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USO DE BIOLOGIA MOLECULAR NA IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS NA CULTURA DO FEIJÃOFEIJÃO-CAUPI PAULO SERGIO TORRES BRIOSO Professor Associado - UFRRJ, Doutor 2009 AGRADECIMENTOS II CONAC EMBRAPA AMAZÔNIA ORIENTAL - Belém (PA) Dr. Altevir de Matos Lopes PRODUÇÃO • Região nordeste nordeste:: 85 % da área colhida • Região sudeste sudeste:: 8 % da área colhida (mais da metade, no Estado do Rio de Janeiro) • Região norte • Região centro centro--oeste PRINCIPAIS FITOPATÓGENOS EM FEIJÃO--CAUPI FEIJÃO • BACTÉRIAS • FUNGOS • NEMATÓIDES • • VÍRUS Associações (vírus X vírus vírus;; fungos X nematóides?) COMPLEXO CAUSAL Virulência do patógeno Efeito sinérgico entre patógenos Vetor Suscetibilidade da cultivar Idade da planta na época da infecção Condições Ambientais Grau de Severidade da Doença PERDAS EM FEIJÃOFEIJÃO-CAUPI OCASIONADAS POR VÍRUS • 80% de perda - Gonçalves & Lima, 1988 DIAGNOSE VIRAL • Testes Biológicos Biológicos:: Inoculação mecânica, enxertia, Cuscuta sp sp.., vetores INOCULACÃO MECÂNICA ENXERTIA CUSCUTA AFÍDEOS MOSCA BRANCA COLEÓPTEROS DIAGNOSE VIRAL • Microscopia Microscopia:: Ótica, de Fluorescência, Eletrônica Cucumber mosaic virus – Inclusão (Microscopia Ótica) Cucumber mosaic virus (Microscopia Eletrônica de Transmissão) DIAGNOSE VIRAL Testes Sorológicos Sorológicos:: • ELISA ELISA,, Dot--ELISA Dot ELISA,, Eletrônica, Imunomicroscopia Microscopia Imunofluorescência de TESTE SOROLÓGICO DOT--ELISA E ELISA DOT DIAGNOSE VIRAL • Testes Moleculares BIOLOGIA MOLECULAR • 1944 - Avery, MacLeod & McCarty - DNA genômico de bactéria - transmissão de caracteres hereditários • 1952 - Hershey & Chase - DNA como material genético • 1953 - Watson & Crick - Modelo estrutural de dupla hélice da molécula de DNA FITOPATOLOGIA MOLECULAR • 1956 1956:: Gierrer & Schramm - Tobacco mosaic virus • • • • • (TMV) e plantas de Fumo - RNA como material genético 1960:: Anderer et al 1960 al.., Fraenkel Fraenkel--Conrat et al al.. Seqüenciamento de aminoácidos do capsídeo do TMV Isolamento e uso de enzimas de restrição Ligação de fragmentos de DNA através da DNA ligase Construção de uma molécula de DNA circular recombinante Desenvolvimento em paralelo de inúmeras técnicas moleculares TÉCNICAS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS EM FEIJÃOFEIJÃO-CAUPI • Extração e Eletroforese do ácido nucléico • Clonagem e Seqüenciamento do ácido • • • nucléico RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”) Hibridização de ácidos nucléicos - Teste de Northern Blot, Blot, Teste de Southern Blot e Teste de Dot Blot Blot)) Polymerase Chain Reaction (PCR) e modalidades (RT (RT--PCR, ICIC-PCR, Real TimeTimePCR, etc) Açúcar Base Fosfato SEQÜENCIAMENTO SEQÜÊNCIAS DISPONÍVEIS DE FITOVÍRUS “National Center for Biotechnology Information” (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html FAMÍLIAS VIRAIS X SUSCETIBILIDADE DO FEIJÃOFEIJÃO-CAUPI 1. Bromoviridae 2. Bunyaviridae 3. Caulimoviridae 4. Comoviridae 5. Geminiviridae 6. Luteoviridae 7. Partitiviridae 8. Potyviridae 9. Rhabdoviridae 10. Tombusviridae 11. Indeterminadas Açúcar Base Fosfato TESTE DE DOT BLOT SONDA NÃO RADIOATIVA SONDA RADIOATIVA Fluorescência Substrato Conjugado-AP Anti-Fluoresceina amostra s 32P F F Sonda marcada com Fluoresceina Membrana de Nylon NEGATIVO amostras NEGATIVO POSITIVO Sondas disponí disponíveis para vírus de Feijão--caupi Feijão caupi:: 4 vvíírus 2 sorotipos 32 P POSITIVO Sonda marcada com 32P TESTE DE PCR 0) Ciclo inicial - 55ºC 1) Desnaturação do DNA - 90ºC 2) Anelamento dos Primers - 55ºC 3) Polimerização - 72ºC TESTE DE PCR TESTE DE RTRT-PCR DNA RNA TESTE DE IMUNOCAPTUREPCR FAMÍLIAS VIRAIS X SUSCETIBILIDADE DO FEIJÃOFEIJÃO-CAUPI 1. Bromoviridae 2. Bunyaviridae 3. Caulimoviridae 4. Comoviridae 5. Geminiviridae 6. Luteoviridae 7. Partitiviridae 8. Potyviridae 9. Rhabdoviridae 10. Tombusviridae 11. Indeterminadas GÊNEROS VIRAIS X SUSCETIBILIDADE DO FEIJÃOFEIJÃO-CAUPI 1. Alphacryptovirus 2. Alfamovirus 3. Begomovirus 4. Bromovirus 5. Capillovirus 6. Carlavirus 7. Carmovirus 8. Comovirus 9. Cucumovirus 10.Curtovirus 11.Dianthovirus 12.Enamovirus 13.Fabavirus 14.Ilarvirus 15.Macluravirus 16.Nanovirus 17.Necrovirus 1. Nepovirus 2. Nucleorhabdovirus 3. Oleavirus 4. Ourmiavirus 5. Pecluvirus 6. Polerovirus 7. Potexvirus 8. Potyvirus 9. Sobemovirus 10.Soybean chlorotic mottlemottle-like viruses 11.Tobamovirus 12.Tobravirus 13.Tombusvirus 14.Tospovirus 15.Trichovirus 16.Tymovirus 17.Vitivirus SEQÜENCIAMENTO E DIAGNOSE MOLECULAR DE FITOVÍRUS (RNA) NO BRASIL Histórico: Histórico: • 1992 - Andean potato mottle virus (APMoV) - Primeiro fitopatógeno completamente seqüenciado no Brasil Isolados virais oriundos de feijão feijão--caupi caupi:: • 1996 - Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) • 2000 - Cowpea aphid aphid--borne mosaic virus (CABMV) Isolados virais (que infectam o feijão feijão--caupi) mas oriundos de outras culturas culturas:: • 2000 - Cucumber mosaic virus (CMV) • 2000 - Cowpea rugose mosaic virus (CPRMV) PRINCIPAIS VÍRUS QUE INFECTAM O FEIJÃOFEIJÃOCAUPI NO BRASIL 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Cucumber mosaic virus (CMV) - Bromoviridae Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) - Comoviridae Cowpea golden mosaic virus (CpGMV) - Geminiviridae Bean common mosaic virus (BCMV) - Potyviridae Cowpea aphid aphid--borne mosaic virus (CABMV) - Potyviridae Cowpea green vein banding virus (CGVBV) - Potyviridae Cowpea rugose mosaic virus (CPRMV) - Potyviridae Cowpea severe mottle virus (CPSMoV) - Potyviridae TESTE DE RTRT-PCR, DOTDOT-BLOT Brioso et al. (1996), Passos (1999), Figueiredo et al. (2000) e Passos et al. (2000) - CPSMV e o CABMV: • • • Seleção inicial de plantas de feijão-caupi resistentes a vírus Diagnose precoce das espécies virais na cultura Detecção de vetores virulíferos (no caso, de besouro, pulgão) Tamanho esperado do fragmento amplificado e posição correspondente dos oligonucleotídeos degenerados na seqüência do RNA 2 viral, elaborados a partir de regiões de aminoácidos conservados na subunidade maior e subunidade menor do capsídeo viral das espécies do gênero Comovirus. __________________________________________________________________________ VÍRUS FRAGMENTO (pb) SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS AWSTQV GPN*GFE __________________________________________________________________________ APMoV 641 973-990 1594-1614** BPMV 602 2711-2728 3293-3313 CPMV 599 2456-2473 3035-3055 CPSMV 593 2472-2489 3045-3065 RCMV 605 2424-2441 3009-3029 SqMV 602 1615-1632 2197-2217 ________________________________________________________ APMoV - Andean potato mottle virus; BPMV - Bean pod mottle virus; CPMV Cowpea mosaic virus; CPSMV - Cowpea severe mosaic virus; RCMV - Red clover mottle virus; SqMV - Squash mosaic virus; pb - Pares de bases nucleotídicas; * - N ou R; ** - Posição correspondente na seqüência nucleotídica do RNA 2 viral. COMOVIRUS - ESPÉCIES VIRAIS Teste de RT-PCR - Par de oligonucleotídeos degenerados correspondentes às seqüências de aminoácidos conservados, AWSTQV e GPN*GFE (* = N ou R), nas subunidades do capsídeo das espécies do gênero Comovirus: L – 1 kb DNA Ladder, A – APMoV estirpe B, B – APMoV estirpe C, C – CPSMV sorotipo I, D – N. rustica sadia, E – Feijãocaupi sadio, F - CPSMV sorotipo II, G - BPMV (Brioso et al., 1996) NORTHERN BLOT - CPSMV A) RNA middle APMoV estirpe C L) 1 kb DNA ladder B) RNA middle CPSMV sorotipo I C) RNA bottom CPSMV sorotipo I Brioso et al., 1996 SELEÇÃO INICIAL DE PLANTAS DE FEIJÃOFEIJÃOCAUPI RESISTENTES Passos (1999) - Técnica de RT-PCR, a partir de um par de oligonucleotídeos degenerados correspondentes às seqüências de aminoácidos conservados (CPSMV). Resistente ao Sorotipo I e Sorotipo II: BR 14 - Mulato, BR 17 Gurguéia, TE 93-244-23F Resistente ao Sorotipo I e suscetível ao Sorotipo II: IT 89KD-260, TE 94-256-2E Resistente ao Sorotipo II e suscetível ao Sorotipo I: TE 93-200-40F, TE 93-200-49F, TE 93-212-10F, TE 93-213-12F.1, TE 93-213-12F.2, TE 93-214-4F.2, TE 94-277-3F Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) sorotipo I L 1 2 3 575 pb Eletroforese em gel de agarose a 1%, do fragmento amplificado por RT-PCR com primers específicos para o CPSMV: (L) Padrão de massa molecular 1kb DNA Ladder, (1) cv. Costelão sadio, (2) TE 93-200-49F infectada com o CPSMV sorotipo I, (3) Controle sem RNA L 1 2 3 4 575 495 316 Eletroforese em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio, do fragmento amplificado com primers específicos para o CPSMV, a partir de amostras de linhagens de feijão-caupi TE 93-200-49F e IT 89D-260 infectadas com o CPSMV sorotipo I (2) e CPSMV sorotipo II (3), respectivamente. Padrão de massa molecular, 1kb DNA Ladder (L). Feijãocaupi ‘Costelão’ sadio (1). Controle sem RNA (4). (Nogueira et al., 2003) Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) SELEÇÃO INICIAL DE PLANTAS DE FEIJÃOFEIJÃOCAUPI RESISTENTES Figueiredo et al. (2000) - RT-PCR, a partir de um par de oligonucleotídeos específicos ao CABMV - fragmento específico de 759 pb Resistente: ‘Capela’, IT 851-2687, IT 860-716-2, IT 870-716-1, TE 96-282-22G, TE 96-2905G Suscetível: BR-14-Mulato, BR-17-Gurguéia, CNC 0434, Costelão, Monteiro, Pitiúba, Seridó, TE 93-43-12F, TE 93-200-49F, TE 93-204-13F, TE 93-204-21F, TE 93-212-10F, TE 94-2691E, TE 94-273-9E, TE 94-277-3F, TE 96-280-1F, TE 96-280-2F, TE 96-280-3F, TE 96-280-4F, TE 96-280-5F, TE 96-280-6F, TE 96-282-7F, TE 96-282-8F, TE 96-282-9F, TE 96-282-10F, TE 96-282-11F, TE 96-282-13F, TE 96-282-14F, TE 96-282-15F, TE 96-282-16F, TE 96-282-17F, TE 96-282-18F, TE 96-282-19F, TE 96-282-20F, TE 96-282-21F, TE 96-282-22F, TE 96-28223F, TE 96-282-25F, TE 96-282-26F, TE 96-282-27F, TE 96-282-30F, TE 96-282-31F, TE 96282-32F, TE 96-282-34F, TE 96-290-1F, TE 96-290-2F, TE 96-290-3F, TE 96-290-4F, TE 96290-5F, TE 96-290-6F, TE 96-290-7F, TE 96-290-8F, TE 96-290-9F, TE 96-290-10F, TE 96290-11F, TE 96-290-12F, TE 96-290-13F TESTE DE DOT – BLOT/ CPSMV • Cerotoma arcuata http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHT ML/Feijao/FeijaoCaupi/pragas_aereas.htm Cowpea golden mosaic virus (CpGMV) Cowpea golden mosaic virus (CpGMV) L 1 2 3 L 1 2 3 1,2 kb 1,5 kb Amostras foliares amplificadas com Primers específicos: (L) 1 kb; (1) Feijãocaupi com CpGMV; (2) Feijão-caupi sadio; (3) amostra sem DNA Amostras foliares amplificadas com Primers específicos: (L) 1 kb; (1) Feijão-caupi com CpGMV; (2) Feijão-caupi sadio; (3) amostra sem DNA CULTIVAR DE FEIJÃOFEIJÃO-CAUPI Nogueira (2003) e Nogueira et al. (2005): • seqüenciamento produto amplificado; • confecção de sonda molecular específica ao CPSMV e ao CABMV; • identificar e selecionar plantas imunes a estes vírus; • linhagens de feijão-caupi adaptadas para o Estado do Rio de Janeiro 2006 - Primeira cultivar de feijão-caupi produtiva, imune ao CPSMV (sorotipo I e sorotipo II), CABMV e adaptada ao Estado do Rio de Janeiro QUEBRA DE RESISTÊNCIA Nogueira et al., 2009 • ‘Capela’ – Mosaico severo • Infecção mista CMV + CABMV • CMV (oriundo do feijãofeijão-caupi do Piauí/ 1982) – 53 1982) 53% % transmissão pela semente de feijão ‘Rico 23 23’’ FITOPATOLOGISTA + MELHORISTA X FITOPATÓGENOS + Prêmio Frederico de Menezes Veiga 2009, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária 2006 2006 - 800 kg/ha TÉCNICAS MOLECULARES Perguntas freqüentes: freqüentes: • Tem custo elevado? • É obrigatória a sua utilização? • Vou ter que remodelar e re re--aparelhar o Laboratório? ESCOLHA DA TÉCNICA • • • • • • Custos e materiais necessários Finalidade Nº de amostras a serem processadas Precisão Sensibilidade Treinamento do operador CONCLUSÃO Técnicas Moleculares - Ampla versatilidade, eficiência, precisão e sensibilidade Diferentes linhas de trabalho, independentemente do patógeno, do vetor e da cultura enfocada Linguagem comum entre Fitopatologistas e outros profissionais Técnica adotada em grande parte dos laboratórios de universidades e de empresas, públicas ou privadas na diagnose molecular de vírus (patógenos) de feijão--caupi feijão LABORATÓRIO OFICIAL DE DIAGNÓSTICO FITOSSANITÁRIO DA UFRRJ - EQUIPE • Laboratório credenciado junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento para análise de fungos, procariotos, nematóides, vírus e viróides em produtos de origem vegetal e expedir laudo oficial de diagnóstico fitossanitário fitossanitário.. • Atualmente, a equipe é formada por 2 DocentesDocentes-doutores, 1 Doutorando, 2 Mestrandos, 1 Estagiário, 5 Servidores CONTATO Laboratório Oficial de Diagnóstico Fitossanitário Instituto de Biologia Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Caixa Postal 74.585 Seropédica, RJ CEP: 23851-970 E-mail: [email protected] [email protected] http://www.fito2009.com/fitop/fitop.htm
