Maria de Fatima Ruiz Martins

1
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
MARIA DE FÁTIMA RUIZ MARTINS
ANÁLISE DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE
PRECURSORES E DERIVADOS QUINOLÔNICOS ANÁLOGOS DE
NORFLOXACINO
ITAJAÍ - 2009
2
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO MICROBIOLOGIA
MARIA DE FÁTIMA RUIZ MARTINS
ANÁLISE DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE
PRECURSORES E DERIVADOS QUINOLÔNICOS ANÁLOGOS DE
NORFLOXACINO
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz
Itajaí, Agosto de 2009.
3
ANÁLISE DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE
PRECURSORES E DERIVADOS QUINOLÔNICOS ANÁLOGOS DE
NORFLOXACINO
MARIA DE FÁTIMA RUIZ MARTINS
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Microbiologia e aprovada em sua
forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências.
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.”
____________________________________
Prof. Alexandre Bella Cruz, Dr.
Orientador
__________________________________________________________
Profª. Tânia Mari Bellé Bresolin, Drª.
Coordenadora do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz (UNIVALI)
Presidente
______________________________________
Profª. Drª. Ednéia Casagranda Bueno (UNIVALI)
Membro
______________________________________
Prof. Dr. Ricardo José Nunes (UFSC)
Membro
Itajaí (SC), Agosto de 2009.
4
Dedicatória
Dedico integralmente ao meu pai (in memorian) e a minha mãe que sempre me
incentivaram em minha vida profissional.
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus por ter me concedido sabedoria e serenidade em
todos os momentos.
Ao professor Dr. Alexandre Bella Cruz, pela orientação que me foi dada com
muita competência, sabedoria e profissionalismo.
Ao professor Rogério Corrêa, pela parceria e confiança na elaboração desse
trabalho.
Aos professores Ruth, Maique, Niero, Angela e Rilton, pelos valiosos
ensinamentos recebidos durante as disciplinas.
A professora Ednéia Casagranda Bueno, pela colaboração na parte escrita do
trabalho, bem como pela carinhosa amizade.
A professora Fátima de Campos Buzzi, pelas valiosas considerações na parte
escrita do trabalho.
A todos os meus colegas do mestrado, pelos bons momentos compartilhados
durante estes dois anos, principalmente pelos nossos divertidos jantares entre
Itapema e Balneário Camboriú.
A minha mãe, pelas suas incansáveis orações.
A toda minha família, pela compreensão nos vários momentos de ausência.
Ao meu namorado, pela paciência, compreensão, amor e companheirismo
nos momentos de estudo. Obrigada pelo carinho.
A Direção do Hospital e Maternidade Jaraguá, por acreditar em meu potencial
e dar a oportunidade de trabalhar nesta instituição podendo assim, concluir esse
sonho.
Aos funcionários da farmácia do Hospital e Maternidade Jaraguá, agradeço a
torcida.
A todos os amigos que de alguma forma torceram por mim, especialmente
minha amiga Cassandra, todo o meu carinho e muito obrigada por tudo.
6
EPÍGRAFE
“Cada um que passa em nossa vida passa sozinho... porque cada pessoa é única
para nós, e nenhuma substitui a outra.
Cada um que passa em nossa vida passa sozinho, mas não vai só...
Levam um pouco de nós mesmos e nos deixam um pouco de si mesmos.
Há os que levam muito, mas não há os que não levam nada.
Há os que deixam muito, mas não há os que não deixam nada.
Esta é a mais bela realidade da vida... a prova tremenda de que cada um é
importante e que ninguém se aproxima do outro por acaso.”
Saint-Exupéry
7
ANÁLISE DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE
PRECURSORES E DERIVADOS QUINOLÔNICOS ANÁLOGOS DE
NORFLOXACINO
MARIA DE FÁTIMA RUIZ MARTINS
Agosto/2009
Orientador: Prof. Alexandre Bella Cruz, Dr.
Área de Concentração: Microbiologia
Número de Páginas: 68
RESUMO
As fluoroquinolonas são agentes que pertencem a uma classe de fármacos capazes
de inibir a DNA girase, enzima essencial envolvida na replicação do DNA bacteriano.
Apesar das fluoroquinolonas possuírem uma ampla atividade antimicrobiana contra
bactérias Gram-negativas e anaeróbias, esta classe de compostos é relativamente
menos ativa contra bactérias Gram-positivas. Esforços têm sido direcionados para a
síntese de novas fluoroquinolonas, visando o aumento da atividade antibacteriana
inclusive contra bactérias Gram-positivas, menores efeitos colaterais, melhores
perfis farmacocinéticos e menor custo. No presente trabalho, os compostos
utilizados nos ensaios para avaliação de atividade antibacteriana foram obtidos a
partir de modificações da molécula de norfloxacino resultando em quatro grupos: a)
precursores fenacílicos; b) precursores imínicos; c) derivados do norfloxacino e, d)
análogos do norfloxacino. A avaliação da atividade antimicrobiana incluiu cepas
padronizadas e cepas de isolados clínicos de micro-organismos Gram-negativos e
Gram-positivos. A determinação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos foi
realizada através da difusão radial em ágar e a determinação da concentração
inibitória mínima (CIM) foi realizada através do método de microdiluição e diluição
em ágar, enquanto que e a concentração bactericida mínima (CBM) foi determinada
a partir do subcultivo das análises de CIM em placas de Petri com ágar MuellerHinton. Os resultados revelaram que todos os derivados de norfloxacino testados
neste estudo, apresentaram atividade antibacteriana, bem como o seu análogo
(derivado do ácido nalidíxico), porém nenhum deles foi mais ativo ou equivalente ao
norfloxacino e ácido nalidíxico. Embora os resultados não foram favoráveis para
estabelecer uma conclusiva correlação entre as mudanças estruturais da molécula
de norfloxacino e sua respectiva atividade antibacteriana, foi verificado que para as
cepas de Escherichia coli e Klebsiella oxytoca houve indício de correlação dos
compostos 6, 9, 12, 14 e 15, com os parâmetros de efeito eletrônico preconizados
por Topliss.
Palavras-chave: atividade antimicrobiana, fluoroquinolona, norfloxacino.
ANALYSIS OF ANTIMICROBIAL POTENTIAL OF QUINOLINIC
DERIVATIVES AND PRECURSORS OF NORFLOXACIN ANALOGS
MARIA DE FÁTIMA RUIZ MARTINS
August 2009
Supervisor: Prof. Alexandre Bella Cruz, Dr.
Area of Concentration: Microbiology
Number of Pages: 67.
ABSTRACT
Fluoroquinolones are agents that belong to a class of drugs capable of inhibiting the DNA
gyrase, an essential enzyme involved in the replication of bacterial DNA. Although
fluoroquinolones have broad antimicrobial activity against Gram-negative and anaerobic
bacteria, this class of compounds is relatively less active against Gram-positive bacteria.
Attempts have been made to synthesize new fluoroquinolones, seeking to increase the
antibacterial activity, including against Gram-positive bacteria, with lower side effects,
improved pharmacokinetic profiles, and lower cost. In this work, the compounds used in
the tests to evaluate antibacterial activity were obtained from modifications to the
norfloxacin molecule, resulting in four groups:
a) phenacyl precursors; b) imine
precursors; c) norofloxacin derivatives, and d) norfloxacin analogs. The assessment of
antimicrobial activity included standard strains and clinical isolates of Gram-negative and
Gram-positive micro-organisms. The antimicrobial susceptibility profile was determined by
agar disk diffusion and the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the
microdilution broth and agar dilution methods, while the minimum bactericidal
concentration (MBC) was determined from the subculture of the MIC analyses in MuellerHinton agar Petri dishes. The results showed that the norfloxacin derivatives tested in this
study presented antibacterial activity, as did its analog (nalidixic acid derivative). However,
none of them were more active than or equivalent to norfloxacin and nalidixic acid.
Although these results did not enable any conclusive correlation to be drawn between the
structural changes of the norfloxacin molecule and its respective antibacterial activity, it
was verified that the Escherichia coli and Klebsiella oxytoca strains showed signs of
correlation between compounds 6, 9, 12, 14 and 15 and the electronic parameters
recommended by Topliss.
Key words: antimicrobial activity, fluoroquinolone, norfloxacin.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Diferenças estruturais entre as bactérias Gram-negativas e positivas .....
Figura 2
Representação esquemática da relação entre estrutura química e
18
atividade biológica de quinolonas .............................................................
22
Figura 3
Representação da evolução das quinolonas ............................................
23
Figura 4
Desenvolvimento cronológico das fluoroquinolonas .................................
26
Figura 5
Representação da estrutura química do norfloxacino ..............................
33
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Padrões interpretativos de diâmetros de halo de inibição para as cepas
bacterianas Gram-negativas .......................................................................
Tabela 2
Padrões interpretativos de diâmetros de halo de inibição para as cepas
da bacteria Gram-positiva Staphylococcus aureus .....................................
Tabela 3
46
Ordem de potência de Topliss para várias dependências
paramétricas ...............................................................................................
Tabela 5
42
Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de cepas bacterianas
padrão e de material clínico ........................................................................
Tabela 4
41
53
Ordem de potência de atividade antibacteriana observada para cinco
derivados destacados, em ensaio envolvendo as cepas de E. coli e
K. oxytoca ...................................................................................................
Tabela 6
54
Atividade antibacteriana (CIM em µg/mL) dos compostos modificados
do norfloxacino frente às cepas das bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas ..........................................................................................
Tabela 7
56
Atividade antibacteriana (CIM em µM) dos compostos modificados
do norfloxacino frente às cepas das bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas ...........................................................................................
Tabela 8
57
Atividade antibacteriana (CBM em µg/mL) dos compostos modificados
do norfloxacino frente às cepas das bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas ..........................................................................................
Tabela 9
58
Atividade antibacteriana (CBM em µM) dos compostos modificados
do norfloxacino frente as cepas das bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas ..........................................................................................
59
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC: American Type Culture Collection
CAP: Pneumonia Adquirida na Comunidade
CBM: Concentração Bactericida Mínima
CCS: Centro de Ciências da Saúde
CIM: Concentração Inibitória Mínima
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
DMF: Dimetilformamida
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
LPS: Lipopolissacarídeo
NCCLS: National Commitee for Clinical Laboratory Standards
NIQFAR: Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas
RNA: Ácido ribonucléico
UNIVALI: Universidade do Vale do Itajaí
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................
13
2 OBJETIVOS ...................................................................................................
15
2.1 Objetivo Geral .............................................................................................
15
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................
15
3 EMBASAMENTO TEÓRICO ..........................................................................
16
3.1 Doenças infecciosas ...................................................................................
16
3.2 Micro-organismos ........................................................................................
17
3.3 Agentes Antimicrobianos .............................................................................
19
3.4 Quinolonas ..................................................................................................
21
3.5 Resistências às quinolonas .........................................................................
29
4 Materiais e Métodos ......................................................................................
33
4.1 Compostos para análise de atividade antimicrobiana ................................
33
4.2 Material Microbiológico ...............................................................................
39
4.2.1 Isolamento e identificação dos micro-organismos ...................................
39
4.2.2 Manutenção dos micro-organismos .........................................................
39
4.2.3 Preparo dos inóculos bacterianos ............................................................
40
4.3 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos ...........................................
40
4.4 Concentração inibitória mínima (CIM) .........................................................
43
4.5 Concentração bactericida mínima (CBM) ....................................................
43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................
44
5.1 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos ............................................
44
5.2 Atividade antibacteriana ..............................................................................
48
6 CONCLUSÕES ..............................................................................................
60
REFERÊNCIAS .................................................................................................
61
13
1 INTRODUÇÃO
A descoberta dos antimicrobianos representou o maior avanço na
farmacoterapia nos últimos 50 anos, pois possibilitou o controle efetivo de muitos
micróbios patogênicos que causam incapacidade prolongada ou a morte de seres
humanos. A era da quimioterapia antimicrobiana iniciou-se em 1936 com a
introdução, na clínica, das sulfonamidas (SOUZA et al., 2004).
A introdução da penicilina em 1941 tornou-se um marco histórico na medicina,
por revolucionar os princípios terapêuticos até então usados nos tratamentos das
doenças infecciosas. Atualmente são conhecidas centenas de antimicrobianos
(SOUZA et al., 2004).
As quinolonas são uma grande família de agentes antibacterianos. Como
usual, sua descoberta foi fruto da casualidade. Durante o desenvolvimento de um
fármaco antimalárico, observou-se que o ácido nalidíxico foi efetivo na eliminação de
bactérias (BUSH, 2004). Os agentes sintéticos quinolônicos apresentam o anel
bicíclico heteroaromático como estrutura farmacofórica, acrescido da natureza dos
substituintes periféricos e as relações espaciais (DIZMAN; ELASRI; MATHIAS,
2005). Desde a sua descoberta no início dos anos 1960, o grupo de agentes
antibacterianos denominados de quinolonas gerou considerável interesse clínico e
científico, incluindo o desenvolvimento de fármacos da segunda geração desta
classe terapêutica, como a ciprofloxacina (BENSIKADDOUR et al., 2008).
As fluoroquinolonas são agentes antibacterianos de largo espectro que
apresentam maior crescimento na utilização clínica. Em 2006, estes agentes
representaram 18% das vendas de antibacterianos no mercado farmacêutico
(DRLICA et al., 2008). Após quatro décadas da descoberta do ácido nalidíxico - o
primeiro membro da família de antibacteriano quinolônico mais de 7000 novos
análogos tem sido registrado na literatura (LI et al., 2007).
O grande avanço da quimioterapia antibacteriana das fluoroquinolonas
ocorreu no final da década de 1970, quando houve a introdução de um átomo de
flúor na posição do carbono 6 (C-6) e um grupo piperazina na posição do carbono 7
(C-7) no anel quinolônico conferindo um amplo e potente espectro de atividade
antimicrobiana. Esta nova molécula, denominada de norfloxacino, foi patenteado em
14
1978, sendo a primeira fluoroquinolona a apresentar potente atividade bacteriana
(SOUZA et al., 2004). As fluoroquinolonas são uma importante classe de
antimicrobianos sintéticos, ativos contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
através da inibição de suas DNA girases (SALEM; FADA; KHATER, 2007). O
norfloxacino é uma fluoroquinolona usada no tratamento de algumas doenças
bacterianas, incluindo infecção do trato urinário e doenças respiratórias crônicas em
crianças (ADJEI et al., 2006).
As resistências às diferentes classes de antimicrobianos, incluindo β
lactâmicos, macrolídeos, clindamicina, tetracilina e cloranfenicol, têm proporcionado
o estudo com compostos com maior atividade in vitro frente a cepas resistentes,
incluindo as fluoroquinolonas (VISCONTI; GARRIGUES; CANTÓN, 2002).
Diante do exposto, é de interesse do grupo dar continuidade aos estudos
realizados preliminarmente com este composto, tornando relevante a sua
investigação no que diz respeito à sua atividade biológica, bem como, a necessidade
da busca de novos fármacos como opção terapêutica.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar a atividade antimicrobiana de precursores e de derivados quinolônicos
análogos da molécula de norfloxacino, utilizando cepas bacterianas padrão e
clinicamente resistentes.
2.2 Objetivos Específicos:
 Identificar cepas bacterianas resistentes aos antimicrobianos de uso clínico;
 Determinar o perfil de susceptibilidade das cepas bacterianas;
 Verificar a atividade antimicrobiana de precursores fenacílicos e derivados
quinolônicos;
 Comparar a atividade antimicrobiana dos compostos quinolônicos com o ácido
nalidíxico e o fármaco de referência norfloxacino.
16
3. EMBASAMENTO TEÓRICO
3.1 Doenças Infecciosas
As doenças infecciosas constituem um grande problema da saúde, tanto em
países desenvolvidos como em desenvolvimento. Velhas e emergentes doenças
infecciosas contribuem substancialmente para a morbidade e mortalidade em todo o
mundo. Por esta razão, a sociedade investe consideravelmente na investigação de
doenças infecciosas, a fim de alcançar o progresso científico e desenvolver novas
intervenções terapêuticas (BLIZIOTIS et al., 2005).
As infecções ocorrem mais frequentemente quando a pele ou as barreiras de
proteção são rompidas, depois da inserção de um corpo estranho ou em paciente
imuno-comprometido. Os traumas que comprometem a integridade da barreira
cutânea constituem-se na principal causa de mudança de comportamento dos microorganismos que colonizam tal região, para agente etiológico mais comum das
infecções (ZAVADINACK-NETO et al., 2001; O'RIORDAN; LEE, 2004).
A infecção é uma doença que envolve a presença de micro-organismos como
bactérias, fungos, vírus e protozoários em um hospedeiro vivo. Uma infecção ocorre
quando
micro-organismos
invasores
estimulam
uma evidente
resposta
do
hospedeiro. Inicialmente ocorre a penetração do agente infeccioso, no corpo do
hospedeiro e há proliferação do mesmo, com consequente apresentação de sinais e
sintomas. Um micro-organismo capaz de causar uma infecção é, com frequência,
referido como patogênico. O grau ou a patogenicidade na qual um micro-organismo
pode causar dano a um hospedeiro infectado é conhecido como virulência
(KONEMAN et al., 2001).
Os micro-organismos podem alcançar o hospedeiro por vias exógenas como
inalação, ingestão, contato direto ou inoculação ou endógenas, que é a ruptura de
barreiras
naturais,
modificações
na
virulência
da
“microbiota
normal”
ou
modificações nos mecanismos de defesa do hospedeiro (SCHAECHTER et al.,
2002).
17
O corpo humano representa para as bactérias uma coleção de nichos
ambientais, capazes de fornecer calor, umidade e nutrientes, essenciais para o
crescimento bacteriano. Assim, a obtenção de determinadas características
genéticas pode tornar as bactérias capazes de penetrar no ambiente, ter acesso aos
alimentos e também conseguir evadir-se do processo de eliminação pela resposta
imunológica do hospedeiro. Deste modo, toda essa adaptação da bactéria pode
resultar em danos e problemas à saúde do hospedeiro (MURRAY et al., 2002;
FOXMAN, 2007).
3.2 Micro-organismos
As bactérias são seres procarióticos com organização relativamente simples e
que se reproduzem por divisão assexuada. Esses micro-organismos são formados
por várias estruturas que diferem de uma espécie para outra (MURRAY et al., 2002).
As bactérias podem ser divididas em duas importantes classes, Gram-positivas e
Gram-negativas (Figura 1). Essa classificação está baseada na reação de coloração
dos micro-organismos, através do método de Gram. A reação das bactérias à
técnica de Gram expressa diferentes características, de modo especial no que diz
respeito à composição química, estrutura, permeabilidade da parede celular,
fisiologia, metabolismo e patogenicidade (RUSSELL; CHOPRA, 1990; TRABULSI et
al., 2005).
As paredes das bactérias Gram-negativas e Gram-positivas apresentam
diferenças marcantes. As bactérias Gram-negativas possuem uma parede composta
de várias camadas, sendo elas uma camada de peptideoglicano e três outros
componentes que a envolvem externamente, lipoproteína, membrana externa e
lipopolissacarídeo que diferem em sua composição química e, consequentemente, é
mais complexa que a parede das Gram-positivas, que apesar de espessa, apresenta
predominantemente múltiplas camadas de peptideoglicano (JAWETZ; MELNICK;
ADELBERG, 1998).
A lipoproteína tem como função estabilizar a membrana externa e ancorá-la à
camada de peptideoglicano. A membrana externa possui uma dupla camada de
18
lipídeos, com moléculas de proteínas e lipoproteínas ligadas ao peptideoglicano
onde se encontra o lipopolissacarídeo (LPS), que é capaz de conferir propriedade de
patogenicidade nas bactérias. O LPS é conhecido também como uma endotoxina,
pois é tóxico, e considerado um ativador nas reações inflamatórias de fase aguda
(TRABULSI et al., 2005).
As bactérias Gram-positivas protegem a membrana citoplasmática com uma
parede celular espessa. As muitas camadas de peptideoglicano impedem a
passagem de compostos hidrofóbicos devido à presença de açucares e aminoácidos
(SCHAECHTER et al., 2002).
Entre os fatores diferenciais das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas,
pode-se ressaltar que as bactérias Gram-negativas não possuem o ácido teicóico,
além de possuir menor concentração de peptideoglicano, sendo que estas
características as tornam mais suscetíveis a permeabilidade da membrana, quando
comparadas às bactérias Gram-positivas (RUSSELL; CHOPRA, 1990; RANG et al.,
2003).
Figura 1: Diferenças estruturais entre as bactérias Gram-negativas e
Gram-positivas.
Fonte: Adaptado de BARON, 1996
19
3.3 Agentes Antimicrobianos
As primeiras descrições sobre o uso de antimicrobianos datam 3.000 anos,
quando os médicos chineses utilizavam bolores com ação antibacteriana e
antifúngica, para tratar tumores inflamatórios e feridas infecciosas, com a
recomendação de uso de emplastros com uma mistura de vinho, cerveja, zimbro e
ameixa. Na época, a descoberta de novos agentes antimicrobianos costumava ser
uma questão meramente casual (TAVARES, 1999). O empirismo reinou até a
descoberta das bases microbiológicas da infecção, no século XX, com a introdução
das sulfonamidas em 1936 e das penicilinas no início dos anos 40 (OLIVEIRA,
2001).
Em 1928, Alexander Fleming descobriu as propriedades antibacterianas da
penicilina, porém, seu uso clínico, só se tornou difundido após 1942. A penicilina era
o milagre da cura para muitas doenças infecciosas, mas não era eficaz para
infecções do trato urinário causada por E. coli devido a grande proporção de
infecções urogenitais persistentes durante o tratamento. Consequentemente, a
introdução da penicilina que marcou o início da revolução antibiótica para muitas
doenças infecciosas não teve o mesmo impacto no que diz respeito ao tratamento
de infecções do trato urinário (NICKEL, 2005).
Os antimicrobianos são fármacos utilizados para o tratamento de doenças
infecciosas devido à atuação e interferência no crescimento dos micro-organismos.
O antimicrobiano ideal inviabiliza o micro-organismo nocivo sem prejudicar o
hospedeiro correspondendo ao princípio da toxicidade seletiva. Os fármacos
utilizados na quimioterapia das doenças infecciosas são classificados em dois
grupos. Aqueles que são sintetizados por procedimentos químicos em laboratórios
são denominados fármacos sintéticos, enquanto que aqueles produzidos por
bactérias ou fungos são denominados antibióticos (TORTORA; FUNKE; CASE,
2000).
Agentes antimicrobianos são, via de regra, classificados como sendo
específicos ou inespecíficos. Os específicos atuam principalmente sobre os microorganismos
invasores,
sem
afetar
significativamente
o
hospedeiro.
Os
antimicrobianos inespecíficos, ou seja, compostos capazes de matar ou inibir o
20
crescimento de qualquer micro-organismo in vitro, não são considerados
quimioterápicos,
e
sim,
desinfetantes,
anti-sépticos,
germicidas,
biocidas,
esterilizantes e sanitizantes, com uso exclusivamente tópico (SOUZA et al., 2003).
Os antimicrobianos são distribuídos em grupos ou classes de acordo com
certas características ou propriedades comuns aos membros de cada grupo. Estas
propriedades são: estrutura química, mecanismo de ação e espectro de atividade
(LOPES, 2005). Segundo Mims et al. (1999), Tavares (1999), e Schaechter et al.
(2002), o sítio alvo dos grupos de agentes antimicrobianos, podem ser abordados da
seguinte maneira:
•
Inibidores da síntese de parede celular: os antimicrobianos que agem sobre a
síntese da parede celular atuam produzindo uma parede com defeitos
estruturais atuando sobre o processo de replicação celular;
•
Inibidores da Síntese de Proteínas: a síntese protéica pode sofrer
interferência em várias fases do seu desenvolvimento como na formação do
RNA-mensageiro, na fixação do RNA-mensageiro ao ribossoma, por
alterações no ribossoma e na fixação do RNA-transportador ao ribossoma;
•
Inibidores da síntese de ácidos nucléicos: para iniciar a síntese de DNA é
necessária a ativação prévia da enzima DNA-girase ou topoisomerase II para
desenrolar a dupla fita de DNA e introduzir uma superespiral negativa, sendo
possível interferir na síntese de ácidos nucléicos através de cinco
mecanismos diferentes: inibição da síntese de nucleotídeos, alteração da
propriedade de pareamento das bases modelo, inibição da DNA ou RNApolimerase, inibição da DNA-girase, efeitos diretos sobre o próprio DNA;
•
Inibidores
da
função
da
membrana
citoplasmática:
a
membrana
citoplasmática é composta por cerca de 66% de proteínas e 33% lipídeos,
que confere a ela permeabilidade seletiva responsável por controlar a
passagem de nutrientes para o interior da célula e a saída de compostos
resultantes do catabolismo. As alterações físico-químicas da membrana
citoplasmática levam a morte bacteriana, pois a permeabilidade seletiva é
rompida, causando a saída de elementos vitais a células como fosfatos, íons,
porinas e ácidos nucléicos ou a entrada de compostos nocivos ao
metabolismo bacteriano (TAVARES, 1999).
21
•
Antimetabólitos: de acordo também com sítio-alvo, os antimicrobianos que
interferem na biossíntese do ácido tetrahidrofólico (THFA), são poderosos
inibidores indiretos. Isto porque o THFA é o doador de um átomo de carbono
em alguns estágios na síntese de porina e pirimidima. A síntese dos THFA na
bactéria está sujeita a inibição através de dois grupos de compostos, as
sulfonamidas (por exemplo, o sulfametoxazol) e o 2,4-diaminopirimidina (por
exemplo, trimetoprim) (RUSSEL; CHOPRA; 1990).
Além destes, existem os compostos que inibem a respiração e/ou fosforilação
oxidativa, que não podem ser usados na terapêutica, pois atuam em processos
comuns a todas as células e são igualmente tóxicos para a bactéria e para o
hospedeiro (FONSECA, 1999; SCHAECHTER et al., 2002; SOUZA et al., 2003)
Os micro-organismos geralmente adquirem resistência aos antimicrobianos
por mutações genéticas, mas muitas vezes pode não ser a mutação o fator
responsável pela resistência. Os mecanismos de resistência clinicamente relevantes
incluem a síntese de enzimas que inativam a droga, prevenção do acesso ao sítio
alvo (inibição da absorção ou mesmo aumento da excreção) ou modificação do sítio
alvo (SCHAECHTER et al., 2002; TENOVER, 2006).
O problema da resistência microbiana vem crescendo continuamente e a
perspectiva para o uso de drogas antimicrobianas no futuro é ainda incerta. Devido à
grande propagação da resistência antimicrobiana torna-se muito importante o
entendimento do mecanismo de ação dos novos agentes antibacterianos
(FOROUMADI et al., 2003). Além do mais, podem ser tomadas ações para reduzir
este problema, por exemplo, o uso racional de antimicrobianos, o desenvolvimento
ou pesquisas para melhor compreensão dos mecanismos genéticos de resistência, e
continuidade de estudos de desenvolvimento de novos compostos, sintéticos ou
naturais (NASCIMENTO et al., 2000).
3.4 Quinolonas
As quinolonas são compostos heterocíclicos que tem em sua estrutura um
núcleo bicíclico e a maioria daquelas clinicamente relevantes, contém um ácido
22
carboxílico na posição 3 e substituintes nas posições 1 e 7 e/ou 8 (SIEGMUND et
al., 2005) (Figura 2).
G rupo com o N H 2 ou um átom o de F
conferem atividade biológica.
C = S ou O conduzem a perda
de atividade biológica.
Im portante para a atividade
biológica.
G rupos com o N O 2,N H 2 e principalm ente
um átom o de F conferem atividade biológica.
R3
G rupos com o piperazila, pirrolidinas
substituídas ou não, conferem atividade
biológica.
R2
R4
5
O
4
3
1
N
2
6
7
8
R1
R
C O2 H
Á tom os com o C ou O conduzem a perda
da atividade biológica.
G rupos com o ciclopropil, terc-butil,
etil, m -fluorbenzeno, 2,4-difluorbenzeno,
O C H 3 , N C H conferem atividade biológica.
3
O átom o de N conferem
atividade biológica.
Á tom os com o H , C l, F ou O m e conferem
atividade biológica.
A nel Q uínolônico
Figura 2: Representação esquemática da relação entre a estrutura química e a atividade
biológica de quinolonas.
Fonte: Adaptado de SOUZA et al., 2004
A partir da estrutura básica das quinolonas se têm efetuado inúmeras
modificações nas posições N-1, C-6, C-7 e C-8, dando origem a mais de 10.000
derivados (Figura 3). As trocas mais relevantes na obtenção de novos derivados
ocorreram sobre as aminas na posição de C-7, devido à facilidade de incorporar
diferentes cadeias laterais como grupos piperazina, aminopirrolidina e derivados
com diferentes substituições (ROTHLIN, 1999).
Os antibacterianos quinolônicos, originalmente derivados de compostos
antimaláricos foram desenvolvidos através da adição de piperazina e outros mono
ou bi substituições cíclicas na posição 7, dando aumento de atividade antipseudomonas e bactérias Gram-negativas, e fluoração em vários sítios, que por sua
vez, aumenta a atividade para bactérias Gram-positivas. A classe já se encontra em
uso clínico por mais de 40 anos. O aumento na atividade acarretou também alguns
problemas, como, reações idiossincráticas em agentes como os compostos 1-(2,4)difluorofenill, tais como temafloxacino (síndrome hemolítica urêmica) e trovafloxacino
(reações hepatotóxicas), com a restrição, suspensão ou até mesmo a retirada do
mercado consumidor (BALL, 2003).
23
Figura 3: Representação da evolução das quinolonas.
Fonte: Adaptado de BRYSKIER, 2004
As principais estratégias, ambas procedentes de intermediários do tipo
enaminomas, tem sido descritas na literatura para construção do anel quinolônico. A
primeira delas foi desenvolvida por químicos da Bayer AG, sendo o anel quinolônico
formado pela ciclização de intermediário 3-aminoacrilatos-2 (2-halobenzoil). Outra
rota alternativa é conhecida como ciclização de Gould-Jacob. Esta estratégia é
baseada na ciclização térmica ou catalizada em meio ácido, de malonatos
anilinometilênicos. Essa ciclização é, essencialmente, uma modificação do clássico
método de preparação 4-quinolonas, realizado por Conrad-Limpach a partir de
anilinas e ésteres acetoacéticos. Estas metodologias, anteriormente mencionadas,
permitem a introdução de diferentes substituintes nas posições C-2, C-5, C-6, C-7,
C-8 e N-1 do anel quinolônico, com o objetivo de se obter fármacos mais eficazes
(SOUZA et al., 2004).
A atividade antibacteriana da 4-quinolona não somente depende da natureza
do substituinte, bem como, de seu arranjo espacial. Esses substituintes
desempenham um papel importante influenciando na atividade antibacteriana e nas
propriedades farmacocinéticas através da afinidade com enzimas bacterianas
24
(BHANOT; SINGH; CHATTERJEE, 2001)
Os agentes antibacterianos derivados quinolônicos possuem amplo espectro,
boa absorção oral e larga distribuição no tecido. Tais agentes são usados
extensivamente
no
tratamento
de
doenças
infecciosas.
Estas
moléculas
biologicamente ativas são ionizadas inteiramente ou parcialmente no pH fisiológico.
Nestas condições, frequentemente, mostra-se a presença de grupos, que são
responsáveis pela a atividade biológica e pela solubilidade e consequente maior
biodisponibilidade. A estrutura não-ionizada, entretanto, tem um coeficiente mais
favorável à subdivisão referente aos produtos não aquosos. Consequentemente, o
conhecimento das constantes de dissociação destes compostos pode ser essencial
para finalidades práticas (avaliação de absorção gastrointestinal, dissolução, etc.) e
para a interpretação de relação estrutura-atividade (PATRICK, 1995; BARREIRO;
FRAGA, 2001).
O ácido nalidíxico, o cinoxacino e o ácido oxolínico são os agentes mais
representativos das quinolonas de primeira geração. A síntese da molécula de
norfloxacino incorporou ao arsenal terapêutico a primeira fluoroquinolona, tendo
como precursor a flumequina em relação à presença do átomo de flúor na posição
de C-6 e o ácido pipemídico pela presença do grupo piperazina (ROTHLIN, 1999). O
ácido nalidíxico foi a primeira quinolona a apresentar atividade antimicrobiana, em
1962. No entanto, o grande avanço das fluoroquinolonas ocorreu em 1970, com a
introdução de um átomo de flúor em posição C-6 e um grupo piperazina em posição
C-7. Esta alteração conferiu um amplo e potente espectro de atividade
antimicrobiana, obtendo-se assim o norfloxacino, mas que foi patenteado somente
em 1978. O norfloxacino foi a primeira fluoroquinolona a apresentar potente
atividade bacteriana (SOUZA et al., 2004).
As quinolonas são potentes agentes antibacterianos. A maioria das bactérias
é sensível as quinolonas, sendo que os derivados contendo um átomo de flúor têm
considerável sucesso clínico quando usado para tratamento das infecções. Todavia,
algumas espécies patogênicas, tais como Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, e Mycobacterium tuberculosis, facilmente adquirem mutações que
limitam o uso das fluoroquinolonas (ZHAO et al., 1997).
Em geral, as quinolonas demonstram excelente atividade in vitro contra
25
membros da família Enterobacteriaceae, bem como Haemophilus influenza, e cocos
Gram-negativos,
incluindo
Neisseria
gonorrhoeae,
Neisseria
meningitidis
e
Branhamella catarrhalis. Os antimicrobianos quinolônicos também apresentam boa
potência contra Pseudomonas aeruginosa, demonstrando boa atividade contra
Staphylococcus aureus e outras espécies estafilocócicas, porém é pouco potente
contra estreptococos, sendo ainda inativas contra Candida albicans (WOLFSON;
HOOPER, 1989).
As quinolonas são ativas in vitro contra todos os patógenos bacterianos
causadores de infecção do trato urinário e gastroenterites bacterianas. O fármaco é
também potente contra alguns patógenos causadores de doenças sexualmente
transmissíveis e infecções do trato respiratório. As quinolonas representam a
primeira classe de agentes orais com atividade contra Pseudomonas aeruginosa
(WOLFSON; HOOPER, 1989). A fluoroquinolona tem excelente atividade in vitro e
eficácia in vivo contra muitos patógenos respiratórios, incluindo Streptococcus
pneumoniae multi- resistentes (OLSEM et al., 2006).
As quinolonas são agentes antimicrobianos que inibem rapidamente a síntese
de DNA, e sua potência nesta inibição se correlaciona diretamente com a atividade
antibacteriana (WOLFSON; HOOPER, 1989). O agente antibacteriano 4-quinolona
tem como alvo duas enzimas bacterianas, DNA girase e topoisomerase IV (DRLICA;
ZHAO, 1997). De modo geral, se pode afirmar que a ação das quinolonas consiste
em inibir estas duas enzimas (VISCONTI; GARRIGUES; CANTÓN, 2002).
Os alvos intracelulares das quinolonas são duas DNA topoisomerases: girase
e topoisomerase IV. A enzima girase tem como alvo principal as bactérias Gramnegativas, enquanto a topoisomerase IV é inibida pela maior parte das quinolonas
preferencialmente em organismos Gram-positivos (DRLICA et al., 2008). Segundo
Bhanot e colaboradores (2001), em geral as pirrolidinas apresentam elevada
potência frente às bactérias Gram-positivas, enquanto as piperazinas oferecem
melhor atividade antibacteriana para as Gram-negativas. Todas as quinolonas
parecem quebrar o DNA durante o crescimento aeróbico, anaeróbico e quando há
quebra na síntese de proteínas. Porém, a capacidade para a rápida morte celular
nestas condições depende da estrutura da quinolona (MALIK; HUSSAIN; DRLICA,
2006).
26
Todavia, o desenvolvimento de novas quinolonas e a análise da relação
estrutura-atividade destes compostos poderá fornecer novas estruturas quinolônicas
para uso clínico (WOLFSON; HOOPER, 1989).
As fluoroquinolonas são muito eficazes para o tratamento de diversas
infecções bacterianas. Foi demonstrado que um grupo ciclo propil na posição 1, em
combinação com um grupo 3-aminopirrolimidil na posição 7 e um átomo de um
halogênio, como flúor ou cloro na posição 8, confere uma melhor atividade
antibacteriana a molécula de fluoroquinolona. Em particular, a introdução de um
átomo de um halogênio na posição 8 de uma quinolona fornece à molécula uma
potente atividade antibacteriana in vivo bem como aumento do espectro
antibacteriano e melhorias na biodisponibilidade oral (HAYASHI; NAKATA; YAZAKI,
2004) (Figura 4).
1997
1962
1966
x
Oxo
lin
l ifl o
P ru
ic
id
(
L
E.
i l ly
1970
)
in
o xa c
, Ros
in
c
g)
xa
e r li n
M il o
o, St
ox
ofl
ox
ac
Tr
Le o v a fl
v
i
(Da
i
n(
A
dis
oxa
c in
)
(P f
iz e r
)
G r e p a f lo x a c in , P a z u f lo x a c in
( W a r n e r L a m b e r t , To y a m a
S par
f lo
tt)
)
bo
r in
yo
Ab
K
(
a,
c in
am
xa
n)
ip p o
fl o
oy
(D a in
(T C i n a
x a c in
in
n)
ac
pa
ni p
im
og
er
Ba
lla
n)
1978
G)
1979
1983
1980
1982
1972
e ( R ik e
P in
r)
e d im
No
i
c
1973
A
c id
Pe rf lo x
(D a
ac
fl o
in ip
in
p on
xa
(K
)
ci
y
or
n
i
n
(R
1974
)
acin
x
,T
afl
ox
1985
id
(D
m
in
ro
ac
Pi i n o x
C
x
Eno
n)
in (Kyori
Fleroxac
Ofloxacin (Daiic
hi)
u fl
o
ac
in
1986
Ac
1967
)
on
pi p
n
ai
i to m
(S u m
F le m iq
u in
C ipr
oflo
Ta
xa
c
s
in
(Ray
er A
.
1987
M
ci
n
1989
if l
ox
a
n)
1992
(N
ip
po
1994
on
i pp
N
(
acin
)
Nalidixic Acid (Lapp
in)
1995
ic A
cid
( Wa
mer
- Lam
bert
)
1996
1981
Figura 4: Desenvolvimento cronológico das fluoroquinolonas.
Fonte: Adaptado de BHANOT; SINGH; CHATTERJEE, 2001
27
A introdução das fluoroquinolonas em 1980 foi um efeito revolucionário no
tratamento das salmoneloses sendo que, geralmente tem boa atividade in vitro
contra espécies isoladas de Salmonella (KOTILAINEN et al., 2005).
Desde a introdução do norfloxacino, um enorme esforço tem sido despendido
mundialmente na síntese de um considerável número de fluoroquinolonas, no
sentido de obter-se um aumento no espectro geral antibacteriano, associado às
outras propriedades desejáveis, como melhor absorção, permeação celular,
biodisponibilidade, etc. Estas iniciativas acabaram por produzir muitos novos
fármacos de sucesso e outros tantos que ainda se encontram em desenvolvimento.
Algumas dessas novas fluoroquinolonas incluem modificações não somente na
estrutura básica anelar com a ausência do átomo de flúor na posição seis do
grupamento farmacofórico, mas, também, utiliza-se de novas aminas cíclicas ou
heterocíclicos nitrogenados, apropriamente substituídos na posição sete do
farmacóforo (BHANOT; SINGH; CHATTERJEE, 2001).
Uma série de derivados quinolônicos substituídos foi sintetizada e avaliada
quanto às atividades antibacteriana e citotóxica. Tomou-se como substrato de partida
o norfloxacino, sendo esta submetida à condensação com brometos de fenacila
substituídos. Os substituintes possuíam diversidade química capaz de possibilitar
uma análise quanto à variação de parâmetros eletrônicos e estéricos. Os compostos
oriundos da condensação foram, então, submetidos à reação com hidroxilamina,
metoxiamina, hidrazina, semicarbazina e tiosemicarbazida, originando, assim novos
compostos imínicos (CHEN et al., 2001).
As novas fluoroquinolonas diferem entre si principalmente pela natureza dos
substituintes atacarem o nitrogênio na posição 1 e a presença de um carbono ou
nitrogênio na posição 8 do núcleo quinolônico. Os compostos que apresentam um
nitrogênio na posição 8 podem ser referenciados simplesmente como quinolonas
(WOLFSON; HOOPER, 1989).
Após a descoberta da atividade antimicrobiana do norfloxacino, inúmeros
análogos foram sintetizados nos últimos 35 anos, identificando-se assim, posição e
grupos farmacofóricos e toxicofóricos. Várias substituições têm sido realizadas em
diferentes posições do anel quinolônico, no entanto, as posições críticas para a
atividade biológica são a C-6 (contendo um átomo de flúor), C-7 (contendo grupos
28
piperazila e pirrolidina) e N-1 (contendo grupos etila, ciclopropila, ter-butila e arilas
fluorados). Existem também algumas fluoroquinolonas que possuem modificações
em posição C-5 e/ou C-8 com potentes atividades antibactericidas como, por
exemplo, BMY-40062, perfloxacina, fleroxacina e sparfloxacina (SOUZA et al., 2004).
O
norfloxacino
[1-etil-6-fluro-1,
4-dihidro-4-oxo-7-(1-piperazinil)-3-ácido
quinolinocarboxílico] é um agente antibacteriano sintético, de amplo espectro que
apresenta elevada atividade antimicrobiana in vitro contra uma variedade de
bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, incluindo Pseudomonas aeruginosa
gentamicina-resistente e Neisseria gonorrhoeae β-lactamase positiva. Este agente
antibacteriano tem mostrado excelente efeito terapêutico no tratamento de doenças
respiratórias, do trato biliar e infecção do trato urinário (SUN et al., 2006).
A administração do norfloxacino por via oral tem sido amplamente utilizada no
tratamento de infecções bacterianas, tais como infecção do trato urinário, gonorréia
e infecções da próstata (UPADHYAY; KUMAR; ARORA, 2006).
A atividade antibacteriana das fluoroquinolonas depende não somente do anel
farmacofórico heteroaromático bicíclico, mas também da natureza do substituinte e
sua relação espacial. Esses substituintes exercem sua influência na atividade
antibacteriana tendo afinidade para as enzimas bacterianas, aumentando a
penetração na célula, ou alterando a farmacocinética (FANG et al., 2000).
As
fluoroquinolonas
são
conhecidas
pela
capacidade
de
inibir
as
topoisomerases bacterianas e têm sido usadas clinicamente há mais de 40 anos.
Alguns medicamentos obtidos a partir desta classe de antibacterianos, tais como
levofloxacino e ciprofloxacino, não estão apenas entre os anti-infecciosos mais
frequentemente receitados no mundo, mas também constituem o medicamento de
escolha contra algumas infecções bastante graves; incluindo aquelas por antraz.
Mesmo infecções micobacterianas podem ser tratadas com fluoroquinolonas (FANG
et al., 2000).
Como terapêutica de primeira escolha na para Pneumonia Adquirida na
Comunidade (CAP) têm a levofloxacina e moxifloxacina em pacientes ambulatoriais
e hospitalizados. A farmacocinética da levofloxacina e moxifloxacina difere, pois a
levofloxacina é eliminada predominantemente pelo rim, enquanto a maior eliminação
para moxifloxacina é hepática (OLSEM et al., 2006).
29
As fluoroquinolonas podem combater as infecções bacterianas, já que são
capazes de inibir a DNA girase, uma enzima essencial e envolvida na replicação,
transcrição e reparação do DNA bacteriano. A DNA girase bacteriana é um
tetrâmero, composto de duas subunidades A e duas subunidades B. Os
antibacterianos fluoroquinolônicos ligam-se especialmente com as subunidades A. A
habilidade de penetração em diferentes espécies de bactérias, bem como de se ligar
a DNA girase, são processos determinantes no espectro de atividade de um agente
antimicrobiano (SOUZA et al., 2004).
As atividades antimicrobianas e farmacológicas das fluoroquinolonas sugerem
seu uso para tratamento de infecções do trato urinário e gonorréia. Em geral, as
fluoroquinolonas, são eficazes para pacientes com infecções bacterianas que estão
em uso de β-lactâmicos ou aminoglicosídeos, pois estes são contra-indicados em
infecção com bactérias multi-resistentes (HOOPER; WOLFSON, 1985).
O norfloxacino é ativo contra um grande número de bactérias Gram-positivas
e Gram-negativas incluindo Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
cloacae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter
freundii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis,
Enterobacter aerogenes, Staphylococcus saprophyticus, Serratia marcescens, e
Streptococcus agalactiae. O composto é utilizado no tratamento de várias
complicações do trato urinário causada por essas bactérias, assim como, no
tratamento de prostatite devido à infecção por Escherichia coli. O tratamento de
infecções oculares superficiais envolvendo a córnea ou a conjuntiva também utilizam
o norfloxacino, principalmente aquelas causadas por Staphylococcus aureus,
Staphylococcus pneumoniae, Escherichia coli, Haemophilus aegyptius, Haemophilus
influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, espécies de Proteus,
Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, e
espécies de Vibrio (RONER et al., 2004).
Apesar das fluoroquinolonas possuírem uma ampla atividade antimicrobiana
esforços têm sido direcionados para a síntese de novas fluoroquinolonas visando o
aumento da atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas, com menores
efeitos colaterais, melhores perfis farmacocinéticos e menores custos (SOUZA et al.,
2004).
30
3.5 Resistências às Quinolonas
No século XX, houve um avanço no desenvolvimento de antimicrobianos que
ajudaram no tratamento de várias infecções, porém a euforia da descoberta desses
agentes no combate as infecções foi vivida brevemente, pois as bactérias
responderam rapidamente manifestando vários mecanismos de resistência a esta
classe de fármacos. Assim a resistência bacteriana demonstrou ser um fator
importante a ser considerado, visto que a complexidade dos mecanismos de
resistência exibida pelos patógenos bacterianos está em constante desenvolvimento
(TENOVER, 2006).
A resistência bacteriana é uma resposta evolucionária inevitável ao uso de
antimicrobianos. Este fenômeno de alteração de patógenos susceptíveis por uma
espécie mais resistente continua até os dias de hoje, principalmente em ambientes
hospitalares (FRENCH, 2005). A resistência bacteriana causa enormes problemas
terapêuticos com implicações na saúde pública. Muitas bactérias possuem
resistência intrínseca a vários grupos de antimicrobianos, mas o problema da
resistência aos antimicrobianos é geralmente colocado quando emerge por
alterações genéticas originando mutações resistentes (SOARES, 2001).
O contínuo aparecimento de bactérias resistentes reflete o problema
emergente de resistência, complicando e impedindo o tratamento de diversas
doenças infecciosas. O problema de resistência abrange não somente as bactérias,
mas também infecções fúngicas, virais e parasitárias. O diagnóstico correto dos
agentes responsáveis pela infecção, identificando o micro-organismo e a seleção
apropriada da terapia para o tratamento destas infecções assegura o uso rápido e
eficaz dos agentes antimicrobianos (LEVY, 2005).
O aparecimento de bactérias resistentes aos antimicrobianos é um problema
crescente que pode causar falhas do tratamento, o que levou ao aumento das taxas
de morbidade e mortalidade. Durante a última década houve vários relatórios sobre
o aparecimento de bactérias resistentes frente às terapias antibacterianas, como os
enterococos resistentes à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente a
meticilina e vancomicina, Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina,
31
macrolídeos, e fluoroquinolona (GROSSMAN et al., 2007).
Devido ao aumento da atividade in vitro do ciprofloxacino em relação ao
levofloxacino contra Pseudomonas aeruginosa, a probabilidade de isolamento de
espécies de P. aeruginosa quinolona-resistente pode ser maior após a exposição ao
levofloxacino que ao ciprofloxacino (KAYE et al., 2006).
O uso de terapia empírica inapropriada foi encontrado como sendo causa de
mortalidade em pacientes com bacteremia originada no trato urinário. Além disso,
alguns estudos mostram que a terapia empírica inadequada pode levar ao uso
desnecessário de antimicrobianos (BAIL; ITO; ESMERINO, 2006).
A resistência a mais de uma classe de antimicrobianos é considerada comum
e tem proporcionado a realização de estudos com compostos com maior atividade in
vitro, incluindo as próprias fluoroquinolonas (VISCONTI; GARRIGUES; CANTÓN,
2002).
O desenvolvimento da resistência das fluoroquinolonas é um resultado
espontâneo de mutações cromossômicas, ou através da indução de multidrogas
(LOWY, 2003). Os mecanismos de resistência as quinolonas podem se agrupar em
três categorias: resistência do tipo cromossômico, resistência por alteração na
membrana externa bacteriana e resistências baseadas na expulsão do fármaco
(VISCONTI; GARRIGUES; CANTÓN, 2002). Somente duas mutações para
resistência das quinolonas têm sido identificadas no gene gyr B, ambos relacionados
com o ácido nalidíxico. Uma mutação (terminal nalD) aumenta a resistência a novas
quinolonas, enquanto a outra (terminal nalC) confere hipersusceptibilidade para as
quinolonas (WOLFSON; HOOPE, 1989).
A resistência que foi desenvolvida à fluoroquinolona teve como resultado as
mutações cromossômicas espontâneas no alvo do antimicrobiano, topoisomerase IV
ou DNA girase, ou pela indução de uma bomba de efluxo multirresistente. Quando
uma classe de antimicrobianos como as quinolonas, é usada no tratamento de
infecções causadas por outras bactérias patogênicas, como colonizações por S.
aureus,
provavelmente
são
expostos
a
concentrações
subterapêuticas
do
medicamento e se tornam, portanto, um risco das colônias bacterianas
transformarem-se em micro-organismos resistentes. Estas espécies resistentes
então se tornam o reservatório para futuras infecções (LOWY, 2003).
32
Enquanto que para a E.coli e outras bactérias Gram-negativas as quinolonas
tem como alvo a DNA girase, para algumas bactérias Gram-positivas, apresentam
situação inversa: a primeira resistência tem lugar por mutações produzidas na
topoisomerase IV, deste modo, as mutações na girase proporcionam resistências
adicionais (VISCONTI; GARRIGUES; CANTÓN, 2002).
As resistências por alterações na membrana externa diminuem a penetração
intracelular do fármaco. Estas modificações se originam por alterações dos genes
que codificam os canais de porinas, que exercem papel fundamental na difusão da
quinolona através da membrana externa das bactérias Gram-negativas. Vários
mutantes tem demonstrado resistência às quinolonas hidrofílicas, e todas tem em
comum a redução do número de OmpF, a principal e maior proteína das porinas na
membrana externa de Escherichia coli (VISCONTI; GARRIGUES; CANTÓN, 2002).
O aumento de resistência entre os estreptococos é uma questão de grande
preocupação. Além de uma bomba de efluxo, o que só contribui minimamente para
resistência das fluoroquinolonas, o principal mecanismo de resistência é mediado
por mutações pontuais na região determinante de resistência as quinolonas das
enzimas bacterianas topoisomerase II, ou seja, DNA girase e topoisomerase IV
(PLETZ et al., 2006).
Em contrapartida, o desenvolvimento de resistência ao norfloxacino é pouco
frequente. Porém são considerados como principais mecanismos de resistência a
diminuição da permeabilidade da membrana e alterações na estrutura da DNA
girase (MANDELL et al., 1988).
A resistência bacteriana aos antimicrobianos é uma crise global emergente e
a
compreensão
dos
mecanismos
de
resistência
é
fundamental
para
o
desenvolvimento de novas estratégias para a terapia antiinfecciosa (KUMAR;
SCHWEIZER, 2005), bem como a, pesquisa, descoberta e produção de novos
agentes antimicrobianos torna-se de relevante importância no sentido de buscar
uma solução para o problema de resistência desenvolvida pelos patógenos.
33
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Compostos para análise de atividade antimicrobiana
Os compostos utilizados nos ensaios de atividade antimicrobiana foram
sintetizados no Laboratório de Síntese Orgânica por Karine Cordeiro de Souza, sob
orientação do Prof. Dr. Rogério Corrêa, como descrito em SOUZA, 2009.
A partir do ácido nalidíxico (19) e do norfloxacino (1) (Figura 5), foram
sintetizados dezoito compostos (Quadros 1, 2, 3 e 4). Os compostos incluíram seis
brometos de fenacila codificados com os seguintes números: 2, 5, 8, 11, 13 e 15;
oito derivados do norfloxacino com os brometos fenacílicos cujos números são: 3, 4,
6, 9, 12, 14, 16 e 18; três derivados imínicos com os números 7, 10 e 17; um
derivado do ácido nalidíxico com brometo fenacilico codificado pelo número 20.
O
F
N
H
O
OH
N
N
Norfloxacino (1)
Figura 5: Representação da estrutura química do norfloxacino.
34
Quadro 1: Representação das estruturas químicas dos brometos de fenacila utilizados para
a avaliação de atividade antimicrobiana.
Legenda: 2-bromo-1-(4-fluorfenil)etanona (2), 2-bromo-1-(4-clorofenil)
etanona
(5),
2-bromo-1-feniletanona
(8),
2-bromo-1-(4-metilfenil)
etanona (11), 2-bromo-1-(4-metóxilfenil) etanona (13), 2-bromo-1-(3,4diclorofenil)etanona (15).
35
Quadro 2: Representação das estruturas químicas dos compostos derivados do norfloxacino
utilizados para a avaliação de atividade antimicrobiana.
Legenda: Ácido 1-etil-6-fluor-4-oxo-7-piperazinil-1,4-di-hidroquinolino-3-carboxílico (1), Ácido 1etil-6-fluor-4-oxo-7-piperazinil-4(4-fluorfenacil)-1,4-di-hidroquinolino-3-carboxílico (3), 1-etil-6fluor-4-oxo-7-(piperazinil)-4(4-fluorfenacil)-1,4-di-hidroquinolino-3-etilcarboxilato (4), Ácido 1etil-6-fluor-4-oxo-7-(piperazinil)-4(4-clorofenacil)-1,4-di-hidroquinolino-3-carboxílico (6), Ácido 1etil-6-fluor-4-oxo-7-piperazinil-4(fenacil)-1,4-di-hidroquinolino-3-carboxílico (9), Ácido 1-etil-6fluor-4-oxo-7-(piperazinil)-4(4-metilfenacil)-1,4-di-hidroquinolino-3-carboxílico (12), Ácido 1etil-6-fluor-4-oxo-7-(piperazinil)-4
(4-metóxifenacil)-1,4-di-hidroquinolino-3-carboxílico
(14),
Ácido 1-etil-6-fluor-4-oxo-7-(piperazinil)-4 (3,4-diclorofenacil)-1,4-di-hidroquinolino-3-carboxílico
(16), Ácido 1-etil-6-fluor-7-{4-[1-(4-fluorfenil) etilideno] hidrazinopiperazin-1-il}-4-oxo-1,4dihidroquinolino-3-carboxílico (18).
36
Quadro 3: Representação das estruturas químicas dos compostos derivados imínicos
utilizados para a avaliação de atividade antimicrobiana.
Legenda: (1E)-[2-bromo-1-(4-clorofenil)etilideno]hidrazina (7); (1E)(2-bromo-1-feniletilideno)
hidrazina
(10);
(1E)-[2-bromo-1-(4-
fluorofenil)etilideno]hidrazina (17)
Quadro 4: Representação das estruturas químicas dos derivados do ácido nalidíxico
utilizados para a avaliação de atividade antimicrobiana.
Legenda: Ácido 1-etil-7-metil-4-oxo-1,4-di-hidro-1,8-naftiridino-3-carboxilico (19),
1-etil-7-metil-4-oxo-1,4-di-hidro-1,8-naftiridino-3-etilcarboxilato (20).
37
A seguir, são apresentadas as rotas sintéticas para obtenção dos compostos,
sendo que, para obtenção dos brometos de fenacila (Quadro 1), foram utilizadas
acetofenonas substituídas e adicionado o reagente bromo usando o ácido acético
como solvente (SOUZA, 2009).
Onde X= H; 4 Cl; 3, 4 Cl2; F; CH3; OCH3
Para obtenção dos derivados do norfloxacino (Quadro 2), o mesmo foi tratado
com bicarbonato de sódio e bromometilacetofenonas substituídas, em quantidades
equimolares, utilizando a dimetilformamida como solvente, para obter-se os N-(2oxo-2-(4-fenil substituído) etil derivados (SOUZA, 2009).
O
nde X= H; 4 Cl; 3, 4 Cl2; F; CH3; OCH3
38
Já para obtenção dos derivados imínicos (Quadro 3), os derivados fenacílicos
do norfloxacino e os brometos de fenacila com hidroxilamina em etanol forneceram
os derivados imínicos de norfloxacino (SOUZA, 2009).
Onde X= H; 4 Cl; 3, 4 Cl2; F; CH3; OCH3
Onde: X= 4-H; 4-Cl; 4-F
39
4.2 Materiais microbiológicos
Os micro-organismos utilizados para a realização dos ensaios de atividade
antimicrobiana foram as bactérias:

Enterobacter aerogenes (isolado clínico)

Escherichia coli 1 (ATCC 25922)

Escherichia coli 2 (isolado clínico)

Klebsiella oxytoca (isolado clínico)

Pseudomonas aeruginosa 1 (ATCC 27853)

Pseudomanas aeruginosa 2 (isolado clínico)

Staphylococcus aureus 1 (ATCC 25923)

Staphylococcus aureus 2 (isolado clínico)
Todas as cepas ATCC foram adquiridas da Coleção de Culturas da Newprov
Produtos para Laboratório (Pinhais/PR), e as cepas de isolado clínico foram
fornecidas pelo Laboratório Escola de Análises Clínicas da UNIVALI (Itajaí/SC).
4.2.1 Isolamento e identificação dos micro-organismos
Antes do uso, as cepas bacterianas foram submetidas à confirmação de
pureza, por meio de testes clássicos de identificação, através da verificação das
características de morfologia celular, rearranjo celular, reação à coloração de Gram,
isolamento em meios de cultivo específicos e provas bioquímicas, como descrito em
Koneman et al. (2001) e ANVISA (2004). Também foram realizados ensaios de
susceptibilidade aos antimicrobianos (antibiograma) como padronizados pelo CLSI
(2007).
4.2.2 Manutenção dos micro-organismos
As cepas bacterianas foram mantidas em ágar nutriente e conservadas sob
refrigeração (4 ºC) no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia do curso de
40
Farmácia da UNIVALI, sendo repicadas em intervalos de 30 dias para a manutenção
da viabilidade celular.
4.2.3 Preparo dos inóculos bacterianos
O preparo dos inóculos teve início com a seleção de 4 a 5 colônias da
bactéria em análise previamente ativada em ágar Mueller-Hinton. As colônias
selecionadas foram transferidas para um tubo de ensaio com 5 mL de solução salina
(NaCl 0,86%) estéril, seguido de homogeneização em agitador de tubos por 15
segundos. A densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520 nm, em
comparação com a escala de 0,5 de McFarland (CLSI, 2007).
A determinação da susceptibilidade aos antimicrobianos de uso clínico utilizou
tamanho do inóculo final de aproximadamente 1,5x10 8 células/mL, enquanto que
para o ensaio de determinação da concentração inibitória mínima (CIM), utilizou o
tamanho do inóculo final entre 1 a 5x105 células/mL (CLSI, 2007).
4.3 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos
A avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos (antibiograma)
foi realizada pelo ensaio de difusão radial em ágar, como preconizado por CLSI
(2007). O meio de cultura utilizado foi o ágar Mueller-Hinton em quantidade
suficiente para a obtenção de uma espessura uniforme equivalente a 4 mm.
Para cada bactéria em análise, sobre a superfície do meio de cultura, com
auxílio de zaragatoa (swab), foi semeado o inóculo previamente preparado como
descrito no item 4.2.3. Posteriormente, os discos com antimicrobianos foram
depositados sobre a superfície do meio inoculado. Os antimicrobianos testados para
as cepas das bactérias Gram-negativas foram: ácido nalidíxico 30 μg, amicacina 30
μg, amoxicilina + ácido clavulânico 30 μg, ampicilina 10 μg, cefalotina 30 μg,
cefepime 30 μg, ceftriaxona 30 μg, ciprofloxacino 5 μg, gentamicina 10 μg,
nitrofurantoína 300 μg, norfloxacino 10 μg e sulfazotrim 25 μg. Os antimicrobianos
citados foram obtidos da DME - Diagnósticos Microbiológicos Especializados
(Araçatuba/SP).
41
Para as cepas da bactéria Gram-positiva S. aureus, os antimicrobianos
testados foram: vancomicina 30 μg, ampicilina 10 μg, eritromicina 15 μg, sulfazotrina
25 μg, gentamicina 10 μg, cefoxitina 30 μg, penicilina G 10 U, oxacilina 1 μg,
tetraciclina 30μg, amoxicilina 10 μg, clindamicina 2 μg e cefalotina 30 μg, que foram
obtidos da Laborclin (Pinhais/PR).
As placas de antibiograma foram incubadas entre 35 e 37 ºC por 18 a 24
horas, e posteriormente os diâmetros dos halos de inibição foram medidos com
auxílio de uma escala em milímetros (mm), determinando a sensibilidade aos
antimicrobianos, por comparação com critérios descritos em CLSI (2007), como
apresentado nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1: Padrões interpretativos de diâmetros de halo de inibição para as cepas
bacterianas Gram-negativas.
Antimicrobiano
Concentração
Ácido nalidíxico
Diâmetro do halo de inibição (mm)
R
I
S
30 μg
≤13
14-18
≥19
Amicacina
30 μg
≤14
15-16
≥17
Amoxacilina + Ác. clavulânico
30 μg
≤13
14-17
≥18
Ampicilina
10 μg
≤13
14-16
≥17
Cefalotina
30 μg
≤14
15-17
≥18
Cefepime
30 μg
≤14
15-17
≥18
Ceftriaxona
30 μg
≤13
14-20
≥21
Ciprofloxacino
05 μg
≤15
16-20
≥21
Gentamicina
10 μg
≤12
13-14
≥15
Nitrofurantoína
300 μg
≤14
15-16
≥17
Norfloxacino
10 μg
≤14
13-16
≥17
Sulfazotrim
25 μg
≤10
11-15
≥16
Legenda: R (resistente); I (intermediário); S (sensível)
Fonte: CLSI, 2007.
42
Tabela 2: Padrões interpretativos de diâmetros de halo de inibição para as cepas da
bacteria Gram-positiva Staphylococcus aureus.
Antimicrobiano
Concentração
Diâmetro do halo de inibição (mm)
R
I
S
Ampicilina
10 μg
≤28
-
≥29
Amoxacilina
10 μg
≤28
-
≥29
Cefalotina
30 μg
≤14
15-17
≥18
Cefoxitina
30 μg
≤24
-
≥25
Clindamicina
2 μg
≤14
15-20
≥21
Eritromicina
15 μg
≤13
14-22
≥23
Gentamicina
10 μg
≤12
13-14
≥15
Oxacilina
1 μg
≤10
11-12
≥13
Penicilina G
10 U
≤28
-
≥29
Sulfazotrina
25 μg
≤10
11-15
≥16
Tetraciclina
30 μg
≤14
15-18
≥19
Vancomicina
30 μg
-
-
≥15
Legenda: R (resistente); I (intermediário); S (sensível)
Fonte: CLSI, 2007
43
4.4 Concentração inibitória mínima (CIM)
A determinação da CIM foi realizada através do método de diluição em ágar e
caldo, respectivamente macrodiluição e microdiluição, conforme descrito em CLSI
(2007). Foram utilizados os meios de cultura ágar Mueller-Hinton e caldo MuellerHinton, ambos suplementados com magnésio e cálcio. Os compostos testes foram
dissolvidos em solução de dimetilformamida (DMF) e água destilada (4:6) e posterior
diluição em placa de microdiluição atingindo concentrações entre 0,03 a 64 μg/mL, e
31,25 a 1000 μg/mL.
Após a adição do inóculo bacteriano, previamente preparado conforme
descrito no item 4.2.3, as culturas foram incubadas a 37 ºC por 12 horas. A CIM foi
determinada por verificação visual para a macrodiluição em ágar e em
espectrofotômetro Drake/QUICK ELISA a 405 nm, para a microdiluição em caldo,
sendo que a CIM foi definida como a menor concentração do agente antimicrobiano
que inibe o crescimento do micro-organismo (GRADELSKI et al., 2002).
Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
As cepas bacterianas estudadas foram classificadas como sensível,
intermediária ou resistente, para o norfloxacino, de acordo com CLSI (2007), onde
os critérios de classificação foram os seguintes: sensível (CIM ≤ 4 μg/mL);
sensibilidade intermediária (CIM de 8 μg/mL) e resistentes (CIM 16 μg/mL).
4.5 Concentração bactericida mínima (CBM)
A determinação da CBM foi realizada a partir da determinação das CIM, que
foram submetidas à suas respectivas subculturas em meio ágar Mueller-Hinton,
isento de compostos teste e incubadas a 37 ºC por 18 a 24 horas. Após a incubação
as culturas foram inspecionadas para a verificação visual do crescimento
microbiano.
Para a interpretação dos resultados foi considerado que, a inibição no ensaio
de CIM e crescimento do micro-organismo na subcultura (CBM) significou ação
bacteriostática, e inibição em ensaio de CIM e a ausência de crescimento na
subcultura significou ação bactericida (EUCAST, 2000).
44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos
A avaliação da atividade antibacteriana identificou e empregou oito cepas
bacterianas,
sendo
três
cepas
padrão:
Escherichia
coli
(ATCC
11775),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923); e
cinco cepas de isolados clínicos: Enterobacter aerogenes, Escherichia coli,
Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, que
passaram por testes de identificação para confirmação de pureza.
As
bactérias
padrão
acima
citadas, foram
empregadas
por
serem
representantes de bacilos Gram-negativos (E. coli e P. aeruginosa) e cocos Grampositivos (S. aureus), e geralmente são micro-organismos clássicos de escolha para
a avaliação de atividade antimicrobiana, pois também apresentam grande
importância médica. Em contrapartida, as bactérias de isolado clínico, foram
empregadas com o objetivo de verificar a ação dos compostos testados sobre cepas
resistentes aos antimicrobianos de uso clínico.
A determinação da susceptibilidade bacteriana em isolado clínico é importante
para a terapia de pacientes infectados, mas também são necessários para
acompanhar o desenvolvimento dos micro-organismos resistentes e dos genes de
resistência na comunidade e nos hospitais (SUNDSFJORD et al., 2004;
REMONATTO et al., 2005), assim como na pesquisa de novos agentes
antimicrobianos.
Visto que o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana
dos compostos obtidos principalmente através de modificações da molécula de
norfloxacino, utilizando cepas bacterianas padrão e clinicamente resistentes, a
determinação do seu perfil de susceptibilidade foi de fundamental importância.
A avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos foi realizada
através da difusão radial em ágar. Devido ao fato desta metodologia ser padronizada
e amplamente utilizada nos laboratórios de microbiologia, além de fácil
implementação e custo acessível, permitindo classificar as cepas microbianas em
sensíveis, intermediárias ou resistentes aos antimicrobianos testados, os quais estão
45
diretamente relacionados com o seu grau de sensibilidade (CLSI 2007) (Tabelas 1 e
2). A classificação da cepa bacteriana em sensível sugere que a mesma pode ser
tratada com doses usualmente recomendadas do antimicrobiano; intermediário
significa que a cepa bacteriana deve ser exposta a uma dosagem mais elevada do
fármaco que a habitual para se obter o resultado terapêutico esperado, e resistente
indica que o micro-organismo não é inibido pela concentração usual do
antimicrobiano avaliado.
Para a determinação do perfil de susceptibilidade foram testadas várias
classes de antimicrobianos: aminoglicosídeos (gentamicina e amicacina), penicilinas
(ampicilina e amoxicilina com ácido clavulânico), cefalosporinas (cefalotina, cefepime
e ceftriaxona), fluoroquinolonas (ciprofloxacino e norfloxacino), quinolona (ácido
nalidíxico), nitrofurano (nitrofurantoína) e sulfa (sulfazotrim).
O resultado do perfil de susceptibilidade das cepas bacterianas testadas está
apresentado na Tabela 3 e revela que várias cepas apresentaram resistência à
muitos agentes antimicrobianos. De acordo com os estudos realizados por Tonkic,
Barisic e Punda-Polic (2005), a elevada prevalência de organismos multirresistentes,
talvez esteja relacionada à escolha equivocada dos agentes terapêuticos, bem como
ao seu uso indiscriminado.
Foi verificado que todas as cepas demonstraram resistência a ampicilina.
A resistência a este antimicrobiano talvez esteja relacionada a diferentes
mecanismos tais como a produção de β-lactamase por diferentes micro-organismos
como a E. aerogenes, E. coli, P. aeruginosa e S. aureus, entre outros. Também deve
ser levado em consideração que vários dos micro-organismos apresentam uma
resistência intrínseca a agentes antimicrobianos, sendo considerado como uma
característica natural das espécies bacterianas. Ainda, cabe ressaltar que a
descoberta das penicilinas data muitos anos e o seu uso indiscriminado ao longo
dos tempos contribuíram para o aparecimento de cepas resistentes (TENOVER,
2006).
Com relação à associação de amoxicilina com ácido clavulânico, foi
observada uma situação diferente, onde os dados experimentais mostraram que
cepas de E. aerogenes e E. coli apresentaram sensibilidade ao antimicrobiano,
talvez pelo fato de o ácido clavulânico ser um inibidor da β-lactamase com boa
46
atividade contra bactérias produtoras da respectiva enzima.
Embora existam diversos mecanismos de resistência aos β-lactâmicos, como
modificação do alvo (transpeptidases), redução de permeabilidade e de efluxo do
antimicrobiano, a principal razão para a resistência é a inativação pela ação de uma
variedade de β-lactamases que são encontradas em um grande número de
patógenos clinicamente importantes (PAGE; BADARAU, 2008).
De acordo com estudos anteriores, a disseminação de bactérias Gramnegativas e Gram-positivas resistentes a vários β-lactâmicos de amplo espectro está
se tornando cada vez mais prevalente (SADER et al., 2001; TORRES et al., 2006;
AUGUSTI; SUPERTI; ZAVASCKI, 2007), conforme observado também nos dados
apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de cepas bacterianas padrão e de
material clínico.
Antimicrobiano
Susceptibilidade bacteriana
E. aero E. coli 1 E. coli 2 K. oxy
P. aer 1
P. aer 2
S. aur 1
S. aur 2
AMP
R
R
R
R
R
R
R
R
AMC
S
S
R
I
R
R
R
R
CFL
S
S
R
R
R
R
S
S
CPM
S
S
I
S
S
S
S
S
CRO
S
S
R
R
I
I
S
R
GEN
S
S
R
R
S
S
R
R
AMI
S
S
I
S
S
S
R
R
NIT
S
S
S
S
R
R
S
S
SUT
S
S
R
R
R
R
S
S
NAL
R
R
R
S
R
R
R
R
CIP
R
R
R
S
S
S
S
S
NOR
R
R
R
S
S
S
S
S
Legenda: E. aero (Enterobacter aerogenes, isolado clínico), E. coli 1 (Escherichia coli 1, ATCC
25922), E. coli 2 (Escherichia coli 2, isolado clínico), K. oxy (Klebsiella oxytoca, isolado clínico), P. aer
1 (Pseudomonas aeruginosa 1, ATCC 27853), P. aer 2 (Pseudomanas aeruginosa 2, isolado clínico).,
S. aur 1 (Staphylococcus aureus 1, ATCC 25923), S. aur 2 (Staphylococcus aureus 2, isolado clínico),
AMP (ampicilina 10μg); AMC (amoxicilina/ ác clavulânico 30μg); GEN (gentamicina 10μg); AMI
(amicacina 30μg); CFL (cefalotina 30μg); CPM (cefepime 30μg); CRO (ceftriaxona 30μg); NIT
(nitrofurantoína 300μg); SUT (sulfazotrim 25μg);NAL (ácido nalidíxico 30μg); CIP (ciprofloxacino
05μg); NOR (norfloxacino 10μg); R (resistente); I (intermediário); S (sensível).
47
As cefalosporinas de um modo geral apresentam elevada potência
antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas e boa estabilidade frente às
β-lactamases produzidas por esses micro-organismos. O presente estudo mostrou
alta incidência de resistência das cepas Gram-negativas a essa classe de
antibacterianos, onde dados do trabalho mostram que 66,7% e 33,3% apresentaram
resistência a cefalotina e ceftriaxona, respectivamente, sendo que outros autores
têm descrito resistência semelhante aos aqui obtidos (MENEZES et al., 2003;
AUGUSTI; SUPERTI; ZAVASCKI, 2007).
A classe dos aminoglicosídeos testada por meio da amicacina e gentamicina
apresentaram sensibilidade para as bactérias Gram-negativas E. aerogenes,
algumas espécies de E. coli e P. aeruginosa, enquanto que a cepa Gram-positiva S.
aureus mostrou resistência a esses antimicrobianos. Conforme pesquisa realizada
por Menezes e colaboradores (2003), a amicacina apresenta propriedades que a
diferenciam dos demais aminoglicosídeos por ser, quase na sua totalidade,
resistente à inativação das enzimas produzidas pelas P. aeruginosa. A gentamicina,
por
outro
lado,
apresenta
propriedades
antimicrobianas
e
farmacológicas
semelhantes aos demais aminoglicosídeos, caracterizando-se pela atividade sobre a
P. aeruginosa. Embora a gentamicina se destaque como sendo um dos primeiros
aminoglicosídeos, ainda hoje, constitui um dos antimicrobianos de escolha para o
tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa, visto que, esse medicamento
apresenta excelente ação de combate a esse micro-organismo.
No
perfil
de
susceptibilidade
frente
às
cepas
bacterianas
para
a
nitrofurantoína, foi observado que apenas a P. aeruginosa apresentou resistência a
este antimicrobiano. A baixa frequência de resistência dos nitrofuranos foi relatada
também em outros trabalhos, mostrando que a elevada susceptibilidade a
nitrofurantoína permite que este antimicrobiano possa ser opção terapêutica no
tratamento empírico das cistites não complicadas, face às resistências detectadas
em relação à associação de trimetoprim/sulfametoxazol e quinolonas (SILVA,
MACHADO, DUARTE, 2008).
Vários micro-organismos testados frente à classe de antimicrobiano das
quinolonas mostraram elevado índice de resistência. Todas as cepas de E.
aerogenes e E. coli foram resistentes ao ácido nalidíxico, ciprofloxacino e
48
norfloxacino. A determinação do perfil de susceptibilidade das cepas bacterianas
mostrou que 87,5% do total geral das cepas apresentaram resistência ao ácido
nalidíxico e 37,5% destas foram resistentes ao ciprofloxacino e ao norfloxacino. Esta
constatação sugere a necessidade contínua de busca por compostos que sejam
sensíveis às cepas bacterianas e que melhorem os resultados obtidos na terapêutica
clínica.
Segundo Akbari-Nakhjavani e colaboradores (2007), as infecções do trato
urinário são frequentes e afetam entre 40 e 50% das mulheres adultas, apesar deste
impacto variar em diferentes populações. A maioria dos casos de infecção do trato
urinário é causada por E. coli, tendo as fluoroquinolonas como fármacos de primeira
escolha para o tratamento. Nos últimos anos, tem sido cada vez mais frequente o
aparecimento de bactérias resistentes as diversas quinolonas, sendo essa classe de
medicamentos de primordial importância no tratamento de várias doenças
infecciosas (HARGREAVES; KOK, 2003; MASUNARI; TAVARES, 2007; AKBARINAKHJAVANI et al., 2007; KARAGEORGOPOULOS et al., 2008; JENKINS;
BROWN; FARRELL, 2008). Por esta razão, torna-se de fundamental importância o
estudo de novos compostos que visem melhorar a atividade antimicrobiana, e seus
perfis farmacocinéticos com o objetivo de combater as doenças infecciosas
causadas pelos diversos micro-organismos.
5.2 Atividade antibacteriana
Desde a introdução do primeiro antimicrobiano, a resistência bacteriana a
estes agentes vem sendo descrita e, atualmente, vem emergindo em uma ampla
variedade de patógenos tanto de origem nosocomial quanto comunitária (POWERS,
2004; BERTONCHELI; HÖRNER, 2008). A busca de novos antimicrobianos eficazes
no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes considera de
fundamental importância a descoberta de novos alvos e a potencialização da
atividade de compostos com atividade antimicrobiana conhecida (FERNANDES et
al., 1999; TSE-DINH, 2009). Levando este fato em consideração, diferentes
compostos derivados do norfloxacino foram testados.
Para a avaliação da atividade antibacteriana dos compostos precursores,
49
derivados de norfloxacino e análogo, bem como para os fármacos norfloxacino e
ácido nalidíxico, empregou-se cepas padrão e de isolados clínicos de bactérias
Gram-negativas e Gram-positivas, visando à observação de possíveis influências
das mudanças na estrutura química sobre diferentes tipos de bactérias. Os
resultados de atividade obtidos com os novos compostos foram comparados,
principalmente entre os valores de CIM (μg/mL e μM) do norfloxacino (1) e do ácido
nalidíxico (19), com os precursores e compostos sintetizados derivados do
norfloxacino e do ácido nalidíxico (Tabelas 6 e 7).
Devido ao fato da grande maioria dos estudos de avaliação de atividade
antimicrobiana empregarem valores expressos em micrograma por mililitro (μg/mL),
optamos por esta forma para discutir os resultados, embora também apresentamos
os resultados de micromolar (μM).
Para possibilitar a avaliação da atividade antibacteriana e a possível influência
das modificações realizadas na molécula de norfloxacino e o análogo, foi empregado
uma faixa de concentração dos compostos, partindo desde 1000 μg/mL, seguindo
com diluições até 0,03 μg/mL. Embora concentrações superiores a 10 μg/mL não
sejam interessantes para aplicação dos compostos na clínica, as análises de
concentrações superiores podem contribuir no estudo de correlação estrutura e
atividade.
Os compostos empregados em concentrações maiores que 100 μg/mL nas
análises apresentaram baixa solubilidade em meio aquoso, inviabilizando a análise
através da microdiluição em caldo, por esta razão foi necessário o emprego de uma
metodologia que permitisse a avaliação da atividade antimicrobiana onde a
suspensão dos compostos não interferissem nos resultados, como o método de
diluição em ágar.
Como pode ser verificado nas Tabelas 6 a 9, diversos compostos estudados
apresentaram atividade contra as bactérias testadas. Tanto o norfloxacino (1) como o
ácido nalidíxico (19) mostraram-se ativos contra todas as cepas bacterianas,
possibilitando a comparação com os demais compostos, sejam precursores ou
derivados.
Foram detectadas algumas diferenças encontradas nos resultados da CIM do
ácido nalidíxico (19) e do norfloxacino (1) apresentados na Tabela 6 em relação ao
50
perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos na Tabela 3. Provavelmente isso se
deva ao fato das diferenças entre as metodologias adotadas conforme descritas nos
itens 4.3 e 4.4, bem como as concentrações utilizadas dos compostos.
Levando-se em consideração os critérios para classificação de atividade
descritos no item 4.4, as cepas bacterianas estudadas foram classificadas como
sensível e intermediária.
De modo geral as cepas bacterianas padrão de E. coli, P. aeruginosa e S.
aureus, foram mais sensíveis que as respectivas cepas resistentes, indicando que
as modificações estruturais do composto de norfloxacino (1) como do ácido
nalidíxico (19) não interferiram nos mecanismos de resistência bacteriano.
Todos os precursores brometos fenacílicos utilizados para a obtenção dos
derivados do norfloxacino apresentaram atividade contra todas as cepas das
bactérias testadas.
Comparando os resultados entre os brometos de fenacila, os compostos mais
ativos foram 8 e 11, seguido do 2, 5, 13 e 15.
Os precursores fenacílicos 2, 5, e 8, que apresentaram significativa atividade
antibacteriana com CIM <64 μg/mL, entretanto quando na forma de derivados
imínicos (7, 10 e 17), demonstraram grande redução de atividade. Embora o átomo
de bromo tenha sido mantido na estrutura química, quando foi adicionado o
grupamento hidrazina observou-se uma perda de atividade antibacteriana com CIM
entre 125 μg/mL a valores >1000 μg/mL.
Para a maioria das bactérias, os precursores fenacílicos foram mais ativos
que os respectivos derivados (adutos obtidos pela condensação com o norfloxacino),
como para o precursor 8 e o derivado 9; precursor 2 e os derivados 3 e 4; precursor
11 e o derivado 12; precursor 13 e o derivado 14; precursor 15 e o derivado 16; e
finalmente precursor 17 e o derivado 18.
Embora os resultados sejam evidentes, não podemos simplesmente comparar
precursores com seus respectivos derivados, especialmente os precursores
brometos fenacílicos, pois provavelmente exercem sua atividade antibacteriana por
mecanismo(s) de ação diferente(s) dos seus compostos derivados, devido sua
característica de serem muito reativos (presença de uma carbonila ainda mais
eletrofílica e presença do efeito indutivo exercido pelo átomo de bromo), podendo
51
reagir com diversos sistemas biológicos. O objetivo, ao mensurar a atividade dos
precursores, foi verificar se a condensação destes com o Norfloxacino poderia
causar alterações significativas na magnitude da atividade biológica aferida, já que
tal fato poderia ser um indicativo do caminho de interação biológica observado
quando da ação dos adutos (precursores fenacílicos com norfloxacino)
Comparando os resultados do derivado do norfloxacino com o derivado do
seu análogo, foi verificado que o derivado éster do norfloxacino (4) foi mais ativo que
o derivado éster do ácido nalidíxico (20), assim como ocorreu com os respectivos
fármacos de referência (1 e 19). Conforme se pode observar na estrutura química
dos compostos 4 e 20 no radical carboxila foram adicionados um grupamento etil,
conferindo um melhor resultado de atividade antibacteriana quando comparados
apenas ao radical carboxila. Isto pode ser um indicativo de que a mudança da
polaridade média das moléculas, diminuída pela substituição do grupamento
hidroxila (–OH), pelo grupamento etila (–CH2CH3), pode ser importante para a
obtenção de um melhor efeito biológico, nas condições em que o ensaio foi
realizado.
Inicialmente as fluoroquinolonas foram introduzidas para o tratamento de
infecções por bactérias Gram-negativas na década de 1980. No entanto, devido ao
seu espectro para bactérias Gram-positivas, elas também têm sido usadas no
tratamento de infecções bacterianas causadas por pneumococos e estafilococos.
A resistência a quinolonas entre S. aureus surgiu rapidamente, mais
proeminente entre as espécies meticilina-resistentes, provocando uma drástica
redução no seu emprego como agente antiestafilocócico (LOWY, 2003). No entanto,
vários estudos têm sido dirigidos com a finalidade de sintetizar substâncias
fluoroquinolônicas que apresentem atividade antimicrobiana para bactérias Grampositivas.
Segundo Letafat e colaboradores (2007), o aparecimento de bactérias Grampositivas resistentes, notadamente S. aureus e Streptococcus pneumoniae tem
levado ao desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos que seletivamente
ataquem novos alvos bacterianos. Considerando os resultados obtidos, os
compostos 4 e 9 parecem promissores, pois foram bem ativos contra a cepa
resistente de S. aureus 2. Mais uma vez podemos observar a presença de um
52
radical etil na carboxila do composto 4, no entanto, o átomo de flúor foi retirado na
posição da fenacila no composto 9. Contudo, há que se observar que a polaridade
média destas duas moléculas ficou muito próxima, havendo uma “compensação”
pela substituição da hidroxila pelo grupo etil, no composto 4, com a introdução de
um átomo de flúor.
Com relação à cepa de E. coli padrão, os compostos derivados do
norfloxacino (3, 6 e 16), apresentaram excelente atividade antibacteriana, embora
que para a cepa resistente da mesma bactéria, os mesmos compostos não
apresentaram atividade. É importante registrar que o composto 16, apresentou valor
de CIM comparável com o fármaco de referência (<0,03 μg/mL) para a cepa padrão,
embora de 32 μg/mL para a cepa resistente.
Comparando os compostos testados frente às cepas de Klebsiella oxytoca os
compostos fenacílicos 2, 8 e 11, demonstraram atividade com CIM de 8 μg/mL. Já
para a mesma cepa bacteriana, os respectivos derivados do norfloxacino
apresentaram atividade intermediária à fraca, com valores de CIM 32,25 μg/mL para
os compostos 3, 4 e 9, e 250 μg/mL para o composto 12.
Entre os compostos derivados do norfloxacino 3, 6, 9, e 16 foi observado que
o composto 3 apresentou CIM de 8 μg/mL e 0,125 μg/mL para as cepas padrão de
S. aureus e E. coli respectivamente. Para o composto 6 foi encontrado o valor de
CIM equivalente a 0,5 μg/mL para a cepa S. aureus obtido de isolado clínico, e CIM
de 0,25 μg/mL para E. coli padrão. Já para o composto 9, a CIM foi de 8 μg/mL e
0,25 μg/mL para a cepa de S. aureus padrão e de isolado clínico respectivamente.
Salientando que o composto 16 apresentou a CIM comparada ao fármaco de
referência, bem como, em todos esses compostos foram mantidos o radical
carboxílico, e no composto 16, dois átomos de cloro na sua estrutura.
As cepas de E. aerogenes e P. aeruginosa, foram as bactérias que
apresentaram as maiores resistências aos compostos testados, sobretudo para os
derivados de norfloxacino e o análogo, entretanto grande parte dos precursores
fenacílicos, foram bem ativos.
Vale salientar a afirmação de que, a ação terapêutica dos fármacos resulta de
interações dos mesmos com os sistemas biológicos e é dependente de fatores
relacionados com sua estrutura química e, consequentemente de suas propriedades
53
físico-químicas. Dois fármacos com estruturas químicas semelhantes, diferenciandose apenas por um átomo ou posição que este ocupa na molécula, podem apresentar
diferenças quanto as suas propriedades físico-químicas bem como, quanto a sua
atividade biológica (TAVARES, 2004; MASUNARI, TAVARES, 2007).
Ao longo dos anos, um grande número de quinolonas com substituição no
grupamento piperazina na posição de carbono 7 da estrutura básica das quinolonas
tem sido sintetizados e avaliados quanto à atividade antibacteriana (FOROUMADI et
al., 2003). Lembrando que o ácido nalidíxico (19) foi o primeiro membro da família
das quinolonas, bem como o análogo estrutural do norfloxacino (1). Após a
descoberta dos efeitos terapêuticos do ácido nalidíxico na década de 1970, começou
o estudo em cada posição dentro do núcleo quinolônico numa tentativa de melhorar
a potência, aumentar o espectro de atividade antibacteriana reconhecida e reduzir
os efeitos secundários (FANG et al., 2000; LETAFAT et al., 2007). No entanto, vale
salientar que a natureza do grupo funcional na posição do carbono 7 do anel
quinolônico tem grande influência sobre o espectro e atividade antibacteriana
(FOROUMADI et al., 2003), razão pela qual, no presente estudo foi mantido o anel
piperazínico nesta posição, as modificações da molécula do norfloxacino foram
realizadas neste anel.
De modo geral, embora os resultados não foram favoráveis para estabelecer
uma conclusiva correlação entre estrutura e atividade, foi verificado que para as
cepas E. coli padrão e K. oxytoca, houve indício de correlação dos compostos 6, 9,
12, 14 e 15, com os parâmetros de efeito eletrônico preconizado por Topliss (1977).
Este método manual, que consiste num modelo não estatístico e não
computadorizado, está baseado na síntese de cinco derivados, os quais contém os
seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3 e 4-OCH3. Os compostos, assim
substituídos, foram escolhidos em função de serem de mais fácil obtenção sintética
e apresentarem variadas características estéricas e eletrônicas.
Os resultados da atividade biológica, então, são analisados de acordo com os
parâmetros π (constante hidrofóbica), σ (constante de Hammett), Es (efeitos
estéricos) e π - σ; π -2 σ; π -3 σ; π + σ, ... (π e σ relacionados). Uma ordem de
potência proposta, para várias dependências paramétricas (Tabela 4), é comparada
com a ordem seqüencial quantitativa da atividade biológica dos cinco derivados
54
sintetizados. Neste ponto, o método identifica quais parâmetros estruturais estão
envolvidos na obtenção do efeito biológico (TOPLISS, 1977; CORRÊA et al., 2008).
Tabela 4: Ordem de potência de Topliss para várias dependências paramétricas.
Substituinte
Parâmetros
π
2π-π
σ
-σ
π+σ
2π-σ
π-σ
π-2σ
π-3σ
E4a
3,4-Cl2
1
1-2
1
5
1
1
1-2
3-4
5
2-5
4-Cl
2
1-2
2
4
2
2-3
3
3-4
3-4
2-5
4-CH3
3
3
4
2
3
2-3
1-2
1
1
2-5
4-OCH3
4-5
4-5
5
1
5
4
4
2
2
2-5
H
4-5
4-5
3
3
4
5
5
5
3-4
1
2
Legenda: aDesfavorável efeito estérico a partir da 4-substituição
Fonte: Topliss, 1977
No
presente
trabalho,
a
série
de
derivados
selecionados
mostrou
dependência no parâmetro σ, que é a constante de Hammet que está relacionada à
demanda eletrônica molecular (Tabela 5).
Tabela 5: Ordem de potência de atividade antibacteriana observada para cinco derivados
destacados, em ensaio envolvendo as cepas de E. coli e K. oxytoca.
Composto
Substituinte
σ
Potência de atividade antibacteriana (µM)
E. coli
K. oxytoca
16
3,4-Cl2
1
< 0,06
63,69
6
4-Cl
2
0,53
68,34
12
4-CH3
5
553,72
553,72
14
4-OCH3
4
136,90
137,97
9
H
3
73,14
73,72
Legenda: σ (constante de Hammet); E. coli (Escherichia coli ATCC 25922); K. oxytoca (Klebsiella
oxytoca, isolado clínico).
Segundo a ordem de potência de Topliss, que prevê para a dependência
paramétrica baseada na constante de Hammet (σ) na ordem 1, 2, 4, 5 e 3, observouse grande similaridade com pequena modificação em função da inversão de ordem
4-5. As potências observadas na série em destaque (compostos 16, 6, 12, 14 e 9)
55
demonstrando que os compostos desta série que possuam grupamentos
eletrossacadores, otimizam o efeito da atividade antimicrobiana.
Com relação ao ácido nalidíxico (19), o seu análogo 20 apresentou grande
redução do potencial antimicrobiano, que pode estar associado a substituição do
grupamento etil na posição X da molécula. No entanto, quando comparamos os
derivados de norfloxacino 3 e 4, o mesmo efeito não foi observado.
Após a determinação da CIM, avaliou-se a CBM para os compostos
norfloxacino, ácido nalidíxico, os compostos fenacílicos e suas respectivas
modificações estruturais (Tabelas 8 e 9). Os valores da CBM para o norfloxacino (1)
e ácido nalidíxico (19), bem como para os seus respectivos compostos modificados
variaram entre resultados <0,03 a >1000 µg/mL. Os resultados dos testes da CBM
demonstraram que o composto 16 para o micro-organismo E. coli, cepa padrão,
apresentou potencial microbicida, o que é considerada uma característica favorável
para os agentes antimicrobianos, uma vez que inviabilizam o crescimento
microbiano
Corroborando com os dados da literatura em que a química medicinal tem
sintetizado um grande número de análogos do norfloxacino e ciprofloxacino na
intenção de melhorar a atividade antibacteriana frente às cepas de bactérias Grampositivas e Gram-negativas; os resultados encontrados neste trabalho evidenciam
que as diversas modificações na estrutura química do norfloxacino (1) e ácido
nalidíxico (19) sugerem o potencial dos compostos sintetizados como possíveis
agentes antibacterianos.
Um dos objetivos do trabalho foi a realização de um estudo entre estrutura e
atividade antimicrobiana, no entanto, os resultados obtidos impossibilitaram a
observação de uma correlação coerente e definitiva com as ferramentas de análise
disponíveis. Portanto, outras modificações estruturais na molécula do norfloxacino,
contemplando uma maior diversidade química, são necessárias para possibilitar a
análise das influências que as mesmas possam provocar sobre a atividade
antimicrobiana, bem como, partindo das melhores modificações estruturais, como
para os compostos codificados com os números 2, 5 e 8, talvez novas modificações
possam melhorar os resultados das atividades antibacterianas.
56
Tabela 6: Atividade antibacteriana (CIM em µg/mL) dos compostos modificados do
norfloxacino frente às cepas das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composto
Concentração Inibitória Minima (µg/mL)
E.a
E.c 1
E.c 2
K.o
P.a 1
P.a 2
S.a 1
S.a 2
1
4
<0,03
8
<0,03
0,125
<0,03
4
0,06
2
4
8
8
8
16
32
4
16
3
>1000
0,125
>1000
32,25
>1000
>1000
8
>1000
4
>1000
0,5
>1000
32,25
>1000
>1000
16
0,25
5
64
8
16
32
64
64
8
32
6
>1000
0,25
>1000
32,25
>1000
>1000
32
0,5
7
>1000
1000
>1000
>1000
>1000
>1000
125
>1000
8
2
8
1
8
8
16
2
8
9
>1000
32
>1000
32,25
>1000
>1000
8
0,25
10
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
11
8
2
4
8
32
32
2
1
12
1000
250
1000
250
1000
1000
1000
250
13
250
125
250
250
500
250
16
250
14
>1000
64
>1000
62,50
>1000
>1000
32
1000
15
500
500
500
500
500
500
16
500
16
>1000
<0,03
32
32,25
500
>1000
62,50
>1000
17
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
250
>1000
18
>1000
32
>1000
32,25
>1000
>1000
8
>1000
19
8
<0,03
16
0,06
0,5
<0,03
8
16
20
>1000
62,50
>1000
62,50
>1000
>1000
16
>1000
Legenda: E.a (Enterobacter aerogenes, isolado clínico), E.c 1 (Escherichia coli 1, ATCC 25922), E.c 2
(Escherichia coli 2, isolado clínico), K.o (Klebsiella oxytoca, isolado clínico), P.a 1 (Pseudomonas
aeruginosa 1, ATCC 27853), P.a 2 (Pseudomanas aeruginosa 2, isolado clínico), S.a 1
(Staphylococcus aureus 1, ATCC 25923), S.a 2 (Staphylococcus aureus 2, isolado clínico).
57
Tabela 7: Atividade antibacteriana (CIM em µM) dos compostos modificados do
norfloxacino frente às cepas das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composto
Concentração Inibitória Minima (µM)
E.a
E.c 1
E.c 2
K.o
P.a 1
P.a 2
S.a 1
S.a 2
1
12,53
<0,09
25,05
<0,09
0,39
<0,09
12,53
0,19
2
18,43
36,86
36,86
36,86
73,72
147,44
18,43
73,72
3
>21955,34
0,27
>21955,34
70,80
>21955,34
>21955,34
17,56
>21955,34
4
>2068,21
1,03
>2068,21
66,70
>2068,21
>2068,21
33,09
0,52
5
274,10
34,26
68,52
137,05
274,10
274,10
34,26
137,05
6
>2119,09
0,53
>2119,09
68,34
>2119,09
>2119,09
67,81
1,06
7
>4042,85
4042,85
>4042,85
4042,85
>4042,85
>4042,85
505,35
>4042,85
8
10,04
40,2
5,02
40,2
40,2
80,38
10,04
40,2
9
>2285,87
73,14
>2285,87
73,72
>2285,87
>2285,87
18,27
0,57
10
>4697,04
>4697,04
>4697,04
>4697,04
>4697,04
>4697,04
>4697,04
>4697,04
11
37,54
9,38
18,77
37,54
150,18
150,18
9,38
4,69
12
2214,89
553,72
2214,89
553,72
2214,89
2214,89
2214,89
553,72
13
1091,32
545,66
1091,32
1091,32
1091,32
2182,64
69,84
1091,32
14
>2139,08
136,90
>2139,08
137,97
>2139,08
>2139,08
68,45
2139,08
15
1866,16
1866,16
1866,16
1866,16
1866,16
1866,16
59,72
1866,16
16
>1974,92
<0,06
63,20
63,69
>1974,92
987,46
127,38
>1974,92
17
>4330,88
>4330,88
>4330,88
>4330,88
>4330,88
>4330,88
1082,72
>4330,88
18
>2014,18
68,16
>2014,18
68,69
>2014,18
>2014,18
17,04
>2014,18
19
34,45
<0,13
68,90
0,26
2,15
<0,13
34,45
68,90
20
>2615,16
163,45
>2615,16
163,45
>2615,16
>2615,16
41,84
>2615,16
Legenda: E.a (Enterobacter aerogenes, isolado clínico), E.c 1 (Escherichia coli 1, ATCC 25922), E.c 2
(Escherichia coli 2, isolado clínico), K.o (Klebsiella oxytoca, isolado clínico), P.a 1 (Pseudomonas
aeruginosa 1, ATCC 27853), P.a 2 (Pseudomanas aeruginosa 2, isolado clínico), S.a 1
(Staphylococcus aureus 1, ATCC 25923), S.a 2 (Staphylococcus aureus 2, isolado clínico).
58
Tabela 8: Atividade antibacteriana (CBM em µg/mL) dos compostos modificados do
norfloxacino frente às cepas das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composto
Concentração Bactericida Minima (µg/mL)
E.a
E.c 1
E.c 2
K.o
P.a 1
P.a 2
S.a 1
S.a 2
1
4
8
32
0,125
<0,03
<0,03
4
4
2
8
8
8
8
16
32
2
4
3
>1000
0,25
>1000
2
>1000
4
>1000
32
4
>1000
2
>1000
1
>1000
2
>1000
32
5
>1000
8
>1000
8
1000
1000
4
32
6
>1000
0,25
>1000
>1000
>1000
1000
>1000
>1000
7
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
8
4
8
2
16
8
16
16
4
9
>1000
>1000
>1000
32,25
>1000
1000
>1000
16
10
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
11
16
2
8
>1000
32
64
2
2
12
>1000
0,06
>1000
>1000
1000
1
>1000
>1000
13
>1000
>1000
>1000
8
>1000
>1000
250
250
14
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
15
>1000
32
>1000
500
>1000
>1000
500
500
16
>1000
<0,03
>1000
>1000
500
500
>1000
1000
17
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
18
>1000
>1000
>1000
32,25
>1000
>1000
>1000
250
19
8
<0,03
16
>1000
8
<0,03
>1000
4
20
>1000
2
>1000
32,25
>1000
2
>1000
>1000
Legenda: E.a (Enterobacter aerogenes, isolado clínico), E.c 1 (Escherichia coli 1, ATCC 25922), E.c 2
(Escherichia coli 2, isolado clínico), K.o (Klebsiella oxytoca, isolado clínico), P.a 1 (Pseudomonas
aeruginosa 1, ATCC 27853), P.a 2 (Pseudomanas aeruginosa 2, isolado clínico), S.a 1
(Staphylococcus aureus 1, ATCC 25923), S.a 2 (Staphylococcus aureus 2, isolado clínico).
59
Tabela 9: Atividade antibacteriana (CBM em µM) dos compostos modificados do
norfloxacino frente as cepas das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composto
Concentração Bactericida Minima (µM)
E.a
E.c 1
E.c 2
K.o
P.a 1
P.a 2
S.a 1
S.a 2
1
12,53
25,05
100,21
0,39
<0,09
<0,09
12,53
12,53
2
36,86
36,86
36,86
36,86
73,72
147,44
9,21
18,43
3
>2195,53
0,55
>2195,53
4,39
>2195,53
8,78
>2195,53
66,18
4
>2068,21
4,14
>2068,21
2,07
>2068,21
4,14
>2068,21
66,18
5
>4282,84
34,26
>4282,84
34,26
>4282,84
4282,84
17,13
137,06
6
>2119,09
0,53
>2119,09 >2119,09 >2119,09
2119,09
7
>4042,85 >4042,85 >4042,85 >4042,85 >4042,85 >4042,85 >4042,85 >4042,85
8
20,09
40,18
10,04
>2119,09 >2119,09
80,38
40,18
80,38
80,38
20,09
73,72
>2285,87
2285,87
>2285,87
36,57
9
>2285,87 >2285,87 >2285,87
10
>4697,04 >4697,04 >4697,04 >4697,04 >4697,04 >4697,04 >4697,04 >4697,04
11
75,09
9,38
37,54
>4693,07
150,18
300,36
>2214,89 >2214,89
2214,89
2,21
12
>2214,89
0,132
13
>4365,28 >4365,28 >4365,28
14
>2139,08 >2139,08 >2139,08 >2139,08 >2139,08 >2139,08 >2139,08 >2139,08
15
>3732,32
119,43
>3732,32
16
>1974,92
<0,06
>1974,92 >1974,92
17
>4330,88 >4330,88 >4330,88 >4330,88 >4330,88 >4330,88 >4330,88 >4330,88
18
>2130,02 >2130,02 >2130,02
34,92
1866,16
68,69
>4365,28 >4365,28
>3732,32 >3732,32
987,46
987,46
9,38
>2214,89 >2214,89
1091,32
34,45
<0,129
68,89
>4306,07
34,45
<0,129
20
>2615,16
5,23
>2615,16
84,34
>2615,16
5,23
1091,32
1866,16
1866,16
>1974,92
1974,92
>2130,02 >2130,02 >2130,02
19
9,38
>4306,07
532,50
17,22
>2615,16 >2615,16
Legenda: E.a (Enterobacter aerogenes, isolado clínico), E.c 1 (Escherichia coli 1, ATCC 25922), E.c 2
(Escherichia coli 2, isolado clínico), K.o (Klebsiella oxytoca, isolado clínico), P.a 1 (Pseudomonas
aeruginosa 1, ATCC 27853), P.a 2 (Pseudomanas aeruginosa 2, isolado clínico), S.a 1
(Staphylococcus aureus 1, ATCC 25923), S.a 2 (Staphylococcus aureus 2, isolado clínico).
60
6 CONCLUSÕES
1 Para a maioria das bactérias estudadas, os precursores fenacílicos utilizados para
a obtenção
dos derivados
de
norfloxacino
apresentaram maior atividade
antibacteriana que os respectivos derivados.
2 Embora os precursores fenacílicos codificados com os números 2, 5, e 8 tenham
apresentado excelente atividade antibacteriana, com CIM entre 1 e 64 μg/mL, os
seus respectivos derivados imínicos 17, 7 e 10, demonstraram acentuada redução
de atividade antibacteriana, onde a adição de um grupamento hidrazina reduziu
consideravelmente a atividade antibacteriana do respectivo precursor fenacílico.
3 As cepas bacterianas padrão de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus, foram mais sensíveis que as respectivas cepas resistentes,
indicando que as modificações estruturais dos derivados de norfloxacino não
interferiram no mecanismo de resistência bacteriano.
4
Todos
os
derivados
de
norfloxacino
testados
apresentaram
atividade
antibacteriana, bem como o derivado do ácido nalidíxico, porém nenhum deles
apresentou atividade superior ou equivalente ao norfloxacino ou ácido nalidíxico.
5 Os derivados do norfloxacino mais ativos foram os compostos 3 e 6, onde o
primeiro apresentou valores de concentração inibitória mínima (CIM) entre duas e
cinco vezes maiores que o norfloxacino e o ácido nalidíxico, para as bactérias
Escherichia coli e Staphylococcus aureus padrão, e o segundo composto (6) com
CIM entre duas e oito vezes maiores que o os mesmos antimicrobianos para as
bactérias citadas.
61
REFERÊNCIAS
ADJEI, M. D.; HEINZE, T. M.; DECK, J..; FREEMAN, J. P; WILLIAMS, A. J.;
SUTHERLAND, J. B. Transformation of the antibacterial agent norfloxacin by
environmental Mycobacteria. Applied and Environmental Microbiology, v. 72, p.
5790-5793, 2006.
AKBARI-NAKHJAVANI, F.; MIRSALEHIAN, A.; HAMIDIAN, M.; KAZEMI, B.;
MIRAFSHAR, M.; JABAL AMELI, F.; PAJAND, O.; PEYMANI, A. Antimicrobial
susceptibility testing of Escherichia coli strains isolated from urinary tract infections to
fluoroquinolones and detection of gyrA mutations in resistant strains. DARU, v. 15, n.
2, p. 94-99, 2007.
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual de microbiologia
clínica para controle de infecção em serviços de saúde. Módulo V: Detecção e
Identificação das bactérias de importância médica. Brasília: Editora ANVISA,
2004. Disponível em <http://www.anvisa.gov.br>
AUGUSTI, G. R.; SUPERTI, S.; ZAVASCKI, A. P. Prevalência de produção de betalactamases de espectro estendido em bacteremias por Klebsiella pneumoniae e
Escherichia coli. Scientia Medica, v. 17, n. 4, p. 192-196, 2007.
BAIL, L.; ITO, C. A. S.; ESMERINO, L. A. Infecção do trato urinário: comparação
entre o perfil de susceptibilidade e a terapia empírica com antimicrobianos. Revista
Brasileira de Análises Clínicas, v.38, n. 1, p. 51-56, 2006.
BARON, S. Medical microbiology. 4th ed. The University of Texas Medical Branch at
Galveston, 1996. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=mmed>
BARREIRO, E. J.; FRAGA, C. A. M. Química medicinal: as bases moleculares da
ação dos fármacos. Porto Alegre: Artmed, 2001.
BALL, P.. Adverse drug reactions: implications for the development of
fluoroquinolones. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 51, p. 21-27, 2003.
BENSIKADDOUR, H.; FA, N.; BURTON, I.; DELEU, M.; LINS, L.; SCHANCK, A.;
BRASSEUR, R.; DUFRÊNE, Y. F.; GOORMAGHTIGH, E.; MINGEOT-LECLERCQ,
M. Characterization of the interactions between fluoroquinolone antibiotics and lipids:
a multitechnique approach. Biophysical Journal, v. 94, n. 8, p. 3035-3046, 2008.
BERTONCHELI, C. M.; HÖRNER, R. Uma revisão sobre metalo-β-lactamases.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v. 44, n. 4, p.577-599, 2008.
BHANOT, S. K.; SINGH, M.; CHATTERJEE, N. R. The Chemical and biological
aspects of fluoroquinolonas: reality and dreams. Current Pharmaceutical Desing,
Sharpah, v.7, p. 313-337, 2001.
62
BLIZIOTIS, I. A.; PARASCHAKIS, K.; VERGIDIS, P. I.; KARAVASIOU, A. I.;
FALAGAS, M. E. Worldwide trends in quantity and quality of published articles in the
field of infectious diseases. BMC Infectious Diseases, v. 5, p. 16, 2005.
BRYSKIER, A. Antibacterial agents Structure
fluoroquinolones. Drugs, v. 49, n. 2, p. 11, 2004.
activity
relationships
of
BUSH, K. Antibacterial drug Discovery in the 21 st ventury. Clinical Microbiology
and Infection, v.10, S 4, p. 10-17, 2004.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Standards for antimicrobial
susceptibility testing. Fifteenth Informational Supplement M100-S15, Wayne, PA,
2007.
CHEN, Y.L.; FLANG, K. C.; SHEU, J. Y.; HSU, S. L.; TZ- GUG, C.C. Sinthesis and
antibacterial evaluation of certain quinolone derivatives. Journal Medicine
Columbus, v. 44, p. 2374-2377, 2001.
CORRÊA, R.; FENNER, B. P.; CAMPOS-BUZZI, F.; CECHINEL FILHO, V.; NUNES,
R. J. Antinociceptive Activity and preliminary structure-activity relationship of
chalcone-like compounds. Zeitschrift für Naturforschung C, v. 63c, p. 830-836,
2008.
DIZMAN, B.; ELASRI, M. O.; MATHIAS, L. J. Synthesis, characterization, and
antibacterial activities of novel methacrylate polymers containing norfloxacin.
Biomacromolecules, v. 6, n. 1, p. 514-20, 2005.
DRLICA, K.; ZHAO, X. DNA Gyrase, Topoisomerase IV, and the 4-Quinolones.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 61, n. 3, p. 377-392, 1997.
DRLICA, K.; MALIK, M.; KERNS,R.J.; ZHAO, X. Quinolone-Mediated bacterial death.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 52, n.2, p.385-392, 2008.
European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing of the European Society
of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (EUCAST). Definitive document
E.Def 1.2, May 2000: Terminology relating to methods for the determination of
susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. Clinical Microbiology and
Infection, v. 6, n. 9, p. 503-508, 2000.
FANG, K-C.; CHEN, Y-L.; SHEU, J-Y.; WANG, T-C.; TZENG, C-C. Synthesis,
Antibacterial, and Cytotoxic Evaluation of Certain 7-Substituted Norfloxacin
Derivatives. Journal Medicinal Chemistry, v. 43, p. 3809-3812, 2000.
FERNANDES, P. B.; MENZEL, R.; HARDY, D. J.; TSEDINH, Y.; WARREN, A.;
ELSEMORE, D.A. Microbial resistance: novel screens for a comtepotany problem.
Medicinal Research Reviews, v.19, n.6, p. 559-568, 1999.
63
FONSECA, A. L. Antibióticos na Clínica Diária. 6 ed. Rio de Janeiro: EPUB, 1999.
468p.
FOROUMADI, A.; MANSOURI, S.; KIANI, Z.; RAHMANI, A. Synthesis and in vitro
antibacterial evaluation of N-[5-(5-nitro-2-thienyl)-1,3,4-thiadiazole-2-yl] piperazinyl
quinolones. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 38, p. 851-854, 2003.
FOXMAN, B. Contributions of Molecular Epidemiology to the Understanding of
Infectious Disease Transmission, Pathogenesis, and Evolution. Annals of
Epidemiology, v. 17, p. 148-156, 2007.
FRENCH, G. L. Clinical impact and relevance of antibiotic resistance. Advanced
Drug Delivery Reviews, v. 57, n. 10, p. 1514-1527, 2005.
GRADELSKI, E.; KOLEK, B.; BONNER, D.; FUNG-TOMC, J. Bacterial mechanism of
gatifloxacin compared with other quinolonas. Journal of Antimicrobial
Chemoratherapy, v. 49, p. 185-188, 2002.
GROSSMAN, T. H.; BARTELS, D. J.; MULLIN, S.; GROSS, C. H.; PARSONS, J. D.;
LIAO, Y.; GRILLOT, A.; STAMOS, D.; OLSON, E. R.; CHARIFSON, P. S.; MANI, N.
Dual Targeting of GyrB and ParE by a Novel Aminobenzimidazole Class of
Antibacterial Compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 51, n. 2, p.
657–666, 2007.
HARGREAVES, J.; KOK, J. Australian hospital morbidity data on antibiotic
resistance. Commun Disease Intell, v. 27, p. S55-S60, 2003.
HAYASHI, N.; NAKATA, Y.; YAZAKI, A. New Findings on the Structure-Phototoxicity
Relationship and Photostability of Fluoroquinolones with Various Substituents at
Position 1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 48, n. 3, p. 799–803, 2004.
HOOPER, D. C.; WOLFSON, J. S. The fluoroquinolones: pharmacology, clinical
uses, and toxicities in humans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 28, p.
716-721, 1985.
JAWETZ, E.; MELNICK, J. L.; ADELBERG, E.A. Microbiologia médica, 2 ed. São
Paulo: Premier, 1998.
JENKINS, S. G.; BROWN, S. D.; FARRELL, D. J. Trends in antibacterial resistance
among Streptococcus pneumoniae isolated in the USA: update from PROTEKT US
Years 1–4. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, v.7, n. 1, 2008.
KAYE, K. S.; KANAFANI, Z. A.; DODDS, A.; ENGEMANN, J. J. Differential effects of
levofloxacin and ciprofloxacin on the risk for isolation of quinolone-resistant
Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 50, n. 6, p.
2192-2196, 2006.
64
KARAGEORGOPOULOS, D.; GIANNOPOULOU, K.; GRAMMATIKOS, A.;
FALAGAS, M. Fluoroquinolones compared with β-lactam antibiotics for the treatment
of acute bacterial sinusitis: a meta-analysis of randomized controlled trials. Canadian
Medical Association Journal, v. 178, n. 7, p.845–854, 2008.
KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.; SCHERECKEN-BERGER, P. C.;
WINN JÚNIOR, W. C. Diagnóstico microbiológico. 5. ed. Rio de Janeiro: Medsi,
2001. 1465p.
KOTILAINEN, P.; PIKANEN, S.; SIITONEN, A.; HUOVINEN, P.; HAKANEN, A. J. In
vitro activities of II fluoroquinolones agains 816 non-typhoidal strains of salmonella
enterica isolated from finnish patients with spcial reference to reduced ciprofloxacin
susceptibility. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, v. 4, p. 4-12.
2005.
KUMAR, A.; SCHWEIZER, H.P.Bacterial resistance to antibiotics: Active effux and
reduced uptake. Advanced Drug Delivery Reviews, v.57, n.10, p. 1486-1513, 2005.
LETAFAT B.; EMAMI S.; MOHAMMADHOSSEINI, N.; FARAMARZI, M.A.; SAMADI,
N.; SHAFIEE, A.; FOROUMADI, A. Synthesis and antibacterial activity of new N-[2(Thiophen-3-yl)ethyl] piperazinyl quinolones. Chemical and Pharmaceutical
Bulletin, v.55, n.6, p. 894-898, 2007.
LEVY, S. B. Antibiotic resistance- the problem intensifies. Advanced Drug Delivery
Reviews, v. 57, n. 10, p. 1446-1450, 2005.
LI, X. H.; ZHU, Z.-L.; CHENG, X.-L.; YANG, X.-D. Quantitative Structure –
Pharmacokinetic/Pharmacodynamic
relationship
for
Fluoroquinolones.
Pharmaceutical Chemistry Journal, v. 41, n. 2, p. 82-87, 2007.
LOPES, H. V. Antibióticos e antibioticoterapia. In: VERONESI, R.; FOCACCIA, R.
(Org.) Tratado de infectologia. 3. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. p. 31- 46.
LOWY, F. D. Antimicrobial resistance: The example of Staphylococcus aureus.
Science in Medicine, v. 111, p. 1265-1273, 2003.
MALIK, M.; HUSSAIN, S.; DRLICA, K. Effect of Anaerobic on Quinolone Lethality
with Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 51, p. 28-34,
2006.
MANDELL, L. G.; BERGERON, M.; MARRIE, T.; NICOLLE, L.; SCHEIFELE, D.;
SHAFRAN, S. Committee on antimicrobial agents. Canadian Infectious Diseases
Society. Norfloxacin: a new quinolone. Canadian Medical Association Journal, v.
139, p. 305-307, 1988.
MASUNARI, A.; TAVARES, L. C.; Estudos de QSAR-3D em derivados 5-nitro-2tiofilidênicos com atividadefrente a Staphylococcus aureus multi-resistentes. Revista
Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 43, n. 2, p. 281-294, 2007.
65
MENEZES, E. A.; SILVEIRA, L. A.; CUNHA, F. A.; CAVALCANTE, M. S.; TEIXEIRA,
A. B.; OLIVEIRA,I. R. N.; SALVIANO, M. N. C. Perfil de resistência aos
antimicrobianos de Pseudomonas isoladas no Hospital Geral de Fortaleza. Revista
Brasileira de Análises Clínicas, v. 35, n. 4, p. 177-180, 2003.
MIMS, C. ;PLAYFAIR, J.; ROITT, I.; WAKELIN, D.; WILLIANS, R. Microbiologia
Médica, 2 ed. Manole: São Paulo, 1999.
MURRAY, P.; KOBAYASHI, G.; ROSENTHAL, K.; PFALLER, M. Microbiologia
médica. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.
NASCIMENTO, G. G. F.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C.; SILVA, G. L. Antibacterial
activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria.
Brazilian Journal of Microbiology, v. 31, n. 2, p. 247-256, 2000.
NICKEL, A.J.Momagement of urinary tract e infections: historiacal perspechve and
current strateges:part 2-modern management. Journal of Urology, v. 173, n.1,
p.27-32, 2005.
OLSEN, K. M.; NIELSEN, M. G.; YUE, M.; SNITILY, M. U.; PREHEIM, L. C. Effect of
ethanol of fluoroquinolone efficacy in a rat model of Pneumococcal Pneumonia.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 50, p. 28-34, 2006.
OLIVEIRA, C. M. Uso racional de antimicrobianos. In: PEDROSA, E. R. P.; ROCHA,
M. O. C. Antibioticoterapia. Rio de Janeiro: MEDSI, v. 4, p. 755-768, 2001.
O'RIORDAN, K.; LEE. J.C. Staphylococcus aureus Capsular Polysaccharides.
Clinical Microbiology Reviews, v. 17, n. 1, p. 218-234, 2004.
PAGE, M. I.; BADARAU, A. The mechanisms of catalasys by metallo β-lactamases.
Bioinorganic Chemistry and Applications, v. 2008, n. 576297, 2008.
PATRICK, G.L. An introduction to medicinal chemistry. Lry. New York. Oxford
University Press. 1995.
PLETZ, M. W. R.; MCGEE, L.; VAN BENEDEN, C. A.; PETIT, S.; BARDSLEY, M.;
BARLOW, M.; KLUGMAN, K. P. Fluoroquinolone Resistance in Invasive
Streptococcus pyogenes Isolates Due to Spontaneous Mutation and Horizontal Gene
Transfer. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 50, n. 3, p. 943-948, 2006.
POWERS, J.H. Antimicrobial drug development – the past, the present, and the
future. Clinical Microbiology Infectious Disease, v.10, n. 4, p.23-31, 2004.
RANG, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M.; MOORE, P. K. Farmacologia. 5 ed. Rio
de Janeiro: Elsevier, 2003.
66
REMONATTO, G.; BOLZAN,V.; ZANCHI, A. C.; D'AZEVEDO, P. A. Detecção
Molecular da Resistência Bacteriana-Ênfase para Enterococcus e Streptococcus.
NewsLab, n. 70, p. 100-112, 2005.
RONER, M. R.; CARRAHER, C. E.; ROEHR, J. L.; BASSETT, K. D.; SIEGMANNLOUDA, D. W. Anti-Viral activity of Norfloxacin and Ampicillin and Dibutyltin Polymers
Derived From Norfloxacin and Ampicillin Against Reovirusus ST3, Vaccinia Virus,
Herpes Simplex Virus (HSV-1) And Varicela Zoster Virus (VZV). Polymeric
Materials-Science, v. 91, p. 744-746, 2004.
ROTHLIN, R. P. Quinolonas - Revision historica. International Standard Serial
Number 0025-7680, n. 59 (Supl I), p. 3-7, 1999.
RUSSEL B., A. D.; I CHOPRA, M. A. Understanding antibacterial action and
resistance. New York: E. Horwood Ltd, 1990.
SADER, H. S.; MENDES, R. E.; GALES, A. C.; JONES, R. N.; PFALLER, M. A.;
ZOCCOLI, C.; SAMPAIO, J. Perfil de sensibilidade a antimicrobianos de bactérias
isoladas do trato respiratório baixo de pacientes com pneumonia internados em
hospitais brasileiros Resultados do Programa SENTRY, 1997 e 1998. Jornal de
Pneumologia, v. 27, n. 2. p. 59-67, 2001.
SALEM, H; FADA, L; KHATER, W. Spectrofluorimetric Determination of Certain
Fluoroquinolones Through Charge Transfer Complex Formation. American Journal
of Pharmacology and Toxicology, v. 2, n. 1, p. 18-25, 2007.
SCHAECHTER, M.; ENGLEBERG, N. C.; EISENSTEIN, B. I.; MEDOFF, G.
Microbiologia: Mecanismos das doenças infecciosas. 3. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2002.
SIEGMUND, K.; MAHESHWARY, S.; NARAYANAN, S.; CONNORS, W.; RIEDRICH,
M.; PRINTZ, M.; RICHERT, C. Molecular details of quinolone-DNA interactions:
solution structure of an unusually stable DNA duplex with covalently linked nalidixic
acid residues and non-covalent complexes derived from it. Nucleic Acids Research,
v. 33, n. 15, p. 4838-4848, 2005.
SILVA, A.; MACHADO, P.; , V.; DUARTE, A. Bactérias uropatogénicas identificadas
de cistites não complicadas de mulheres. Acta Urológica, v. 25, n. 3, p. 9-14, 2008.
SOARES, M. A. Resistência antibiótica. Pharmacia Brasileira, v. jan./fev., p.60-62,
2001.
SOUZA, K. C. Síntese e avaliação de atividade imunomodulatória preliminar de
precursores e derivados do norfloxacin. Itajaí, 2009. Trabalho de Conclusão de
Curso em Farmácia, Univali, 2009. 41p.
67
SOUZA, M.M.; BELLA CRUZ, A.; SCHUHMACHER, M. B.; KREUGER, M. R. O.;
FREITAS, R. A.; BELLA CRUZ, R. C. Métodos de Avaliação Biológica de produtos
naturais e sintéticos. In: BRESOLIN, T. M. B.; CECHINEL FILHO, V. (Editores)
Ciências Farmacêuticas: Contribuição ao Desenvolvimento de novos
Fármacos e Medicamentos. Editora UNIVALI, Itajaí, 2003.
SOUZA, M. V. N. de; ALMEIDA, M. V.; SILVA, A. D.; COURI, M. R. C. Ciprofloxacina,
uma importante fluorquinolona no combate ao antraz. Revista. Brasileira de
Farmácia, v. 85, n. 1, p. 13-18, 2004.
SUN, H-W.; LI, L. Q.; CHEN, X. Y.; SHI, H. M.; LÜ, Y. K. Determination of norfloxacin
by flow injection analysis with chemiluminescence detection. Canadian Journal of
Analytical Sciences and Spectroscopy, v. 51, n. 2, p. 100, 2006.
SUNDSFJORD, A.; SIMONSEN, G. S., HALDORSEN, B. C.; HAAHEIM, H.;
HJELMEVOLL, S-O.; LITTAUER, P.; DAHL, K. H. Genetic methods for detection of
antimicrobial resistance. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica
Scandinavica, v. 112, p. 815-837, 2004.
TAVARES, W. Manual de Antibióticos e Quimioterápicos Antiinfecciosos. 2 ed.
Atheneu: São Paulo, 1999. 792p.
TAVARES, L. C. QSAR: a abordagem de Hansch. Química Nova, v. 27, n. 4, p.
631-639, 2004.
TENOVER, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. The American
Journal of Medicine, v.119, n. 6 A, p. S3-S10, 2006.
TOPLISS, J. G. A manual method for applying the Hansch approach to drug design.
Journal of Medical Chemical, v. 20, p. 463-469, 1977.
TONKIC, M.; BARISIC, I. G.; PUNDA-POLIC, V. Prevalence and antimicrobial
resistance of extended-spectrum ß-lactamases-producing Escherichia coli and
Klebsiella pneumoniae strains isolated in a university hospital in Split, Croatia.
International Microbiology, v. 8, p. 119-124, 2005.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. l. Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre:
Artes Médicas Sul, 2000.
TORRES, J. C. N.; MENEZES, E. A.; ÂNGELO, M. R. F.; OLIVEIRA, I. R. N.;
SALVIANO, M. N. C.; XAVIER, D. E.; FILHO, L. S. Cepas de Pseudomonas spp.
produtoras de metalo-betalactamase isoladas no Hospital Geral de Fortaleza. Jornal
Brasileiro de Patologia Médica e Laboratorial, v. 42, n. 5, p. 313-319, 2006.
TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O. F.; CANDEIAS, J. A. N.
Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005.
68
TSE-DINH Y-C. Bacterial topoisomerase I as a target for discovery of antibacterial
compounds. Nucleic Acids Research, v. 37, n. 3, p. 731-737. 2009.
UPADHYAY, S. K.; KUMAR, P.; ARORA, V. Complexes of quinolone drugs norfloxacin
and ciprofloxacin with alkaline earth metal perchlorates. Journal of Structural
Chemistry, v. 47, n. 6, p. 1089-1093, 2006.
VISCONTI, T.; GARRIGUES, T. M.; CANTÓN, E. Quinolonas y Streptococcus
pneumoniae. Mecanismo de acción y resistência. Revista. Espanhola de
Quimioterapia, v. 15, n 4, p. 313-324, 2002.
WOLFSON, J. S.; HOOPER, D. C. Fluoroquinolone antimicrobial agents. Clinical
Microbiology Reviews, v. 2, n. 4, p. 378-424, 1989.
ZAVADINACK-NETO, M.; HERREIRO, F.; PERALTA, C. O. B.; YOSWHIRO I.;
CIORLIN, E.; SAQUETI, E. E.; ANSILIEIRO, I. J.; GONSALVES, L.; SIQUEIRA, V. L.
D. Staphylococcus aureus: incidência e resistência antimicrobiana em abcessos
cutâneos de origem comunitária. Acta Scientiarum, v. 23, n. 3, p. 709-712, 2001.
ZHAO, XILIN; XU, CHEN; DOMAGALA, JOHN; DRLICA, KARL. DNA Topoisomerase
targets of the fluoroquinolones: A strategy for avoiding bacterial resistance.
Proceedings of the National Academy of Sciences, v.94, n. 25, p. 13991-13996.
1997.