caracterização molecular de begomovírus infectando fabáceas não

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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BEGOMOVÍRUS INFECTANDO
FABÁCEAS NÃO CULTIVADAS
Janaina da Silva Rodrigues (discente do Programa ICV), José Evando Aguiar Beserra
(Orientador, Depto de Fitotecnia – UFPI)
INTRODUÇÃO
Begomovírus são vírus pertencentes à família Geminiviridae que apresentam estrutura
icosaédrica geminada apresentando genoma monopartido; àqueles originários do Velho Mundo
(Europa, Ásia, África), ou bipartido, com origem no Novo Mundo (Américas) estando organizado em
cadeias circulares denominadas de DNA-A e DNA-B (BRIDDON et al., 2010). Esses vírus infectam
dicotiledôneas e são transmitidos através da mosca branca Bemisia tabaci, pertencente à família
Aleyrodidae: Homoptera (ROCHA et al., 2013), cujo biótipo B foi introduzido no Brasil na década de
1990 sendo responsável pelo aumento na incidência de begomoviroses que causam enormes danos a
muitas plantas cultivadas (GALVÃO et al., 2003).
Além das plantas cultivadas, muitas espécies de plantas daninhas são hospedeiras naturais de
begomovírus, funcionando como reservatórios naturais desses vírus com grande variabilidade
genética, resultando em uma maior possibilidade de transmissão a novos hospedeiros.
O objetivo desse trabalho foi verificar a ocorrência de begomovírus em espécies de plantas
daninhas da família Fabaceae provenientes dos Estados do Piauí, Ceará e Paraíba, e estudar a
variabilidade genética dos isolados detectados mediante PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction –
Restriction Fragment Length Polymorphism).
METODOLOGIA
O DNA viral das amostras coletadas foi extraído segundo o método de Dellaporta et al. (1983).
O DNA total foi amplificado por círculo rolante (RCA) com a DNA polimerase do fago phi29 utilizando o
kit Templi Phi (Amersham Biosciences), seguindo as orientações do fabricante. Esse método utiliza a
DNA polimerase do bacteriófago phi29 que amplifica somente cadeias de DNA circulares, como os
componentes genômicos (DNA-A e o DNA-B) dos begomovírus (INOUE-NAGATA et al., 2004).
Em seguida, as amostras foram digeridas com as endonucleases de restrição Bam HI, Eco RI,
Cla I, Kpn I e Xho I visando estimar a diversidade genética. Os produtos da extração, amplificação e
digestão foram analisados através de eletroforese em gel de agarose a 1% corados com brometo de
etídio.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram coletadas oito amostras foliares de Macroptilium lathyroides (feijão de rôla)
apresentando sintomas característicos aos da infecção por begomovírus, em municípios dos Estados
do Piauí, Ceará e Paraíba. Observou-se a existência de DNA total no produto da extração, como
também a amplificação do DNA viral por RCA, revelando densas bandas na parte superior devido ao
grande número de moléculas (dados não mostrados).
Devido à impossibilidade de efetuação da clonagem em vetor plasmidial, utilizou-se a técnica
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), para observarmos a variabilidade genética das
amostras.
Foram utilizadas cinco endonucleases de restrição: Eco RI, Bam HI, XhoI, Kpn I e Cla I (Figuras
1 e 2), cuja função é fragmentar as cadeias de DNA em um ou mais sítios de reconhecimento. Os
fragmentos, na RCA-RFLP são observados com a finalidade de estimarmos a variabilidade genética
das amostras pelo polimorfismo de bandas.
No gel de eletroforese com as digestões da enzima Eco RI é possível observar que a maioria
das amostras apresentou um ou mais sítios de restrição para a enzima e foram gerados diferentes
tamanhos de bandas; utilizando a enzima Kpn I observa-se que a maioria das amostras não possui
sítios de clivagem para a enzima; com a enzima Bam HI a maioria das amostras foi linearizada em um
ou ambos DNA’s, revelando ser essa enzima indicada para futuras clonagens dos genomas completos;
com a enzima Xho I, alguns dos DNA’s foram linearizados nas amostras 5, 6 e 7. Observou-se o mesmo
padrão de bandas nas amostras 5 e 6. A amostra 3 apresentou um padrão de bandas diferente, abaixo
de 2 kb. As amostras 1, 2, 4 e 8 não apresentaram sítios de reconhecimento para essa enzima; a
digestão com a enzima Cla I também se mostrou bastante eficaz na linearização de DNA de
begomovírus, como observado nas amostras 1, 2, 4, 5, 7 e 8.
Figura 1. Padrão eletroforético em gel de agarose (1,0%) da digestão do produto de RCA de nove
amostras com as enzimas Eco RI (A) e Kpn I (B). M. Marcador de comprimento (1kb DNA ladder).
Figura 2. Padrão eletroforético em gel de agarose (1,0%) da digestão do produto de RCA de nove
amostras com as enzimas Bam HI (C), Xho I (D) e Cla I (E). M. Marcador de comprimento (1kb DNA
ladder).
CONCLUSÃO
Utilizando-se o método RCA-RFLP é possível observar a variabilidade genética das amostras
através do padrão de bandas resultante da digestão com enzimas de restrição. Os padrões de clivagem
gerados pelas enzimas de restrição evidenciaram a elevada variabilidade genética entre os isolados de
begomovírus provenientes de Macroptilium lathyroides.
APOIO: FAPEPI.
Palavras-Chave: Begomovírus. Plantas daninhas. RCA-RFLP.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRIDDON, R.W.; PATIL, B.L; BAGEWADI, B.; NAWAZ-UL-REHMAN, M. S; FAUQUET, C. M. Distinct
evolutionary histories of the DNA-A and DNA-B components of bipartite begomoviruses. BMC
Evolutionary Biology. v. 10, n. 1, p. 97, 2010.
GALVÃO, R. F.; MARIANO, A. C.; LUZ, D. F.; ALFENAS, P. F.; ANDRADE, E. C.;ZERBINI, F. M.;
ALMEIDA, M. R.; FONTES, E. P. B. A naturally occurring recombinant DNA-A of a typical bipartite
begomovirus does not require the cognate DNA-B to infect Nicotiana benthamiana systemically.
Journal of General Virology. v. 84, p. 715-726, mar 2003.
INOUE-NAGATA, A. K.; ALBUQURQUE, L. C.; ROCHA, W. B.; NAGATA, T. A simple method for
cloning the complete begomovirus genome using the bacteriophage phi29 DNA polymerase.
Journal of Virological Methods. v. 116, p. 209-211, 2004.
ROCHA, C. S.; CASTILLO-URQUIZA, G. P.; LIMA, A. T. M.; SILVA, F, N.; XAVIER, C. A. D.; HORAJÚNIOR, B. T.; BESERRA-JÚNIOR, J. E. A.; MALTA, A. W. O.; MARTIN, D. P.; VARSANI, A.;
ALFENAS-ZERBINI,P.; MIZUBUTI, E. S. G.; ZERBINI, M. Brazilian Begomovirus Populations Are
Highly Recombinant, Rapidly Evolving, and Segregated Based on Geographical Location. Journal
of Virology. v. 87, n. 10, p. 5784–5799, mai. 2013.