendo 50 mL de meio
LB líquido (10 g/L triptona; 10 g/L NaCl; 5 g/L extrato de levedura) até alcançar a
DO600nm= 0,5 - 0,7 e foram posteriormente centrifugadas a 4 ºC a 2.060 x g durante 5
minutos; o meio foi descartado e o sedimento foi dissolvido em 25 mL de solução
CaCl2 50 mM gelado e colocado em gelo durante 20 min. Essa mistura foi
centrifugada a 4ºC a 2.060 x g durante 5 minutos, o sedimento foi dissolvido em 3,5
mL de 15% glicerol/ CaCl2 50 mM; alíquotas de 100 µL foram congeladas em
nitrogênio líquido e, posteriormente, estocados a -70ºC.
4.6.
Digestão das construções pGem-T easy/espA e pBinPS2NT2AGFP com
as enzimas de restrição Apa I e Stu I
A construção recombinante pGem-T easy/EspA foi digerida com as enzimas de
restrição Apa I e Stu I (Promega®), a fim de produzir EspA com as extremidades
coesivas necessárias para a clonagem no vetor pBinPS2NT2A.
Na reação de digestão da construção pGem-T easy/EspA, seguindo as
especificações do fabricante, foi utilizado: pGem-T easy/EspA - 3 µg; BSA – 0,2 µL;
21
enzima Apa I (Promega®) - 3 unidades; enzima Stu I (Promega®) – 3 unidades;
tampão de reação (H) 1X (Promega®).
A digestão da construção pGem-T easy/EspA gerou um fragmento de 579 pb,
correspondente a região que codifica a proteína EspA, e um fragmento de
aproximadamente 3000 pb, correspondente ao vetor pGem-T easy (Promega®).
Na reação de digestão da construção recombinante pBinPS2NT2AGFP,
seguindo as especificações do fabricante, foi utilizado: pBinPS2NT2AGFP - 3 µg;
BSA – 0,2 µL; enzima Apa I (Promega®) - 3 unidades; enzima Stu I (Progema®) - 3
unidades; tampão de reação (H) 1X (Promega®).
A digestão da construção pBinPS2NT2AGFP gerou um fragmento de
aproximadamente 900 pb, que corresponde região que codifica a proteína GFP, e
um
fragmento
de
aproximadamente
18000
pb,
correspondente
ao
vetor
pBinPS2NT2A (Liu e Lomonossoff, 2002).
4.7.
Clonagem no vetor pBINPS2NT2A
A ligação de espA com extremidades coesivas Apa I e Stu I no vetor
pBinPS2NT2A, também com extremidades coesivas Apa I e Stu I, foi realiza
utilizando a enzima T4 DNA ligase (Promega®), segundo as especificações do
fabricante. O experimento foi feito em diferentes proporções de espA: vetor (1:1; 2:1;
3:1).
Para a reação de ligação (relação inserto: vetor = 1:1) em um volume final de
10 µL, foram utilizados: 60 ng de do vetor pBinPS2NT2A; 2 ng de espA; 1X tampão
de reação; 3 unidades de enzima T4 DNA ligase (Promega®).
Os produtos da ligação foram utilizados para transformar células E. coli DH5α
competentes (cessão 4.6) utilizando choque térmico (Sambrook, 1989). As células
transformadas foram cultivadas em meio LB sólido (10 g triptona/L; 10 g NaCl/L; 5 g
extrato de levedura/L; 15 g/L agar) contendo 50 µg/mL de Kanamicina e por 12
22
horas a 370 em estufa (Sambrook, 1989). A confirmação dos clones foi feita por
digestão com enzimas de restrição e pela técnica da PCR (cessão 4.3).
4.8.
Conjugação triparental
A transformação de células de Agrobacterium tumefaciens, cepa LBA4404
(PGV3850+RIFr), foi feita utilizando a técnica de conjugação triparental. O protocolo
de conjugação triparental utilizado para neste trabalho foi: Agrobacterium
tumefaciens cepa LBA4404 ((PGV3850+RIFr) foi cultivada em 5 mL de meio YEP
(peptona 10 g/L; sacarose 1 g/L; extrato de levedura 5 g/L; MgSO4 – 7 H2O 0,5 g/L)
contendo 100 µg/mL de Rifampicina por 48 horas a 28oC (Sambrook, 1989). Células
de E. coli Helper foram cultivadas em 5 mL de meio LB (cessão 4.5) por 24 horas a
37oC. Células de E. coli DH5α transformadas com a construção recombinante
pBinPS2NT2A/ESPA foram cultivadas em 5 mL de meio LB (cessão 4.5) contendo
50 µg/mL de Kanamicina por 24 horas a 370C em estufa. Após o cultivo inicial, 100
µL da cultura de Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 ((PGV3850+RIFr) foram
cultivados em 1 mL de meio YEP, sem antibiótico, por 4 horas a 28oC; 100 µL da
cultura de E. coli Helper foram cultivados em 5 mL de meio LB, sem antibiótico, por 4
horas a 37oC; e 100 µL da cultura de E. coli transformada com a construção
recombinante pBinPS2NT2A/ESPA foram cultivadas em 5 mL de meio LB, sem
antibiótico, por 4 horas a 37oC. Após o termino do segundo cultivo, 100 µL de cada
cultura do segundo cultivo (Agrobacterium tumefaciens; E. coli Helper; e E. coli
transformada
com
a
construção
recombinante
pBinPS2NT2A/ESPA)
foram
cultivadas em um mesmo tubo, sem agitação, por 3 horas a 28oC. Após o cultivo, a
cultura mista foi incubada em meio YEP sólido (peptona 10 g/L; sacarose 1 g/L;
extrato de levedura 5 g/L; MgSO4 – 7 H2O 0,5 g/L; agar 15 g/L) contendo 100 µg/mL
de Rifampicina e 50 µg/mL de Kanamicina por 48 horas a 28oC (Sambrook, 1989).
A confirmação dos clones transformantes (Agrobacterium tumefaciens
transconjugantes com a construção recombinante pBinPS2NT2A/ESPA) foi feita
pela técnica da PCR (cessão 4.3).
O seqüenciamento parcial da construção recombinante pBinPS2NT2A/ESPA,
para confirmar a construção recombinante foi realizado, por encomenda, pela
Genemed Synthesis, Califórnia, EUA.
23
4.9.
Infiltração de folhas de Vigna unguiculata e Nicotiana benthamiana
Para avaliar a produção da proteína recombinante EspA em um curto espaço
de tempo foi realizado uma agroinfiltração. A agroinfiltração consiste na infiltração a
vácuo de folhas utilizando um clone de A. tumefaciens transformado com a
construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA. Para isso, o clone pTU 13B foi
cultivado em meio YEB (5g/L extrato de carne; 1g/L de triptona; 1g/L de extrato de
levedura; 5g/L de sacarose; 2 mM MgSO4; pH7. 4) contendo 100 µg/mL de
Rifampicina e 50 µg/mL de Kanamicina a 28o C, até atingir uma DO600nm = 1,0. O
cultivo foi centrifugado a 5.000 g por 30 minutos a 4oC. O sedimento de células foi
cultivado em 200 mL de meio indutor (Meio YEB; 10mM MÊS [ácido 2-{morpholino}
etano sulfônico]; 20 µM acetosiringona [3’-5’- dimetoxi-4-hidroxiacetofenona]; 2 mM
MgSO4 pH 5.6) a 28º C, até atingir uma DO600nm= 0,8. Após este período a cultura foi
centrifugada a 5.000 g por 10 minutos. O sedimento de células foi dissolvido e
cultivado em 100 mL de meio MMA (Sais MS; 10 mM MÊS; 20g/L sacarose; 200 µM
acetosiringona; pH 5.6) até atingir a DO600nm = 2,4 e posteriormente cultivada por 2
horas a 22º C sem agitação. Após este período a cultura foi transferida para um
recipiente estéril e incubada com folhas de Vigna unguiculata e Nicotiana
benthamiana (as folhas a serem infiltradas foram previamente feridas com o auxilio
de uma ponteira de pipeta automática); foram utilizadas 5 folhas para cada 100 mL
de cultura. Com as folhas submersas na cultura foi aplicado vácuo de 0,1 a 1 mbar
por 20 minutos utilizando uma bomba de vácuo e um dessecador (figura 9). Após
este período o vácuo foi cessado rapidamente e as folhas infiltradas foram lavadas
com água destilada. As folhas infiltradas foram colocadas em bandejas forradas com
papel filtro umedecido, com a parte adaxial voltada para cima, e incubadas a 25º C
sob um fotoperíodo de 16 horas por 60 horas (Vaquero-Martin, comunicação
pessoal) (figura 10).
24
Bomba de vácuo
Dessecador
Recipiente contendo
cultura e folhas.
Figura 9. Esquema demonstrativo do dessecador e da bomba de
vácuo
utilizados
para
a
Agroinfiltração
de
folhas
Vignia
unguiculata e Nicotiana benthamiana.
Figura 10. Folhas de Feijão de Corda agroinfiltradas com o clone
pTU13B. Foram feitos riscos na superfície foliar para facilitar a
agroinfiltração.
4.10. Agroinfecção de folhas de Vigna unguiculata e Nicotiana benthamiana
A agroinfecção consiste na infecção de plantas utilizando dois clones: o clone
de A. tumefaciens transformado com a seqüência a ser expressa clonada no vetor
pBINPS2NT2A, e o clone SINT (A. tumefaciens transformada com a construção
recombinante pBINPSINT; esta construção também é derivada do vetor binário
pBINplus e possui o cDNA do RNA I do CPMV). No processo de agroinfecção, uma
cultura mista com os dois clones é utilizada para infectar folhas de Feijão de Corda
com o auxilio de uma seringa (sem agulha); foram infectadas duas folhas por planta
com aproximadamente 10 dias de plantio. A ocorrência de uma dupla infecção faz
25
com que eventualmente uma célula vegetal receba as duas construções
recombinantes (baseada no RNA1 e no RNA2 do CPMV); a transcrição e tradução
das construções recombinantes pela maquinaria celular levam a imediata formação
de partículas virais viáveis e a proteína recombinante. Os vírus quiméricos passam
então a se replicar no tecido vegetal levando, conseqüentemente, à produção da
proteína recombinante. Os sintomas da infecção aparecem aproximadamente 8 dias
após a agroinfecção e a proteína recombinante se acumula do citosol da célula
vegetal (Gopinath, 2000).
O clone pTU13B e o clone SINT [Agrobacterium tumefaciens transformadas
com a construção pBINP1NT (cDNA do RNA-1 do CPMV)], foram cultivados a 28º C
em 50 mL meio LB (cessão 4.5) contendo 50 µg/mL de Kanamicina até atingir uma
DO600nm = 1,0. As culturas foram centrifugadas a 5000 g por 30 minutos a 4 º C e os
sedimentos de células foram dissolvidos e cultivados em 200 mL de meio indutor
(cessão 4.10) a 28º C até atingirem uma DO600nm = 0,6. As culturas foram então
centrifugadas a 5000 g por 30 minutos a 4 º C e os sedimentos foram dissolvidos e
cultivados em 100 mL meio MMA (cessão 4.10) até atingirem uma DO600nm = 2,4.
Volumes iguais das duas culturas foram misturados e incubados a 22º C por 2 horas
a temperatura ambiente. Folhas de Vigna unguiculata com aproximadamente 10
dias, e folhas de N. benthamiana, foram infiltradas com aproximadamente 50 µL da
cultura mista; a inoculação na região adaxial (foi utilizado duas folhas por planta) foi
realizada com o auxilio de uma seringa (sem agulha). As folhas foram observadas
diariamente até o aparecimento dos sinais de infecção (Liu e Lomonossoff, 2002).
4.11. Análise da expressão de proteína EspA recombinante
Após o período de incubação (72 horas para as folhas infiltradas e 20 dias para
as folhas infectadas), as folhas foram pesadas e maceradas em nitrogênio líquido.
Para cada grama de folha macerada foi acrescentado 1 mL de tampão ESB (75 mM
Tris-HCl pH 6,8; 9M uréia; 4,5% (w/v) SDS; 7,5% (v/v) β-mercaptoetanol; 5nM
PMSF). O extrato total foi fervido por 10 minutos em banho-maria e centrifugado a
11.000 x g por 5 minutos. O precipitado foi descartado e o restante foi transferido
para tubos limpos e armazenados a – 20oC (Lomonossoff e Vaquero-Martin,
comunicação pessoal). Alternativamente, folhas infectadas ou infiltradas foram
26
maceradas em nitrogênio líquido com o auxílio de um pistilo; para cada 0, 5 gramas
de macerado foi adicionado 100 µL de tampão fosfato 100 mM pH 7,0; foi adicionado
coquetel de inibidores de proteases (2,5 µg/mL Cistatina; 100 µg/mL TLCK; 0,5
µg/mL Leupeptina; 1 µM EDTA; 500 µM PMSF; e 250 µg/mL E-64); o macerado foi
centrifugado a 10.000g por 10 minutos, sendo o precipitado descartado e o
sobrenadante coletado.
A análise da expressão de EspA foi feita em gel de acrilamida SDS PAGE 12%
(Laemmli, 1970) utilizando extratos totais das folhas infectadas, e por testes de
imuno detecção Elisa e Western Blotting (Towbin, 1979). O teste de ELISA foi
realizado utilizando soro de coelho anti EspA recombinante (Amaral et al, 2007),
soro de um paciente pediátrico, e soro de coelho anti CPMV, na diluição inicial de
1/500. O teste de Western Blotting foi realizado utilizando soro de coelho anti EspA
recombinante (Amaral et al, 2007) e soro de coelho anti CPMV, na diluição de
1/5.000.
4.12. Extração de RNA total
Todas as soluções utilizadas na extração de RNA total de folhas foram
preparadas em água tratadas com DEPC. Folhas de plantas infectadas foram
maceradas em nitrogênio líquido com o auxilio de um almofariz. Para cada 0,1
grama de tecido macerado foi adicionado 1 mL de Trizol (Invitrogen®); a solução
resultante foi agitada vigorosamente por 5 min e centrifugada a 12.000 x g por 10
min a 8ºC. O precipitado foi descartado e o restante foi incubado por 5 min a
temperatura ambiente. Foi adicional 200 mL de clorofórmio e misturado
vigorosamente por 15 segundos. A solução resultante foi incubada por 3 minutos a
temperatura ambiente e centrifugada a 12.000 x g por 15 minutos a 8ºC. A fase
aquosa (superior) foi coletada e foram adicionados 250 µL de isopropanol e 50 µL de
solução salina (0,8M citrato de sódio; 1,5M NaCl); a solução resultante foi incubada
por 10 minutos. Posteriormente a solução foi centrifugada a 12.000 x g por 10
minutos a 8ºC, o precipitado (RNA total) foi reservado e o restante foi descartado. Ao
RNA total foi adicionado com 1 mL de etanol 75% (75% de etanol; 25% de água
destilada); a solução foi agitada vigorosamente e centrifugada a 7.500 x g por 5
27
minutos a 8ºC. O precipitado foi reservado, secado na estufa a 30ºC e dissolvido 30
µL em água.
A visualização do produto da extração foi feita em gel de agarose 0,8% com
brometo de etídio.
4.13. RT - PCR
Todas as soluções utilizadas no ensaio de RT – PCR foram preparadas em
água tratada com DEPC. Para cada reação de RT PCR foram utilizados:
aproximadamente 3, 5 µg de RNA total; 30 unidades de AMV Transcriptase Reserva
(Invitrogen®); 1x de tampão de reação; 4 picomoles de iniciador (reverso de EspA);
0,5 mM dNTP; 0,5 µL de RNAse out (Invitrogen®); água para um volume final de 50
µL. Como controles negativos foram utilizados RNA total de plantas não infectadas;
e ensaio utilizando RNA de folhas infectadas sem a enzima AMV Transcriptase
Reserva (Invitrogen®). A visualização dos produtos da reação foi feita em gel de
agarose 0,8% com brometo de etídio.
4.14. Purificação de vírus quiméricos
Folhas de plantas infectadas foram maceradas em tampão fosfato 100 mM (25
gramas de folhas para 50mL tampão), o macerado foi filtrado em tecido muceline e o
filtrado foi centrifugado a 15.000 x g por 20 minutos a 4ºC. A fase aquosa foi
reservada e ao precipitado foi adicionado 12,5 mL de tampão fosfato 100 mM que foi
centrifugado a 15.000 x g por 20 minutos a 4ºC. As fases aquosas da 1º e da 2º
centrifugação foram combinadas e foi adicionado 35 mL de solução colorofórmiobutanol (razão 1:1); a solução resultante foi agitada por 1 minuto e centrifugada a
5.000 x g por 5 minutos a 4ºC. O precipitado foi descartado e á fase aquosa foi
adicionado 0,25% (volume:volume) de solução PEG; a solução resultante foi
incubada a 4ºC por 1 hora com agitação constante. Após o período de incubação a
solução foi centrifugada a 10.000 x g por 15 minutos a 4ºC, a fase aquosa foi
descartada e ao precipitado foi acrescentado 7 mL de tampão fosfato 10 mM. A
solução resultante foi centrifugada a 15. 000 x g por 15 minutos a 4ºC e a fase
aquosa foi reservada; ao precipitado foi adicionado 2 mL de tampão fosfato 10 mM e
a solução resultante foi centrifugada a 15.000 x g por 15 minutos a 4ºC; a fase
28
aquosa foi reservada. As fases aquosas da 1º e da 2º centrifugação foram
combinadas e centrifugadas a 36.000 x g por 2 ½ horas a 4ºC. A fase aquosa foi
descartada e ao precipitado foram adicionados 100 µL de tampão fosfato 100 mM; a
solução resultante foi centrifugada a 12.000 x g por 1 minuto a 4ºC. O precipitado foi
descartado e a fase aquosa foi adicionada 0,3% (volume:volume) de azida sódica.
29
5.
Resultados
Após o desenho de iniciadores específicos foram iniciadas varias tentativas de
amplificação da seqüência que codifica a proteína EspA. Durante as tentativas foram
variados a quantidade de Cloreto de Magnésio, iniciadores e dNTPs a fim de se
identificar a melhor condição de PCR para amplificação da seqüência de interesse.
Após várias tentativas mal sucedidas de amplificação, conseguiu-se amplificar
a seqüência que codifica a proteína EspA de EPEC. As condições ideais de
amplificação por PCR estão listadas em materiais e métodos (cessão 4.3).
Na figura 11 pode ser observado o produto da amplificação por PCR,
correspondente a região que codifica a proteína EspA, com tamanho de 579 pb.
O produto da amplificação foi purificado do gel utilizando o Kit de Extração de
DNA Concert Rapid Gel Extraction System, GIBCO BRL®, Life Technologies,
seguindo as especificações do fabricante. A confirmação da purificação da região
espA amplificada foi realizada utilizando eletroforese em gel de agarose. A figura 12
mostra a região que codifica a proteína EspA (amplificada por PCR) purificada.
30
500 pb
579 pb
M A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 C1 C2 C3 C4 D1 D2 D3 D4 H
I
J
C- C+
Figura 11. Gel de agarose 0,8% tratado com Brometo de
Etídio. M: marcado de DNA lamdba Hind III; A, B, C, D, H, I, J:
amostras em diferentes condições de PCR (quadro 1); C-:
controle negativo (água); C+: controle positivo (DNA genômico
EAF+). O fragmento de 579 pb indicado corresponde a região
espA. O fragmento de 500 pb indicado corresponde ao marcador
λ Hind III (Promega®) utilizado.
Quadro 1: Condições de reação das amostras da figura 11.
Amostras
Condições de amplificação
A1, B1, C1 e D1
0,2 mM dNTP; 100 pmol iniciadores
A2, B2, C2 e D2
0,2 mM dNTP; 50 pmol iniciadores
A3, B3, C3 e D3
0,1mM dNTP; 100 pmol iniciadores
A4, B4, C4 e D4
0,1 mM dNTP; 50 pmol iniciadores
H, I, J, C- e C+
0,2 mM dNTP; 100 pmol iniciadores
A1, A2, A3 e A4
2 mM Mg2Cl
B1, B2, B3 e B4
2,5 mM Mg2Cl
C1, C2, C3 e C4
3 mM Mg2Cl
D1, D2, D3 e D4
3,5 mM Mg2Cl
H, I e J
2 mM Mg2Cl
31
500pb
579pb
M
A1 A2
Figura 12. Gel de agarose 0,8% tratado com Brometo de Etídio.
M: marcador de DNA Lambda Hind; A1 e A2 produtos da
amplificação por PCR purificados.
A região amplificada foi utilizada para clonagem no vetor de comercial pGem-T
easy (Promega®). O produto da ligação foi utilizado para transformar células DH5α
(cessão 4.5) e o produto da transformação foi cultivado em meio LB sólido (cessão
4.5)
Após o período de incubação verificou-se o crescimento de colônias com
coloração azul e colônias sem esta coloração (colônias azuis: não transformadas
com
a
construção
recombinante
pGem-T-easy/EspA;
colônias
brancas:
transformadas com a construção recombinante). Um total de 11 colônias
transformadas foram retiradas da placa e cultivadas em meio LB líquido (cessão
4.5); após o período de incubação o DNA plasmidial dos clones transformantes foi
extrato utilizando o método de TENS (Sambrook, 1989).
Como pode ser observado na figura 13, as colônias obtidas da transformação
de Escherichia coli DH5α competentes com o produto da ligação pGem T-easy +
EspA possuem um fragmento de DNA plasmidial com mobilidade eletroforética
correspondente ao esperado da construção recombinante pGem-T-easy/EspA.
32
3600 pb
DNA plasmidial
M A1 A2 A3 A4 A5
A6 A7 A8 A9 A10 A11
Figura 13. Gel de Agarose 0,8% tratado com brometo de
etídio. M: marcador DNA Lambda Hind III. A1, A2, A3, A4, A5, A6,
A7, A8, A9, A10 e A11: diferentes amostras de DNA extraído de
11
diferentes
colônias
transformadas
com
a
construção
recombinante pGem-T-easy/EspA. O fragmento de 3600 pb
indicado corresponde ao marcador utilizado.
A confirmação da construção recombinante foi realizada por PCR, utilizando
iniciadores específicos, e digestão com as enzimas de restrição Apa I e Stu I. Após a
identificação das colônias transformadas com a construção recombinante pGem-Teasy/EspA, foi escolhido um clone (clone A1), que passou a ser chamado de pTU14,
e o DNA plasmidial deste clone foi digerido com as enzimas de Restrição Apa I e Stu
I (cessão 4.7) para se obter a região que codifica a proteína EspA com as
extremidades coesivas necessárias para a clonagem no verto de expressão
pBINS2NT2A.
A digestão da construção recombinante pGem-T-easy/EspA obtida a partir do
clone pTU14 gerou um fragmento de aproximadamente 3000 pb, correspondente ao
vetor de clonagem pGem-T-easy, e um fragmento de 579 pb, correspondente região
que codifica a proteína EspA (figura 14).
33
pGEM - T
EspA
500pd
M
A1
A1
A1
Figura 14. Gel de Agarose 0,8% tratado com brometo de etídio.
M: marcador DNA Lambda Hind III. A1: construção recombinante
pGem-T-easy/EspA (clone pTU 14) digerida com as enzimas de
restrição Apa I e Stu I.
Após a digestão da construção recombinante pGem-T-easy/EspA, espA foi
purificado do gel utilizando o Kit de extração de DNA (GIBCO BRL®) (cessão 4.4).
Simultaneamente
foi
realizada
a
digestão
da
construção
recombinante
pBinPS2NT2A/GFP utilizando enzimas de restrição ApA I e Stu I (Promega®)
(cessão 4.7) para obter o vetor pBinPS2NT2A com as extremidades coesivas
necessárias para a ligação.
A
digestão
gerou
um
fragmento
de
aproximadamente
19000
pb,
correspondente ao vetor pBinPS2NT2A, e um fragmento de aproximadamente 900
pb, correspondente a região que codifica a proteína GFP (figura 15).
34
Figura 15. Gel de Agarose 0,8% tratado com brometo de etídio.
M: marcador DNA Lambda Hind III (Promega®). D1: construção
recombinante pBinPS2NT2AGFP digerida com enzimas de
restrição Apa I e Stu I. O fragmento de 19000 pb indicado
corresponde ao vetor pBinPS2NT2A digerido; o fragmento de 900
pb indicado corresponde à região de codifica a proteína GFP; o
fragmento de 23000 pb indicado corresponde ao marcador
utilizado. A imagem corresponde a partes relevantes de um
mesmo gel.
Após a digestão da construção recombinante pBinPS2NT2AGFP, o vetor
pBinPS2NT2A foi purificado do gel utilizando o protocolo de purificação com papel
(Dretzen e Ballarde, 1981; Danner, 1982). Na figura 16 pode ser observado os
produtos da purificação EspA e pBINPS2NT2A.
35
19000 pb
23000 pb
579 pb
500 pb
M
Vetor
espA
Figura 16. Gel de Agarose 0,8% tratado com brometo de etídio. M:
marcado de DNA Lambda Hind III. Vetor: vetor pBinPS2NT2A digerido com
enzimas Apa I e Stu I; EspA: espA digerido com enzimas Apa I e Stu I. O
fragmento de 19000 pb indicado corresponde ao vetor de expressão
pBinPS2NT2A digerido com enzimas Apa I e Stu I. O fragmento de 579 pb
indicado corresponde à região que codifica a proteína EspA digerida com as
enzimas Apa I e Stu I. Os fragmentos de 23000 pb e 500 pb indicados
correspondem ao marcador utilizado.
Após a purificação de espA e pBinPS2NT2A, digeridos com as enzimas de
restrição Apa I e Stu I, foi realizada a ligação das duas construções (cessão 4.8).
O produto da ligação foi utilizado para transformar Escherichia coli DH5α
(cessão 4.6) por choque térmico (Sambrook, 1989), e o produto da transformação foi
cultivado em meio LB sólido (cessão 4.8).
Após o período de incubação, foram identificadas 13 colônias. Estas colônias
foram incubadas em meio LB líquido (cessão 4.8). Após o período de incubação, foi
realizada a extração do DNA plasmidial das 13 colônias, pelo método de TENS
(Sambrook, 1989).
Como pode ser observado na figura 17, todas as 13 colônias analisadas
possuem DNA plasmidial com mobilidade eletroforética correspondente ao esperado
para construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA.
36
23000
pb
DNA
plasmidial
M A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13
Figura 17. Gel de Agarose 0,8% tratado com brometo de
etídio. M: marcador DNA Lambda Hind III. A1, A2, A3, A4, A5,
A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12 e A 13: DNA plasmidial
extraído
de
construção
diferentes
colônias
recombinante
transformadas
com
pBinPS2NT2A/EspA.
a
Os
fragmentos, com aproximadamente 19000 pb, indicados
correspondem ao DNA plasmidial extraído das 13 colônias
transformadas
com
a
construção
recombinante
pBinPS2NT2A/EspA. O fragmento de 23000 pb indicado
corresponde ao marcador utilizado.
A confirmação dos 13 clones de E. coli transformados com a construção
recombinante pBinPS2NT2A/EspA foi realizada por PCR (cessão 4.3).
Como pode ser observado na figura 18, todos as 13 clones transformados com
a construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA foram amplificadas pela da técnica
da PCR (cessão 4.3) utilizando iniciadores específicos.
37
23000pb
espA
500pb
M A1
A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 C+ C-
Figura 18. Gel de Agarose 0,8 % tratado com brometo de
etídio. M: marcador DNA Lambda Hind III. A1, A2, A3, A4, A5, A6,
A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13: produtos de amplificação por
PCR a partir de DNA plasmidial dos 13 clones transformados com
a construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA. C+: controle
positivo (DNA EAF+); C-: controle negativo. EspA indica a região
codifica a proteína EspA amplificada pela técnica da PCR
utilizando DNA plasmidial extraído dos 13 diferentes clones
transformados
com
a
construção
recombinante
pBinPS2NT2A/EspA. Os fragmentos de 23000 pb e 500 pb
indicados correspondem ao marcador utilizado.
Após a confirmação dos 13 clones transformados com a construção
recombinante pBinPS2NT2A/EspA, células de Agrobacterium tumefaciens foram
transformadas com a construção de interesse. Para a transformação de
Agrobacterium tumefaciens foi selecionado apenas um clone (clone A6) que passou
a ser chamado de pTU13. A transformação de A. tumefaciens foi feita utilizando a
técnica da conjugação triparental (cessão 4.9).
Após o período de incubação, 10 colônias foram selecionadas e retiradas da
placa e cultivadas em meio YEP líquido (cessão 4.9) contento 100mg/mL de
Rifampicina e 50mg/mL de Kanamicina.
Como pode ser observado na figura 19, alguns clones (A1, A2, A4 e A10) de A.
tumefaciens transconjugantes com a construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA
38
possuem DNA plasmidial com mobilidade eletroforética esperada para a construção
recombinante pBINPS2NT2A/espA. O fato de alguns clones não apresentarem o
DNA plasmidial esperado pode ser devido ao fato da baixa eficiência de extração de
DNA plasmidial A. tumefaciens.
23000pb
DNA plasmidial
M
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
Figura 19. Gel de Agarose 0,8 % tratado com Brometo de Etídio.
M: marcador DNA Lambda Hind III. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7,
A8, A9, A10 correspondem a diferentes clones de A. tumefaciens
transformados com a construção pBinPS2NT2A/EspA. O DNA
plasmidial indicado corresponde o DNA plasmidial extraído de
diferentes clones de A. tumefaciens transconjugante. O fragmento
de 23.000 pb indica corresponde ao marcador utilizado.
A confirmação dos clones de A. tumefaciens transformadas com a construção
recombinante pBinPS2NT2A/EspA foi feita utilizando a técnica da PCR (cessão 4.3).
Como pode ser observado na figura 20, foi possível amplificar em alguns clones
a região que codifica a proteína EspA utilizando DNA plasmidial extraído de A.
tumefaciens
transconjugante
transformada
com
a
construção
recombinante
pBinPS2NT2A/EspA. A não amplificação de todas as amostras pode ser devido à
baixa quantidade do DNA utilizado como molde ou a existência de colônias não
transformadas (figura 19).
39
espA
500 pb
M
A1
A2
A3 A4 A5 A6 A7
A8 C1 C2 C3
EspA
Figura 20. Gel de Agarose 0,8 % tratado com brometo de etídio.
M: marcador DNA Lambda Hind. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8
são amostras de DNA de diferentes clones de A. tumefaciens
transformados com a construção pBinPS2NT2A/EspA. C1:
controle
negativo
da
reação;
C2:
controle
negativo
(pBinPS2NT2A/GFP). C3: controle positivo (DNA EAF+). EspA:
EspA purificado. EspA indica o produção da amplificação (região
que codifica a proteína EspA), de 579 pb. O fragmento 500 pb
indicado corresponde ao marcador utilizado.
Após a confirmação dos clones de A. tumefaciens transconjugantes para
construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA, foi escolhido apenas um clone (clone
A5) para dar continuidade ao trabalho. Este clone passou a ser chamado de
pTU13B.
A seqüência da região codante espA contida nas construções deste trabalho
corresponde àquela de EPEC de origem humana, cepa B171, sorotipo O111:NM
(figura 21) (Amaral, 2007). Essa seqüência é 100% de homóloga à região espA de
EPEC isolada de coelhos (rEPEC) (Amaral, 2007).
40
Iniciador 2
5’ATGGATACATCAACTGCAACATCAGTTGCTAGTGCGAACGCGAGTACTTCGACATCGACA
GTCTATGACTTAGGCAGTATGTCGAAAGACGAAGTAGTTCAGCTATTTAATAAAGTCGGTGT
Iniciador 1
TTTTCAGGCTGCGCTTCTCATGTTTGCCTATATGTATCAGGCACAAAGCGATCTGTCGATTG
CAAAGTTTGCTGATATGAATGAGGCATCTAAGGAGTCAACCACAGCCCAAAAAATGGCTAAT
CTTGTGGATGCTAAAATTGCTGATGTTCAGAGTAGTTCTGACAAGAATAAGAAAGCCAAACT
TCCTCAAGAAGTGATTGACTATATAAATGATCCTCGCAATGACATTACAGTAAGTGGTATTA
GCGATCTAAATGCTGAATTAGGCGCTGGTGATTTGCAAACGGTGAAGGCCGCTATTTCGGCC
AAATCGAATAACTTGACCACGGTAGTGAATAATAGCCAGCTTGAAATACAGCAAATGTCAAA
TACGTTAAACCTATTAACGAGTGCACGTTCTGATATTCAGTCACTGCAATACAGAACTATTT
CAGCAATATCCCTTGGTAAATAA 3’
Figura 21. Seqüência de EspA de rEPEC. Sequenciamento
realizado sob encomenda pela Genemed Synthesis, Califórnia,
EUA (adaptado de Amaral et al, 2007).
O seqüenciamento parcial da construção recombinante pBinPS2NT2A/EspA foi
realizado utilizando dois iniciadores específicos para a região espA, indicados na
figura 21. A estratégia de seqüenciamento foi montada de modo a verificar a
clonagem de espA na construção pBinPS2NT2A (figura 22).
Apa I
Stu I
Iniciador 2
RNA -2
2A
espA
Nos
Iniciador 1
PBINPS2NT2A/EspA
Figura 22. Esquema demonstrativo da estratégia de sequenciamento da
construção recombinante pBINPS2NT2A/ EspA.
41
Por meio do seqüenciamento parcial utilizando o iniciador 1 foi possível
identificar uma parte da seqüência de espA (32 a 91 nu), a seqüência de FMDV
(correspondente ao peptídeo catalítico 2A) (121 a 176 nu), a seqüência do CPMV
(204 a 744) e o sítio de restrição Apa I (figura 23).
Por meio do seqüenciamento parcial utilizando o iniciador 2 foi possível
identificar uma parte da seqüência de espA (17 a 512 nu), a seqüência do CPMV
(513 a 1183 nu), e o sítio de restrição Stu I (AGGCT) (figura 24).
42
Seqüência de espA (32 – 91nt).
Seqüência de FMDV (121 – 176nt).
Seqüência de CPMV (204 – 744nt).
Sítio da enzima de restrição Apa I – CCCGGG.
CGTACTTAAGCCGGCGGGTGACGTCATCTTCTCTTTCGACCTACTGCCTAAGTCAAAGACTG
Apa I
GCCATGTCCAAATACCCCCGTTCCCCCTAACAACTGATGTTGCAGTTGATTTTTCCCTGGGC
CCAGGGTTGGACTCAACGTCCCCTGCTAACTTAAGTAGGGCAAAGTTTAAAAACTGTTTTGC
CGGGCCTGCAACAATAACAGTGGGTCCAACCATAACCCTACCCTTGGAGCGTTCAATATCCC
GAAACCTAAACTTTAAAAACGGGGGAATTTCCGTTGACAGGGGAAATGGGGGCATCAGGATT
TTGCCGGCAACCCTGAAATTAGGATCCAAGCCCATGTTGACCCCAAATTGGTGTTTTTGTCT
GGGATTGGTAACAACCCCTTCAAAAAACCCGGGGGTCTGATTGGCCCATGGGCTTTCGGCAA
ATTCAAATCCCCTTTTCGGCCCTATGAAATCAAAAAAAAAATTCAACATGGCAAAACCCGGT
TGGGAAATCCCAAATGGCCCCCCATCAAAACTTTCCGGGGTCATGGACTGGCCCAGGTAAAC
AAAAACTTGGCCCTCCCAATCTGCTTTTTTGACCCCCGCACCCCTAACAATAAGTTGAACAT
GAATAATTCCCAAATTCCAAGCAGCAGTACCCAAGAAATTCATAATTGGAGGATTAAAAATG
GGCCTTTTCCAATTGGCATCCCCAAAAGGAATTATTTTGCCCTTGATTAAATCAAAAATTAC
GCTTGGACGTCCTAAAAAGGGACAGGGGGAATTTAAACTATTAAAAGAGGGCTATACCCTTT
GAAGGTTCCACAAAAAAAGGGCCTTGGGCTTAAACTCCCAACAAGCGGGAACCTTCATACCC
GGATAGAAACTATACCAAAATTCTTAAGGCAACAACTTGACCCAAAATAAAAACCCCGAAAA
TTGACCTGTGTACTCAAGAAAAATGCAATAAGTAGGACACCCTTCTCTTAAGGGGGTCTCGG
GTTACTTTGTGTAACAACGTACAAAAATTCTGTAGGAAAAAACATAACATCTTTTCCCCACA
CTCGAAGATGCACATTCTGGAGGAGAAGCTCTGAATAAGCCCAGGAGCAATCGTGAGATTAC
GCAGGCTGGTGAGTGAAGTAGTATACGTACGAGTCGTATA
Figura 23. Sequenciamento parcial da construção recombinante
pBINPS2NT2A/ EspA utilizado o iniciador 1.
43
Seqüência de espA (17-512 nu) - 72% de homologia com espA.
Seqüência do vetor pBINPS2NT2A (513-1183 nu)
Sítio da enzima de restrição Stu I – AGGCCT.
GAACTAGGCTAGGCCGAGAAGAAGTTATTCCGCCATTTAAATAAATCCGGGGTCCTCCAGGT
TGCCCTTCCCAGGTTGGCCTATAGGATTCAGGACCAAACCATCCGGCCAATGGCAAAGTTGG
CGGATATAAAGGAGGCATCTAAGGATCCACCCCCACCCCAAAAAAGGGTTAACCTGGGGAAG
GCTAAATTGGCGAAGGTCCAAAGAATTCCGAACAAAAATAAAAAACCCAACCTCCCCCAAAA
ATGGATGGACTTTTTAATGGACCCCCCCATGGCCTTTCCAGAAAGGGGATTTACCAATCTAA
TGGCTAAATTAGGCCCGGGGGATTTGCAACCGGGAAAGGCCCTTTTTCCGGCCAATTCAAAT
AACTGGCCCCCGGAAGGGAATAATACCCACTTGGAAATACACCAAAGGTCAAATCCTTTAAA
CCTATTACCAAGGGCCCTTCCGGATATCCATCCCCGGCATTCCAAACTTTTTTCGGCAATTT
Stu I
CCCTGGGAAAATACCCCAAGGCCTTAACCTCGGGTTCCTTTAATTTTCCTTTATTTGAAAT
TTCCGGTTTTCCGGGGTGCTTTCTTTTGTTGGGGGAGGGGTTTTCTGTGCTCAAAGGGGGTT
AATTTATGGTAATTTAATTCCTTGGGGACCCCCGGTTAACAAGGCCTCCCCTCCACCAAGGA
CCCAAAAAAATTTTAATTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAGAACCGGAAATCCGATTTCAACT
TTTTCACCTGGCGAACCGTCCAAACCTTTGGGGAAAAAAGGTTTCTTAAAATTGAATCCGGT
TGCGGGGCCTGGGAAGGTTATCCTAAAAATTTTCTGTGGATTTCGGTAAGCATGTAAAAATT
TAACTTGTAATGGCTGAACTTTTTTTTGGGTGGGGTTTTTAGATTTAGAGCCCGGAATTAAC
CATTTATACCCAATAAAAAACAAATATAGCGCGCAAACTAGATAATTTACCCGCGCGGTGTC
ACCTAGTGTACTAGACTCTAAGTTTCAAGCTTGGGGCGCCGCTTACGTTATTATGGTCTAGC
TGTTCCTCGTGTGAATGTATACCGCTCCAATTCGACAACATCACGACCGCAGACTAAGTTGT
ATACCCGTCGCTGCATCATGAGTAGTCATACTAGCTCACTATTGATGTGCTCAGTCACTTCT
GCTGGA
Figura 24. Seqüenciamento parcial da construção recombinante
pBINPS2NT2A/ EspA utilizado o iniciador 2.
44
Portanto,
o
seqüenciamento
parcial
da
construção
recombinante
pBinPS2NT2A/EspA utilizando os iniciadores 1 e 2, obtida a partir do clone pTU13B,
confirmou a clonagem.
Após a confirmação do clone pTU13B por PCR e por seqüenciamento parcial,
este clone foi utilizado para realizar experimentos de agroinfiltração e agroinfecção
(cessão 5.3.9) de folhas V. unguiculata (Feijão de Corda) e N. benthamiana. Para
estes experimentos foram utilizadas as construções recombinantes constantes da
tabela 3.
Tabela 3: Construções recombinantes utilizadas.
Construção
pBINPS2NT2A
Características gerais
Construção recombinante baseada
no cDNA do RNA 2 do CPMV e
derivada do plasmídeo pBINplus de
A. tumefaciens.
Referência
Gopinath, 2000; Liu e
Lomonossoff, 2002.
pBINPS2NT2A/
GFP
Construção recombinante obtida a
partir da clonagem da seqüência
para a proteína GFP (Green
Fluorescent Protein) no vetor
pBINPS2NT2A
Gopinath, 2000; Liu e
Lomonossoff, 2002.
pBINPS2NT2A/
EspA
Construção recombinante obtida a
partir da clonagem da seqüência
para a proteína EspA (proteína
translocada A de EPEC) no vetor
pBINPS2NT2A.
Este trabalho.
pBINPS2NT2A/
EspB
Construção recombinante obtida a
partir da clonagem da seqüência
para a proteína EspB (proteína
translocada B de EPEC) no vetor
pBINPS2NT2A.
Mesquita, 2006.
pBINPSINT
Construção recombinante baseada
no cDNA do RNA 1 do CPMV e
derivada do plasmídeo pBINplus de
A. tumefaciens.
Gopinath, 2000; Liu e
Lomonossoff, 2002.
PCP1
Construção recombinante baseada
no plasmídeo pUC 18 (Dessens e
Lomonossoff, 1993) e no RNA 1 do
CPMV.
Dessens e
Lomonossoff, 1993.
45
No primeiro experimento de agroinfecção realizado (cessão 4.11) foi utilizado o
DNA plasmidial PCP1, digerido com a enzima de restrição Mlu I (Mittmann, 2004),
em substituição do clone SINT (A. tumefaciens transformada com a construção
recombinante pBINPSINT). O DNA PCP1 (Dessens e Lomonossoff, 1993) é um DNA
infeccioso baseado no cDNA do RNA1 do CPMV que pode ser utilizado para
transformar plantas de Feijão de Corda. Em outro experimento alternativo, foi
utilizado CPMV selvagem como alternativa a utilização do clone SINT. Assim, foram
realizados seis diferentes experimentos de agroinfecção utilizando os clones
pTU13B, A4-4 (transformado com a construção recombinante pBINPS2NT2A/EspB;
EspB – proteína translocada B de EPEC) (Mesquita, 2006) e, NSI/GFP
(transformado com a construção recombinante pBINPS2NT2A/GFP) (Gopinath,
2000; Liu e Lomonossoff, 2002).
Segue abaixo a relação de experimentos realizados:
Experimento 1: Agroinfecção de Feijão de corda e N. benthamiana utilizando o
clone pTU13B e DNA linear PCP1.
Experimento 2: Agroinfecção de N. benthamiana utilizando o clone NSI/GFP e
DNA linear PCP1.
Experimento 3: Agroinfecção de N. benthamiana utilizando o clone A 4-4 e
DNA linear PCP1.
Experimento 4: Agroinfecção de N. benthamiana utilizando o clone pTU13B e
CPMV selvagem.
Experimento 5: Agroinfecção de N. benthamiana utilizando o clone NSI/GFP e
CPMV selvagem.
Experimento 6: Agroinfecção de N. benthamiana utilizando o clone A 4-4 e
CPMV selvagem.
46
Após 20 dias de infecção foram observados os sintomas característicos de
infecção por CPMV; os extratos foliares foram então coletados e analisados por
Imunoblotting utilizando soro de coelho imune anti CPMV (soro R20) para detectar a
produção de proteínas virais.
Como pode ser observado na figura 25, utilizando soro imune anti CPMV foi
possível detectar proteínas virais em extratos de V. unguiculata e N. benthamiana
infectados com diferentes construções recombinantes.
L
S
E1 0 E9 E8 E7 E6
E5
E4 E3
E2
E1
Figura 25. Imunoblotting utilizando diferentes extratos de plantas
infectadas com construções recombinantes incubados com soro
de coelho anti CPMV (soro R20). E1: V. unguiculata infectada
com pTU13B e DNA PCP1; E2: N. benthamiana infectada com
pTU13 B e CPMV; E3: N. benthamiana infectada com pTU13B e
DNA PCP1; E4: N. benthamiana infectada com A4-4 e CPMV; E5:
N. benthamiana infectada com A4-4 e DNA PCP1; E6: N.
benthamiana
infectada
com
NSI/GFP
e
CPMV;
E7:
N.
benthamiana infectada com NSI/GFP e DNA PCP1; E8: Controle
positivo (CPMV WT purificado); E9: Controle negativo – extrato de
V. unguiculata não infectada; E10: Controle negativo – extrato de
N. benthamiana não infectada.
47
Com este experimento foi possível demonstrar que a infecção de V.
unguiculata e N. benthamiana com diferentes clones (pTU 13B; NSI/GFP; e A 4-4) e
DNA linear PCP1, ou CMPV selvagem, leva a formação de partículas virais. Para os
experimentos utilizando DNA linear PCP1 espera-se a produção de uma população
homogênea de vírus quiméricos; para os experimentos utilizando CPMV WT
esperam-se a produção de uma população mista de vírus (vírus quiméricos e vírus
selvagem). A não detecção de proteínas virais em todos os extratos pode ser devido
ao fato de que o vírus não se distribui de maneira uniforme pelos tecidos vegetais.
Após a verificação de que agroinfecção levam a formação de proteínas virais foi
realizado a agroinfiltração (cessão 4.10) de folhas de Feijão de Corda. Após a
agroinfiltração as folhas de Feijão de Corda foram colocadas em uma bandeja
forrada com papel filtro umedecido e incubada por 72 horas sob um foto-período de
16 horas em sala de vegetação (figura 26).
Figura 26. Folhas de Feijão de Corda infiltradas com o clone
pTU13B.
Após o período de incubação das folhas infiltradas, foi obtido o extrato total
(cessão 4.12) para a análise da produção de proteínas virais e EspA.
Folhas de Feijão de Corda, com aproximadamente 10 dias de plantio, foram
agroinfectadas (cessão 4.11) com os clones pTU13B e SINT. Após 7-8 dias de
agroinfecção pode ser observado os primeiros sintomas característicos da infecção
por CPMV; os sintomas tornam-se mais visíveis após 20 dias de infecção.
48
Como pode ser observado na figura 27, plantas de Feijão de Corda após 20
dias da agroinfecção desenvolveram sintomas característicos da infecção por
CPMV.
A
B
C
Figura 27. Feijão de Corda após 20 dias da agroinfecção com os
clones
pTU13B
e
S1NT.
A,
B,
C:
diferentes
plantas
agroinfectadas demonstrando o padrão de mosaico, e má
formação foliar, característico da infecção por CPMV.
Após a observação dos primeiros sintomas da infecção por CPMV folhas de
plantas infectadas foram coletos e o extrato total foi obtido, a fim de analisar a
produção de proteínas virais e da proteína EspA. Os extratos das folhas de Feijão de
Corda agroinfiltradas também foram utilizados para infectar novas plantas (1o
passagem).
Plantas de Feijão de Corda infectadas com extratos totais de folhas de Feijão
de Corda agroinfectadas com as construções recombinantes desenvolveram
sintomas de infecção por CPMV após 7-8 dias após a infecção; tornam mais visíveis
após 20 dias de infecção. A partir do 20º dia de infecção observou a diminuição dos
sintomas da infecção em todas as plantas infectadas (Liu e Lomonossoff, 2002).
A agroinfecção de plantas de Feijão de Corda utilizando o clone NSI/GFP
(transformado com a construção recombinante pBINPS2NT2A/GFP). Este ensaio foi
realizado para se obter a rápida verificação da produção da proteína recombinante
(Isso é possível por que a proteína GFP tem propriedades florescentes quando
exposta à luz ultravioleta).
49
Como pode ser observado na figura 28, a agroinfecção de plantas de Feijão de
Corda com os clones SINT e NSI/GFP leva formação de folhas com propriedades
florescentes quando exposta à luz ultravioleta, indicando a produção da proteína
GFP).
F1
F2
F3
F4
A
F1
F5
F2
F3
F4
F5
B
Figura 28. Folhas de Feijão de Corda após 20 dias de
agroinfecção com os clones SINT e NSI/GFP. A: visualização sob
luz branca; B: Visualização sob luz ultravioleta. F1, F3 e F5:
folhas agroinfectadas; F2 e F4: folhas não infectadas. A
florescência em F1, F3 e F5 indicam a produção da proteína
recombinante GFP.
Folhas de Feijão de Corda agroinfiltradas com o clone pTU13B e
agroinfectadas com os clones pTU13B e SINT foram analisadas para verificar a
produção de proteínas virais utilizando soro de coelho imune anti CPMV (soro R20)
pela técnica de Western Blotting.
Como pode ser observado na figura 29, foi possível demonstrar que folhas de
Feijão de Corda agroinfiltradas e agroinfectadas produzem proteínas virais
(proteínas L e S).
50
L
S
FN FI1 FI2 FN
Figura 29. Western Blotting de extratos foliares de Feijão de
Corda utilizando soro de coelho imune anti CPMV (soro R20)
(diluição 1/5000).
FN: Folhas de Feijão não infectadas; FI1:
Folhas de Feijão infectadas; FI2: Folhas de Feijão Agroinfectadas.
Este experimento utilizando o extrato total das folhas (cessão 4.12) e soro de
coelho imune anti CPMV evidencia a presença das proteínas virais L e S no tecido
vegetal, sugerindo a produção proteínas virais (agroinfiltração) e de partículas virais
(agroinfecção).
A agroinfiltração não leva a formação de partículas virais devido ao fato que o
RNA1 ser essencial na replicação viral (Gopinath, 2000). Neste caso, ocorre apenas
a transcrição e tradução das proteínas codificadas pelo RNA2; estas proteínas se
acumulam no citoplasma da célula hospedeira sem formar partículas virais.
Como pode ser observado na figura 30, foi possível detectar por Western
Blotting a produção das proteínas virais L e S em extrato total de folhas de Feijão de
Corda agroinfectadas com os clones pTU13B e SINT, utilizando soro de coelho anti
CPMV; não foi possível a detecção da produção da proteína EspA, utilizando soro
de coelho anti EspA (figura 31).
51
L
S
A1
A2
A3
A4
Figura 30. Western Blotting utilizando extrato total de folhas de
Feijão de Corda e soro de coelho imune anti CPMV (diluição
1/5.000). A1, A2, A3 e A4: Extrato total de folhas de Feijão de
Corda após 20 dias de agroinfecção com os clones pTU13B e
SINT. A1: Extração utilizando Tampão ESB (cessão 4.12); A2:
Extração utilizando Tampão fosfato 100 mM pH 7,0 (cessão 4.12);
A3: Extração utilizando Tampão de corrida 2x (Tris base pH 6.8;
2,3% SDS; 0,1% azul de bromofenol; 10% glicerol; 50 µL de βmercaptoetanol/mL);
A4:
Extração
utilizando
Tampão
ESB
(cessão 4.12) e precipitado com TCA (Ácido Tricloro acético)
10%.
52
EspA
EspA A1
A2
A3
Figura 31. Western Blotting de folhas de Feijão de Corda
utilizando soro de coelho imune anti EspA (diluição 1/5.000).
EspA: controle positivo (proteína EspA recombinante); A1, A2, A3:
Extrato total de folhas de Feijão de Corda após 20 dias de
agroinfecção com os clones pTU13B e SINT. A1: Extração
utilizando Tampão ESB (cessão 4.12); A2: Extração utilizando
Tampão fosfato 100 mM pH 7,0 (cessão 4.12); A3: Extração
utilizando Tampão de corrida 2x (Tris base pH 6.8; 2,3% SDS;
0,1%
azul
de
bromofenol;
mercaptoetanol/mL).
10%
glicerol;
50
µL
de
β-
53
Contudo, foi possível detectar a produção da proteína EspA por ELISA (Towbin,
1979), utilizando soro de coelho inume anti EspA (diluição 1/500) (figura 32).
2,5
OD (490 nm)
2
1,5
Lisado teste
Planta não infectada
1
Controle Positivo
0,5
0
anti CPMV
anti EspA
soro de
paciente
Figura 32. Ensaio de ELISA utilizando soros de coelho imune anti
CPMV e EspA, e soro de um paciente pediátrico. Extrato teste:
extrato de Feijão de Corda agroinfectada com as construções
recombinantes
pBINPS2NT2A/EspA
e
pBINPSINT;
controle
negativo: extrato de Feijão de Corda não infectado; controle
negativo: proteína EspA purificada, ou CPMV purificado.
A detecção de EspA recombinante em extratos de folha de Feijão de Corda
infectados apenas por ELISA deve-se ao fato de que esta técnica é mais sensível
que a técnica de Western Blotting.
A detecção das proteínas virais e não detecção da proteína EspA por
Western Blotting sugere a ocorrência de silenciamento gênico. Para analisar a
ocorrência de silenciamento gênico foi obtido RNA total de folhas de Feijão de Corda
e Nicotiana benthamiana.
A extração de RNA total de folhas de Feijão de Corda, infectadas e não
infectadas, foi realizada com TRIZOL
fabricante.
®
(Invitrogen), seguindo as especificações do
54
Na figura 33 pode ser observado o perfil eletroforético do RNA total extraído.
RNA
Ribossômico
A1 A2 A3 A4 A5 A6 C
Figura 33. Gel de Agarose 0,8 % com brometo de etídio. A1, A2,
A3, A4: RNA total de folhas de Feijão de Corda agroinfectadas.
A5 e A6: RNA total de folhas de Feijão de Corda não
agroinfectadas. C: RNA total controle (1,2 µg).
O RNA total foi utilizado para realizar ensaios de RT - PCR, utilizando iniciador
específico para amplificação da seqüência espA (cessão 4.2, iniciador 2), o que
revelou a presença de mRNA de EspA em todas as folhas de plantas de Feijão de
Corda agroinfectadas com as construções recombinantes pBINPS2NT2A/EspA e
pBINPSINT (figura 34).
55
EspA
500p
M A1 A2 A4 B1 B2 B4 C1 C2 C4 D1 D2 D4 E1 E2 E4 C+ C-
Figura 34. Gel de agarose 0.8% com brometo de etídio. Produtos
da reação de RT PCR utilizando 5 µg de RNA total extraído de
Folhas de Feijão de Corda agroinfectadas. M: Marcador Lambda
Hind III; A, B, C, D e E: amostras de RNA total de diferentes
folhas de Feijão de Corda agroinfectadas utilizadas. C+: controle
positivo da reação de PCR (DNA EAF+); C-: controle negativo da
reação de PCR. As amostras 1, 2, 3 e 4 correspondem a 1, 2, 3 e
4 µL da reação de RT PCR utilizados na reação de PCR,
respectivamente.
Como demonstrado na figura 35, por meio da técnica de RT PCR, utilizando
iniciador específico para amplificação da seqüência espA (cessão 4.2 e RNA total,
iniciador 2), foi possível detectar a presença de mRNA de EspA em folhas de Feijão
de Corda agroinfectadas e em folhas de Nicotiana benthamiana agroinfiltradas com
o clone pTU13B. Também foi possível determinar a ausência de mRNA de EspA em
folhas de Feijão não infectadas.
56
500p
espA
M A2 A4 A- B2 B4 B- C2 C4 C- D2 D4 D- E2 E4 E- C+ C-
Figura 35. Gel de agarose 0,8% com brometo de etídio. Produtos
do ensaio de RT - PCR utilizando RNA total de folhas de plantas
agroinfectadas. M: marcador Lambda Hind III; Amostras utilizadas
- A: RNA total de folha de Feijão de Corda agroinfectadas com os
clones pTU13B e SINT; B: RNA total de folhas Nicotiana
Benthamiana agroinfiltrada com o clone pTU13B; C: RNA total de
folha de Feijão de Corda infectado com extratos de folhas
agroinfectadas; D: RNA total de folha de Feijão de Corda não
infectados; E: RNA total de folha de Feijão de Corda
agroinfiltrado. C+: controle positivo da reação de PCR (DNA
EAF+). C-: controle negativo da reação de PCR. As amostras A -,
B -, C -, D - e E - são os controles da reação de RT - PCR (sem
enzima transcriptase reversa) das amostras A, B, C, D e E
respectivamente.
Não foi possível detectar a presença de mRNA de EspA em folhas de Feijão de
Corda infectado com extratos de folhas agroinfectadas (1º passagem), o que sugere
a ausência de vírus quiméricos (dados não mostrados).
A analise por Western Blotting, utilizando soro de coelho anti EspA (figura 36.A)
e soro de coelho anti CPMV (figura 36.B), de partículas virais quiméricas purificadas
a partir de folhas de feijão de Corda agroinfectadas com os clones pTU13B e SINT,
revelou a presença da proteína EspA e de proteína virais.
57
L
42 kDa
S
24 kDa
EspA
21 kDa
A
EspA A1
A2
B
CPMV A1 A2
Figura 36. A: Montagem de partes relevantes de um mesmo
ensaio de Western Blotting utilizando CPMV quimérico purificado
e soro de coelho inume anti EspA (diluição 1/5000). EspA:
proteína EspA purificada; A1 e A2: CPMV quiméricos purificados.
B: Western Blotting utilizando CPMV quimérico purificado e soro
de coelho inume anti CPMV (diluição 1/5000). CPMV: CPMV
purificado (controle positivo); A1 e A2: CPMV quiméricos
purificados.
Este ensaio demonstra que a agroinfecção de folhas de feijão de Corda com
os clones pTU13B e SINT leva a formação de partículas virais viáveis. Após a
agroinfecção há a formação e propagação de partículas virais quiméricas pelo tecido
vegetal.
58
6.
Discussão
Este trabalho buscou a expressão transiente de EspA em plantas de Feijão de
Corda visando o desenvolvimento de imunoterápico, e o desenvolvimento e
implementação da tecnologia de expressão transiente no Laboratório de
Biotecnologia. Para isso a seqüência que codifica a proteína EspA de EPEC foi
amplificada pela técnica da PCR; posteriormente a seqüência espA foi digerida com
as enzimas de restrição Apa I e Stu I, e foi clonada no vetor de expressão
pBINPS2NT2A. A clonagem de seqüência espA no vetor pBINPS2NT2A foi
dificultada
devido
a
tamanho
de
aproximadamente
19.000pb
do
vetor
pBINPS2NT2A. As dificuldades da ligação e a baixa eficiência da transformação de
E. coli com a construção recombinante pBINPS2NT2A/EspA, justificam a obtenção
de poucos clones transformantes.
Durante os ensaios de agroinfiltração e agroinfecção, utilizando A. tumefaciens
transformada com a construção recombinante pBINPS2NT2A/EspA, foi observado
que a eficiência do processo mostrou ser muito depende da acidez do meio utilizado
(pH 5,6), da concentração celular utilizada (DO600nm = 2,4), do vácuo aplicado (100
mbar) (no caso da agroinfiltração), e da concentração de acetosiringona (200 µM)
(dados não mostrados). Qualquer variação nestas condições levou a ineficiência do
processo (Kapila et al, 1997).
Todas as plantas de Feijão de Corda agroinfectadas com as construções
recombinantes pBINPS2NT2A/EspA e pBINPSINT desenvolveram os primeiros
sintomas característicos da infecção por CMPV após 8 dias de infecção; a
progressão dos sintomas ocorreu até, aproximadamente, 20 dias; após este período
observou-se uma diminuição dos sintomas da infecção. A diminuição nos sintomas
da infecção está relacionada a uma possível resposta antiviral desenvolvida pela
planta (Liu et al, 2004). Segundo Liu e Lomosossoff (2002), plantas agroinfectadas
individualmente com as construções recombinantes baseadas no RNA1 ou no RNA2
não desenvolvem os sintomas da infecção por CPMV e não levam a produção de
partículas virais, e 100% das plantas infectadas com as duas construções
simultaneamente desenvolvem os sintomas da infecção e levam a produção de
partículas virais quiméricas viáveis (Gopinath et al, 2000).
59
Segundo Liu e Lomosossoff (2004), o RNA 2 de CPMV codifica um supressor
de silenciamento gênico o que possibilita o sucesso da infecção viral; após 20 dias
de infecção há apenas a diminuição, e não a eliminação, da infecção. Baseado
nestes dados, após 20 dias de infecção as folhas das plantas infectadas foram
coletas e congeladas a -20º C. A estocagem das folhas infectadas sob refrigeração
possibilita a manutenção do tecido vegetal infectado, onde os vírus permanecem
viáveis por até 1 ano.
Plantas de Feijão de Corda infectadas com extratos (1º passagem dos vírus
quiméricos produzidos) de folhas agroinfectadas (20 dias após a agroinfecção)
desenvolveram sintomas característicos da infecção por CPMV após 8 dias de
infecção. Esta observação sugere que a agroinfecção utilizando os clones
pBINPS2NT2A/ EspA e pBINPSINT leva a formação de partículas virais viáveis que
podem ser facilmente disseminadas para outras plantas. Também foi observado que
plantas infectadas com extratos de folhas inferiores desenvolvem os sintomas de
infecção, e plantas infectadas com extratos de folhas superiores não desenvolvem,
ou desenvolvem tardiamente, os sintomas de infecção por CPMV, sugerindo uma
maior carga viral nas folhas inferiores (sintomas de mosaico) do que nas folhas
superiores (sintomas de má formação foliar) (dados não mostrados). Contudo, por
RT - PCR utilizando iniciadores específicos, não foi possível detectar a presença de
mRNA de EspA em extratos foliares destas plantas (dados não mostrados). Esta
observação sugere a perda da seqüência espA durante a replicação viral,
ocasionando a formação de partículas virais tipo selvagem. A perda da seqüência
clonada durante o processo de replicação viral pode ser devido à ocorrência de
recombinação homóloga (Gopinath et al, 2000).
Foi possível demonstrar, por meio técnica de Western Blotting e ELISA
utilizando extratos totais de folhas e soro de coelho imune anti CMPV, que a
agroinfiltração e a agroinfecção de Feijão de Corda levam a produção das proteínas
virais L e S e a formação de partículas virais viáveis, respectivamente. A
agroinfecção utilizando a construção recombinante pBINPSINT não leva a formação
de partículas virais por que para que ocorra a replicação viral é necessário a
presença do RNA 1 e do RNA 2 (Gopinath et al, 2000).
60
A produção da proteína recombinante EspA não pode ser detectada por meio
da técnica de Western Blotting em extratos foliares, utilizando soro de coelho anti
EspA. A detecção da proteína recombinante EspA em extratos de plantas infectadas
com a construção recombinante pBINPS2NT2A/EspA só foi possível pela técnica de
ELISA, utilizando soro de coelho imune anti EspA (diluição 1/500); esta observação
sugere uma baixa expressão da proteína EspA.
Também foi possível detectar a produção da proteína EspA por meio da técnica
de ELISA utilizando soro um de paciente pediátrico com histórico de diarréia
(diluição 1/500). Esta observação sugere que apesar do baixo nível de expressão, a
proteína
EspA
recombinante
produzida
em
plantas
possui
propriedades
imunogênicas.
Segundo Gopinath e colaboradores (2000) a proporção na produção de
proteína recombinante e proteínas virais neste sistema de expressão é 1:1, o que
não foi observado neste trabalho. A diferença na proporção da proteína EspA e
proteínas virais produzidas levantou a possibilidade da ocorrência de silenciamento
gênico. Considerando que a produção de proteínas virais não foi afeta foi proposto
inicialmente a ocorrência de silenciamento apenas da seqüência espA.
Análise de RT PCR, utilizando iniciador específico para espA e extratos totais
de folhas de Feijão de Corda e N. benthamiana infectadas com as construções
recombinantes pBINPS2NT2A/EspA e pBINPSINT, revelou a presença do mRNA
que codifica a proteína EspA. O presença de mRNA de EspA detectada tanto em
folhas de Feijão de Corda agroinfectadas como em folhas de N. Benthamiana
agroinfiltradas, sugere a ocorrência replicação viral (o que leva a amplificação da
seqüência EspA clonada no tecido vegetal).
A detecção de mRNA para EspA de RNA total de plantas infectadas, no ensaio
de RT PCR em que não foi utilizado a enzima Transcriptase Reversa (controle
negativo do ensaio de RT PCR), e juntamente com a observação de que não foi
possível detectar mRNA em plantas não infectadas, sugere a presença de DNA
como intermediário no processo de replicação viral. Não foi possível obter maiores
detalhes do processo de replicação do CPMV na literatura.
61
A detecção de mRNA para EspA no tecido vegetal de plantas agroinfiltradas e
agroinfectadas descarta a possibilidade de ocorrência de silenciamento em nível de
transcrição. Esta observação levantou a possibilidade de silenciamento pós
transcricional. A análise do “códon de uso” de EPEC (anexo 9.1.1) e CPMV (anexo
9.1.2) relevou diferenças significativas na utilização de “códons de uso” destes dois
organismos. A diferença de utilização nos “códons de uso” e os baixos níveis de
expressão de espA sugerem a tradução ineficiente do mRNA de EspA, o que por
sua vez explica os baixos níveis de expressão detectados. Comprovada esta
observação, uma possibilidade de contornar este problema e obter maior nível de
expressão de espA e adaptar a seqüência clonada ao padrão de códon de uso do
organismo hospedeiro (Feijão de Corda).
Devido a baixa expressão da proteína recombinante EspA, foi realizado um
ensaio de agroinfecção de plantas de Feijão de Corda utilizando os clones de A.
tumefaciens transformadas com as construções recombinantes pBINPS2NT2A/GFP
e pBINPSINT. Este ensaio teve o objetivo de verificar a eficiência da técnica de
agroinfecção. Foi observado que folhas de plantas de feijão infectadas com as
construções pBINPS2NT2A/GFP e pBINPSINT possuem propriedades florescentes
quando expostas a luz ultravioleta, o que sugere a produção da proteína
recombinante GFP. Este ensaio demonstra que a técnica de agroinfecção é viável e,
levanta novamente a questão da interferência da utilização de “códons de uso” como
responsável pela baixa produção de EspA.
A análise por Western Blotting de partículas virais quiméricas, purificadas a
partir folhas de Feijão de Corda agroinfectadas com as construções recombinantes
pBINPS2NT2A/EspA e pBINPSINT, utilizando soro de coelho imune anti EspA
revelou a presença da proteína recombinante EspA. Esta observação sugere a
ocorrência de clivagem ineficiente do peptídeo catalítico 2A, levando a produção de
uma proteína de fusão (S-2A-EspA). Esta observação levanta a possibilidade de que
a proteína EspA recombinante faça parte do capsídeo viral na forma de proteína de
fusão (Gopinath et al, 2000). Assim, espera-se que 1/6 das proteínas S que formam
o capsídeo viral estejam na forma de S-2A-EspA, ou seja, cada partícula viral
62
quimérica terá cerca de 10 cópias de S-2A-EspA no capsídeo viral (Gopinath et al,
2000).
A confirmação de que a proteína EspA recombinante faz parte do capsídeo
viral, na forma de proteína de fusão, pode ser um fator determinante no
desenvolvimento de imunoterápicos baseados nesta técnica, pois as partículas virais
possuem propriedades imunológicas e estimulam o sistema imune aumentando a
antigenicidade do antígeno (Liu et al 2005; Rae et al 2005). Faz-se necessário,
portanto, a imunização de coelhos utilizando partículas virais quiméricas a fim de se
analisar a produção de anticorpos anti CPMV.
63
7.
Conclusões
Plantas de Feijão de Corda agroinfectadas com as construções recombinantes
pBINPS2NT2A/EspA e pBINPSINT desenvolvem sintomas característicos da
infecção por CPMV, produziram partículas virais e expressaram a proteína EspA foi
a níveis detectáveis por ELISA.
As partículas virais quiméricas purificadas contêm proteína EspA recombinante.
Os baixos níveis de expressão de EspA, em relação as proteínas virais, podem
ser explicados pela ocorrência de silenciamento gênico pós transcricional, devido a
diferenças no padrão de utilização de códons.
Não foi possível observar os níveis de expressão descritos na literatura para
outras proteínas. Esta diferença pode ser devido à origem bacteriana da proteína
recombinante.
64
8.
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75
9.
Anexos
9.1.
Códon de Uso
9.1.1. Códon de Uso de EPEC
Aminoácido
Ala
Ala
Ala
Ala
Códon
GCG
GCA
GCT
GCC
Número
11.00
18.00
15.00
9.00
/1000
28.87
47.24
39.37
23.62
Razão
0.21
0.34
0.28
0.17
Cys
Cys
TGT
TGC
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
Asp
Asp
Glu
Glu
GAT
GAC
GAG
GAA
12.00
2.00
9.00
8.00
31.50
5.25
23.62
21.00
0.86
0.14
0.53
0.47
Phe
Phe
TTT
TTC
7.00
0.00
18.37
0.00
1. 00
0.00
Gly
Gly
Gly
Gly
GGG
GGA
GGT
GGC
4.00
3.00
9.00
8.00
10.50
7.87
23.62
21.00
0.17
0.13
0.38
0.33
His
His
CAT
CAC
0.00
1. 00
0.00
2.62
0.00
1. 00
Ile
Ile
Ile
ATA
ATT
ATC
2.00
10.00
3.00
5.25
26.25
7.87
0.13
0.67
0.20
Lys
Lys
AAG
AAA
5.00
16.00
13.12
41.99
0.24
0.76
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
TTG
TTA
CTG
CTA
CTT
CTC
3.00
9.00
14.00
0.00
4.00
2.00
7.87
23.62
36.75
0.00
10.50
5.25
0.09
0.28
0.44
0.00
0.13
0.06
Met
ATG
10.00
26.25
1.00
Asn
Asn
AAT
AAC
12.00
10.00
31.50
26.25
0.55
0.45
Pro
Pro
Pro
Pro
CCG
CCA
CCT
CCC
3.00
4.00
3.00
1. 00
7.87
10.50
7.87
2.62
0.27
0.36
0.27
0.09
GIn
GIn
CAG
CAA
15.00
9.00
39.37
23.62
0.63
0.38
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
AGG
AGA
CGG
CGA
CGT
CGC
2.00
0.00
0.00
5.00
2.00
1. 00
5.25
0.00
0.00
13.12
5.25
2.62
0.20
0.00
0.00
0.50
0.20
0.10
76
Ser
Ser
Ser
Ser
Ser
Ser
AGT
AGC
TCG
TCA
TCT
TCC
11.00
8.00
0.00
8.00
13.00
5.00
28.87
21.00
0.00
21. 00
34.12
13.12
0.24
0.18
0.00
0.18
0.29
0.11
Thr
Thr
Thr
Thr
ACG
ACA
ACT
ACC
8.00
7.00
8.00
4.00
21.00
18.37
21.00
10.50
0.30
0.26
0.30
0.15
VaI
VaI
VaI
VaI
GTG
GTA
GTT
GTC
6.00
7.00
19.00
6.00
15.75
18.37
49.87
15.75
0.16
0.18
0.50
0.16
Trp
Tyr
Tyr
TGG
TAT
TAC
TGA
TAG
TAA
3.00
3.00
3.00
0.00
0.00
1. 00
7.87
7.87
7.87
0.00
0.00
2.62
1. 00
0.50
0.50
0.00
0.00
1. 00
End
End
End
77
9.1.2. Códon de uso de CPMV
Aminoácido
Ala
Ala
Ala
Ala
Códon
GCG
GCA
GCT
GCC
Número
1.00
2.00
10.00
5.00
/1000
4.67
9.36
46.73
23.36
Razão
0.06
0.11
0.56
0.28
Cys
Cys
TGT
TGC
3.00
0.00
14.02
0.00
1.00
0.00
Asp
Asp
GAT
GAC
8.00
3.00
37.38
14.02
0.73
0.27
Glu
Glu
GAG
GAA
1.00
7.00
4.67
32.71
0.13
0.88
Phe
Phe
TTT
TTC
11.00
3.00
51.40
14.02
0.79
0.21
Gly
Gly
Gly
Gly
GGG
GGA
GGT
GGC
1.00
4.00
5..00
2.00
4.67
18.69
23.36
9.35
0.08
0.33
0.42
0.17
His
His
CAT
CAC
1.00
2.00
4.67
9.35
0.33
0.67
Ile
Ile
Ile
ATA
ATT
ATC
4.00
4.00
4.00
18.69
18.69
18.69
0.33
0.33
0.33
Lys
Lys
AAG
AAA
2.00
3.00
9.35
14.02
0.40
0.60
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
TTG
TTA
CTG
CTA
CTT
CTC
2.00
3.00
3.00
0.00
2.00
0.00
9.35
14.02
14.02
0.00
9.35
0.00
0.20
0.30
0.30
0.00
0.20
0.00
Met
ATG
7.00
32.71
1.00
Asn
Asn
AAT
AAC
10.00
4.00
46.73
18.69
0.71
0.29
Pro
Pro
Pro
CCG
CCA
CCT
2.00
7.00
8.00
9.35
32.71
37.38
0.11
0.37
0.42
GIn
GIn
CAG
CAA
3.00
5.00
14.02
23.36
0.38
0.63
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
AGG
AGA
CGG
CGA
CGT
CGC
3.00
2.00
2.00
0.00
2.00
3.00
14.02
9.35
9.35
0.00
9.35
14.02
0.25
0.17
0.17
0.00
0.17
0.24
Ser
Ser
Ser
Ser
Ser
Ser
AGT
AGC
TCG
TCA
TCT
TCC
2.00
4.00
0.00
4.00
3.00
2.00
9.35
18.69
0.00
18.69
14.02
9.35
0.13
0.27
0.00
0.27
0.20
0.13
78
Thr
Thr
Thr
Thr
ACG
ACA
ACT
ACC
2.00
2.00
8.00
3.00
9.35
9.35
37.38
14.02
0.13
0.13
0.53
0.20
VaI
VaI
VaI
VaI
GTG
GTA
GTT
GTC
2.00
1.00
10.00
4.00
9.35
4.67
46.73
18.69
0.12
0.06
0.59
0.24
Trp
Trp
Trp
TGG
TAT
TAC
5.00
4.00
1.00
23.36
18.69
4.67
1.00
0.80
0.20
End
End
End
TGA
TAG
TAA
0.00
0.00
1.00
0.00
0.00
4.67
0.00
0.00
1.00