lígia fernandes gundim expressão de her

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
LÍGIA FERNANDES GUNDIM
EXPRESSÃO DE HER-2 EM TUMORES MAMÁRIOS DE GATAS
UBERLÂNDIA
2017
LÍGIA FERNANDES GUNDIM
EXPRESSÃO DE HER-2 EM TUMORES MAMÁRIOS DE GATAS
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias,
da
Faculdade
de
Medicina Veterinária, da Universidade
Federal de Uberlândia, como exigência
parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Saúde Animal
Orientadora: Profa. Dra. Alessandra
Aparecida Medeiros-Ronchi
UBERLÂNDIA
JANEIRO – 2017
Agradecimentos
A Deus por ter me dado a vida e condições para conseguir chegar até aqui.
Aos meu pais, Célia e Joaquim, pelo amor, exemplo, dedicação, por sonharem
comigo e me mostrarem que o estudo é o melhor caminho. Nossos encontros aos
fins de semana é o que me enche de energia para continuar seguindo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
bolsa de mestrado.
À professora Alessandra, minha orientadora, exemplo profissional e pessoal.
Obrigada pelos ensinamentos, conselhos, amizade, confiança e oportunidade de
trabalhar ao seu lado.
À equipe do Laboratório de Patologia Animal, obrigada pelo apoio, em especial
professores Márcio e Matias e aos amigos Mariana, Tais Meziara, William, Erica e
Igor, sem vocês para me ajudar e me ouvir não teria a menor graça.
À minha família que sempre torceu por mim, em especial Izabel e Misael, pelo
incentivo e pelo orgulho que têm ao falar do meu mestrado.
RESUMO
As neoplasias mamárias são o terceiro tipo mais frequente de neoplasias em felinos
e a busca por fatores prognósticos para este tipo de tumor nas gatas tem se
intensificado nos últimos anos, dada sua alta frequência e relevância na clínica de
felinos. Dentre os marcadores imunohistoquímicos utilizados para prognóstico
destaca-se o receptor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (Human
Epidermal Growth Factor Receptor type 2 – Her-2) que em mulheres está associado
a um pior prognóstico. Objetivou-se avaliar a expressão de Her-2 em hiperplasias e
neoplasias mamárias, benignas e malignas, de gatas e relacionar a expressão ao tipo
e grau histológico dos carcinomas mamários. Foram selecionados 38 casos de
neoplasias e hiperplasias mamárias de gatas, no período de 2006 a 2016. A partir dos
protocolos selecionados obteve-se informações epidemiológicas e características
macroscópicas das lesões nas mamas. Os tumores foram individualmente
classificados e graduados histologicamente por dois patologistas. A expressão de Her2 foi determinada por imunohistoquímica, por meio de análise semi quantitativa das
lâminas conforme escore recomendado pelo Herceptest (Dako). Utilizou-se Teste Quiquadrado (χ2) para avaliação da relação entre expressão de Her-2 e tipo de lesão
mamária, tipos histológicos de carcinoma e grau histológico (P<0,05). A idade média
dos animais foi de 8,5 anos e as gatas jovens foram acometidas somente por
hiperplasias e neoplasias benignas. Gatas sem raça definida foram mais acometidas
(84,37%), seguida por siamês (9,37%) e persa (6,25%). Quanto à classificação
histológica, 18,42% das lesões mamárias foram classificadas como hiperplasia,
18,42% como adenoma e 63,16% foram classificadas como carcinoma. O tipo de
carcinoma mais comum foi o carcinoma tubulopapilar (66,7%), seguido por carcinoma
sólido (25%) e carcinoma cribriforme (8,33%). Observou-se superexpressão de Her-2
em 4 amostras (16,7%) de carcinoma do tipo tubulopapilar, sendo dois carcinomas
grau I e dois graduação II, todavia não houve relação entre a expressão de Her-2 e o
tipo de lesão mamária (p=0,3127), tipo de carcinoma (0,3467) ou grau histológico
(0,6485). Conclui-se que o percentual de carcinomas mamários de gatas que
expressam Her-2 é menor que no câncer de mama da mulher e não houve relação
entre grau e tipo histológico e expressão de Her-2.
PALAVRAS-CHAVE: c-erbB-2/neu, felino, neoplasia mamária.
ABSTRACT
Mammary neoplasms are the third most frequent type of neoplasm in felines and the
search for prognostic factors for this type of tumor in cats has intensified in recent
years, given its high frequency and relevance in feline clinics. Among the
immunohistochemical markers used for prognosis, the Human Epidermal Growth
Factor Receptor type 2 (Her-2) receptor, which in women is associated with a worse
prognosis, stands out. The objective of this study was to evaluate the expression of
Her-2 in hyperplasias and benign and malignant neoplasms of cats and to relate the
expression to the type and histological grade of mammary carcinomas. Thirty-eight
cases of neoplasia and mammary hyperplasia of cats were selected from 2006 to 2016.
From the protocols selected, epidemiological information and macroscopic
characteristics of mammary lesions were obtained. Tumors were individually classified
and graded histologically by two pathologists. Her-2 expression was determined by
immunohistochemistry, using a semi-quantitative analysis of the slides according to
the Hercepest (Dako) recommended score. The Chi-square test (χ2) was used to
evaluate the relationship between Her-2 expression and type of mammary lesion,
histological types of carcinoma and histological grade (P <0.05). The mean age of the
animals was 8.5 years and young cats were affected only by benign hyperplasias and
neoplasms. Undefined cats were more affected (84.37%), followed by Siamese
(9.37%) and Persian (6.25%). Regarding the histological classification, 18.42% of the
mammary lesions were classified as hyperplasia, 18.42% as adenoma and 63.16%
were classified as carcinoma. The most common type of carcinoma was
tubulopapillary carcinoma (66.7%), followed by solid carcinoma (25%) and cribriform
carcinoma (8.33%). Her-2 overexpression was observed in 4 samples (16.7%) of
tubulopapillary carcinoma, two carcinomas grade I and two degrees II, but there was
no relationship between Her-2 expression and type of mammary lesion (P = 0.3127),
carcinoma type (0.3446) or histological grade (0.6485). It is concluded that the
percentage of female mammary carcinomas expressing Her-2 is lower than in women's
breast cancer and there was no relation between grade and histological type and Her2 expression.
KEY WORDS: c-erbB-2 / neu, feline, mammary neoplasia.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1
1
INTRODUÇÃO............................................................................................. 8
2
REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 9
2.1 Anatomia...................................................................................................... 9
2.2 Histologia.................................................................................................... 10
2.3 Lesões não neoplásicas............................................................................. 11
2.4 Neoplasias mamárias na gata.................................................................... 11
2.5 Classificação e graduação histológica ....................................................... 12
2.6 Fatores prognósticos.................................................................................. 14
2.7 Her-2........................................................................................................... 16
2.8 Diagnóstico................................................................................................. 21
2.9 Tratamento.................................................................................................. 21
REFERÊNCIAS................................................................................................ 23
CAPÍTULO 2 – Expressão de HER-2 em lesões mamárias de gatas e relação com
fatores de prognóstico...................................................................................... 31
8
1. INTRODUÇÃO
A longevidade dos animais domésticos tem aumentado consideravelmente
devido à melhor qualidade de vida, melhor nutrição e vacinas e tratamentos para
doenças infecciosas que anteriormente eram letais. Com este aumento, nota-se
também maior incidência de neoplasias (GIORGI, 2012).
Os tumores mamários são o terceiro tipo de neoplasia mais frequente em gatas
(MACEWEN, 1990), correspondendo a 17% das neoplasias nesta espécie (SEIXAS
et al., 2011). Dentre esses, o tipo mais frequente é o carcinoma tubulopapilar, seguido
pelo carcinoma sólido e carcinoma cribriforme (MISDORP et al., 1999). Lesões
proliferativas não-neoplásicas, como as hiperplasias, são alterações de mama
comuns em gatas e que podem ser confundidas com tumores. Dentre estas destacase a hiperplasia fibroepitelial, cuja etiologia está relacionada ao uso de progestágenos
(CARPENTER, 1987).
Muitos fatores prognósticos já estão estabelecidos para estes tumores como:
estádio clínico, tamanho tumoral (ITO et al., 1996), grau histológico (HUGHES,
DOBSON, 2012; DE CAMPOS et al., 2015), taxa de mitose (HUGHES, DOBSON,
2012; PREZIOSI et al., 2002) e invasão linfovascular (SEIXAS et al., 2011).
Entretanto, Hughes e Dobson (2012) destacam a necessidade de investigação de
marcadores imunohistoquímicos tanto para fornecer informações clínicas quanto para
entender a patogênese molecular das neoplasias.
O proto-oncongene Her-2 (fator de crescimento epidérmico humano 2) é
responsável pela codificação de uma glicoproteína transmembrana que atua como
receptor de fator de crescimento e apresenta atividade de tirosina quinase específica.
A ativação de Her-2 leva a diminuição de apoptose, proliferação celular, promoção da
angiogênese e maior ocorrência de metástase (GLEICH e SALAMONE, 2002).
Em mulheres, a superexpressão de Her-2 em tumores mamários está
relacionada à ocorrência de metástases (DHINGRA et al., 1996), maior taxa de
recidiva e mortalidade (WOLFF et al., 2007). Apesar disso, pacientes cujos tumores
superexpressam Her-2 respondem positivamente ao tratamento com trastuzumab, um
anticorpo monoclonal humanizado (HONIG et al., 2011). Em cadelas, a positividade
para Her-2 está associada a maior pleomorfismo nuclear, maior grau histológico e
maior taxa de mitoses (DUTRA et al., 2004), todavia Hsu et al. (2009) observaram
9
associação da superexpressão com maior sobrevida e Ressel et al. (2013)
questionam o valor prognóstico deste em cadelas, uma vez que lesões não
neoplásicas também superexpressaram Her-2.
Em gatas, aproximadamente 10% dos tumores mamários superexpressam Her2 e essa expressão está relacionada à maior tamanho do tumor, maior grau histológico
(ORDÁS et al., 2007) e menor sobrevida (ORDÁS et al., 2007; DE CAMPOS et al.,
2015, MILLANTA et al., 2005). Por outro lado, Rasotto et al. (2011) descrevem que
tumores malignos e benignos não apresentam diferenças na expressão de Her-2,
questionando o envolvimento deste na carcinogênese e seu valor como fator de
prognóstico em gatas.
Os carcinomas mamários em gatas apresentam semelhanças ao câncer de
mama na mulher, quanto à histopatologia (PÉREZ-ALENZA et al., 2004), padrão
metastático (MACEWEN, 1990) e ausência de dependência hormonal (DE LAS
MULAS et al., 2000), indicando que a gata pode ser um modelo animal adequado para
o câncer de mama em mulheres (DE MARIA et al., 2005). Todavia, trabalhos
abordando Her-2 em gatas ainda são escassos e mais estudos são necessários para
esclarecer seu papel como fator prognóstico.
Objetivou-se avaliar a imunoexpressão de Her-2 em hiperplasias, neoplasias
benignas e malignas em gatas e relacionar essa expressão ao tipo e grau histológico.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Anatomia
As gatas possuem quatro pares de mamas dispostas desde a região axilar até
a região inguinal, sendo denominadas torácica cranial, torácica caudal, abdominal
cranial, abdominal caudal (RAHARISON e SAUET, 2006). A mama é composta por
glândulas sudoríparas modificadas contendo ductos que ligam massas de epitélio
secretor envolvido por tecido conjuntivo, gordura, vasos e nervos (DYCE, 2004).
Quanto à drenagem linfática, inicialmente foi descrito que as glândulas
mamárias torácicas drenavam para o linfonodo axilar, enquanto as abdominais para o
10
linfonodo inguinal (SILVER, 1966). Entretanto, Raharison e Sauet (2006)
demonstraram que a drenagem da glândula torácica caudal ocorre com maior
frequência para o linfonodo axilar, podendo ainda drenar para o linfonodo inguinal,
enquanto a glândula abdominal cranial usualmente drena para o linfonodo inguinal,
todavia a drenagem pode ocorrer em ambas direções. Além disso, as glândulas
torácicas podem ainda drenar para o linfonodo esternal.
2.2 Histologia
A glândula mamária é um sistema túbulo-alveolar composto, suportado por
estroma de tecido conjuntivo e coberto por pele ligeiramente modificada. Na fêmea
não lactante, a mama é ocupada predominantemente por estroma relativamente
denso, gordura e tecido glandular (SILVER,1966).
O parênquima da glândula mamária é composto por células epiteliais
secretoras que formam os alvéolos mamários. Estes drenam para ductos pequenos
que se unem a ductos maiores até desembocarem em uma cisterna ou diretamente
no teto (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2000).
As células mioepiteliais, recobrem os alvéolos e ductos e são responsáveis pela
ejeção de leite. Os alvéolos são agrupados em lóbulos, envolvidos por um septo de
tecido conjuntivo, enquanto ao agrupamento de lóbulos dá-se o nome de lobos, estes
também rodeados por tecido conjuntivo. Apesar de comumente o conjunto de lobos
ser chamado de glândula mamária, cada lobo é de fato uma glândula (JUNQUEIRA E
CARNEIRO, 2000).
Uma particularidade da gata é que o teto é constituído por três camadas:
exterior, interior longitudinal e circular média, enquanto a cadela só possui 2 camadas
(interna circular e externa longitudinal). Além disso, a gata possui 4 a 8 ductos,
enquanto a cadela possui 8 a 20. Em ambas as espécies, o teto é composto por
músculo liso, desprovido de glândulas sudoríparas e a extremidade é protegida pelo
músculo esfíncter (SILVER,1966).
2.3 Lesões não neoplásicas
11
As lesões não neoplásicas que ocorrem na glândula mamária de gatas são
cistos,
ectasia
ductal,
fibrose,
hiperplasia
ductal
e
lobular
e
alteração
fibroadenomatosa, sendo esta última a mais frequente (MISDORP et al., 1999).
Enquanto os cistos são cavidades revestidas por células epiteliais sem
conteúdo necrótico, a ectasia ductal é a dilatação cística de ductos com acúmulo de
debris necróticos, variável número de macrófagos espumosos misturados com
material lipídico e fendas de colesterol. Já as hiperplasias, são proliferações de células
epiteliais, sendo que a hiperplasia ductal ocorre dentro do ducto, algumas vezes
levando a oclusão do lúmem e a hiperplasia lobular ocorre nos lóbulos (MISDORP et
al., 1999; GOLDSCHMIDT et al., 2011).
A alteração fibroadenomatosa, também chamada hiperplasia fibroepitelial
(CARPENTER, 1987), hipertrofia mamária felina, alteração fibroadenomatosa total ou
parcial, adenomatose mamária felina (HAYDEN et al., 1981) ou fibroadenoma juvenil
(NIELSEN, 1993) tem etiologia associada à utilização de progestágenos naturais ou
sintéticos. Macroscopicamente, uma ou mais mamas se apresentam aumentadas,
macias ou flutuantes e a pele que recobre a mama pode estar avermelhada (LORETTI
et al., 2004). Na histologia, nota-se proliferação de ductos mamários rodeados por
estroma fino e abundante (MISDORP, 2002)
2.4 Neoplasias mamárias na gata
As neoplasias mamárias benignas em gatas são classificadas como papiloma
ductal e adenoma simples, ambas com proliferação benigna da porção epitelial,
adenoma complexo, quando ocorre proliferação das células mioepiteliais e
fibroadenoma, que é a proliferação de células epiteliais luminais e células do estroma
(MISDORP et al., 1999).
As fêmeas felinas são mais acometidas por tumores mamários, no entanto 2%
das neoplasias são diagnosticadas em gatos machos. A maioria dos tumores
mamários são malignos, com proporção benigno:maligno variando de 1:9 (HAYES;
12
MILNE; MANDELL, 1981) até 1:14,27 (TOGNI et al., 2013) sendo o carcinoma o tipo
histológico mais comum.
Gatas castradas antes dos 6 meses têm redução de 91% do risco de
desenvolver carcinomas mamários em comparação à gatas não castradas e a
esterilização após 1 ano têm redução de 86% do risco (OVERLEY et al., 2005).
Ademais, a administração regular de progestágenos foi associada a um maior risco
de ocorrência de tumores malignos e benignos (MISDORP, ROMIJN, HART, 1990).
Conforme Hayes, Milne e Mandell (1981) gatas da raça siamesa são mais
acometidas com neoplasias mamárias, enquanto Costa (2010) descrevem a raça
Europeu Comum como mais prevalente em Portugal. Togni et al. (2013) e Cunha et
al. (2016) em estudos realizados no Brasil descrevem maior ocorrência em gatas sem
raça definida.
2.5 Classificação e graduação
A classificação mais utilizada para neoplasias mamárias em gatas é a do
Instituto de Patologia das Forças Armadas - Organização Mundial da Saúde (OMS)
(MISDORP et al., 1999). Nela, os tumores são classificados como: carcinoma
tubulopapilar, quando as células neoplásicas se dispõem em túbulos e papilas;
carcinoma sólido, quando as células formam uma massa compacta, dispostas em
manto e carcinoma cribriforme, no qual as células epiteliais apresentam espaços entre
elas, com aspecto de peneira. Quando a neoplasia está circunscrita pela membrana
basal, atribui-se a classificação de carcinoma in situ. Outras classificações menos
frequentes
são
carcinoma
de
células
escamosas,
carcinoma
mucinoso,
carcinossarcoma e carcinoma adenoescamoso.
Alguns autores como De Campos et al. (2015) e Seixas et al. (2011) utilizam
uma adaptação da classificação da OMS, incluindo o tipo histológico carcinoma em
tumor misto, quando o carcinoma tubulopapilar, sólido ou cribriforme era
acompanhado de proliferação mioepitelial com formação de matriz mixoide, condroide
ou cartilaginosa. Já Manesh et al. (2014) utilizou a classificação proposta por Rosen
e Oberman (1993) para tumores de glândula mamária de mulheres.
13
Com relação à agressividade dos tipos histológicos de carcinomas mamários,
Mills et al., (2015) descrevem o carcinoma cribriforme como o mais agressivo (média
de sobrevida 10 meses), seguido pelo carcinoma sólido (média 36 meses) e
carcinoma tubulopapilar (média de 61 meses).
Goldschmidt et al. (2016) relataram que o carcinoma inflamatório mamário
felino e o carcinoma micropapilar invasivo felino, recentemente descritos, estão
associados a menor sobrevida (4 a 5 meses), enquanto que os carcinomas ductais e
carcinomas papilares intraductais têm um comportamento menos agressivo (média de
35 meses de sobrevida).
Para graduação histológica destes tumores, o método mais amplamente
utilizado é o proposto por Elston e Ellis (1993), onde o grau histológico é obtido a partir
de formação tubular, pleomorfismo e número de mitoses (Tabela 1).
Tabela 1. Graduação histológica de tumores mamários segundo Elston e Ellis (1993).
Característica
Escore
Formação tubular
Maioria do tumor (>75%)
1
Moderada (10-75%)
2
Pequena ou nenhuma (<10%)
3
Pleomorfismo nuclear
Discreto
1
Moderado
2
Marcado
3
Mitoses
0a8
1
9 a 16
2
>17
3
3-5: Grau I; 6-7: Grau II; 8-9: Grau III.
2.6 Fatores de prognóstico
14
Muitos estudos têm sido realizados no sentido de estabelecer fatores
prognósticos para neoplasias mamárias felinas. Sabe-se que animais que apresentam
tumores maiores que 3 cm possuem menor sobrevida (ITO et al., 1996). Mills et al.
(2015) também descrevem maior sobrevida associada a tumores menores que dois
centímetros (média de 51 meses), enquanto animais com tumores maiores que 2 cm
apresentaram média de 19 meses de sobrevida. Por outro lado, Viste et al. (2002) não
encontraram relação entre tamanho tumoral e sobrevida e ressaltam a necessidade
de associação do tamanho a outros fatores de prognóstico.
A graduação histológica é um dos preditores prognósticos mais significativos
nos tumores mamários felinos (GOLDSCHMIDT et al., 2016). Seixas et al. (2011)
descrevem que animais com tumores grau I viveram em média 36 meses, enquanto
aqueles com tumores grau III tiveram sobrevida média de 6 meses. Da mesma forma,
De Campos et al. (2015) também descrevem menor sobrevida associada a tumores
grau III, com média de sobrevida de 54 meses em gatas com tumores grau I e apenas
2,6 meses associada a tumores grau III. As neoplasias classificadas como grau II não
possuem prognóstico bem estabelecido (CASTAGNARO et al., 1998a)
Com respeito à idade, a incidência de tumores mamários em gatas aumenta
após os 6 anos e o pico de ocorrência é entre 10 a 11 anos (GIMÉNEZ et al., 2010.
Hayes, Milne e Mandell (1981) relatam que em gatas mais velhas é mais frequente a
ocorrência de tumores malignos que benignos. Por outro lado, Mills et al. (2015) não
observaram associação entre a idade do diagnóstico e a sobrevida, sendo que
animais com idade ≤ 11 anos viveram em média 15 meses após a cirurgia e os >11
anos mostraram média de 14 meses de sobrevida.
Quanto ao estadiamento clínico, gatas com estádio clínico 4 possuem pior
prognóstico, com sobrevida em média de 1 mês. Animais com estádio clínico 1
sobrevivem em média 29 meses, estádio 2, 12,5 meses e estádio 3 possuem média
de 9 meses (Ito et al., 1996). Seixas et al. (2011) associando o estadiamento à
graduação histológica, relatam ainda que animais com estádio 3 possuem também
graduação histológica maior (grau III).
O índice mitótico é considerado um indicador prognóstico independente para
neoplasias mamárias (HUGHES E DOBSON, 2012). Preziosi et al. (2002) relataram
que 70% dos animais com baixo grau de proliferação (índice mitótico ≤0.72) estavam
15
vivos até 24 meses após a cirurgia e dentre os animais com alto grau de proliferação
(índice mitótico>0.72), apenas 10% sobreviveram nesse período. Do mesmo modo,
Seixas et al. (2011) descreveram que gatas com índice mitótico ≤1.1 viveram em
média 13 meses e animais com índice mitótico ≥1.1 possuíam sobrevida média 7
meses.
Os Agnors (regiões organizadoras nucleares marcadas por nitrato de prata) são
utilizados para marcação de proliferação celular. De Vico et al. (1995) não
encontraram associação entre marcação de Agnor e outros fatores prognósticos para
tumores de mama em gatas como tipo histológico, estádio tumoral, grau de atipia
nuclear e taxa de mitose. Já Castagnaro et al. (1998b) estudando apenas carcinomas,
analisou 100 células no aumento de 100x e descreveram que 78% das gatas que
apresentaram contagem de Agnor até 5.9/campo tumoral permaneceram vivas após
um ano da cirurgia e dentre as que apresentaram contagem maior que 5.9 apenas
22%. Preziosi et al. (2002) afirmam ainda que dentre os animais com contagem de
Agnor ≤3.19/campo, 65% estavam vivos dois anos após a cirurgia, enquanto aqueles
com contagem<3.19, apenas 25% não haviam morrido.
O Ki-67 também é um marcador de proliferação celular, cuja expressão é mais
intensa em carcinomas do que em tumores benignos e maior também em mamas
hiperplásicas que em mamas normais (PEREIRA et al., 2004). Silva et al. (2016)
descreveram índice Ki-67 médio de 27,5%, não encontraram relação entre contagem
Ki67 e tipo e grau histológico, todavia a contagem de Ki67 estava aumentada em
tumores com sinais de necrose.
Já Castagnaro et al. (1998b) verificaram que animais com tumores que
expressam mais ki67, têm pior prognóstico, sendo que dentre os que tinham
neoplasias com índice Ki67 ≤ 25,2, 87,5% permaneceram vivos um ano após a
cirurgia, percentual que diminui para 12,5% naqueles que apresentaram índice ≥25,2.
Quanto aos marcadores hormonais, De Las Mulas et al. (2000) descreveram
que 33% das hiperplasias mamárias eram positivas para receptor de estrógeno e
progesterona, enquanto nas neoplasias malignas, 16,67% foram positivas. A menor
expressão de receptores de estrógeno por carcinomas mamários também foi relatada
por Brunetti et al. (2013), que observaram que 9,52% dos carcinomas (tipos sólido e
tubulopapilar) em gatas expressaram receptor de estrógeno e 42,86% expressaram
16
receptor de progesterona. Do mesmo modo, Millanta et al. (2005) relataram que
mamas sem alterações, hiperplásicas e com neoplasias benignas apresentam maior
expressão de receptor de estrógeno e que lesões displásicas e in situ apresentam
maior expressão do receptor de progesterona. Entretanto, ao contrário do que ocorre
em humanos, não houve relação entre ausência de expressão e menor sobrevida.
2.7 Her-2
O Her-2 pertence à família dos receptores do fator de crescimento epidérmico
(EGFR). Esta família é composta por quatro proteínas (HER1, HER-2, HER3 e HER4),
que funcionam como receptores, apresentando atividade tirosina quiinase (AKIYAMA
et al., 1986). Em humanos, o gene responsável pela expressão do Her-2 se encontra
na banda q21 do cromossomo 17 e codifica uma proteína transmembrana de 185 kDa
que atua como receptor de fator de crescimento (SLAMON, 1989) e apresenta três
domínios: o extracelular, o transmembranar e o intracelular. O domínio extracelular é
composto, por sua vez, por quatro subdomínios: L1, CR1, L2 e CR2 (I, II, III, IV), que
se dispõem numa repetição em tandem de 2 unidades, separadas por resíduos ricos
em cisteína. Este domínio extracelular contém um local de ligação para o ligando e
regula a dimerização induzida por este. O domínio transmembrana é composto por
uma hélice α de natureza hidrofóbica. O domínio intracelular é formado por uma região
citoplasmática com um domínio altamente conservado e uma cauda C-terminal
regulatória (KRAUS et al., 1989). Este domínio apresenta atividade tirosina quiinase e
os locais para autofosforilação que a regulam.
Em gatas, o gene Her-2 correspondente possui 92% de similaridade ao humano
(DE MARIA et al., 2005) e está localizado no cromossomo E-1 (GenBank, 2013).
A ativação de Her-2 não depende de um ligante extracelular, mas sim da
formação de dímeros (Her-2:2) ou heterodímeros (Her-2:Her-3) (EARP et al., 1995).
Esta ativação resulta em diminuição de apoptose, proliferação celular, promoção da
angiogênese (GLEICH; SALAMONE, 2002), diferenciação, adesão e motilidade
celular (SCHNITT, 2001).
17
Os métodos de diagnóstico recomendados pela FDA (Food and Drug
Adminstration - USA) são imunohistoquímica, FISH (hibridização fluorescente in situ)
e CISH (hibridização in situ cromogênica) (MENG et al., 2004). A técnica
imunohistoquímica consiste na detecção de antígenos através da ligação específica a
anticorpos e duas formas de avaliação de imunomarcação para Her2 foram propostas,
ambas considerando positivas apenas marcação na membrana. Conforme o manual
Herceptest®, são considerados positivos os tumores com escore 2+ (coloração fraca
a moderada em toda a circunferência da membrana, observada em mais de 10% das
células tumorais) e 3+ (coloração intensa em toda a membrana, observada em mais
de 10% de todas as células tumorais), enquanto no método proposto pela American
Society of Clinical Oncology, apenas tumores escore 3+ são considerados positivos e
as neoplasias classificadas como 2+ são consideradas suspeitas (WOLFF et al.,
2013).
Cuello-Carrion et al. (2015) observaram que em condições estressantes, como
a administração de cadmo e H202, a imunomarcação para Her-2 pode migrar para o
citoplasma e áreas perinucleares e Korlinova et al. (1992) relataram que a marcação
citoplasmática pode ocorrer devido à internalização e degradação do c-erbB-2 nos
compartimentos lisossômicos.
Aproximadamente 20% dos tumores
mamários
em
mulheres
superexpressam Her-2 na membrana celular (DE POTTER, 1994; MOLINA et al.,
1991). A superexpressão de Her-2 está associada à amplificação gênica em 90% dos
casos (BÁNKFALVI et al., 2000; DOWSETT et al., 2003). A amplificação gênica é
analisada através das técnicas de FISH e CISH no cromossomo 17, local onde que
está localizado o gene Her-2 (HANNA et al., 2014). A FISH é considerada padrãoouro para determinação de status Her-2 e é recomendada pela FDA quando o tumor
apresenta escore 2+ ou 3+ na imunohistoquímica (NUNES, 2013).
A técnica tradicional de FISH consiste em utilização de uma única sonda, no
entanto Luoh et al. (2013) consideram que 5 a 10% dos cânceres primários com
amplificação de Her-2 e sem superexpressão são falso-positivos, devido à incompleta
amplificação da região menor de Her-2 e recomendam a utilização de várias sondas
para aumentar a acurácia. Iorfida et al. (2012) relataram ainda que 13% das pacientes
com status Her-2 1+ mostraram amplificação gênica e recomendam a utilização de
18
FISH em tumores que apresentem alto grau histológico, alto índice proliferativo,
ausência de expressão de receptores hormonais e presença de invasão vascular.
Um outro método de diagnóstico de Her-2 foi proposto por Meng et al. (2004),
no qual células cancerígenas circulantes são detectadas no sangue e o status Her-2
destas células avaliado por FISH, sendo que houve concordância de 97% entre o
status Her-2 do tumor primário e das células circulantes.
Mulheres com tumores que superexpressam Her-2 estão mais propensas a
desenvolver metástases (DHINGRA et al., 1996), além de apresentarem maior taxa
de recidiva local (NGUYEN et al., 2008), menor tempo livre da doença (MONTAGNA
et al., 2013), maior mortalidade (WOLFF et al., 2007) e maior resistência ao tratamento
com quimioterapia e radioterapia (ROSS e GRAY, 2002).
Apesar de estar associada a maior agressividade e pior prognóstico, a
superexpressão de Her-2 é fator preditivo em câncer de mama em mulheres. Da
mesma forma que tumores positivos para imunomarcação de estrógeno e receptor de
progesterona são susceptíveis à tratamento hormonal, tumores com superexpressão
deste marcador possuem resposta positiva ao tratamento com trastuzumab (HONIG
et al., 2011). O trastuzumab é um anticorpo monoclonal dirigido ao domínio
extracelular da proteína Her-2 aprovado pela FDA em 1998 como tratamento para
cânceres Her-2 positivo (ROMOND et al., 2005).
Korkaya et al. (2008) sugerem que os efeitos da amplificação de Her-2 na
carcinogênese, tumorigênese e invasão podem ser devido aos seus efeitos em células
tronco mamárias normais e malignas. Estes autores demostraram que em ratos, a
superexpressão de Her-2 em linhagens celulares de carcinoma mamário estava
associada ao aumento da expressão de ALDH (aldeído desidrogenase humana), uma
proteína responsável pela oxidação de aldeídos intracelulares e utilizada para o
isolamento das células-tronco tumorais. A supexpressão de Her-2 mostrou ainda
associação com aumento da invasão e da tumorigênese in vitro.
Além dos carcinomas mamários, a superexpressão de Her-2 também é fator
prognóstico em outros tumores, tais como tumores de origem epitelial em ovário, nos
quais é associada a um menor tempo de sobrevida (BERCHUCK et al., 1990), e
câncer de endométrio, em que está associado ao aumento da mortalidade devido à
neoplasia (BERCHUCK et al., 1991). Já em carcinomas hepatocelulares, a expressão
19
de Her-2 foi insignificante e o tratamento com trastuzumab não mostrou resultado
satisfatório (HSU C. et al., 2002).
Em cadelas, vários estudos foram feitos no sentido de elucidar o papel do Her2 nas neoplasias mamárias. Cerca de 17% a 35% das neoplasias mamárias são
positivas para Her-2, no entanto, a importância deste imunomarcador como fator
prognóstico permanece incerta nesta espécie (DE LAS MULAS et al., 2003; HSU W.
et al., 2009; BURRAI et al., 2015).
Dutra et al. (2014) descreveram associação de superexpressão de Her-2 e
maior pleomorfismo nuclear, maior grau histológico e maior taxa de mitoses. Ao
contrário do que é observado em mulheres, nas quais a superexpressão está
associada à menor taxa de sobrevida, Hsu W. et al. (2009) descreveram que em
cadelas esta está associada ao aumento da sobrevida e Ressel et al. (2013)
observaram superexpressão tanto em tumores malignos quanto em lesões não
neoplásicas.
Quanto à expressão gênica de Her-2 em cadelas, Burrai et al. (2015), através
de PCR em tempo real, observaram que a glândula mamária normal apresentou
menor expressão quando comparada a adenoma simples e carcinoma simples, no
entanto não houve diferença entre a expressão em tumores benignos e malignos. Já
De Las Mulas et al. (2003) observaram que 17,6% dos carcinomas mamários em
cadelas superexpressaram Her-2, no entanto não houve amplificação genética por
hibridação in situ cromogênica (CISH) como ocorre em mulheres.
A positividade para Her-2 em neoplasias mamárias felinas está associada ao
maior tamanho tumoral, maior grau histológico e ausência de expressão para
receptores hormonais (ORDÁS et al., 2007), menor tempo de sobrevida (DE CAMPOS
et al., 2015) e devido às semelhanças histopatológicas, ausência de dependência
hormonal na maioria dos tumores e expressão de Her-2 pode ser usada como modelo
animal para câncer de mama em mulheres (DE MARIA et al., 2005). Por outro lado, a
expressão de Her-2 não apresenta relação com marcação para ki67 e p53 e nem
diferença entre a imunoexpressão em tumores benignos e malignos (Rasotto et al.,
2011), questionando o papel do Her-2 na carcinogênese e prognóstico em gatas.
A amplificação gênica em carcinomas mamários felinos é baixa. Ordás et al.
(2007) descreveram que apenas 16% dos tumores Her-2 positivos possuíam
20
amplificação gênica, número muito inferior ao observado em mulheres, mas sugerem
que a gata pode ser usada como modelo para câncer de mama que não apresenta
amplificação gênica. Da mesma forma, Soares et al. (2013) observaram que 33% dos
carcinomas mamários superexpressaram Her-2, no entanto a amplificação gênica não
foi observada, pois apenas um ou dois sinais do gene foram detectados por núcleo.
Com respeito à transição epitélio-mesênquima em felinos, Karabolovski et al.
(2015) observaram que a diminuição de expressão de marcadores epiteliais
(citoqueratina) e de adesão (E-caderina) e aumento da expressão de vimentina
(marcador de células mesenquimais) foi mais freqüentemente observado em
carcinomas de maior malignidade, o que indica a ocorrência de alterações sugestivas
de transição epitélio-mesenquima em carcinomas mamários de gatas. Todavia, não
há estudos que abordem a associação de transição epitélio-mesênquima e
superexpressão de Her-2 como em mulheres.
A transição epitélio-mesenquimal ocorre em carcinomas mamários em
mulheres e é caracterizada por transformação de características epiteliais para
fenótipo mesenquimal, que facilita a ocorrência de metástases. Células tumorais
circulantes com aumento de EMT-TFs (fatores de indução de transcrição transição
epitélio mesenquima) foram isoladas a partir de sangue periférico de pacientes Her-2
positivas e pacientes com EMT-TFs em células tumorais circulantes tinham mais
células ALDH + e CD133 + (GIORDANO et al., 2012).
2.8 Diagnóstico
O diagnóstico clínico de neoplasias mamárias é feito pela palpação das
glândulas mamárias e a citologia por agulha fina pode ser utilizada como teste de
triagem, tanto para avaliação das mamas afetadas, quanto dos linfonodos regionais.
As vantagens deste exame são o baixo custo, agilidade nos resultados, eliminação de
diagnósticos diferenciais, como mastites e hiperplasias, além de mostrar forte
correlação com a histopatologia (SHAFIEE et al.,2013; MANESH et al., 2014).
21
Já o exame histopatológico, possibilita a avaliação da arquitetura do tecido,
permitindo a graduação e classificação histológica destes tumores, o que contribui
para uma melhor avaliação prognóstica. Na histopatologia, pode-se ainda avaliar a
presença êmbolos neoplásicos em vasos ou metástase em linfonodos, caso estes
forem coletados (SHAFIEE et al., 2013). Exames radiológicos de tórax nas projeções
látero-lateral direita e esquerda e ventro-dorsal, podem ser utilizados para avaliar a
presença de metástases à distância (GIMÉNEZ et al., 2010).
2.9 Tratamento
Ao contrário do cão, em que ressecções mais conservadoras podem ser
apropriadas em alguns casos, a maioria das gatas com neoplasia mamária maligna
necessita de mastectomia unilateral ou bilateral (GIMÉNEZ et al., 2010). Macewen et
al. (1984) afirmam ainda que animais submetidos a cirurgia radical tem maior tempo
livre da doença se comparados aos que fizeram cirurgia conservativa ao contrário de
Ito et al. (1996) não encontraram diferença estatística na sobrevida de gatas
submetidas a mastectomia parcial ou total.
Usualmente, o linfonodo inguinal é removido juntamente à cadeia mamária e a
exérese do linfonodo axilar só é recomendada caso este se apresentar aumentado ou
com metástase comprovada por citologia (LANA et al., 2007), todavia, Morris (2013)
descreve não haver evidências que a exérese nodal intervenha na sobrevida.
Os benefícios do uso da quimioterapia como adjuvante à excisão cirúrgica de
tumores mamários em gatas ainda não estão claros (MORRIS, 2013). Mauldin et al.
(1988) relatam citorredução com utilização de doxorrubicina e ciclofosfamida e Mcneill
et al. (2009) descrevem que os animais tratados com doxorrubicina apresentaram
maior tempo de sobrevida e maior tempo livre da doença, assim como Novosad et al.
(2006) que relatam maior média de sobrevida em gatas que foram tratadas
cirurgicamente e utilizaram doxorrubicina.
Por outro lado, Ito et al. (1996) observaram prognóstico pior nas gatas tratadas
com ciclosporina e/ou vincristina. Não há relatos de uso de quimioterápicos anti-
22
estrogênio, como o tamoxifeno, visto que a maior parte dos tumores felinos não
possuem receptores de estrógeno (MORRIS, 2013).
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31
Capítulo 2 - Expressão de Her-2 em lesões mamárias de gatas e relação com
fatores de prognóstico
Artigo nas normas da revista Pesquisa Veterinária Brasileira
32
Expressão de Her-2 em neoplasias mamárias de gatas e avaliação de seu potencial
prognóstico1
Lígia F. Gundim2*, Taís M. Wilson2, William T. Blanca2, Nicolle P. Soares2, Mariana R. Castro3,
Igor P. Castro2, Alessandra A. Medeiros-Ronchi3
ABSTRACT.– GUNDIM L.F., WILSON T.N., BLANCA W.T., SOARES N.P., CASTRO M.R., IGOR DE
PAULA CASTRO MEDEIROS-RONCHI A.A. 2017. [Her-2 expression in feline mammary
tumors and evaluation of its prognostic potential.] Expressão de Her-2 em neoplasias
mamárias de gatas e avaliação de seu potencial prognóstico. Pesquisa Veterinária Brasileira
00(0):00-00. Laboratório de Patologia Animal, Universidade Federal de Uberlândia, Av. Mato
Grosso 3289, Uberlândia, MG 38400-900, Brazil. E-mail: [email protected]
ABSTRACT - Mammary neoplasms are the third most frequent type of neoplasm in felines and
the search for prognostic factors for this type of tumor in cats has intensified in the last years,
due to its high frequency and relevance in the cat clinic. Among the immunohistochemical
markers used for prognosis, the Human Epidermal Growth Factor Receptor type 2 (Her-2)
receptor, which in women is associated with a worse prognosis, stands out. The objective of
this study was to evaluate the expression of Her-2 in hyperplasias and benign and malignant
neoplasms of cats and to relate the expression to the type and histological grade of mammary
carcinomas. Thirty-eight cases of neoplasia and mammary hyperplasia of cats were selected
from 2006 to 2016. From the protocols selected, epidemiological information and macroscopic
characteristics of mammary lesions were obtained. Tumors were individually classified and
graded histologically by two pathologists. Her-2 expression was determined by
immunohistochemistry, using a semi-quantitative analysis of the slides according to the
Hercepest (Dako) recommended score. The Chi-square test χ2 was used to evaluate the
relationship between Her-2 expression and type of mammary lesion, histological types of
carcinoma and histological grade (P <0.05). The mean age of the animals was 8.5 years and
young cats were affected only by benign hyperplasias and neoplasms. Undefined cats were
more affected (84.37%), followed by Siamese (9.37%) and Persian (6.25%). Regarding the
histological classification, 18.42% of the mammary lesions were classified as hyperplasia,
18.42% as adenoma and 63.16% were classified as carcinoma. The most common type of
carcinoma was tubulopapillary carcinoma (66.7%), followed by solid carcinoma (25%) and
cribriform carcinoma (8.33%). Her-2 overexpression was observed in 4 samples (16.7%) of
tubulopapillary carcinoma, two carcinomas grade I and two degrees II, but there was no
relationship between Her-2 expression and type of mammary lesion (P = 0.3127), carcinoma
type (0.3446) or histological grade (0.6485). It is concluded that the percentage of female
mammary carcinomas expressing Her-2 is lower than in women's breast cancer and there was
no relation between grade and histological type and Her-2 expression.
INDEX TERMS: c-erbB-2/neu, feline, imunohistochemistry, mammary tumor.
Recebido em ................................................
Aceito para publicação em ..................................................
² Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Medicina Veterinária,
Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Av. Mato Grosso 3289, bloco 2S, Bairro Umuarama,
Uberlândia, MG 38405314, Brazil. Pesquisa de mestrado com apoio CAPES e FAPEMIG. *Autor
para correspondência: [email protected].
3 Laboratório de Patologia Animal, Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Av. Mato Grosso
3289, bloco 2S, Bairro Umuarama, Uberlândia, MG 38405314, Brazil.
1
33
RESUMO.– As neoplasias mamárias são o terceiro tipo mais frequente de neoplasias em felinos
e a busca por fatores prognósticos para este tipo de tumor nas gatas tem se intensificado nos
últimos anos, dada sua alta frequência e relevância na clínica de felinos. Dentre os marcadores
imunohistoquímicos utilizados para prognóstico destaca-se o receptor do fator de crescimento
epidérmico humano tipo 2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor type 2 – Her-2) que em
mulheres está associado a um pior prognóstico. Objetivou-se avaliar a expressão de Her-2 em
hiperplasias e neoplasias mamárias, benignas e malignas, de gatas e relacionar a expressão ao
tipo e grau histológico dos carcinomas mamários. Foram selecionados 38 casos de neoplasias e
hiperplasias mamárias de gatas, no período de 2006 a 2016. A partir dos protocolos
selecionados obteve-se informações epidemiológicas e características macroscópicas das
lesões nas mamas. Os tumores foram individualmente classificados e graduados
histologicamente por dois patologistas. A expressão de Her-2 foi determinada por
imunohistoquímica, por meio de análise semi quantitativa das lâminas conforme escore
recomendado pelo Herceptest (Dako). Utilizou-se Teste Qui-quadrado (χ2) para avaliação da
relação entre expressão de Her-2 e tipo de lesão mamária, tipos histológicos de carcinoma e
grau histológico (P<0,05). A idade média dos animais foi de 8,5 anos e as gatas jovens foram
acometidas somente por hiperplasias e neoplasias benignas. Gatas sem raça definida foram
mais acometidas (84,37%), seguida por siamês (9,37%) e persa (6,25%). Quanto à classificação
histológica, 18,42% das lesões mamárias foram classificadas como hiperplasia, 18,42% como
adenoma e 63,16% foram classificadas como carcinoma. O tipo de carcinoma mais comum foi
o carcinoma tubulopapilar (66,7%), seguido por carcinoma sólido (25%) e carcinoma
cribriforme (8,33%). Observou-se superexpressão de Her-2 em 4 amostras (16,7%) de
carcinoma do tipo tubulopapilar, sendo dois carcinomas grau I e dois graduação II, todavia não
houve relação entre a expressão de Her-2 e o tipo de lesão mamária (p=0,3127), tipo de
carcinoma (0,3467) ou grau histológico (0,6485). Conclui-se que o percentual de carcinomas
mamários de gatas que expressam Her-2 é menor que no câncer de mama da mulher e não
houve relação entre grau e tipo histológico e expressão de Her-2.
TERMOS DE INDEXAÇÃO: c-erbB-2/neu, felino, imunohistoquímica, tumor de mama.
INTRODUÇÃO
As neoplasias mamárias são o terceiro tipo tumoral mais frequente em felinos e acometem mais
frequentemente fêmeas, adultas, não castradas e não há predisposição racial (Lana et al. 2007).
Vários fatores prognósticos já estão estabelecidos para estes tumores, tais como: estádio
clínico, tamanho tumoral (Ito et al. 1996), grau histológico (Castagnaro et al. 1998, Hughes e
Dobson 2012, De Campos et al. 2015), taxa de mitose (Preziosi et al. 2002, Hughes e Dobson
2012) e invasão linfovascular (Seixas et al. 2011). Entretanto, nos últimos anos, marcadores
imunohistoquímicos estão sendo explorados para melhor compreensão da patogênese
molecular nas neoplasias de felinos (Hughes e Dobson 2012).
Neste sentido, o receptor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (Human
Epidermal Growth Factor Receptor type 2 – Her-2), um proto-oncogene muito empregado em
câncer de mama em mulheres, tem sido estudado como fator prognóstico e preditivo de
tumores mamários em cães e gatos. Em mulheres, sua superexpressão está relacionada a menor
tempo livre da doença, maior risco de metástases e maior resistência a quimioterápicos (Eccles,
2011) e seu efeito na carcinogênese está ligado à inibição da apoptose, indução da proliferação
celular e angiogênese (Gleich e Salamone, 2002).
Os carcinomas mamários em gatas apresentam características histológicas (PérezAlenza et al. 2004), metastáticas (Macewen 1990) e de dependência hormonal (De Las Mulas et
al. 2000) semelhantes a neoplasias mamárias em mulheres, indicando que a gata pode ser um
modelo animal adequado para o câncer de mama em mulheres (De Maria et al. 2005). Além
34
disto, a expressão de Her-2 poderia ser utilizada como fator preditivo para seleção de gatas
para tratamento com fármacos anti-Her-2 (como o trastuzumab), à semelhança do que ocorre
em mulheres, apesar do alto custo, e assim ser uma alternativa para tratamento das neoplasias
mamárias em gatas.
Estudos indicam que a expressão de Her-2 em gatas está associada à maior tamanho do
tumor, maior grau histológico (Ordás et al. 2007) e menor sobrevida (Ordás et al. 2007, De
Campos et al. 2015). Entretanto, alguns autores afirmam que, ao contrário do que ocorre na
mulher, o Her-2 pode não estar envolvido na carcinogênese dos tumores mamários nas gatas e
seu valor como fator de prognóstico em gatas é discutido, pois tanto as hiperplasias quanto os
tumores malignos e benignos expressam Her-2 (Rasotto et al. 2011).
Assim, uma vez que estudos abordando expressão de Her-2 em gatas ainda são escassos
e tais estudos se fazem necessários para elucidar seu papel como fator prognóstico, objetivouse avaliar a imunoexpressão de Her-2 em hiperplasias, neoplasias benignas e malignas em gatas
e relacionar essa imunoexpressão ao tipo e grau histológico, importantes parâmetros
histológicos para carcinomas mamários.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras. Foram revisados os protocolos do Laboratório de Patologia Animal do
Hospital Veterinário da Universidade Federal de Uberlândia, entre os anos de 2006 a 2016, e
selecionou-se protocolos de gatas com diagnóstico de neoplasia mamária (maligna ou benigna)
ou lesões não neoplásicas (hiperplasias ou displasias).
Dados epidemiológicos (idade, sexo, raça) foram coletados a partir dos protocolos, assim
como características clinicopatológicas como localização e o tamanho das lesões. Quanto ao
tamanho, considerou-se T1 tumores menores que 2cm, T2 tumores entre 2 e 3 cm e T3 tumores
maiores que 3cm (Mc Neiil et al. 2009).
As gatas foram classificadas quanto à faixa etária em jovens (menos de ano), adultos (de
um a oito anos) e idosos (acima de oito anos de idade) (Togni et al. 2013).
Histopatologia. As lâminas histológicas, contendo fragmentos de tecido mamário
dos casos selecionados, foram revisadas por dois patologistas e classificadas de acordo com
Misdorp et al. (1999) e o grau histológico foi atribuído segundo Elston e Ellis (1993).
Imunohistoquímica. Lâminas contendo poli-L-lisina (Sigma Aldrich) foram
submetidas à secagem em temperatura ambiente (25ºC). Os fragmentos de mama das gatas, já
inclusos em parafina, foram submetidos à corte histológico em micrótomo, na espessura de
quatro µm e acondicionados em estufa a 45ºC por aproximadamente 24 horas. Os cortes foram
colocados sobre as lâminas previamente preparadas e então submetidos à diafanização por 20
minutos em xilol. A reidratação dos cortes foi realizada em álcool 99,5% e 95% por seis minutos
cada um. Por fim, as lâminas foram lavadas em água corrente por 10 minutos. As amostras
foram então submetidas à técnica de imunohistoquímica para detecção de Her-2, segundo
Ressel et al. (2013) com modificações. A recuperação antigênica por calor foi realizada em
micro-ondas, em solução de ácido etilenodiamino tetra-acético dissódico (EDTA) e em seguida,
as lâminas foram resfriadas. Para o bloqueio de peroxidase endógena utilizou-se peróxido de
hidrogênio e em sequência os cortes foram contornados com caneta hidrofóbica (DAKO
S200230) e para o bloqueio das proteínas inespecíficas utilizou-se Protein Block (DAKO
X0909). O anticorpo anti Her-2 (Dakocytomation polyclonal antibody A0485) foi diluído 1:400
em soro albumina bovina (BSA) (Amresco, 0332) 1%. Os cortes receberam 100 microlitros (µl)
do anticorpo diluido e foram cobertos com parafilm American National Can® e as lâminas foram
incubadas overnight em câmara úmida. Após incubação as lâminas, utilizou-se a técnica de
estreptavidina-biotina-peroxidase (Dako, K069011). Após cada etapa, as lâminas foram lavadas
em solução 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris-HCl). A reação foi revelada com
35
diaminobenzidina (Diaminobenzina, Dako- K3468-1) e as lâminas contra coradas com
hematoxilina de Harris e montadas.
Como controle positivo da reação utilizou-se corte histológico de carcinoma mamário de
mulher, previamente testado para expressão de Her-2 e com escore 3+, conforme Bertangolli
et al. (2011). Como controle negativo, substitui-se o anticorpo primário pelo diluente do
anticorpo (BSA 1%).
A expressão de Her-2 foi determinada por análise semiquantitativa, realizada a partir da
verificação da marcação da membrana das células epiteliais, conforme escore recomendado
pelo Herceptest (Dako). O escore 0 (negativo) foi considerado quando não havia coloração de
membrana ou coloração em <10% das células tumorais; escore 1+ (fraco) quando havia
coloração fraca e incompleta da membrana em >10% das células tumorais; escore 2+
(moderadamente positivo) quando havia coloração fraca e moderadamente completa da
membrana em >10% das células tumorais; escore 3+ (fortemente positivo) quando havia forte
e completa coloração da membrana em >10% das células tumorais. As imunomarcações de
secreções luminais, em epitélio normal e acúmulos extracelulares foram desconsideradas. As
amostras com escore 2+ e 3+ foram consideradas positivas.
Análise Estatística. A relação entre expressão de Her-2 e tipo de lesão mamária
(hiperplasia, adenoma e carcinoma), tipo histológico de carcinoma (tubulopapilar, sólido,
cribriforme) e grau histológico foi determinada pelo teste Qui-quadrado χ2) por meio do
programa Action 2.5 em Microsoft Excel 2007 (P<0,05).
RESULTADOS
Foram selecionados 38 protocolos de gatas, sendo que dois não possuíam informação de
idade e em seis não constava a raça do animal. A idade média das gatas foi de 8,5 anos, variando
de 6 meses a 15 anos, sendo quatro animais jovens (11,11%), oito gatas adultas (22,22%) e 24
idosas (66,67%). As gatas jovens foram acometidas somente por hiperplasias (3/4; 75%) e
tumor benigno (1/4; 25%), assim como a maioria das gatas adultas (5/8, 62,5%). Já as gatas
idosas foram acometidas por carcinomas em sua maioria (20/24, 83,33%) (Quadro 1).
Com respeito às raças, lesões mamárias ocorreram com maior frequência em gatas sem
raça definida (SRD) (84,37%), seguido da raça siamesa (9,37%) e persa (6,25%). Das 38 lesões
mamárias, 24 (63,16%) eram tumores malignos e dentre estes, o carcinoma tubulopapilar foi o
mais frequente (66,67%) (Quadro 1).
Em 11 protocolos de gatas com carcinoma havia informações a respeito do tamanho
tumoral, sendo três tumores classificados como T1 (27,27%), quatro em T2 (36,36%) e quatro
como T3 (36,36%). Sobre a localização, três (10%) se encontravam na mama torácica cranial,
dois (6,67%) na glândula torácica caudal, seis (20%) na abdominal cranial, oito (26,67%) na
glândula abdominal caudal, 11(36,67%) animais apresentavam tumores em várias mamas e em
8 fichas este dado não estava disponível.
Na graduação histológica, apenas os carcinomas foram graduados, totalizando 24
amostras. Dez carcinomas receberam grau I (41,67%), sendo que todos eram do tipo
tubulopapilar; 10 receberam grau II (41,67%), sendo seis classificados como carcinoma
tubulopapilar (60%), 3 classificados como carcinoma sólido (30%) e 1 como carcinoma
cribriforme (10%). Apenas quatro carcinomas receberam grau III (16,67%), sendo três do tipo
carcinoma sólido (75%) e um carcinoma cribriforme (25%).
Quanto à expressão de Her-2, das 24 amostras de carcinoma, quatro amostras (16,7%)
foram positivas, sendo que uma amostra recebeu escore 3+ e três receberam escore 2+ (Figura
1). Todos os carcinomas que expressaram Her-2 eram do tipo tubulopapilar e dois carcinomas
eram grau I (50%) e dois grau II (50%). A marcação de membrana ocorreu exclusivamente nas
células epiteliais tumorais, não houve marcação de células epiteliais normais e em alguns casos
36
verificou-se fraca marcação de citoplasma. Nenhuma amostra de neoplasia benigna ou
hiperplasia apresentou marcação de membrana para Her-2.
Não houve relação entre imunomarcação e tipo de lesão mamária (carcinomas,
adenomas ou hiperplasias) (p= 0.3127), tipo histológico de carcinoma (tubulopapilar, sólido,
cribriforme) (p=0,3467) e grau histológico (p=0,6485).
DISCUSSÃO
As gatas jovens foram mais acometidas por hiperplasias (75%), fato que pode estar
associado à etiologia das hiperplasias fibroepiteliais ligada à progestágenos naturais,
produzidos a partir do primeiro cio (Hayden et al. 1981). Já a média de idade de gatas
acometidas por carcinomas (10,31 anos) condiz com outros estudos que descrevem que esta
média varia entre 10 a 12 anos (Millanta et al. 2006, Lana et al. 2007, Kustritz 2007, Cunha et
al. 2016). Em gatas idosas, é mais comum a ocorrência de carcinomas que de tumores benignos
(Hayes, 1985) e embora haja indicação de que o prognóstico é pior em gatas mais velhas, a
idade não apresentou associação significativa com sobrevida pós-cirúrgica (Castagnaro et al.
1998).
Gatas de pelo curto são mais acometidas por tumores mamários (Seixas et al .2011,
Manesh et al. 2014), assim como as raças siamesa (Hayes et al. 1981) e persa (Seixas et al.
2011). Estas últimas raças também foram observadas no presente estudo, apesar das gatas SRD
terem sido as mais frequentemente acometidas por tumores mamários. A maior ocorrência em
gatas SRD pode estar associada ao estrato populacional atendido no Hospital Veterinário da
Universidade Federal de Uberlândia e diferenças raciais entre populações estudadas torna
difícil o estabelecimento dessa relação. Togni et al. (2013) e Cunha et al. (2016), em estudos
realizados no Brasil, também relataram maior ocorrência em gatas sem raça definida.
Quanto ao tamanho das massas, a maioria (72,72%) apresentava mais que 2
centímetros, assim como relatado por Manesh et al. (2014) que observaram 33,33% das massas
maiores que 3 centímetros de diâmetro. Já Togni et al. (2013) e De Campos et al. (2015)
relataram que tumores menores que 2 centímetros foram mais frequentes em gatas. O tamanho
da massa tumoral é considerado importante fator de prognóstico pois tumores maiores
apresentam maior número de divisões celulares e maior probabilidade de progressão para
comportamento maligno, devido ao acúmulo de mutações (Matos et al. 2012). E ainda, sua
relação já foi estabelecida com a sobrevida, onde gatas com massas maiores apresentam menor
sobrevida (Ito et al. 1996).
Com respeito à localização, as mamas abdominais foram mais acometidas, assim como
relatado por De Campos et al. (2015). Alguns autores utilizam a denominação das mamas em
torácicas, abdominais e inguinais, conforme Dyce et al. (2004), relatando maior ocorrência de
tumores nas glândulas abdominais (Shafiee et al. 2013, Manesh et al. 2014) e inguinais (Cunha
et al. 2016).
Tumores malignos foram mais frequentes que lesões benignas e o carcinoma
tubulopapilar foi o mais frequente. Na Itália, considerando apenas as neoplasias, 88% dos
tumores foram classificados como carcinomas (Rasotto et al. 2011); e Maniscalco et al. (2012),
considerando as hiperplasias como lesões benignas, verificaram que 69,2% das amostras eram
malignas.
Quanto à classificação dos carcinomas, a maioria dos autores relata o carcinoma
tubulopapilar como o mais frequente (Togni et al. 2013), seguido pelo carcinoma sólido
(Pereira et al. 2004, Millanta et al. 2006, Maniscalco et al. 2012, De Campos et al. 2015), assim
como neste trabalho. Todavia, em alguns trabalhos o carcinoma cribriforme não foi citado
(Pereira et al. 2004, Millanta et al. 2006) e em outro foram citados outros tipos histológicos,
como carcinoma mucinoso, rico em glicogênio e carcinossarcoma (De Campos et al. 2015). As
neoplasias classificadas como carcinoma tubulopapilar expressam mais Ki-67 que os
carcinomas sólido e cribriforme (Pereira et al. 2004), apontando maior índice proliferativo.
37
Além disso, gatas com carcinoma cribriforme são as que apresentam menor sobrevida, seguido
por carcinoma sólido e carcinoma tubulopapilar (Seixas et al. 2011, Mills et al. 2015)
A classificação histológica das neoplasias deve ser acompanhada da graduação
histológica para melhor avaliação prognóstica (Hughes e Dobson 2012). No presente estudo, a
maioria dos tumores (84%) apresentou grau I e II. Outros autores também citam que
carcinomas de gatas são, em sua maioria, bem diferenciados (grau I e II) (Silva 2016), ou ainda
que os carcinomas mostram distribuição semelhante entre os graus (Rasotto et al. 2011, De
Campos et al. 2015). Filgueira et al. (2014) verificaram que metástases à distância podem
ocorrer em gatas com carcinomas tubulares e sólidos, moderadamente diferenciados e
indiferenciados, sugerindo que a graduação associada ao tipo histológico podem predizer a
ocorrência de metástases.
Estudos anteriores relataram a superexpressão de Her-2 em gatas variando entre 12,3%
a 40% (De Maria et al. 2005, Ordás et al. 2007, Rasotto et al. 2011, De Campos et al. 2015) e,
neste trabalho, verificou-se que 16,7% dos carcinomas apresentaram superexpressão. A
variação nos resultados pode ocorrer devido à falta de padronização da técnica
imunohistoquímica (Matos et al. 2012, De Campos et al. 2015) e ao uso de anticorpos humanos
que podem apresentar baixa especificidade (Matos et al. 2012). No entanto, Soares et al. (2012)
testando vários protocolos e anticorpos para verificação da expressão de Her-2 demonstrou
que o clone usado no presente estudo (A0485) foi o que apresentou melhor resultado.
Apesar de trabalhos anteriores relatarem associação de superexpressão de Her-2 com
maior tamanho tumoral, maior grau histológico e ausência de expressão de receptores
hormonais (Ordás et al. 2007) e sobrevida global (Millanta et al. 2006, De Campos et al. 2015),
esta associação não foi observada no presente estudo. Outros estudos também mostraram
ausência de relação entre superexpressão de Her-2 e classificação histopatológica do tumor,
grau de malignidade, índice de Ki-67, tamanho do tumor, presença de metástases regionais e
idade da gata ao diagnóstico (Soares et al. 2012).
No presente estudo, os tumores benignos e as hiperplasias não apresentaram
superexpressão de Her-2, assim como em estudo realizado na Espanha (Ordás, 2007). Em
cadelas, Ferreira et al. (2014) relataram que hiperplasias ductais atípicas associadas a
carcinomas mamários caninos apresentaram fraca expressão da proteína Her-2 e não tiveram
amplificação do seu gene codificador detectado pela técnica de hibridização in situ. Por outro
lado, estudo realizado na Itália descreveu 6,8% das hiperplasias e 10% dos adenomas como
positivos e sugere que a superexpressão de Her-2 pode estar associada ao crescimento destas
lesões benignas (Rasotto et al. 2011).
CONCLUSÕES
Apesar da expressão de Her-2 ser um importante fator de prognóstico para mulheres
portadoras de tumor de mama, e da similaridade entre tumores de mama na mulher e na gata,
o percentual de carcinomas mamários de gatas que expressam Her-2 é menor que no câncer de
mama da mulher. Além disto, não foi possível estabelecer relação entre grau e tipo histológico
e expressão de Her-2. Com relação às lesões mamárias benignas em gatas, estas aparentemente
não expressam Her-2.
Agradecimentos. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e
à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (Capes) pela concessão de bolsa de
mestrado.
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Figura 1 – Expressão de Her-2 em lesões mamárias de gatas por meio de IHQ. (A) Carcinoma
tubulopapilar, escore 3+ (forte e completa coloração da membrana em >10% das células
tumorais), 40x. (B) Carcinoma tubulopapiplar, escore 2+ (coloração fraca e moderadamente
40
completa da membrana em >10% das células tumorais), 4x. (C) Hiperplasia lobular, escore 1+
(coloração fraca e incompleta da membrana em >10% das células tumorais), 10x. (D)
Carcinoma tubulopapilar, escore 0 (ausência de coloração de membrana ou coloração em <10%
das células tumorais), 10x. Contracoloração com hematoxilina de Harris.
Quadro 1- Frequência de lesões mamárias de gatas de acordo com a idade e raça.
41
Quadro 1- Frequência de lesões mamárias de gatas de acordo com a idade e raça.
Tipo histológico
Hiperplasia
Adenoma
Carcinoma
tubulopapilar
Carcinoma sólido
Carcinoma cribriforme
* SRD: sem raça definida.
Número/
Frequência
7 (18,42%)
7 (18,42%)
16
(42,10%)
6 (15,79%)
2 (5,26%)
Jovem
(n=4)
3 (75%)
1 (25%)
-
Idade
Adulta
(n=8)
2 (25%)
3 (37,5%)
1 (12,5%)
Idosa
(n=24)
1(4,17%)
3(12,5%)
15(62,5%)
-
2 (25%)
-
3 (12,5%)
2 (8,33%)
SRD*
(n= 27)
4(14,81%)
5 (18,52%)
13
(48,15%)
4 (14,81%)
1 (3,70%)
Raça
Persa
(n=2)
2 (100%)
Siamês
(n=3)
2 (66,67%)
1 (33,33%)
-
-
NSTRUÇÕES AOS AUTORES 800 Pesq. Vet. Bras. 35(7), julho 2015
Os artigos devem ser submetidos através do Sistema Scholar One,
link , com os arquivos de texto na versão mais recente do Word e
formatados de acordo com o modelo de apresentação disponíveis
no ato de submissão e no site da revista (www.pvb. com.br).
Devem constituir-se de resultados de pesquisa ainda não
publicados e não considerados para publicação em outro
periódico. Apesar de não serem aceitas comunicações (Short
commu-nications sob a forma de Notas Científicas , não há limite
mínimo do número de páginas do artigo enviado. Embora sejam
de responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos
nos artigos, o Conselho Editorial, com a assistência da Assessoria
Científica, reserva-se o direito de sugerir ou solicitar modificações
aconselháveis ou necessárias. Os artigos submetidos são aceitos
através da aprovação pelos pares (peer review). NOTE: Em
complementação aos recursos para edição da revista é cobrada
taxa de publicação (paper charge) no valor de R$ 2.000,00 por
artigo editorado, na ocasião do envio da prova final, ao autor para
correspondência. 1. Os artigos devem ser organizados em Título,
ABSTRACT, RESUMO, INTRODUÇÃO, MATERIAL E MÉTODOS,
RESULTADOS, DISCUSSÃO, CONCLUSÕES, Agradecimentos e
REFERÊNCIAS: a) o Título deve ser conciso e indicar o conteúdo
do artigo; pormenores de identificação científica devem ser
colocados em MATERIAL E MÉTODOS. b) O(s) Autor(es) deve(m)
sistematicamente abreviar seus nomes quando compridos, mas
mantendo o primeiro nome e o último sobrenome por extenso,
como por exemplo: Paulo Fernando de Vargas Peixoto escreve
Paulo V. Peixoto (inverso, Peixoto P.V.); Franklin Riet-Correa
Amaral escreve Franklin Riet-Correa (inverso, Riet-Correa F.). Os
artigos devem ter no máximo 8 (oito) autores; c) o ABSTRACT
deve ser uma versão do RESUMO em português, podendo ser mais
explicativo, seguido de INDEX TERMS que incluem palavras do
título; d) o RESUMO deve conter o que foi feito e estudado,
indicando a metodologia e dando os mais importantes resultados
e conclusões, seguido dos TERMOS DE INDEXAÇÃO que incluem
palavras do título; e) a INTRODUÇÃO deve ser breve, com citação
bibliográfica específica sem que a mesma assuma importância
principal, e finalizar com a indicação do objetivo do artigo; f) em
MATERIAL E MÉTODOS devem ser reunidos os dados que
permitam a repetição da experimentação por outros
pesquisadores. Em experimentos com animais, deve constar a
aprovação do projeto pela Comissão de Ética local; g) em
RESULTADOS deve ser feita a apresentação concisa dos dados
obtidos. Quadros (em vez de Tabelas) devem ser preparados sem
dados supérfluos, apresentando, sempre que indicado, médias de
várias repetições. É conveniente expressar dados complexos, por
gráficos (=Figuras), ao invés de apresentá-los em Quadros
extensos; h) na DISCUSSÃO devem ser discutidos os resultados
diante da literatura. Não convém mencionar artigos em
desenvolvimento ou planos futuros, de modo a evitar uma
obrigação do autor e da revista de publicá-los; i) as CONCLUSÕES
devem basear-se somente nos resultados apresentados; j)
Agradecimentos devem ser sucintos e não devem aparecer no
texto ou em notas de rodapé; k) a Lista de REFERÊNCIAS, que só
incluirá a bibliografia citada no artigo e a que tenha servido como
fonte para consulta indireta, deverá ser ordenada alfabetica e
cronologicamente, pelo sobrenome do primeiro autor, seguido
dos demais autores (todos), em caixa alta e baixa, do ano, do título
da publicação citada, e, abreviado (por extenso em casos de
dúvida), o nome do periódico ou obra, usando sempre como
exemplo os últimos fascículos da revista (www.pvb.com.br). 2. Na
elaboração do texto devem ser atendidas as seguintes normas: a)
A digitação deve ser na fonte Cambria, corpo 10, entrelinha
simples; a página deve ser no formato A4, com 2cm de margens
(superior, inferior, esquerda e direita), o texto deve ser corrido e
não deve ser formatado em duas colunas, com as legendas das
Figuras no final (logo após as REFERÊNCIAS). As Figuras e os
Quadros devem ter seus arquivos fornecidos separados do texto.
Os nomes científicos devem ser escritos por extenso no iní- cio de
cada capítulo. b) a redação dos artigos deve ser concisa, com a
linguagem, tanto quanto possível, no passado e impessoal; no
texto, os sinais de chamada para notas de rodapé serão números
42
arábicos colocados em sobrescrito após a palavra ou frase que
motivou a nota. Essa numeração será contínua por todo o artigo;
as notas deverão ser lançadas ao pé da página em que estiver o
respectivo número de chamada, sem o uso do Inserir nota de fim ,
do Word. Todos os Quadros e todas as Figuras têm que ser citados
no texto. Estas citações serão feitas pelos respectivos números e,
sempre que possível, em ordem crescente. ABSTRACT e RESUMO
serão escritos corridamente em um só parágrafo e não devem
conter citações bibliográficas. c) no rodapé da primeira página
deverá constar endereço profissional completo de todos os
autores (na língua do país dos autores), o e-mail do autor para
correspondência e dos demais autores. Em sua redação deve-se
usar vírgulas em vez de traços horizontais; d) siglas e abreviações
dos nomes de instituições, ao aparecerem pela primeira vez no
artigo, serão colocadas entre parênteses, após o nome da
instituição por extenso; e) citações bibliográficas serão feitas pelo
sistema autor e ano ; artigos de até dois autores serão citados
pelos nomes dos dois, e com mais de dois, pelo nome do primeiro,
seguido de et al. , mais o ano; se dois artigos não se distinguirem
por esses elementos, a diferenciação será feita através do
acréscimo de letras minúsculas ao ano. Artigos não consultados na
íntegra pelo(s) autor(es), devem ser diferenciados, colocando-se
no final da respectiva referência, Resumo ou Apud Fulano e
o ano. ; a referência do artigo que serviu de fonte, será incluída
na lista uma só vez. A menção de comunicação pessoal e de dados
não publicados é feita no texto somente com citação de Nome e
Ano, colocando-se na lista das Referências dados adicionais, como
a Instituição de origem do(s) autor(es). Nas citações de artigos
colocados cronologicamente entre parênteses, não se usará
vírgula entre o nome do autor e o ano, nem ponto-e-vírgula após
cada ano, como por exemplo: (Priester & Haves 1974, Lemos et al.
2004, Krametter-Froetcher et. al. 2007); f) a Lista das
REFERÊNCIAS deverá ser apresentada em caixa alta e baixa, com
os nomes científicos em itálico (grifo), e sempre em conformidade
com o padrão adotado nos últimos fascículos da revista, inclusive
quanto à ordenação de seus vários elementos. 3. Os gráficos
(=Figuras) devem ser produzidos em 2D, com colunas em branco,
cinza e preto, sem fundo e sem linhas. A chave das convenções
adotadas será incluída preferentemente, na área do gráfico
(=Figura); evitar-se-á o uso de título ao alto do gráfico (=Figura).
4. As legendas explicativas das Figuras devem conter informações
suficientes para que estas sejam compreensíveis, (até certo ponto
autoexplicatívas, independente do texto). 5. Os Quadros devem ser
explicativos por si mesmos. Entre o título (em negrito) e as
colunas deve vir o cabeçalho entre dois traços longos, um acima e
outro abaixo. Não há traços verticais, nem fundos cinzas. Os sinais
de chamada serão alfabéticos, recomeçandos, se possível, com a
em cada Quadro; as notas serão lançadas logo abaixo do Quadro
respectivo, do qual serão separadas por um traço curto à
esquerda.