Anexo 13.5.2 – 6 – Procedimentos para realização da análise

6° RELATÓRIO CONSOLIDADO DE ANDAMENTO DO PBA E DO ATENDIMENTO
DE CONDICIONANTES
CAPÍTULO 2 – ANDAMENTO DO PROJETO BÁSICO AMBIENTAL
Anexo 13.5.2 – 6 – Procedimentos para realização da
análise genética dos quelônios
Anexo 13.5.2 – 7 – Procedimentos para realização da análise genética dos
quelônios.
Qualificação e quantificação do DNA
Foi extraído o DNA genômico total de 164 amostras de sangue, 55 amostras de P.
expansa, 49 amostras de P. sextuberculata e 60 amostras de P. unifilis, usando
QIAGEN DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA), de acordo com as
recomendações do fabricante. A qualidade das amostras de DNA foi analisada através
da eletroforese horizontal em gel de agarose 1% e tampão TBE. Os DNAs genômicos
foram quantificados utilizando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
Amplificação in vitro do DNA via reação em cadeia da polimerase
A amplificação por PCR (INNIS et al., 1990) dos fragmentos da região controle do
DNA mitocondrial estão sendo otimizadas usando primers diretos para cada espécie:
PRO (5'-CCCATCACCCACTCCCAAAGC-3') para P. expansa; PuniDFLI (5’CATCTCCAA
CCATAATCTCAA-3)
para
P.
unifilis
e
DLSex
(5’AGTGCTCTTCCCCATATTATG-3’) para P. sextuberculata e o primer reverso 12SR5
(5'-GTCAGGACCATGCCTTTGTG-3') para todas elas (PEARSE et al., 2006)
(KOCHER et al.,1989).
As reações são realizadas em um termociclador Veriti™ Thermal Cycler (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) e as concentrações dos reagentes da PCR estão
sendo otimizados, para cada tubo são adicionados MgCl2 (Fermentas),
dNTPs (Fermentas), tampão da enzima Taq polimerase (100 mM Tris-HCl, pH 8,5,
500 mM KCl) (Fermentas), primers, enzima Taq DNA polimerase (Fermentas) e DNA
completando com água ultrapura em um volume final de reação de 15 μL. Os ciclos de
amplificação estão realizados como segue: desnaturação inicial de 94 °C por 1 minuto,
seguido de 35 ciclos de desnaturação a 94 °C por 35 segundos, anelamento a 55°C
por 50 seg e extensão a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos, além da extensão final a
72ºC por 5min. Todos esses procedimentos estão sendo realizados no Laboratório de
Biotecnologia (LABIOTEC), UFT.
Purificação do Produto Amplificado e Reação de Sequenciamento
As amostras amplificadas são purificadas com sistema Endonuclease I e enzima SAP,
submetidas à reação de sequenciamento utilizando o do Kit Big Dye Terminator Cycle
Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), precipitadas com EtOH /
EDTA e submetidas ao sequenciador automático ABI PRISM® 3130 xl (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA).
As reações de sequenciamento estão sendo feitas em placas para um volume final de
10 µL contendo DNA amplificado e purificado, um dos primers, Big Dye, de água
autoclavada deionizada e do tampão de reação do Big Dye para cada amostra. Em
seguida as amostras são submetidas ao termociclador cujos ciclos são otimizados. Ao
término da reação, as amostras de DNA resultantes desta PCR são submetidas ao
protocolo EtOH / EDTA de precipitação. Em seguida, são submetidas a eletro-injeção
e as sequências nucleotídicas determinadas pelo sequenciador automático ABI
PRISM® 3130xl seguindo instruções do fabricante, no Laboratório de Evolução e
Genética Animal – LEGAL, da Universidade Federal do Amazonas - UFAM.
As sequências são alinhadas por meio do programa de alinhamento múltiplo Clustal W
(THOMPSON et al., 1994) incluído no software Bioedit v. 7.0.9 (HALL, 1999), sendo a
base para a construção de uma matriz de dados contendo todas as sequências
nucleotídicas, e posteriormente revisadas manualmente.
Análises dos dados genéticos
A diversidade genética será estimada a partir da diversidade gênica (Ĥ), que é a
probabilidade de duas sequências, escolhidas aleatoriamente de uma população,
serem diferentes; da diversidade nucleotídica (Π), que corresponde ao número de
nucleotídeos diferentes por sítio entre sequências escolhidas ao acaso em uma
população (NEI, 1987); do número de haplótipos, que corresponde a cada indivíduo
com sequência de DNA única; e do número de sítios segregantes (S) - mutações que
separam cada haplótipo.
Os níveis de diferenciação entre as populações serão calculados usando a análise de
variância molecular – AMOVA, uma análise hierárquica entre todos os haplótipos
diretamente de uma matriz de distância de qui-quadrado obtido com a permutação
entre os grupos previamente definidos com base em critérios não genéticos (Fsc - no
caso do presente estudo Xambioá, Antonina e Tucuruí), entre populações encontradas
as análises genéticas dentro desses grupos (Fst) e dentro dessas populações (Fct).
Não havendo variação entre os grupos, as amostras são consideradas como retiradas
de uma única população global, com variações devido à amostragem aleatória
(EXCOFFIER et al., 1992).
Os níveis de estruturação das populações são estimados através da comparação par
a par do ФST (análogo ao FST) (WEIR & COCKERHAM, 1984) com correção de
Bonferroni para múltiplas comparações (RICE, 1989). Podem ser usados para estimar
o número efetivo de fêmeas migrantes (WEIR & COCKERHAM, 1984). O fluxo gênico,
dado pelo equivalente ao número de migrantes por geração impõe um limite à
diferenciação genética, é uma força contrária (HARTL e CLARK, 1989). Quanto maior
o número de migrantes, os valores de ФST são negativos indicando intenso fluxo
gênico entre populações e ausência de estruturação populacional.
Será utilizado também o teste desenvolvido por MANTEL (1967), uma metodologia
estatística geral que testa a significância da correlação entre duas matrizes de
similaridade, em estudos de genética de populações ele é utilizado entre a divergência
genética e a distância geográfica, testando a significância da correlação entre duas
matrizes de similaridade, ou seja, a hipótese de isolamento por distância. Os valores
de [ФST /(1 - ФST )] serão adequados a uma distância em quilômetros referente ao
mais curto caminho percorrido pelos rios entre cada par de populações e será utilizada
a correlação de Spearman (SPEARMAN, 1904) com 10.000 permutações para avaliar
a significância do teste (VASCONCELOS, 2005). Todos esses testes e as medidas de
variabilidade genética serão estimadas no programa ARLEQUIN versão 5.1
(EXCOFFIER & LISCHER 2010).
Os clados agrupados serão verificados pelo software Treefinder (JOBB, 2004) e a
árvore haplotipica será realizada no software hapview (SALZBURGER, et al., 2011),
que usa a topologia da maioria das árvores parcimoniosas, onde, cada comprimento
dos ramos representa a genealogia do haplótipo e passos mutacionais discretos, não
amostrados (PIIROINEN et al., 2013). A conclusão dos dados será estimada
baseando-se na análise dos 164 indivíduos, 55 amostras de P. expansa, 49 amostras
de P. sextuberculata e 60 amostras de P. unifilis.